ES2811060T3 - Anticuerpo contra péptido codificado por exón-21 de periostina y composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades asociadas a inflamación que contienen el mismo - Google Patents

Anticuerpo contra péptido codificado por exón-21 de periostina y composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades asociadas a inflamación que contienen el mismo Download PDF

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Ryuichi Morishita
Junya Azuma
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Abstract

Anticuerpo que se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en un péptido codificado por el exón-21 de periostina que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 para su uso en la prevención o el tratamiento, a través de la inhibición de una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, de una enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada la isoforma de periostina, en el que la enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada la isoforma de periostina es una enfermedad seleccionada de esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, periodontosis, dermatitis atópica, asma, retinopatía diabética, arteriosclerosis, enterocolitis inflamatoria, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma, aneurisma y osteoartritis.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo contra péptido codificado por exón-21 de periostina y composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades asociadas a inflamación que contienen el mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo contra un péptido codificado por el exón-21 de periostina y a una composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades asociadas a inflamación que contienen el mismo.
Antecedentes de la técnica
La periostina es una proteína de la matriz extracelular que consiste en un polipéptido de un peso molecular de aproximadamente 90.000. La cadena polipeptídica contiene una secuencia señal, un dominio rico en cisteína, un dominio repetido cuatro veces y un dominio C-terminal.
La periostina se designó inicialmente factor específico de osteoblastos-2 (OSF-2) y se aisló e identificó como un gen expresado específicamente en la línea celular de osteoblastos de ratón MC3T3-E1 (documento de patente 1, documento no de patente 1). Posteriormente, la proteína pasó a denominarse periostina y se notificó que tenía actividad promotora de la adhesión en células osteoblásticas (documento no de patente 2).
En estudios tempranos, se consideró que la periostina era una matriz extracelular expresada específicamente en tejido óseo. Sin embargo, se ha revelado que la periostina se expresa altamente no solo en el tejido óseo sino también al comienzo de la insuficiente cardiaca (documento no de patente 3, documento no de patente 4), aneurisma (documento no de patente 5), cánceres (documentos no de patente 6 a 8), preeclampsia (documento no de patente 9), reestenosis vascular (documentos no de patente 10 a 15), enfermedades inflamatorias (i) esofagitis (documento no de patente 16), ii) sinusitis y asma (documento no de patente 17), (iii) asma (documento no de patente 18), (iv) angiogénesis (documento no de patente 6, documentos no de patente 19 a 22), etc. y que la proteína se expresa muy ligeramente en tejido normal. También se ha revelado que algunas variantes de corte y empalme de periostina se expresan en osteoblastos (documentos no de patente 1 y 2, documento no de patente 23, documento de patente 2). Además, se ha notificado que PLF (factor similar a periostina) y periostina muestran similitudes y diferencias en su ubicación durante la embriogénesis (Zhu et al., J Histochem Cytochem (2008) 56 (4), 329-345).
En cuanto a las funciones de la periostina, se ha notificado que una variante de corte y empalme de periostina de 811 aminoácidos (correspondiente a PN-2 en la figura 1) (documento no de patente 2) y una variante de corte y empalme de periostina de 783 aminoácidos (correspondiente a PN-4 en la figura 1) (documento no de patente 24) tienen propiedades de adhesión celular. En cambio, algunas variantes de corte y empalme de periostina carecen de propiedades de adhesión celular e incluyen una variante de corte y empalme de periostina de 838 aminoácidos (correspondiente a PN-1 en la figura 1) (documento de patente 2) y una variante de corte y empalme de periostina de 810 aminoácidos (correspondiente a PN-3 en la figura 1) (documento de patente 4).
En cuanto a los cánceres, la metástasis del cáncer está mediada por procesos tales como invasión de células cancerosas del tumor primario a los vasos sanguíneos o los vasos linfáticos, migración selectiva de células cancerosas a órganos metastásicos, invasión de células cancerosas de los vasos sanguíneos a órganos metastásicos, crecimiento de células cancerosas apoyado por el microentorno donde se produjo la metástasis y crecimiento asociado a angiogénesis de un tumor cuyo diámetro supera varios milímetros (documentos no de patente 25 y 26). Entre estos complejos procesos para el establecimiento de la metástasis, la invasión y metástasis inducidas por la motilidad potenciada de las células cancerosas son fases muy importantes (documento no de patente 27). Hasta ahora, se ha notificado que células cancerosas altamente metastásicas producen por sí mismas un factor de motilidad autocrino para potenciar su propio movimiento (documento no de patente 28). Se espera que sustancias inhibidoras contra este factor maligno sean inhibidores de la metástasis, pero no se ha encontrado ningún inhibidor específico en la actualidad.
Se han publicado diversos informes sobre la expresión de alto nivel de periostina en cánceres altamente metastásicos (documento no de patente 29), cáncer oral (documento no de patente 21), cáncer pancreático (documento no de patente 30), cáncer de mama (documento no de patente 31), cáncer de cabeza y cuello (documento no de patente 32), cáncer de colon (documento no de patente 19), cáncer de mama (documentos no de patente 6, 8 y 33), cáncer tímico (documentos no de patente 34 y 35), cáncer de pulmón de células no pequeñas (documentos no de patente 36 y 37), cáncer de ovario (documento no de patente 38), cáncer de próstata (documento no de patente 39), cáncer de hígado y de conducto biliar (documento no de patente 40), cáncer escamoso de esófago (documento no de patente 41), cáncer de próstata (documento no de patente 42), cáncer de tiroides (documento no de patente 43). Se ha notificado la expresión de alto nivel del factor de transcripción Twist en cánceres altamente metastásicos (documentos no de patente 44 y 45) y ha recibido atención. Hubo un informe que mostró que Twist se ubica también en la región promotora de periostina (documento no de patente 46). Además, se ha notificado que la capacidad de invasión de la línea celular epitelial de riñón embrionario humano 293T se potencia cuando se introduce el gen de periostina en la línea celular (documento no de patente 47). También se ha notificado que una variante de corte y empalme de periostina de 811 aminoácidos (correspondiente a PN-2 en la figura 1) se expresaba menos en diversas células cancerosas, y la introducción del gen de periostina en células de melanoma inhibió su metástasis al pulmón (documento no de patente 48).
En cuanto a la reestenosis vascular, se ha usado ampliamente una endoprótesis de metal desnudo (BMS). De tres a ocho meses después de la implantación de la BMS, se produce reestenosis en la endoprótesis (ISR) en el 10 al 40% de los casos. El mecanismo de ISR se considera que es principalmente hiperplasia de la neoíntima asociada con la migración de células del músculo liso desde la túnica media de la arteria coronaria hacia la endoprótesis y la proliferación posterior de las células (documento no de patente 49). Para superar el inconveniente, Sousa et al. en 1999 desarrollaron una endoprótesis liberadora de fármacos (DES), que es una endoprótesis con la superficie recubierta con un fármaco, como una endoprótesis liberadora de sirolimús (SES). Sin embargo, se ha notificado trombosis tardía de la endoprótesis provocada por DES y, por consiguiente, se ha deseado un fármaco para inhibir de manera segura la reestenosis. Diversos informes han notificado una expresión de alto nivel de periostina en músculo liso vascular de un modelo animal con reestenosis inducida por lesiones con balón (documentos no de patente 10 a 15).
En cuanto a las inflamaciones, se han usado clínicamente fármacos antiinflamatorios e incluyen fármacos antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos para enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, e inmunosupresores y preparaciones de oro para enfermedades inflamatorias crónicas progresivas (por ejemplo, reumatismo, osteoartritis, etc.). El principal mecanismo de acción de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos es la inhibición de mediadores inflamatorios. Los fármacos proporcionan tratamiento sintomático y son eficaces para enfermedades agudas, pero menos eficaces para enfermedades inflamatorias crónicas. Los fármacos antiinflamatorios esteroideos son sumamente eficaces para enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, pero se ha notificado que provocan de manera concomitante efectos secundarios graves. En consecuencia, debe tenerse cuidado cuando se usan los fármacos. No se aplican preparaciones de oro a enfermedades inflamatorias agudas, sino que se usan para el reumatismo crónico. Las preparaciones de oro tienen actividad inmunoreguladora y, por tanto, ejercen efectos retardados. Sin embargo, también se ha notificado que las preparaciones de oro provocan efectos secundarios, incluyendo síntomas mucosos y cutáneos, mielosupresión, disfunción renal y disfunción respiratoria. En consecuencia, como con el caso de los fármacos antiinflamatorios esteroideos, debe tenerse suficiente cuidado cuando se usan preparaciones de oro. Algunos inmunosupresores también han recibido atención en cuanto a su aplicación clínica al reumatismo crónico, pero los efectos secundarios característicos de los inmunosupresores son motivo de preocupación.
Se ha notificado una expresión potenciada de periostina en enfermedades inflamatorias (documentos no de patente 16 a 18, 50 y 51).
La angiogénesis está estrechamente asociada con, además de cánceres, el agravamiento de algunas enfermedades incluyendo retinopatía diabética, aterosclerosis, periodontosis, esclerodermia, glaucoma, degeneración macular relacionada con la edad y diabetes mellitus tipo II. La angiogénesis también desempeña un papel fundamental en el comienzo y el agravamiento de artritis reumatoide, sarcoma de Kaposi, psoriasis y enfermedad de Basedow (documento no de patente 52). También se ha mostrado que la expansión del tejido adiposo depende de la angiogénesis, y se ha notificado que la inhibición de la angiogénesis es eficaz para la prevención de la obesidad, etc. (documento no de patente 53). En la enfermedad de Alzheimer, las células endoteliales cerebrales activadas por angiogénesis secretan un sustrato precursor para p-amiloide y un péptido neurotóxico que destruye selectivamente neuronas corticales y, por tanto, se ha notificado que la inhibición de la angiogénesis es eficaz para la prevención y el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (documento no de patente 54). Basándose en estos estudios, se han usado inhibidores de la angiogénesis para tratar y prevenir las enfermedades anteriores en los últimos años, y ha habido una demanda de sustancias eficaces para inhibir la angiogénesis.
Inhibidores de la angiogénesis que se han encontrado son angiostatina (documentos no de patente 55 y 56); endostatina (documento no de patente 57); fumagillina derivada de Aspergillus fumigatus y su derivado sintético TNP-470 (documento no de patente 58); citogenina (documento no de patente 59); sustancias químicas sintéticas, tales como inhibidores de metaloproteinasa, batimastat (BB-94) y marimastat (BB-2516) (documentos no de patente 60 y 61); y anticuerpos monoclonales que inhiben la unión de factores de angiogénesis (EGF, TGF-a, VEGF, etc.) a los receptores correspondientes (documento no de patente 62). Sin embargo, estas sustancias requieren una cuidadosa consideración de los efectos secundarios, y la seguridad de las sustancias para un cuerpo humano no está completamente garantizada.
Se ha notificado que la expresión de periostina está estrechamente relacionada con la angiogénesis en el comienzo de cánceres (documento no de patente 6, documento no de patente 19, documentos no de patente 21 y 22). Se ha notificado que la inducción de angiogénesis por periostina se logra a través de la expresión del receptor-2 de VEGF (Flk-1/KDR) en células endoteliales vasculares (documento no de patente 20).
Tal como se describió anteriormente, se ha indicado que la expresión del gen de periostina está relacionada con estados de reestenosis vascular, cánceres, inflamaciones y estados de angiogénesis. También se han notificado un anticuerpo relacionado con la inhibición de la migración celular mediada por periostina (documento no de patente 12) y un anticuerpo que tiene actividad inhibitoria contra el crecimiento celular inducido por periostina (documento no de patente 13). Sin embargo, la relación de la estructura de una variante de corte y empalme de periostina y reestenosis vascular, cánceres, inflamaciones y angiogénesis sigue sin estar clara.
Lista de citas
Documentos de patente
Documento de patente 1: JP 5-268982 A
Documento de patente 2: WO 2005/019471
Documento de patente 3: WO 2007/077934
Documento de patente 4: WO 02/020055
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Takeshita S. et al., Biochem J (1993) 294, 271-278.
Documento no de patente 2: Horiuchi K. et al., J. Bone Miner. Res. (1999) 14, 1239-1249.
Documento no de patente 3: Katsuragi N. et al., Circulation (2004) 110, 1806-1813.
Documento no de patente 4: Wang D. et al., Hypertension (2003) 42, 88-95.
Documento no de patente 5: Peters DG. et al., Stroke (2001) 32, 1036-1042.
Documento no de patente 6: Shao R. et al., Mol Cell Biol. (2004) 24(9), 3992-4003.
Documento no de patente 7: Gonzalez HE. et al., Arch Otolaryngol Head Neck Surg. (2003) 129, 754-759.
Documento no de patente 8: Sasaki H. et al., Breast Cancer Res Treat. (2003) 77(3), 245-252.
Documento no de patente 9: Sasaki H. et al., Am J Obstet Gynecol. (2002) 186, 103-108.
Documento no de patente 10: Lindner V. et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2005) 25, 77-83.
Documento no de patente 11: Litvin J. et al., Am J Physiol Cell Physiol (2007) 292, C1672-C1680.
Documento no de patente 12: Butcher JT. et al., Dev Biol. (2007) 302(1), 256-266.
Documento no de patente 13: Li G. et al., Atherosclerosis (2006) 188(2), 292-300.
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Documento no de patente 15: Goetsch SC. et al., Physiol Genomics (2003) 14(3), 261-271.
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Documento no de patente 20: Shao R. et al., Biochem Biophys Res Commun. (2004) 321(4), 788-794.
Documento no de patente 21: Siriwardena BS. et al., Br J Cancer.(2006) 95(10),1396-1403.
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Documento no de patente 30: Baril P. et al, Oncogene (2007) 26(14), 2082-2094.
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Documento no de patente 36: Sasaki H. et al, Cancer (2001) 92(4), 843-848.
Documento no de patente 37: Erratum in: Cancer (2002) 95(12), 2580.
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Documento no de patente 40 Riener MO et al., Histopathology. (2010) 56(5): 600-6.
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Documento no de patente 58: D. Ingber, et al., Nature, 1990, 348, 555-557.
Documento no de patente 59: T. Oikawa, et al., Anticancer Research, 1997, 17, 1881-1886.
Documento no de patente 60: G. Taraboletti, et al., Journal of National Cancer Institute., 1995, 87, 293-298.
Documento no de patente 61: Marimastat: BB 2516, TA 2516., Drugs in R&D, 2003, 4(3), 198-203.
Documento no de patente 62: S. Iqbal y H. J. Lenz, HYPERLINK “http://www.ingentaconnect.com/content/klu/2 80” ¥o “Cancer Chemotherapy and Pharmacology” Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2004, 54 Suppl. 1, S32-39.
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objeto de la presente invención es proporcionar un inhibidor de una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un agente novedoso para prevenir o tratar reestenosis vascular, cánceres, inflamaciones, angiogénesis y arteriosclerosis, teniendo el agente un mecanismo diferente al de los agentes existentes y siendo capaz de mejorar la calidad de vida y el pronóstico a largo plazo. Además, otro objeto de la presente invención es proporcionar un método terapéutico, un método de diagnóstico y un reactivo de diagnóstico para reestenosis vascular, cánceres, inflamaciones y angiogénesis.
Solución al problema
Los inventores forzaron la expresión de las variantes de corte y empalme de periostina PN-2 y PN-4, purificaron las proteínas y recubrieron una placa con cada una de las proteínas para investigar la adhesión de fibroblastos a la placa. La adhesión de los fibroblastos varió con los tipos de las variantes de corte y empalme. La variante de corte y empalme de periostina PN-2 mostró una actividad de adhesión celular significativamente más fuerte que el control negativo albúmina (BSA) y el grupo no recubierto, mientras que la variante de corte y empalme de periostina PN-4 mostró una actividad de adhesión celular más débil que el grupo no recubierto y solo tuvo una actividad de adhesión celular muy débil en comparación con el control negativo albúmina (BSA) (figura 2). La diferencia en la capacidad de adhesión indicó que la región del exón-21 está implicada en la adhesión celular. Basándose en esto, los inventores supusieron que un anticuerpo policlonal anti-exón-21 de periostina producido usando la región del exón-21 como antígeno inhibirá la adhesión celular por PN-2.
