CN114364400A

CN114364400A - 使用pd-1轴抑制剂及抗骨膜蛋白抗体治疗癌症的方法

Info

Publication number: CN114364400A
Application number: CN202080063265.XA
Authority: CN
Inventors: A·杰塔; J·弗朗森; A·R·麦格雷; J·休尔姆
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2022-04-15
Also published as: TW202124432A; MX2022003001A; KR20220062056A; EP4028056A1; EP4028056A4; AU2020345655A1; WO2021046634A8; CA3148291A1; JP2022547550A; BR112022001985A2; US20230030597A1; WO2021046634A1

Abstract

本发明提供治疗癌症的方法，其包含向个体施用(a)PD‑1轴抑制剂；及(b)骨膜蛋白抑制剂。

Description

使用PD-1轴抑制剂及抗骨膜蛋白抗体治疗癌症的方法

序列表

本申请案含有序列表，该序列表已以ASCII格式以电子方式提交且其全文以引用的方式并入本文中。该ASCII复本于2020年8月11日创建，命名为01-3435-WO-1_SL.txt且大小为19,155个字节。

背景技术

骨膜蛋白是被假定为调节多种生理过程(包括上皮-间质转化、细胞-基质相互作用及发炎)的基质细胞蛋白质。已显示其表达在包括癌症及纤维化在内的若干病变中失调，其中骨膜蛋白的过度表达与负面结果相关。除通过结合至其他基质细胞蛋白质(诸如纤维结合蛋白及胶原蛋白)来调节细胞外重塑之外，已显示骨膜蛋白介导的整合素信号传导对于癌细胞迁移及在致瘤环境中募集免疫细胞两者均为至关重要的。

发明内容

本文描述用于治疗癌症的PD-1轴抑制剂及骨膜蛋白抑制剂的方法、用途及组合。本文所描述的方法降低肿瘤的胶原蛋白含量，减少抑制性骨髓细胞群(诸如粒细胞及肿瘤相关巨噬细胞)的浸润，同时增加巨噬细胞极化成M1表型，且提高肿瘤浸润性T细胞的抗肿瘤特性。

在一个方面中，本文描述一种治疗罹患癌症的个体的方法，该方法包含向该个体施用(a)PD-1轴抑制剂；及(b)骨膜蛋白抑制剂。在某些实施方案中，骨膜蛋白抑制剂包含结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，骨膜蛋白抑制剂包含结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段，其中结合其骨膜蛋白的抗体或抗原结合片段包含：(a)包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1)；(b)包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中的任一者中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2)；(c)包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中的任一者中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3)；(d)包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1)；(e)包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2)氨基；及(f)包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3)。在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段是嵌合的或人源化的。在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段为IgG抗体。在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段为Fab、F(ab)₂、单域抗体或单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链及免疫球蛋白轻链：(a)其中免疫球蛋白重链包含与SEQ IDNO:13中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列；及(b)其中该免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的天冬酰胺编号55为天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸，且其中SEQ ID NO:13的甲硫氨酸编号100为甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在某些实施方案中，在用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞细胞进行的细胞黏附分析中，结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段的IC50小于约50纳摩尔浓度。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂为PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂，为结合至PD-1的抗体或其片段。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂为结合至PD-1的抗体或其片段。

PD-1路径抑制剂在本发明的含义及其所有实施方案中为抑制PD-1与其受体相互作用的化合物。PD-1路径抑制剂能够削弱PD-1路径信号传导，优选由PD-1受体介导的信号传导。PD-1抑制剂可以是针对能够拮抗PD-1路径信号传导的PD-1路径的任何成员的任何抑制剂。抑制剂可以是靶向PD-1路径的任何成员的拮抗性抗体，优选针对PD-1受体、PD-L1或PD-L2。另外，PD-1路径抑制剂可以是PD-1受体的片段或阻断PD1配体的活性的PD-1受体。

PD-1拮抗剂在本领域中是熟知的，例如由Li等人,Int.J.Mol.Sci.2016,17,1151(以引用的方式并入本文中)所综述。根据本发明，可使用任何PD-1拮抗剂(尤其抗体)(诸如Li等人所公开的那些抗体)以及本文下文所公开的其他抗体。优选地，本发明的PD-1拮抗剂及其所有实施方案选自由以下抗体组成的群：派姆单抗(pembrolizumab)(抗PD-1抗体)；纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1抗体)；皮立珠单抗(pidilizumab)(抗PD-1抗体)；替雷利珠单抗(tislelizumab)(抗PD-1)；斯巴达珠单抗(spartalizumab)(PDR-001)(抗PD-1抗体)；优选埃本利单抗(ezabenlimab)(抗PD-1抗体)。

