CN101389656A - 抗骨膜素的抗体和含有该抗体的用于预防或治疗骨膜素相关疾病的药物组合物 - Google Patents

抗骨膜素的抗体和含有该抗体的用于预防或治疗骨膜素相关疾病的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种针对具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗体，尤其是具有中和抗细胞粘附作用的能力的抗骨膜素抗体，以及使用该抗体的骨膜素相关疾病的预防或治疗药。而且，还提供了使用该抗体的试样中的该多肽的检测和定量方法，以及通过用该方法测定骨膜素量从而诊断骨膜素相关疾病的方法。

Description

抗骨膜素的抗体和含有该抗体的用于预防或治疗骨膜素相关疾病的药物组合物
发明的详细说明
[01]技术领域
[02]本发明涉及针对具有抗细胞粘附作用的骨膜素(periostin)的抗体，尤其是具有中和抗细胞粘附作用的能力的抗骨膜素抗体。更详细的是，在心力衰竭等骨膜素相关疾病的预防或治疗或这些疾病的诊断中有用的抗体，该抗体为识别在以心肥大组织为代表的组织重建的间质中特异表达的，具有抗细胞粘附作用的骨膜素的剪切变体(splice variant)的抗骨膜素抗体。
背景技术
[03]慢性心衰是一种由于心肌收缩力下降而使心脏陷入无法向各脏器搏动出足够量的血液的疾病。以往，在其治疗中，一直使用的是使心肌收缩力增加的洋地黄制剂等强心剂。但是，这些药剂由于过度消耗心肌能量，因此清楚了长期给药使生命预后恶化。因此，最近，通过在心衰竭状态下亢进的交感神经系统和肾素血管紧张素醛固酮(renin angiotensin aldosterone)系统，采用使对心脏的过剩负荷减轻的利尿剂，β阻滞剂，血管紧张肽抑制剂进行的治疗渐渐成为主流。但是，仍然存在的问题是，心衰竭患者无法激烈运动等日常生活受到限制，无法保证生活质量，进而无法充分确保心衰竭患者的生命预后，因此希望开发一种可以改善生活质量和长期生命预后的有效的新型心衰竭治疗药物。
[04]另一方面，骨膜素是一种细胞外基质蛋白质，由分子量约为9万的多肽构成。各多肽链中含有信号序列，半胱氨酸富集结构域，4个重复结构域，C末端结构域。
[05]骨膜素最初被称为成骨细胞特异性因子-2(OSF-2)，作为在小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞中特异性表达的基因被分离鉴定(专利文献1，非专利文献1)，后来被称为现在的名称的骨膜素，据报道在成骨细胞中有粘附促进活性(非专利文献2)。
[06]在初期的研究中，人们认为骨膜素是在骨组织中特异性表达的细胞外基质。但是，现在已清楚了其不仅在骨组织，而且还在心衰减(非专利文献3，非专利文献4)，动脉瘤(非专利文献5)，高转移性癌(非专利文献6，非专利文献7，非专利文献8)，子痫前症(非专利文献9)等发病中以极高水平表达，而且在正常组织中极少表达。而且，现已清楚了一些骨膜素剪切变体在成骨细胞中表达(非专利文献1，非专利文献2，非专利文献10，专利文献3)。
[07]对于骨膜素的作用，就细胞粘附作用而言，报道了由811个氨基酸构成的骨膜素剪切变体(相当于图1中PN-2)(非专利文献2)和由782个氨基酸构成的骨膜素剪切变体(非专利文献11)具有细胞粘附作用。与之相对，据报道，细胞不粘附于涂覆了由838个氨基酸构成的骨膜素剪切变体(相当于图1中PN-1)的平板上，即该骨膜素剪切变体没有细胞粘附活性，与正常的大鼠相比，在心衰竭模型大鼠中由838个氨基酸构成的骨膜素剪切变体(相当于图1中PN-1)的基因表达显著增加，其为引起心脏扩张的激发因子，而且若抑制该蛋白质的表达则存活率显著上升(非专利文献3)。进而，还报道了通过使用针对由838个氨基酸构成的骨膜素剪切变体的反义核苷酸抑制该骨膜素剪切变体的表达的心衰竭的预防剂或治疗剂(专利文献2)。
[08]这样，提示了骨膜素基因的表达与心衰竭的病状相关，但是骨膜素剪切变体的结构与心衰竭的关系尚不清楚。因此，本发明人使用抗体试图弄清楚与心衰竭病状相关的骨膜素的结构。
[09]对于骨膜素抗体，报道了骨膜素的与细胞游走抑制相关的抗体(非专利文献12)和具有抑制骨膜素产生的细胞的增殖的活性的抗体(非专利文献13)。但是，并未报道与骨膜素的细胞粘附活性相关区域的结构相关的抗体，而且，也没有任何关于骨膜素的细胞粘附活性和心衰竭等疾病之间的关系的报道。
专利文献1：特开平5-268982号公报
专利文献2：再公开专利WO02/020055号公报
专利文献3：国际公开WO2005/019471号公报
非专利文献1：Takeshita S.et al.，Biochem J(1993)294，271-8
非专利文献2：Horiuchi K.et al.，J.Bone Miner.Res.(1999)14，1239-49
非专利文献3：Katsuragi N.et al.，Circulation(2004)110，1806-13
非专利文献4：Wang D.et al.，Hypertension(2003)42，88-95
非专利文献5：Peters DG.et al.，Stroke(2001)32，1036-42
非专利文献6：Shao R.et al.，Mol Cell Biol.(2004)24，3992-4003
非专利文献7：Gonzalez HE.et al.，Arch Otolaryngol HeadNeck Surg.(2003)129，754-9
非专利文献8：Sasaki H.et al.，Breast Cancer ResTreat.(2003)77，245-52
非专利文献9：Sasaki H.et al.，Am J ObstetGynecol.(2002)186，103-8
非专利文献10：Litvin J.et al.，J Cell Biochem.(2004)92，1044-61
非专利文献11：Gillan L.et al.，Cancer Res.(2002)62，5358-64
非专利文献12：Lindner V.et al.，Arterioscler Thromb VascBiol.(2005)25，77-83
非专利文献13：Tai IT.et al.，Carcinogenesis(2005)26，908-15
发明内容：
[10]本发明的目的在于提供可以改善生活质量和长期生命预后的有效的新型心衰竭预防剂或治疗剂等。具体的是提供针对具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗体。而且，还提供产生该抗体的杂交瘤，编码该抗体的DNA，含有该DNA的重组载体，在宿主细胞中导入该重组载体而获得的转化体，以及通过培养该转化体，从该培养物中收集该抗体制备该抗体的方法。而且，还提供了一种含有该抗体的用于预防或治疗与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的药物组合物。进而，还提供了由对患者施予该药物组合物构成的预防或治疗与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的的方法，以及该疾病的诊断方法。
[11]本发明人清楚了不具有细胞粘附活性的骨膜素剪切变体(PN-1)具有抗细胞粘附活性，即具有剥离粘附的细胞的活性，而且，另一方面，确认了具有细胞粘附活性的骨膜素(PN-2)不具有抗细胞粘附活性，即不剥离粘附的细胞。于是，在具有抗细胞粘附活性的骨膜素剪切变体(PN-1)和不显示抗细胞粘附活性的骨膜素(PN-2)中，关注于其结构和细胞粘附中活性的差异，认为通过抑制具有抗细胞粘附活性的骨膜素剪切变体中特异存在的区域，可以预防或治疗具有抗细胞粘附活性的骨膜素的相关疾病。总而言之，认为针对该区域的抑制物质作为具有抗细胞粘附活性的骨膜素的相关疾病的预防或治疗剂是有用的。
[12]对心衰竭时亢进的骨膜素剪切变体进行研究，其结果清楚了剪切变体形成的C-末端结构域由15-23个外显子(exon)构成，在大鼠中存在以下(1)-(4)。
(1)全都有的(称为PN-1；序列号1所示的838个氨基酸构成；cDNA序列示为序列号6)、
(2)缺失外显子-17(称为PN-2；序列号5所示的811个氨基酸构成；PN-1中缺失了序列号3所示的27个氨基酸(外显子-17)；cDNA序列示为序列号7)、
(3)缺失外显子-21(称为PN-3；由810个氨基酸构成)、
(4)缺失外显子-17和外显子21(称为PN-4；由783个氨基酸构成。)
而且，在大鼠之外，在小鼠和人也发现PN-1和PN-2(小鼠PN-1：序列号8(氨基酸序列)、序列号9(cDNA序列)；小鼠PN-2：序列号10(氨基酸序列)、序列号11(cDNA序列)；人PN-1：序列号12(cDNA序列)；人PN-2：序列号13(氨基酸序列)、序列号14(cDNA序列))。接着，本发明人在这些变体中，发现PN-1多在大鼠的心脏肥大组织中表达，PN-2和PN-3的表达量少。因此，本发明人对作为PN-1和PN-2的结构上不同的部位，即只存在于PN-1上的外显子-17部位的抑制物质的特异性识别该位置编码的氨基酸序列部分的抗体的制备进行了研究。
[13]为了制备抗体，作为免疫原使用的物质需要是亲水性的，而且，使用蛋白质等大多肽的一部分制备抗体时，需要作为免疫原使用的部分出现在该蛋白质的表面，构成表位部分。因此，为了探讨外显子-17肽链作为抗原使用的可能性，最初使用在生物信息学领域中广泛使用的accelrys公司的软件Mac Vector 7.2进行表位检索。其结果是，从“亲水性(Hydrophilicity)”、“从表面露出的容易性(SurfaceProbability)”和“抗原性(Antigenicity)”来看，外显子-17区域的TTKIITKLVEPKIKVIQGSLQPIIKTE(序列号3)基本上是疏水性区域，这提示在蛋白质分子的表面出现的可能性非常低，因此认为其不具有抗原性，无法制备抗体，预测实际上难以制备抗体。
[14]但是，本发明人等为了特异性抑制PN-1的功能，故认为使用针对特异性存在于PN-1上的外显子-17编码的肽区域的抗体是最合适的，由此完成了针对外显子-17编码的氨基酸序列的抗体制备。合成构成外显子-17区域编码的肽的由27个氨基酸构成的肽，使家兔免疫，从获得的血清中纯化IgG级分，制备抗外显子-17肽的多克隆抗体。然后，若在培养至80％融合时的成纤维细胞中添加骨膜素蛋白质PN-1，则观察到几乎100％的细胞脱离(即，抗细胞粘附活性)。该实验系统中施以抗外显子-17肽的抗体的结果是，通过骨膜素蛋白质PN-1可抑制细胞的脱离，由此清楚了该抗外显子-17肽的抗体是具有中和骨膜素蛋白质PN-1的活性的抗体。然后，制备急性心肌梗塞模型大鼠，在每周一次连续给药抗外显子-17肽抗体后，清楚了在模型制备后4周时心脏的扩张受到显著抑制，而且心脏机能获得改善。进而清楚了即使在模型制备后8周时，上述效果持续，并且心脏纤维化受到抑制。由此清楚了抗外显子-17肽抗体是具有抑制在心衰竭病状进行的同时引起的心脏扩张和纤维化的活性，且具有使心脏机能获得改善的活性的抗体，从而完成了本发明。
[15]本发明，作为解决前述问题，提供了针对在心脏衰竭时等心脏中特异性表达的具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗体，尤其是以该骨膜素剪切部位作为抗原的抗体。
[16]即，本发明可以列举以下内容。
(1)具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗体。
(2)针对具有序列号1或序列号2所示的氨基酸序列的骨膜素的抗体。
(3)针对具有序列号3或序列号4所示的氨基酸序列的骨膜素的抗体。
(4)针对具有序列号34所示的氨基酸序列的骨膜素的抗体。
(5)针对与具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗细胞粘附活性相关区域的抗体。
(6)针对具有序列号3或序列号4所示的氨基酸序列或其部分构成的肽的抗体。
(7)针对具有序列号34所示的氨基酸序列或其部分的氨基酸序列的肽的抗体。
(8)(1)-(7)任一项中记载的抗体，所述抗体是特异性识别序列号3或4所示的氨基酸序列或其部分的部位的抗体。
(9)(1)-(7)任一项中记载的抗体，所述抗体是特异性识别序列号34所示的氨基酸序列或其部分的肽的抗体。
(10)与序列号26所示的氨基酸序列构成的肽结合的抗体。
(11)(1)-(10)任一项中记载的抗体，所述抗体是具有中和抗细胞粘附活性能力的抗体。
(12)(1)-(11)任一项中记载的抗体，所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
(13)(12)记载的抗体，所述抗体是单克隆抗体。
(14)由杂交瘤细胞株FERM BP-10718产生的抗体。
(15)(13)中记载的单克隆抗体的部分片段构成的抗体片段。
(16)结合了(1)-(14)任一项中记载的抗体或(15)中记载的抗体片段和蛋白质或低分子的药物的抗体的衍生物。
(17)产生(1)-(14)任一项中记载的抗体的杂交瘤。
(18)(17)中记载的杂交瘤，其是杂交瘤细胞株FERM BP-10718。
(19)编码蛋白质与(1)-(14)任一项中记载的抗体，(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的抗体或抗体片段结合的衍生物的DNA。
(20)含有(19)中记载的DNA的重组载体。
(21)通过在宿主细胞中导入(20)中记载的重组载体而获得的转化体。
