JP5019464B2 - 抗ペリオスチン抗体およびそれを含有するペリオスチンが関与する疾患の予防または治療用医薬組成物 - Google Patents
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Description
［０００１］
技術分野
［０００２］
本発明は、抗細胞接着作用を有するペリオスチンに対する抗体、特に抗細胞接着作用を中和する能力を有する抗ペリオスチン抗体に関する。更に詳しくは、心肥大組織をはじめとして組織再構築の間質において特異的に発現する、抗細胞接着作用を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識する抗ペリオスチン抗体であって、心不全などのペリオスチンが関与する疾患の予防もしくは治療またはこれらの疾患の診断に有用な抗体に関する。
背景技術
［０００３］
慢性心不全は、心筋収縮力の低下により、心臓が各臓器へ十分量の血液を拍出できない状態に陥る疾患である。従来、その治療には、心筋収縮力を増加させるジギタリス製剤等の強心剤が使用されてきた。しかし、これらの薬剤は心筋エネルギーの過剰消費により、長期投与においては生命予後を悪化させることが明らかになっている。そのため、最近では、心不全状態で亢進している交感神経系やレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系による心臓への過剰な負荷を軽減させる利尿剤やβ遮断薬、アンジオテンシン阻害薬による治療が主流になってきている。しかし、依然として、心不全患者は激しい運動ができないなど日常生活が制限され、生活の質を保つことができず、さらに、心不全患者の生命予後を十分に担保できていないため、生活の質の改善および長期生命予後の改善が可能である有効な新規心不全治療薬の開発が望まれている。
［０００４］
一方、ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質の一種であり、分子量約９万のポリペプチドからなる。各ポリペプチド鎖には、シグナル配列、システインリッチドメイン、４回繰り返しドメイン、Ｃ末端ドメインが含まれている。
【０００５】
ペリオスチンは、当初、骨芽細胞特異的因子−2（ＯＳＦ−2）と呼ばれ、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に特異的に発現している遺伝子として分離同定されたが（特許文献１、非特許文献１）、後に現在の名称であるペリオスチンと呼ばれるようになり、骨芽細胞における接着促進活性が報告された（非特許文献２）。
【０００６】
初期の研究では、ペリオスチンは骨組織に特異的に発現する細胞外マトリックスであると考えられていた。しかし、現在では骨組織のみならず心不全（非特許文献３、非特許文献４）、動脈瘤（非特許文献５）、高転移性癌（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）、子癇前症（非特許文献９）等の発症において極めて高く発現しており、また正常組織においてもごく僅かであるが発現していることが明らかになっている。また、いくつかのペリオスチンスプライシングバリアントが骨芽細胞で発現していることも明らかになっている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献１０、特許文献３）。
【０００７】
ペリオスチンの作用について、細胞接着作用に関しては、811アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−2に相当）（非特許文献２）および782アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（非特許文献１１）が細胞接着作用を有すると報告されていた。これに対し、838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）は、該ペリオスチンスプライシングバリアントをコーティングしたプレートには心線維芽細胞が接着しないこと、すなわち細胞接着活性を有しないこと、正常ラットに比べ心不全モデルラットにおいて838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）の遺伝子発現が有意に増加していること、加えてそれが心拡大を惹起させる増悪因子であること、およびこのタンパク質の発現を抑制すると有意に生存率が上昇したことが報告されている（非特許文献３）。さらに、838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアントに対するアンチセンスヌクレオチドを用いて、該ペリオスチンスプライシングバリアントの発現を抑制することによる心不全の予防剤または治療剤について報告されている（特許文献２）。
【０００８】
このように、ペリオスチン遺伝子の発現が心不全の病態に関連することが示唆されているが、ペリオスチンスプライシングバリアントの構造と心不全の関連については不明である。そこで、本発明者らは、抗体を用いて心不全病態に関与するペリオスチンの構造を明らかにすることを試みた。
［０００９］
ペリオスチン抗体については、ペリオスチンの細胞遊走阻害に関する抗体（非特許文献１２）およびペリオスチンによる細胞の増殖抑制活性を有する抗体（非特許文献１３）が報告されている。しかし、ペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域の構造に関する抗体の報告は未だなく、また、ペリオスチンの細胞接着活性と心不全などの疾患との関係についての報告も何らなされていない。
特許文献１：特開平５−２６８９８２号公報
特許文献２：再公表特許ＷＯ０２／０２００５５号公報
特許文献３：国際公開ＷＯ２００５／０１９４７１号公報
非特許文献１：Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ（１９９３）２９４，２７１−８
非特許文献２：Ｈｏｒｉｕｃｈｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９９）１４，１２３９−４９
非特許文献３：Ｋａｔｓｕｒａｇｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００４）１１０，１８０６−１３
非特許文献４：Ｗａｎｇ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ（２００３）４２，８８−９５
非特許文献５：Ｐｅｔｅｒｓ ＤＧ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ（２００１）３２，１０３６−４２
非特許文献６：Ｓｈａｏ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００４）２４，３９９２−４００３
非特許文献７：Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＨＥ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．（２００３）１２９，７５４−９
非特許文献８：Ｓａｓａｋｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．（２００３）７７，２４５−５２
非特許文献９：Ｓａｓａｋｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．（２００２）１８６，１０３−８
非特許文献１０：Ｌｉｔｖｉｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００４）９２，１０４４−６１
非特許文献１１：Ｇｉｌｌａｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００２）６２，５３５８−６４
非特許文献１２：Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．（２００５）２５，７７−８３
非特許文献１３：Ｔａｉ ＩＴ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（２００５）２６，９０８−１５
発明の開示
［００１０］
本発明の目的は、生活の質の改善および長期生命予後の改善が可能である有効な新規心不全の予防剤または治療剤等を提供することである。詳しくは、抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識する抗体を提供することである。また、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの製造方法、該ハイブリドーマを培養することによる該抗体の製造方法を提供する。さらに、該抗体を含有する抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。さらに、該医薬組成物を患者に投与することからなる抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防または治療方法、ならびに該疾患の診断方法を提供する。
［００１１］
本発明者らは、細胞接着活性を有しないペリオスチンスプライシングバリアント（ＰＮ−１）が抗細胞接着活性、すなわち接着した細胞を剥離する活性を有することを明らかにし、また、一方、細胞接着活性を有するペリオスチン（ＰＮ−２）は抗細胞接着活性を有さない、すなわち接着した細胞を剥離しないことを確認した。そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンスプライシングバリアント（ＰＮ−１）と、抗細胞接着活性を示さないペリオスチン（ＰＮ−２）において、その構造と細胞接着における活性の相違に注目し、抗細胞接着活性を有するペリオスチンスプライシングバリアントに特異的に存在する領域を阻害することにより、抗細胞接着活性を有するペリオスチン関連疾患の予防または治療が可能であると考えた。つまり、該領域に対する阻害物質が、抗細胞接着活性を有するペリオスチン関連疾患の予防または治療剤として有用であると考えた。
［００１２］
心不全時に発現が亢進するペリオスチンスプライシングバリアントを調べた結果、スプライシングバリアントが形成されるＣ−末端ドメインは、ｅｘｏｎ（エクソン）１５から２３で構成されているが、ラットでは、下記（１）から（４）が存在することが明らかとなった。
（１）全てを保持しているもの（ＰＮ−１と呼ぶ；配列番号１として示す８３８アミノ酸からなる；ｃＤＮＡ配列を配列番号６として示す）、
（２）Ｅｘｏｎ−１７が欠失しているもの（ＰＮ−２と呼ぶ；配列番号５として示す８１１アミノ酸からなる；ＰＮ−１から配列番号３で示される２７アミノ酸（Ｅｘｏｎ−１７）が欠失しているもの；ｃＤＮＡ配列を配列番号７として示す）、
（３）Ｅｘｏｎ−２１が欠失しているもの（ＰＮ−３と呼ぶ；８１０アミノ酸からなる）、
（４）Ｅｘｏｎ−１７とＥｘｏｎ−２１が欠失しているもの（ＰＮ−４と呼ぶ；７８３アミノ酸からなる）
また、ラット以外でも、マウス及びヒトについてＰＮ−1及びＰＮ−2が見出されている（マウスＰＮ−1：配列番号８（アミノ酸配列）、配列番号９（cDNA配列）；マウスＰＮ−2：配列番号１０（アミノ酸配列）、配列番号１１（cDNA配列）；ヒトＰＮ−1：配列番号１２（cDNA配列）；ヒトＰＮ−2：配列番号１３（アミノ酸配列）、配列番号１４（cDNA配列））。そして、これらのうち、ラットの心肥大組織ではＰＮ−1が多く発現しており、ＰＮ−2およびＰＮ−3の発現量は少なかった。そこで、本発明者らは、ＰＮ−1とＰＮ−2の構造上異なる部位であり、ＰＮ−1のみに存在するＥｘｏｎ−１７部位の阻害物質として、該部位がコードするアミノ酸配列部分を特異的に認識する抗体の作製を検討した。
【００１３】
抗体を作製するためには、免疫原として用いる物質が親水性であることが必要であり、また、タンパク質のような大きなポリペプチドの一部分を用いて抗体を作製する際には、免疫原として使用する部分が、該タンパク質の表面に出ており、エピトープ部分を構成していることが必要である。そこで、Ｅｘｏｎ−１７ペプチド鎖を抗原として用いることの可能性を検討するために、最初に、バイオインフォマティクス分野で汎用されているaccelrys社のソフト、Mac Vector 7.2を使用してエピトープ検索を行なった。その結果、“親水性（Hydrophilicity）”、“表面への露出のしやすさ（Surface Probability）”および“抗原性（Antigenicity）”から見て、Ｅｘｏｎ−１７領域のTTKIITKLVEPKIKVIQGSLQPIIKTE（配列番号３）は殆どが疎水性領域であり、タンパク質分子の表面に出ている可能性が非常に低いことが示唆され、抗原性を有しておらず、抗体が作製できないと考えられ、実際に抗体を作製することは困難であることが予想された。
【００１４】
しかしながら、本発明者らは、ＰＮ−１の機能を特異的に阻害するためには、ＰＮ−１に特異的に存在するＥｘｏｎ−１７がコードするペプチド領域に対する抗体の使用が最適であるとの考えのもと、Ｅｘｏｎ−１７がコードするアミノ酸配列に対する抗体の作製を遂行した。Ｅｘｏｎ−１７領域がコードするペプチドを構成する27アミノ酸からなるペプチドを合成し、ウサギに免疫させ、得られた血清からIgG画分を精製し、抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチドポリクローナル抗体を作製した。次に80％コンフルエントに培養した心線維芽細胞にペリオスチンタンパク質ＰＮ−１を添加すると、ほぼ100％の細胞の脱離（すなわち、抗細胞接着活性）が観察された。この実験系に抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチド抗体を投与した結果、ペリオスチンタンパク質ＰＮ−１による細胞の脱離を抑制したことから、該抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチド抗体はペリオスチンタンパク質ＰＮ−１に対する中和活性を持つ抗体で有ることが明らかとなった。次に、急性心筋梗塞モデルラットを作製し、抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチド抗体を週に一度投与し続けたところ、モデル作製後４週間で心臓の拡大が有意に抑えられ、また心機能が改善されることが明らかとなった。さらに、モデル作製後８週間でも、上述の効果が持続すること、および心線維化が抑制されることが明らかとなった。これにより、抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチド抗体が心不全病態の進行とともに起こる心拡大および心線維化を抑制する活性、ならびに心機能を改善させる活性を持つ抗体であることが明らかとなり、本発明を完成するに至った。
［００１５］
本発明は、前記の課題を解決するものとして、心不全時等の心臓に特異的に発現する抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体、特に抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識する抗体を提供するものである。
［００１６］
すなわち、本発明としては、以下を挙げることができる。
（１）抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、且つ当該ペリオスチンの抗細胞接着活性を中和する活性を有する抗体。
（２）抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域が、エクソン−１７又は当該エクソンの一部によりコードされるアミノ酸配列である（１）記載の抗体。
（３）エクソン−１７又は当該エクソンの一部によりコードされるアミノ酸配列が、配列番号３、４、２１、２２、２３、２４、２６および３４で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列である（２）記載の抗体。
（４）アミノ酸配列が、配列番号３、４又は２１で示されるアミノ酸配列である（３）記載の抗体。
（５）抗体が、モノクローナル抗体である（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）ハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８により産生される（５）記載の抗体。
（７）配列番号３、４及び２１で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドで哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて得られるハイブリドーマ。
（８）ハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８。
（９）配列番号３、４及び２１で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドで哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する（５）記載の抗体を製造する方法。
（１０）ハイブリドーマが、ハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８である（９）の製造方法。
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含有する医薬組成物。
（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含有する、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（１３）前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎、膵炎、肝炎、肝線維症又は肺線維症である（１２）記載の医薬組成物。
（１４）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を患者に投与することからなる、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防又は治療方法。
（１５）前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎、膵炎、肝炎、肝線維症又は肺線維症である（１４）記載の予防または治療方法。
（１６）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を用いて、生体試料中のペリオスチン量を測定することからなる、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を診断する方法。
（１７）用いる抗体が、標識化された抗体である（１６）記載の診断方法。
（１８）前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎、膵炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である（１６）又は（１７）記載の診断方法。
（１９）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を用いて、生体試料中の抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。
（２０）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含む、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の診断薬。
（２１）前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎、膵炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である、（２０）記載の診断薬。
【図面の簡単な説明】
［００１８］
［図１］図１は、ラットのペリオスチンのスプライシングバリアントを示す模式図である。
［図２］図２は、ラットＰＮ−１の抗細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例２）。
［図３］図３は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体のラットＰＮ−１活性阻害について測定した結果を示す図である（実施例３）。
［図４−１］図４−１は、急性心筋梗塞モデル作成後４週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：前壁厚、後壁厚）。
［図４−２］図４−２は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能）。
［図４−３］図４−３は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：心拍数、梗塞エリア）。
［図５−１］図５−１は、急性心筋梗塞モデル作製後８週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：前壁厚、後壁厚）。
［図５−２］図５−２は、急性心筋梗塞モデル作製後８週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能）。
［図５−３］図５−３は、急性心筋梗塞モデル作製後８週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：心拍数、梗塞エリア）。
【図６−１】図６−１は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例４：ＬＶＰ、心拍数）。
【図６−２】図６−２は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例４：（＋）ｄＰ／ｄｔ、（−）ｄＰ／ｄｔ）。
【図６−３】図６−３は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例４：ＳＢＰ、ＤＢＰ、ＬＶＥＤＰ）。
【図７】図７は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの組織学的に検討した結果を示す図である（実施例４）。
【図８】図８は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの心筋細胞の短軸径を示す図である（実施例４）。
【図９−１】図９−１は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：Ｇ３ＰＤＨ）。
【図９−２】図９−２は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：ＥＴ−１／Ｇ３、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ／Ｇ３）。
【図９−３】図９−３は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：α−ＭＨＣ／Ｇ３、β−ＭＨＣ／Ｇ３）。
【図９−４】図９−４は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：Ｃｏｌ−Ｉ／Ｇ３、Ｃｏｌ−ＩＩＩ／Ｇ３）。
【図９−５】図９−５は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：ＴＧＦ−β／Ｇ３、ＴＮＦ−α／Ｇ３）。
【図１０】図１０は、ヒトＰＮ−１の抗細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例１５）。
【図１１】図１１は、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のヒトＰＮ−１活性阻害について測定した結果を示す図である（実施例１６）。
【図１２−１】図１２−１は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例１７：前壁厚、後壁厚）。
［図１２−２］図１２−２は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例１７：拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能）。
［図１２−３］図１２−３は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例１７：心拍数、梗塞エリア）。
発明を実施するための最良の形態
［００１９］
１つの態様において、本発明は、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体を提供する。ここで、ペリオスチンは、細胞外マトリックスの一種であり、いくつかのスプライシングバリアントの存在が知られており、そのいくつかは、心不全時等の心臓に特異的に発現する。心不全時等の心臓に特異的に発現するペリオスチンスプライシングバリアントの機能を阻害する物質、すなわち阻害剤として、本発明においては、特異性が高い、ヒトへの安全性が高い、などの理由から、抗体を使用できる。本発明では、スプライシングバリアントが形成されるＣ−末端ドメインのＥｘｏｎ−１７領域がコードするアミノ酸配列からなるペプチドを化学合成したものを抗原として、抗体を作製できるが、係るペプチドは、ペリオスチンタンパク質の酵素消化や遺伝子工学的手法などによっても得られ、その由来は問わない。
［００２０］
本発明において、「抗細胞接着活性を有する」とは、接着している細胞を剥離若しくは脱離させる作用を有することである。また、「抗細胞接着活性を有さない」とは、接着している細胞を剥離若しくは脱離させることがないことであり、この時、細胞は接着状態を維持することとなる。抗細胞接着活性の有無は、心線維芽細胞などの細胞を培養プレートで培養して該細胞を培養プレートに接着させた後、検定用試料を添加して培養、洗浄して剥離した細胞を除去した後に、残存している細胞を染色し、接着していた細胞の残存状態を確認することにより、判断することができる。
［００２１］
また、本発明において、抗細胞接着活性を有するペリオスチンとしては、好ましくは、配列番号１（ラットペリオスチンＰＮ−１、８３８アミノ酸）、配列番号２（ヒトペリオスチンＰＮ−１、８３６アミノ酸：ラットペリオスチンよりもＮ末端のシグナル配列が２アミノ酸少ない）、または配列番号８（マウスペリオスチンＰＮ−１）のアミノ酸配列からなるペリオスチンを挙げることができる。
［００２２］
ペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域としては、例えばＥｘｏｎ−１７部位を挙げることができる。具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号３で示されるアミノ酸配列部分（配列番号１の６７２〜６９８アミノ酸）、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号４で示されるアミノ酸配列部分（配列番号２の６７０〜６９６アミノ酸）、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号２１で示されるアミノ酸配列部分（配列番号８の６７２〜６９８アミノ酸）が挙げられ、さらに、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２６で示されるアミノ酸配列、並びに配列番号３４（配列番号２２または配列番号２３で示されるアミノ酸配列、並びに配列番号２２または配列番号２３のＮ末端アミノ酸残基１番目から６番目のアミノ酸配列）が挙げられる。
［００２３］
［００２４］
「ペリオスチンの抗細胞接着活性を中和する」とは、上述の「ペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域」が有する作用ないし活性を阻害することであり、具体的には、例えば、上述の抗細胞接着活性に関与する部位を特異的に認識できる抗体を用いて、ペリオスチンの有する作用ないし活性を阻害することである。
［００２５］
１つの態様において、本発明の抗体は、上記のような抗原を用いて得られるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体である。ここで、「モノクローナル抗体」とは、前述の抗原に反応性を有する任意のモノクローナル抗体であって、「モノクローナル抗体」には、前記の抗原を、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクローナル抗体（キメラ抗体）及びヒト化モノクローナル抗体（ヒト化抗体；ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体（ヒト抗体）も包含される。また、本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）またはＩｇＭである。
［００２６］
抗原に上記ペプチドを用いる場合には、それ自身抗原として用いることも可能であるが、抗原性を高めるために、上記ペプチドをポリビニルピロリドン、ラテックス、ポリメチルメタクリレートなどの巨大分子の物質に吸着させて免疫する方法、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：スカシ貝ヘモシアニン）やＢＳＡ（牛血清アルブミン）などのキャリアー蛋白に結合して用いる方法等があり、いずれの方法をも使用することができる。一般的にはペプチドをキャリヤー蛋白に結合して用いる方法が好ましく、結合方法は公知の方法を用いることができる（例えば、「続医薬品の開発、14巻、廣川書店、1991」）。ペプチドはキャリアー蛋白と結合させて方向性を持たせるために、ペプチドのＣ末端またはＮ末端にシステイン基を導入し、システイン基を介してキャリアー蛋白と結合させる方法が用いられる。この目的に合った結合方法であれば当技術分野において一般に用いられている架橋剤を用いることができる。スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（以下「SMCC」と略す）や３−マレイミドベンゾイックアシッド−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（MBS）などが適している。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタインによる細胞融合法（G.Kohler et al Nature (1975) 256,495-7) により作製されたハイブリドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離することにより調製される。すなわち、Ｅｘｏｎ−１７がコードするアミノ酸配列を有するペプチド等で哺乳動物を免疫した後、この動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを得る。Ｅｘｏｎ−１７に結合する抗体を産生するハイブリドーマの検索は、例えばハイブリドーマ上清について抗原を固定したマイクロプレートを用いる酵素免疫測定法（以下「ELISA」と略す）によって行われる。免疫に使用する動物としては特に制限はなく、各種の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を使用することができる。モノクローナル抗体の作製には、上記の免疫動物のうち、取扱い易さ等の理由により一般にはBalb/cマウスが用いられるが、他の系統のマウスを使用することもできる。その際、免疫に用いる抗原の濃度は、十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選択し、好ましくは１〜１００μgの抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、フロイント完全アジュバントあるいはフロイント不完全アジュバント等の懸濁液とし、動物に腹腔内注射または皮下注射などによって投与する。投与は２〜４週毎に１〜数回行う。最終免疫は通常１〜１００μg の抗原を添加した生理食塩溶液を静脈注射または皮下注射などにより投与して行われる。最終免疫の数日後に細胞融合のため免疫した動物から抗原産生細胞、例えばリンパ球、好ましくは脾臓細胞またはリンパ節細胞を取り出す。次に、抗体産生細胞として脾臓細胞を用いた場合について説明するが、脾臓細胞以外の抗体産生細胞も同様に細胞融合に供し得る。細胞融合は、最終免疫３〜４日後に無菌的に取り出した脾臓から調製した脾臓細と適当なミエローマ細胞を融合促進剤の存在下で細胞融合させる。融合に用いるミエローマ細胞は、哺乳動物からのものでよいが、一般には、免疫に用いた動物と同じ種の動物に由来するものが好適であり、既に公知の種々の細胞株、例えばマウスではSP2/0-Ag14(SP2)[[Nature, 276, 269(1978)]、NS-1-Ag4/1（NS-1）、P3-X63Ag8U.1（P3U1）[Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1-7(1978)：ATCCから入手可、ATCC No. CRL-1597]、P3-NS1-1-Ag4-1、P3-X63Ag8（P3）、FO、X63Ag8.653（X63.653）、210.RCY3.Ag1.2.3、S194/5XXO.BU1、SKO-007、GM15006TG-A12等が好適に使用され、ラットではY3.Ag1.2.3等が好適に使用される。好ましい融合促進剤として例えば、平均分子量が1000〜6000のポリエチレングリコール（PEG）のほかセンダイウィルスも使用できる。融合時の脾臓細胞とミエローマ細胞の混合比率は、一般に１０：１〜２：１の範囲が好ましい。