El análisis de variantes de corte y empalme de periostina altamente expresadas en reestenosis vascular, cánceres, colitis inflamatoria o estados de angiogénesis reveló que el dominio C-terminal del cual se derivan las variantes de corte y empalme consiste en los exones 15 a 23, y que las ratas tienen las siguientes variantes (1) a (4) (véase la figura 1).
(1) una variante que conserva todos los exones (denominada PN-1; que consiste en 838 aminoácidos de SEQ ID NO: 1; la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 2)
(2) una variante que carece del exón-17 (denominada PN-2; que consiste en 811 aminoácidos de SEQ ID NO: 3; 27 aminoácidos (exón-17) de SEQ ID NO: 4 se delecionan de p N-1; la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 5)
(3) una variante que carece del exón-21 (denominada PN-3; que consiste en 810 aminoácidos; los aminoácidos en las posiciones 785 a 812 del extremo N-terminal (28 aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (exón-21)) se delecionan de PN-1)
(4) una variante que carece del exón-17 y el exón-21 (denominada PN-4; que consiste en 783 aminoácidos de SEQ ID NO: 7; 28 aminoácidos (exón-21) de SEQ ID NO: 6 se delecionan de p N-2; la secuencia de ADNc se muestra en SEQ ID NO: 8)
Además de la variantes de corte y empalme de rata, se encontraron también PN-2 y PN-4 de ser humano y ratón (PN-2 de ratón (SEQ ID NO: 9 (secuencia de aminoácidos), SEQ ID NO: 10 (secuencia de ADNc)); PN-4 de ratón (SEQ ID NO: 11 (secuencia de aminoácidos), SEQ ID NO: 12 (secuencia de ADNc)); PN-2 de ser humano (SEQ ID NO: 13 (secuencia de aminoácidos), SEQ ID NO: 14 (secuencia de ADNc)); PN-4 de ser humano (SEQ ID NO: 15 (secuencia de aminoácidos), SEQ ID NO: 16 (secuencia de ADNc))).
Los inventores intentaron producir un anticuerpo que reconociera específicamente los residuos de aminoácidos codificados por el exón-21 como inhibidor del exón, exón que es la diferencia estructural entre PN-2 y PN-4 y que se encuentra exclusivamente en PN-2.
Con el fin de producir un anticuerpo, el material usado como inmunógeno debe ser hidrófilo, y cuando parte de un polipéptido grande, tal como una proteína, se usa para producir un anticuerpo, la parte que va a usarse como inmunógeno debe exponerse en la superficie de la proteína y formar un epítopo. Por tanto, con el fin de examinar la posibilidad de usar la cadena peptídica del exón-21 como antígeno, se realizó inicialmente una búsqueda de epítopos usando el software de Accelrys Mac Vector 7.2, que se usa ampliamente en el campo de la bioinformática. La región del exón mostró cierta “hidrofilicidad”, pero se sugirió a partir de la “probabilidad superficial” y “antigenicidad” que la secuencia de aminoácidos de la región del exón-21 de SEQ ID NO: 6 (EVSKVTKFIEGGDg HlFEDEAIKRLLQG) es muy poco probable que se exponga en la superficie de la molécula de proteína y no tiene inmunogenicidad. Por tanto, se supuso que la región del exón no podía usarse como inmunógeno para producir un anticuerpo y que sería difícil producir en la práctica un anticuerpo contra la región del exón.
Sin embargo, basándose en la creencia de que el uso de un anticuerpo contra la región polipeptídica codificada por el exón-21 encontrado en PN-2 sería óptimo para la inhibición específica de las funciones de la proteína PN-2, los inventores intentaron producir un anticuerpo contra la secuencia de aminoácidos codificada por el exón-21. Los inventores sintetizaron un péptido que consiste en 28 aminoácidos que constituyen el péptido codificado por la región del exón-21, inmunizaron conejos con el péptido y purificaron una fracción de IgG del suero, logrando de ese modo la producción de un anticuerpo policlonal anti-péptido de exón-21 de rata.
Los inventores llevaron a cabo una investigación para determinar si el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata tiene actividad inhibitoria contra la actividad de adhesión de periostina. La proteína PN-2 de ratón se recubrió sobre células del músculo liso vascular de rata que se habían cultivado hasta la subconfluencia, y se sembraron sobre las mismas células THP-1 derivadas de monocitos, dando como resultado la adhesión de las células THP-1. Por separado, la proteína PN-2 se mezcló con el anticuerpo, y la mezcla y las células THP-1 se sembraron, dando como resultado la inhibición de la adhesión de las células THP-1. Los resultados globales confirmaron que el anticuerpo policlonal antiexón-21 de rata tiene actividad inhibidora contra la actividad de adhesión de periostina. El anticuerpo policlonal antiexón-21 de rata inhibe la adhesión de células THP-1, inhibiendo de ese modo la diferenciación de las células en macrófagos. Por tanto, el anticuerpo tiene una función inhibidora contra la invasión de macrófagos en los órganos. Los macrófagos a menudo están asociados con diversas enfermedades inflamatorias, y se mostró por tanto que el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata tenía actividad antiinflamatoria (figura 3).
Los inventores investigaron el efecto inhibidor sobre la hiperplasia de la íntima vascular usando un modelo animal. Se indujo lesión en la arteria carótida izquierda de ratas s D con el uso de un catéter con balón, y simultáneamente se administró por vía intravascular el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata. Después de un cierto período de tiempo, los vasos sanguíneos se recogieron, se fijaron y se tiñeron con HE. Se calculó la razón de área de la íntima con respecto a la media y se examinó la gravedad de la hiperplasia de la íntima. No se encontró diferencia significativa en el área de la media, pero se observó una diferencia significativa en la razón íntima/media entre el grupo de administración de anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata y el grupo de rasguño solo. Los resultados mostraron la inhibición de la hiperplasia de la íntima (figura 4A).
Basándose en el informe de la asociación de la proteína PN-2 con inflamaciones, los inventores investigaron el efecto sobre la arteriosclerosis por el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) (el anticuerpo policlonal contra el péptido codificado por el exón-21 de periostina de rata). La investigación se realizó usando un modelo de ratones deficientes en ApoE (KO), que se considera generalmente que son un modelo propenso a arteriosclerosis, cargado con una dieta alta en grasas durante tres meses. Los ratones a los que se les administró anticuerpo policlonal antiexón-21 de rata (ex21PoAb) mostraron una inhibición significativa de la arteriosclerosis en la aorta torácica (la parte superior de la aorta), tal como se evaluó por la tinción con aceite rojo O, en comparación con los ratones a los que se les administró anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG). Los resultados revelaron el efecto inhibidor de la arteriosclerosis del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (figura 5).
Los inventores investigaron el efecto antiinflamatorio de un anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) en un modelo con enfermedad de Crohn, que es la colitis inflamatoria que tipifica enfermedades inflamatorias. El anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) o un anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG) se administró a ratones C57B6 macho a las 8 semanas de edad, y se administró sulfato de dextrano sódico (DDS) al 1,75% por medio del agua potable. Dos semanas más tarde, la longitud del intestino grueso se mantuvo significativamente bien en el grupo de administración de anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) en comparación con el grupo de administración de anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG) (figura 6). El anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) mostró actividad antiinflamatoria en el modelo de colitis de ratón.
A partir del informe de la asociación de la proteína PN-2 con la angiogénesis, los inventores investigaron el efecto inhibidor de la angiogénesis del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) y del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) en un modelo animal. Tras la confirmación de la expresión del gen de PN-2 en un modelo de ratón con isquemia de las extremidades inferiores, se administró el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb), como resultado de lo cual se observó un efecto inhibidor significativo sobre la angiogénesis (figura 7B). La inmunotinción de los vasos sanguíneos en el tejido con un anticuerpo frente a CD31 mostró una inhibición significativa de la angiogénesis en el grupo de administración de anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) (figura 8). El anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) también mostró un efecto inhibidor sobre el flujo sanguíneo de las extremidades inferiores (figura 9). El efecto inhibidor de la angiogénesis de los anticuerpos antiexón-21 sugirió un posible efecto inhibidor de los anticuerpos anti-exón-21 sobre la angiogénesis patológica.
Los inventores realizaron ensayos en Matrigel usando células cultivadas. El sobrenadante de células de cáncer de mama humano MDA-MB231 aumentó significativamente la angiogénesis en células endoteliales humanas, mientras que la adición del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) o del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) inhibió significativamente la angiogénesis (figuras 10A y 10B). También se mostró que PN-2 indujo angiogénesis de manera dependiente de la dosis (figuras 11A y 11B). Los resultados mostraron que los anticuerpos anti-exón-21 inhiben la angiogénesis inducida por un cáncer.
Los inventores investigaron el efecto del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) sobre la capacidad proliferativa de las células de cáncer de mama 4T1 de ratón cultivadas, y como resultado, se observó una actividad citostática significativa mediante el ensayo de MTS, en comparación con la administración de un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) (figura 12A). Los inventores también investigaron el efecto del anticuerpo monoclonal antiexón-21 humano (ex21MoAb) sobre la necrosis de las células de cáncer de mama 4T1 de ratón, y como resultado, se observó una actividad significativa de inducción de necrosis mediante la medición de LDH en el sobrenadante, en comparación con la administración de un anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG). Los resultados confirmaron el efecto inhibidor de la proliferación directo y el efecto de inducción de necrosis directo de los anticuerpos anti-exón-21 sobre células de cáncer de mama 4T1 de ratón (figura 12B).
Se inyectaron células de cáncer de mama 4T1 de ratón en la almohadilla del pie de los ratones para establecer ratones modelo de metástasis pulmonar, y entonces se les administró a los ratones modelo el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) una vez a la semana. De tres a cinco semanas después del establecimiento del modelo, se observó una inhibición significativa del crecimiento tumoral primario, así como del número de colonias metastásicas pulmonares a partir de los tumores primarios, en comparación con un grupo de administración de anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) (figuras 13A y 13B). El anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) se administró de la misma manera que anteriormente, y como resultado, se observó una inhibición significativa de la metástasis pulmonar en comparación con un grupo de administración de anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG) (figura 14).
Se inyectaron células de melanoma de ratón B16F10 en la almohadilla del pie de ratones para establecer ratones modelo de metástasis pulmonar, y entonces se les administró a los ratones modelo el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) una vez a la semana. Tres semanas después del establecimiento del modelo, se observó una inhibición significativa del crecimiento tumoral primario, así como del número de colonias metastásicas pulmonares a partir de los tumores primarios, en comparación con un grupo de administración de anticuerpos IgG de control de conejo (rIgG) (figuras 15A y 15B). Se supuso que los anticuerpos neutralizantes contra PN-2 (los anticuerpos antiexón-21) inhiben las funciones PN-2, tales como el efecto promotor de la adhesión de macrófagos y el efecto angiogénico, y de ese modo inhiben el crecimiento y la metástasis pulmonar de células de cáncer de mama o células de melanoma. Esta suposición sugiere el potencial de los anticuerpos neutralizantes como agentes terapéuticos novedosos. Los resultados experimentales revelaron que los anticuerpos anti-exón-21 tienen actividad inhibidora sobre el crecimiento tumoral primario, que avanza junto con la progresión de los estados cancerosos, y también tienen actividad inhibidora sobre la metástasis pulmonar de los tumores primarios.
Los inventores investigaron el efecto del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) sobre la arteriosclerosis. El anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) se administró a un modelo de ratón de aneurisma una vez a la semana, y como resultado, se observó una inhibición significativa de la expansión del diámetro de la aorta tal como se midió con un escáner de ultrasonidos, en comparación con un grupo de administración de anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG). Los resultados revelaron el efecto inhibidor de aneurismas del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) (figura. 16). Por tanto los inventores completaron la presente invención.
La presente invención soluciona los problemas anteriores. La presente invención proporciona un anticuerpo contra una isoforma de periostina tal como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas, que tiene actividad de adhesión celular que se expresa específicamente en diversos estados asociados a inflamación incluyendo cánceres. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo tal como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas para tratar diversas enfermedades asociadas a inflamación, incluyendo cánceres, comprendiendo la composición un anticuerpo que reconoce el sitio de corte y empalme de la isoforma de periostina como antígeno.
Es decir, la presente invención incluye lo siguiente.
(1) Un anticuerpo que se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 para su uso en la prevención o el tratamiento, a través de la inhibición de una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, de una enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada la isoforma de periostina, en el que la enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada la isoforma de periostina es una enfermedad seleccionada de esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, periodontosis, dermatitis atópica, asma, retinopatía diabética, arteriosclerosis, enterocolitis inflamatoria, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma, aneurisma y osteoartritis.
(2) Un anticuerpo que se une específicamente a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, y un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. (3) El anticuerpo según lo anterior (1) o (2), que reconoce específicamente una región relacionada con la actividad de adhesión celular de una isoterma de periostina que tiene actividad de adhesión celular y neutraliza la actividad de adhesión celular de la isoterma de periostina.
(4) El anticuerpo según uno cualquiera de los anteriores (1) a (3), que es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
(5) El anticuerpo según lo anterior (4), que es un anticuerpo monoclonal.
(6) El anticuerpo según lo anterior (5), que se produce por una línea celular de hibridoma designada como NITE BP-01546.
(7) Un fragmento de anticuerpo que consiste en un fragmento parcial del anticuerpo monoclonal según lo anterior (5) o (6).
(8) Un derivado de anticuerpo que comprende una proteína o fármaco de bajo peso molecular unidos al anticuerpo según uno cualquiera de los anteriores (1) a (6) o al fragmento de anticuerpo según lo anterior (7).
(9) También se da a conocer en el presente documento, aunque no está comprendido en las reivindicaciones, un hibridoma que produce el anticuerpo según uno cualquiera de los anteriores (1) a (5), y
(10) una línea celular de hibridoma designada como NITE BP-01546.
(11) También se da a conocer en el presente documento, aunque no está comprendido en las reivindicaciones, un método para producir el anticuerpo según lo anterior (4), comprendiendo el método
inmunizar un mamífero no humano con un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, o el péptido que tiene un residuo de Cys añadido al extremo N-terminal,
fusionar una célula productora de anticuerpos del animal con una célula de mieloma para formar un hibridoma y cultivar el hibridoma.
(12) El método de producción según lo anterior (11), en el que el hibridoma es una línea celular de hibridoma designada como NITE BP-01546.
(13) También se da a conocer en el presente documento una composición farmacéutica para inhibir una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, comprendiendo la composición el anticuerpo según uno cualquiera de los anteriores (1) a (6), el fragmento de anticuerpo según lo anterior (7) o el derivado de anticuerpo según lo anterior (8), y
(14) una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, comprendiendo la composición el anticuerpo según uno cualquiera de los anteriores (1) a (6), el fragmento de anticuerpo según lo anterior (7) o el derivado de anticuerpo según lo anterior (8), así como
(15) una composición farmacéutica para inhibir la hiperplasia de la íntima vascular en la que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, tratar un cáncer en el que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, inhibir la angiogénesis en la que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, o prevenir o tratar aneurisma en el que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, comprendiendo la composición el anticuerpo según uno cualquiera de los anteriores (1) a (6), el fragmento de anticuerpo según lo anterior (7) o el derivado de anticuerpo según lo anterior (8).
(16) Se da a conocer en el presente documento, aunque no está comprendido en las reivindicaciones, un método para detectar o cuantificar una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular en una muestra biológica usando el anticuerpo según uno cualquiera de los anteriores (1) a (6), el fragmento de anticuerpo según lo anterior (7) o el derivado de anticuerpo según lo anterior (8).
El término “una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: XX” en el presente documento incluye una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: XX que tiene deleción, sustitución o adición de uno a varios aminoácidos. El término “varios” significa habitualmente de 2 a 8, preferiblemente de 2 a 5, más preferiblemente de 2 a 3.
Efectos ventajosos de invención
Un inhibidor de una isoterma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, comprendiendo el inhibidor el anticuerpo de la presente invención, se usa para inhibir una variante de periostina particular altamente expresada en hiperplasia de la íntima vascular, cánceres, inflamaciones incluyendo colitis inflamatoria, enfermedades acompañadas de angiogénesis, o similares, inhibiendo de ese modo la exacerbación de los estados de las enfermedades y tratando las enfermedades. El anticuerpo también puede usarse para la medición de la cantidad de tal variante de periostina en una muestra de un paciente para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad y la progresión de los estados patológicos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una vista esquemática que muestra variantes de corte y empalme de periostina de ratón.