(22)抗体，抗体片段或蛋白质与抗体或抗体片段结合的衍生物的制备方法，其特征在于培养(21)中记载的转化体，使(1)-(14)中任一项记载的抗体、蛋白质与(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的抗体或抗体片段结合的衍生物在培养物中生成，从该培养物中收集该抗体，该抗体片段，或蛋白质与抗体或抗体片段结合的衍生物。
(23)含有(1)-(14)中任一项记载的抗体，(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的衍生物的药物组合物。
(24)用于预防或治疗与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的药物组合物，其含有(1)-(14)中任一项记载的抗体，(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的衍生物。
(25)(24)中记载的药物组合物，前述疾病是心脏衰竭，心肌梗塞，心脏扩张，心脏肥大，心纤维化，心肌病，心肌炎，瓣膜症，癌症，动脉瘤，动脉硬化，中枢神经变性疾病，肾脏病，关节风湿病，骨质疏松症，肺气肿，肺高血压症，慢性闭塞性肺疾病(COPD)，肾炎，胰腺炎，肝炎，肝纤维症或肺纤维症。
(26)与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的预防或治疗方法，其由对患者施以(23)的药物组合物构成。
(27)(26)中记载的预防或治疗方法，前述疾病是心脏衰竭，心肌梗塞，心脏扩张，心脏肥大，心纤维化，心肌病，心肌炎，瓣膜症，癌症，动脉瘤，动脉硬化，中枢神经变性疾病，肾脏病，关节风湿病，骨质疏松症，肺气肿，肺高血压症，慢性闭塞性肺疾病(COPD)，肾炎，胰腺炎，肝炎，肝纤维症或肺纤维症。
(28)与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的诊断方法，其使用(1)-(14)任一项中记载的抗体，(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的衍生物。
(29)(28)中记载的诊断方法，前述抗体是标记的抗体。
(30)(28)或(29)中记载的诊断方法，前述疾病是心脏衰竭，心肌梗塞，心脏扩张，心脏肥大，心纤维化，心肌病，心肌炎，瓣膜症，癌症，动脉瘤，动脉硬化，中枢神经变性疾病，肾脏病，关节风湿病，骨质疏松症，肺气肿，肺高血压症，慢性闭塞性肺疾病(COPD)，肾炎，胰腺炎，肝炎，肝纤维症或肺纤维症。
(31)标记的(1)-(14)任一项中记载的抗体，(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的衍生物。
(32)定量试样中的具有抗细胞粘附活性的骨膜素的方法，其使用(1)-(14)任一项中记载的抗体，(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的衍生物。
(33)检测试样中的具有抗细胞粘附活性的骨膜素的方法，其使用(1)-(14)任一项中记载的抗体，(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的衍生物。
(34)具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关疾病的诊断剂，其使用(1)-(14)任一项中记载的抗体，(15)中记载的抗体片段或(16)中记载的衍生物。
[17]而且，本发明中所谓“以序列号○表示的氨基酸序列”时，还包括该氨基酸序列中缺失，取代或添加了1或多个氨基酸的情况。
附图的简要说明
[18]图1是表示大鼠的骨膜素的剪切变体的模式图。
图2是表示测定大鼠PN-1的抗细胞粘附作用的结果的图(实施例2)。
图3是表示对抗大鼠外显子-17肽抗体的大鼠PN-1活性抑制进行测定的结果的图(实施例3)。
图4-1是表示测定急性心肌梗塞模型制成后4周后抗大鼠外显子-17肽抗体所导致的心肌扩张的抑制的结果的图(实施例4：前壁厚，后壁厚)。
图4-2是表示测定急性心肌梗塞模型制成后4周后抗大鼠外显子-17肽抗体所导致的心肌扩张的抑制的结果的图(实施例4：扩张末期心内径，收缩末期心内径，心脏机能)。
图4-3是表示测定急性心肌梗塞模型制成后4周后抗大鼠外显子-17肽抗体所导致的心肌扩张的抑制的结果的图(实施例4：心搏动数，梗塞区域)。
图5-1是表示测定急性心肌梗塞模型制成后8周后抗大鼠外显子-17肽抗体所导致的心肌扩张的抑制的结果的图(实施例4：前壁厚，后壁厚)。
图5-2是表示测定急性心肌梗塞模型制成后8周后抗大鼠外显子-17肽抗体所导致的心肌扩张的抑制的结果的图(实施例4：扩张末期心内径，收缩末期心内径，心脏机能)。
图5-3是表示测定急性心肌梗塞模型制成后8周后抗大鼠外显子-17肽抗体所导致的心肌扩张的抑制的结果的图(实施例4：心搏动数，梗塞区域)。
图6-1是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的血流动向的图(实施例4：LVP、心搏动的)。
图6-2是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的血流动向的图(实施例4：(+)dP/dt、(-)dP/dt)。
图6-3是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的血流动向的图(实施例4：SBP、DBP、LVEDP)。
图7是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的组织学研究的结果的图(实施例4)。
图8是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的心肌细胞的短轴径的图(实施例4)。
图9-1是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的基因表达分析的结果的图(实施例4：G3PDH)。
图9-2是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的基因表达分析的结果的图(实施例4：ET-1/G3、血管紧张素原(angiotensinogen/G3))。
图9-3是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的基因表达分析的结果的图(实施例4：α-MHC/G3、β-MHC/G3)。
图9-4是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的基因表达分析的结果的图(实施例4：Col-I/G3、Col-III/G3)。
图9-5是表示用抗大鼠外显子-17肽抗体处理的模型大鼠的基因表达分析的结果的图(实施例4：TGF-β/G3、TNF-α/G3)。
图10是表示测定人PN-1的抗细胞粘附作用的结果的图(实施例15)。
图11是表示对抗人外显子-17单克隆抗体的人PN-1活性抑制进行测定的结果的图(实施例16)。
图12-1是表示对急性心肌梗塞模型制备4周后抗人外显子-17单克隆抗体所导致的对心脏扩张的抑制进行测定的结果的图(实施例17：前壁厚，后壁厚)。
图12-2是表示急性心肌梗塞模型制备4周后对抗人外显子-17单克隆抗体所导致的对心脏扩张的抑制进行测定的结果的图(实施例17：扩张末期心内径，收缩末期心内径，心脏机能)。
图12-3是表示急性心肌梗塞模型制备4周后抗人外显子-17单克隆抗体所导致的对心脏扩张的抑制进行测定的结果的图(实施例17：心搏动数，梗塞区域)。
用于实施发明的最佳方式
[19]在一个方式中，本发明提供了针对具有抗细胞粘附活性的抗体。其中，本发明提供了针对具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗体。其中，骨膜素是一种细胞外基质，已知存在一些骨膜素剪切变体，这些变体是在心脏衰竭时等情况的心脏中特异表达。作为抑制在心脏衰竭时等情况的心脏中特异表达的骨膜素剪切变体的功能的物质，即抑制剂，在本发明中从特异性高，对人类的安全性高等理由出发，可以使用抗体。本发明中，以化学合成的形成在心脏衰竭时等情况的心脏中特异的骨膜素剪切变体的C-末端结构域的外显子-17区域编码的氨基酸构成的肽作为抗原，可以制备抗体，但涉及的肽可以通过骨膜素蛋白质的酶消化或基因工程法等获得，而不用管其来源。
[20]在本发明中，所谓“具有抗细胞粘附活性”是具有剥离粘附的细胞或使之脱离的作用。而且，所谓“不具有抗细胞粘附活性”是不剥离粘附的细胞或不使之脱离，此时，细胞维持粘附状态。通过在培养板上培养心成纤维细胞等细胞使细胞粘附于培养板上后，添加检测用试样进行培养，通过清洗除去玻璃的细胞后，染色残留的细胞，确认粘附的细胞的残存状态，从而可以评断抗细胞粘附活性的有无。
[21]而且，本发明中，作为具有抗细胞粘附活性的骨膜素，优选可以列举序列号1(大鼠骨膜素PN-1，838个氨基酸)，序列号2(人骨膜素PN-1，836个氨基酸：比大鼠骨膜素在N末端的信号序列少2个氨基酸)，或者序列号8(小鼠骨膜素PN-1)的氨基酸序列构成的骨膜素。而且，作为具有抗细胞粘附活性的骨膜素，还可以列举由序列号3(大鼠骨膜素的外显子-17编码的27个氨基酸)，序列号4(人骨膜素的外显子-17编码的27个氨基酸)或序列号21(小鼠骨膜素的外显子-17编码的27个氨基酸)所示的氨基酸序列的骨膜素。进而，具有由序列号22(人骨膜素的外显子-17编码的氨基酸序列的N末端起第1位至第9位，9个氨基酸)，序列号23(大鼠骨膜素的外显子-17编码的氨基的序列的N末端起第1位至第9位，9个氨基酸)，或者序列号24(小鼠骨膜素的外显子-17编码的氨基酸序列的N末端起第1位至第9位，9个氨基酸)所示的氨基酸序列的骨膜素。进而还可以列举具有序列号34(人骨膜素的外显子-17编码的氨基酸序列的N末端起第1位至第6位，6个氨基酸)所示的氨基酸序列的骨膜素。
[22]作为骨膜素的抗细胞粘附活性相关区域，可以列举例如外显子-17的剪切部位。具体而言，可以列举例如具有序列号1所示的氨基酸序列的骨膜素的序列号3所示的氨基酸残基部分(序列号1的672-698位氨基酸)，具有序列号2所示的氨基酸序列的骨膜素的序列号4所示的氨基酸残基部分(序列号2的670-696位氨基酸)，具有序列号8所示的氨基酸序列的骨膜素的序列号21所示的氨基酸残基部分(序列号8的672-698位氨基酸)。进而，还可以列举序列号22或序列号23所示的氨基酸序列，以及序列号34(序列号22或序列号23所示的氨基酸序列和序列号22或序列号23的N末端的第1位至第6位的氨基酸残基的氨基酸序列)。
[23]在本发明的优选方式中，所谓“可以特异性识别与抗细胞粘附相关的部位”优选是指可以特异性识别含有上述外显子-17的剪切部位的骨膜素的与抗细胞粘附相关的部位。例如，作为可以特异性识别骨膜素的与抗细胞粘附相关的部位的抗体，可以适当列举针对具有序列号1所示的氨基酸序列的骨膜素的序列号3所示的氨基酸序列部分(序列号1的672-698位氨基酸)，具有序列号2所示的氨基酸序列的骨膜素的序列号4所示的氨基酸序列部分(序列号2的670-696位氨基酸)，具有序列号8所示的氨基酸序列的骨膜素的序列号21所示的氨基酸序列部分(序列号8的672-698位氨基酸)，或者其一部分的抗体。进而，还可以列举针对具有序列号22或序列号23所示的氨基酸序列，或者其一部分的多肽的抗体。进而，可以列举针对具有序列号22或序列号23的N末端的第1位至第6位的氨基酸残基的氨基酸序列(序列号34)的骨膜素的抗体。
[24]所谓“抑制骨膜素的与抗细胞粘附活性相关的区域”是指抑制上述的“骨膜素的与抗细胞粘附活性相关的区域”所具有的作用或活性，具体是例如是用可以特异性识别与上述的抗细胞粘附活性相关的部位的抗体抑制骨膜素所具有的作用或活性。
[25]在一个方式中，本发明的抗体是使用上述所述抗原获得的单克隆抗体和多克隆抗体。其中，所谓“单克隆抗体”是对前述抗原具有反应性的任意的单克隆抗体，在“单克隆抗体”中还包括了通过给小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠或家兔等哺乳动物免疫前述抗原而获得的天然型抗体，使用基因重组技术获得的嵌合单克隆抗体(嵌合抗体)和人源化多克隆抗体(人源化抗体；CDR-grafted抗体)，和使用人抗体产生转基因动物等制造获得的人单克隆抗体(人抗体)。而且，本发明的抗体还包括具有IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA，IgD等任意一种的异型的单克隆抗体。优选是IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)或IgM。