在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂为特异性结合PDL-1或PDL-2的抗体。在某些非限制性实施方案中，特异性结合PDL-1或PDL-2的抗体包含德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、BMS-936559(MDX-1105)、特瑞普利单抗(toripalimab)(JS001-PD-1)、西米普利单抗(cemiplimab)(REGN2810)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)(SHR-1210)、多塔利单抗(dostarlimab)(TSR-042)、西利单抗(cetrelimab)(JNJ-63723283)或FAZ053或其PDL-1或PDL-2结合片段。在某些实施方案中，PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂包含结合PD-1、PDL-1或PDL-2的Fc融合蛋白质。在某些实施方案中，Fc融合蛋白质包含AMP-224或其PD-1结合片段。在某些实施方案中，PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂包含PD-1、PDL-1或PDL-2的小分子抑制剂。在某些实施方案中，经由PD-1、PDL-1或PDL-2进行的信号传导的小分子抑制剂包含以下中的一或多者：N-{2-[({2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]吡啶-3-基}甲基)氨基]乙基}乙酰胺(BMS 202)；(2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)-5-甲基苯甲基)-D-丝氨酸盐酸盐；(2R,4R)-1-(5-氯-2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)苯甲基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基吲哚；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基-1h-吲哚；L-α-谷氨酰胺、N2,N6-双(L-丝氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-苏氨酰基-L-丝氨酰基-L-α-谷氨酰基-L-丝氨酰基-L-苯丙氨酰基)-L-赖氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-精氨酰基-L-缬氨酰基-L-苏氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-亮氨酰基-L-丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-异亮氨酰基-L-赖氨酰基；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶甲酸；甘氨酰胺，N-(2-巯基乙酰基)-L-苯丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-脯氨酰基-L-组氨酰基-L-亮氨酰基-N-甲基甘氨酰基-L-色氨酰基-L-丝氨酰基-L-色氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-L-精氨酰基-L-半胱氨酰基-，环(1→14)-硫醚；或其衍生物或类似物。

在某些实施方案中，在用呈单一疗法形式的检查点抑制剂治疗之后，个体已罹患进行性疾病。在某些实施方案中，检查点抑制剂包含PD-1进入抑制剂。在某些实施方案中，分开施用PD-1轴抑制剂及骨膜蛋白抑制剂。在某些实施方案中，在同一天施用PD-1轴抑制剂及骨膜蛋白抑制剂。在某些实施方案中，不在同一天施用PD-1轴抑制剂及骨膜蛋白抑制剂。在某些实施方案中，癌症包含神经胶母细胞瘤、胰脏癌、乳癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、子宫颈癌、前列腺癌或肺癌。

在另一方面中，本文描述结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段，其用于亦用PD-1轴抑制剂进行治疗的患者中。在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1)；(b)包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中的任一者中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2)；(c)包含SEQID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中的任一者中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3)；(d)包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1)；(e)包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2)氨基；及(f)包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3)。

在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段是嵌合的或人源化的。在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段为IgG抗体。在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段为Fab、F(ab)₂、单域抗体或单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链及免疫球蛋白轻链：(a)其中该免疫球蛋白重链包含与13中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列；及(b)其中该免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的天冬酰胺编号55为天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸，且其中SEQ ID NO:13的甲硫氨酸编号100为甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在某些实施方案中，在用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞细胞进行的细胞黏附分析中，结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段的IC50小于约50纳摩尔浓度。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂为PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂，为结合至PD-1的抗体或其片段。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂为结合至PD-1的抗体或其片段。在某些实施方案中，该结合至PD-1的抗体或其片段包含派姆单抗、纳武单抗、AMP-514、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗，优选埃本利单抗或其PD-1结合片段。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂为特异性结合PDL-1或PDL-2的抗体。在某些实施方案中，特异性结合PDL-1或PDL-2的抗体包含德瓦鲁单抗(MEDI4736)、阿特珠单抗(MPDL3280A)、阿维鲁单抗(MSB0010718C)、BMS-936559(MDX-1105)、AMP-224、MEDI0680(AMP-514)、西米普利单抗(REGN2810)、特瑞普利单抗(JS001-PD-1)、卡瑞利珠单抗(SHR-1210)、多塔利单抗(TSR-042)、西利单抗(JNJ-63723283)或FAZ053或其PDL-1或PDL-2结合片段。在某些实施方案中，PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂包含结合PD-1、PDL-1或PDL-2的Fc融合蛋白质。在某些实施方案中，Fc融合蛋白质包含AMP-224或其PD-1结合片段。在某些实施方案中，PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂包含PD-1、PDL-1或PDL-2的小分子抑制剂。在某些实施方案中，经由PD-1、PDL-1或PDL-2进行的信号传导的小分子抑制剂包含以下中的一或多者：N-{2-[({2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]吡啶-3-基}甲基)氨基]乙基}乙酰胺(BMS 202)；(2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)-5-甲基苯甲基)-D-丝氨酸盐酸盐；(2R,4R)-1-(5-氯-2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)苯甲基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基吲哚；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基-1h-吲哚；L-α-谷氨酰胺、N2,N6-双(L-丝氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-苏氨酰基-L-丝氨酰基-L-α-谷氨酰基-L-丝氨酰基-L-苯丙氨酰基)-L-赖氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-精氨酰基-L-缬氨酰基-L-苏氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-亮氨酰基-L-丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-异亮氨酰基-L-赖氨酰基；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶甲酸；甘氨酰胺，N-(2-巯基乙酰基)-L-苯丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-脯氨酰基-L-组氨酰基-L-亮氨酰基-N-甲基甘氨酰基-L-色氨酰基-L-丝氨酰基-L-色氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-L-精氨酰基-L-半胱氨酰基-，环(1→14)-硫醚；或其衍生物或类似物。在某些实施方案中，个体罹患癌症。在某些实施方案中，癌症包含神经胶母细胞瘤、胰脏癌、乳癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、子宫颈癌、前列腺癌或肺癌。