La figura 2 es un gráfico que muestra los resultados del ensayo de las propiedades de adhesión celular de las proteínas PN-2 y PN-4 de rata en el ejemplo 1.
Las figuras 3A y 3B son imágenes y un gráfico que muestra los resultados del estudio en el ejemplo 4. Las imágenes y el gráfico indican que la proteína PN-2 de ratón promueve la adhesión de células THP-1 e induce diferenciación en macrófagos, mientras que un anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata inhibe la adhesión de células THP-1 e inhibe la diferenciación en macrófagos.
Las figuras 4A y 4B son un gráfico e imágenes que muestran los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor de la hiperplasia de la neoíntima del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata en un modelo de lesión con balón de la arteria carótida de rata en el ejemplo 7.
La figura 5 es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor de la arteriosclerosis del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata en un modelo de ratón arteriosclerosis ApoE KO en el ejemplo 8.
La figura 6 es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor de la inflamación de un anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano en un modelo de colitis de ratón en el ejemplo 9.
La figura 7A es un gráfico que muestra el momento de la administración de un anticuerpo en el ejemplo 10. La figura 7B es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor de la angiogénesis del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata en un modelo de arteriosclerosis obliterante en el ejemplo 10.
La figura 8 es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor de la angiogénesis del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata en un modelo de arteriosclerosis obliterante en el ejemplo 10.
La figura 9 es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor de la angiogénesis del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano en un modelo de arteriosclerosis obliterante en el ejemplo 10.
Las figuras 10A y 10B son imágenes y un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor de la angiogénesis del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata y el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano en un modelo de angiogénesis Matrigel usando células endoteliales humanas en el ejemplo 11. En el gráfico, el término “simulado” indica un grupo de tratamiento simulado.
Las figuras 11A y 11B son imágenes y un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor de la angiogénesis del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata y el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano en un modelo de angiogénesis Matrigel usando células endoteliales humanas en el ejemplo 11. En el gráfico, el término “simulado” indica un grupo de tratamiento simulado.
La figura 12A es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre efecto inhibidor de la proliferación de células cancerosas del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata en células de cáncer de mama 4T1 de ratón en el ejemplo 12. La figura 12B es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto de inducción de necrosis del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano en células de cáncer de mama 4T1 de ratón en el ejemplo 11.
La figura 13A es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata usando ratones modelo de metástasis pulmonar de células de cáncer de mama 4T1 de ratón en el ejemplo 13 (inyección de células de cáncer de mama 4T 1 de ratón, seguido por la medición del volumen de los tumores primarios en las extremidades inferiores tres semanas después de la inyección). La figura 13B es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata usando ratones modelo de metástasis pulmonar de células de cáncer de mama 4T1 de ratón en el ejemplo 13 (inyección de células de cáncer de mama 4T1 de ratón, seguido por el recuento de colonias metastásicas cinco semanas después de la inyección).
La figura 14 es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano usando ratones modelo de metástasis pulmonar de células de cáncer de mama 4T1 de ratón en el ejemplo 13 (inyección de células de cáncer de mama 4T1 de ratón, seguido por el recuento de colonias metastásicas cinco semanas después de la inyección).
La figura 15A es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata usando ratones modelo de metástasis pulmonar de células B16-F10 de melanoma de ratón en el ejemplo 14 (inyección de células de melanoma de ratón, seguido por la medición del volumen de los tumores primarios tres semanas después de la inyección). La figura 15B es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata usando ratones modelo de metástasis pulmonar de células B16-F10 de melanoma de ratón en el ejemplo 14 (inyección de células de melanoma de ratón, seguido por el recuento de colonias metastásicas cinco semanas después de la inyección).
La figura 16 es un gráfico que muestra los resultados del estudio sobre el efecto inhibidor del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano sobre la expansión del diámetro de la aorta en un modelo de aneurisma en el ejemplo 15.
Descripción de realizaciones
Una realización de la presente invención proporciona un anticuerpo contra una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular. La periostina es una de las proteínas de la matriz extracelular y se conocen varias variantes de corte y empalme de periostina. Algunas de las variantes de corte y empalme de periostina se expresan específicamente en estados de cáncer, etc. En general, los anticuerpos son altamente específicos, son seguros para los seres humanos y tienen otras ventajas, y por lo tanto, en la presente invención, un anticuerpo puede usarse como una sustancia para la inhibición (es decir, un inhibidor de fármacos) contra las funciones de las variantes de empalme de periostina específicamente expresadas en cáncer condiciones, etc. En la presente invención, puede producirse un anticuerpo usando, como antígeno, un péptido químicamente sintetizado que consiste en la secuencia de aminoácidos codificada por el exón-21 en el dominio C-terminal de la cual se derivan variantes de corte y empalme específicas para estados cancerosos y similares. Sin embargo, un péptido de este tipo también puede producirse por digestión enzimática de proteínas periostina o por técnicas de ingeniería genética, y el origen no está particularmente limitado.
El término “que tiene actividad de adhesión celular” en el presente documento significa la posesión de actividad promotora de la adhesión celular. Una investigación para determinar si una proteína tiene actividad de adhesión celular puede realizarse tal como sigue. Se coloca una muestra de 10 |ig/ml en una placa de Petri para permitir que una proteína se adhiera a la superficie durante la noche. Entonces se añaden células cultivadas, tales como fibroblastos cardíacos, a la placa. De tres a seis horas más tarde, la placa se lava y se eliminan las células desprendidas. Las células restantes están teñidas. Se examina el estado de las células adherentes restantes.
En la presente invención, la isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular no está particularmente limitada, pero se prefiere una isoforma de periostina que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (periostina de rata PN-2, 811 aminoácidos), una isoforma de periostina que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (periostina de ratón PN-2, 811 aminoácidos), una isoforma de periostina que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (periostina humana PN-2, 809 aminoácidos), que se predice fácilmente que tiene actividad de adhesión dado que la secuencia de aminoácidos de la periostina humana es casi idéntica a la de las periostinas de ratón y rata, una variante de corte y empalme de periostina que tiene los aminoácidos que constituyen el péptido codificante del exón-21 pero que carece de los aminoácidos que constituyen el péptido codificante del exón-17, etc.
Las isoformas de periostina que tienen actividad de adhesión celular incluyen isoformas de periostina que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (28 aminoácidos codificados por el exón-21 de periostina de rata), SEQ ID NO: 17 (28 aminoácidos codificados por el exón-21 de periostina de ratón) o SEQ ID NO: 18 (28 aminoácidos codificados por el exón-21 de periostina humana).
Las isoformas de periostina que pueden servir como epítopo para un anticuerpo incluyen una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (6 aminoácidos en las posiciones 2 a 7 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos codificada por el exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18)), una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (7 aminoácidos en las posiciones 17 a 23 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos codificada por el exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18)), una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (5 aminoácidos en las posiciones 3 a 7 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos codificada por el exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18)), una isoforma de periostina que tiene una secuencia de 8 aminoácidos de SEQ ID NO: 22 que consiste en 2 aminoácidos en las posiciones 27 y 28 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos codificada por el exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18) y los 6 aminoácidos posteriores, etc.
Las regiones responsables de la actividad de adhesión celular de la periostina incluyen, por ejemplo, el exón-21. Los ejemplos específicos de las regiones incluyen los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 que representa una porción de una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (los aminoácidos en las posiciones 758 a 785 de SEQ ID NO: 3), los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 que representa una porción de una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (los aminoácidos en las posiciones 758 a 785 de SEQ ID NO: 9), los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 que representa una porción de una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (los aminoácidos en las posiciones 756 a 783 de SEQ ID NO: 13), etc.
En una realización preferida de la presente invención, la frase “reconoce específicamente un sitio implicado en la adhesión celular” significa reconocer específicamente una región relacionada con la adhesión celular preferiblemente de una isoforma de periostina que contiene el exón-21. Los anticuerpos preferidos que reconocen específicamente un sitio implicado en la actividad de adhesión celular de una isoforma de periostina incluyen, por ejemplo, anticuerpos contra los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 que representa una porción de una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (los aminoácidos en las posiciones 758 a 785 de SEQ ID NO: 3), los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 que representa una porción de una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (los aminoácidos en las posiciones 758 a 785 de SEQ ID NO: 9), los residuos de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 que representa una porción de una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (los aminoácidos en las posiciones 756 a 783 de SEQ ID NO: 13), o parte de cualquiera de los residuos de aminoácidos. Los ejemplos adicionales de los anticuerpos incluyen anticuerpos contra un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, o parte de las secuencias de aminoácidos.
La frase “inhibe una región implicada en la actividad de adhesión celular de la periostina” significa la inhibición del efecto o la actividad de la “región implicada en la actividad de adhesión celular de la periostina” descrita anteriormente. En particular, por ejemplo, la frase significa la inhibición del efecto o la actividad de la periostina usando el anticuerpo descrito anteriormente que reconoce específicamente un sitio implicado en la actividad de adhesión celular.
En una realización, el anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal producido usando cualquiera de los antígenos descritos anteriormente. El término “anticuerpo monoclonal” en el presente documento se refiere a cualquier anticuerpo monoclonal reactivo contra cualquiera de los antígenos descritos anteriormente. El “anticuerpo monoclonal” incluye anticuerpos naturales producidos inmunizando mamíferos tales como ratones, ratas, hámsteres, cobayas y conejos con cualquiera de los antígenos; anticuerpos que pueden producirse usando técnicas de recombinación genética, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos (anticuerpos quiméricos) y anticuerpos monoclonales humanizados (anticuerpos humanizados, es decir, anticuerpos con injerto de CDR); y anticuerpos monoclonales humanos (anticuerpos humanos) que pueden producirse usando animales transgénicos productores de anticuerpos humanos o similares. El anticuerpo de la presente invención incluye anticuerpos monoclonales de cualquier isotipo, tales como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE. El anticuerpo de la presente invención es preferiblemente IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) o IgM.
Cuando cualquiera de los péptidos descritos anteriormente va a usarse como antígeno, el péptido puede usarse solo como antígeno. Alternativamente, para aumentar su antigenicidad, el péptido puede adsorberse a un material macromolecular tal como polivinilpirrolidona, látex y poli(metacrilato de metilo) y usarse para su inmunización, o puede conjugarse con una proteína portadora tal como KLH (hemocianina de lapa californiana ) y BSA (albúmina sérica bovina), y puede usarse cualquier método para aumentar la antigenicidad. Por lo general, el péptido se conjuga preferiblemente con una proteína portadora por métodos conocidos (por ejemplo, véase “Zoku Iyakuhin no Kaihatsu, vol. 14, Hirokawa-Soten Ltd., 1991”).
Para la conjugación direccional del péptido con una proteína portadora, se añade un residuo de cisteína al extremo C-o N-terminal del péptido, y por medio del residuo de cisteína, el péptido se conjuga con la proteína portadora. Siempre que se logre la conjugación adecuada para este propósito, puede usarse cualquier agente de reticulación comúnmente usado en la técnica. Los agentes de reticulación adecuados incluyen ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometilo) (a continuación en el presente documento abreviado como “SMCC”), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-maleimidobenzoico (MBS), etc. El anticuerpo monoclonal se produce generando un hibridoma por el método de fusión celular de Kohler y Milstein (G. Kohler et al Nature (1975) 256, 495-7), cultivando el hibridoma para permitir que el hibridoma secrete un anticuerpo y aislando el anticuerpo del cultivo. En particular, un mamífero se inmuniza con un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el exón-21 o similar y entonces las células productoras de anticuerpos del animal se fusionan con células de mieloma para generar un hibridoma. El examen para detectar un hibridoma que produce un anticuerpo que se une al exón-21 se realiza mediante, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (a continuación en el presente documento abreviado como “ELISA”) sobre el sobrenadante del hibridoma usando una microplaca sobre la que se ha inmovilizado el antígeno.
El animal que va a inmunizarse no está particularmente limitado, e incluye diversos mamíferos tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, ovejas, cabras, gatos, perros, etc. De los animales enumerados para la inmunización, se usan generalmente ratones Balb/c para la producción de anticuerpos monoclonales debido a la facilidad de manejo u otras ventajas, pero también pueden usarse otras variedades de ratones. La concentración del antígeno usado para la inmunización se determina de modo que se produzca una cantidad suficiente de linfocitos estimulados antigénicamente. Preferiblemente, se diluyen de 1 a 100 |ig de antígeno hasta una concentración apropiada en solución salina fisiológica o similar, se suspenden en adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund o similares, y se administran a un animal por inyección intraperitoneal o subcutánea u otros medios. La administración se realiza de una vez a varias veces en intervalos de 2 a 4 semanas. La inmunización final se realiza normalmente administrando una disolución de 1 a 100 |ig del antígeno en solución salina fisiológica mediante inyección intravenosa o subcutánea u otros medios. Varios días después de la inmunización final, se recogen células productoras de anticuerpos tales como linfocitos, preferiblemente células del bazo o células de los ganglios linfáticos del animal inmunizado para la fusión celular.
A continuación se explicará la fusión celular usando células del bazo como células productoras de anticuerpos, pero también pueden usarse células productoras de anticuerpos distintas de las células del bazo para la fusión celular. Se fusionan células del bazo preparado de manera aséptica de 3 a 4 días después de la inmunización final con células de mieloma apropiadas en presencia de un promotor de la fusión. Las células de mieloma usadas para la fusión pueden ser células de mieloma siempre que se deriven de mamíferos, pero generalmente se prefieren aquellas derivadas de la misma especie que el animal usado para la inmunización. Ya se conocen diversas líneas celulares. Por ejemplo, líneas celulares preferidas usadas para ratones son SP2/0-Ag14 (SP2) [Nature, 276, 269 (1978)], NS-1-Ag4/1 (NS-1), P3-X63Ag8U.1 (P3U1) [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1-7 (1978), disponibles de la ATCC con el n.° de la ATCC CRL-1597], P3-NS1-1-Ag4-1, P3-X63Ag8 (P3), FO, X63Ag8.653 (X63.653), 210.RCY3.Ag1.2.3, S194/5XXO.BUl, SKO-007, GM15006TG-A12, etc. Líneas celulares preferidas usadas para ratas son Y3.Ag1.2.3, etc. Los promotores de la fusión preferidos incluyen polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular de 1.000 a 6.000 y virus Sendai. Generalmente, la proporción de células del bazo y células de mieloma para la fusión celular es preferiblemente de 10:1 a 2:1.
Los hibridomas pueden separarse de las células fusionadas cultivando una mezcla de células del bazo no fusionadas, células de mieloma no fusionadas y células fusionadas en un medio selectivo que inhibe la supervivencia de las células de mieloma no fusionadas durante un período de tiempo apropiado hasta que las células no fusionadas mueran (aproximadamente 1 semana). El medio selectivo puede ser, por ejemplo, medio HAT (un medio que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). En este medio selectivo, las células de mieloma no fusionadas mueren, y las células no tumorales, es decir, las células del bazo no fusionadas mueren después de un cierto período de tiempo (después de aproximadamente 1 semana), como resultado de lo cual se seleccionan hibridomas como células viables. Los hibridomas pueden someterse a dilución limitante convencional para el examen para seleccionar una cepa que produce el anticuerpo deseado y para la clonación de la cepa. El hibridoma así obtenido que produce un anticuerpo monoclonal de la presente invención puede hacerse crecer en medio adecuado para el crecimiento y puede almacenarse fácilmente en un congelador profundo o nitrógeno líquido durante un largo período de tiempo.
El hibridoma así obtenido puede hacerse crecer en medio nutriente o en la cavidad abdominal de un mamífero para la producción de anticuerpos. Los anticuerpos producidos pueden purificarse a partir del sobrenadante de cultivo o de la ascitis o el suero del mamífero.
Como hibridoma de la presente invención, puede usarse un hibridoma que se depositó internacionalmente ante la Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary (NPMD) fecha de depósito: 26 de febrero de 2013, n.° de registro: NITE BP-01546, referencia de identificación: KS-0259#8, 080611 Kohjin Bio).
La purificación de los anticuerpos puede realizarse por métodos convencionales de aislamiento/purificación tales como centrifugación, diálisis, precipitación con sales con sulfato de amonio o similares, cromatografía de intercambio iónico usando una columna de DEAE o similar, filtración en gel, cromatografía de afinidad, etc.