[26]使用上述肽作为抗原时，其自身也可以作为抗原使用，为了提高抗原性，有使通过上述肽吸附于聚乙烯吡咯烷酮，乳剂，聚甲基丙烯酸甲酯等巨大分子的物质进行免疫的方法，与KLH(KeyholeLimpet Hemocyanin：匙孔血蓝蛋白)或BSA(牛血清白蛋白)等载体蛋白结合再使用的方法等，可以使用任意一种方法。一般优选采用肽与载体蛋白结合再使用的方法，结合方法可以使用公知的方法(例如，续医药品的开发，14卷，广川书店，1991)。为了肽通过与载体蛋白结合保持方向性，采用在肽的C末端或N末端上导入半胱氨酸基，通过半胱氨酸基使之与载体蛋白结合的方法。如果是适于此目的的结合方法，可以使用本领域中一般使用的交联剂。使用琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(以下简称为“SMCC”)或3-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)等。单克隆抗体通过培养用G.Kohler和Milstein的细胞融合法(G.Kohler等人Nature(1975)256，495-7)制备的杂交瘤，使之分泌，从其培养液中分离进行制备。即，用具有外显子-17编码的氨基酸序列的肽等免疫哺乳动物后，获得该动物的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤。产生与外显子-17结合的抗体的杂交瘤的检索，通过例如对于杂交瘤上清使用固定了抗原的微板通过酶免疫测定法(以下简称“ELISA”)进行。作为免疫中使用的动物，没有特别的限定，可以使用各种哺乳动物，例如小鼠，大鼠，豚鼠，兔，绵羊，山羊，猫，狗等。在单克隆抗体的制备中，在上述免疫动物中，从容易吸收等理由出发，一般可以使用Balb/c小鼠，也可以使用其它系统的小鼠。此时，免疫中使用的抗原的浓度，按受到足够量的抗原刺激形成淋巴细胞那样进行选择，优选用生理盐水将1-100μg的抗原稀释到适当的浓度形成弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等悬浮液，通过在动物的腹腔内注射或皮下注射等方式给药。给药按每2-4周1-数次进行。最终免疫通常通过静脉注射或皮下注射等施以添加了1-100μg的抗原的生理食盐溶液来进行。最终免疫的数如后从用于细胞融合的被免疫的动物中取出抗原产生细胞，例如淋巴细胞，优选脾脏细胞或淋巴结细胞。然后，对于使用脾脏细胞作为抗体产生细胞的情况进行说明，脾脏细胞以外的抗体产生细胞也同样可提供给细胞融合。细胞融合，在最终免疫3-4天后，在融合促进剂的存在下使从无菌取出的脾脏制备的脾脏细胞和适当的骨髓瘤细胞发生细胞融合。融合中使用的骨髓瘤细胞可以是从哺乳动物中获得的，一般合适的是来自于与免疫中使用的动物同种的动物，可以适当使用已知的各种细胞株，例如小鼠中，SP2/0-Ag14(SP2)[Nature，276，269(1978)]、NS-1-Ag4/1(NS-1)、P3-X63Ag8U.1(P3U1)[Curr.Top.Microbiol.Immunol.81，1-7(1978)：从ATCC获得，ATCC号CRL-1597]、P3-NS1-1-Ag4-1、P3-X63Ag8(P3)、FO、X63Ag8.653(X63.653)、210.RCY3.Ag1.2.3、S194/5XXO.BU1、SKO-007、GM15006TG-A12等，大鼠中可适当使用Y3.Ag1.2.3等。作为优选的融合促进剂，除了例如平均分子量为1000-6000的聚乙二醇(PEG)之外还可以使用仙台病毒。融合时的脾脏细胞和骨髓瘤细胞的混合比率一般优选在10:1-2:1。
[27]从融合的细胞分离杂交瘤，可以通过下述方式进行培养：在未融合的骨髓瘤细胞无法生存的选择培养基中培养未融合的脾脏细胞、未融合的骨髓瘤细胞和融合的细胞的混合物适当的时间(约1周)直至未融合的细胞死亡。选择培养基可以使用例如HAT培养基(含有6—羟基嘌呤、氨基喋呤和胸腺啶的培养基)。在该选择培养基中，由于未融合的骨髓瘤细胞死亡且未融合的脾脏细胞是肿瘤性细胞，在一定时间后(约一周后)死亡，因此通过选择可以生长的细胞可以获得杂交瘤。产生目的抗体的杂交瘤，通过常规的有限稀释法，进行作为目的的抗体的产生株的检索和单一克隆化。通过使这样获得的杂交瘤在营养培养基中或哺乳动物的腹腔中增殖可以使之产生抗体，产生的抗体可以从培养上清或该哺乳动物的腹水或血清中纯化。作为本发明的杂交瘤，可以使用例如2006年18年11月1日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏号为FERM BP-10718的杂交瘤。抗体的纯化可以使用离心分离，透析，硫酸铵等进行的盐析，DEAE株等进行的离子交换色谱，凝胶过滤，亲合层析等一般的层析，纯化方法进行。就这样获得的单克隆抗体的异型或亚类的确定可以按如下方式进行。首先，作为鉴定法，可以列举奥克特洛尼(Ouchterlony)法，ELISA法或RIA法。奥克特洛尼法简便，但单克隆抗体浓度低时需要浓缩操作。另一方面，使用ELISA法或RIA法时，使培养上清按原样与抗原吸附固相反应，再通过使用针对各种免疫球蛋白异型、亚类的抗体作为第二抗体，可以鉴定单克隆抗体的异型、亚类。而且，作为更为简便的方法，还可以使用市售的鉴定用试剂盒(例如，小鼠分型试剂盒；Bio-Rad公司社制)等。进而，可以通过Folin-Lowry法和根据在280nm处的吸光度[1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml]计算的方法进行蛋白质的定量。这样获得的本发明的单克隆抗体，特异性识别具有序列号1或2所示的氨基酸序列，序列号3或4所示的氨基酸序列，序列号34所示的氨基酸序列的骨膜素(PN-1)，序列号3或4所示的氨基酸序列构成的肽，或具有序列号34所示的氨基酸序列的肽。优选，本发明的单克隆抗体可以特异性识别并结合氨基酸序列YTTKIITKVV(序列号26)构成的肽，即人骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号4)中N末端的第1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列构成的肽，和人骨膜素PN-1的氨基酸序列(序列号2)中N末端的第669位的酪氨酸至第679位的缬氨酸的氨基酸序列构成的肽。即，可以特异性识别人骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号4)中N末端的苏氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列部位(TTKIITKVV；序列号22)或其一部分。更优选的是，本发明的单克隆抗体可以特异性结合人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端第-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV；序列号26)构成的肽中，N末端第1位至第8-10位的氨基酸被取代为丙氨酸的肽。即，可以特异性识别人骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号4)或大鼠骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号3)的至少N末端第1位的苏氨酸至第6位的苏氨酸的氨基酸序列部位(序列号34)或其一部分。进而，本发明的单克隆抗体具有抑制或阻碍人骨膜素-1蛋白质的抗细胞粘附作用，即中和人骨膜素-1蛋白质的抗细胞粘附作用的活性。进而，可以抑制心衰竭时等引起的心脏扩张，心脏肥大和心脏纤维化，改善心脏机能。
[28]本发明使用多克隆抗体作为抗体时，多克隆抗体可以通过通常进行的方法，例如“日本生物化学会编，新生化学实验讲座12，东京化学同人，1992”中记载的方法获得。作为免疫动物，没有特别的限定，可以列举马，山羊，羊，兔，豚鼠，小鼠，家禽等。使用兔子作为免疫动物时，用生理盐水等将抗原稀释到适当的浓度，形成弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或氢氧化铝等的悬浮液，注射10-1000μg/次/只，在2-4周后进行1-3次追加免疫注射，获得抗血清。注射优选在多处皮下进行。由抗血清制备多克隆抗体，可以通过与上述单克隆抗体的纯化相同的方法进行。这样获得的本发明的多克隆抗体，特异性识别具有序列号1或2所示的氨基酸序列，序列号3或4所示的氨基酸序列，序列号34所示的氨基酸序列的骨膜素(PN-1)，序列号3或4所示的氨基酸序列构成的肽，或具有序列号34所示的氨基酸序列的肽。优选，本发明的多克隆抗体可以特异性识别并结合氨基酸序列YTTKIITKVV(序列号26)构成的肽，即人骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号4)中N末端的第1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列构成的肽，和人骨膜素PN-1的氨基酸序列(序列号2)中N末端的第669位的酪氨酸至第679位的缬氨酸的氨基酸序列构成的肽。即，可以特异性识别人骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号4)中N末端的苏氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列部位(TTKIITKVV；序列号22)或其一部分。更优选的是，本发明的多克隆抗体可以特异性结合人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端第-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV；序列号26)构成的肽中，N末端第1位至第8-10位的氨基酸被取代为丙氨酸的肽。即，可以特异性识别人骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号4)或大鼠骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号3)的至少N末端第1位的苏氨酸至第6位的苏氨酸的氨基酸序列部位(序列号34)或其一部分。进而，本发明的多克隆抗体具有抑制或阻碍人骨膜素-1蛋白质的抗细胞粘附作用，即中和人骨膜素-1蛋白质的抗细胞粘附作用的活性。进而，可以抑制心衰竭时等引起的心脏扩张，心脏肥大和心脏纤维化，改善心脏机能。
[29]人源化抗体的制备
免疫球蛋白G(以下单独称为“IgG”)由分子量为约23000的轻多肽链(以下称为“轻链”)，分子量约为50000的重多肽链(以下称为“重链”)两条链构成。重链，轻链均由约110个残基构成，具有氨基酸序列保守的区域重复的结构，它们构成IgG的三维结构的基本单位(以下称为“区域”)。重链和轻链各由4个连续区域以及2个连续区域构成。在重链、轻链中，氨基末端的区域与其它区域相比，各抗体分子间的氨基酸序列的差异大，该区域称为可变区域(variabledomain：以下称为“V区域”)。IgG的氨基末端上，重链、轻链的V区域互补性会合形成可变区域。与之相对，残余的区域整体形成恒定区域。恒定区域具有各动物种类中的特征序列，例如由于小鼠IgG的恒定区域与人IgG的恒定区域不同，小鼠IgG被人的免疫系统识别为异物，其结果是，引起人抗小鼠抗体(Human Anti Mouse Antibody：以下称为“HAMA”。)应答(Schroff RW等人CancerRes.(1985)45，879-85)。因此，小鼠抗体无法对人反复给药。为了对人施以这种抗体，需要修饰抗体分子使得其保持抗体的特异性而不引起HAMA应答。根据X射线晶体结构分析的结果，一般而言，这种区域形成由3至5条β链构成的逆平行β片合在一起形成两层重叠的长圆筒状结构。在可变区域中，重链，轻链的各个V区域而言，集合成各3个环，形成抗原结合部位。各环称为互补性决定区域(complementarity determining region：以下，称之为“CDR”。)，氨基酸序列的差异最为显著。可变区域的CDR以外的部分一般具有保持CDR结构的作用，称为骨架(framework)。Kabatt等人收集了多个重链，轻链的可变区域的一级序列，基于序列的保守性，将这些一级序列分类为CDR和骨架，并制成表(Kabatt等人SEQUENCES OFIMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版，NIH出版，No.91-3242，E.A.)。而且，各骨架被分类为氨基酸序列具有共同的特征的多个亚类。进而，发现人和小鼠之间存在对应的骨架。根据关于这种IgG结构特征的研究，设计出了以下的人源化抗体的制备法。在研究初期的阶段，设计出了小鼠来源的抗体的可变区域与人来源的恒定区域结合的嵌合抗体(Morrison SL等人Proc Natl Acad Sci USA.(1984)81，6851-5)。但是，这种嵌合抗体依然存在的问题是，由于含有多个非人氨基酸残基，因此尤其在长期给药时会诱导HAMA应答(Begent等人，Br.J.Cancer，(1990)62，487)。
[30]作为使存在对人表达HAMA应答的可能性的非人哺乳动物来源的氨基酸残基变得更少的方法，设计出了在人来源的抗体中只整合CDR部分的方法(Peter T等人，Nature，(1986)321，522-5)，但是一般而言，只移植CDR不足以保持对于抗原的免疫球蛋白活性。另一方面，Chothia等人在1987年使用X射线结晶结构分析数据，发现(a)CDR氨基酸序列中存在直接与抗原结合的部位和维持CDR自身结构的部位，CDR所取得的三维结构被分类为多种典型的模式(规则结构)，(b)规则结构的类型，通过CDR和骨架部分的特定位置的氨基酸种类进行确定(Chothia C等人，J.Mol.Biol.(1987)196，901-17)。基于这种认识，提示使用CDR移植法时，除了CDR序列之外还需要在人抗体上移植一部分骨架的氨基酸残基(特表平4-502408号)。一般，要移植的具有CDR的非人哺乳动物来源的抗体被定义为“供体”，移植CDR侧的人抗体被定义为“受体”，在实施CDR移植法时应当考虑的方面在于尽可能保持CDR结构，保持免疫球蛋白分子的活性。为了达到这个目的，需要留意两点：(a)受体应当选择属于任意亚群的生物，以及(b)应当从供体的骨架中选择任意氨基酸残基。