【００２７】
融合した細胞よりハイブリドーマの分離は、未融合の脾臓細胞、未融合のミエローマ細胞及び融合した細胞の混合物を未融合のミエローマ細胞が生存できない選択培地で、未融合の細胞が死滅するまでの適当な時間（約１週間）培養することにより行える。選択培地は、例えばHAT 培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）が使用される。この選択培地中では、未融合のミエローマ細胞は死滅し、また未融合の脾臓細胞は、非腫瘍性細胞であるので、一定期間後（約１週間後）死滅するので、生育できる細胞を選択することによりハイブリドーマを得ることができる。目的の抗体を産生するハイブリドーマは、通常の限界希釈法によって、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行える。このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、生育に適した培地中で生育でき、また超低温冷凍庫や液体窒素中などで容易に長期に保存が可能である。このようにして得られたハイブリドーマは、栄養培地中あるいは哺乳動物の腹腔内で増殖させることにより抗体を産生させることができ、産生した抗体は培養上清あるいはその哺乳動物の腹水または血清から精製することができる。本発明のハイブリドーマとしては、例えば、平成１８年１１月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８として寄託されているハイブリドーマを使用することができる。抗体の精製は、遠心分離、透析、硫酸アンモニウム等による塩析、DEAEカラム等によるイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどの一般的な単離、精製方法を用いて行うことができる。かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ouchterlony）法、ELISA法、またはRIA法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ELISA法またはRIA法を用いる場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び280nmにおける吸光度［1.4（OD280）＝イムノグロブリン１mg/ml］より算出する方法により行うことができる。この様にして得られた本発明のモノクローナル抗体は、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチン（ＰＮ−１）、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなるペプチド、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチド、およびヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列部位（TTKIITKVV；配列番号２２）或いはその一部を特異的に認識することができる。さらに好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドを認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号３）の少なくともＮ末端から１番目のトレオニンから６番目のトレオニンまでのアミノ酸配列部位（配列番号３４）またはその一部を特異的に認識することができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトペリオスチン−１タンパク質の抗細胞接着作用を抑制または阻害する、すなわちヒトペリオスチン−１タンパク質の抗細胞接着作用を中和する活性を有する。さらに、心不全時等に引き起こされる心拡大、心肥大および心線維化を抑制し、心機能を改善させることができる。
【００２８】
本発明の抗体としてポリクローナル抗体を使用する場合、ポリクローナル抗体は通常行われている方法、例えば「日本生化学会編、新生化学実験講座12、東京化学同人、1992」記載の方法によって得ることができる。免疫動物としては、特に限定されるものではないが、馬、山羊、羊、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどが挙げられる。免疫動物としてウサギを用いる場合には、抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントまたは水酸化アルミニウムアジュバントなどの懸濁液とし、10〜1000μg／回／匹を注射し、さらに２〜４週間後に追加免疫注射を１〜３回行い、抗血清を得る。注射は多数箇所の皮下に行うのが好ましい。抗血清からポリクローナル抗体の調製は、上記モノクローナル抗体の精製と同様の方法で行うことができる。この様にして得られた本発明のポリクローナル抗体は、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチン（ＰＮ−１）、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明のポリクローナル抗体は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなるペプチド、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチド、およびヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列部位（ＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２２）或いはその一部を特異的に認識することができる。さらに好ましくは、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（ＹＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドを認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号３）の少なくともＮ末端から１番目のトレオニンから６番目のトレオニンまでのアミノ酸配列部位（配列番号３４）またはその一部を特異的に認識することができる。さらに、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＰＮ−１タンパク質の抗細胞接着作用を抑制または阻害する、すなわちヒトペリオスチンＰＮ−１タンパク質の抗細胞接着作用を中和する活性を有する。さらに、心不全時等に引き起こされる心拡大、心肥大および心線維化を抑制し、心機能を改善させることができる。
［００２９］
ヒト型抗体の作製
免疫グロブリンＧ（以下、単に「ＩｇＧ」という。）は、分子量約２３０００の軽ポリペプチド鎖（以下「軽鎖」という）、分子量約５００００の重ポリペプチド鎖（以下「重鎖」という）の各２本ずつから構成される。重鎖、軽鎖とも約１１０残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を持ち、これらはＩｇＧの３次元構造の基本単位（以下、「ドメイン」という。）を構成する。重鎖および軽鎖は、それぞれ連続した４個、および２個のドメインから構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ：以下、「Ｖドメイン」という。）と呼ばれる。ＩｇＧのアミノ末端においては、重鎖、軽鎖のＶドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウスIgGの定常領域はヒトIgGの定常領域とは異なっているので、マウスIgGはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体（Human Anti Mouse Antibody：以下「HAMA」という。）応答が起こる（Schroff RW. et al Cancer Res. (1985)45,879-85）。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままHAMA応答を起こさないように抗体分子を修飾する必要がある。Ｘ線結晶構造解析の結果によれば、一般に、このようなドメインは３本から５本のβ鎖からなる逆平行βシートが二層重なり合った長円筒状の構造をとる。可変領域では、重鎖、軽鎖のＶドメインそれぞれにつき各３個のループが集合し、抗原結合部位を形成する。この各ループは相補性決定領域（complementarity determining region：以下、「CDR」という。）と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、一般に、CDRの構造を保持する役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。カバトらは、重鎖、軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、配列の保存性に基づき、それぞれの一次配列をCDRおよびフレームワークに分類した表を作成した（Kabatt et al. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E.A.）。また、各フレームワークは、アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さらに、ヒトとマウスの間で対応するフレームワークが存在することも見いだされた。このようなIgGの構造的特徴に関する研究から以下のヒト化抗体の作製法が考案された。研究初期の段階では、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提案された（Morrison SL. et al Proc Natl Acad Sci U S A. (1984)81,6851-5）。しかし、そのようなキメラ抗体は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むので、特に長期間投与した場合にはHAMA応答を誘導しうる（Begent et al., Br. J. Cancer, (1990)62, 487）。
【００３０】
ヒトに対しＨＡＭＡ応答を発現する可能性のある、非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸残基を更に少なくする方法として、CDR部分のみをヒト由来の抗体に組み込む方法が提案された（Peter T et al. Nature, (1986) 321, 522-5）が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活性を保持するにはCDRのみの移植では不十分であった。一方、チョッチアらは、1987年、Ｘ線結晶構造解析データを用い、（ａ）CDRのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とCDR自体の構造を維持する部位とが存在し、CDRの取り得る三次元構造は、複数の典型的なパターン（カノニカル構造）に分類されること、（ｂ）カノニカル構造のクラスは、CDRのみならずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした（Chothia C. et al. J. Mol. Biol. (1987)196, 901-17）。この知見に基づき、CDR移植法を用いる場合、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された（特表平4-502408号）。一般に、移植すべきCDRを有する非ヒト哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、CDRが移植される側のヒト抗体は「アクセプター」と定義され、CDR移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りCDRの構造を保存し、免疫グロブリン分子の活性を保持することにある。この目的を達成するためには、（ａ）アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか、及び、（ｂ）ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基を選択すべきか、の２点に留意する必要がある。
【００３１】
クィーンらは、ドナーのフレームワークのアミノ酸残基が、以下の基準の少なくともひとつに該当する場合、CDR配列とともにアクセプターに移植するデザインの方法を提唱した（特表平4-502408号）：
（ａ）アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通であること
（ｂ）該アミノ酸がCDRのひとつのすぐ近くであること
（ｃ）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約３Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原とまたはヒト化抗体のCDRと相互作用することができると予想されること。
【００３２】
本発明の抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNAは、上記抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを調製し、該mRNAを逆転写酵素でcDNAに変換してから、該抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNAをそれぞれ単離することにより得ることができる。
【００３３】
ヒト抗体の作製
本発明における「ヒト抗体」あるいは「ヒト免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域（VH）及びＨ鎖の定常領域（CH）並びにＬ鎖の可変領域（VL）及びＬ鎖の定常領域（ＣＬ）を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。換言すれば、Ｈ鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来するものである抗体を意味する。ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報（Ｍｅｎｄｅｚ ＭＪ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１５，１４６−５６，Ｇｒｅｅｎ ＬＬ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）７，１３−２１，表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；Ｎｉｌｓ Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６８，８５６−９，及び特表平６−５００２３３号公報）に記載の方法に従って作製することができる。
［００３４］
本発明で使用される抗体は、抗体の分子全体に限らず、抗細胞接着活性を有するペリオスチンの該活性を中和するものであれば、抗体の断片または誘導体であってもよい。
［００３５］
抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、ＣＤＲを含有するペプチド等を挙げることができる。
［００３６］
本発明の抗体断片のうちＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等は、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理して得ることができ、また、得られた抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
［００３７］
本発明の抗体断片のうちｓｃＦｖは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を、適当なペプチドリンカー等を用いて連結し、作製することができる。また、上記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
［００３８］
本発明の抗体断片のうちｄｓＦｖは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間でジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片であり、システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測により選択することができる。該抗体断片をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
［００３９］
本発明の抗体断片のうちＣＤＲを含有するペプチドは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖またはＬ鎖のＣＤＲ領域のうち、少なくとも１つのＣＤＲ領域以上を含んで構成される。また複数のＣＤＲ領域を適当なペプチドリンカーを介する等の方法により結合させてもよい。該ＣＤＲを含有するペプチドは、これをコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。また、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法等の化学合成によっても作製できる。
［００４０］
また、本発明では、上述の抗体または抗体断片に、蛋白質または低分子化合物を結合させた誘導体を使用することができ、これら修飾は、公知の方法で行うことができる。
［００４１］
［００４２］
１つの態様において、本発明の抗体、抗体断片又は誘導体は、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を予防または治療するために使用することができる。抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患とは、疾患の病態時に抗細胞接着活性を有するペリオスチンの遺伝子の発現が高く、該遺伝子によりコードされる蛋白質の産生が増加している疾患である。また、該遺伝子または蛋白質の増加により、病態が悪化する疾患のことである。このような抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患としては、特に限定されるものではないが、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎（急性及び慢性）、膵炎（急性及び慢性）、肝炎（急性及び慢性）、肝線維症または肺線維症を挙げることができる。また、本発明の抗体を適用できる癌としては、これに限定されるものではないが、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、悪性黒色腫、骨癌、膵臓癌、胃癌、皮膚癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、結腸癌、子宮癌、卵管癌、食道癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、及び腎臓癌を挙げることができ、特に好適には、乳癌、大腸癌、肺癌、及び悪性黒色腫を挙げることができる。
【００４３】
本発明はまた、上記の抗体をマーカー標識することにより作製した心不全などの抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の診断薬である。ここでマーカーとしては、酵素、放射性同位元素、蛍光色素等を用いることができる。ここで用いる酵素としては、ターンオーバー数（turn over number）が大きく、かつ酵素と結合しても安定であること、基質と特異的に反応して発色させることができる等の条件を満たす物であれば特に制限されるものではなく、通常の酵素免疫アッセイ（EIA）に用いられる酵素を使用することができる。好ましい酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。
【００４４】
これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法により行うことができる。基質としては、使用する酵素に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。マーカーとして用いる放射性同位元素としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、本診断薬は、不全心間質を特異的に染色することが可能な、免疫組織学的染色として使用することができる。また、放射性同位体を標識した場合には、体内に投与することによって、心不全時の病変部を画像化するために使用することもできる。
［００４５］
本発明はまた、本発明の抗体、抗体断片又は誘導体を用いることによる、ヒト又は動物の血液から血清を調製した生体試料中、すなわち血清中における抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出または定量する方法であり、さらに検出又は定量することによる心不全などの抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の診断方法である。本方法において、いわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）によって抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出することができる。本発明の診断キットを用いる場合には、まず抗ペリオスチン一次抗体を固相化したプレートに試料を接触させて両者を結合させ、この結合体にマーカー標識した抗ペリオスチン二次抗体を結合させ、この三者の結合体におけるマーカーのシグナル強度を測定することにより、抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出または定量することができる。、特に抗細胞接着活性を有するペリオスチンは、心不全等の病態時に特異的に発現するスプライシングバリアントであるので、その産生をモニターすることにより心不全等における病態の診断をすることができる。
［００４６］
このように、本発明の抗体を標識化して、二次抗体として使用する事が可能である。
［００４７］
本発明の抗体、抗体断片または誘導体を有効成分として含有する医薬組成物は、通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
［００４８］
本発明に係る医薬組成物の有効成分は、公知の薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤等と混合して医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法によって投与するのが好ましい。本発明の医薬組成物は、例えば、有効成分を生理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、安定剤、希釈剤、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等と、適宜混和することにより製造することができ、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤等として用いることができる。錠剤等に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチンのような結合剤、コーンスターチのような潤沢剤等を用いることができ、また糖衣又は医溶性若しくは腸溶性物質のフィルムにより被膜してもよい。カプセルの剤型である場合には、前記の組成物に更に液状担体を含有させることができる。注射のための無菌組成物も、通常の処方を適用して製造することができる。注射用の水性液としては、ブドウ糖などを含む等張液などが挙げられ、ポリエチレングリコールのような適当な溶解補助剤などと併用してもよい。また、緩衝剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤、無痛化剤などと配合してもよい。経口投与において、消化管内で有効成分が分解を受けやすい場合、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分をリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻腔内、舌下、肺などの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は、座剤、点鼻剤、舌下剤、経肺剤といった形態で投与することができる。
【００４９】
本発明の医薬組成物の投与量は、治療に用いられる場合、治療に有効な投与量が決められるが、当該投与量は投与対象者の年齢、体重、症状の程度および投与経路等によって異なり、個々の場合に応じて決められる。通常、経口投与による場合、成人一日当たりの投与量は０．１〜１０００ｍｇ程度であり、これを１ないし数回に分けて投与すればよい。持続静脈内投与においては０．０１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜１．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎの範囲で投与することができ、０．０２５μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜０．１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎで投与するのが望ましい。
【００５０】
以下、実施例を用いて本発明について詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
[実施例]
［製造例１］サブトラクション法によるペリオスチンの検索
１−１ 心不全病態モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取
雄性ダール食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）（清水実験材料）を６週齢より８％高食塩含有食で飼育し、心肥大期（１１週齢）および心不全期（１４週齢）に各３匹の左心室を採取した。
【００５１】
１−２ mＲＮＡの調整
総ＲＮＡは上記左心室約５００ｍｇからＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって調整した。次に心肥大期、心不全期それぞれ３匹分を合わせた総ＲＮＡ約４００μｇよりＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２．０ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがってｍＲＮＡを精製し、それぞれ約３μｇのｍＲＮＡを回収した。
【００５２】
１−３ ｃＤＮＡサブトラクション
ｃＤＮＡサブトラクションは、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（クローンテック社）により、説明書に記載の方法にしたがって行った。すなわち、上記１−２で得られたｍＲＮＡそれぞれ２μｇよりｃＤＮＡを合成し、制限酵素Ｒｓａｌで消化した。次に、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１１週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとし、テスターｃＤＮＡにｋｉｔ添付の２種類のアダプターを別々に連結させた後、サブトラクトハイブリダイゼーションを行った。次に、アダプターに相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現量に違いのあるｃＤＮＡ断片を特異的に増幅させ、増幅産物１を得た。
【００５３】
また、同様のサブトラクションを１１週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとして行い、得られた増幅産物を増幅産物２とした。
【００５４】
１−４ ドットブロットスクリーニング
Ａ．ドットブロットの作製
増幅産物１をＰＣＲ IIベクター（インビトロジェン社）にＴＡクローニングし、挿入断片の入ったクローンを選択した。各クローンの挿入断片を増幅したＰＣＲ反応後、それぞれ１μＬを熱処理後、２枚のナイロンメンブレンフィルター（ベーリンガー社）にドットブロットし、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社）により固定した。
【００５５】
Ｂ．ｃＤＮＡプローブの作製
増幅産物１を制限酵素Ｒｓａｌ及びＥａｅｌ、Ｓｍａｌで消化し、アダプターを除去し、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットII（ベーリンガー社）を用いて説明書に記載の方法に従ってＤＩＧ−ｄＵＴＰでランダムプライム標識を行い、ｃＤＮＡプローブ１を作製した。増幅産物２より同様にして、ｃＤＮＡプローブ２を作製した。
【００５６】
Ｃ．スクリーニング