附图说明

本文所描述的新颖特征将在随附权利要求书中细致阐述。将参考阐述利用本文所述特征的原理的说明性实施方案及附图的以下详细描述来获得对本文所述的特征及特征优势的更好理解，在所述附图中：

图1说明通过在500nM的单一浓度下所测试的78序列特有IgG来抑制骨膜蛋白介导的细胞附着。

图2说明在用NB0828或媒剂对照处理之后小鼠MB49膀胱癌模型中的肿瘤生长。

图3说明NB0828处理对瘤内骨髓细胞的积聚的影响。用如图2中所描述的NB0828或媒剂处理携带MB49肿瘤的小鼠。数据呈现为总CD45+免疫浸润细胞的百分比。

图4说明在用NB0828处理之后的总肿瘤胶原蛋白含量的变化。如图2中所描述处理携带MB49肿瘤的小鼠且如方法中所描述评定端点MB49肿瘤的总肿瘤胶原蛋白含量。

图5说明在用NB0828或媒剂对照处理后小鼠CT26结肠癌模型中的肿瘤生长。

图6说明在经NB0828处理的携带CT26肿瘤的小鼠中，粒细胞/肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的瘤内积聚减少且巨噬细胞向M1表型偏移。

图7说明在经NB0828处理的携带CT26肿瘤的小鼠中，CD8+及CD4+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的积聚增加且CD8+TIL功能增强。

图8说明在用NB0828或媒剂对照处理后小鼠MC38结肠癌模型中的肿瘤生长。

图9A至图9D说明在MC38结肠癌模型中，NB0828降低肿瘤相关巨噬细胞(9A)的总量，同时增加促发炎I型巨噬细胞(9B)及CD8+T细胞(9C)，且肿瘤功效取决于C8+T细胞(9D)。

图10A至图10C说明在关于肿瘤尺寸(10A)及存活率(10B)两者的控制方面，与单独使用PD-1相比，PD-1与NB0828的组合改良MC38结肠癌模型中的反应；在第一次攻击下存活下来的动物均免于再次攻击(10C)。

图11说明NB0828克服所建立的MC38肿瘤中对抗PD-1的抗性。

图12A至图12D说明在抗PD-1肿瘤中，NB0828增加CD8+TIL的出现(12A)且改良其功能(12B)，同时降低总TAM(12C)且促进免疫刺激M1TAM的积聚(12D)。

实施方式

在以下描述中，阐述某些特定细节以便彻底理解各种实施方案。然而，本领域技术人员应理解，所提供的实施方案亦可在无这些细节的情况下实施。除非上下文另外要求，否则在通篇说明书及随后权利要求书中，词语“包含(comprise)”及其变化形式(诸如“包含(comprises/comprising)”)应视为开放的、包括性的含义，亦即“包括但不限于”。除非上下文另外明确指示，否则如本说明书及随附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”及“该(the)”包括复数个指示物。亦应注意，除非上下文明确规定，否则术语“或”一般以其包括“和/或”的含义而采用。另外，本文中所提供的标题仅是为方便起见，而不解释所主张的实施方案的范畴或含义。

如本文所用，术语“约”是指接近所述量10％或更小的量。

如本文所使用，术语“个体(individual)”、“患者”或“个体(subject)”是指诊断患有、疑似罹患或出现患有至少一种所描述的组合物及方法适用于治疗的疾病的风险的个体。在某些实施方案中，个体为哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物为小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、马、乳牛、绵羊、猪、山羊、骆马、羊驼或牦牛。在某些实施方案中，个体为人类。

如本文所使用，术语“组合”或“组合治疗”可指同时施用欲组合的物品或依序施用欲组合的物品。如本文所描述，当组合是指依序施用物品时，所述物品可以任何时间次序施用。可根据使生物可用性达至最大、降低副作用、使治疗潜力达至最大或其任何组合的时程不在同一天或在同一天分开施用各物品。

术语“癌症”及“肿瘤”涉及以细胞生长失调为特征的哺乳动物中的生理病况。癌症为一群细胞呈现不受控生长或非所需生长之一类疾病。癌细胞亦可能扩散至其他部位，其可导致形成癌转移。癌细胞可例如经由淋巴或血液在体内扩散。不受控生长、入侵及癌转移形成亦称为癌症的恶性特性。这些恶性特性将癌症与良性肿瘤相区别，良性肿瘤通常不会入侵或转移。