[31]Queen等人建议了供体的骨架的氨基酸残基当符合以下标准的至少一种时，其与CDR序列一起移植到受体中的设计的方法(特表平4-502408号)：可以预料
(a)受体的骨架区域中的氨基酸在其位置上稀有，供体对应的氨基酸在受体的前述位置上普通
(b)该氨基酸为很接近于CDR的一个氨基酸
(c)该氨基酸在三维免疫球蛋白模型中CDR的约
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以内具有侧链原子，而且可以与抗原或人源化抗体的CDR相互作用。
[32]编码本发明的抗外显子-17单克隆抗体的重链或轻链的DNA可以通过下述方式获得：从产生上述抗外显子-17单克隆抗体的杂交瘤细胞中制备mRNA，用逆转录酶将该mRNA转换为cDNA，再分别分离编码该抗体的重链或轻链的DNA。
[33]人抗体的制备
本发明中所谓“人抗体”或“人免疫球蛋白”是指含有构成免疫球蛋白的H链的可变区域(VH)和H链的恒定区域(CH)以及L链的可变区域(VL)和L链的恒定区域(CL)的所有区域是来源于编码人免疫球蛋白的基因的免疫球蛋白。换言之，是指H链来源于人免疫球蛋白重链基因，轻链来源于人免疫球蛋白轻链基因的抗体。人抗体，可以按照常规方法，例如，对通过在小鼠等人以外的哺乳动物的基因座中整合至少人免疫球蛋白基因制备的转基因动物，用抗原进行免疫接种，与前述的单克隆抗体的制备方法同样进行制造。例如，可以按照已经报道的文献(Mendez MJ等人，Nature Genetics(1997)15，146-56，GreenLL等人，Nature Genetics(1997)7，13-21，表平4-504365号公报；国际公开WO94/25585号公报；日经科学，6月号，第40-50页，1995年；Nils Lonberg等人，Nature(1994)368，856-9和特表平6-500233号公报)中记载的方法制备产生人抗体的转基因小鼠。
[34]本发明中使用的抗体不限于所有抗体分子，如果是抑制具有抗细胞粘附活性的骨膜素的该活性，可以是抗体的片段或衍生物。
[35]作为抗体片段，可以列举，例如Fab、F(ab’)2、Fv、单链抗体(scFv)、二硫化物稳定化抗体(dsFv)、含有CDR的肽等。
[36]本发明的抗体片段中的Fab、F(ab’)2等，可以通过以下方式进行制备：用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白质分解酶处理抑制骨膜素的抗细胞粘附活性的抗体而获得，而且，构建编码所获抗体片段的基因，将其导入于表达载体后，使之在适当的宿主细胞中表达。
[37]本发明的抗体片段中的scFv可以使用适当的肽连接子连接抑制骨膜素的抗细胞粘附活性的抗体的H链V区域和L链V区域进行制备。而且，可以通过构建编码上述抗体的H链或H链V区域的基因，和编码L链或L链V区域的基因的所有序列或编码所希望的氨基酸序列的DNA部分，将其导入于表达载体后，使之在适当的宿主细胞中表达进行制备。
[38]本发明的抗体片段中的dsFv是与抑制骨膜素的抗细胞粘附活性的抗体的H链V区域和L链V区域的各1个氨基酸残基被取代为半胱氨酸残基的多肽在该半胱氨酸残基之间通过二硫键结合的抗体片段，取代为半胱氨酸残基的氨基酸残基可以通过抗体的立体结构预测进行选择。可以通过构建编码该抗体的基因的全序列或编码所希望的氨基酸序列的DNA部分，将其导入表达载体后，使之在适当的宿主细胞中表达来制备。
[39]本发明的抗体片段中含有CDR的肽，由抑制骨膜素的抗细胞粘附活性的抗体的H链或L链的CDR区域中至少含有一个以上的CDR区域而构成。而且，也可以通过适当的肽连接子等方法使多个CDR区域结合。含有该CDR的肽可以通过将编码其的基因的全序列或编码所希望的氨基酸序列的DNA部分，将其导入表达载体后，使之在适当的宿主细胞中表达来制备。而且，还可以通过Fmoc法或tBoc法等化学合成来制备。
[40]而且，本发明中，还可以使用使蛋白质或低分子化合物结合于上述抗体或抗体片段的衍生物，这些修饰可以用公知的方法进行。
[41]编码本发明的抗体，抗体片段和该抗体或抗体片段与蛋白质结合的衍生物的DNA可以通过常规方法测定。而且，通过常规方法制备含有该DNA的重组载体，通过常规方法将该重组载体导入于宿主细胞中可以制备转化体。进而，通过常规方法，培养该转化体，使抗体，抗体片段和该抗体或抗体片段与蛋白质结合的衍生物在培养物中生成，通过从该培养物中收集抗体，抗体片段和该抗体或抗体片段与蛋白质结合的衍生物，可以制备抗体，抗体片段和该抗体或抗体片段与蛋白质结合的衍生物。
[42]在1个方式中，本发明的抗体，抗体片段或衍生物可以用于预防或治疗与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病。所谓与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病是在病人的病状时具有抗细胞粘附活性的骨膜素的基因的表达高，由该基因编码的蛋白质的产生增加的疾病。而且是由于该基因或蛋白质的增加而病情恶化的疾病。作为这种与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病，没有特别的限制，可以列举心脏衰竭，心肌梗塞，心脏扩张，心脏肥大，心纤维化，心肌病，心肌炎，瓣膜症，癌症，动脉瘤，动脉硬化，中枢神经变性疾病，肾脏病，关节风湿病，骨质疏松症，肺气肿，肺高血压症，慢性闭塞性肺疾病(COPD)，肾炎(急性和慢性)，胰腺炎(急性和慢性)，肝炎(急性和慢性)，肝纤维症或肺纤维症。而且，作为可以使用本发明的抗体的癌症，并不限于此，可以列举，例如乳癌，大肠癌，肺癌，恶性黑色素瘤，骨癌，胰腺癌，胃癌，皮肤癌，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，结肠癌，子宫癌，卵管癌，食道癌，小肠癌，甲状腺癌，副甲状腺癌，副肾癌，前列腺癌，膀胱癌和肾癌，特别合适的可以列举乳癌，大肠癌，肺癌和恶性黑色素瘤。
[43]本发明是一种通过用标记标识上述抗体制备的诊断心衰竭等与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的诊断剂。其中，作为标记，可以使用酶，放射性同位素，荧光色素等。作为其中使用的酶，如果是满足周转数大且即使与酶结合也稳定，可以特异性与底物反应使之发色等条件，则没有特别的限制，可以使用通常可以在酶免疫测试(EIA)中使用的酶。作为优选的酶的例子，可以使用过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶，葡糖氧化酶，胆碱酯酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶等。而且，还可以使用酶抑制物质或辅酶等。
[44]这些酶与抗体的结合可以通过采用马来酰亚胺混合物等交联剂的公知方法进行。作为底物，可以使用使用的酶所对应的公知物质。例如，使用过氧化物酶作为酶时，可以使用3，3’，5，5’-四甲基苯胺，且在使用碱性磷酸酶作为酶时，可以使用对硝基苯酚等。作为标记使用的放射线同位素，可以使用125I和3H等通常在放射性免疫检测(RIA)中使用的放射线同位素。作为荧光色素，可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)和四乙基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)等通常可以在荧光抗体法中使用的荧光色素。而且，本诊断剂可以特异性染色衰竭心间质，可以作为免疫组织学的染色使用。而且，标识放射性同位素时，通过体内施加，还可以用于使心脏衰竭时的病变部位图像化。
[45]本发明还是一种通过使用本发明的抗体、抗体片段或衍生物检测或定量由人或动物的血液制备的生物体试样的样品中，即血清中具有抗细胞粘附活性的骨膜素的方法，而且还是通过检测或定量诊断心衰竭等与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的方法。本发明中，通过所谓三明治ELISA法(Enzyme-linked immunosorbent assay：酶免疫测定法)可以检测具有抗细胞粘附活性的骨膜素。在使用本发明的诊断试剂盒时，首先使试样与固定了抗骨膜素一级抗体的平板相接触，使二者结合，使经标记标识的抗骨膜素二级抗体与该结合体结合，通过测定这三者的结合体中标记物的信号强度，可以检测或定量具有抗细胞粘附活性的骨膜素。尤其是具有抗细胞粘附活性的骨膜素由于是心衰竭等病状时特异表达的剪切变体，因此通过监控其产生，可以诊断心衰竭等中的病状。
[46]这样，通过标识本发明的抗体，其可以作为二级抗体使用。
[47]含有本发明的抗体，抗体片段或衍生物作为有效成分的药物组合物，可以使用通常制剂化时可以使用的载体或赋形剂，其它的添加剂进行制备。
[48]本发明中涉及的药物组合物的有效成分，通常与公知的药理学上可容许的载体，赋形剂，稀释剂等混合后再在药物中使用，给药方法，例如，优选通过口服给药方法，或静脉给药，肌肉内给药或皮下给药等非口服给药方法。本发明的药物组合物可以通过将有效成分与生理学上可允许的载体，香味剂，赋形剂，稳定剂，稀释剂，乳浊剂，溶液剂，悬浮液，糖浆剂等适当混合来制备，可以作为片剂，粉剂，颗粒剂，溶液剂等来使用。作为可以在片剂等中混合的添加剂，可以使用例如明胶等结合剂，玉米浆等润滑剂等，而且也可以用糖衣或医溶性或肠溶性物质的膜进行被膜。胶囊剂的情况下，前述组合物中还可以再含有液状载体。用于注射的无菌组合物可以使用常规的处方来制备。作为注射用的水性液，可以列举含有葡萄糖等的等渗溶液等，还可以与聚乙二醇等适当的溶解辅助剂等合用。而且还可以配合缓冲剂，稳定剂，保存剂，抗氧化剂，去痛剂等。在口服给药中，在消化道内有效成分容易受到分解时，还可以作为在消化道内难以受到分解的制剂，例如在脂质体中包容活性成分的微胶囊剂进行口服给药。而且，也可以是使有效成分从直肠，鼻腔内，舌下，肺等消化管以外的粘膜被吸收的给药方法。此时，可以以栓剂，滴鼻剂，舌下剂，经肺剂等形态给药。
[49]本发明的药物组合物的给药量，在可以在治疗中使用时，对于治疗有效的给药量可以被确定，给药量根据给药对象的年龄，体重，症状的程度和给药途径等而不同，根据各个情况来决定。通常，通过口服给药时，成人每日的给药量约为0.1-1000mg，可以分成1-数次给药。在持续静脉给药中，可以在0.01μg/kg/min-1.0μg/kg/min的范围内给药，理想的是在0.025μg/kg/min-0.1μg/kg/min的范围内给药。
[50]以下，使用实施例对本发明进行详细而具体的说明，当本发明并不限于这些实施例。
实施例
[制造例1]通过排除法进行的骨膜素的检索
1-1心衰竭病状模型大鼠的制备和左心室试样的摘取
从6周大时开始用含有8％的食盐的高含盐食品饲养雄性Dah1食盐感受性大鼠(Dahl-S)(清水实验材料)，心脏肥大期(11周)和心衰竭期(14周)时各摘取三只的左心室。
[51]1-2mRNA的制备
使用ISOGEN(Nippon gene社)按照说明书中记载的方法从约500mg上述左心室中制备总RNA。接着，用Fast Track2.0Kit(Invitrogen公司)从放入了心脏肥大期，心衰竭期的各3只的总RNA约400μg中，按照说明书记载的方法纯化mRNA，分别回收了约3μg的mRNA。
[52]1-3 cDNA消减
cDNA消减，用PCR-Select cDNA消减试剂盒(Clontech公司)，按照说明书记载的方法进行。即，由上述1-2获得的mRNA各2μg合成cDNA，用限制性酶Rsal消化。然后，以十四周合成的cDNA作为检测cDNA，以11周合成的cDNA作为驱动cDNA(driver cDNA)，将试剂盒附带的两种接头(adapter)分别连接到检测cDNA(tester cDNA)上后，进行消减杂交。然后，用与接头互补的引物进行PCR，特异性扩增表达量存在差异的cDNA片段，获得了扩增产物1。
[53]而且，以11周合成的cDNA作为检测cDNA，以14周合成的cDNA作为驱动cDNA，进行同样的消减，获得的扩增产物称为扩增产物2。
[54]1-4点印迹筛选
A.点印迹的制备
将扩增产物1TA克隆到PCRII载体(Invitrogen公司)中，选择导入了插入片段的克隆。扩增各克隆的插入片段的PCR反应后，对各1μL进行热处理后，在两张尼龙膜过滤膜(Boehringer)上点印迹，用UV交联剂(Stragene公司)固定。
[55]B.cDNA探针的制备
用限制性酶Rsal和Eael，Smal消化扩增产物1，除去adapter，用DIG HighPrime DNA标签/检测试剂盒II(Boehringer公司)，按照说明书记载的方法用DIG-dUTP进行随机引物标识，制备cDNA探针1。从扩增产物2中，同样方式制备cDNA探针2。
[56]C.筛选
进行cDNA探针1与一张上述A制备的点印迹膜的杂交，cDNA探针2与另一张的杂交。具体而言，使用HighPrimeDNA标签/检测试剂盒II，按照说明书记载的方法，在DIG Easy Hyb.液中42℃下杂交一晚。2×SSC，0.1％SDS中于室温下五分钟内清洗两次，于0.1×SSC，0.1％SDS中于68℃下15分钟内清洗两次，在试剂盒附加的阻断缓冲液中与碱性磷酸酶标识抗DIG抗体反应后，添加CSPD ready-to use使之进行化学发光，使X射线膜露光。选择cDNA探针1中的信号比cDNA探针2中的信号强的克隆作为阳性克隆，进行碱基序列的测定。