上記Ａで作製したドットブロットメンブランの1枚をｃＤＮＡプローブ１、他の１枚をｃＤＮＡプローブ２とハイブリダイゼーションを行った。具体的には、ベーリンガー社のＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットIIを用いて、説明書に記載の方法にしたがい、ＤＩＧイージーハイブ液中４２℃で一晩ハイブリダイセーションを行った。2×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温にて５分間２回、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６８℃にて１５分間２回洗浄した後、キットに添付のブロッキングバッファー中でアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体と反応後、ＣＳＰＤ ｒｅａｄｙ−ｔｏ ｕｓｅを加えて化学発光を進行させ、Ｘ線フィルムを露光させた。ｃＤＮＡプローブ１でのシグナルがｃＤＮＡプローブ２でのシグナルより強いクローンをポジティブクローンとして選択し、塩基配列の決定を行った。
【００５７】
１−５ 塩基配列の決定
塩基配列は、ＴＨＥＲＭＯ ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM II ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いて自動ＤＮＡ配列読み取り装置モデル３７３Ａ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析することにより決定した。得られた遺伝子配列をＧｅｎＢａｎＫのデータバンクに照会した結果、クローンの１つ（ＳＦ０１４）がマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３６６４）と８６％ホモロジーのある遺伝子であることが判明した。
【００５８】
［製造例２］ラットペリオスチン ｃＤＮＡのクローニング
ラットペリオスチンｃＤＮＡの単離はλｇｔIIベクターに挿入されたｒａｔ ａｏｒ
ｔａ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ（クローンテック社）より作製した約４０００クローンのファージサブプール１０個（計約４万クローン）をＳＦ０１４の塩基配列を基に設計したプライマー（１）５’−ＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１５）、（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号１６）を用いてＰＣＲスクリーニングを行い、３個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅された断片をＡｌｋＰｈｏｓ ＤｉｒｅｃｔTM（アマシャムファルマシア社）を用いてアルカリフォスファターゼ標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い、１個のポジティブクローンラットペリオスチン＃１を得た。その挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、製造例１−５の方法に従って全塩基配列を決定した。
【００５９】
得られたクローンの長さは約３ｋｂであり、マウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の２９２番から３’−末端までに相当するものであり、５’−末端が欠けたクローンであることが示唆された。
【００６０】
そこで、ＳＭＡＲＴTM ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クローンテック社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって、ｒａｔ ａｏｒｔａ ｃＤＮＡを鋳型として、上記プライマー（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号１６）とラットペリオスチン＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）を用いて５’−ＲＡＣＥ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をインビトロジェン社のＰＣＲ IIベクターにＴＡクローニングし、ラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ ＃１と命名した。塩基配列を製造例１−５の方法にしたがって決定した。
【００６１】
その結果、ラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ ＃１は最初に得られたラットペリオスチン＃１より５’方向に約３００ｂｐ長いクローンであり、５’−末端はマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の５’−末端より１５ｂｐ長いクローンであった。さらにラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ ＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（４）５’−ＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１８）と上記プライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）を用いて上記ｒａｔ ａｏｒｔａ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙより作製した約４万クローンのファージサブプール１０個（計約４０万クローン）をＰＣＲスクリーニングすることにより２個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅される断片をプローブとしてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い１個のポジティブクローンを得、ラットペリオスチン＃２と命名した。挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、塩基配列を製造例１−５の方法にしたがって決定した。
【００６２】
得られたクローンの長さは約２．６ｋｂであり、５’−末端は５’−ＲＡＣＥで得られたクローンと同一であったが、３’−末端はマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の２４１０番までに相当するクローンであった。また、先に得られたラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ＃１の塩基配列とラットペリオスチン＃２の相当する領域の塩基配列は全く同一であった．ラットペリオスチン＃１とラットペリオスチン＃２よりラットペリオスチンｃＤＮＡの完全長を完成させた。この完全長ｃＤＮＡの塩基配列とこの塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号６及び１に示す。
【００６３】
［製造例３］Myc-His-ラットペリオスチン融合タンパク質発現ベクターの構築
製造例２で得られたラットペリオスチン遺伝子のコード領域から翻訳されるタンパク質のカルボキシル末端にＭｙｃエピトープと６個のヒスチジンタグを有し、ＣＭＶプロモーターを有する発現ベクターを作製した。
【００６４】
まず、ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２ベクター（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化したベクター断片に、製造例２で得られたラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ ＃１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約５００ｂｐの断片と製造例２で得られたラットペリオスチン＃１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａｌで消化して得られた約２７８０ｂｐの断片をライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られたプラスミドをｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ラットペリオスチンと命名した。このようにして作製したｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ラットペリオスチンを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａｌで消化し、ラットペリオスチン遺伝子のコード領域を含む約２３３０ｂｐの断片を得、製造例２で得られたラットペリオスチン＃１を鋳型としてその配列を基に設計したプライマー（５）５’−ＧＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１９）とラットペリオスチンの終止コドンの直前にＢｓｔＥＩＩサイトが挿入されるように設計したプライマー（６）５’−ＴＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、精製後、制限酵素ＳｍａｌとＢｓｔＥＩＩで消化して約２７０ｂｐの断片を得た。上記の２つの断片を、発現ベクター構築用のプラスミドｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｔｙｐｅ Ｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩで消化したベクター断片に、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ラットペリオスチンと命名した。挿入部分の全塩基配列は製造例に記載の方法により確認した。
【００６５】
［製造例４］バキュロウイルス用発現ベクターの構築
製造例３で得られたプラスミドｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ラットペリオスチンを、制限酵素ＳａｃＩ及びＰｍｅｌで消化し、ペプチド断片ｒａｔ ＰＮ−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを切り出した。これを、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ＳａｃＩとＫｐｎＩ（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）で消化して得られたベクター断片に、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られた発現ベクターをｐＦａｓｔＢａｃ／ラットペリオスチン−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓと命名した。挿入部分の塩基配列は製造例１−５に記載の方法により確認した。
【００６６】
［製造例５］組換えバキュロウイルスの調製および培養
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＤＨ１０ＢＡＣ細胞を、製造例５で得られたｐＦａｓｔＢａｃ／ラットペリオスチン−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓで形質転換し、組換えバキュロウイルスを調製した。得られたバキュロウイルスは、電気泳動およびＰＣＲにより、目的のものが挿入されていることを確認した。
【００６７】
この組換えバキュロウイルスをＭＯＩ＝０．１にて感染させた昆虫Ｓｆ９細胞（２×１０6 cells/mL）を、無血清培地（Ｓｆ−９００IIＳＦＭ（インビトロジェン社製）２０００ｍＬ中にゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加）中、２８℃で４〜５日培養した後、培養上清を回収した。
【００６８】
［製造例６］ラットペリオスチンタンパク質の精製
製造例５で得られた培養上清２０００ｍＬを平衡化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐH６．０ ０．１M塩化ナトリウム）で平衡化したＳＰｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ １０ｍＬ ｂｅｄに供し、得られたFlow Through（通過分画）をＳＰセファロース通過分画とした。
【００６９】
平衡化バッファーで２８０ｎｍの吸光度が０付近になるまで（約１００ｍＬ）洗浄し、ＳＰセファロース洗浄分画とした。
【００７０】
溶出バッファー（５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール）１００ｍＬで溶出し、ＳＰセファロース溶出分画とした。
次に、１００ｍＬのＳＰセファロース溶出分画を、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭイミダゾールで平衡化したＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ ５ｍＬ ｂｅｄに供し、得られた通過分画をＮｉ−ＮＴＡアガロース通過分画とした。
【００７１】
洗浄バッファー（５０ｍＬ リン酸２水素ナトリウム ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール）約５０ｍＬで洗浄し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース洗浄分画とした。
【００７２】
溶出バッファーは以下の通り（（１）５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、以降イミダゾール量が（２）３０ｍＭ、（３）４０ｍＭ、（４）５０ｍＭ、（５）６０ｍＭ）とし、それぞれ約２５ｍＬで溶出し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース溶出分画（１）〜（６）とした。
【００７３】
ウエスタンブロット法により目的蛋白が含まれることが確認された分画を、１ｍＬ以下に濃縮した。
【００７４】
次に、脱気したＰＢＳ（−）（１３７ mM ＮａＣｌ、８．１ mM Ｎａ２ＨＰＯ４、 ２．６８ mM ＫＣｌ、１．４７ mM ＫＨ２ＰＯ４）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ Φ１１ｍｍ×９５ｃｍ；容量：９０ｂｅｄ）に上記濃縮試料を供し、ＰＢＳ（−）で溶出し、凍結乾燥することにより、ラットペリオスチン精製タンパク質を得た。
【実施例１】
【００７５】
ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖の合成およびポリクローナル抗体の作製
ノーマルのＳＤラットの心臓にＰＮ−１遺伝子を高発現させると心拡大が惹起され、またダール心不全モデルラットの心臓にラットペリオスチンのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すると生存率が改善されたことに加え、報告されてきたＰＮ−２とは異なり、ラットＰＮ−１には細胞接着作用が無いことが明らかとなったことを受け、ラットＰＮ−１に特異的な構造は夫々の配列比較からＥｘｏｎ−１７配列であると同定した。このＥｘｏｎ−１７を構成するアミノ酸配列のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチドを、純度８０％以上にて10ｍｇ、化学合成した。キャリアタンパク質としてＫＬＨ６ｍｇを結合させたものをウサギ(Ｋｂｌ:ＪＷ)に免疫させた。免疫方法は初回免疫にはＦＣＡ(フロイント完全アジュバント)を使用し、２次免疫以降はＦＩＡ (フロイント不完全アジュバント)を使用した。また、投与部位は背部皮下２０ヶ所、投与週 は０、２、４、６週、投与量は初回免疫では８００μgペプチド/匹、2次免疫以降では４００μgペプチド/匹にて免疫した。抗体力価はＥＬＩＳＡ法にて測定し 投与週７週目に全血清を集めた。その後、合成ペプチドを用いたアフィニティーカラムを作製し、Ｅｘｏｎ−１７ペプチドに特異的に反応する抗体のみを回収した。以降、上記の、ラットペリオスチンのＥｘｏｎ−１７がコードするペプチドに対するポリクローナル抗体を、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体と称する。
実施例２
［００７６］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）の抗細胞接着活性の有無の検討
文献記載の方法（Ｒｕｗｈｏｆ Ｃ，ｖａｎ Ｗａｍｅｌ ＡＥ，Ｅｇａｓ ＪＭ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｒｓｅ Ａ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００ Ｍａｙ；２０８（１−２）：８９−９８、Ａｓｈｉｚａｗａ Ｎ，Ｇｒａｆ Ｋ，Ｄｏ ＹＳ，Ｎｕｎｏｈｉｒｏ Ｔ，Ｇｉａｃｈｅｌｌｉ ＣＭ，Ｍｅｅｈａｎ ＷＰ，Ｔｕａｎ ＴＬ，Ｈｓｕｅｈ ＷＡ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６ Ｎｏｖ．１５；９８（１０）：２２１８−２７）と同様な方法にて、ラットの心線維芽細胞を取得した。具体的には、生後１〜２日齢のＳＤラット２０匹をエーテル麻酔し、胸部をエタノールで消毒した。心臓を摘出しＰＢＳ（−）を入れたディッシュに入れ心臓を横断するように切って血液を出し、更にＰＢＳ（−）で３回洗浄後、出来るだけＰＢＳ（−）を捨て鋏にて細かく刻んだ。次に、ＰＢＳ（−）：コラゲナーゼ／トリプシンを１：１で混合し、３７℃で１５分間振盪した後、更にピペッティングを行い出来る限り細胞を分離させた。次に、白金メッシュを遠心管に置いて細胞分離液をろ過し、１０ｍｌの１０％血清入りＭ１９９培地と１０ｍｌのＰＢＳ（−）で白金メッシュを洗浄した。その後、遠心管を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿物として得られた細胞を、１０％血清入りＭ１９９培地２０ｍｌで攪拌しディッシュに播いた。３７℃、１時間放置後ディッシュに接着した細胞をラット心線維芽細胞として採取した。上述のラット心線維芽細胞を、９６穴プレートに６．４×１０４個／１００μｌずつ播き、一夜培養後、培養液を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）を加えた１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に変更し、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＤＭＥＭ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ：無血清培地）で細胞を２度洗い、終濃度１０μｇ／ｍｌになるように製造例にしたがって製造したラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）をＤＭＥＭ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）に添加した。陽性コントロールとして細胞接着促進作用を有するフィブロネクチンを、陰性コントロールとしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いた。３７℃で１時間培養後の顕微鏡観察においてラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）を添加した群は完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図２）。その結果、コントロールであるフィブロネクチンおよびＢＳＡを投与した群ならびに無添加群では接着していた細胞の剥離は起こらず、抗細胞接着作用が見られなかったが、ラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）を添加した群では細胞の剥離が認められたことから、ラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）は接着細胞の剥離作用、すなわち抗細胞接着作用を有していることが明らかとなった。
実施例３
［００７７］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体の中和活性の検討実施例２と同様の方法で得たＳＤラット由来の心線維芽細胞を、９６穴プレートに６．４×１０４個／１００μｌずつ播き、一夜培養後、培養液を１０μｇ／ｍｌのｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅを加えた１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に変更し、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＤＭＥＭ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）で細胞を２度洗い、終濃度１０μｇ／ｍｌのラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）と抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体を終濃度１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌになるようにＤＭＥＭ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）に添加した。陽性コントロールとしてラットペリオスチンタンパク質のみを、陰性コントロールとしてＢＳＡを用いた。３７℃で１時間培養後の顕微鏡観察においてラットペリオスチンタンパク質のみを添加した群はほぼ完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図３）。その結果、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体は、ラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）による接着細胞の剥離を抑制する、つまりラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）の抗細胞接着作用を抑制する、すなわちラットＰＮ−１の抗細胞接着作用を中和する活性を有した抗体であることが判明した。
実施例４
［００７８］
急性心筋梗塞モデルラットを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体の効果
体重２５０〜３００ｇのオスのルイスラットを用いて、ペントバルビタール麻酔薬（０．１ｍｌ／１００ｇ）を腹腔に投与し充分麻酔がかかった後に、ラット用手術台に固定した。経口より気管挿管しラット用のベンチレーターに接続し（一回換気量３ml、８０回/分）、胸骨左第３肋間より皮膚を横切開して、その下にある大胸筋も横切開を加え、ラット用開胸器を用いて肋間を広げて心臓を露出させた。
【００７９】
その後、左房の下付近にある左冠動脈を直径５mmの曲針を用いて1.0シルクで縛った。この時、左冠動脈の還流領域である前壁および側壁が赤色から白色に変化し冠血流が充分に遮断されており、同部位の壁運動が消失したことを目視下に確認し（シャムオペ群では針を冠動脈に通した後、糸で縛らず針を抜いた）、第３肋骨および第４肋骨を3.0シルクにて縛り固定した（この時肺を拡張させ胸郭の肺の外にある空気を出し、肺が拡張しやすいようにしてから縛った）。更に同様に皮膚の切開部位を3.0シルクにて縫い付けてからしばらく観察し、意識が回復し自発呼吸が出てきたことを確認してから抜管した。
【００８０】
以上の手順により、順次、急性心筋梗塞モデルを作製した。
【００８１】
翌日、イソフルレンによる経鼻麻酔下に経皮的心臓超音波検査を行ない、梗塞サイズが左室全周の２０％に満たない小さな梗塞モデルを除外した。その他の梗塞モデルを心機能の悪い順に序列し、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体投与群とコントロール抗体（ウサギＩｇＧ）投与群に交互に群分けし、各２００μｇずつを尾静脈より投与した。
【００８２】
抗体は、モデル作製の翌日に投与し、更に初回投与の６日毎に計4回、各群に投与した。
【００８３】
一方、1週間毎に8週間後まで経胸壁的に心臓超音波検査で心臓を評価した。8週間後には、ペントバルビタール麻酔薬下に気管挿管しベンチレーターに乗せた上で、左頚部より皮膚切開を行い、頚部の筋肉をピンセットで分けて、左総頚動脈を露出させ、左頚動脈起始部を糸かけて止血した上で、遠位部に小ハサミにて動脈に穴をあけ、同部位よりラット用のミラーカテーテルを挿入し左心室内に圧モニターのあるカテーテルの先端が届くようにして、コンピューターに接続し、心機能および血圧等を測定した。
【００８４】
モデル作製の4週後の心臓超音波検査の結果では、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体を投与した群ではウサギＩｇＧを投与したコントロール群に比べ、有意に、心臓の前壁厚および後壁厚が薄くなることが抑制され、拡張末期心内径および収縮末期心内径の拡大が抑制され、ならびに心臓の収縮機能の指標であるＥＦ値が上昇した。つまり、心拡大が抑えられ、心機能が改善したことが明らかとなった（図４−１〜図４−３）。さらに、モデル作製の８週後の心臓超音波検査の結果においても、上記の４週後の結果と同様に、心拡大の抑制および心機能の改善が確認された（図５−１〜図５−３）。この結果より、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体投与後約４週間後においても、該抗体による心拡大の抑制および心機能の改善効果が維持されることが示唆された。次に、血行動態においては、コントロールＩｇＧ抗体投与群に比べ抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体投与群では最大内圧変化率（（＋）ｄＰ／ｄＴ）、最小内圧変化率（（−）ｄＰ／ｄＴ）及び左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）に有意な差が得られたことから、心機能の改善が示唆された。（図６−１〜図６−３）。マッソントリクローム染色した心臓切片において、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体を投与した群ではコントロールＩｇＧ抗体を投与した群に比べ、青色に染まる部位が減少しており、線維化が抑制された（図７）。また、心筋細胞の短軸径の計測により抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体を投与した群ではコントロールＩｇＧ抗体を投与した群に比べ、有意に心筋細胞の短軸径の菲薄化が抑制されたことが明らかとなった（図８）。この結果は心臓超音波検査における結果と相関している。さらに、梗塞部位と非梗塞部位に分けた遺伝子発現解析の結果、非梗塞部位において、中和抗体投与群におけるエンドセリン−１（ＥＴ−１）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ、ＩＩＩ、ＴＧＦ−ｂｅｔａの発現量が、コントロール抗体投与群に比べ有意に減少し、ｓｈａｍ群とほぼ同等になり、改善効果がみられた（図９−１〜図９−５）。
【実施例５】
【００８５】
ヒトペリオスチン-１ｃＤＮＡの完全長クローニング
ヒト心臓由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社製、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．６４１００−１、Ｌｏｔ Ｎｏ．４１２０４９３）１μｇから作製したｃＤＮＡをテンプレートとして、全長クローニング用プライマーセンス鎖5'- AAGCTAGCCACCATGATTCCCTTTTTACCCAT-3'（配列番号２７）とアンチセンス鎖5' -AACTCCACAATTTCCCTCAT-3'（配列番号２８）を用いてＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラ−セ（東洋紡社製）によりＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてクローン化した。
【００８６】
このクローン群からヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７に相当する領域でセンス鎖5'-TAACCAAAGTTGTGGAACCAA-3'（配列番号２９）を、また、Ｅｘｏｎ−２１に相当する領域でアンチセンス鎖5'-TGTGTCTCCCTGAAGCAGTC-3' （配列番号３０）を作製し、これらのプライマーを用いて検出されるクローンを選別した。次に、選別したクローンの塩基配列を決定しスプライシングの起きていないクローンを選別し、ヒトペリオスチンー１ｃＤＮＡの完全長クローニングを完成させ、得られたクローンはｐＣＲ４／ヒトペリオスチンー１と命名した。
【実施例６】
【００８７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 翻訳用ヒトペリオスチンー１発現ベクターの構築
実施例５で得られたプラスミドｐＣＲ４／ヒトペリオスチンー１を、制限酵素Ｐｍｅ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化し、ＤＮＡ断片ヒトペリオスチンー１を切り出しｂｌｕｎｔｉｎｇ処理を行った。これを、CATCACCATCACCATCACTAA（6×Ｈｉｓ + 終止コドン）（配列番号３１）を予め挿入したｐＴＮＴ発現ベクター（プロメガ社製）のマルチクローニングサイトのＭｌｕ Ｉサイトを酵素消化後ｂｌｕｎｔｉｎｇ処理を行い、ライゲーションキット（宝酒造（株）社製）を用いて連結した。
【００８８】
次に、Ｈｉｓタグとのフレームを合わせる目的で合成リンカー（ｓｅｎｓｅ鎖5'-CTAGAAGACGATTAAGGGAAGGTCGTTCTCAGCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC-3' （配列番号３２）とantisense鎖5'-GGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGCTGAGAACGACCTTCCCTTAATCGTCTT-3' （配列番号３３））を作製し、制限酵素Ｘｂａ ＩとＳｍａ Ｉで消化したベクター断片にライゲーションキットを用いて連結した。連結部分の塩基配列を確認し、得られた発現ベクターをｐＴＮＴ／ヒトペリオスチンー１／Ｈｉｓと命名した。
【実施例７】
【００８９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 翻訳によるタンパク質の合成
実施例６で得られた発現ベクターはＴＮＴ ＳＰ６ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）に供してｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質の合成を行った。詳しくはｐＴＮＴ／ヒトペリオスチンー１／Ｈｉｓ発現ベクター２μｇに対し、ＳＰ６ Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを４０μｌ、１ｍＭメチオニンを１μｌ、ＤＥＰＣ処理水にて総量５０μｌとし、３０℃で９０分間反応させ精製するまで−８０℃で保存した。
実施例８
［００９０］
ヒトペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）の精製
実施例７で得られた合成タンパク質はＭａｇＺ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて精製した。詳しくは実施例７で得られた合成タンパク質にＭａｇＺ Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを２倍量加え良く混ぜた試料をＭａｇＺ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅに添加した。これを４℃で１時間撹拌した後、上清を除いてＭａｇＺ Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒにて４回ＭａｇＺ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅを洗浄後、ＭａｇＺ Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにて合成タンパク質を溶出し使用するまで−８０℃で保存した。
実施例９
［００９１］
ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖に対するモノクローナル抗体の作製
（１） 抗原の作製
ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７を構成するアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチド（配列番号２５）を、Ｆｍｏｃ法にて化学合成し、純度９０％以上のペプチド１０ｍｇを得た。このペプチド５ｍｇにキャリアタンパク質としてＫＬＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）５ｍｇを結合させ、抗原溶液を得た。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳ（０．０１Ｍ）に溶解して３．３ｍｇ／ｍＬに調整し、０．２５２４ｍｇ／ｍＬのＭＢＳ溶液（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を滴下して室温で６０分間攪拌し反応させた。ジクロロメタンを用いてフリーのＭＢＳを除き、ＫＬＨ−ＭＢを得た。このＫＬＨ−ＭＢ５ｍｇと、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した抗原ペプチド５ｍｇとを混合し、４℃で１２時間攪拌して反応させ、抗原溶液を得た。
（２） 免疫
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス３匹の両足に、（１）で得られたＫＬＨ結合抗原ペプチド１００μｇを含む抗原溶液５０μｌと、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）５０μｌとの混合乳濁液全量を皮下注射した。その後２週間間隔で２回、用時調製した上記抗原溶液とＦＩＡ (フロイント不完全アジュバント) との混合乳濁液を両足に投与した。その後、そのマウスを頸椎脱臼により致死させ、無菌的に足部リンパ節を採取した。
ＲＰＭＩ培地（コージンバイオ株式会社製）を供給しながら上記リンパ節を破砕し、孔径約１０μｍのメッシュを通過させて ＲＰＭＩ培地に懸濁状態のリンパ節細胞を得た。これを1000ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけて、リンパ節細胞を沈殿画分として得た。この沈殿画分に、０．８４ ％の塩化アンモニウム溶液に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４） を加えた溶液１ｍｌを入れて溶血させ、赤血球を除いた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけた。得られた沈殿画分（細胞画分）をRPMI培地で数回洗浄し、細胞融合に用いた。
(3) ミエローマ細胞の調製
８-アザグアニン耐性でかつイムノグロブリン非分泌型のマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１ 株）を、２０％のウシ胎児血清(ＦＣＳ) を含む ＲＰＭＩ培地で、１０％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で培養し、対数増殖期にある細胞を集め、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけて沈殿画分として細胞のみを取得し、ＲＰＭＩ培地に懸濁させた。
(4) 細胞の融合
(2)で得た免疫化リンパ節細胞１０8 〜３×１０8 個を含む RPMI培地と、 (3)で得たミエローマ細胞１０8 個を含むRPMI培地とを混合した後、１，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけた。上清を静かに除いて沈殿画分として細胞を取得し、これに２５％（ｗ／ｖ） のポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ １５００ 、ベーリンガー社製) １ｍｌを加えた後、更にＲＰＭＩ培地をゆっくりと加えて総量を１０ｍｌとした。これに２０％ ＦＣＳを含む ＲＰＭＩ培地１０ｍｌを加えて、少し静置させた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿画分（細胞画分）に２０％ ＦＣＳを含む ＲＰＭＩを加えて細胞濃度が１０6 個／ｍｌになるように調整した細胞懸濁液を、コーニング社製の９６穴培養プレートに２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター中で２４時間培養後、ＨＡＴ 溶液（インビトロジェン社製）を添加した後、更に２週間培養した。
(5)ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング
培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ｗｅｌｌのスクリーニングを行った。
【００９２】
アッセイ用の抗原溶液には、（１）で得られた抗原ペプチド２ｍｇに、キャリアタンパク質として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を結合させたコンジュゲートを用いた。
【００９３】
９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３５３９１２）の各ｗｅｌｌを、上記コンジュゲート１μg ／ｍｌで４℃下一夜静置してコーティングした。このプレートを洗浄後、（４）の培養上清（モノクローナル抗体を含む）５０μｌ を各ｗｅｌｌに滴下し、３７℃のインキュベーター内で２時間放置した後、ＰＢＳ（−） (リン酸緩衝液) で洗浄した。これにアルカリフォスターゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、３７℃インキュベーターで１時間放置し、ＰＢＳ（−） で洗浄後、発色基質剤(ＡＬＰ)を加えて２０分間発色させ、プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、 Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）で各ｗｅｌｌのＯＤ４９０ｎｍの吸光度（抗体価）を測定し、抗原ペプチドとの反応性を確認し、培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ｗｅｌｌを決定した。
(6) 抗体産生細胞のクローニング
（５）のＥＬＩＳＡ法で抗原ペプチドとの反応性が確認された陽性ｗｅｌｌ内の細胞から、限界希釈法により、抗体産生細胞株のクローニングを行った。すなわち、陽性ｗｅｌｌ内の細胞を９６穴培養プレートの各ｗｅｌｌに撒き込み、５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で２週間培養した。各ｗｅｌｌの培養上清について、（５）の方法と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて、抗原ペプチドとの反応性を確認し、陽性ｗｅｌｌについて、再度、限界希釈法によるクローニングを行い、抗原ペプチドとの反応性が高く、細胞コロニーの発育が良好な３０個の細胞を得た。これら細胞を２４穴培養プレートに移し、５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で２週間培養した。培養上清について、再び、（５）の方法と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて、抗原ペプチドとの反応性（抗体価）を確認した。ＯＤ４９０ｎｍの吸光度が高かった１０ｗｅｌｌ内の細胞、すなわち１０個のハイブリドーマ細胞株を、抗体産生細胞として有用であると判断し、選別した。
【００９４】
【化１】
【００９５】
このようにして得た抗体産生細胞は、本発明抗体である抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を常時産生するので、この抗体産生細胞を培養した培養液の上清液は、直接、本発明抗体溶液として使用することができる。なお、上記の抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）No.1（SBM337）は、平成１８年１１月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８として寄託されている。
（７）ヒトペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性の確認
（６）で得られた抗体産生細胞１０個が産生する抗体と、ヒトペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、実施例８で得られた合成タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンに（６）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の0.4mｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＥＣＬ ｐｌｕｓ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、（６）でクローニングした抗体産生細胞１０個全てが、ヒトペリオスチンＰＮ−１と結合することが確認された。
（8） モノクローナル抗体の大量調製と精製
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にプリスタン[２,６,１０,１４-テトラメチルペンタデカン(和光純薬製)]０.５ｍｌを投与し、２〜３週間飼育した。予め、対数増殖期に維持しておいたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ No.1およびNo.3を回収し、培養上清を除いた沈殿画分の細胞にＦＣＳ不含のＲＰＭＩ培地を加え、細胞数が１×１０7個／ｍｌになるように細胞液を調製した。この細胞液を、プリスタン前投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に注入し、３週間後頃から漏出した腹水を腹部より注射器で回収した。採取した腹水を、孔径０.２２μmφのフィルターを用いて濾過した後、濾液をプロテインＧ-セファロースカラム(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１１５１１３２４)によるアフィニティークロマトグラフィーによって常法に従い精製し、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体２種を調製した。
【実施例１０】
【００９６】
抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
得られたモノクローナル抗体２種（No.1およびNo.3）についてヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。すなわち、セルロースメンブレン上に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４；１位のスレオニンから２７位のグルタミン酸まで）のＮ末端から−９番目のフェニルアラニンから、Ｃ末端から９番目のイソロイシンまでの計４５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列において、下記のアミノ酸１０個からなるペプチド３６種を膜結合型ペプチドアレイを作製した（シグマアルドリッチジャパン株式会社カスタムＳｐｏｔｓ サービス）。
【００９７】
【化２】
【００９８】
このメンブレンを少量のメタノール中で５分間放置した後、ＴＢＳ溶液で３回洗浄した。ブロッキングバッファー（カゼイン、SPOTsに添付）を加えて、室温で２時間攪拌した。メンブレンに実施例９（８）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液中で１０分間振盪洗浄を３回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて２時間インキュベートした後、メンブレンをＴＢＳ溶液で５分間振盪洗浄を３回行った。検出用試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、モノクローナル抗体No.1およびNo.3は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなる合成ペプチドＮｏ．９、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでであり、ヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるのＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドとのみ反応し、結合した。
【実施例１１】
【００９９】
抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
実施例１で作製したポリクローナル抗体について、実施例１０と同様に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。その結果、実施例１０のモノクローナル抗体と同様に、該ポリクローナル抗体は合成ペプチドＮｏ．９とのみ反応し、モノクローナル抗体と同様の部位を特異的に認識していることが明らかとなった。従って、ラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製しても、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作製しても、同様な特異性をもつ抗体が得られることが示唆された。
【実施例１２】
【０１００】
ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性の確認
得られたモノクローナル抗体２種（No.1およびNo.3）について、ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、製造例６で得られた精製タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンにモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の0.4μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＥＣＬ ｐｌｕｓ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、得られたモノクローナル抗体２種はラットペリオスチンＰＮ−１とも結合することが確認された。
【実施例１３】
【０１０１】
抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例１０の結果から、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ部分はヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（TTKIITKVV；配列番号２２）を認識していることが明らかとなり、また実施例１２の結果において、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体がラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）とも結合することが確認された。このことから、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ部分はヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（TTKIITKVV；配列番号２２）のうち、ヒトとラットの種間においてアミノ酸に相違がない部分、すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号３）のＮ末端のスレオニンから７番目のリジンまでのアミノ酸配列の全部またはその一部分を認識していることが示唆された。そこで、さらに詳細にエピトープ部分を解析するために、アラニンスキャンの手法にて解析を行った。
【０１０２】
ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）のうち、一部のアミノ酸をアラニンに変換した下記１０種のペプチドを純度８０％以上で合成した。
＃１ YTTKIITKVV
＃２ ATTKIITKAA
＃３ AATKIITKAA
＃４ AAAKIITKAA
＃５ AAAAIITKAA
＃６ AAAAAITKAA
＃７ ATTKIITAAA
＃８ ATTKIIAAAA
＃９ ATTKIAAAAA
＃１０ ATTKAAAAAA
１ｍｇの合成ペプチドをＰＢＳ（−）５０μlで可溶化させ、１．５μlずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンに実施例９（８）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。
【０１０３】
その結果、該モノクローナル抗体は、上記合成ペプチド＃７（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）と強く反応し、＃１（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖の（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチド）および＃２（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（ＹＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および９〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）とは弱く反応し、＃３（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（ＹＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１〜２番目および９〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）および＃８（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（ＹＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および７〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）とは更に弱く反応した。
実施例１４
［０１０４］
抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
実施例１で作製したポリクローナル抗体について、実施例１３と同様に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。その結果、実施例１３のモノクローナル抗体と同様に、該ポリクローナル抗体は合成ペプチドＮｏ．＃７と強く反応し、＃１および＃２とは弱く反応し、＃３および＃８とは更に弱く反応し、モノクローナル抗体と同様の部位を特異的に認識していることが明らかとなった。従って、ラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製しても、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作製しても、同様な特異性をもつ抗体が得られることが示唆された。
実施例１５
［０１０５］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着活性の有無の検討
実施例２と同様に、ヒト心線維芽細胞（大日本製薬（株）社製、ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＣＳ−ＡＢＩ−５１１８）を、９６穴プレートに６．４×１０４個／１００μｌずつ播き、一夜培養後、培養液を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）を加えた１０％ＦＢＳ添加ＣＳＣ培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）に変えて、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＣＳＣ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）で細胞を２度洗い、終濃度１μｇ／ｍｌになるように実施例にしたがって作製したヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）をＣＳＣ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）に添加した。陽性コントロールとして細胞接着促進作用を有するフィブロネクチンを、陰性コントロールとして細胞接着作用を持たないＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いた。３７℃で３．５時間培養後の顕微鏡観察においてヒトペリオスチンタンパク質を添加した群は完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図１０）。その結果、コントロールであるフィブロネクチンおよびＢＳＡを投与した群ならびに無添加群では抗細胞接着作用が見られなかったが、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）を添加した群では細胞の剥離が認められたことから、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）は抗細胞接着作用を有していることが明らかとなった。
実施例１６
［０１０６］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の中和活性の検討
実施例３と同様に、ヒト心線維芽細胞を、９６穴プレートに６．４×１０４個／１００μｌずつ播き、一夜培養後、培養液を１０μｇ／ｍｌのｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅを加えた１０％ＦＢＳ添加ＣＳＣ培地に変更し、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＣＳＣ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）で細胞を２度洗い、終濃度１μｇ／ｍｌのヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）と抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（Ｎｏ．１およびＮｏ．３）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるようにＣＳＣ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）に添加した。陽性コントロールとしてヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のみを、陰性コントロールとしてＢＳＡを用いた。３７℃で３．５時間培養後の顕微鏡観察においてヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のみを添加した群はほぼ完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図１１）。その結果、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体は、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着作用を抑制する、すなわちヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着作用を中和する活性を有した抗体であることが判明した。
また、上述のように、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のＥｘｏｎ−１７に対する抗体であり、かつ、Ｅｘｏｎ−１７のＮ末端１番目から６番目のアミノ酸配列或いはその一部を特異的に認識する抗体により、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着作用が抑制されたことから、Ｅｘｏｎ−１７、少なくともＥｘｏｎ−１７のＮ末端１番目から６番目のアミノ酸配列からなるペプチド部分又はその一部が、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着作用に関与する領域を構成していることが示唆された。
実施例１７
［０１０７］
急性心筋梗塞モデルラットを用いた抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の効果
実施例４と同様に、体重２５０〜３００ｇのオスのルイスラットを用いて、ペントバルビタール麻酔薬（０．１ｍｌ／１００ｇ）を腹腔に投与し充分麻酔がかかった後に、ラット用手術台に固定した。経口より気管挿管しラット用のベンチレーターに接続し（一回換気量３ｍｌ、８０回／分）、胸骨左第３肋間より皮膚を横切開して、その下にある大胸筋も横切開を加え、ラット用開胸器を用いて肋間を広げて心臓を露出させた。
［０１０８］
その後、左房の下付近にある左冠動脈を直径５ｍｍの曲針を用いて１．０シルクで縛った。この時、左冠動脈の還流領域である前壁および側壁が赤色から白色に変化し冠血流が充分に遮断されており、同部位の壁運動が消失したことを目視下に確認し（シャムオペ群では針を冠動脈に通した後、糸で縛らず針を抜いた）、第３肋骨および第４肋骨を３．０シルクにて縛り固定した（この時肺を拡張させ胸郭の肺の外にある空気を出し、肺が拡張しやすいようにしてから縛った）。更に同様に皮膚の切開部位を３．０シルクにて縫い付けてからしばらく観察し、意識が回復し自発呼吸が出てきたことを確認してから抜管した。
［０１０９］
以上の手順により、順次、急性心筋梗塞モデルを作製した。
［０１１０］
翌日、イソフルレンによる経鼻麻酔下に経皮的心臓超音波検査を行ない、梗塞サイズが左室全周の２０％に満たない小さな梗塞モデルを除外した。その他の梗塞モデルを心機能の悪い順に序列し、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（Ｎｏ．３）投与群とコントロール抗体（ウサギＩｇＧ）投与群に交互に群分けし、各２００μｇずつを尾静脈より投与した。
［０１１１］
抗体は、モデル作製の翌日に投与し、更に初回投与の６日毎に計４回、各群に投与した。
［０１１２］
一方、１週間毎に４週間後まで経胸壁的に心臓超音波検査で心臓を評価した。モデル作製の４週後の心臓超音波検査の結果では、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を投与した群ではウサギＩｇＧを投与したコントロール群に比べ、有意に、心臓の前壁厚および後壁厚が薄くなることが抑制され、拡張末期心内径および収縮末期心内径の拡大が抑制され、ならびに心臓の収縮機能の指標であるＦＳ値或いはＥＦ値が上昇した。つまり、心拡大が抑えられ、心機能が改善したことが明らかとなった（図１２−１〜図１２−３）。また、上述のように、急性心筋梗塞モデルラットにおいて、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のＥｘｏｎ−１７に対する抗体であり、かつ、少なくともＥｘｏｎ−１７のＮ末端１番目から６番目のアミノ酸配列を含んで構成されているエピトープを持つ抗体により、心拡大の抑制および心機能の改善効果が示されたことから、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のＥｘｏｎ−１７、特に少なくともＥｘｏｎ−１７のＮ末端１番目から６番目のアミノ酸配列からなるペプチド部分を含む領域が、心筋梗塞後の心拡大および心機能の悪化に関与する領域であることが示唆された。
産業上の利用可能性
［０１１３］
抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体を用いることにより、心不全などの疾患で発現が増大する抗細胞接着活性を有するペリオスチンの作用を抑制し、病態の増悪化の抑制および組織の機能の改善を行うことにより、ペリオスチンが関与する疾患の予防および治療を行うことができる。また、患者の生体試料中の該ペリオスチン量を測定することにより、疾患の有無および病状の進行程度を知ることができる。
技術分野
［０００２］
本発明は、抗細胞接着作用を有するペリオスチンに対する抗体、特に抗細胞接着作用を中和する能力を有する抗ペリオスチン抗体に関する。更に詳しくは、心肥大組織をはじめとして組織再構築の間質において特異的に発現する、抗細胞接着作用を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識する抗ペリオスチン抗体であって、心不全などのペリオスチンが関与する疾患の予防もしくは治療またはこれらの疾患の診断に有用な抗体に関する。
背景技術
［０００３］
慢性心不全は、心筋収縮力の低下により、心臓が各臓器へ十分量の血液を拍出できない状態に陥る疾患である。従来、その治療には、心筋収縮力を増加させるジギタリス製剤等の強心剤が使用されてきた。しかし、これらの薬剤は心筋エネルギーの過剰消費により、長期投与においては生命予後を悪化させることが明らかになっている。そのため、最近では、心不全状態で亢進している交感神経系やレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系による心臓への過剰な負荷を軽減させる利尿剤やβ遮断薬、アンジオテンシン阻害薬による治療が主流になってきている。しかし、依然として、心不全患者は激しい運動ができないなど日常生活が制限され、生活の質を保つことができず、さらに、心不全患者の生命予後を十分に担保できていないため、生活の質の改善および長期生命予後の改善が可能である有効な新規心不全治療薬の開発が望まれている。