如本文所用，术语“有效量”是指在向哺乳动物施用时引起生物效应的治疗的量。生物效应包括但不限于以下：抑制或阻断受体-配体相互作用、降低目标的酶促活性、减少肿瘤生长、减少肿瘤转移、增加CD8+T细胞向肿瘤部位的浸润、减少肿瘤部位中的总巨噬细胞、增加M1巨噬细胞的浸润、提高M1/M2比率或延长携带肿瘤的动物的存活期。“治疗量”为经计算以发挥疗效的药物的浓度。治疗量涵盖能够诱导个体群体中的治疗反应的剂量范围。哺乳动物可以是人类个体。人类个体可罹患或疑似罹患肿瘤。

所提供的抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体及多反应性抗体)及抗体片段。抗体包括抗体-缀合物及包含抗体的分子(诸如嵌合分子)。因此，抗体包括但不限于以下：全长及天然抗体以及其保留有结合特异性的片段及部分，诸如包括具有任何数目的免疫球蛋白类别和/或同型的那些者(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE及IgM)的其任何特异性结合部分；及其生物学相关(抗原结合)片段或特异性结合部分，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fv及scFv(单链或相关实体)。单克隆抗体一般为实质上均质抗体的组合物内的一种抗体；因此，除可少量存在的可能天然存在的突变以外，单克隆抗体组合物内所包含的任何单独抗体是相同的。多克隆抗体是包括通常针对两个或更多个不同决定子(抗原决定基)的不同序列的不同抗体的制剂。单克隆抗体可包含人类IgG1恒定区。单克隆抗体可包含人类IgG4恒定区。

本文中的术语“抗体”以最广义形式使用且包括多克隆及单克隆抗体，其包括完整抗体及其功能性(抗原结合)抗体片段；包括抗原结合片段(Fab)片段、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段；包括单链可变片段(sFv或scFv)及单域抗体(例如sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖免疫球蛋白的经基因工程改造和/或以其他方式修饰的形式，诸如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人类抗体、人源化抗体，及异结合抗体、多特异性(例如双特异性)抗体、双功能抗体、三功能抗体及四功能抗体、串联二scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。该术语亦涵盖完整或全长抗体，包括任何种类或子类的抗体，包括IgG及其子类、IgM、IgE、IgA及IgD。抗体可包含人类IgG1恒定区。抗体可包含人类IgG4恒定区。

与“高变区”或“HVR”同义的术语“互补决定区”及“CDR”在本领域中已知是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。一般而言，各重链可变区中存在三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)且各轻链可变区中存在三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“构架区”及“FR”在本领域中已知是指重链及轻链的可变区的非CDR部分。一般而言，各全长重链可变区中存在四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4)，且各全长轻链可变区中存在四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4)。所给定CDR或FR的确切氨基酸序列边界可容易使用多种熟知方案中的任一者判定，包括以下文献中所述的方案：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案),Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysisand binding site topography”,J.Mol.Biol.262,732-745.(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains”,Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A及Plückthun A,“Yet another numberingscheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysistool”,J Mol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70,(“Aho”编号方案)；及Whitelegg NR及Rees AR,“WAM:an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB”,Protein Eng.2000年12月；13(12):819-24(“AbM”编号方案)。

给定CDR或FR的边界可根据用于鉴别的方案而变化。举例而言，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat与Chothia方案两者的编号均基于最常见的抗体区序列长度，其中在一些抗体中出现由插入字母(例如“30a”)表示的插入及缺失。两种方案使得某些插入及缺失(“插入缺失(indel)”)位于不同位置，产生不同编号。Contact方案是基于复杂晶体结构的分析且在多个方面与Chothia编号方案相似。

术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的域。天然抗体的重链及轻链的可变域(分别为V_H及V_L)通常具有类似结构，其中各域包含四个保守性构架区(FR)及三个CDR(参见例如Kindt等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman公司,第91页(2007))。单个V_H或V_L域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的V_H或V_L域分别筛选互补V_L或V_H域的库而分离(参见例如Portolano等人,J.Immunol.,150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature,352:624-628(1991))。

抗体片段是所提供的抗体之一。“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的实例包括(但不限于)Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂；双功能抗体；线抗体；单链抗体分子(例如scFv或sFv)；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体为包含重链可变区和/或轻链可变区的单链抗体片段，诸如scFv。

抗体片段可通过各种技术制得，包括但不限于完整抗体的蛋白分解消化，及由重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体为重组产生的片段，诸如包含并非天然存在的排列的片段，诸如具有由合成连接符(例如多肽连接符)接合的两个或更多个抗体区域或链的那些片段，和/或并非由天然存在的完整抗体的酶分解产生的那些片段。在一些方面中，抗体片段为scFv。