[57]1-5碱基序列的测定
通过以THERMO Sequena8eTM II染料终止子循环测序试剂盒(Amersham Pharmacia)碱基序列，用自动DNA序列读取装置模型373A(PE Applied Biosystems公司)分析来测定碱基序列。将获得的基因序列与GenBank的数据库进行查询的结果是，判明了其中1个克隆(SF014)是与小鼠骨膜素(GenBank登录号No.D13664)具有86％同源性的基因。
[58][制造例2]大鼠骨膜素cDNA的克隆
大鼠骨膜素cDNA的分离，使用基于SF014的碱基序列设计的引物(1)5’-GTTCATTGAAGGTGGCGATGGTC-3’(序列号15)，(2)5’-GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3’(序列号16)，对由插入于λgtII载体中的大鼠主动脉cDNA文库(C1ontech公司)制备的约4000个克隆的10个噬菌体亚库(subpool)(总计约4万个克隆)，进行PCR筛选，获得了3个阳性亚库。对于通过上述PCR对其中的1个亚库进行扩增获得的片段，用AlkPhos DirectTM(Amersham Pharmacia公司)，采用经碱性磷酸酶标识的探针通过杂交进行筛选，获得了1个阳性克隆大鼠骨膜素#1。将该插入片段整合于pBluescriptII(Stragene公司)的EcoRI位点，按照制造例1-5的方法测定全碱基序列。
[59]获得的克隆的长度为约3kb，相当于小鼠的骨膜素(GenBank登录号D13664)的第292位至3’端，这提示其缺少5’末端。
[60]于是，使用SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司)，按照说明书中记载的方法，以大鼠主动脉cDNA为模板，使用上述引物(2)5’-GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT-3’(序列号16)和基于大鼠骨膜素#1的碱基序列设计的引物(3)5’-CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3’(序列号17)，进行5’-RACE反应。将获得的PCR产物TA克隆到Invitrogen公司的PCR II载体中，命名为大鼠骨膜素5’RACE#1。按照制造例1-5的方法测定碱基序列。
[61]其结果是，大鼠骨膜素5’RACE#1是最初获得的大鼠骨膜素#1的5’方向上长度为约300bp的克隆，5’末端为小鼠骨膜素(GenBank登录号D13664)的5’-末端起长度为15bp的克隆。再使用基于大鼠骨膜素5’RACE#1的碱基序列设计的引物(4)5’-ACGGAGCTCAGGGCTGAAGATG-3’(序列号18)和上述引物(3)5’-CACGGTCGATGACATGGACAACACC-3’(序列号17)，通过PCR筛选由上述大鼠主动脉cDNA文库制备的约4万个克隆的10个噬菌体subpool(总计约40万个克隆)，获得了2个阳性的subpool。通过上述PCR对其中1个subpool进行扩增，以获得的片段作为探针，通过杂交进行筛选，获得1个阳性克隆，命名为大鼠骨膜素#2。将插入片段整合到pBluescriptII(Stragene公司)的EcoRI位点，按照制造例1-5的方法测定碱基序列。
[62]获得的克隆长度为约2.6kb，5’末端与5’-RACE中获得的克隆相同，而3’末端相当于一直到小鼠骨膜素(GenBank登录号D13664)的第2410位的克隆。而且，先前获得的大鼠骨膜素5’RACE#1的碱基序列和大鼠骨膜素#2的相当区域的碱基序列完全一样。由大鼠骨膜素#1和大鼠骨膜素#2完成大鼠骨膜素cDNA的全长。该全长cDNA的碱基序列和由该碱基序列翻译的氨基酸序列示于序列号6和1。
[63][制造例3]Myc-His-大鼠骨膜素融合蛋白质表达载体的构建
制备在由制造例2获得的大鼠骨膜素基因的编码区域翻译的蛋白质的羧基末端上具有Myc表位和6个组氨酸标记，具有CMV启动子的表达载体。
[64]首先，用限制性酶EcoRI和EcoRV消化pTracer-CMV2载体(Invitrogen公司)获得的消化片段上，用连接试剂盒(宝酒造(株))连接通过用限制性酶EcoRI和HindIII消化制造例2中获得的大鼠骨膜素5’RACE#1获得的约500bp的片段和用限制性酶HindIII和Hpal消化制造例2中获得的大鼠骨膜素#1获得的约2780bp的片段，将获得的质粒命名为pTracer-CMV2/大鼠骨膜素。用限制性酶EcoRI和Smal消化这样制备的pTracer-CMV2/大鼠骨膜素，获得了含有大鼠骨膜素基因的编码区域的约2330bp的片段，以基于制造例2获得的大鼠骨膜素#1作为模板，基于其序列设计的引物(5)5’-GACCCGGGAAGAACGCATCATC-3’(序列号19)和设计为在紧挨着大鼠骨膜素的终止密码子插入BstEII位点的引物(6)5’-TGGGTGACCCTGAGAACGGCCTTCTCTTGATC-3’(序列号20)，进行PCR，纯化后，用限制性酶Smal和BstEII消化后获得约270bp的片段。将上述两个片段用连接试剂盒(宝酒造(株))连接到用限制性酶EcoRI和BstEII消化表达载体构建用质粒pcDNA4/Myc-His/C型(Invitrogen公司)获得的载体片段上，将获得的质粒命名为pcDNA4/Myc-His/大鼠骨膜素。用制造例中记载的方法确认插入部分的全碱基序列。
[65][制造例4]杆状病毒用表达载体的构建
用限制性酶SacI和Pmel消化制造例3中获得的质粒pcDNA4/Myc-His/大鼠骨膜素，切出肽片段大鼠PN-1/Myc-His。用连接试剂盒(宝酒造(株))将其连接到用限制性酶SacI和KpnI(钝化)消化pFastBacHTc(Invitrogen公司)获得的载体片段上，将获得的表达载体命名为pFastBac/大鼠PN-1/Myc-His。用制造例1-5中记载的方法确认插入部分的碱基序列。
[66][制造例5]重组杆状病毒的制备和培养
用制造例5获得的pFastBac/大鼠PN-1/Myc-His转化大肠杆菌DH10BAC细胞，制备重组杆状病毒。对于获得的杆状病毒，通过电泳和PCR确认目的片段插入。
[67]在无血清培养基(2000mL Sf-900IISFM(Invitrogen公司制)添加庆大霉素使其终浓度为50μg/mL)中，于28℃培养经上述重组杆状病毒以MOI＝0.1感染的昆虫Sf9细胞(2×106细胞/ml)4-5天后，回收上清。
[68][制造例6]大鼠骨膜素蛋白质的纯化
将2000mL制造例5中获得的培养上清提供给经平衡化缓冲液(50mM醋酸钠缓冲液pH6.0 0.1M氯化钠)平衡化的琼脂糖Fast Flow10mL bed，获得的通过级分作为琼脂糖通过级分。
[69]用平衡化缓冲液清洗至280nm处的吸光度达到0附近(约100mL)，形成琼脂糖洗脱分级。
[70]用100mL洗脱缓冲液(50mM磷酸二氢钠(pH8.0)，0.5M氯化钠，5mM咪唑)洗脱，形成琼脂糖清洗级分。
然后，将100mL琼脂糖洗脱级分提供给经50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，0.5M氯化钠和5mM咪唑平衡化的Ni-NTA琼脂糖5mL bed，获得的通过级分作为Ni-NTA琼脂糖通过馏分。
[71]用约50mL清洗缓冲液(50mL磷酸二氢钠pH8.0，0.5M氯化钠，5mM咪唑)清洗，形成Ni-NTA琼脂糖清洗级分。
[72]洗脱缓冲液为如下((1)50mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，20mM咪唑，之后的咪唑量为(2)30mM，(3)40mM，(4)50mM，(5)60mM)，分别用约25mL洗脱，形成Ni-NTA琼脂糖洗脱级分(1)-(6)。
[73]将经Western blot法确认含有目的蛋白的级分浓缩到1mL以下。
[74]然后，将上述浓缩试样提供给经脱气的PBS(-)(137mM NaCl，8.1mMNa2HPO4，2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4)平衡化的凝胶过滤柱(Sephacryl S-200HRφ11mm×95cm；容量：90bed)，用PBS(-)洗脱，通过冷冻干燥，获得了大鼠骨膜素纯化蛋白质。
实施例1
[75]大鼠外显子-17肽链的合成和多克隆抗体的制备
若使PN-1基因在正常的SD大鼠的心脏中高表达，则引起心脏扩张，并且，如果在Dahl心衰竭模型大鼠的心脏中施以大鼠骨膜素的反义寡核苷酸，则存活率得以改善，除此之外，与已报道的PN-2不同，已经清楚大鼠PN-1中没有细胞粘附作用，根据各个序列的比较，大鼠PN-1中特异的结构鉴定为是外显子-17序列。以80％以上的纯度化学合成在该外显子-17构成的氨基酸序列的N末端上添加了Cys残基的肽10mg。使所述肽与6mg作为载体蛋白质的KLH结合，再免疫家兔(Kb1：JW)。免疫方法，在最初免疫时使用FCA(弗氏完全佐剂)，两次免疫之后使用FIA(弗氏不完全佐剂)。而且，以给药部位在背部皮下20处，给药时间为0，2，4，6周，给药量为在最初免疫时800μg肽/只，2次免疫之后为400μg肽/只的方式进行免疫。用ELISA法测定抗体效价，给药第7周时收集全血清。然后，使用合成肽制备亲合层析柱，只回收对外显子-17特异性反应的抗体。以后，将针对大鼠骨膜素的外显子-17编码的肽的多克隆抗体称为抗大鼠外显子-17肽抗体。
实施例2
[76]体外研究大鼠PN-1的抗细胞粘附活性的有无
通过与文献记载的方法(Ruwhof C，van Wamel AE，Egas JM，vander Laarse A.Mol Cell Biochem.2000年5月；208(1-2)：89-98，Ashizawa N，Graf K，Do YS，Nunohiro T，GiachelliCM，Meehan WP，Tuan TL，Hsueh WA.J Clin Invest.1996年11月15日；98(10)：2218-27)相同的方法，获得大鼠的心成纤维细胞。具体而言，用乙醚麻醉20只出生后1-2天大的SD大鼠，用乙醇消毒胸部。摘出心脏，放入转入了PBS(-)的皿中，按横截面切割心脏，血液流出，再用PBS(-)清洗3次后，尽可能除去PBS(-)，用剪子细刻。然后，将PBS(-)与胶原酶/胰蛋白酶按1:1混合，于37℃振荡15分钟后，再进行petting使细胞尽可能分离。然后，将白金筛装入离心管中过滤细胞分离液，用10ml的加入10％血清的M199培养基和10ml的PBS(-)清洗白金筛。然后，用1500rpm离心分离离心管10分钟，形成沉淀物，用20ml的加入10％血清的M199培养基搅拌获得的细胞，接种于培养皿中。于37℃放置1小时后，收集粘附于皿上的细胞作为大鼠心成纤维细胞。将上述大鼠心成纤维细胞以6.4×104个/100μl接种于96孔板上，培养一夜后，将培养液更换为添加了10μg/ml的环己酰亚胺(cycloheximide)的10％FBS添加DMEM培养基，于37℃培养1小时。然后，用预先加热到37℃的DMEM培养基(无血清培养基)清洗细胞2遍，将按照制造例制备的大鼠骨膜素蛋白质添加到DMEM培养基(无血清)中，使终浓度达到10μg/ml。使用具有细胞粘附促进作用的纤连蛋白作为阳性对照，使用BSA(牛血清白蛋白)作为阴性对照。于37℃培养1小时后，在显微镜观察中，添加了大鼠骨膜素蛋白质的组细胞完全剥离，用PBS(-)清洗2次后，用10％中性缓冲福尔马林液固定细胞30分钟。然后，用PBS(-)清洗3次后，用甲基紫染色30分钟。然后。用550nm的读板仪(BIO-RAD，Model 680 MICRO读板仪)测定细胞的染色度(图2)。其结果是，作为对照的纤连蛋白和BSA给药组和无添加组中没有发生粘附的细胞的剥离，没有发现抗细胞粘附作用，而添加大鼠PN-1的组中发现了细胞的剥离，由此清楚了PN-1具有粘附细胞的剥离作用，即抗细胞粘附作用。
实施例3
[77]在体外研究抗大鼠外显子-17肽抗体的中和活性
将按与实施例2相同的方法获得的SD大鼠来源的心成纤维细胞按6.4×104个/100μl接种于96孔板上，培养一夜后，将培养液更换为添加了10μg/ml的环己酰亚胺(cycloheximide)的10％FBS添加DMEM培养基，于37℃培养1小时。然后，用预先加热到37℃的DMEM培养基(无血清培养基)清洗细胞2遍，将终浓度10μg/ml的大鼠骨膜素蛋白质和抗大鼠外显子-17肽抗体添加到DMEM培养基(无血清)中，使终浓度达到10μg/ml和100μg/ml。只使用大鼠骨膜素蛋白质作为阳性对照，使用BSA作为阴性对照。于37℃培养1小时后，在显微镜观察中，添加了大鼠骨膜素蛋白质的组，细胞几乎完全剥离，用PBS(-)清洗2次后，用10％中性缓冲福尔马林液固定细胞30分钟。然后，用PBS(-)清洗3次后，用甲基紫染色30分钟。然后。用550nm的读板仪(BIO-RAD，Model 680 MICRO读板仪)测定细胞的染色度(图3)。其结果是，判明了抗大鼠外显子-17抗体是具有抑制由于PN-1而产生的粘附细胞的剥离，最终抑制PN-1的抗细胞粘附作用，即中和PN-1的抗细胞粘附作用的活性的抗体。
实施例4
[78]采用急性心肌梗塞模型大鼠的抗大鼠外显子-17肽抗体的效果
用体重为250-300g的雄性Lewis大鼠，在腹腔给药戊巴比妥麻醉剂(0.1mg/100g)充分麻醉后，固定在大鼠用手术台上。经口插入气管，连接到大鼠用呼吸器上(一次换气量3ml，80次/分)，从左胸骨第3肋间横切开皮肤，再横切开位于其下的大胸肌，此外再用大鼠用开胸器扩张肋间，露出心脏。