La determinación de isotipo y subclase del anticuerpo monoclonal así obtenido puede realizarse mediante un método de identificación tal como el método de Ouchterlony, ELISA y RIA. El método de Ouchterlony es conveniente, pero requiere la condensación del anticuerpo monoclonal cuando la concentración es baja. Cuando se usa ELISA o RIA, el isotipo y subclase del anticuerpo monoclonal pueden identificarse por reacción directa del sobrenadante de cultivo con una fase sólida con antígeno absorbido, seguido por reacción con anticuerpos contra diferentes isotipos de inmunoglobulina y subclases como anticuerpos secundarios. Más convenientemente, pueden usarse kits de identificación disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit Mouse Typer (Bio-Rad)) o similares. La cuantificación de proteínas puede realizarse por el método de Folin-Lowry o por cálculo a partir de la absorbancia a 280 nm [1,4 (DO 280) = 1 mg/ml de inmunoglobulina].
El anticuerpo monoclonal así obtenido de la presente invención reconoce específicamente una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 13 (PN-2); una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18; una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20; un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18; o un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20. Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal de la presente invención reconoce y se une específicamente a un péptido (SEQ ID NO: 19) que consiste en los residuos de aminoácidos desde valina (V) en la posición 2 hasta lisina (K) en la posición 7 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18), y un péptido (SEQ ID NO: 20) que consiste en los residuos de aminoácidos desde fenilalanina (F) en la posición 17 hasta lisina (K) en la posición 23 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18). Es decir, el anticuerpo monoclonal de la presente invención reconoce específicamente la secuencia de aminoácidos VTKVTK (SEQ ID NO: 19) que consiste en los residuos de aminoácidos desde la valina en la posición 2 hasta la lisina en la posición 7 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18), la secuencia de aminoácidos FEDEEIK (SEQ ID NO: 20) que consiste en los residuos de aminoácidos desde fenilalanina (F) en la posición 17 hasta lisina (K) en la posición 23 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18), o parte de las secuencias de aminoácidos.
El anticuerpo monoclonal de la presente invención inhibe o previene las propiedades de adhesión celular de la proteína periostina-1 humana, es decir, el anticuerpo monoclonal tiene la actividad de neutralizar las propiedades de adhesión celular de la proteína periostina-1 humana. El anticuerpo monoclonal de la presente invención también inhibe la invasión, las inflamaciones y la angiogénesis en estados cancerosos o similares, y previene o trata enfermedades asociadas a la inflamación.
Cuando se usa un anticuerpo policlonal como anticuerpo de la presente invención, el anticuerpo policlonal puede producirse mediante métodos convencionales tales como el descrito en “Shin Seikagaku Jikken Koza, vol. 12, editado por la Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dozin Co. Ltd., 1992”.
El animal que va a inmunizarse no está particularmente limitado, e incluye caballos, cabras, ovejas, conejos, cobayas, ratones, pollos, etc. Cuando va a inmunizarse un conejo, se diluye un antígeno hasta una concentración apropiada en solución salina fisiológica o similar y se suspende en adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, adyuvante de hidróxido de aluminio, o similares, y se inyecta a una dosis de 10 a 1.000 |ig/animal por inyección, seguido por 1 a 3 inyecciones de refuerzo 2 a 4 semanas después de la inmunización para administrar los antisueros. Se prefiere la inyección subcutánea en múltiples sitios. La preparación de anticuerpos policlonales a partir de antisueros puede realizarse de la misma manera que la descrita para la purificación del anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo policlonal así obtenido de la presente invención reconoce específicamente una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 13 (PN-2); una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18; una isoforma de periostina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20; un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 18; o un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20. Preferiblemente, el anticuerpo policlonal de la presente invención reconoce y se une específicamente a un péptido (SEQ ID NO: 19) que consiste en los residuos de aminoácidos desde la lisina (K) en la posición 7 hasta la glicina (G) en la posición 11 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18), y un péptido (SEQ ID NO: 20) que consiste en los residuos de aminoácidos desde la lisina (K) en la posición 23 hasta la leucina (L) en la posición 26 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18). El anticuerpo policlonal del presente invención reconoce específicamente la secuencia de aminoácidos TKVTK (SEQ ID NO: 21) que consiste en los residuos de aminoácidos desde la posición 3 hasta la posición 7 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18), la secuencia de aminoácidos QGDTPVRK (SEQ ID NO: 22) que consiste en los residuos de aminoácidos en las posiciones 27 y 28 desde el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18) y los 6 aminoácidos posteriores, o parte de las secuencias de aminoácidos.
El anticuerpo policlonal de la presente invención inhibe o previene las propiedades de adhesión celular de la proteína periostina-1 humana, es decir, el anticuerpo policlonal tiene la actividad de neutralizar las propiedades de adhesión celular de la proteína periostina-1 humana. El anticuerpo policlonal de la presente invención también inhibe la invasión, las inflamaciones y la angiogénesis en estados cancerosos o similares, y previene o trata enfermedades asociadas a inflamación.
La presente invención también proporciona una composición para inhibir la hiperplasia de la íntima vascular, tratar un cáncer o inhibir la angiogénesis, comprendiendo la composición un anticuerpo anti-periostina que reconoce una variante de corte y empalme de periostina que tiene propiedades de adhesión celular.
Producción de anticuerpos humanizados
La inmunoglobulina G (a continuación en el presente documento simplemente denominada “IgG”) consiste en dos cadenas polipeptídicas ligeras que tienen un peso molecular de aproximadamente 23.000 (a continuación en el presente documento denominadas “cadenas ligeras”) y dos cadenas polipeptídicas pesadas que tienen un peso molecular de aproximadamente 50.000 (a continuación en el presente documento denominadas “cadenas pesadas”). Las cadenas pesadas y ligeras tienen ambas unidades de repetición de una secuencia de aminoácidos conservada de aproximadamente 110 residuos, y estas unidades son los elementos básicos de la estructura tridimensional de IgG (a continuación en el presente documento denominados “dominios”). Las cadenas pesadas y ligeras consisten en 4 y 2 dominios sucesivos, respectivamente. Los dominios amino-terminales de las cadenas pesadas y ligeras son más variables en la secuencia de aminoácidos entre moléculas de anticuerpos que otros dominios y, por tanto, los dominios amino-terminales se denominan dominios variables (a continuación en el presente documento denominados “dominios V”). En cada dominio amino-terminal de IgG, el dominio V de la cadena pesada y el dominio V de la cadena ligera se asocian complementariamente para formar una región variable. Los dominios restantes forman colectivamente una región constante. La secuencia de la región constante es divergente entre especies animales. Por ejemplo, la región constante de la IgG de ratón difiere de la región constante de la IgG humana y, por tanto, la IgG de ratón se reconoce como un cuerpo extraño por el sistema inmunitario humano, dando como resultado una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (a continuación en el presente documento denominada “HAMA”) (Schroff Rw . et al. Cancer Res. (1985) 45, 879-85). Los anticuerpos de ratón por tanto no pueden administrarse repetidamente a los seres humanos. Con el fin de administrar tales anticuerpos a los seres humanos, las moléculas de anticuerpos deben modificarse para prevenir una respuesta de HAMA manteniendo al mismo tiempo la especificidad de los anticuerpos.
Según los resultados del análisis estructural de cristales de rayos X, los dominios están generalmente en forma de una estructura cilíndrica larga constituida por un apilamiento de dos láminas beta antiparalelas que consisten en 3 a 5 cadenas beta. En cuanto a la región variable, se ensamblan tres bucles para formar un sitio de unión a antígeno en cada uno de los dominios V de las cadenas pesadas y ligeras. Estos bucles se denominan regiones determinantes de complementariedad (a continuación en el presente documento denominadas “CDR”), que son las más variables en la secuencia de aminoácidos. Las partes restantes de la región variable distintas de las CDR sirven para mantener las estructuras de las CDR y se denominan “región de marco”. Kabatt et al. recogieron un gran número de las secuencias primarias de regiones variables de cadena pesada y ligera, y proporcionaron una tabla en la que las secuencias primarias se clasificaban en CDR y regiones de marco basándose en la conservación de secuencias (Kabatt et al. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5a edición, publicación de los NIH, n.° 91-3242, E.A.).
Las regiones de marco se clasificaron además en una pluralidad de subgrupos basándose en patrones compartidos de secuencias de aminoácidos. También se encontró la existencia de una región de marco de consenso entre el ser humano y el ratón. Tales estudios sobre los rasgos estructurales de IgG condujeron al desarrollo de los métodos para producir anticuerpos humanizados que se describen a continuación. En una fase temprana de los estudios, se propusieron anticuerpos quiméricos que tenían una región variable de un anticuerpo de ratón fusionada a una región constante de un anticuerpo humano (Morrison SL. et al Proc Natl Acad Sci U S A. (1984) 81,6851-5). Sin embargo, dado que tales anticuerpos quiméricos todavía contienen muchos residuos de aminoácidos no humanos, los anticuerpos pueden inducir una respuesta de HAMA, especialmente cuando se administran a largo plazo (Begent et al., Br. J. Cancer, (1990) 62, 487).
Se propuso un método para reducir además los residuos de aminoácidos derivados de un mamífero no humano que pueden inducir una respuesta de HAMA en seres humanos, y el método implicaba injertar únicamente las CDR en un anticuerpo humano (Peter T et al. Nature, (1986) 321, 522-5). Sin embargo, el injerto de solo las CDR era normalmente insuficiente para presentar actividad de inmunoglobulina contra un antígeno. En 1987, Chothia et al. usaron datos de análisis estructural de cristales de rayos X para encontrar lo siguiente: (a) las secuencias de aminoácidos de las CDR contienen los sitios que se unen directamente a un antígeno y los sitios que mantienen las estructuras de las CDR, y las posibles estructuras tridimensionales de las CDR se clasifican en varios patrones típicos (estructuras canónicas); y (b) las clases de estructuras canónicas están determinadas no solo por las CDR sino también por los tipos de los aminoácidos ubicados en posiciones específicas de la región de marco (Chothia C. et al. J. Mol. Biol. (1987) 196, 901­ 17). Estos hallazgos sugirieron que, cuando se realiza el injerto de CDR, parte de los residuos de aminoácidos en la región de marco también deben injertarse en un anticuerpo humano además de las secuencias de CDR (documento JP 4-502408 T).
Un anticuerpo de mamífero no humano que tiene una(s) CDR que va(n) a injertarse en un anticuerpo humano se define en general como “donador”, y el anticuerpo humano en el que va(n) a injertarse la(s) CDR se define como “aceptor”. En el injerto de CDR, la(s) estructura(s) de la(s) CDR debe(n) conservarse tanto como sea posible para garantizar la retención de la actividad de la molécula de inmunoglobulina. Para lograr esto, los puntos clave a tener en cuenta son: (a) de qué subgrupo debe seleccionarse el aceptador, y (b) qué residuos de aminoácidos deben seleccionarse de la región de marco donadora.
Queen et al. propusieron un método para diseñar un anticuerpo humanizado, que implicaba injertar los residuos de aminoácidos de una región de marco donadora junto con las secuencias de CDR en un aceptor, con la condición de que los residuos de aminoácidos de la región de marco donadora satisfagan al menos uno de los siguientes criterios (documento JP 4-502408 T):
(a) los aminoácidos que van a sustituirse son poco comunes para sus posiciones en la región de marco aceptora, y los aminoácidos correspondientes del donador son comunes para sus posiciones en la región de marco aceptora;
(b) los aminoácidos son inmediatamente adyacentes a una de las CDR; y
(c) se predice que los aminoácidos tienen un átomo de cadena lateral dentro de aproximadamente 3 angstroms de las CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional y que son capaces de interaccionar con un antígeno o con las CDR del anticuerpo humanizado.
El ADN que codifica para la cadena pesada o ligera de un anticuerpo monoclonal anti-exón-21 de la presente invención puede producirse mediante la preparación de ARNm a partir de células de hibridoma que producen el anticuerpo monoclonal anti-exón-21, convirtiendo el ARNm en ADNc con una transcriptasa inversa y aislando el ADN que codifica para la cadena pesada o ligera del anticuerpo.
Producción de anticuerpos humanos
El término “anticuerpo humano” o “inmunoglobulina humana” en el presente documento significa una inmunoglobulina en la que sus regiones constituyentes, incluidas las regiones variables de cadena pesada (VH) y las regiones constantes de cadena pesada (CH), así como las regiones variables de cadena ligera (VL) y las regiones constantes de cadena ligera (CL), se derivan todas de un gen que codifica para una inmunoglobulina humana. En otras palabras, el término significa un anticuerpo en el que las cadenas pesadas se derivan de un gen de cadena pesada de inmunoglobulina humana y las cadenas ligeras se derivan de un gen de cadena ligera de inmunoglobulina humana.
Un anticuerpo humano puede producir por métodos convencionales. Por ejemplo, al menos un gen de inmunoglobulina humana se integra en un locus del gen de un mamífero no humano tal como un ratón para generar un animal transgénico, y el animal transgénico se inmuniza con un antígeno, seguido por los mismos procedimientos descritos anteriormente para la producción de anticuerpos monoclonales. Pueden generarse ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos, por ejemplo, por los métodos descritos en documentos anteriores (Mendez MJ et al. Nature Genetics (1997) 15, 146-56; Green LL et al. Nature Genetics (1994) 7, 13-21; documento JP 4-504365 T; documento WO 94/25585; Nikkei Science, June, pp. 40-50, 1995; Nils Lonberg et al. Nature (1994) 368, 856-9; y documento JP 6-500233 T).
El anticuerpo usado en la presente invención no se limita a la molécula de anticuerpo completa y puede ser un fragmento o derivado de anticuerpo siempre que el fragmento o derivado neutralice la actividad de una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular.
El fragmento de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un Fab, un F(ab')2, Fv, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo estabilizado por disulfuro (dsFv), un péptido que contiene CDR, o similares.
El fragmento de anticuerpo Fab, F(ab')2, o similar de la presente invención puede producirse tratando un anticuerpo que inhibe la actividad de adhesión celular de periostina con una proteasa tal como papaína o pepsina o, alternativamente, puede producirse construyendo un gen que codifica para el fragmento de anticuerpo e introduciendo el constructo en un vector de expresión, seguido por la expresión en una célula huésped apropiada.
El fragmento de anticuerpo scFv de la presente invención puede producirse uniendo una región V de cadena H con una región V de cadena L de un anticuerpo que inhibe la actividad de adhesión celular de periostina por medio de un ligador peptídico apropiado, etc. Alternativamente, el scFv puede producirse construyendo segmentos de ADN que codifican las secuencias completas o secuencias de aminoácidos deseadas de genes que codifican la cadena H o la región V de cadena H y que codifican la cadena L o la región V de cadena L del anticuerpo, e introducen los constructos en un vector de expresión, seguido por expresión en una célula huésped apropiada.
El fragmento de anticuerpo dsFv de la presente invención es un fragmento de anticuerpo producido preparando la región V de cadena H y la región V de cadena L de un anticuerpo que inhibe la actividad de adhesión celular de periostina, sometiendo las regiones a sustitución de un residuo de aminoácido por un residuo de cisteína para dar dos polipéptidos modificados y uniendo los polipéptidos entre los residuos de cisteína mediante una unión disulfuro. El residuo de aminoácido que va a sustituirse por un residuo de cisteína puede seleccionarse usando predicción de la estructura proteica del anticuerpo. Alternativamente, el dsFv puede producirse construyendo un segmento de ADN que codifica para la secuencia completa o la secuencia de aminoácidos deseada de un gen que codifica el fragmento de anticuerpo, e introduciendo el constructo en un vector de expresión, seguido por expresión en una célula huésped apropiada.
El fragmento de anticuerpo de péptido que contiene CDR de la presente invención se produce de modo que comprenden al menos una o más regiones CDR seleccionadas de las regiones CDR en las cadenas H o L de un anticuerpo que inhibe la actividad de adhesión celular de periostina. Alternativamente, varias regiones CDR pueden unirse por técnicas usando un ligador peptídico apropiado o similares. El péptido que contiene CDR también puede producirse construyendo un segmento de ADN que codifica toda la secuencia o secuencia de aminoácidos deseada de un gen que codifica el péptido, e introduciendo el constructo en un vector de expresión, seguido por expresión en una célula huésped apropiada. Alternativamente, el péptido que contiene CDR también puede producirse mediante síntesis química tal como el método de Fmoc o tBoc.