“人源化”抗体是一种全部或实质上全部CDR氨基酸残基均来源于非人类CDR且全部或实质上全部FR氨基酸残基均来源于人类FR的抗体。人源化抗体任选可包括来源于人类抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人类抗体的“人源化形式”是指已经历人源化(通常用以降低对人类的免疫原性)，同时保持亲本非人类抗体的特异性及亲和力的非人类抗体变异体。在一些实施方案中，人源化抗体中之一些FR残基经来自非人类抗体(例如，衍生该CDR残基的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或改良抗体特异性或亲和力。

人类抗体是所提供的抗体之一。“人类抗体”是具有与人类或人类细胞或非人类源所产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体，该非人类源利用人类抗体组库或其他人类抗体编码序列(包括人类抗体库)。该术语不包括包含非人类抗原结合区的非人类抗体的人源化形式，诸如那些其中全部或实质上全部CDR为非人类CDR者。

人类抗体可通过将免疫原施用至已经过改造以响应抗原攻击产生完整人类抗体或具有人类可变区的完整抗体的转殖基因动物来制备。此类动物通常含有人类免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置换内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合至动物染色体中。在此类转殖基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。人类抗体亦可来源于人类抗体库，包括噬菌体呈现库及无细胞库，其含有来源于人类组库的抗体编码序列。

术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，且不限于最小长度。多肽(包括所提供的抗体及抗体链及其他肽，例如连接符及结合肽)可包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。术语亦包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化及类似修饰。在一些方面中，多肽可含有相对于原生或天然序列进行的修饰，只要蛋白质维持所需活性。这些修饰可以是有意的，如经由定点突变诱发进行；或可以是偶然的，诸如经由产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增所引起的错误引起。

相对于参考多肽序列的序列一致性百分比(％)为在比对序列且引入空位(若需要)以达成最大序列一致性百分比之后，与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的候选序列中的氨基酸残基的百分比，且不将任何保守性取代视为序列一致性的部分。出于判定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以各种已知方式达成；例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。用于比对序列的适当参数能够进行测定，包括为在经比较序列的全长上达成最大比对所需的算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列一致性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech公司撰写，且源程序代码已与用户文件一起提交给美国知识产权局(U.S.Copyright Office),Washington D.C.,20559，其在此注册在美国版权注册第TXU510087号下。ALIGN-2程序可公开购自加利福尼亚州南旧金山的Genentech公司或可由源程序代码编译。ALIGN-2程序经编写可用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且无变化。

在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(或者，其可表述为与给定氨基酸序列B具有或包含一定氨基酸序列一致性％的给定氨基酸序列A)如下计算：100×分数X/Y，其中X是由序列比对程序ALIGN-2在A和B的程序比对中以相同匹配数进行评分的氨基酸残基数，且其中Y为B中氨基酸残基的总数。应了解，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的氨基酸序列一致性％与B相对于A的氨基酸序列一致性％不相等。除非另外特定陈述，否则本文所用的所有氨基酸序列一致性％值是如刚刚前一段落中所描述使用ALIGN-2计算机程序获得。

在一些实施方案中，涵盖本文所提供的抗体的氨基酸序列变异体。变异体通常不同于本文特定公开的多肽，其不同之处可在于一或多个取代、删除、添加和/或插入。此类变异体可天然存在或可以合成方式产生，例如通过修饰本发明的以上多肽序列中的一或多者且评估如本文所述的多肽的一或多个生物活性，和/或使用多种已知技术中的任一者。举例而言，可能需要改良抗体的抗体氨基酸序列变异体的结合亲和力和/或其他生物特性，其可通过将适当修饰引入编码该抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备抗体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构建物，只要最终构建物具有所需特征(例如抗原结合)即可。

在一些实施方案中，提供具有一或多个氨基酸取代的抗体变异体。所关注的取代型突变诱发位点包括CDR及FR。氨基酸取代可引入相关抗体中且针对所需活性筛选产物，例如保留/提高的抗原结合、降低的免疫原性或改良ADCC或CDC的产物。

在一些具体例中，取代、插入或缺失可发生在一或多个CDR内，其中取代、插入或缺失实质上不减少抗体与抗原的结合。举例而言，实质上不降低结合亲和力的保守取代可在CDR中进行。类更改可位于CDR“热点”外部。在某些实施方案中，对于变异体V_H及V_L序列，各CDR为不变的。

改变(例如取代)可于CDR中进行以例如改良抗体亲和力。此类变化可在编码在体细胞成熟期间具有高突变率的密码子的CDR中进行(参见例如Chowdhury,MethodsMol.Biol.,207:179-196(2008))，且测试所得变异体的结合亲和力。亦可使用亲和力成熟(例如使用易错PCR、链改组、CDR的随机化或寡核苷酸导向突变诱发)改良抗体亲和力(参见例如Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(2001))。与抗原结合有关的CDR残基可例如使用丙氨酸扫描突变诱发或仿真来特定鉴别(参见例如Cunningham及Wells,Science,244:1081-1085(1989))。特别是常常靶向CDR-H3及CDR-L3。替代地或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴别抗体与抗原之间的接触点。此类接触残基及邻近残基可作为取代候选物靶向或消除。可筛检变异体以判定其是否含有所需特性。