[79]然后，用直径为5mm的曲针用1.0丝绑住位于左心房下方附近的左冠动脉。此时左冠动脉的环流区域-前壁和侧壁由红色变为白色，冠脉血流量被充分阻断，目视确认相同部位的壁运动消失(在Sham组中，在冠动脉中通入针后，不用丝绑住而拔出针)，用3.0丝绑住第3肋骨和第4肋骨，并固定(此时，排出使肺扩张的肺的外部的空气，使得肺容易扩张后再绑)。然后，用3.0丝缝合相同的皮肤切开部位片刻后开始观察，确认意识恢复，逐渐自己发出呼吸后，拔管。
[80]按照以上步骤，逐次制备急性心肌梗塞模型。
[81]次日，用异氟烷经鼻麻醉后，进行经皮的心脏超声波检查，除去梗塞大小不到左心室全周的20％的小梗塞模型。其它的梗塞模型按照心脏功能的损伤的顺序排列，按顺序分为分组为抗大鼠外显子-17肽抗体给药组和对照抗体(家兔IgG)给药组，从尾静脉给药各200μg。
[82]在模型制作的次日给药抗体，再在初次给药的每六天给各组给药4次。
[83]另一方面，在直至8周后，每一周用心脏超声波检查经胸壁评价心脏。8周后，在戊巴比妥麻醉剂下插入气管，装载到呼吸机上，从左颈部切开皮肤，用镊子分开颈部肌肉，露出左颈总动脉，用线绑住左颈动脉止血，然后在远处部位用小剪子在动脉上开孔，从相同部位插入大鼠用Miller导管，使得有压力监控的导管的前端到达左心室内，与呼吸机连接，测定心脏机能和血压等。
[84]模型制备的4周后的心脏超声波检查的结果中，在给药抗大鼠外显子-17肽抗体的组中，与给药兔IgG的对照组相比，心脏的前壁厚和后壁厚的变薄明显受到抑制，扩张末期心脏内径和收缩末期心脏内径的扩大受到抑制，并且心脏的收缩机能的指标-EF值上升。总之，清楚了心脏扩大受到抑制，心脏机能得以改善(图4-1至图4-3)。进而，即使在模型制备的8周后的心脏超声波检查的结果中，与上述4周后的结果相同，也确认了心脏扩张的抑制和心脏机能的改善(图5-1至图5-3)。该结果提示，即使在抗大鼠外显子-17肽抗体给药后约4周后，由该抗体产生的心脏扩张的抑制和心脏机能的改善效果依然得以维持。然后，在血液动力学中，与对照IgG抗体给药组相比，抗大鼠外显子-17肽抗体给药组中在最大内压变化率((+)dP/dT)，最小内压变化率((-)dP/dT)和左心室扩张末期压力(LVEDP)上获得显著差异，由此提示心脏机能的改善(图6-1至图6-3)。在用肝胶原染色(Masson-Trichrome染色)的心脏切片中，在经抗大鼠外显子-17肽抗体给药的组中，与对照IgG抗体给药组相比，被蓝色染到的部位减少，纤维化受到抑制(图7)。而且，通过心肌细胞短轴径的测量，清楚了给药抗大鼠外显子-17肽抗体的组中，与对照IgG抗体给药组相比，心肌细胞的短轴径变薄显著受到抑制(图8)。该结果与心脏超声波检查中的结果相关。进而，分布于梗塞部位和非梗塞部位的基因表达分析的结果是，在非梗塞部位，中和抗体给药组中内皮素-1(ET-1)，胶原I，III型，TGF-β的表达量，与对照抗体给药组相比显著减少，与Sham组基本相同，可以观察到改善效果(图9-1至图9-5)。
实施例5
[85]人骨膜素-1cDNA的全长克隆
以1μg人心脏来源的总RNA(Clontech公司制，CatalogNo.64100-1，Lot No.4120493)制备的cDNA作为模板，用全长克隆用引物有义链5’-AAGCTAGCCACCATGATTCCCTTTTTACCCAT-3’(序列号27)和反义链5’-AACTCCACAATTTCCCTCAT-3’(序列号28)，通过KOD plusDNA聚合酶(东洋纺社制)进行PCR，用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Clontech公司)克隆获得的PCR产物。
[86]制备相当于人骨膜素外显子-17的区域有义链5’-TAACCAAAGTTGTGGAACCAA-3’(序列号29)，和相当于外显子21的区域反义链5’-TGTGTCTCCCTGAAGCAGTC-3’(序列号30)，从该克隆组中选择使用这些引物检测出的克隆。然后，测定所选择的克隆的碱基序列，选择不发生剪切的克隆，完成人骨膜素-1cDNA的全长克隆，将获得的克隆命名为pCR4/人骨膜素-1。
实施例6
[87]体外翻译用人骨膜素-1表达载体的构建
用限制性酶PmeI和NotI消化实施例5中获得的质粒pCR4/人骨膜素-1，切出DNA片段人骨膜素-1，进行钝化处理。用酶消化预先插入CATCACCATCACCATCACTAA(6×His+终止密码子)(序列号31)的pTNT表达载体(Promega公司)的多克隆位点的MluI位后进行钝化处理，用连接试剂盒(宝酒造(株)社制)连接上述片段。
[88]然后，以His标记与骨架结合的目的制备合成连接子(有义链5’-CTAGAAGACGATTAAGGGAAGGTCGTTCTCAGCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC-3’)(序列号32)和反义链5’-GGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGCTGAGAACGACCTTCCCTTAATCGTCTT-3’(序列号33)，用连结试剂盒连接到用限制性酶Xba I和Sma I消化的载体片段上。确认连结部分的碱基序列，将获得的载体命名为pTNT/人骨膜素-1/His。
实施例7
[89]体外翻译合成蛋白质
将实施例6获得的表达载体提供给TNT SP6 Quick CoupledTranscription/Translation系统(Promega公司制)，进行体外的蛋白质合成。具体的是，对于2μg pTNT/人骨膜素-1/His表达载体，加入40ml SP6 Quick Master Mix，1μl的1mM蛋氨酸，用DEPC处理水使总量达到50μl，于30℃反应90分钟，之后直至纯化都在-80℃下保存。
实施例8
[90]人骨膜素蛋白质(PN-1)的纯化
用MagZ蛋白质纯化系统(Promega公司制)纯化实施例7获得的合成蛋白质。具体是，在实施例7获得的合成蛋白质中添加两倍量的MagZ结合/洗脱缓冲液，充分混合，将此试样添加到MagZ结合颗粒上。将其于4℃搅拌1小时后，除去上清，用MagZ结合/洗脱缓冲液清洗MagZ结合颗粒4次后，用MagZ洗脱缓冲液洗脱合成蛋白质，于-80℃一直保存直至使用。
实施例9
[91]针对人骨膜素的外显子-17肽的单克隆抗体的制备
(1)抗原的制备
通过Fmoc法化学合成了纯度在90％以上的在构成人骨膜素的外显子-17的氨基酸序列(序列号4)的N末端上添加了Cys残基的肽抗原肽：序列号25)10mg。使所述5mg肽与5mg作为载体蛋白质的KLH(CALBIOCHEM公司制)结合，获得抗原溶液。即，将KLH溶解于PBS(0.01M)调整到3.3mg/mL，滴下0.2524mg/mL的MBS溶液(GEHealthcare Science公司制)，于室温下搅拌60分钟使之反应。用二氯甲烷除去自由的MBS，获得了KLH-MB。将5mg该KLH-MB与5mg溶解于0.01M磷酸钠缓冲液(pH7.0)的抗原肽混合，于4℃搅拌12小时使之反应，获得抗原溶液。
(2)免疫
在3只六周大的BALB/c雄性小鼠的两足上皮下注射含有(1)获得的KLH结合抗原肽100μg的50μl抗原溶液和50μl FCA(弗氏完全佐剂)的混合乳浊液。然后以两周间隔在两足给药泳时调制的上述抗原溶液和FIA(弗氏不完全佐剂)的混合乳浊液。然后，通过颈椎脱臼使这些小鼠致死，无菌采集足部淋巴结。
在供给给RPMI培养基(KOHJINBIO株式会社制)的同时，破碎上述淋巴结，通过直径为约10μm的筛，获得了悬浮于RPMI培养基的状态的淋巴结细胞。将其以1000rpm离心分离10分钟，获得作为沉淀馏分的淋巴结细胞。在该沉淀馏分中，加入1ml在0.84％的氯化铵溶液中加入了20mM的HEPES缓冲液(pH7.4)的溶液使之溶血，除去红血球后，以1000rpm离心分离5分钟。用RPMI培养基清洗获得的沉淀馏分(细胞馏分)数次，用于细胞融合。
(3)骨髓瘤细胞的制备
用含有20％的胎儿牛血清(FCS)的RPMI培养基在10％CO2·37℃培养箱内培养具有8-氮鸟嘌呤抗性且免疫球蛋白非分泌型小鼠骨髓瘤细胞株P3X63Ag8U.1(P3U1株)，收集处于对数增殖期的细胞，以1000rpm离心分离5分钟，只获得作为沉淀馏分的细胞，使之悬浮于RPMI培养基中。
(4)细胞的融合
混合(2)获得的含有108-3×108个免疫化淋巴结细胞的RPMI细胞培养基和(3)获得的含有108个骨髓瘤细胞的RPMI培养基后，以1000rpm离心分离10分钟。轻轻地除去上清获得作为沉淀馏分的细胞，在其中加入1ml的25％(w/v)的聚乙二醇1500(PEG1500，Boehringer公司制)后，再慢慢加入RPMI培养基使总量达到10ml。在其中加入10ml含有20％FCS的RPMI培养基，少许静置后，以1000rpm离心分离5分钟，在获得的沉淀馏分(细胞馏分)中添加含有20％FCS的RPMI使细胞浓度调整到106个/ml，将此细胞悬浮液以200μl/孔分注于corning公司制的96孔培养板上。于5％CO2·37℃培养箱内培养24小时后，添加HAT溶液(Invitrogen公司制)后，再培养2周。
(5)用ELISA法筛选
进行培养上清与抗原肽反应的阳性孔的筛选。
[92]使用2mg(1)获得抗原肽上结合了作为载体蛋白的卵清蛋白(OVA)的结合物，作为测试用的抗原溶液。
[93]将96孔微量滴定板(Falcon353912)的各孔用1μg/ml上述结合物于4℃静置一夜进行包被。清洗该板后，在各孔滴下50μl的(4)的培养上清(含有单克隆抗体)，在37℃的培养箱内放置2小时后，用PBS(-)(磷酸缓冲液)清洗。在其中添加碱性磷酸酶结合绵羊抗小鼠IgG抗体(Zymed公司制)，在37℃的培养箱内放置1小时后，用PBS(-)清洗后，加入发色底物剂(ALP)使之发色20分钟，用读板仪(BIO-RAD，Model 680 MICRO读板仪)测定各孔的OD490nm的吸光度(抗体效价)，确认与抗原肽的反应性，测定培养上清与抗原肽反应的阳性孔。
(6)抗体产生细胞的筛选
从经(5)的ELISA法确认了与抗原肽的反应性的阳性孔内的细胞中，通过有限稀释法进行抗体产生细胞株的筛选。即，将阳性孔内的细胞接种于96孔培养板的各孔中，于5％CO2·37℃培养箱内培养2周。对于各孔的培养上清，与(5)的方法相同，用ELISA法确认与抗原肽的反应性，对于阳性孔，再通过有限稀释法进行筛选，获得了与抗原的反应性高且细胞菌落生长良好的30个细胞。将这些细胞转移到24孔培养板上，于5％CO2·37℃培养箱内培养2周。对于各孔的培养上清，与(5)的方法相同，用ELISA法确认与抗原肽的反应性(抗体效价)。OD490nm的吸光度变高的10个孔中的细胞，即10个杂交瘤细胞株被判断为作为抗体产生细胞有用，并选择了这些细胞。
[94]
杂交瘤细胞株
 
No. OD值
12345678910 0.410.370.680.240.330.320.330.320.120.3 
[95]这样获得的抗体产生细胞由于总是产生本发明抗体-抗人外显子-17单克隆抗体，因此培养该抗体产生细胞的培养液的上清液可以直接作为本发明的抗体溶液使用。并且，产生上述的抗人外显子-17单克隆抗体的抗体产生细胞株(杂交瘤)No.1(SBM337)以FERMBP-10718于平成18年11月1日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
(7)与人骨膜素蛋白质(PN-1)的结合性的确认
通过点印迹法确认了由10个(6)获得的抗体产生细胞产生的抗体和人骨膜素蛋白质(PN-1)的结合性。即，将平均5μl实施例8中合成的蛋白质(30μg/ml)点样到Hybond-ECL硝化纤维素膜上(GEHealthcare Science公司制)上，用TBS溶液(10mMTris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl)清洗1次。添加阻断缓冲液(ブロツクエ—ス，雪印乳业株式会社制)，于室温下振荡1小时。在膜上加入(6)获得的单克隆抗体(一次抗体)的1μg/ml浓度的溶液，振荡3小时后，进行4次用TBS溶液振荡清洗10分钟的步骤。在膜上加入HRP标识抗小鼠IgG抗体(Promega公司制)(二次抗体)的0.4mg/ml浓度溶液，于室温下振荡1小时后，进行4次用TBS溶液振荡清洗10分钟的步骤。加入检测用试剂(ECL plus western blotting检测系统，GEHealthcare Science公司制)使之反应1小时，通过化学发光法检测。其结果是，(6)中克隆的所有10个抗体产生细胞均与人骨膜素PN-1结合。
(8)单克隆抗体的大量制备和纯化
在BALB/c小鼠腹腔内给药0.5ml的二苯哌酮[2，6，10，14-四甲基十五烷(和光纯药制)]，饲养2-3周。首先，回收维持在对数增殖期的单克隆抗体产生杂交瘤No.1和No.3，在除去上清的沉淀馏分的细胞中添加不含FCS的RPMI培养基，制备细胞数为1×107个/ml的细胞液。将该细胞液注入于二苯哌酮前给药了的BALB/c小鼠的腹腔中，3周后用注射器从腹部回收从后顷漏出的腹水。用孔径为0.22μmφ滤膜过滤收集的腹水，用蛋白质G-琼脂糖柱(Millipore，11511324)，通过亲合层析过滤，按照常规方法纯化滤液，制备两种抗人外显子-17单克隆抗体。
实施例10
[96]抗人外显子-17单克隆抗体的人骨膜素外显子-17肽链中的识别位点分析