En la presente invención, también puede usarse un derivado que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo anterior unido a una proteína o a un compuesto de bajo peso molecular. Tal modificación puede lograrse por técnicas conocidas.
Un ADN que codifica el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o su derivado unido a proteína de la presente invención puede determinarse por un método convencional. El ADN puede usarse para producir un vector recombinante que contiene el ADN por un método convencional, y el vector recombinante puede introducirse en una célula huésped por un método convencional para dar un transformante. El transformante puede cultivarse por un método convencional para producir el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o su derivado unido a proteína en el cultivo. A partir del cultivo, pueden recogerse el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o su derivado unido a proteína. De esta manera, pueden producirse el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y su derivado unido a proteína.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo de la presente invención se usa para prevenir o tratar enfermedades asociadas a inflamación en las que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, tal como se especifica en la reivindicaciones adjuntas.
Mientras que el término “enfermedades asociadas a inflamación en las que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular” se refiere a enfermedades durante las que el gen de una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular está altamente expresado y durante las que la producción de la isoforma de proteína codificada por el gen está aumentada, y aunque el término también se refiere a enfermedades cuya patología se ve agravada por un aumento en la expresión génica o proteica, la presente invención se refiere a las enfermedades enumeradas en las reivindicaciones adjuntas.
Las enfermedades asociadas a inflamación en las que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular incluyen enfermedades cuya causa principal es hiperplasia de la íntima vascular, cánceres y otras enfermedades asociadas a inflamación. Los ejemplos de las enfermedades cuya causa principal es hiperplasia de la íntima vascular incluyen arteriosclerosis, reestenosis provocada principalmente por hiperplasia de la íntima vascular observada después de angioplastia coronaria, etc. Los cánceres a los que puede aplicarse el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo de la presente invención incluyen cáncer de mama, melanoma, cáncer de pulmón. Otras enfermedades asociadas a inflamación incluyen dermatitis atópica, asma, esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enterocolitis inflamatoria, arteriosclerosis, osteoartritis, retinopatía diabética, periodontosis, aneurisma, etc. La angiogénesis está implicada en muchas de las enfermedades asociadas a inflamación anteriores.
También se da a conocer en el presente documento pero no está comprendido en las reivindicaciones un reactivo de diagnóstico para enfermedades asociadas a inflamación en las que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, produciéndose el reactivo de diagnóstico marcando cualquiera de los anticuerpos anteriores con un marcador. El marcador no está particularmente limitado y ejemplos del mismo incluyen enzimas, radioisótopos, colorantes fluorescentes, etc. Las enzimas usadas en el presente documento no están particularmente limitadas siempre que satisfagan ciertas condiciones, tales como tener un alto número de recambio, permanecer estables incluso después de la conjugación y reaccionar específicamente con sus sustratos para desarrollar color, etc. Pueden usarse enzimas usadas en inmunoensayo enzimático convencional (EIA). Los ejemplos de enzimas preferidas incluyen peroxidasas, p-galactosidasas, fosfatasas alcalinas, glucosa oxidasa, acetilcolina esterasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, etc. También pueden usarse inhibidores enzimáticos y coenzimas, etc.
La conjugación de la enzima y el anticuerpo puede realizarse por un método conocido usando un agente de reticulación conocido tal como compuestos de maleimida. Los sustratos que pueden usarse son sustancias conocidas seleccionadas dependiendo de la enzima usada. Por ejemplo, cuando la enzima usada es una peroxidasa, puede usarse 3,3',5,5'-tetrametilbencidina. Cuando la enzima usada es una fosfatasa alcalina, puede usarse paranitrofenol o similares. Los radioisótopos que pueden usarse como marcador incluyen los usados en radioinmunoensayos convencionales (RIA) tales como 125I y 3H. Los colorantes fluorescentes que pueden usarse son los usados en fluoroinmunoensayo convencional, tales como isotiocianato de fluorescencia (FITC) e isotiocianato de tetrametilrodamina (TRTC). El presente reactivo de diagnóstico también puede usarse para tinciones inmunohistológicas que tiñen específicamente células cancerosas y los fibroblastos circundantes. Cuando el reactivo de diagnóstico está marcado con un radioisótopo, el reactivo de diagnóstico también puede administrarse internamente para obtener imágenes de lesiones cancerosas, etc.
También se da a conocer en el presente documento pero no está comprendido en las reivindicaciones un método para detectar o cuantificar una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular en una muestra biológica, es decir, suero, preparado a partir de sangre humana o animal, usando el método el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo de la presente invención. También se da a conocer en el presente documento pero no está comprendido en las reivindicaciones un método de diagnóstico de una enfermedad asociada a inflamación (por ejemplo, insuficiencia cardiaca, etc.) en la que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, comprendiendo el método detectar o cuantificar la isoforma de periostina. En los métodos dados a conocer en el presente documento, puede detectarse una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular mediante el denominado ELISA de tipo sándwich (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas).
Se usa un kit de diagnóstico de la presente invención tal como sigue. Un anticuerpo primario anti-periostina se inmoviliza sobre una placa, se pone en contacto una muestra con la placa para formar un complejo con el anticuerpo primario, luego se permite que un anticuerpo secundario anti-periostina marcado con un marcador se una al complejo, y la intensidad de la señal del marcador en el complejo ternario se mide para detectar y cuantificar una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular. Dado que una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular es una variante de corte y empalme que se expresa específicamente en condiciones tales como cánceres, la monitorización de la producción de la isoforma de periostina puede usarse para diagnosticar estados tales como cánceres.
Tal como se describió anteriormente, el anticuerpo de la presente invención puede ser marcarse y usarse como anticuerpo secundario.
También se da a conocer en el presente documento pero no está comprendida en las reivindicaciones una composición farmacéutica para inhibir una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, comprendiendo la composición el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo del presente invención como principio activo. Dado que el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado tiene una actividad inhibitoria sobre una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, la composición farmacéutica inhibe la angiogénesis, inhibe la hiperplasia de la íntima vascular, trata un cáncer y previene o trata el aneurisma. También se da a conocer en el presente documento pero no está comprendida en las reivindicaciones una composición para inhibir la hiperplasia de la íntima vascular, tratar un cáncer, inhibir la angiogénesis o prevenir o tratar el aneurisma, comprendiendo la composición un anticuerpo anti-periostina que reconoce una variante de corte y empalme de periostina que tiene propiedades de adhesión celular. La composición puede usarse para tratar y prevenir la reestenosis que está provocada principalmente por hiperplasia de la íntima vascular observada después de angioplastia coronaria, para prevenir o tratar un cáncer, para tratar o prevenir enfermedades acompañadas por angiogénesis y para prevenir o tratar el aneurisma.
También se da a conocer en el presente documento pero no está comprendida en las reivindicaciones una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, comprendiendo la composición el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de la presente invención como principio activo. Los ejemplos incluyen una composición farmacéutica para inhibir la hiperplasia de la íntima vascular, comprendiendo la composición el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo como principio activo; una composición farmacéutica para tratar un cáncer, comprendiendo la composición el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo como principio activo; una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis, comprendiendo la composición el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo como principio activo; una composición farmacéutica para prevenir o tratar el aneurisma, comprendiendo la composición el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo como principio activo; etc.
La composición para tratar un cáncer presenta los efectos de inhibir el crecimiento de focos cancerosos e inhibir la metástasis de un cáncer. La composición, por tanto, puede usarse con el propósito previsto de inhibir el crecimiento de focos de cáncer o de inhibir la metástasis de un cáncer, o ambos propósitos.
La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo y/o el derivado de anticuerpo de la presente invención como principio activo se prepara con el uso de aditivos conocidos farmacológicamente aceptables que se usan comúnmente en un método de preparación convencional, incluyendo un portador, un excipiente y otros aditivos.
El principio activo de la composición farmacéutica según la presente invención se administra preferiblemente en mezcla con un portador, excipiente, diluyente o similar farmacológicamente aceptable conocido por cualquier modo de administración comúnmente usado en el campo farmacéutico (por ejemplo, mediante administración oral o administración parenteral, tal como administración intravenosa, intramuscular y subcutánea). La composición farmacéutica de la presente invención puede prepararse, por ejemplo, mezclando el principio activo con un portador farmacológicamente aceptable, sabor, excipiente, estabilizador, diluyente, emulsionante, disolución, suspensión, jarabe, o similar, según sea necesario. La forma de dosificación de la composición farmacéutica de la presente invención no está particularmente limitada y los ejemplos de la misma incluyen comprimidos, polvos, gránulos, disoluciones, etc. Los aditivos que pueden incorporarse en comprimidos o similares incluyen, por ejemplo, aglutinantes tales como gelatina y lubricantes tales como almidón de maíz. La composición farmacéutica puede estar recubierta con un azúcar o una película gástrica o entérica. Cuando la forma de dosificación es una cápsula, la composición puede comprender además un portador de líquido. La composición puede formularse en una composición estéril inyectable con una fórmula farmacéutica convencional. Los vehículos acuosos inyectables incluyen disoluciones isotónicas que contienen glucosa, etc., y tales disoluciones isotónicas pueden usarse en combinación con un solubilizador apropiado, tal como polietilenglicol. La composición farmacéutica puede incorporarse con un tampón, un estabilizador, un conservante, un antioxidante, un agente calmante, o similares. Para administración oral, cuando es probable que el principio activo se descomponga en el tracto digestivo, la composición puede convertirse en una formulación resistente a la descomposición en el tracto digestivo (por ejemplo, microcápsulas de liposomas que encapsulan el principio activo) y luego administrarse por vía oral. También son posibles otros modos de administración para la absorción a través de una membrana mucosa distinta del tracto digestivo, incluyendo las vías rectal, intranasal, sublingual y transpulmonar. En estos casos, la composición puede administrarse en forma de un supositorio, una gota nasal, un comprimido sublingual, un agente transpulmonar, o similares.
Cuando la composición farmacéutica de la presente invención se usa para fines terapéuticos, la dosificación se determina para que sea terapéuticamente eficaz. La dosificación terapéuticamente eficaz varía, por ejemplo, con la edad, el peso corporal y la gravedad de los síntomas de un sujeto al que va a administrarse la composición, así como con la vía de administración. Por estos motivos, la dosificación se determina de forma individual. En general, la dosificación diaria para un adulto por administración oral es de aproximadamente 0,1 a 1.000 mg, y la dosificación se da como una sola dosis o de una a varias dosis divididas (dos veces, tres veces, etc.). Para la administración intravenosa continua, la composición puede administrarse a una dosificación de 0,01 |ig/kgmin a 1,0 |ig/kgmin, deseablemente de 0,025 |ig/kgmin a 0,1 |ig/kgmin.
Otras aplicaciones que se dan a conocer en el presente documento pero que no están comprendidas por las reivindicaciones proporcionan “un método para inhibir una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular usando un anticuerpo contra la isoforma de periostina”, “un método para prevenir o tratar una enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, comprendiendo el método administrar, a un paciente con cáncer, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-periostina que reconoce una variante de corte y empalme de periostina que tiene propiedades de adhesión celular”, etc. También se da a conocer en el presente documento pero no está comprendido en las reivindicaciones el “uso de un anticuerpo contra una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular para la producción de una composición farmacéutica para inhibir la isoforma de periostina”, “uso de un anticuerpo contra un isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular para la producción de una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada la isoforma de periostina”, etc. El anticuerpo anti-periostina incluye los anticuerpos descritos anteriormente, fragmentos de anticuerpo y/o derivados de anticuerpo. La enfermedad asociada a inflamación incluye las enfermedades asociadas a inflamación descritas anteriormente.
Ejemplos
La presente invención se describirá en más detalle con referencia a ejemplos, pero no se limita a los mismos. Pueden hacerse diversas modificaciones por un experto en la técnica, sin apartarse de la idea técnica de la presente divulgación.
Ejemplo de preparación 1: Búsqueda de periostina por sustracción 1-1 Establecimiento de ratas modelo patológicas de insuficiencia cardiaca y recogida de muestras del ventrículo izquierdo
Se criaron ratas macho Dahl sensibles a sal (Dahl-S) (Shimizu Laboratory Supplies Co., Ltd.) con una dieta alta en sal del 8% desde las 6 semanas de edad, y se recogieron los ventrículos izquierdos de tres animales en la fase de hipertrofia cardiaca (11 semanas de edad) y de tres animales en la fase de insuficiencia cardiaca (14 semanas de edad).
1-2 Preparación de ARNm
Se prepararon ARN totales a partir de aproximadamente 500 mg de cada ventrículo izquierdo usando ISOGEN (Nippon Gene) según las instrucciones del fabricante. Los ARN totales de los tres animales en la fase de hipertrofia cardíaca y los ARN totales de los tres animales en la fase de insuficiencia cardiaca se combinaron por separado. Se purificaron ARNm a partir de aproximadamente 400 |ig de cada uno de los ARN totales combinados usando el kit Fast Track 2.0 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante para recuperar aproximadamente 3 |ig de ARNm de cada fase.
1-3 Sustracción de ADNc
Se realizó la sustracción de ADNc usando el kit de sustracción de ADNc PCR-Select (Clontech) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sintetizaron ADNc a partir de 2 |ig de cada ARNm obtenido en la sección 1-2 anterior y se digirieron con la enzima de restricción Rsal. El ADNc sintetizado a partir de los animales a las 14 semanas de edad se utilizó como ADNc probador y el ADNc sintetizado a partir de los animales a las 11 semanas de edad se utilizó como ADNc conductor. Para el ADNc probador, dos tipos de adaptadores incluidos en el kit se ligaron por separado. Se realizó la hibridación por sustracción. Entonces se realizó la PCR usando cebadores complementarios a los adaptadores para amplificar específicamente fragmentos de ADNc expresados de manera diferencial para dar producto de amplificación 1.
Se realizó otra operación de sustracción de la misma manera que antes, excepto porque el ADNc sintetizado a partir de los animales a las 11 semanas de edad se usó como ADNc probador y porque el ADNc sintetizado a partir de los animales a las 14 semanas de edad se usó como ADNc conductor para dar el producto de amplificación 2.
1-4 Examen de transferencia puntual
A. Preparación de transferencias puntuales
El producto de amplificación 1 se clonó TA en el vector PCR II (Invitrogen) y se seleccionaron clones con el fragmento de inserto. El fragmento de inserto de cada clon se amplificó por reacción PCR, y se trató térmicamente 1 |il de cada producto amplificado, luego se sometió a transferencia puntual sobre dos filtros de membrana de nailon (Boehringer) y se fijó con un agente de reticulación de UV (Stratagene).
B. Preparación de sondas de ADNc
Se digirió el producto de amplificación 1 con las enzimas de restricción RsaI, EaeI y SmaI para extraer los adaptadores. Entonces se sometió el producto a marcaje de sensibilización al azar con DIG-dUTP usando el kit de marcaje y detección de ADN DIG High Prime II (Boehringer) según las instrucciones del fabricante para preparar la sonda de ADNc 1. De la misma manera, se preparó la sonda de ADNc 2 a partir del producto de amplificación 2.
C. Examen
Una de las membranas de transferencia puntual preparadas en la sección A anterior se hibridó con la sonda 1 de ADNc y la otra se hibridó con la sonda 2 de ADNc. Específicamente, la hibridación se realizó en una disolución de hibridación (disolución DIG Easy Hyb) a 42°C durante la noche usando el kit de marcaje y detección de ADN DIG High Prime II (Boehringer) según las instrucciones del fabricante. Se lavaron las membranas dos veces con 2 X SSC y SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego dos veces con 0,1 X SSC y SDS al 0,1% a 68°C durante 15 minutos. Entonces se hicieron reaccionar las membranas con el anticuerpo frente a DIG conjugado con fosfatasa alcalina en el tampón de bloqueo incluido en el kit. Se añadió un sustrato de quimioluminiscencia (CSPD listo para usar) para permitir que avanzara la reacción quimioluminiscente. Se expusieron las membranas a películas de rayos X. Los clones que mostraban una señal más fuerte con la sonda de ADNc 1 que con la sonda de ADNc 2 se seleccionaron como clones positivos y se secuenciaron.