氨基酸序列插入及缺失包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽范围内的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入及缺失。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变异体包括抗体的N端或C端与酶(例如对于ADEPT而言)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合。抗体分子的序列内插入变异体的实例包括在轻链中插入3个氨基酸。末端缺失的实例包括在轻链末端缺失7个或更少个氨基酸的抗体。

在一些实施方案中，改变抗体以提高或降低其糖基化(例如通过改变氨基酸序列以使得产生或移除一或多个糖基化位点)。可改变附接至抗体的Fc区的碳水化合物。来自哺乳动物细胞的天然抗体通常包含通过N键附接至Fc区的CH₂域的Asn₂₉₇的分支双触角寡糖(参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997))。寡糖可以是各种碳水化合物，例如附接至在双触角寡糖结构的主干中的GlcNAc的甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、唾液酸或岩藻糖。寡糖在抗体中的修饰可例如产生具有某些改良特性的抗体变异体。抗体糖基化变异体可具有改良的ADCC和/或CDC功能。在一些实施方案中，提供具有缺乏(直接或间接地)连接至Fc区的海藻糖的碳水化合物结构的抗体变异体。举例而言，此类抗体中的海藻糖含量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％，或20％至40％。岩藻糖的量通过相对于附接至Asn297的所有糖结构总和，计算糖链内Asn297处的岩藻糖的平均量来测定(参见例如WO08/077546)。Asn₂₉₇是指位于Fc区中的位置297附近的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号；参见例如Edelman等人Proc Natl Acad Sci U S A.1969年5月；63(1):78-85)。然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn₂₉₇亦可位于位置297的上游或下游±3氨基酸附近，亦即位置294与位置300之间。此类岩藻糖基化变异体可具有提高的ADCC功能(参见例如Okazaki等人,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；及Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004))。细胞株(例如基因敲除细胞株)及其使用方法可用于产生脱海藻糖基化抗体，例如在蛋白质海藻糖基化中缺乏的Lec13 CHO细胞及α-1,6-海藻糖基转移酶基因(FUT8)被基因敲除的CHO细胞(参见例如Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.,87:614(2004)；Kanda,Y.等人,生物技术与生物工程,94(4):680-688(2006))。亦包括其他抗体糖基化变异体(参见例如美国专利第6,602,684号)。

在一些实施方案中，可将一或多个氨基酸修饰引入至本文所提供的抗体的Fc区中，进而产生Fc区变异体。本文中的Fc区为含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C端区。Fc区包括原生序列Fc区及变异Fc区。Fc区变异体可包含人类Fc区序列(例如人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。

在一些实施方案中，本发明的抗体为拥有一些(但并非所有)效应子功能的变异体，此使得所述抗体成为合乎其中体内抗体半衰期至关重要，而某些效应功能(诸如补体及ADCC)为不必要或有害的应用需要的候选物。可进行体外和/或体内细胞毒性分析以确认CDC和/或ADCC活性得到降低/消除。举例而言，可进行Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体不具有FcγR结合能力(因此可能不具有ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。评定所关注分子的ADCC活性的体外分析的非限制性实施例描述于美国专利第5,500,362号及美国专利第5,821,337号中。替代地，可采用非放射性分析(例如ACTI^TM及

非放射性细胞毒性分析)。适用于此类分析的效应细胞包括外周血液单核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)、单核球、巨噬细胞及天然杀手(Natural Killer，NK)细胞。

抗体可具有增加的半衰期及改良的与新生Fc受体(FcRn)的结合(参见例如US2005/0014934)。此类抗体可包含其中具有改良Fc区与FcRn的结合的一或多个取代的Fc区，且包括具有根据EU编号系统(参见例如美国专利第7,371,826号)的一或多个Fc区残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处的取代的那些者。亦涵盖Fc区变异体的其他实施例(参见例如Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号及第5,624,821号；及WO94/29351)。

在一些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸工程改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。在一些实施方案中，经取代的残基存在于抗体的可进入位点处。反应性巯基可位于用于结合诸如药物部分或连接符药物部分的其他部分的位点，以产生免疫结合物。在一些实施方案中，以下残基中的任一或多者可经半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的S400(EU编号)。

在一些具体例中，本文提供的抗体可经进一步修饰以含有已知且可获得的额外非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三

烷、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可在制造中具有一定优势。聚合物可具有任何分子量，且可以是支化或非支化的。与抗体附接的聚合物的数目可变化，且若连接两个或更多个聚合物，则聚合物可以是相同或不同分子。