对于获得的两种单克隆抗体(No.1和No.3)进行人骨膜素外显子-17肽链中识别位点的分析(表位的鉴定)。即，在纤维素膜上，制成了，在由从人骨膜素外显子-17肽链(序列号4；1位的苏氨酸至27位的谷氨酸)的N末端起的第9位的苯丙氨酸，到从C末端起的第9位的异亮氨酸的共计45个氨基酸构成的氨基酸序列中，下述36种由10个氨基酸构成的肽的膜结合型肽阵列(SIGMA-ALDRICH JAPAN株式会社custom Spots service)。
[97]
1   FKEIPVTVYT
2   KEIPVTVYTT
3   EIPVTVYTTK
4   IPVTVYTTKI
5   PVTVYTTKII
6   VTVYTTKIIT
7   TVYTTKIITK
8   VYTTKIITKV
9   YTTKIITKVV
10  TTKIITKVVE
11  TKIITKVVEP
12  KIITKVVEPK
13  IITKVVEPKI
14  ITKVVEPKIK
15  TKVVEPKIKV
16  KVVEPKIKVI
17  VVEPKIKVIE
18  VEPKIKVIEG
19  EPKIKVIEGS
20  PKIKVIEGSL
21  KIKVIEGSLQ
22  IKVIEGSLQP
23  KVIEGSLQPI
24  VIEGSLQPII
25  IEGSLQPIIK
26  EGSLQPIIKT
27  GSLQPIIKTE
28  SLQPIIKTEG
29  LQPIIKTEGP
30  QPIIKTEGPT
31  PIIKTEGPTL
32  IIKTEGPTLT
33  IKTEGPTLTK
34  KTEGPTLTKV
35  TEGPTLTKVK
36  EGPTLTKVKI
[98]将该膜放置于少量的甲醇中5分钟后，用TBS溶液清洗3次。添加阻断缓冲液(核黄素，SPOT附带的)，室温下搅拌2小时。在膜上添加实施例9(8)中获得的单克隆抗体(一次抗体)的浓度为1μg/ml的溶液，振荡3小时后，用TBS溶液中进行3次10分钟的振荡清洗。在膜上添加HRP标识抗小鼠IgG抗体(Promega公司制)(二次抗体)的浓度为0.4μg/ml的溶液，温育2小时后，用TBS溶液中进行3次5分钟的振荡清洗。添加检测用试剂(SuperSignal West Pico，Pierce公司制)使之反应1分钟，通过化学发光法检测。其结果是，单克隆抗体No.1和No.3只与由氨基酸序列YTTKIITKVV(序列号26)构成的合成肽No.9，即人骨膜素外显子-17肽链的氨基酸序列(序列号4)中的末端起的-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸，人骨膜素PN-1的氨基酸序列(序列号2)中的N末端起的第669位的酪氨酸至第679位的缬氨酸的氨基酸序列构成的肽反应并结合。
实施例11
[99]抗大鼠外显子-17的多克隆抗体的人骨膜素外显子-17肽链中的识别位点分析
对于实施例1制备的多克隆抗体，与实施例10同样，进行人骨膜素外显子-17肽链中的识别位点分析(表位的鉴定)。其结果清楚了，与实施例10的单克隆抗体一样，该多克隆抗体只与合成肽No.9反应，与单克隆抗体特异性识别相同的部位。因此，提示即使以大鼠骨膜素外显子-17作为抗原制备多克隆抗体，以人骨膜素外显子-17作为抗原制备多克隆抗体也可以得到具有相同特异性的抗体。
实施例12
[100]与大鼠骨膜素(PN-1)的结合性的确认
通过点印迹法确认了所获得的2种单克隆抗体(No.1和No.3)与大鼠骨膜素蛋白质(PN-1)的结合性。即，将平均5μl制造例6中获得的纯化蛋白质(30μg/ml)点样到Hybond-ECL硝化纤维素膜上(GEHealthcare Science公司制)上，用TBS溶液(10mMTris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl)清洗1次。添加封闭缓冲液(Block Ace，雪印乳业株式会社制)，于室温下振荡1小时。在膜上加入单克隆抗体(一次抗体)的浓度为1μg/ml的溶液，振荡3小时后，用TBS溶液进行4次10分钟的振荡清洗。在膜上加入HRP标识抗小鼠IgG抗体(Promega公司制)(二次抗体)的0.4μg/ml浓度溶液，于室温下振荡1小时后，进行4次用TBS溶液振荡清洗10分钟的步骤。加入检测用试剂(ECL plus western blotting检测系统，GE Healthcare Science公司制)使之反应1小时，通过化学发光法检测。其结果确认了，获得的两种单克隆抗体均与大鼠骨膜素PN-1结合。
实施例13
[101]抗人外显子-17的单克隆抗体的表位分析
根据实施例10的结果，清楚了抗人外显子-17的单克隆抗体的表位部分识别人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端的苏氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(TTKIITKVV；序列号22)，而且在实施例12的结果中，还确认了抗人外显子-17的单克隆抗体也与大鼠骨膜素蛋白质(PN-1)结合。由此提示，抗人外显子-17单克隆抗体的表位部分识别人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端的苏氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(TTKIITKVV；序列号22)中在人与大鼠间氨基酸不同的部分，即人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)或大鼠人骨膜素外显子-17肽链(序列号3)的N末端的苏氨酸至第7位的赖氨酸的氨基酸序列的全部或其部分。因此，为了更详细地分析表位部分，用丙氨酸扫描(alanine scanning)的方法进行分析。
[102]以80％的纯度合成人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV；序列号26)中，一部分氨基酸被替换成丙氨酸的下述10种肽。
# 1 YTTKIITKVV
# 2 ATTKIITKAA
# 3 AATKIITKAA
# 4 AAAKIITKAA
# 5  AAAAIITKAA
# 6  AAAAAITKAA
# 7  ATTKIITAAA
# 8  ATTKIIAAAA
# 9  ATTKIAAAAA
# 10 ATTKAAAAAA
用50μl PBS(-)使1mg的合成肽溶解，将平均1.5μl点样到Hybond-ECL硝化纤维素膜上(GE Healthcare Science公司制)上，用TBS溶液清洗1次。添加阻断缓冲液(Block Ace，雪印乳业株式会社制)，于室温下振荡1小时。在膜上加入实施例9(8)获得的单克隆抗体(一次抗体)的1μg/ml浓度的溶液，振荡3小时后，用TBS溶液进行4次10分钟的振荡清洗。在膜上加入HRP标识抗小鼠IgG抗体(Promega公司制)(二次抗体)的0.4μg/ml浓度溶液，于室温下振荡1小时后，用TBS溶液进行4次10分钟的振荡清洗。加入检测用试剂(SuperSignal West Pico，Pierce公司制)使之反应1分钟，通过化学发光法检测。
[103]其结果是，该单克隆抗体与上述合成肽#7(人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV；序列号26)中，N末端的第1位至8-10位的氨基酸被替换成丙氨酸的肽)强烈反应，与#1(人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV；序列号26)构成的肽)和#2(人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV；序列号26)构成的肽中，N末端的第1位至9-10位的氨基酸被替换成丙氨酸的肽)弱反应，与#3(人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV；序列号26)构成的肽中，N末端的第1-2位至9-10位的氨基酸被替换成丙氨酸的肽)和#8(人骨膜素外显子-17肽链(序列号4)的N末端起的第-1位的酪氨酸至第9位的缬氨酸的氨基酸序列(YTTKIITKVV；序列号26)构成的肽中，N末端的第1位至7-10位的氨基酸被替换成丙氨酸的肽)反应更弱。
实施例14
[104]抗大鼠外显子-17多克隆抗体的人骨膜素外显子-17肽链中识别位点分析
对于实施例1制备的多克隆抗体，与实施例13同样，进行人骨膜素外显子-17肽链中的识别位点分析(表位的鉴定)。其结果清楚了，与实施例13的单克隆抗体一样，该多克隆抗体与合成肽No.#7强反应，和#1和#2弱反应，与#3和#8反应更弱，与单克隆抗体特异性识别相同的部位。因此，提示即使以大鼠骨膜素外显子-17作为抗原制备多克隆抗体，以人骨膜素外显子-17作为抗原制备多克隆抗体也可以得到具有相同特异性的抗体。
实施例15
体外对人骨膜素-1的抗细胞粘附活性的有无的研究
[105]与实施例2一样，将上述人心成纤维细胞(大日本制药社制，目录号CS-ABI-5118)以6.4×104个/100μl接种于96孔板上，培养一夜后，将培养液更换为添加了10μg/ml的环己酰亚胺(cycloheximide)的10％FBS添加CSC培养基(Cell SystemCorporation制)，于37℃培养1小时。然后，用预先加热到37℃的CSC培养基(无血清)清洗细胞2遍，将按照实施例制备的人骨膜素-1蛋白质添加到CSC培养基(无血清)中，使终浓度达到1μg/ml。使用具有细胞粘附促进作用的纤连蛋白作为阳性对照，使用不具有细胞粘附促进作用的BSA(牛血清白蛋白)作为阴性对照。于37℃培养3.5小时后的显微镜观察中，添加了人骨膜素蛋白质的组细胞完全剥离，用PBS(-)清洗2次后，用10％中性缓冲福尔马林液固定细胞30分钟。然后，用PBS(-)清洗3次后，用甲基紫染色30分钟。然后，用550nm的读板仪(BIO-RAD，Model 680 MICRO读板仪)测定细胞的染色度(图10)。其结果是，作为对照的纤连蛋白和BSA给药组和无添加组中没有发现抗细胞粘附作用，而添加人PN-1蛋白质的组中发现了细胞的剥离，由此清楚了PN-1具有抗细胞粘附作用。
实施例16
[106]体外研究抗人外显子-17单克隆抗体的中和活性
与实施例3一样，将上述人心成纤维细胞以6.4×104个/100μl接种于96孔板上，培养一夜后，将培养液更换为添加了10μg/ml的环己酰亚胺(cycloheximide)的10％FBS添加CSC培养基，于37℃培养1小时。然后，用预先加热到37℃的CSC培养基(无血清)清洗细胞2遍，将终浓度为1μg/ml的人骨膜素-1蛋白质和抗人外显子-17肽单克隆抗体(No.1和No.3)添加到CSC培养基(无血清)中，使终浓度达到20μg/ml。只使用人骨膜素-1蛋白质作为阳性对照，使用BSA作为阴性对照。于37℃培养3.5小时后，在显微镜观察中，只添加了人骨膜素蛋白质的组，细胞几乎完全剥离，用PBS(-)清洗2次后，用10％中性缓冲福尔马林液固定细胞30分钟。然后，用PBS(-)清洗3次后，用甲基紫染色30分钟。然后。用550nm的读板仪(BIO-RAD，Model 680MICRO读板仪)测定细胞的染色度(图11)。其结果是，判明了抗人外显子-17单克隆抗体是具有抑制人骨膜素-1蛋白质的抗细胞细胞粘附作用，即即中和人骨膜素-1蛋白质的抗细胞粘附作用的活性的抗体。
而且，如上所述，通过针对人骨膜素-1蛋白质的外显子-17且特异性识别外显子-17的N末端第1位-第6位的氨基酸序列或其部分的抗体，人骨膜素-1蛋白质的抗细胞粘附作用受到抑制，提示外显子-17，至少由外显子-17的N末端第1位-第6位的氨基酸序列或其部分构成的肽部分或其一部分构成与人骨膜素-1蛋白质的抗细胞粘附作用相关的区域。
实施例17
[107]使用急性心肌梗塞模型大鼠的抗人外显子-17单克隆抗体的效果
与实施例4相同，用体重为250-300g的雄性Lewis大鼠，在腹腔给药戊巴比妥麻醉剂(0.1mg/100g)充分麻醉后，固定在大鼠用手术台上。经口插入气管，连接到大鼠用呼吸器上(一次换气量3ml，80次/分)，从左胸骨第3肋间横切开皮肤，再横切开位于其下的大胸肌，此外再用大鼠用开胸器扩张肋间，露出心脏。
[108]然后，用直径为5mm的曲针用1.0丝绑住位于左心房下方附近的左冠动脉。此时左冠动脉的环流区域-前壁和侧壁由红色变为白色，冠脉血流量被充分阻断，目视确认相同部位的壁运动消失(在Shamop操作组中，在冠动脉中通入针后，不用丝绑住而拔出针)，用3.0丝绑住第3肋骨和第4肋骨，并固定(此时，排出使肺扩张的肺的外部的空气，使得肺容易扩张后再绑)。然后，用3.0丝缝合相同的皮肤切开部位，片刻后开始观察，确认意识恢复，逐渐自己发出呼吸后，拔管。
[109]按照以上步骤，依次制备急性心肌梗塞模型。
[110]次日，用异氟烷经鼻麻醉后，进行经皮的心脏超声波检查，除去梗塞大小不到左心室全周的20％的小梗塞模型。其它的梗塞模型按照心脏功能的损伤的顺序排列，按顺序分为分组为抗人外显子-17单克隆抗体(No.3)给药组和对照抗体(家兔IgG)给药组，从尾静脉给药各200μg。
[111]在模型制作的次日给药抗体，再在初次给药的每六天给各组给药4次。
[112]另一方面，在直至4周后，每一周用心脏超声波检查经胸壁评价心脏。模型制作4周后的心脏超音波检查的结果是，在给药抗人外显子-17单克隆抗体的组中，与给药兔IgG的对照组相比，心脏的前壁厚和后壁厚的变薄明显受到抑制，扩张末期心脏内径和收缩末期心脏内径的扩大受到抑制，并且心脏的收缩机能的指标-FS值或EF值上升。总之，清楚了心脏扩大受到抑制，心脏机能得以改善(图12-1至图12-3)。