1-5 Secuenciación
Las secuencias de nucleótidos se determinaron mediante análisis en un secuenciador de ADN automatizado , modelo 373A (PE Applied Biosystems), usando un kit de secuenciación de terminador de colorante (nombre comercial: Kit de secuenciación de ciclo de terminador de colorante Thermo Seguenase™ II (Amersham Pharmacia)). Las secuencias genéticas obtenidas se compararon con secuencias disponibles en el banco de datos de GenBank. Uno de los clones (SF014) se encontró que tenía un gen que tenía un 86% de homología con periostina de ratón (n.° de registro de GenBank D13664).
Ejemplo de preparación 2: Clonación del ADNc de periostina-1 de rata
Se aisló ADNc de periostina de rata tal como sigue. Se insertó una biblioteca de ADNc de aorta de rata (Clontech) en el vector Xgt 11 para generar 10 subgrupos de fagos de aproximadamente 4.000 clones (un total de aproximadamente 40.000 clones). Los subgrupos de fagos se examinaron mediante PCR usando los cebadores (1) 5'-GTTCATTGAAGGTGGCGATGGTC-3' (SEQ ID NO: 23) y (2) 5'-GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3' (SEQ ID NO: 24) que se diseñaron basándose en la secuencia de nucleótidos de SF014. Como resultado del examen, se obtuvieron tres subgrupos positivos. Uno de los subgrupos se seleccionó mediante hibridación usando el fragmento anterior amplificado por PCR como sonda, se marcó con fosfatasa alcalina usando AlkPhos Direct™ (Amersham Pharmacia), para dar una periostina de rata de clon positivo #1. Su fragmento de inserto se subclonó en el sitio de EcoRI de pBluescript II (Stratagene) y la secuencia de nucleótidos completa se determinó por el método descrito en 1-5 del ejemplo de preparación 1.
El clon resultante tenía una longitud de aproximadamente 3 kb, correspondiente a los nucleótidos desde la posición 292 hasta el extremo 3' de la periostina de ratón (n.° de registro de GenBank D13664). Los resultados sugieren que el clon era un clon truncado en 5'.
Un kit de amplificación de ADNc SMART RACE (nombre comercial: kit de amplificación de ADNc SMART™ (Clontech)) se usó según las instrucciones del fabricante para realizar una reacción de 5'-RACE usando ADNc de aorta de rata como molde y los cebadores (2) 5'-GAGATa Aa ATCCCTGCATGGTCCT-3' (SEQ ID NO: 24) tal como se describió anteriormente y (3) 5'-CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3' (SEQ ID NO: 25) diseñado basándose en la secuencia de nucleótidos de periostina de rata #1. El producto de PCR resultante se clonó TA en el vector PCR II (Invitrogen) para dar un clon. El clon se diseñó como periostina de rata 5' RACE #1. La secuencia de nucleótidos se determinó por el método descrito en 1-5 del ejemplo de preparación 1.
Los resultados mostraron que la periostina de rata 5' RACE #1 era un clon del cual la secuencia de nucleótidos es más larga que la de la periostina de rata #1 obtenida inicialmente en aproximadamente 300 pb en la dirección 5', y que el extremo 5' de periostina de rata 5' RACE #1 es más largo en 15 pb que el extremo 5' de periostina de ratón (n.° de registro de GenBank D13664). Los diez subgrupos de fagos anteriores de aproximadamente 40.000 clones (un total de aproximadamente 400.000 clones) preparados a partir de la biblioteca de ADNc de aorta de rata se examinaron mediante PCR usando los cebadores (4) 5'-ACGGAGCTCAGGGCTGAAGATG-3' (SEQ ID NO: 26) diseñado basándose en la secuencia de nucleótidos de periostina de rata 5' RACE #1 y (3) 5'-CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3' (SEQ ID NO: 25) tal como se describió anteriormente, para dar dos subgrupos positivos. Uno de los subgrupos se examinó por hibridación usando el fragmento anterior amplificado por PCR como sonda para dar un clon positivo. El clon se designó como periostina de rata #2. Su fragmento de inserto se subclonó en el sitio EcoRI de pBluescript II (Stratagene) y la secuencia de nucleótidos se determinó mediante el método descrito en 1-5 del ejemplo de preparación 1.
El clon resultante tenía una longitud de aproximadamente 2,6 kb. El extremo 5' era idéntico al del clon obtenido a partir de la reacción 5'-RACE y el extremo 3' correspondía a los nucleótidos hasta la posición 2410 de periostina de ratón (n.° de registro de GenBank D13664). La secuencia de nucleótidos de periostina de rata 5' RACE #1 obtenida anteriormente era idéntica a la secuencia de nucleótidos de la región relevante de periostina de rata #2. La longitud completa del ADNc de periostina de rata se completó mediante la periostina de rata #1 y la periostina de rata #2. La secuencia de nucleótidos del ADNc de longitud completa se muestra en SEQ ID NO: 2, y la secuencia de aminoácidos traducida a partir de la secuencia de nucleótidos se muestra en SEQ ID NO: 1.
Ejemplo de preparación 3: Clonación de ADNc de periostinas-2 y -4 de rata
Se realizó la PCR a partir del ADNc de las ratas Dahl en la fase de hipertrofia cardiaca usado en el ejemplo de preparación 1 y la secuencia genética clonada en el ejemplo de preparación 2 usando los cebadores 5'-AAGCTAGCGAAGATGGTTCCTCTCCTGCCCT-3' (SEQ ID NO: 27) y 5'-CTTTGGGTTTTTCCAGCCTC-3' (SEQ ID NO: 28). El producto de PCR se clonó TA en el vector pCR4 Blunt TOPO (Invitrogen). A partir de las colonias resultantes, se seleccionaron 96 colonias y se transfirieron a una placa de 96 pocillos para que fueran 1 colonia/pocillo. El examen para los genes de periostina-2 y -4 de rata candidatos se realizó usando los cebadores 5'-CCCCATGACTGTCTATAGACCT-3' (SEQ ID NO: 29) y 5'-ATTTCCCTTAAAAATCAGATTG-3' (SEQ ID NO: 30). Los clones seleccionados se examinaron además mediante secuenciación para clones sin errores de PCR.
Ejemplo de preparación 4: Construcción de vectores de expresión de baculovirus
Los plásmidos pCR4 Blunt TOPO/periostina-2 de rata y pCR4 Blunt TOPO/periostina-4 de rata preparados en el ejemplo de preparación 3 se digirieron con las enzimas de restricción Spe I y Not I para cortar fragmentos de periostina-2 y -4 de rata. Los fragmentos se ligaron por separado usando un kit de ligación (Takara Bio Inc.) a un fragmento de vector pFastBacHTc (Invitrogen) digerido con las enzimas de restricción pe I y Not I para dar vectores de expresión. Los vectores se diseñaron como pFastBac/periostina-2 de rata y pFastBac/periostina-4 de rata, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de los insertos se confirmaron mediante el método descrito en 1-5 del ejemplo de preparación 1.
Ejemplo de preparación 5: Preparación y cultivo de baculovirus recombinantes
Se transformaron por separado células de Escherichia coli DH10BAC con cada uno de pFastBac/periostina-2 de rata y pFastBac/periostina-4 de rata preparados en el ejemplo de preparación 4 para producir baculovirus recombinantes. La inserción de los insertos deseados en los baculovirus resultantes se confirmó por electroforesis y PCR.
Se infectaron por separado células de insectos Sf9 (2 X 106 células/ml) con cada uno de los baculovirus recombinantes a MOI = 0,1, y luego se cultivaron en medio libre de suero (2.000 ml de Sf-900 II SFM (Invitrogen) con 50 |ig/ml de gentamicina) a 28°C durante de 4 a 5 días. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo.
Ejemplo de preparación 6: Purificación de proteínas periostina de rata
A columnas SP Sepharose Fast Flow (10 ml de volumen de lecho) equilibradas con tampón de equilibración (tampón acetato de sodio 50 mM, pH 6,0, cloruro de sodio 0,1 M) se les aplicó por separado 2.000 ml de cada uno de los sobrenadantes de cultivo obtenidos en el ejemplo de preparación 5, y las fracciones no retenidas resultantes se agruparon por separado para dar fracciones no retenidas de SP Sepharose.
Las columnas se lavaron con el tampón de equilibración (aproximadamente 100 ml) hasta que la absorbancia a 280 nm se aproximó a cero para dar fracciones de lavado de SP Sepharose.
Las columnas se eluyeron con 100 ml de tampón de elución (dihidrogenofosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), cloruro de sodio 0,5 M, imidazol 5 mM) para dar fracciones de eluato de SP Sepharose.
Las fracciones de eluato de SP Sepharose cada una en una cantidad de 100 ml se aplicaron por separado a columnas de agarosa Ni-NTA (volumen de lecho de 5 ml) equilibradas con tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, cloruro de sdoio 0,5 M e imidazol 5 mM. Las fracciones no retenidas resultantes se agruparon por separado para dar fracciones no retenidas de agarosa Ni-NTA.
Las columnas se lavaron con aproximadamente 50 ml de tampón de lavado (50 ml de dihidrogenofosfato de sodio, pH 8.0, cloruro de sodio 0,5 M, imidazol 5 mM) para dar fracciones de lavado de agarosa Ni-NTA.
Las columnas se eluyeron con aproximadamente 25 ml de cada uno de los siguientes tampones de elución: (1) dihidrogenofosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 0,5 M, imidazol 20 mM, seguido por tampones de elución con las mismas formulaciones, excepto porque las concentraciones de imidazol fueron (2) 30 mM, (3) 40 mM, (4) 50 mM y (5) 60 mM, para dar fracciones de eluato de agarosa Ni-NTA (1) a (5).
Las fracciones que se muestran que contienen las proteínas deseadas por inmunotransferencia de tipo Western se concentraron hasta 1 ml o menos.
Las muestras concentradas se aplicaron a columnas de filtración en gel (Sephacryl S-200HR, 11 mm de diámetro X 95 cm; 90 volúmenes de lecho) equilibradas con PBS desgasificado (-) (NaCl 137 mM, Na2HPO48,1 mM, KCl 2,68 mM, KH2PO41,47 mM), y se eluyeron con PBS (-). Los eluatos se liofilizaron para dar proteínas de periostina de rata purificadas.
Ejemplo 1: Estudio in vitro de la presencia o ausencia de actividad de adhesión celular de proteínas PN-2 y PN-4 de rata
A una placa de cultivo celular de 96 pocillos, se le añadieron fibronectina 10 |ig/ml, BSA 100 |ig/ml, proteína PN-2 10 |ig/ml y proteína PN-410 |ig/ml por separado y se incubó a 4°C durante la noche para que los pocillos se recubrieran con cada proteína. Tras la retirada de la disolución proteica de los pocillos, se añadieron fibroblastos cardiacos neonatales de ratas suspendidos en DMEM (BSA al 10%, PC/SM) a 104 células/pocillo y se cultivaron en una incubadora a 37°C durante 3 horas. El nivel de adhesión celular se midió tal como sigue. Tras la retirada del sobrenadante de cultivo, se fijaron las células en glutaraldehído al 2,5% durante 30 minutos, se tiñeron con cristal violeta al 0,02% y luego se midieron para determinar su absorbancia a DO 550 nm con un lector de placas (BIO-RAD, LECTOR DE MlCROPLACAS modelo 680). Se tiñeron los pocillos no recubiertos como muestras de fondo y se usaron para corregir los valores de absorbancia con fines de comparación. El análisis de datos se realizó mediante la prueba PLSD de Fisher (figura 2). La fibronectina de control positivo (indicada por FN en la figura) mostró adhesión celular, mientras que la BSA de control negativo no mostró adhesión celular. Los pocillos sin recubrimiento proteico también mostraron adhesión celular, pero el nivel fue menor que el de la fibronectina de control positivo. El grupo al que se le añadió proteína PN-2 de rata mostró un nivel de adhesión celular igual o mayor que el del grupo de fibronectina, mientras que el grupo al que se le añadió proteína PN-4 mostró un nivel de adhesión celular simplemente igual al de los pocillos no recubiertos.
Ejemplo 2: Síntesis de la cadena peptídica de exón-21 de rata y producción de anticuerpos policlonales
En el ejemplo 1, se demostró que la proteína PN-4 de rata tiene propiedades de adhesión celular menores que la proteína p N-2 de rata. A partir de este hecho y de los resultados de la comparación de secuencias de las proteínas, se reveló que la estructura específica de la proteína PN-2 de rata era la secuencia del exón-21. Basándose en esto, un péptido que tiene un residuo de Cys añadido al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos que constituye el exón-21 se sintetizó químicamente en un rendimiento de 10 mg con una pureza del 80% o más. Se inmunizaron conejos (Kbl:JW) con el polipéptido conjugado a 6 mg de una proteína portadora KLH. Se usó FCA (adyuvante completo de Freund) en la inmunización primaria (administración), y se usó FIA (adyuvante incompleto de Freund) en las inmunizaciones secundarias y posteriores. Se realizó la administración en 20 sitios subcutáneos dorsales a las semanas 2, 4 y 6 después de la administración primaria, usando una dosis de péptido de 800 |ig/animal en la inmunización primaria y 400 |ig/animal en las inmunizaciones secundarias y posteriores. El título de anticuerpo se determinó mediante ELISA y el suero total se recogió en la semana 7 después del inicio de la administración. Se preparó una columna de afinidad mediante el uso del péptido sintético y se aislaron los anticuerpos que reaccionaban específicamente con el péptido del exón-21. Los anticuerpos policlonales contra el péptido codificado por el exón-21 de periostina de rata se denominaron anticuerpos policlonales anti-exón-21 de rata.
Ejemplo 3: Confirmación de la capacidad de unión a proteína periostina de rata (PN-2)
Los dos tipos de anticuerpos policlonales (n.° 1 y n.° 3) producidos en el ejemplo 2 se sometieron a ensayo mediante transferencia puntual para confirmar su capacidad de unión a proteína periostina de rata (PN-2). Las proteínas purificadas (30 |ig/ml) producidas en el ejemplo de preparación 6 se dispusieron en puntos cada una en un volumen de 5 |il sobre una membrana de nitrocelulosa Hybond-ECL (GE Healthcare Bio-Sciences KK) y la membrana se lavó una vez con disolución de TBS (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM). Se añadió tampón de bloqueo (Block Ace, Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) y la membrana se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de añadir a la membrana una disolución de 1 |ig/ml de cada anticuerpo monoclonal (anticuerpo primario), se agitó la membrana durante 3 horas y se repitió cuatro veces el lavado con disolución de TBS bajo 10 minutos de agitación. Después de añadir a la membrana una disolución de 0,4 |ig/ml de un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con HRP (Promega) (anticuerpo secundario), se agitó la membrana a temperatura ambiente durante 1 hora y se repitió el lavado cuatro veces con disolución de TBS bajo 10 minutos de agitación. Se añadió un reactivo de detección (ECL Plus Western Btting Detection System, GE Healthcare Bio-Sciences KK) y se hizo reaccionar durante 1 minuto para detectar la quimioluminiscencia. El ensayo confirmó que los dos tipos de anticuerpos monoclonales se unen a la periostina p N - 2 de rata.
Ejemplo 4: Estudio in vitro de la actividad neutralizante del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata
Células de músculo liso vascular de rata DB1X A7r5 (n.° de cat. 09-1444, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.) se sembraron en una placa de múltiples pocillos de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 0,5 a 1 X 104 células/pocillo y se cultivaron hasta la subconfluencia, y luego se reemplazó el medio por un medio sin suero (-). Por separado, con el fin de marcar fluorescentemente células THP-1 (leucemia monocitica aguda humana, n.° cat. 06-202, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd.), se añadió BCECF-AM 2 nM (envasado especial BCECFAM, n.° cat. B221, Dojindo Laboratories Co., Ltd.) a las células THP-1, se incubaron durante 30 minutos, se centrifugaron y se lavaron dos veces con PBS (-). Para la medición de la adhesión de las células THP-1 marcadas fluorescentemente, se mezcló el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) o un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) con proteína PN-2 y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego la mezcla reaccionada y 1 X 104 células/pocillo de las células THP-1 marcadas fluorescentemente se añadieron a los pocillos sembrados con A7r5. Como controles se usaron (1) fibronectina, (2) PN-2, (3) PN-2 anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) y (5) THP-1 solo. La mezcla anterior y los controles se incubaron durante 6 horas. Entonces se añadió lentamente medio RPMI 1640 a cada pocillo hasta llenarlo, y la placa se cubrió con parafilm para excluir el aire. La placa se puso boca abajo y se incubó durante 30 minutos. Entonces se retiró cuidadosamente el parafilm, se aspiró el medio y la placa se lavó tres veces con PBS (-). Como medida de adhesión celular, se determinó la intensidad de fluorescencia con un lector de placas (Wallac 1420 ARVOmx/Light (Perkin-Elmer)) a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de fluorescencia de 535 nm. Tal como se muestra en las figuras 3A y 3B, se observó adhesión celular en (1) el grupo de fibronectina, (2) el grupo de PN-2 y (3) el grupo de PN-2 anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG), mientras que no se observó adhesión significativa en (4) el grupo de tratamiento con anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) como en el caso de (5) THP-1 solo. Los resultados revelaron que el anticuerpo policlonal antiexón-21 de rata tiene actividad inhibidora, es decir, actividad neutralizante, contra las propiedades de adhesión celular de PN-2.