本文所描述的抗体可由核酸编码。核酸是包含两个或更多个核苷酸碱基的聚核苷酸类型。在某些实施方案中，核酸为载体的组分，其可用于将编码聚核苷酸的多肽转移至细胞中。如本文所用，术语“载体”意欲指能够运输其已连接的另一种核酸的核酸分子。一种载体为基因组整合载体或“整合载体”，其可整合于宿主细胞的染色体DNA中。另一类型的载体为“游离型”载体，例如能够进行染色体外复制的核酸。能够导引其可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。适合的载体包含质体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒载体及其类似物。在表达载体中，用于控制转录的调节组件(诸如启动子、强化子、聚腺苷酸化信号)可来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。可另外并入通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力及促进识别转化子的选择基因。可采用来源于病毒(诸如慢病毒、反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及其类似物)的载体。质体载体可经线性化以整合于染色体位置中。载体可包含将位点特异性整合导引至基因组中的限定位置或限制性位点集合中的序列(例如AttP-AttB重组)。另外，载体可包含来源于可转座组件的序列。

如本文所用，术语“同源”、“同源性”或“同源百分比”当在本文中用于相对于参考序列描述氨基酸序列或核酸序列时，可使用Karlin及Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268,1990,如在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993中所修改)所述的式测定。此类式并入至Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的基于局部比对的检索工具(BLAST)程序中。截至本申请案的申请日，序列同源性百分比可使用BLAST的最新近版本测定。

编码本文所描述的抗体的核酸可用于感染、转染、转型或以其他方式产生适合核酸的细胞转殖基因，因此使得能够产生用于商业或治疗用途的抗体。用于通过大规模细胞培养产生抗体的标准细胞株及方法是本领域中已知的。参见例如Li等人,“Cell cultureprocesses for monoclonal antibody production.”Mabs.2010年9月-10月；2(5):466-477。在某些实施方案中，细胞是真核细胞。在某些实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞或

细胞。在某些实施方案中，将编码抗体的核酸整合至适用于产生抗体的细胞的基因组基因座中。在某些实施方案中，本文描述一种制造抗体的方法，其包含在足以允许产生及分泌该抗体的体外条件下培养包含编码抗体的核酸的细胞。

在某些实施方案中，本文描述一种主细胞库，其包含：(a)哺乳动物细胞株，其包含编码本文所述的抗体的一或多种核酸，该抗体整合在一定基因组位置；及(b)低温保护剂。在某些实施方案中，低温保护剂包含甘油。在某些实施方案中，主细胞库包含：(a)CHO细胞株，其包含编码具有以下的抗体的核酸：(i)与SEQ ID NO:13所示的序列有至少90％一致性的重链氨基酸序列；及(ii)与SEQ ID NO:14所示的序列有至少90％一致性的轻链氨基酸序列，其整合于一定基因组位置；及(b)低温保护剂。在某些实施方案中，低温保护剂包含甘油。在某些实施方案中，主细胞库包含于能够耐受液氮的冷冻的适合小瓶或容器中。

本文亦描述制造本文所描述的抗体的方法。此类方法包含在足以允许抗体表达及分泌的条件下在细胞培养基中培育包含编码抗体的核酸的细胞或细胞株，且进一步自细胞培养基收集抗体。收集可进一步包含一或多个纯化步骤以移除活细胞、细胞碎片、非抗体蛋白质或多肽、非所需盐、缓冲剂及培养基组分。在某些实施方案中，额外纯化步骤包括离心、超速离心、透析、脱盐、蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或蛋白质L纯化和/或离子交换色谱。

抗骨膜蛋白抗体

本文描述阻断骨膜蛋白功能的抗体。此类抗体适用于治疗癌症。本文所描述的抗体降低肿瘤的胶原蛋白含量，减少粒细胞及肿瘤相关巨噬细胞的浸润，同时增加巨噬细胞极化成M1表型，且提高肿瘤浸润性T细胞的积聚及抗肿瘤特性。在某些实施方案中，与未治疗或对照治疗的个体相比，抗骨膜蛋白抗体使肿瘤胶原蛋白含量降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。在某些实施方案中，与未治疗或对照治疗的个体相比，抗骨膜蛋白抗体使粒细胞及肿瘤相关巨噬细胞的浸润减少至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在某些实施方案中，与未治疗或对照治疗的个体相比，抗骨膜蛋白抗体使CD11b+细胞的浸润减少至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在某些实施方案中，与未治疗或对照治疗的个体相比，抗骨膜蛋白抗体使肿瘤相关巨噬细胞至M1型(CD11b+、MHC类II+、CD206-)的极化增加至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在某些实施方案中，与未治疗或对照治疗的个体相比，抗骨膜蛋白抗体使肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的积聚增加至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在某些实施方案中，与未治疗或对照治疗的个体相比，抗骨膜蛋白抗体使肿瘤浸润性CD8+T细胞的干扰素γ的产生增加至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

本文描述一种结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1)；(b)包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中的任一者中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2)；(c)包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中的任一者中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3)；(d)包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1)；(e)包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2)氨基；(f)及包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3)。在某些实施方案中，抗体为人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施方案中，抗体为IgG抗体。在某些实施方案中，本文所描述的抗体可包含缺乏效应功能的Fc部分。在某些实施方案中，在用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞进行的细胞黏附分析中，抗体的IC50小于约50纳摩尔浓度。在某些实施方案中，在用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞进行的细胞黏附分析中，抗体的IC50小于约40纳摩尔浓度。在某些实施方案中，在用人类肺纤维母细胞细胞和/或小鼠纤维母细胞进行的细胞黏附分析中，抗体的IC50小于约30纳摩尔浓度。