［０００４］
一方、ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質の一種であり、分子量約９万のポリペプチドからなる。各ポリペプチド鎖には、シグナル配列、システインリッチドメイン、４回繰り返しドメイン、Ｃ末端ドメインが含まれている。
【０００５】
ペリオスチンは、当初、骨芽細胞特異的因子−2（ＯＳＦ−2）と呼ばれ、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に特異的に発現している遺伝子として分離同定されたが（特許文献１、非特許文献１）、後に現在の名称であるペリオスチンと呼ばれるようになり、骨芽細胞における接着促進活性が報告された（非特許文献２）。
【０００６】
初期の研究では、ペリオスチンは骨組織に特異的に発現する細胞外マトリックスであると考えられていた。しかし、現在では骨組織のみならず心不全（非特許文献３、非特許文献４）、動脈瘤（非特許文献５）、高転移性癌（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）、子癇前症（非特許文献９）等の発症において極めて高く発現しており、また正常組織においてもごく僅かであるが発現していることが明らかになっている。また、いくつかのペリオスチンスプライシングバリアントが骨芽細胞で発現していることも明らかになっている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献１０、特許文献３）。
【０００７】
ペリオスチンの作用について、細胞接着作用に関しては、811アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−2に相当）（非特許文献２）および782アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（非特許文献１１）が細胞接着作用を有すると報告されていた。これに対し、838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）は、該ペリオスチンスプライシングバリアントをコーティングしたプレートには心線維芽細胞が接着しないこと、すなわち細胞接着活性を有しないこと、正常ラットに比べ心不全モデルラットにおいて838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）の遺伝子発現が有意に増加していること、加えてそれが心拡大を惹起させる増悪因子であること、およびこのタンパク質の発現を抑制すると有意に生存率が上昇したことが報告されている（非特許文献３）。さらに、838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアントに対するアンチセンスヌクレオチドを用いて、該ペリオスチンスプライシングバリアントの発現を抑制することによる心不全の予防剤または治療剤について報告されている（特許文献２）。
【０００８】
このように、ペリオスチン遺伝子の発現が心不全の病態に関連することが示唆されているが、ペリオスチンスプライシングバリアントの構造と心不全の関連については不明である。そこで、本発明者らは、抗体を用いて心不全病態に関与するペリオスチンの構造を明らかにすることを試みた。
［０００９］
ペリオスチン抗体については、ペリオスチンの細胞遊走阻害に関する抗体（非特許文献１２）およびペリオスチンによる細胞の増殖抑制活性を有する抗体（非特許文献１３）が報告されている。しかし、ペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域の構造に関する抗体の報告は未だなく、また、ペリオスチンの細胞接着活性と心不全などの疾患との関係についての報告も何らなされていない。
特許文献１：特開平５−２６８９８２号公報
特許文献２：再公表特許ＷＯ０２／０２００５５号公報
特許文献３：国際公開ＷＯ２００５／０１９４７１号公報
非特許文献１：Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ（１９９３）２９４，２７１−８
非特許文献２：Ｈｏｒｉｕｃｈｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．（１９９９）１４，１２３９−４９
非特許文献３：Ｋａｔｓｕｒａｇｉ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（２００４）１１０，１８０６−１３
非特許文献４：Ｗａｎｇ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ（２００３）４２，８８−９５
非特許文献５：Ｐｅｔｅｒｓ ＤＧ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ（２００１）３２，１０３６−４２
非特許文献６：Ｓｈａｏ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００４）２４，３９９２−４００３
非特許文献７：Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＨＥ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．（２００３）１２９，７５４−９
非特許文献８：Ｓａｓａｋｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．（２００３）７７，２４５−５２
非特許文献９：Ｓａｓａｋｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．（２００２）１８６，１０３−８
非特許文献１０：Ｌｉｔｖｉｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００４）９２，１０４４−６１
非特許文献１１：Ｇｉｌｌａｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００２）６２，５３５８−６４
非特許文献１２：Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．（２００５）２５，７７−８３
非特許文献１３：Ｔａｉ ＩＴ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ（２００５）２６，９０８−１５
発明の開示
［００１０］
本発明の目的は、生活の質の改善および長期生命予後の改善が可能である有効な新規心不全の予防剤または治療剤等を提供することである。詳しくは、抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識する抗体を提供することである。また、該抗体を産生するハイブリドーマ、該ハイブリドーマの製造方法、該ハイブリドーマを培養することによる該抗体の製造方法を提供する。さらに、該抗体を含有する抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。さらに、該医薬組成物を患者に投与することからなる抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防または治療方法、ならびに該疾患の診断方法を提供する。
［００１１］
本発明者らは、細胞接着活性を有しないペリオスチンスプライシングバリアント（ＰＮ−１）が抗細胞接着活性、すなわち接着した細胞を剥離する活性を有することを明らかにし、また、一方、細胞接着活性を有するペリオスチン（ＰＮ−２）は抗細胞接着活性を有さない、すなわち接着した細胞を剥離しないことを確認した。そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンスプライシングバリアント（ＰＮ−１）と、抗細胞接着活性を示さないペリオスチン（ＰＮ−２）において、その構造と細胞接着における活性の相違に注目し、抗細胞接着活性を有するペリオスチンスプライシングバリアントに特異的に存在する領域を阻害することにより、抗細胞接着活性を有するペリオスチン関連疾患の予防または治療が可能であると考えた。つまり、該領域に対する阻害物質が、抗細胞接着活性を有するペリオスチン関連疾患の予防または治療剤として有用であると考えた。
［００１２］
心不全時に発現が亢進するペリオスチンスプライシングバリアントを調べた結果、スプライシングバリアントが形成されるＣ−末端ドメインは、ｅｘｏｎ（エクソン）１５から２３で構成されているが、ラットでは、下記（１）から（４）が存在することが明らかとなった。
（１）全てを保持しているもの（ＰＮ−１と呼ぶ；配列番号１として示す８３８アミノ酸からなる；ｃＤＮＡ配列を配列番号６として示す）、
（２）Ｅｘｏｎ−１７が欠失しているもの（ＰＮ−２と呼ぶ；配列番号５として示す８１１アミノ酸からなる；ＰＮ−１から配列番号３で示される２７アミノ酸（Ｅｘｏｎ−１７）が欠失しているもの；ｃＤＮＡ配列を配列番号７として示す）、
（３）Ｅｘｏｎ−２１が欠失しているもの（ＰＮ−３と呼ぶ；８１０アミノ酸からなる）、
（４）Ｅｘｏｎ−１７とＥｘｏｎ−２１が欠失しているもの（ＰＮ−４と呼ぶ；７８３アミノ酸からなる）
また、ラット以外でも、マウス及びヒトについてＰＮ−1及びＰＮ−2が見出されている（マウスＰＮ−1：配列番号８（アミノ酸配列）、配列番号９（cDNA配列）；マウスＰＮ−2：配列番号１０（アミノ酸配列）、配列番号１１（cDNA配列）；ヒトＰＮ−1：配列番号１２（cDNA配列）；ヒトＰＮ−2：配列番号１３（アミノ酸配列）、配列番号１４（cDNA配列））。そして、これらのうち、ラットの心肥大組織ではＰＮ−1が多く発現しており、ＰＮ−2およびＰＮ−3の発現量は少なかった。そこで、本発明者らは、ＰＮ−1とＰＮ−2の構造上異なる部位であり、ＰＮ−1のみに存在するＥｘｏｎ−１７部位の阻害物質として、該部位がコードするアミノ酸配列部分を特異的に認識する抗体の作製を検討した。
【００１３】
抗体を作製するためには、免疫原として用いる物質が親水性であることが必要であり、また、タンパク質のような大きなポリペプチドの一部分を用いて抗体を作製する際には、免疫原として使用する部分が、該タンパク質の表面に出ており、エピトープ部分を構成していることが必要である。そこで、Ｅｘｏｎ−１７ペプチド鎖を抗原として用いることの可能性を検討するために、最初に、バイオインフォマティクス分野で汎用されているaccelrys社のソフト、Mac Vector 7.2を使用してエピトープ検索を行なった。その結果、“親水性（Hydrophilicity）”、“表面への露出のしやすさ（Surface Probability）”および“抗原性（Antigenicity）”から見て、Ｅｘｏｎ−１７領域のTTKIITKLVEPKIKVIQGSLQPIIKTE（配列番号３）は殆どが疎水性領域であり、タンパク質分子の表面に出ている可能性が非常に低いことが示唆され、抗原性を有しておらず、抗体が作製できないと考えられ、実際に抗体を作製することは困難であることが予想された。
【００１４】
しかしながら、本発明者らは、ＰＮ−１の機能を特異的に阻害するためには、ＰＮ−１に特異的に存在するＥｘｏｎ−１７がコードするペプチド領域に対する抗体の使用が最適であるとの考えのもと、Ｅｘｏｎ−１７がコードするアミノ酸配列に対する抗体の作製を遂行した。Ｅｘｏｎ−１７領域がコードするペプチドを構成する27アミノ酸からなるペプチドを合成し、ウサギに免疫させ、得られた血清からIgG画分を精製し、抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチドポリクローナル抗体を作製した。次に80％コンフルエントに培養した心線維芽細胞にペリオスチンタンパク質ＰＮ−１を添加すると、ほぼ100％の細胞の脱離（すなわち、抗細胞接着活性）が観察された。この実験系に抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチド抗体を投与した結果、ペリオスチンタンパク質ＰＮ−１による細胞の脱離を抑制したことから、該抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチド抗体はペリオスチンタンパク質ＰＮ−１に対する中和活性を持つ抗体で有ることが明らかとなった。次に、急性心筋梗塞モデルラットを作製し、抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチド抗体を週に一度投与し続けたところ、モデル作製後４週間で心臓の拡大が有意に抑えられ、また心機能が改善されることが明らかとなった。さらに、モデル作製後８週間でも、上述の効果が持続すること、および心線維化が抑制されることが明らかとなった。これにより、抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチド抗体が心不全病態の進行とともに起こる心拡大および心線維化を抑制する活性、ならびに心機能を改善させる活性を持つ抗体であることが明らかとなり、本発明を完成するに至った。
［００１５］
本発明は、前記の課題を解決するものとして、心不全時等の心臓に特異的に発現する抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体、特に抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識する抗体を提供するものである。
［００１６］
すなわち、本発明としては、以下を挙げることができる。
（１）抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、且つ当該ペリオスチンの抗細胞接着活性を中和する活性を有する抗体。
（２）抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域が、エクソン−１７又は当該エクソンの一部によりコードされるアミノ酸配列である（１）記載の抗体。
（３）エクソン−１７又は当該エクソンの一部によりコードされるアミノ酸配列が、配列番号３、４、２１、２２、２３、２４、２６および３４で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列である（２）記載の抗体。
（４）アミノ酸配列が、配列番号３、４又は２１で示されるアミノ酸配列である（３）記載の抗体。
（５）抗体が、モノクローナル抗体である（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）ハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８により産生される（５）記載の抗体。
（７）配列番号３、４及び２１で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドで哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて得られるハイブリドーマ。
（８）ハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８。
（９）配列番号３、４及び２１で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドで哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する（５）記載の抗体を製造する方法。
（１０）ハイブリドーマが、ハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８である（９）の製造方法。
（１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含有する医薬組成物。
（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含有する、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防又は治療用医薬組成物。
（１３）前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎、膵炎、肝炎、肝線維症又は肺線維症である（１２）記載の医薬組成物。
（１４）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を患者に投与することからなる、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防又は治療方法。
（１５）前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎、膵炎、肝炎、肝線維症又は肺線維症である（１４）記載の予防または治療方法。
（１６）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を用いて、生体試料中のペリオスチン量を測定することからなる、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を診断する方法。
（１７）用いる抗体が、標識化された抗体である（１６）記載の診断方法。
（１８）前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎、膵炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である（１６）又は（１７）記載の診断方法。
（１９）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を用いて、生体試料中の抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。
（２０）（１）〜（６）のいずれかに記載の抗体を含む、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の診断薬。
（２１）前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎、膵炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である、（２０）記載の診断薬。
【図面の簡単な説明】
［００１８］
［図１］図１は、ラットのペリオスチンのスプライシングバリアントを示す模式図である。
［図２］図２は、ラットＰＮ−１の抗細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例２）。
［図３］図３は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体のラットＰＮ−１活性阻害について測定した結果を示す図である（実施例３）。
［図４−１］図４−１は、急性心筋梗塞モデル作成後４週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：前壁厚、後壁厚）。
［図４−２］図４−２は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能）。
［図４−３］図４−３は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：心拍数、梗塞エリア）。
［図５−１］図５−１は、急性心筋梗塞モデル作製後８週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：前壁厚、後壁厚）。
［図５−２］図５−２は、急性心筋梗塞モデル作製後８週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能）。
［図５−３］図５−３は、急性心筋梗塞モデル作製後８週間後における抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例４：心拍数、梗塞エリア）。
【図６−１】図６−１は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例４：ＬＶＰ、心拍数）。
【図６−２】図６−２は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例４：（＋）ｄＰ／ｄｔ、（−）ｄＰ／ｄｔ）。
【図６−３】図６−３は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例４：ＳＢＰ、ＤＢＰ、ＬＶＥＤＰ）。
【図７】図７は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの組織学的に検討した結果を示す図である（実施例４）。
【図８】図８は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの心筋細胞の短軸径を示す図である（実施例４）。
【図９−１】図９−１は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：Ｇ３ＰＤＨ）。
【図９−２】図９−２は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：ＥＴ−１／Ｇ３、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ／Ｇ３）。
【図９−３】図９−３は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：α−ＭＨＣ／Ｇ３、β−ＭＨＣ／Ｇ３）。
【図９−４】図９−４は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：Ｃｏｌ−Ｉ／Ｇ３、Ｃｏｌ−ＩＩＩ／Ｇ３）。
【図９−５】図９−５は、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例４：ＴＧＦ−β／Ｇ３、ＴＮＦ−α／Ｇ３）。
【図１０】図１０は、ヒトＰＮ−１の抗細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例１５）。
【図１１】図１１は、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のヒトＰＮ−１活性阻害について測定した結果を示す図である（実施例１６）。
【図１２−１】図１２−１は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例１７：前壁厚、後壁厚）。
［図１２−２］図１２−２は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例１７：拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能）。
［図１２−３］図１２−３は、急性心筋梗塞モデル作製後４週間後における抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例１７：心拍数、梗塞エリア）。
発明を実施するための最良の形態
［００１９］
１つの態様において、本発明は、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体を提供する。ここで、ペリオスチンは、細胞外マトリックスの一種であり、いくつかのスプライシングバリアントの存在が知られており、そのいくつかは、心不全時等の心臓に特異的に発現する。心不全時等の心臓に特異的に発現するペリオスチンスプライシングバリアントの機能を阻害する物質、すなわち阻害剤として、本発明においては、特異性が高い、ヒトへの安全性が高い、などの理由から、抗体を使用できる。本発明では、スプライシングバリアントが形成されるＣ−末端ドメインのＥｘｏｎ−１７領域がコードするアミノ酸配列からなるペプチドを化学合成したものを抗原として、抗体を作製できるが、係るペプチドは、ペリオスチンタンパク質の酵素消化や遺伝子工学的手法などによっても得られ、その由来は問わない。
［００２０］
本発明において、「抗細胞接着活性を有する」とは、接着している細胞を剥離若しくは脱離させる作用を有することである。また、「抗細胞接着活性を有さない」とは、接着している細胞を剥離若しくは脱離させることがないことであり、この時、細胞は接着状態を維持することとなる。抗細胞接着活性の有無は、心線維芽細胞などの細胞を培養プレートで培養して該細胞を培養プレートに接着させた後、検定用試料を添加して培養、洗浄して剥離した細胞を除去した後に、残存している細胞を染色し、接着していた細胞の残存状態を確認することにより、判断することができる。
［００２１］
また、本発明において、抗細胞接着活性を有するペリオスチンとしては、好ましくは、配列番号１（ラットペリオスチンＰＮ−１、８３８アミノ酸）、配列番号２（ヒトペリオスチンＰＮ−１、８３６アミノ酸：ラットペリオスチンよりもＮ末端のシグナル配列が２アミノ酸少ない）、または配列番号８（マウスペリオスチンＰＮ−１）のアミノ酸配列からなるペリオスチンを挙げることができる。
［００２２］
ペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域としては、例えばＥｘｏｎ−１７部位を挙げることができる。具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号３で示されるアミノ酸配列部分（配列番号１の６７２〜６９８アミノ酸）、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号４で示されるアミノ酸配列部分（配列番号２の６７０〜６９６アミノ酸）、配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号２１で示されるアミノ酸配列部分（配列番号８の６７２〜６９８アミノ酸）が挙げられ、さらに、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２６で示されるアミノ酸配列、並びに配列番号３４（配列番号２２または配列番号２３で示されるアミノ酸配列、並びに配列番号２２または配列番号２３のＮ末端アミノ酸残基１番目から６番目のアミノ酸配列）が挙げられる。
［００２３］
［００２４］
「ペリオスチンの抗細胞接着活性を中和する」とは、上述の「ペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域」が有する作用ないし活性を阻害することであり、具体的には、例えば、上述の抗細胞接着活性に関与する部位を特異的に認識できる抗体を用いて、ペリオスチンの有する作用ないし活性を阻害することである。
［００２５］
１つの態様において、本発明の抗体は、上記のような抗原を用いて得られるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体である。ここで、「モノクローナル抗体」とは、前述の抗原に反応性を有する任意のモノクローナル抗体であって、「モノクローナル抗体」には、前記の抗原を、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクローナル抗体（キメラ抗体）及びヒト化モノクローナル抗体（ヒト化抗体；ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体（ヒト抗体）も包含される。また、本発明の抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）またはＩｇＭである。
［００２６］
抗原に上記ペプチドを用いる場合には、それ自身抗原として用いることも可能であるが、抗原性を高めるために、上記ペプチドをポリビニルピロリドン、ラテックス、ポリメチルメタクリレートなどの巨大分子の物質に吸着させて免疫する方法、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：スカシ貝ヘモシアニン）やＢＳＡ（牛血清アルブミン）などのキャリアー蛋白に結合して用いる方法等があり、いずれの方法をも使用することができる。一般的にはペプチドをキャリヤー蛋白に結合して用いる方法が好ましく、結合方法は公知の方法を用いることができる（例えば、「続医薬品の開発、14巻、廣川書店、1991」）。ペプチドはキャリアー蛋白と結合させて方向性を持たせるために、ペプチドのＣ末端またはＮ末端にシステイン基を導入し、システイン基を介してキャリアー蛋白と結合させる方法が用いられる。この目的に合った結合方法であれば当技術分野において一般に用いられている架橋剤を用いることができる。スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（以下「SMCC」と略す）や３−マレイミドベンゾイックアシッド−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（MBS）などが適している。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタインによる細胞融合法（G.Kohler et al Nature (1975) 256,495-7) により作製されたハイブリドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離することにより調製される。すなわち、Ｅｘｏｎ−１７がコードするアミノ酸配列を有するペプチド等で哺乳動物を免疫した後、この動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを得る。Ｅｘｏｎ−１７に結合する抗体を産生するハイブリドーマの検索は、例えばハイブリドーマ上清について抗原を固定したマイクロプレートを用いる酵素免疫測定法（以下「ELISA」と略す）によって行われる。免疫に使用する動物としては特に制限はなく、各種の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を使用することができる。モノクローナル抗体の作製には、上記の免疫動物のうち、取扱い易さ等の理由により一般にはBalb/cマウスが用いられるが、他の系統のマウスを使用することもできる。その際、免疫に用いる抗原の濃度は、十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選択し、好ましくは１〜１００μgの抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、フロイント完全アジュバントあるいはフロイント不完全アジュバント等の懸濁液とし、動物に腹腔内注射または皮下注射などによって投与する。投与は２〜４週毎に１〜数回行う。最終免疫は通常１〜１００μg の抗原を添加した生理食塩溶液を静脈注射または皮下注射などにより投与して行われる。最終免疫の数日後に細胞融合のため免疫した動物から抗原産生細胞、例えばリンパ球、好ましくは脾臓細胞またはリンパ節細胞を取り出す。次に、抗体産生細胞として脾臓細胞を用いた場合について説明するが、脾臓細胞以外の抗体産生細胞も同様に細胞融合に供し得る。細胞融合は、最終免疫３〜４日後に無菌的に取り出した脾臓から調製した脾臓細と適当なミエローマ細胞を融合促進剤の存在下で細胞融合させる。融合に用いるミエローマ細胞は、哺乳動物からのものでよいが、一般には、免疫に用いた動物と同じ種の動物に由来するものが好適であり、既に公知の種々の細胞株、例えばマウスではSP2/0-Ag14(SP2)[[Nature, 276, 269(1978)]、NS-1-Ag4/1（NS-1）、P3-X63Ag8U.1（P3U1）[Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1-7(1978)：ATCCから入手可、ATCC No. CRL-1597]、P3-NS1-1-Ag4-1、P3-X63Ag8（P3）、FO、X63Ag8.653（X63.653）、210.RCY3.Ag1.2.3、S194/5XXO.BU1、SKO-007、GM15006TG-A12等が好適に使用され、ラットではY3.Ag1.2.3等が好適に使用される。好ましい融合促進剤として例えば、平均分子量が1000〜6000のポリエチレングリコール（PEG）のほかセンダイウィルスも使用できる。融合時の脾臓細胞とミエローマ細胞の混合比率は、一般に１０：１〜２：１の範囲が好ましい。