Ejemplo 5: Producción de anticuerpos monoclonales contra la cadena peptídica del exón-21 de periostina humana
(1) Producción de antígenos
Un péptido (péptido antigénico; CEVTKVTKFIE GGDGHLFEDE EIKRLLQG (SEQ ID NO: 31)) que tiene un residuo de Cys añadido al extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos que constituye el exón-21 de periostina humana (SEQ ID NO: 18) se sintetizó químicamente por el método de Fmoc con un rendimiento de 10 mg a una pureza del 90% o más. Entonces, se conjugaron 5 mg de una proteína portadora KLH (CALBIOCHEM) con 5 mg del péptido antigénico para dar una disolución de antígeno. Brevemente, se disolvió KLH en PBS (0,01 M) hasta una concentración de 3,3 mg/ml. A esto se le añadió gota a gota una disolución MBS 0,2524 mg/ml (GE Healthcare Bio-Sciences KK), y la mezcla se hizo reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se usó diclorometano para eliminar MBS libre para dar KLH-MB. Entonces, se mezclaron 5 mg de KLH-MB con una disolución de 5 mg del péptido antigénico en tampón fosfato de sodio 0,01 M (pH 7,2), y la mezcla se hizo reaccionar con agitación a 4°C durante 12 horas para dar una disolución de antígeno.
(2) Inmunización
La disolución de antígeno (50 |il) que contenía 100 |ig del péptido antigénico conjugado con KLH obtenido anteriormente (1) se mezcló con FCA (adyuvante completo de Freund, 50 |il) para preparar una emulsión. Todo el volumen de la emulsión se inyectó por vía subcutánea en las patas traseras de tres ratones BALB/c hembra a las 6 semanas de edad. Entonces los ratones recibieron inyecciones adicionales dos veces a un intervalo de 2 semanas en las patas traseras con una emulsión mixta de la disolución de antígeno anterior y FIA (adyuvante incompleto de Freund) preparada en el momento de su uso. Los ratones se sacrificaron entonces por dislocación cervical y los ganglios linfáticos de las patas se recogieron asépticamente.
Los ganglios linfáticos anteriores se trituraron en medio RPMI (Kohjin Bio Co., Ltd.) y se hicieron pasar a través de una malla de aproximadamente 10 |im de tamaño de poro para dar una suspensión de las células de los ganglios linfáticos en medio RPMI. La suspensión se centrifugó a 1.000 rpm durante 10 minutos para dar una fracción de sedimento de las células de los ganglios linfáticos. Los glóbulos rojos contenidos en la fracción de sedimento se hemolizaron con 1 ml de una disolución preparada añadiendo tampón HEPES 20 mM (pH 7,4) a una disolución de cloruro de amonio al 0,84%. Después de la eliminación de los glóbulos rojos, la fracción se centrifugó a 1.000 rpm durante 5 minutos. La fracción de sedimento resultante (fracción celular) se lavó varias veces con medio RPMI y luego se usó para la fusión celular.
(3) Preparación de células de mieloma
La línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag8U.1 (P3U1), que es resistente a 8-azaguanina y no secreta inmunoglobulina, se cultivó en medio RPMI que contenía suero fetal de ternero (FCS) al 20% en una incubadora con el 10% de CO2 a 37°C. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se recogieron y centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos para separar las células como una fracción de sedimento. La fracción de sedimento se suspendió en medio RPMI.
(4) Fusión celular
El medio RPMI que contenía de 1 X 108 a 3 X 108 células de ganglios linfáticos inmunizados preparados anteriormente (2) se mezcló con el medio RPMI que contenía 108 células de mieloma preparadas anteriormente (3). La mezcla se centrifugó a 1.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retiró suavemente para dejar las células como una fracción de sedimento, seguido por la adición de 1 ml de polietilenglicol 1500 al 25% (p/v) (PEG 1500, Boehringer). A esto, se le añadió lentamente medio RPMI hasta un volumen total de 10 ml. A esto, se añadió medio RPMI que contenía FCS al 20% (10 ml) y se dejó reposar por un tiempo, seguido por centrifugación a 1.000 rpm durante 5 minutos. La fracción de sedimento resultante (fracción celular) se ajustó a una densidad celular de 106 células/ml mediante la adición de medio RPMI que contenía FCS al 20%. La suspensión celular se dispensó a 200 ^l/pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos (Corning). Después del cultivo de las células en una incubadora con el 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas, se añadió disolución de HAT (Invitrogen) y se continuó el cultivo durante 2 semanas adicionales.
(5) Examen por ELISA
Se realizó el examen de pocillos positivos que contenían el sobrenadante de cultivo que mostraban reactividad con el péptido antigénico. Una disolución de antígeno usada para el ensayo era un conjugado preparado acoplando el péptido antigénico (2 mg) producido anteriormente (1) a ovoalbúmina (OVA) como proteína portadora.
Cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Falcon 353912) se recubrió con el conjugado (1 |ig/ml) a 4°C durante la noche. Después de lavar la placa, se añadieron gota a gota 50 |il del sobrenadante de cultivo a partir de lo anterior (4) (que contenía anticuerpos monoclonales) a cada pocillo y se dejaron reposar en una incubadora a 37°C durante 2 horas, seguido por lavado con PBS (-) (solución salina tamponada con fosfato). Después de la adición del anticuerpo de cabra anti-IgG de raton conjugado con fosfatasa alcalina (Zymed), la placa se dejó reposar en una incubadora a 37°C durante 1 hora, y se lavó con PBS (-). Se añadió un sustrato de desarrollo de color (ALP) y se desarrolló color durante 20 minutos. La absorbancia (título de anticuerpo) a DO 490 nm se midió para cada pocillo con un lector de placas (BIO-RAD, LECTOR DE MICROPLACAS modelo 680) para evaluar la reactividad con el péptido antigénico y de ese modo determinar pocillos positivos que contenían el sobrenadante de cultivo que mostraron reactividad con el péptido antigénico.
(6) Clonación de células productoras de anticuerpos
La clonación de líneas celulares productoras de anticuerpos a partir de las células en los pocillos positivos para las que la reactividad con el péptido antigénico se confirmó por ELISA anteriormente (5) se realizó mediante dilución limitante. Brevemente, las células de los pocillos positivos se sembraron en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos y se cultivaron en una incubadora con el 5% de CO2 a 37°C durante 2 semanas. Para el sobrenadante de cultivo en cada pocillo, la reactividad con el péptido antigénico se examinó por ELISA de la misma manera que anteriormente (5). Para cada pocillo positivo, la clonación por dilución limitante se realizó de nuevo para seleccionar 30 células que tenían una alta reactividad con el péptido antigénico y mostraban un buen crecimiento de colonias. Las células se transfirieron a placas de cultivo de 24 pocillos y se cultivaron en una incubadora con el 5% de CO2 a 37°C durante 2 semanas. Para cada sobrenadante de cultivo, la reactividad con el péptido antigénico (título de anticuerpos) se examinó de nuevo por ELISA de la misma manera que anteriormente (5). Se determinó que las células de dos pocillos mostraban una alta absorbancia a DO 490 nm, es decir, dos líneas celulares de hibridoma (n.° 8 y n.° 10) se determinaron que eran útiles como células productoras de anticuerpos y se seleccionaron.
Las células productoras de anticuerpos así obtenidas producen constantemente anticuerpos monoclonales anti-exón-21 humano, es decir, los anticuerpos de la presente invención, y por tanto el sobrenadante del medio en el que se han cultivado estas células productoras de anticuerpos pueden usarse directamente como disolución de anticuerpos de la presente invención.
La línea celular productora de anticuerpos anterior (hibridoma) n.° 8, que produce un anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano, se depositó en la Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary ( N p M D ) (fecha de depósito: 26 de febrero de 2013, n.° de registro: NITE BP- 01546, referencia de identificación: KS-0259#8,080611 Kohjin Bio).
(7) Confirmación de la capacidad de unión a proteína periostina (PN-2)
Los anticuerpos producidos por las dos células productoras de anticuerpos obtenidas anteriormente (6) se evaluaron mediante transferencia puntual para confirmar su capacidad de unión a proteína periostina del ratón (PN-2), basándose en el hecho de que la periostina de ratón tiene una secuencia de aminoácidos casi idéntica a la de periostina humana. Brevemente, la proteína PN-2 de ratón (periostina de ratón recombinante/OSF-2, R&D SYSTEMS) (100 |ig/ml) se dispuso en puntos en volúmenes de 5 |il sobre una membrana de nitrocelulosa Hybond-ECL (GE Healthcare Bio-Sciences KK) y se lavó la membrana una vez con disolución de TBS (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM). Se añadió tampón de bloqueo (Block Ace, Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) y la membrana se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de añadir a la membrana una disolución de 1 |ig/ml de cada anticuerpo monoclonal (anticuerpo primario) obtenido anteriormente (6), se agitó la membrana durante 3 horas y se repitió cuatro veces el lavado con disolución de TBS bajo 10 minutos de agitación. Después de añadir a la membrana una disolución de 0,4 |ig/ml de un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con HRP (Promega) (anticuerpo secundario), se agitó la membrana a temperatura ambiente durante 1 hora y se repitió cuatro veces el lavado con solución de TBS bajo 10 minutos de agitación. Se añadió un reactivo de detección (ECL Plus Western Btting Detection System, GE Healthcare Bio-Sciences KK) y se hizo reaccionar durante 1 minuto para detectar la quimioluminiscencia. El ensayo confirmó que los anticuerpos producidos por las dos células productoras de anticuerpos clonadas anteriormente (6) se unen a periostina humana PN-2.
(8) Producción en masa y purificación de anticuerpos monoclonales
A ratones BALB/c se les administraron por vía intraperitoneal 0,5 ml de pristano [2,6,10,14-tetrametilpentadecano (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] y los ratones se mantuvieron durante de 2 a 3 semanas. Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales n.° 8 y n.° 10 que se habían mantenido en la fase de crecimiento logarítmico se recogieron y se centrifugaron para la retirada del sobrenadante del cultivo. A cada una de las fracciones de sedimento celular se les añadió medio RPMI libre de FCS para preparar una suspensión celular a una densidad celular de 1 X 107 células/ml. La suspensión celular se inyectó por vía intraperitoneal en los ratones los BALB/c pretratados con pristano. Aproximadamente tres semanas más tarde, se recogió la ascitis exudada del abdomen con una jeringa. La ascitis recogida se hizo pasar a través de un filtro con un diámetro de poro de 0,22 |im, se purificó el filtrado de manera convencional mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de proteína G-Sepharose (Millipore, 11511324) para preparar dos tipos de anticuerpos monoclonales anti-exón-21 humano.
Ejemplo 6: Análisis de epitópos de anticuerpos monoclonales anti-exón-21 humano
Se produjo Replitope (un alineamiento de 37 tipos de péptidos fijados sobre un portaobjetos de vidrio) y se usó para identificar los epítopos de los anticuerpos monoclonales peptídicos anti-exón-21 de periostina humana (dos tipos) y para los anticuerpos policlonales (dos tipos).
Como anticuerpos primarios, se usaron los anticuerpos policlonales de IgG de conejo n.° 1 (0,51 mg/ml) y n.° 3 (0,62 mg/ml), y los anticuerpos monoclonales de IgG2b de ratón n.° 8 (2,21 mg/ml) e IgG1 de ratón n.° 10 (1,35 mg/ml). Como anticuerpos secundarios, se usaron anti-IgG de conejo conjugado con Cy5 (H L) (JIR 111-175-144) y anti-IgG de ratón conjugado con Dylight 649 (Pierce, #35515). Los péptidos se sintetizaron sobre membranas de celulosa. Los péptidos se transfirieron entonces a placas de microtitulación y se dispusieron en puntos sobre una superficie de vidrio con un sistema de nanopipeteo para alineamientos de péptidos (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlín, Alemania). El microalineamiento de péptidos se incubó con tampón de bloqueo (Pierce International, Superblock TBS, orden n.° 37536) durante 2 horas. El microalineamiento se incubó con los anticuerpos primarios (10 |ig/ml, en tampón de bloqueo, volumen total de ensayo 200 |il) o tampón de bloqueo solo en una estación de hibridación de microalineamientos (estación de hibridación de microalineamientos TECAN HS400). El microalineamiento se lavó con tampón TBS (tampón TBS 50 mM Tween 20 al 0,1% (JPT), pH 7,2) y se incubó con los anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo (anti-IgG de conejo o anti-IgG de ratón) a una concentración final de 1 |ig/ml en tampón de bloqueo. El microalineamiento se lavó tres veces con tampón TBS y luego se lavó con tampón SSC (tampón SSC 3 mM (JPT), pH 7,0) y se secó bajo corriente de nitrógeno. Finalmente se analizó el microalineamiento con un escáner de fluorescencia de alta resolución (nombre comercial: GenePix 4200AL, Axon, Inc.). Se realizó el análisis puntual usando un software GenePix 6.0.
Como resultado del ensayo, los epítopos para los anticuerpos policlonales anti-exón-21 de rata se identificó que eran las secuencias TKVTK (SEQ ID n O: 21) y QGDTPVr K (SEQ ID NO: 22), y los epítopos para los anticuerpos monoclonales anti-exón-21 humano se identificó que eran las secuencias VTKVTK (SEQ ID NO: 19) y FEDEEIK (SEQ ID NO: 20).
Ejemplo 7: Estudio del efecto inhibidor del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata sobre la hiperplasia de la íntima vascular usando el modelo de lesión con balón de la arteria carótida de rata
Se indujo la lesión en ratas SD mediante rascado de la arteria carótida común izquierda con un catéter de balón Fogarty 2F (francés), y simultáneamente se administró por vía intravascular el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) o un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG). Un día, tres días, una semana, dos semanas y tres semanas después de la producción de los modelos de lesión intimal, se fijaron cinco ratas por perfusión para cada período de tiempo. Se recogieron los vasos sanguíneos, y se diseccionaron las arterias carótidas inducidas por lesiones con balón como muestras y las arterias carótidas sin lesión como controles en una longitud de aproximadamente 1 cm de los vasos sanguíneos. De aproximadamente 2 a 3 mm de segmento de cada uno de los vasos sanguíneos diseccionados se fijaron en paraformaldehído al 4%, y el resto de cada vaso se usó para la extracción del ARN total para la síntesis de ADNc. A partir del tejido fijado, se prepararon secciones y se tiñeron con HE (hematoxilina-eosina) (figura 4B). Las áreas de la túnica íntima y la túnica media en todas las secciones teñidas con HE se determinaron usando un software de análisis gráfico (nombre comercial: Graphic converter ver.4.02). A partir de las áreas determinadas, se calculó la razón de íntima/media y se examinó la gravedad de la hiperplasia de la íntima. Tal como se muestra en figura 4A, se observó una diferencia significativa de p = 0,0362 (N = 8) en la razón de íntima/media entre el grupo de administración de anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) y el grupo de anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG). Los resultados mostraron la inhibición de la hiperplasia de la íntima (figuras 4A y 4B).