而且，如上所述，在急性心肌梗塞模型大鼠中，通过针对人骨膜素-1蛋白质外显子-17，且具有至少含有外显子-17的N末端第1-6位的氨基酸序列或其部分而构成的表位的抗体，显示出心脏扩大的抑制和心脏功能的改善效果，由此提示人骨膜素-1蛋白质外显子-17，尤其是至少含有外显子-17的N末端第1-6位的氨基酸序列构成的肽部分或其部分的区域是与心肌梗塞后的心脏扩张和心脏功能的恶化相关的区域。
工业上利用的可能性
通过使用针对具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗体，抑制在心脏衰竭等疾病中表达增大的具有抗细胞粘附活性的骨膜素的作用，进行病状的恶化的抑制和组织功能的改善，可以进行与骨膜素的疾病的预防和治疗。而且，通过测定患者试样中的该骨膜素量，可以了解疾病的有无以及病状的进行程度。
序列表
<110>Asubio Pharma.Co.，Ltd.
<120>抗骨膜素的抗体和含有该抗体的用于预防或治疗骨膜素相关疾病的药物组合物
<130>D-11-35
<160>34
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>838
<212>PRT
<213>大鼠(Rattus sp.)
<400>1
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<210>2
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<400>2
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<212>PRT
<213>大鼠
<400>3
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<213>智人
<400>4
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<213>大鼠
<400>5
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<212>DNA
<213>大鼠
<400>6
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<213>大鼠
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<210>8
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<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>8
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<212>DNA
<213>小家鼠
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<213>小家鼠
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<212>DNA
<213>小家鼠
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<213>智人
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<212>PRT
<213>智人
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<213>智人
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<220>
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<211>32
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<212>PRT
<213>小家鼠
<400>21
Figure A200680053363Q00952
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<213>智人
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<213>大鼠
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Figure A200680053363Q00954
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<213>小家鼠
<400>24
Figure A200680053363Q00961
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<212>PRT
<213>智人
<400>25
Figure A200680053363Q00962
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>26
Figure A200680053363Q00963
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Figure A200680053363Q00972
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<211>21
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<220>
<223>引物号：9
<400>29
Figure A200680053363Q00973
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<211>20
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<213>人工序列
<220>
<223>引物号：10
<400>30
Figure A200680053363Q00974
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<211>21
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<213>人工序列
<220>
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Figure A200680053363Q00981
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<213>人工序列
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Figure A200680053363Q00982
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<213>人工序列
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Figure A200680053363Q00983
<210>34
<211>6
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Figure A200680053363Q00984

Claims (34)

1、针对具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗体。
2、针对具有序列号1或序列号2所示的氨基酸序列的骨膜素的抗体。
3、针对具有序列号3或序列号4所示的氨基酸序列的骨膜素的抗体。
4、针对具有序列号34所示的氨基酸序列的骨膜素的抗体。
5、针对与具有抗细胞粘附活性的骨膜素的抗细胞粘附活性相关区域的抗体。
6、针对具有序列号3或序列号4所示的氨基酸序列或其部分构成的肽的抗体。
7、针对具有序列号34所示的氨基酸序列或其部分的氨基酸序列的肽的抗体。
8、权利要求1-7任一项中记载的抗体，所述抗体是特异性识别序列号3或4所示的氨基酸序列或其部分的部位的抗体。
9、权利要求1-7任一项中记载的抗体，所述抗体是特异性识别序列号34所示的氨基酸序列或其部分的肽的抗体。
10、与序列号26所示的氨基酸序列构成的肽结合的抗体。
11、权利要求1-10任一项中记载的抗体，所述抗体是具有中和抗细胞粘附活性能力的抗体。
12、权利要求1-11任一项中记载的抗体，所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
13、权利要求12记载的抗体，所述抗体是单克隆抗体。
14、由杂交瘤细胞株FERM BP-10718产生的抗体。
15、权利要求13中记载的单克隆抗体的部分片段构成的抗体片段。
16、结合了权利要求1-14任一项中记载的抗体或权利要求15中记载的抗体片段与蛋白质或低分子的药剂的抗体的衍生物。
17、产生权利要求1-14任一项中记载的抗体的杂交瘤。
18、权利要求17中记载的杂交瘤，其是杂交瘤细胞株FERMBP-10718。
19、DNA，其编码权利要求1-14任一项中记载的抗体、权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的与蛋白质结合的抗体或抗体片段的衍生物。
20、含有权利要求19中记载的DNA的重组载体。
21、通过在宿主细胞中导入权利要求20中记载的重组载体而获得的转化体。
22、抗体，抗体片段，或蛋白质与抗体或抗体片段结合的衍生物的制备方法，其特征在于培养权利要求21中记载的转化体，使权利要求1-14任一项中记载的抗体，权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的抗体或抗体片段结合的衍生物在培养物中生成，从该培养物中收集该抗体，该抗体片段，或蛋白质与抗体或抗体片段结合的衍生物。
23、含有权利要求1-14任一项中记载的抗体，权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的衍生物的药物组合物。
24、用于预防或治疗与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的药物组合物，其含有权利要求1-14任一项中记载的抗体，权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的衍生物。
25、权利要求24中记载的药物组合物，前述疾病是心脏衰竭，心肌梗塞，心脏扩张，心脏肥大，心纤维化，心肌病，心肌炎，瓣膜症，癌症，动脉瘤，动脉硬化，中枢神经变性疾病，肾脏病，关节风湿病，骨质疏松症，肺气肿，肺高血压症，慢性闭塞性肺疾病(COPD)，肾炎，胰腺炎，肝炎，肝纤维症或肺纤维症。
26、与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的预防或治疗方法，其由对患者施以权利要求23的药物组合物构成。
27、权利要求26中记载的预防或治疗方法，前述疾病是心脏衰竭，心肌梗塞，心脏扩张，心脏肥大，心纤维化，心肌病，心肌炎，瓣膜症，癌症，动脉瘤，动脉硬化，中枢神经变性疾病，肾脏病，关节风湿病，骨质疏松症，肺气肿，肺高血压症，慢性闭塞性肺疾病(COPD)，肾炎，胰腺炎，肝炎，肝纤维症或肺纤维症。
28、与具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关的疾病的诊断方法，其使用权利要求1-14任一项中记载的抗体，权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的衍生物。
29、权利要求28中记载的诊断方法，前述抗体是标记的抗体。
30、权利要求28或29中记载的诊断方法，前述疾病是心脏衰竭，心肌梗塞，心脏扩张，心脏肥大，心纤维化，心肌病，心肌炎，瓣膜症，癌症，动脉瘤，动脉硬化，中枢神经变性疾病，肾脏病，关节风湿病，骨质疏松症，肺气肿，肺高血压症，慢性闭塞性肺疾病(COPD)，肾炎，胰腺炎，肝炎，肝纤维症或肺纤维症。
31、标记的权利要求1-14任一项中记载的抗体，权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的衍生物。
32、定量试样中的具有抗细胞粘附活性的骨膜素的方法，其使用权利要求1-14任一项中记载的抗体，权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的衍生物。
33、检测试样中的具有抗细胞粘附活性的骨膜素的方法，其使用权利要求1-14任一项中记载的抗体，权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的衍生物。
34、具有抗细胞粘附活性的骨膜素相关疾病的诊断剂，其使用权利要求1-14任一项中记载的抗体，权利要求15中记载的抗体片段或权利要求16中记载的衍生物。
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