【００２７】
融合した細胞よりハイブリドーマの分離は、未融合の脾臓細胞、未融合のミエローマ細胞及び融合した細胞の混合物を未融合のミエローマ細胞が生存できない選択培地で、未融合の細胞が死滅するまでの適当な時間（約１週間）培養することにより行える。選択培地は、例えばHAT 培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）が使用される。この選択培地中では、未融合のミエローマ細胞は死滅し、また未融合の脾臓細胞は、非腫瘍性細胞であるので、一定期間後（約１週間後）死滅するので、生育できる細胞を選択することによりハイブリドーマを得ることができる。目的の抗体を産生するハイブリドーマは、通常の限界希釈法によって、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行える。このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、生育に適した培地中で生育でき、また超低温冷凍庫や液体窒素中などで容易に長期に保存が可能である。このようにして得られたハイブリドーマは、栄養培地中あるいは哺乳動物の腹腔内で増殖させることにより抗体を産生させることができ、産生した抗体は培養上清あるいはその哺乳動物の腹水または血清から精製することができる。本発明のハイブリドーマとしては、例えば、平成１８年１１月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８として寄託されているハイブリドーマを使用することができる。抗体の精製は、遠心分離、透析、硫酸アンモニウム等による塩析、DEAEカラム等によるイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどの一般的な単離、精製方法を用いて行うことができる。かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ouchterlony）法、ELISA法、またはRIA法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ELISA法またはRIA法を用いる場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び280nmにおける吸光度［1.4（OD280）＝イムノグロブリン１mg/ml］より算出する方法により行うことができる。この様にして得られた本発明のモノクローナル抗体は、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチン（ＰＮ−１）、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなるペプチド、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチド、およびヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列部位（TTKIITKVV；配列番号２２）或いはその一部を特異的に認識することができる。さらに好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドを認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号３）の少なくともＮ末端から１番目のトレオニンから６番目のトレオニンまでのアミノ酸配列部位（配列番号３４）またはその一部を特異的に認識することができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトペリオスチン−１タンパク質の抗細胞接着作用を抑制または阻害する、すなわちヒトペリオスチン−１タンパク質の抗細胞接着作用を中和する活性を有する。さらに、心不全時等に引き起こされる心拡大、心肥大および心線維化を抑制し、心機能を改善させることができる。
【００２８】
本発明の抗体としてポリクローナル抗体を使用する場合、ポリクローナル抗体は通常行われている方法、例えば「日本生化学会編、新生化学実験講座12、東京化学同人、1992」記載の方法によって得ることができる。免疫動物としては、特に限定されるものではないが、馬、山羊、羊、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどが挙げられる。免疫動物としてウサギを用いる場合には、抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントまたは水酸化アルミニウムアジュバントなどの懸濁液とし、10〜1000μg／回／匹を注射し、さらに２〜４週間後に追加免疫注射を１〜３回行い、抗血清を得る。注射は多数箇所の皮下に行うのが好ましい。抗血清からポリクローナル抗体の調製は、上記モノクローナル抗体の精製と同様の方法で行うことができる。この様にして得られた本発明のポリクローナル抗体は、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチン（ＰＮ−１）、配列番号３または配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号３４で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明のポリクローナル抗体は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなるペプチド、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチド、およびヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列部位（ＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２２）或いはその一部を特異的に認識することができる。さらに好ましくは、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（ＹＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドを認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号３）の少なくともＮ末端から１番目のトレオニンから６番目のトレオニンまでのアミノ酸配列部位（配列番号３４）またはその一部を特異的に認識することができる。さらに、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＰＮ−１タンパク質の抗細胞接着作用を抑制または阻害する、すなわちヒトペリオスチンＰＮ−１タンパク質の抗細胞接着作用を中和する活性を有する。さらに、心不全時等に引き起こされる心拡大、心肥大および心線維化を抑制し、心機能を改善させることができる。
［００２９］
ヒト型抗体の作製
免疫グロブリンＧ（以下、単に「ＩｇＧ」という。）は、分子量約２３０００の軽ポリペプチド鎖（以下「軽鎖」という）、分子量約５００００の重ポリペプチド鎖（以下「重鎖」という）の各２本ずつから構成される。重鎖、軽鎖とも約１１０残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を持ち、これらはＩｇＧの３次元構造の基本単位（以下、「ドメイン」という。）を構成する。重鎖および軽鎖は、それぞれ連続した４個、および２個のドメインから構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ：以下、「Ｖドメイン」という。）と呼ばれる。ＩｇＧのアミノ末端においては、重鎖、軽鎖のＶドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウスIgGの定常領域はヒトIgGの定常領域とは異なっているので、マウスIgGはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体（Human Anti Mouse Antibody：以下「HAMA」という。）応答が起こる（Schroff RW. et al Cancer Res. (1985)45,879-85）。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままHAMA応答を起こさないように抗体分子を修飾する必要がある。Ｘ線結晶構造解析の結果によれば、一般に、このようなドメインは３本から５本のβ鎖からなる逆平行βシートが二層重なり合った長円筒状の構造をとる。可変領域では、重鎖、軽鎖のＶドメインそれぞれにつき各３個のループが集合し、抗原結合部位を形成する。この各ループは相補性決定領域（complementarity determining region：以下、「CDR」という。）と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、一般に、CDRの構造を保持する役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。カバトらは、重鎖、軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、配列の保存性に基づき、それぞれの一次配列をCDRおよびフレームワークに分類した表を作成した（Kabatt et al. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E.A.）。また、各フレームワークは、アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さらに、ヒトとマウスの間で対応するフレームワークが存在することも見いだされた。このようなIgGの構造的特徴に関する研究から以下のヒト化抗体の作製法が考案された。研究初期の段階では、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提案された（Morrison SL. et al Proc Natl Acad Sci U S A. (1984)81,6851-5）。しかし、そのようなキメラ抗体は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むので、特に長期間投与した場合にはHAMA応答を誘導しうる（Begent et al., Br. J. Cancer, (1990)62, 487）。
【００３０】
ヒトに対しＨＡＭＡ応答を発現する可能性のある、非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸残基を更に少なくする方法として、CDR部分のみをヒト由来の抗体に組み込む方法が提案された（Peter T et al. Nature, (1986) 321, 522-5）が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活性を保持するにはCDRのみの移植では不十分であった。一方、チョッチアらは、1987年、Ｘ線結晶構造解析データを用い、（ａ）CDRのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とCDR自体の構造を維持する部位とが存在し、CDRの取り得る三次元構造は、複数の典型的なパターン（カノニカル構造）に分類されること、（ｂ）カノニカル構造のクラスは、CDRのみならずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした（Chothia C. et al. J. Mol. Biol. (1987)196, 901-17）。この知見に基づき、CDR移植法を用いる場合、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された（特表平4-502408号）。一般に、移植すべきCDRを有する非ヒト哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、CDRが移植される側のヒト抗体は「アクセプター」と定義され、CDR移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りCDRの構造を保存し、免疫グロブリン分子の活性を保持することにある。この目的を達成するためには、（ａ）アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか、及び、（ｂ）ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基を選択すべきか、の２点に留意する必要がある。
【００３１】
クィーンらは、ドナーのフレームワークのアミノ酸残基が、以下の基準の少なくともひとつに該当する場合、CDR配列とともにアクセプターに移植するデザインの方法を提唱した（特表平4-502408号）：
（ａ）アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通であること
（ｂ）該アミノ酸がCDRのひとつのすぐ近くであること
（ｃ）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約３Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原とまたはヒト化抗体のCDRと相互作用することができると予想されること。
【００３２】
本発明の抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNAは、上記抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを調製し、該mRNAを逆転写酵素でcDNAに変換してから、該抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNAをそれぞれ単離することにより得ることができる。
【００３３】
ヒト抗体の作製
本発明における「ヒト抗体」あるいは「ヒト免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域（VH）及びＨ鎖の定常領域（CH）並びにＬ鎖の可変領域（VL）及びＬ鎖の定常領域（ＣＬ）を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。換言すれば、Ｈ鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来するものである抗体を意味する。ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報（Ｍｅｎｄｅｚ ＭＪ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１５，１４６−５６，Ｇｒｅｅｎ ＬＬ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４）７，１３−２１，表平４−５０４３６５号公報；国際出願公開ＷＯ９４／２５５８５号公報；日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年；Ｎｉｌｓ Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３６８，８５６−９，及び特表平６−５００２３３号公報）に記載の方法に従って作製することができる。
［００３４］
本発明で使用される抗体は、抗体の分子全体に限らず、抗細胞接着活性を有するペリオスチンの該活性を中和するものであれば、抗体の断片または誘導体であってもよい。
［００３５］
抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、ＣＤＲを含有するペプチド等を挙げることができる。
［００３６］
本発明の抗体断片のうちＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等は、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理して得ることができ、また、得られた抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
［００３７］
本発明の抗体断片のうちｓｃＦｖは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を、適当なペプチドリンカー等を用いて連結し、作製することができる。また、上記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
［００３８］
本発明の抗体断片のうちｄｓＦｖは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間でジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片であり、システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測により選択することができる。該抗体断片をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。
［００３９］
本発明の抗体断片のうちＣＤＲを含有するペプチドは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖またはＬ鎖のＣＤＲ領域のうち、少なくとも１つのＣＤＲ領域以上を含んで構成される。また複数のＣＤＲ領域を適当なペプチドリンカーを介する等の方法により結合させてもよい。該ＣＤＲを含有するペプチドは、これをコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。また、Ｆｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法等の化学合成によっても作製できる。
［００４０］
また、本発明では、上述の抗体または抗体断片に、蛋白質または低分子化合物を結合させた誘導体を使用することができ、これら修飾は、公知の方法で行うことができる。
［００４１］
［００４２］
１つの態様において、本発明の抗体、抗体断片又は誘導体は、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を予防または治療するために使用することができる。抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患とは、疾患の病態時に抗細胞接着活性を有するペリオスチンの遺伝子の発現が高く、該遺伝子によりコードされる蛋白質の産生が増加している疾患である。また、該遺伝子または蛋白質の増加により、病態が悪化する疾患のことである。このような抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患としては、特に限定されるものではないが、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、腎炎（急性及び慢性）、膵炎（急性及び慢性）、肝炎（急性及び慢性）、肝線維症または肺線維症を挙げることができる。また、本発明の抗体を適用できる癌としては、これに限定されるものではないが、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、悪性黒色腫、骨癌、膵臓癌、胃癌、皮膚癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、結腸癌、子宮癌、卵管癌、食道癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、及び腎臓癌を挙げることができ、特に好適には、乳癌、大腸癌、肺癌、及び悪性黒色腫を挙げることができる。
【００４３】
本発明はまた、上記の抗体をマーカー標識することにより作製した心不全などの抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の診断薬である。ここでマーカーとしては、酵素、放射性同位元素、蛍光色素等を用いることができる。ここで用いる酵素としては、ターンオーバー数（turn over number）が大きく、かつ酵素と結合しても安定であること、基質と特異的に反応して発色させることができる等の条件を満たす物であれば特に制限されるものではなく、通常の酵素免疫アッセイ（EIA）に用いられる酵素を使用することができる。好ましい酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。
【００４４】
これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法により行うことができる。基質としては、使用する酵素に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。マーカーとして用いる放射性同位元素としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、本診断薬は、不全心間質を特異的に染色することが可能な、免疫組織学的染色として使用することができる。また、放射性同位体を標識した場合には、体内に投与することによって、心不全時の病変部を画像化するために使用することもできる。
［００４５］
本発明はまた、本発明の抗体、抗体断片又は誘導体を用いることによる、ヒト又は動物の血液から血清を調製した生体試料中、すなわち血清中における抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出または定量する方法であり、さらに検出又は定量することによる心不全などの抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の診断方法である。本方法において、いわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：酵素免疫測定法）によって抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出することができる。本発明の診断キットを用いる場合には、まず抗ペリオスチン一次抗体を固相化したプレートに試料を接触させて両者を結合させ、この結合体にマーカー標識した抗ペリオスチン二次抗体を結合させ、この三者の結合体におけるマーカーのシグナル強度を測定することにより、抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出または定量することができる。、特に抗細胞接着活性を有するペリオスチンは、心不全等の病態時に特異的に発現するスプライシングバリアントであるので、その産生をモニターすることにより心不全等における病態の診断をすることができる。
［００４６］
このように、本発明の抗体を標識化して、二次抗体として使用する事が可能である。
［００４７］
本発明の抗体、抗体断片または誘導体を有効成分として含有する医薬組成物は、通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
［００４８］
本発明に係る医薬組成物の有効成分は、公知の薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤等と混合して医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法によって投与するのが好ましい。本発明の医薬組成物は、例えば、有効成分を生理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、安定剤、希釈剤、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等と、適宜混和することにより製造することができ、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤等として用いることができる。錠剤等に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチンのような結合剤、コーンスターチのような潤沢剤等を用いることができ、また糖衣又は医溶性若しくは腸溶性物質のフィルムにより被膜してもよい。カプセルの剤型である場合には、前記の組成物に更に液状担体を含有させることができる。注射のための無菌組成物も、通常の処方を適用して製造することができる。注射用の水性液としては、ブドウ糖などを含む等張液などが挙げられ、ポリエチレングリコールのような適当な溶解補助剤などと併用してもよい。また、緩衝剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤、無痛化剤などと配合してもよい。経口投与において、消化管内で有効成分が分解を受けやすい場合、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分をリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻腔内、舌下、肺などの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は、座剤、点鼻剤、舌下剤、経肺剤といった形態で投与することができる。
【００４９】
本発明の医薬組成物の投与量は、治療に用いられる場合、治療に有効な投与量が決められるが、当該投与量は投与対象者の年齢、体重、症状の程度および投与経路等によって異なり、個々の場合に応じて決められる。通常、経口投与による場合、成人一日当たりの投与量は０．１〜１０００ｍｇ程度であり、これを１ないし数回に分けて投与すればよい。持続静脈内投与においては０．０１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜１．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎの範囲で投与することができ、０．０２５μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜０．１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎで投与するのが望ましい。
【００５０】
以下、実施例を用いて本発明について詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
[実施例]
［製造例１］サブトラクション法によるペリオスチンの検索
１−１ 心不全病態モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取
雄性ダール食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）（清水実験材料）を６週齢より８％高食塩含有食で飼育し、心肥大期（１１週齢）および心不全期（１４週齢）に各３匹の左心室を採取した。
【００５１】
１−２ mＲＮＡの調整
総ＲＮＡは上記左心室約５００ｍｇからＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって調整した。次に心肥大期、心不全期それぞれ３匹分を合わせた総ＲＮＡ約４００μｇよりＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２．０ Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがってｍＲＮＡを精製し、それぞれ約３μｇのｍＲＮＡを回収した。
【００５２】
１−３ ｃＤＮＡサブトラクション
ｃＤＮＡサブトラクションは、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（クローンテック社）により、説明書に記載の方法にしたがって行った。すなわち、上記１−２で得られたｍＲＮＡそれぞれ２μｇよりｃＤＮＡを合成し、制限酵素Ｒｓａｌで消化した。次に、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１１週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとし、テスターｃＤＮＡにｋｉｔ添付の２種類のアダプターを別々に連結させた後、サブトラクトハイブリダイゼーションを行った。次に、アダプターに相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現量に違いのあるｃＤＮＡ断片を特異的に増幅させ、増幅産物１を得た。
【００５３】
また、同様のサブトラクションを１１週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとして行い、得られた増幅産物を増幅産物２とした。
【００５４】
１−４ ドットブロットスクリーニング
Ａ．ドットブロットの作製
増幅産物１をＰＣＲ IIベクター（インビトロジェン社）にＴＡクローニングし、挿入断片の入ったクローンを選択した。各クローンの挿入断片を増幅したＰＣＲ反応後、それぞれ１μＬを熱処理後、２枚のナイロンメンブレンフィルター（ベーリンガー社）にドットブロットし、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社）により固定した。
【００５５】
Ｂ．ｃＤＮＡプローブの作製
増幅産物１を制限酵素Ｒｓａｌ及びＥａｅｌ、Ｓｍａｌで消化し、アダプターを除去し、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットII（ベーリンガー社）を用いて説明書に記載の方法に従ってＤＩＧ−ｄＵＴＰでランダムプライム標識を行い、ｃＤＮＡプローブ１を作製した。増幅産物２より同様にして、ｃＤＮＡプローブ２を作製した。
【００５６】
Ｃ．スクリーニング
上記Ａで作製したドットブロットメンブランの1枚をｃＤＮＡプローブ１、他の１枚をｃＤＮＡプローブ２とハイブリダイゼーションを行った。具体的には、ベーリンガー社のＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットIIを用いて、説明書に記載の方法にしたがい、ＤＩＧイージーハイブ液中４２℃で一晩ハイブリダイセーションを行った。2×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温にて５分間２回、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６８℃にて１５分間２回洗浄した後、キットに添付のブロッキングバッファー中でアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体と反応後、ＣＳＰＤ ｒｅａｄｙ−ｔｏ ｕｓｅを加えて化学発光を進行させ、Ｘ線フィルムを露光させた。ｃＤＮＡプローブ１でのシグナルがｃＤＮＡプローブ２でのシグナルより強いクローンをポジティブクローンとして選択し、塩基配列の決定を行った。
【００５７】
１−５ 塩基配列の決定
塩基配列は、ＴＨＥＲＭＯ ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM II ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（アマシャムファルマシア社）を用いて自動ＤＮＡ配列読み取り装置モデル３７３Ａ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で解析することにより決定した。得られた遺伝子配列をＧｅｎＢａｎＫのデータバンクに照会した結果、クローンの１つ（ＳＦ０１４）がマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３６６４）と８６％ホモロジーのある遺伝子であることが判明した。