Ejemplo 8: Estudio del efecto inhibidor del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata sobre la hiperplasia de la íntima vascular usando ratones deficientes en apoE
Ratones deficientes en ApoE, un modelo propenso a arteriosclerosis, se estimularon con una dieta alta en grasas, y simultáneamente con el inicio de la alimentación con dieta alta en grasas, se administró por vía intraperitoneal el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) o un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) a una dosis de 100 |ig/ml una vez a la semana. Tres meses después, se diseccionó la aorta. Las lesiones arterioscleróticas desarrolladas se compararon en cuanto a los siguientes dos parámetros: la gravedad de la arteriosclerosis definida como la razón de área positiva teñida con aceite rojo O con respecto al área total de los vasos sanguíneos; y el % de cambio en la gravedad de la arteriosclerosis definida como la gravedad de la arteriosclerosis dividida entre el valor promedio del grupo de administración de IgG de la gravedad de la arteriosclerosis. Los resultados mostraron una inhibición significativa de la arteriosclerosis aórtica en el grupo de administración de anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) en comparación con el grupo de administración de anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) (N = 3) (p < 0,05) (figura 5).
Ejemplo 9: Estudio del efecto antiinflamatorio del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano usando el modelo de colitis de ratón
Se realizó un estudio para investigar el efecto del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) o un anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG) sobre un modelo de colitis de ratón con enfermedad de Crohn inducida por dextrano de sulfato sódico (DDS) al 1,75%. Simultáneamente con la administración de DDS, cada anticuerpo se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 100 |ig/animal una vez a la semana. Dos semanas más tarde, se recogieron los intestinos gruesos, y se midieron y compararon las longitudes de los intestinos gruesos. Debido a la administración de DDS, las longitudes de los intestinos gruesos se acortaron significativamente en comparación con el grupo simulado (N = 6) (p < 0,01). Sin embargo, el grupo de administración de anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) mostró una inhibición significativa del acortamiento de la longitud del intestino grueso, en comparación con el grupo de administración de anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG) y el grupo de administración de DDS solo (N = 6) (p < 0,05) (figura 6).
Ejemplo 10: Estudio del efecto inhibidor del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata sobre la angiogénesis usando el modelo de isquemia de las extremidades inferiores
Se ligó la arteria femoral de las extremidades inferiores de ratones C57BL6N para preparar un modelo de isquemia de extremidades inferiores. Tres días antes de la ligación, se administró por vía intraperitoneal el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) o un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) a una dosis de 40 |ig/ml (dos veces a la semana). El día cero (inmediatamente antes de la administración), y 1, 7, 14, 21 y 28 días después de la administración, se midió el flujo sanguíneo de las extremidades inferiores en el lado no afectado y el lado afectado con un instrumento de obtención de imágenes Doppler de láser (LDI; Moor Instruments). Para la evaluación del flujo sanguíneo de las extremidades inferiores, se calculó la tasa de perfusión relativa definida como el flujo del lado afectado/flujo del lado no afectado, y se compararon los grupos. La tasa de perfusión relativa 28 días después mostró una disminución significativa en el flujo sanguíneo de las extremidades inferiores en el grupo de administración de anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) en comparación con el grupo de administración de anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) (p < 0,05) (figura 7). Se recogieron los músculos aducentes de los ratones, se prepararon secciones congeladas, se inmunotiñeron con un anticuerpo frente a CD31 y se sometieron a evaluación de los vasos sanguíneos. El número de los vasos sanguíneos por unidad de área fue significativamente menor en el grupo de administración de anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) que en el grupo de administración de anticuerpo IgG de control de conejo, lo que reveló una inhibición significativa de la angiogénesis (p < 0,01) (N = 6) (figura 8). El mismo conjunto de experimentos se realizó usando el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb). Como con el caso del anticuerpo policlonal, la tasa de perfusión relativa calculada con LDI indicó una disminución significativa del flujo sanguíneo en comparación con el grupo de administración de anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG), lo que reveló una inhibición de la angiogénesis (figura 9).
Ejemplo 11: Efecto inhibidor in vitro del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata sobre la formación de tubos
El sobrenadante de células de cáncer de mama 4T1 se añadió a Matrigel (BD Bioscience, n.° 356231). A esto, se le añadieron por separado un anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG), el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb), un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) y el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb), cada uno a una concentración de 1/100. Cada mezcla se añadió a una placa de 96 pocillos en una cantidad de 70 |il/pocillo. Las mezclas se incubaron durante 30 minutos para permitir la formación de gel, y se sembraron HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana normal) a una densidad celular de 1,5 X 104 células/pocillo. Las células se incubaron durante 5 horas, se tiñeron con una disolución de cristal violeta y se fotografiaron bajo un microscopio. Se contó el número de tubos. Las propiedades angiogénicas del sobrenadante de células de cáncer de mama 4T1 se inhibieron significativamente por el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata y el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (p < 0,05) (figuras 10A y 10B). El Matrigel al que se añadió proteína PN-2 en diversas concentraciones se procesó y se evaluó de la misma manera que anteriormente. La evaluación mostró que, a concentraciones de 5 |ig/ml 0 más, la proteína PN-2 indujo significativamente la formación de tubos de una manera dependiente de la dosis, lo que indicó las propiedades angiogénicas de la proteína PN-2 (p < 0,05) (figuras 11A y 11B). Los resultados del estudio mostraron que los anticuerpos anti-exon-21 tienen un efecto inhibidor de la angiogénesis. Los resultados también indicaron las propiedades angiogénicas de la proteína PN-2.
Ejemplo 12: Estudio in vitro de la influencia del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata sobre el crecimiento celular
Se sembraron células de cáncer de mama 4T1 de ratón en DMEM (sin suero, PC/SM) en una placa de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 105 células/pocillo y se cultivaron en una incubadora a 37°C durante la noche. Tras la retirada del sobrenadante de cultivo, a los pocillos se les añadió medio DMEM (sin suero, PC/SM) al que se añadió el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) o un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) (cada uno a 200 |ig/ml) a una concentración final de 1 |ig/ml. Entonces se cultivaron las células durante la noche. Al día siguiente, el medio en todos los pozos se reemplazó por DMEM (BSA al 10%, PC/SM), y se añadieron 20 |il de reactivo CellTiter de un kit de ensayo de proliferación celular (nombre comercial: kit de ensayo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous One Solution, Promega) a 100 |il del medio en los pocillos. Las células se cultivaron a 37°C durante 1 hora. La intensidad de tinción de las células se midió con un lector de placas (BIO-RAD, LECTOR DE MICROPLACAS modelo 680) a 490 nm (figura 12A). Los resultados revelaron que el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) mostró actividad inhibidora del crecimiento celular a una concentración elevada en comparación con el anticuerpo IgG de control del conejo (rIgG) (p < 0,05).
Se realizó otra investigación para determinar si el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano tiene citotoxicidad contra células de cáncer de mama 4T1 de ratón. Se sembraron células de cáncer de mama F4T1 de ratón en DMEM (sin suero, PC/SM) en una placa de cultivo celular de 96 pocillos a una densidad de 1 X 104 células/pocillo y se cultivaron en una incubadora a 37°C durante la noche. Después de la retirada del sobrenadante de cultivo, se añadió a los pocillos medio DMEM (sin suero, PC/SM) al que se añadió el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) o un anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG) (cada uno a 100 |ig/ml) a una concentración final de 1 |ig/ml. Entonces se cultivaron las células durante 6 horas. Se recogió el sobrenadante de cultivo y la lactato deshidrogenasa (LDH) contenida en el sobrenadante se midió mediante ELISA. Para la medición, se usó un kit de ensayo de citotoxicidad (nombre comercial: kit de detección de citotoxicidad LDH, Takara Bio, Inc.). La LDH es una enzima presente en el citoplasma y habitualmente no permea a través de la membrana celular. Cuando la membrana celular está dañada, se libera LDH fuera de la célula, es decir, al medio. La LDH, por tanto, puede servir como indicador de citotoxicidad. Se sometió el sobrenadante a medición con un lector de placas (BIO-RAD, LECTOR DE MICROPLACAS modelo 680) a 490 nm. Los resultados revelaron que el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) presentaba actividad inhibidora significativa del crecimiento celular a una concentración elevada en comparación con el anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG) (P < 0,01) (figura 12B).
Ejemplo 13: Estudio del efecto del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata usando ratones modelo de metástasis pulmonar de células de cáncer de mama 4T1 de ratón
Se sembraron células de ratón 4T1 (ATCC) sobre placas de cultivo tisular de 10 cm (Greiner) que contenían RPMI 1640 (Gibco) con el 10% de albúmina sérica bovina (FBS) (Biowest) y solución mixta de penicilina-estreptomicina (Nacalai Tesque), y las células se cultivaron en una incubadora a 37°C durante 24 horas. Se eliminó el sobrenadante de cultivo, se lavaron las células con PBS y luego se trataron con tripsina/EDTA. Las células flotantes se recogieron y centrifugaron a 1.500 rpm durante 3 minutos. Posteriormente, se realizaron pases de 1,5 X 105 células y se cultivaron en una incubadora a 37°C durante 72 horas. Las células en la fase de crecimiento logarítmico se suspendieron en 100 |il de PBS para que fuesen 1 X 106 células/animal. Las células preparadas se inyectaron en la almohadilla del pie de ratones BALB/c hembra a las 8 semanas de edad usando una jeringa de insulina equipada con una aguja de inyección, 29 G Myjector (TERMO), para establecer ratones modelo de metástasis pulmonar. A los ratones modelo, se les administró el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) o un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) por vía intraperitoneal a 100 |ig/animal por semana usando una jeringa de insulina equipada con una aguja de inyección, 29 G Myjector. Para el experimento usando el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) (1 mg/ml), la inyección de células se realizó simultáneamente con la administración de anticuerpos, y una semana después y dos semanas después de la inyección de células, se realizaron las administraciones de anticuerpos adicionales. El anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) usado fue IgG de conejo normal (R&D Systems). Después de la inyección de células, se midió el diámetro de las lesiones de hinchazón en las extremidades inferiores con un calibre para evaluar el volumen de los tumores primarios. La evaluación se realizó según Dethlefsen LA. et al. J. Natl. Cáncer Inst., 40, 389 (1968), usando la fórmula: (longitud de la suela del pie) X (anchura de la suela del pie) A2/2. Los ratones se diseccionaron tres semanas después de la inyección de células, y se realizaron la medición del peso corporal, el examen de la presencia o ausencia de metástasis pulmonar a partir de los tumores primarios y el recuento de las colonias metastásicas pulmonares. Los datos obtenidos se analizaron mediante la prueba de la t de Student. El volumen de los tumores primarios en las extremidades inferiores tres semanas después de la inyección de células se redujo significativamente mediante la administración del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) (p < 0,05) (figura 13A). Una comparación del número de colonias metastásicas pulmonares cinco semanas después de la inyección de células reveló una reducción significativa en el número de colonias por la administración del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) (P < 0,05) (figura 13B). Se realizó el mismo conjunto de experimentos usando el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb). Al igual que en el caso del anticuerpo policlonal, se observó una reducción significativa en el número de colonias metastásicas pulmonares, en comparación con un grupo de administración de anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG) y con un grupo de administración de PBS (-) (figura 14). Los resultados revelaron el efecto inhibidor de los anticuerpos anti-exón-2l sobre los tumores primarios y focos metastásicos de células de cáncer de mama 4T1.
Ejemplo 14: Estudio del efecto del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata usando ratones modelo de metástasis pulmonar de células de melanoma B16F10 de ratón
Se cultivaron células de melanoma B16F10 de ratón (línea celular de melanoma de ratón B16F10) en una incubadora a 37°C, se lavaron con PBS y se trataron con tripsina/EDTA. Las células flotantes se recogieron y centrifugaron a 1.500 rpm durante 3 minutos. Se suspendieron las células recogidas en 100 |il de PBS para que fuesen 5 X 105 células/animal. Se inyectaron las células preparadas en la almohadilla del pie de ratones C57BL/6N macho a las 8 semanas de edad usando una jeringa de insulina equipada con una aguja de inyección, 29 G Myjector (TERMO), para establecer ratones modelo de metástasis pulmonar. A los ratones modelo se les administró el anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) o un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) a 100 ^g/animal por semana usando una jeringa de insulina equipada con una aguja de inyección, 29 G Myjector. El control usado fue IgG de conejo normal (R&D Systems).
Para reproducir las condiciones cercanas a la situación clínica, la administración del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata (ex21PoAb) (1 mg/ml) o de un anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) (1 mg/ml) como control a 100 |ig/animal por semana se realizó una semana después de la inyección de las células de melanoma B16F10 de ratón. Los tumores primarios se midieron con un calibre para evaluar el volumen de los tumores primarios. La evaluación se realizó según Dethlefsen LA. et al. J. Natl. Cancer Inst., 40, 389 (1968), usando la fórmula: (longitud de la suela del pie) X (anchura de la suela del pie) A2/2. Tres semanas después de la inyección de células, la administración del anticuerpo policlonal anti-exón-21 de rata inhibió significativamente el crecimiento de los tumores primarios en comparación con la administración del anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) (p < 0,05) (figura 15A). El número de colonias metastásicas pulmonares se contó mediante inspección visual y se comparó. Los resultados mostraron que, cinco semanas después de la inyección de células, la administración del anticuerpo policlonal antiexón-21 de rata (ex21PoAb) inhibió significativamente la metástasis pulmonar en comparación con la administración del anticuerpo IgG de control de conejo (rIgG) (p < 0,05) (figura 15B). El análisis de datos del número de colonias metastásicas pulmonares se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney.
Ejemplo 15: Estudio del efecto del anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano usando ratones modelo de aneurisma
El estudio se realizó usando ratones deficientes en ApoE envejecidos (6 meses o más) . Se disolvió angiotensina II en solución salina fisiológica. La disolución de angiotensina II (Sigma Aldrich, A9525) se cargó en una bomba osmótica para su administración continua (Alzet, Muromachi Kikai Co., Ltd., modelo: 2004). La dosificación se fijó a 1.000 ng/kgdía. La bomba osmótica ajustada se cebó con solución salina fisiológica durante una noche y día. Se administró isoflurano vaporizado a los ratones por inhalación a una concentración del 2% y una velocidad de flujo de 1 l/min. Después de que se lograra una anestesia suficiente, los ratones se mantuvieron en decúbito prono. Se esterilizó la piel del cuello con una disolución de etanol al 70% y se realizó una pequeña incisión. A partir del sitio de la incisión, se insertaron tijeras debajo de la piel del ratón y se despegó la piel. Se creó un espacio para colocar la bomba y se implantó la bomba osmótica debajo de la piel del ratón. Después de la implantación, se cerró la incisión con grapas para cirugía de animales pequeños (Fine Science Tools, Muromachi Kikai Co., Ltd., modelo: 12040-01).
Se administró un anticuerpo IgG de control de ratón (mIgG, 100 ^g/animal) o el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb; 100 ^g/animal) por vía intraperitoneal una vez a la semana, comenzando a partir de la semana cero. Cuatro semanas más tarde, se midió el diámetro de la aorta con un escáner de ultrasonidos (Toshiba Medical Systems Corporation, Aplio XV). Los resultados revelaron que el anticuerpo monoclonal anti-exón-21 humano (ex21MoAb) inhibía significativamente la expansión del diámetro de la aorta (figura 16).
Aplicabilidad industrial
Puede usarse un anticuerpo contra una isoforma de periostina que tiene actividad de adhesión celular para prevenir y

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo que se une a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en un péptido codificado por el exón-21 de periostina que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 y un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 para su uso en la prevención o el tratamiento, a través de la inhibición de una isoterma de periostina que tiene actividad de adhesión celular, de una enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada la isoterma de periostina, en el que la enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada la isoforma de periostina es una enfermedad seleccionada de esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, periodontosis, dermatitis atópica, asma, retinopatía diabética, arteriosclerosis, enterocolitis inflamatoria, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma, aneurisma y osteoartritis.
2. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 1, en el que la enfermedad asociada a inflamación en la que está implicada la isoforma de periostina es una enfermedad seleccionada de polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, periodontosis, retinopatía diabética, arteriosclerosis, enterocolitis inflamatoria, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma y aneurisma.
3. Anticuerpo para su uso según las reivindicaciones 1 o 2, que se une específicamente a uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
4. Anticuerpo para su uso según las reivindicaciones 1 a 3, que se produce usando como antígeno un péptido de exón-21 de periostina solo.
5. Anticuerpo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
6. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 5, que es un anticuerpo monoclonal.
7. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 6, que se produce por una línea celular de hibridoma designada como NITE BP-01546, línea celular de hibridoma que se depositó en el National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary, según el Tratado de Budapest con el número de registro NITE BP-01546.
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