【００５８】
［製造例２］ラットペリオスチン ｃＤＮＡのクローニング
ラットペリオスチンｃＤＮＡの単離はλｇｔIIベクターに挿入されたｒａｔ ａｏｒ
ｔａ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ（クローンテック社）より作製した約４０００クローンのファージサブプール１０個（計約４万クローン）をＳＦ０１４の塩基配列を基に設計したプライマー（１）５’−ＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１５）、（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号１６）を用いてＰＣＲスクリーニングを行い、３個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅された断片をＡｌｋＰｈｏｓ ＤｉｒｅｃｔTM（アマシャムファルマシア社）を用いてアルカリフォスファターゼ標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い、１個のポジティブクローンラットペリオスチン＃１を得た。その挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、製造例１−５の方法に従って全塩基配列を決定した。
【００５９】
得られたクローンの長さは約３ｋｂであり、マウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の２９２番から３’−末端までに相当するものであり、５’−末端が欠けたクローンであることが示唆された。
【００６０】
そこで、ＳＭＡＲＴTM ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クローンテック社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって、ｒａｔ ａｏｒｔａ ｃＤＮＡを鋳型として、上記プライマー（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号１６）とラットペリオスチン＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）を用いて５’−ＲＡＣＥ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をインビトロジェン社のＰＣＲ IIベクターにＴＡクローニングし、ラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ ＃１と命名した。塩基配列を製造例１−５の方法にしたがって決定した。
【００６１】
その結果、ラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ ＃１は最初に得られたラットペリオスチン＃１より５’方向に約３００ｂｐ長いクローンであり、５’−末端はマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の５’−末端より１５ｂｐ長いクローンであった。さらにラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ ＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（４）５’−ＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１８）と上記プライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）を用いて上記ｒａｔ ａｏｒｔａ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙより作製した約４万クローンのファージサブプール１０個（計約４０万クローン）をＰＣＲスクリーニングすることにより２個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅される断片をプローブとしてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い１個のポジティブクローンを得、ラットペリオスチン＃２と命名した。挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、塩基配列を製造例１−５の方法にしたがって決定した。
【００６２】
得られたクローンの長さは約２．６ｋｂであり、５’−末端は５’−ＲＡＣＥで得られたクローンと同一であったが、３’−末端はマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ１３６６４）の２４１０番までに相当するクローンであった。また、先に得られたラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ＃１の塩基配列とラットペリオスチン＃２の相当する領域の塩基配列は全く同一であった．ラットペリオスチン＃１とラットペリオスチン＃２よりラットペリオスチンｃＤＮＡの完全長を完成させた。この完全長ｃＤＮＡの塩基配列とこの塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号６及び１に示す。
【００６３】
［製造例３］Myc-His-ラットペリオスチン融合タンパク質発現ベクターの構築
製造例２で得られたラットペリオスチン遺伝子のコード領域から翻訳されるタンパク質のカルボキシル末端にＭｙｃエピトープと６個のヒスチジンタグを有し、ＣＭＶプロモーターを有する発現ベクターを作製した。
【００６４】
まず、ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２ベクター（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化したベクター断片に、製造例２で得られたラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ ＃１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約５００ｂｐの断片と製造例２で得られたラットペリオスチン＃１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａｌで消化して得られた約２７８０ｂｐの断片をライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られたプラスミドをｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ラットペリオスチンと命名した。このようにして作製したｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ラットペリオスチンを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａｌで消化し、ラットペリオスチン遺伝子のコード領域を含む約２３３０ｂｐの断片を得、製造例２で得られたラットペリオスチン＃１を鋳型としてその配列を基に設計したプライマー（５）５’−ＧＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１９）とラットペリオスチンの終止コドンの直前にＢｓｔＥＩＩサイトが挿入されるように設計したプライマー（６）５’−ＴＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、精製後、制限酵素ＳｍａｌとＢｓｔＥＩＩで消化して約２７０ｂｐの断片を得た。上記の２つの断片を、発現ベクター構築用のプラスミドｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｔｙｐｅ Ｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩで消化したベクター断片に、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ラットペリオスチンと命名した。挿入部分の全塩基配列は製造例に記載の方法により確認した。
【００６５】
［製造例４］バキュロウイルス用発現ベクターの構築
製造例３で得られたプラスミドｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ラットペリオスチンを、制限酵素ＳａｃＩ及びＰｍｅｌで消化し、ペプチド断片ｒａｔ ＰＮ−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを切り出した。これを、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ＳａｃＩとＫｐｎＩ（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）で消化して得られたベクター断片に、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られた発現ベクターをｐＦａｓｔＢａｃ／ラットペリオスチン−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓと命名した。挿入部分の塩基配列は製造例１−５に記載の方法により確認した。
【００６６】
［製造例５］組換えバキュロウイルスの調製および培養
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＤＨ１０ＢＡＣ細胞を、製造例５で得られたｐＦａｓｔＢａｃ／ラットペリオスチン−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓで形質転換し、組換えバキュロウイルスを調製した。得られたバキュロウイルスは、電気泳動およびＰＣＲにより、目的のものが挿入されていることを確認した。
【００６７】
この組換えバキュロウイルスをＭＯＩ＝０．１にて感染させた昆虫Ｓｆ９細胞（２×１０6 cells/mL）を、無血清培地（Ｓｆ−９００IIＳＦＭ（インビトロジェン社製）２０００ｍＬ中にゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加）中、２８℃で４〜５日培養した後、培養上清を回収した。
【００６８】
［製造例６］ラットペリオスチンタンパク質の精製
製造例５で得られた培養上清２０００ｍＬを平衡化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー ｐH６．０ ０．１M塩化ナトリウム）で平衡化したＳＰｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ １０ｍＬ ｂｅｄに供し、得られたFlow Through（通過分画）をＳＰセファロース通過分画とした。
【００６９】
平衡化バッファーで２８０ｎｍの吸光度が０付近になるまで（約１００ｍＬ）洗浄し、ＳＰセファロース洗浄分画とした。
【００７０】
溶出バッファー（５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール）１００ｍＬで溶出し、ＳＰセファロース溶出分画とした。
次に、１００ｍＬのＳＰセファロース溶出分画を、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭイミダゾールで平衡化したＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ ５ｍＬ ｂｅｄに供し、得られた通過分画をＮｉ−ＮＴＡアガロース通過分画とした。
【００７１】
洗浄バッファー（５０ｍＬ リン酸２水素ナトリウム ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール）約５０ｍＬで洗浄し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース洗浄分画とした。
【００７２】
溶出バッファーは以下の通り（（１）５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、以降イミダゾール量が（２）３０ｍＭ、（３）４０ｍＭ、（４）５０ｍＭ、（５）６０ｍＭ）とし、それぞれ約２５ｍＬで溶出し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース溶出分画（１）〜（６）とした。
【００７３】
ウエスタンブロット法により目的蛋白が含まれることが確認された分画を、１ｍＬ以下に濃縮した。
【００７４】
次に、脱気したＰＢＳ（−）（１３７ mM ＮａＣｌ、８．１ mM Ｎａ２ＨＰＯ４、 ２．６８ mM ＫＣｌ、１．４７ mM ＫＨ２ＰＯ４）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００ＨＲ Φ１１ｍｍ×９５ｃｍ；容量：９０ｂｅｄ）に上記濃縮試料を供し、ＰＢＳ（−）で溶出し、凍結乾燥することにより、ラットペリオスチン精製タンパク質を得た。
【実施例１】
【００７５】
ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖の合成およびポリクローナル抗体の作製
ノーマルのＳＤラットの心臓にＰＮ−１遺伝子を高発現させると心拡大が惹起され、またダール心不全モデルラットの心臓にラットペリオスチンのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すると生存率が改善されたことに加え、報告されてきたＰＮ−２とは異なり、ラットＰＮ−１には細胞接着作用が無いことが明らかとなったことを受け、ラットＰＮ−１に特異的な構造は夫々の配列比較からＥｘｏｎ−１７配列であると同定した。このＥｘｏｎ−１７を構成するアミノ酸配列のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチドを、純度８０％以上にて10ｍｇ、化学合成した。キャリアタンパク質としてＫＬＨ６ｍｇを結合させたものをウサギ(Ｋｂｌ:ＪＷ)に免疫させた。免疫方法は初回免疫にはＦＣＡ(フロイント完全アジュバント)を使用し、２次免疫以降はＦＩＡ (フロイント不完全アジュバント)を使用した。また、投与部位は背部皮下２０ヶ所、投与週 は０、２、４、６週、投与量は初回免疫では８００μgペプチド/匹、2次免疫以降では４００μgペプチド/匹にて免疫した。抗体力価はＥＬＩＳＡ法にて測定し 投与週７週目に全血清を集めた。その後、合成ペプチドを用いたアフィニティーカラムを作製し、Ｅｘｏｎ−１７ペプチドに特異的に反応する抗体のみを回収した。以降、上記の、ラットペリオスチンのＥｘｏｎ−１７がコードするペプチドに対するポリクローナル抗体を、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体と称する。
実施例２
［００７６］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）の抗細胞接着活性の有無の検討
文献記載の方法（Ｒｕｗｈｏｆ Ｃ，ｖａｎ Ｗａｍｅｌ ＡＥ，Ｅｇａｓ ＪＭ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｒｓｅ Ａ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００ Ｍａｙ；２０８（１−２）：８９−９８、Ａｓｈｉｚａｗａ Ｎ，Ｇｒａｆ Ｋ，Ｄｏ ＹＳ，Ｎｕｎｏｈｉｒｏ Ｔ，Ｇｉａｃｈｅｌｌｉ ＣＭ，Ｍｅｅｈａｎ ＷＰ，Ｔｕａｎ ＴＬ，Ｈｓｕｅｈ ＷＡ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６ Ｎｏｖ．１５；９８（１０）：２２１８−２７）と同様な方法にて、ラットの心線維芽細胞を取得した。具体的には、生後１〜２日齢のＳＤラット２０匹をエーテル麻酔し、胸部をエタノールで消毒した。心臓を摘出しＰＢＳ（−）を入れたディッシュに入れ心臓を横断するように切って血液を出し、更にＰＢＳ（−）で３回洗浄後、出来るだけＰＢＳ（−）を捨て鋏にて細かく刻んだ。次に、ＰＢＳ（−）：コラゲナーゼ／トリプシンを１：１で混合し、３７℃で１５分間振盪した後、更にピペッティングを行い出来る限り細胞を分離させた。次に、白金メッシュを遠心管に置いて細胞分離液をろ過し、１０ｍｌの１０％血清入りＭ１９９培地と１０ｍｌのＰＢＳ（−）で白金メッシュを洗浄した。その後、遠心管を１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿物として得られた細胞を、１０％血清入りＭ１９９培地２０ｍｌで攪拌しディッシュに播いた。３７℃、１時間放置後ディッシュに接着した細胞をラット心線維芽細胞として採取した。上述のラット心線維芽細胞を、９６穴プレートに６．４×１０４個／１００μｌずつ播き、一夜培養後、培養液を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）を加えた１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に変更し、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＤＭＥＭ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ：無血清培地）で細胞を２度洗い、終濃度１０μｇ／ｍｌになるように製造例にしたがって製造したラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）をＤＭＥＭ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）に添加した。陽性コントロールとして細胞接着促進作用を有するフィブロネクチンを、陰性コントロールとしてＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いた。３７℃で１時間培養後の顕微鏡観察においてラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）を添加した群は完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図２）。その結果、コントロールであるフィブロネクチンおよびＢＳＡを投与した群ならびに無添加群では接着していた細胞の剥離は起こらず、抗細胞接着作用が見られなかったが、ラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）を添加した群では細胞の剥離が認められたことから、ラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）は接着細胞の剥離作用、すなわち抗細胞接着作用を有していることが明らかとなった。
実施例３
［００７７］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体の中和活性の検討実施例２と同様の方法で得たＳＤラット由来の心線維芽細胞を、９６穴プレートに６．４×１０４個／１００μｌずつ播き、一夜培養後、培養液を１０μｇ／ｍｌのｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅを加えた１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に変更し、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＤＭＥＭ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）で細胞を２度洗い、終濃度１０μｇ／ｍｌのラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）と抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体を終濃度１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌになるようにＤＭＥＭ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）に添加した。陽性コントロールとしてラットペリオスチンタンパク質のみを、陰性コントロールとしてＢＳＡを用いた。３７℃で１時間培養後の顕微鏡観察においてラットペリオスチンタンパク質のみを添加した群はほぼ完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図３）。その結果、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体は、ラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）による接着細胞の剥離を抑制する、つまりラットペリオスチンタンパク質（ラットＰＮ−１）の抗細胞接着作用を抑制する、すなわちラットＰＮ−１の抗細胞接着作用を中和する活性を有した抗体であることが判明した。
実施例４
［００７８］
急性心筋梗塞モデルラットを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体の効果
体重２５０〜３００ｇのオスのルイスラットを用いて、ペントバルビタール麻酔薬（０．１ｍｌ／１００ｇ）を腹腔に投与し充分麻酔がかかった後に、ラット用手術台に固定した。経口より気管挿管しラット用のベンチレーターに接続し（一回換気量３ml、８０回/分）、胸骨左第３肋間より皮膚を横切開して、その下にある大胸筋も横切開を加え、ラット用開胸器を用いて肋間を広げて心臓を露出させた。
【００７９】
その後、左房の下付近にある左冠動脈を直径５mmの曲針を用いて1.0シルクで縛った。この時、左冠動脈の還流領域である前壁および側壁が赤色から白色に変化し冠血流が充分に遮断されており、同部位の壁運動が消失したことを目視下に確認し（シャムオペ群では針を冠動脈に通した後、糸で縛らず針を抜いた）、第３肋骨および第４肋骨を3.0シルクにて縛り固定した（この時肺を拡張させ胸郭の肺の外にある空気を出し、肺が拡張しやすいようにしてから縛った）。更に同様に皮膚の切開部位を3.0シルクにて縫い付けてからしばらく観察し、意識が回復し自発呼吸が出てきたことを確認してから抜管した。
【００８０】
以上の手順により、順次、急性心筋梗塞モデルを作製した。
【００８１】
翌日、イソフルレンによる経鼻麻酔下に経皮的心臓超音波検査を行ない、梗塞サイズが左室全周の２０％に満たない小さな梗塞モデルを除外した。その他の梗塞モデルを心機能の悪い順に序列し、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体投与群とコントロール抗体（ウサギＩｇＧ）投与群に交互に群分けし、各２００μｇずつを尾静脈より投与した。
【００８２】
抗体は、モデル作製の翌日に投与し、更に初回投与の６日毎に計4回、各群に投与した。
【００８３】
一方、1週間毎に8週間後まで経胸壁的に心臓超音波検査で心臓を評価した。8週間後には、ペントバルビタール麻酔薬下に気管挿管しベンチレーターに乗せた上で、左頚部より皮膚切開を行い、頚部の筋肉をピンセットで分けて、左総頚動脈を露出させ、左頚動脈起始部を糸かけて止血した上で、遠位部に小ハサミにて動脈に穴をあけ、同部位よりラット用のミラーカテーテルを挿入し左心室内に圧モニターのあるカテーテルの先端が届くようにして、コンピューターに接続し、心機能および血圧等を測定した。
【００８４】
モデル作製の4週後の心臓超音波検査の結果では、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体を投与した群ではウサギＩｇＧを投与したコントロール群に比べ、有意に、心臓の前壁厚および後壁厚が薄くなることが抑制され、拡張末期心内径および収縮末期心内径の拡大が抑制され、ならびに心臓の収縮機能の指標であるＥＦ値が上昇した。つまり、心拡大が抑えられ、心機能が改善したことが明らかとなった（図４−１〜図４−３）。さらに、モデル作製の８週後の心臓超音波検査の結果においても、上記の４週後の結果と同様に、心拡大の抑制および心機能の改善が確認された（図５−１〜図５−３）。この結果より、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体投与後約４週間後においても、該抗体による心拡大の抑制および心機能の改善効果が維持されることが示唆された。次に、血行動態においては、コントロールＩｇＧ抗体投与群に比べ抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体投与群では最大内圧変化率（（＋）ｄＰ／ｄＴ）、最小内圧変化率（（−）ｄＰ／ｄＴ）及び左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）に有意な差が得られたことから、心機能の改善が示唆された。（図６−１〜図６−３）。マッソントリクローム染色した心臓切片において、抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体を投与した群ではコントロールＩｇＧ抗体を投与した群に比べ、青色に染まる部位が減少しており、線維化が抑制された（図７）。また、心筋細胞の短軸径の計測により抗ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド抗体を投与した群ではコントロールＩｇＧ抗体を投与した群に比べ、有意に心筋細胞の短軸径の菲薄化が抑制されたことが明らかとなった（図８）。この結果は心臓超音波検査における結果と相関している。さらに、梗塞部位と非梗塞部位に分けた遺伝子発現解析の結果、非梗塞部位において、中和抗体投与群におけるエンドセリン−１（ＥＴ−１）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ、ＩＩＩ、ＴＧＦ−ｂｅｔａの発現量が、コントロール抗体投与群に比べ有意に減少し、ｓｈａｍ群とほぼ同等になり、改善効果がみられた（図９−１〜図９−５）。
【実施例５】
【００８５】
ヒトペリオスチン-１ｃＤＮＡの完全長クローニング
ヒト心臓由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社製、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．６４１００−１、Ｌｏｔ Ｎｏ．４１２０４９３）１μｇから作製したｃＤＮＡをテンプレートとして、全長クローニング用プライマーセンス鎖5'- AAGCTAGCCACCATGATTCCCTTTTTACCCAT-3'（配列番号２７）とアンチセンス鎖5' -AACTCCACAATTTCCCTCAT-3'（配列番号２８）を用いてＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラ−セ（東洋紡社製）によりＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてクローン化した。
【００８６】
このクローン群からヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７に相当する領域でセンス鎖5'-TAACCAAAGTTGTGGAACCAA-3'（配列番号２９）を、また、Ｅｘｏｎ−２１に相当する領域でアンチセンス鎖5'-TGTGTCTCCCTGAAGCAGTC-3' （配列番号３０）を作製し、これらのプライマーを用いて検出されるクローンを選別した。次に、選別したクローンの塩基配列を決定しスプライシングの起きていないクローンを選別し、ヒトペリオスチンー１ｃＤＮＡの完全長クローニングを完成させ、得られたクローンはｐＣＲ４／ヒトペリオスチンー１と命名した。
【実施例６】
【００８７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 翻訳用ヒトペリオスチンー１発現ベクターの構築
実施例５で得られたプラスミドｐＣＲ４／ヒトペリオスチンー１を、制限酵素Ｐｍｅ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで消化し、ＤＮＡ断片ヒトペリオスチンー１を切り出しｂｌｕｎｔｉｎｇ処理を行った。これを、CATCACCATCACCATCACTAA（6×Ｈｉｓ + 終止コドン）（配列番号３１）を予め挿入したｐＴＮＴ発現ベクター（プロメガ社製）のマルチクローニングサイトのＭｌｕ Ｉサイトを酵素消化後ｂｌｕｎｔｉｎｇ処理を行い、ライゲーションキット（宝酒造（株）社製）を用いて連結した。
【００８８】
次に、Ｈｉｓタグとのフレームを合わせる目的で合成リンカー（ｓｅｎｓｅ鎖5'-CTAGAAGACGATTAAGGGAAGGTCGTTCTCAGCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC-3' （配列番号３２）とantisense鎖5'-GGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGCTGAGAACGACCTTCCCTTAATCGTCTT-3' （配列番号３３））を作製し、制限酵素Ｘｂａ ＩとＳｍａ Ｉで消化したベクター断片にライゲーションキットを用いて連結した。連結部分の塩基配列を確認し、得られた発現ベクターをｐＴＮＴ／ヒトペリオスチンー１／Ｈｉｓと命名した。
【実施例７】
【００８９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 翻訳によるタンパク質の合成
実施例６で得られた発現ベクターはＴＮＴ ＳＰ６ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社製）に供してｉｎ ｖｉｔｒｏでのタンパク質の合成を行った。詳しくはｐＴＮＴ／ヒトペリオスチンー１／Ｈｉｓ発現ベクター２μｇに対し、ＳＰ６ Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを４０μｌ、１ｍＭメチオニンを１μｌ、ＤＥＰＣ処理水にて総量５０μｌとし、３０℃で９０分間反応させ精製するまで−８０℃で保存した。
実施例８
［００９０］
ヒトペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）の精製
実施例７で得られた合成タンパク質はＭａｇＺ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて精製した。詳しくは実施例７で得られた合成タンパク質にＭａｇＺ Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを２倍量加え良く混ぜた試料をＭａｇＺ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅに添加した。これを４℃で１時間撹拌した後、上清を除いてＭａｇＺ Ｂｉｎｄｉｎｇ／Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒにて４回ＭａｇＺ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅを洗浄後、ＭａｇＺ Ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒにて合成タンパク質を溶出し使用するまで−８０℃で保存した。
実施例９
［００９１］
ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖に対するモノクローナル抗体の作製
（１） 抗原の作製
ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７を構成するアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチド（配列番号２５）を、Ｆｍｏｃ法にて化学合成し、純度９０％以上のペプチド１０ｍｇを得た。このペプチド５ｍｇにキャリアタンパク質としてＫＬＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）５ｍｇを結合させ、抗原溶液を得た。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳ（０．０１Ｍ）に溶解して３．３ｍｇ／ｍＬに調整し、０．２５２４ｍｇ／ｍＬのＭＢＳ溶液（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を滴下して室温で６０分間攪拌し反応させた。ジクロロメタンを用いてフリーのＭＢＳを除き、ＫＬＨ−ＭＢを得た。このＫＬＨ−ＭＢ５ｍｇと、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した抗原ペプチド５ｍｇとを混合し、４℃で１２時間攪拌して反応させ、抗原溶液を得た。
（２） 免疫
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス３匹の両足に、（１）で得られたＫＬＨ結合抗原ペプチド１００μｇを含む抗原溶液５０μｌと、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント）５０μｌとの混合乳濁液全量を皮下注射した。その後２週間間隔で２回、用時調製した上記抗原溶液とＦＩＡ (フロイント不完全アジュバント) との混合乳濁液を両足に投与した。その後、そのマウスを頸椎脱臼により致死させ、無菌的に足部リンパ節を採取した。
ＲＰＭＩ培地（コージンバイオ株式会社製）を供給しながら上記リンパ節を破砕し、孔径約１０μｍのメッシュを通過させて ＲＰＭＩ培地に懸濁状態のリンパ節細胞を得た。これを1000ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけて、リンパ節細胞を沈殿画分として得た。この沈殿画分に、０．８４ ％の塩化アンモニウム溶液に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４） を加えた溶液１ｍｌを入れて溶血させ、赤血球を除いた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけた。得られた沈殿画分（細胞画分）をRPMI培地で数回洗浄し、細胞融合に用いた。
(3) ミエローマ細胞の調製
８-アザグアニン耐性でかつイムノグロブリン非分泌型のマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１ 株）を、２０％のウシ胎児血清(ＦＣＳ) を含む ＲＰＭＩ培地で、１０％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で培養し、対数増殖期にある細胞を集め、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけて沈殿画分として細胞のみを取得し、ＲＰＭＩ培地に懸濁させた。
(4) 細胞の融合
(2)で得た免疫化リンパ節細胞１０8 〜３×１０8 個を含む RPMI培地と、 (3)で得たミエローマ細胞１０8 個を含むRPMI培地とを混合した後、１，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけた。上清を静かに除いて沈殿画分として細胞を取得し、これに２５％（ｗ／ｖ） のポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ １５００ 、ベーリンガー社製) １ｍｌを加えた後、更にＲＰＭＩ培地をゆっくりと加えて総量を１０ｍｌとした。これに２０％ ＦＣＳを含む ＲＰＭＩ培地１０ｍｌを加えて、少し静置させた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿画分（細胞画分）に２０％ ＦＣＳを含む ＲＰＭＩを加えて細胞濃度が１０6 個／ｍｌになるように調整した細胞懸濁液を、コーニング社製の９６穴培養プレートに２００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター中で２４時間培養後、ＨＡＴ 溶液（インビトロジェン社製）を添加した後、更に２週間培養した。
(5)ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング
培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ｗｅｌｌのスクリーニングを行った。
【００９２】
アッセイ用の抗原溶液には、（１）で得られた抗原ペプチド２ｍｇに、キャリアタンパク質として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を結合させたコンジュゲートを用いた。
【００９３】
９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３５３９１２）の各ｗｅｌｌを、上記コンジュゲート１μg ／ｍｌで４℃下一夜静置してコーティングした。このプレートを洗浄後、（４）の培養上清（モノクローナル抗体を含む）５０μｌ を各ｗｅｌｌに滴下し、３７℃のインキュベーター内で２時間放置した後、ＰＢＳ（−） (リン酸緩衝液) で洗浄した。これにアルカリフォスターゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、３７℃インキュベーターで１時間放置し、ＰＢＳ（−） で洗浄後、発色基質剤(ＡＬＰ)を加えて２０分間発色させ、プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、 Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）で各ｗｅｌｌのＯＤ４９０ｎｍの吸光度（抗体価）を測定し、抗原ペプチドとの反応性を確認し、培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ｗｅｌｌを決定した。
(6) 抗体産生細胞のクローニング
（５）のＥＬＩＳＡ法で抗原ペプチドとの反応性が確認された陽性ｗｅｌｌ内の細胞から、限界希釈法により、抗体産生細胞株のクローニングを行った。すなわち、陽性ｗｅｌｌ内の細胞を９６穴培養プレートの各ｗｅｌｌに撒き込み、５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で２週間培養した。各ｗｅｌｌの培養上清について、（５）の方法と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて、抗原ペプチドとの反応性を確認し、陽性ｗｅｌｌについて、再度、限界希釈法によるクローニングを行い、抗原ペプチドとの反応性が高く、細胞コロニーの発育が良好な３０個の細胞を得た。これら細胞を２４穴培養プレートに移し、５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で２週間培養した。培養上清について、再び、（５）の方法と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて、抗原ペプチドとの反応性（抗体価）を確認した。ＯＤ４９０ｎｍの吸光度が高かった１０ｗｅｌｌ内の細胞、すなわち１０個のハイブリドーマ細胞株を、抗体産生細胞として有用であると判断し、選別した。
【００９４】
【化１】
このようにして得た抗体産生細胞は、本発明抗体である抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を常時産生するので、この抗体産生細胞を培養した培養液の上清液は、直接、本発明抗体溶液として使用することができる。なお、上記の抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）No.1（SBM337）は、平成１８年１１月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８として寄託されている。
（７）ヒトペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性の確認
（６）で得られた抗体産生細胞１０個が産生する抗体と、ヒトペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、実施例８で得られた合成タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンに（６）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の0.4mｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＥＣＬ ｐｌｕｓ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、（６）でクローニングした抗体産生細胞１０個全てが、ヒトペリオスチンＰＮ−１と結合することが確認された。
（8） モノクローナル抗体の大量調製と精製
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にプリスタン[２,６,１０,１４-テトラメチルペンタデカン(和光純薬製)]０.５ｍｌを投与し、２〜３週間飼育した。予め、対数増殖期に維持しておいたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ No.1およびNo.3を回収し、培養上清を除いた沈殿画分の細胞にＦＣＳ不含のＲＰＭＩ培地を加え、細胞数が１×１０7個／ｍｌになるように細胞液を調製した。この細胞液を、プリスタン前投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に注入し、３週間後頃から漏出した腹水を腹部より注射器で回収した。採取した腹水を、孔径０.２２μmφのフィルターを用いて濾過した後、濾液をプロテインＧ-セファロースカラム(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１１５１１３２４)によるアフィニティークロマトグラフィーによって常法に従い精製し、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体２種を調製した。
【実施例１０】
【００９６】
抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
得られたモノクローナル抗体２種（No.1およびNo.3）についてヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。すなわち、セルロースメンブレン上に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４；１位のスレオニンから２７位のグルタミン酸まで）のＮ末端から−９番目のフェニルアラニンから、Ｃ末端から９番目のイソロイシンまでの計４５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列において、下記のアミノ酸１０個からなるペプチド３６種を膜結合型ペプチドアレイを作製した（シグマアルドリッチジャパン株式会社カスタムＳｐｏｔｓ サービス）。
【００９７】
【化２】
このメンブレンを少量のメタノール中で５分間放置した後、ＴＢＳ溶液で３回洗浄した。ブロッキングバッファー（カゼイン、SPOTsに添付）を加えて、室温で２時間攪拌した。メンブレンに実施例９（８）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液中で１０分間振盪洗浄を３回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて２時間インキュベートした後、メンブレンをＴＢＳ溶液で５分間振盪洗浄を３回行った。検出用試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、モノクローナル抗体No.1およびNo.3は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなる合成ペプチドＮｏ．９、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでであり、ヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるのＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドとのみ反応し、結合した。
【実施例１１】
【００９９】
抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
実施例１で作製したポリクローナル抗体について、実施例１０と同様に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。その結果、実施例１０のモノクローナル抗体と同様に、該ポリクローナル抗体は合成ペプチドＮｏ．９とのみ反応し、モノクローナル抗体と同様の部位を特異的に認識していることが明らかとなった。従って、ラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製しても、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作製しても、同様な特異性をもつ抗体が得られることが示唆された。
【実施例１２】
【０１００】
ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性の確認
得られたモノクローナル抗体２種（No.1およびNo.3）について、ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、製造例６で得られた精製タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンにモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の0.4μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＥＣＬ ｐｌｕｓ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、得られたモノクローナル抗体２種はラットペリオスチンＰＮ−１とも結合することが確認された。
【実施例１３】
【０１０１】
抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例１０の結果から、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ部分はヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（TTKIITKVV；配列番号２２）を認識していることが明らかとなり、また実施例１２の結果において、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体がラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）とも結合することが確認された。このことから、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ部分はヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（TTKIITKVV；配列番号２２）のうち、ヒトとラットの種間においてアミノ酸に相違がない部分、すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号３）のＮ末端のスレオニンから７番目のリジンまでのアミノ酸配列の全部またはその一部分を認識していることが示唆された。そこで、さらに詳細にエピトープ部分を解析するために、アラニンスキャンの手法にて解析を行った。
【０１０２】
ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）のうち、一部のアミノ酸をアラニンに変換した下記１０種のペプチドを純度８０％以上で合成した。
＃１ YTTKIITKVV
＃２ ATTKIITKAA
＃３ AATKIITKAA
＃４ AAAKIITKAA
＃５ AAAAIITKAA
＃６ AAAAAITKAA
＃７ ATTKIITAAA
＃８ ATTKIIAAAA
＃９ ATTKIAAAAA
＃１０ ATTKAAAAAA
１ｍｇの合成ペプチドをＰＢＳ（−）５０μlで可溶化させ、１．５μlずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンに実施例９（８）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。
【０１０３】
その結果、該モノクローナル抗体は、上記合成ペプチド＃７（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）と強く反応し、＃１（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖の（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチド）および＃２（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（ＹＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および９〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）とは弱く反応し、＃３（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（ＹＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１〜２番目および９〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）および＃８（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（ＹＴＴＫＩＩＴＫＶＶ；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および７〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）とは更に弱く反応した。
実施例１４
［０１０４］
抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
実施例１で作製したポリクローナル抗体について、実施例１３と同様に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。その結果、実施例１３のモノクローナル抗体と同様に、該ポリクローナル抗体は合成ペプチドＮｏ．＃７と強く反応し、＃１および＃２とは弱く反応し、＃３および＃８とは更に弱く反応し、モノクローナル抗体と同様の部位を特異的に認識していることが明らかとなった。従って、ラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製しても、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作製しても、同様な特異性をもつ抗体が得られることが示唆された。
実施例１５
［０１０５］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着活性の有無の検討
実施例２と同様に、ヒト心線維芽細胞（大日本製薬（株）社製、ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．ＣＳ−ＡＢＩ−５１１８）を、９６穴プレートに６．４×１０４個／１００μｌずつ播き、一夜培養後、培養液を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）を加えた１０％ＦＢＳ添加ＣＳＣ培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）に変えて、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＣＳＣ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）で細胞を２度洗い、終濃度１μｇ／ｍｌになるように実施例にしたがって作製したヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）をＣＳＣ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）に添加した。陽性コントロールとして細胞接着促進作用を有するフィブロネクチンを、陰性コントロールとして細胞接着作用を持たないＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いた。３７℃で３．５時間培養後の顕微鏡観察においてヒトペリオスチンタンパク質を添加した群は完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図１０）。その結果、コントロールであるフィブロネクチンおよびＢＳＡを投与した群ならびに無添加群では抗細胞接着作用が見られなかったが、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）を添加した群では細胞の剥離が認められたことから、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）は抗細胞接着作用を有していることが明らかとなった。
実施例１６
［０１０６］
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の中和活性の検討
実施例３と同様に、ヒト心線維芽細胞を、９６穴プレートに６．４×１０４個／１００μｌずつ播き、一夜培養後、培養液を１０μｇ／ｍｌのｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅを加えた１０％ＦＢＳ添加ＣＳＣ培地に変更し、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＣＳＣ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）で細胞を２度洗い、終濃度１μｇ／ｍｌのヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）と抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（Ｎｏ．１およびＮｏ．３）を終濃度２０μｇ／ｍｌになるようにＣＳＣ培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）に添加した。陽性コントロールとしてヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のみを、陰性コントロールとしてＢＳＡを用いた。３７℃で３．５時間培養後の顕微鏡観察においてヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のみを添加した群はほぼ完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ ６８０ ＭＩＣＲＯ ＰＬＡＴＥ ＲＥＡＤＥＲ）を用いて細胞の染色度を測定した（図１１）。その結果、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体は、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着作用を抑制する、すなわちヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着作用を中和する活性を有した抗体であることが判明した。
また、上述のように、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のＥｘｏｎ−１７に対する抗体であり、かつ、Ｅｘｏｎ−１７のＮ末端１番目から６番目のアミノ酸配列或いはその一部を特異的に認識する抗体により、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着作用が抑制されたことから、Ｅｘｏｎ−１７、少なくともＥｘｏｎ−１７のＮ末端１番目から６番目のアミノ酸配列からなるペプチド部分又はその一部が、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）の抗細胞接着作用に関与する領域を構成していることが示唆された。
実施例１７
［０１０７］
急性心筋梗塞モデルラットを用いた抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の効果
実施例４と同様に、体重２５０〜３００ｇのオスのルイスラットを用いて、ペントバルビタール麻酔薬（０．１ｍｌ／１００ｇ）を腹腔に投与し充分麻酔がかかった後に、ラット用手術台に固定した。経口より気管挿管しラット用のベンチレーターに接続し（一回換気量３ｍｌ、８０回／分）、胸骨左第３肋間より皮膚を横切開して、その下にある大胸筋も横切開を加え、ラット用開胸器を用いて肋間を広げて心臓を露出させた。
［０１０８］
その後、左房の下付近にある左冠動脈を直径５ｍｍの曲針を用いて１．０シルクで縛った。この時、左冠動脈の還流領域である前壁および側壁が赤色から白色に変化し冠血流が充分に遮断されており、同部位の壁運動が消失したことを目視下に確認し（シャムオペ群では針を冠動脈に通した後、糸で縛らず針を抜いた）、第３肋骨および第４肋骨を３．０シルクにて縛り固定した（この時肺を拡張させ胸郭の肺の外にある空気を出し、肺が拡張しやすいようにしてから縛った）。更に同様に皮膚の切開部位を３．０シルクにて縫い付けてからしばらく観察し、意識が回復し自発呼吸が出てきたことを確認してから抜管した。
［０１０９］
以上の手順により、順次、急性心筋梗塞モデルを作製した。
［０１１０］
翌日、イソフルレンによる経鼻麻酔下に経皮的心臓超音波検査を行ない、梗塞サイズが左室全周の２０％に満たない小さな梗塞モデルを除外した。その他の梗塞モデルを心機能の悪い順に序列し、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（Ｎｏ．３）投与群とコントロール抗体（ウサギＩｇＧ）投与群に交互に群分けし、各２００μｇずつを尾静脈より投与した。
［０１１１］
抗体は、モデル作製の翌日に投与し、更に初回投与の６日毎に計４回、各群に投与した。
［０１１２］
一方、１週間毎に４週間後まで経胸壁的に心臓超音波検査で心臓を評価した。モデル作製の４週後の心臓超音波検査の結果では、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を投与した群ではウサギＩｇＧを投与したコントロール群に比べ、有意に、心臓の前壁厚および後壁厚が薄くなることが抑制され、拡張末期心内径および収縮末期心内径の拡大が抑制され、ならびに心臓の収縮機能の指標であるＦＳ値或いはＥＦ値が上昇した。つまり、心拡大が抑えられ、心機能が改善したことが明らかとなった（図１２−１〜図１２−３）。また、上述のように、急性心筋梗塞モデルラットにおいて、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のＥｘｏｎ−１７に対する抗体であり、かつ、少なくともＥｘｏｎ−１７のＮ末端１番目から６番目のアミノ酸配列を含んで構成されているエピトープを持つ抗体により、心拡大の抑制および心機能の改善効果が示されたことから、ヒトペリオスチンタンパク質（ヒトＰＮ−１）のＥｘｏｎ−１７、特に少なくともＥｘｏｎ−１７のＮ末端１番目から６番目のアミノ酸配列からなるペプチド部分を含む領域が、心筋梗塞後の心拡大および心機能の悪化に関与する領域であることが示唆された。
産業上の利用可能性
［０１１３］
抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体を用いることにより、心不全などの疾患で発現が増大する抗細胞接着活性を有するペリオスチンの作用を抑制し、病態の増悪化の抑制および組織の機能の改善を行うことにより、ペリオスチンが関与する疾患の予防および治療を行うことができる。また、患者の生体試料中の該ペリオスチン量を測定することにより、疾患の有無および病状の進行程度を知ることができる。
Claims (12)
- 抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域を特異的に認識し、且つ当該ペリオスチンの抗細胞接着活性を中和する活性を有する抗体であって、
前記領域が配列番号３、４、２１、２２、２３、２４、および２６で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列である、前記抗体。 - 前記領域が配列番号３、４又は２１で示されるアミノ酸配列である、請求項１記載の抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
- ハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８により産生される、請求項３に記載の抗体。
- 配列番号３、４及び２１で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドでヒトを除く哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて得られるハイブリドーマ。
- ハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８。
- 配列番号３、４及び２１で示されるアミノ酸配列から成る群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド又は当該ペプチドのＮ末端にＣｙｓ基を付加したペプチドでヒトを除く哺乳動物を免疫した後、当該動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマを培養する工程を有する請求項３に記載の抗体を製造する方法。
- ハイブリドーマがハイブリドーマ細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７１８である、請求項７の製造方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を含有する医薬組成物。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を含有する、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、または弁膜症の予防または治療用医薬組成物。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を用いて、生体試料中の抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出又は定量する方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を含む、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、または弁膜症の診断薬。
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