本文亦描述一种结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段，其包含免疫球蛋白重链及免疫球蛋白轻链：(a)其中免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列；及(b)其中该免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO 13的天冬酰胺编号55为天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸，且其中SEQ ID NO:13的甲硫氨酸编号100为甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在某些实施方案中，抗体为IgG抗体。在某些实施方案中，本文所描述的抗体可包含缺乏效应功能的Fc部分。在某些实施方案中，在用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞进行的细胞黏附分析中，抗体的IC50小于约50纳摩尔浓度。在某些实施方案中，在用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞进行的细胞黏附分析中，抗体的IC50小于约40纳摩尔浓度。在某些实施方案中，在用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞进行的细胞黏附分析中，抗体的IC50小于约30纳摩尔浓度。

PD-1轴抑制剂

PD-1轴是PD-1对T细胞反应发挥抑制作用的信号传导路径且包括PD-1与PDL-1或PDL-2的相互作用。本文所描述的骨膜蛋白结合多肽及抗体可与PD-1轴抑制剂组合且部署于治疗肿瘤、癌症或其他赘瘤的方法中。在某些实施方案中，本文所描述的骨膜蛋白结合多肽及抗体可与PD-1轴抑制剂在适用于治疗癌症、肿瘤或其他赘瘤的药物组合物中组合。本文所描述的NB0828抗体可与PD-1轴抑制剂组合且部署于治疗肿瘤、癌症或其他赘瘤的方法中。在某些实施方案中，本文所描述的NB0828抗体可在适用于治疗癌症、肿瘤或其他赘瘤的药物组合物中与PD-1轴抑制剂组合。

本文组合物及方法中所用的PD-1轴抑制剂可抑制经由PD-1(CD279)、PDL-1(CD274)或PDL-2(CD273)进行的信号传导。抑制剂可以是抗体或抗体片段、可溶性配体-Fc融合构建物或小分子抑制剂。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂包含抗体或PD-1结合片段。在某些实施方案中，特异性结合PD-1(CD279)的抗体或抗原结合片段包含派姆单抗、纳武单抗、AMP-514(MEDI0680)、斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗(BGB-A317)、皮立珠单抗，优选埃本利单抗(CAS#2249882-54-8)(抗PD-1抗体)或其PD-1(CD279)结合片段。

具体言之，本文所描述的抗PD-1抗体分子为埃本利单抗，其包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链及含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链。

在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂为PD-L2 Fc融合蛋白质(例如AMP-224)。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂包含特异性结合PDL-1(CD274)的抗体或PDL-1结合片段。在某些实施方案中，特异性结合PDL-1(CD274)的抗体或抗原结合片段包含德瓦鲁单抗(MEDI4736)、阿特珠单抗(MPDL3280A)、阿维鲁单抗(MSB0010718C)、BMS-936559(MDX-1105)、MEDI0680(AMP-514)、西米普利单抗(REGN2810)、特瑞普利单抗(JS001-PD-1)、卡瑞利珠单抗(SHR-1210)、多塔利单抗(TSR-042)、西利单抗(JNJ-63723283)或FAZ053或其PDL-1(CD274)结合片段。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂包含特异性结合PDL-2(CD273)的抗体或PDL-2结合片段。

在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂包含一或多种小分子抑制剂，诸如N-{2-[({2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]吡啶-3-基}甲基)氨基]乙基}乙酰胺(BMS202)；(2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)-5-甲基苯甲基)-D-丝氨酸盐酸盐；(2R,4R)-1-(5-氯-2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)苯甲基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基吲哚；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基-1h-吲哚；L-α-谷氨酰胺、N2,N6-双(L-丝氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-苏氨酰基-L-丝氨酰基-L-α-谷氨酰基-L-丝氨酰基-L-苯丙氨酰基)-L-赖氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-精氨酰基-L-缬氨酰基-L-苏氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-亮氨酰基-L-丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-异亮氨酰基-L-赖氨酰基；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶甲酸；甘氨酰胺，N-(2-巯基乙酰基)-L-苯丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-脯氨酰基-L-组氨酰基-L-亮氨酰基-N-甲基甘氨酰基-L-色氨酰基-L-丝氨酰基-L-色氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-L-精氨酰基-L-半胱氨酰基-，环(1→14)-硫醚；或其衍生物或类似物。

在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂可通过适用于施用小分子多肽或含抗体药物组合物的任何途径施用，诸如例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、瘤内、脑内或经口施用。在某些实施方案中，静脉内施用PD-1轴抑制抗体。在某些实施方案中，以适合的剂量时程(例如每周一次、每周两次、每月一次、每月两次、每两周一次、每三周一次或每四周一次)施用PD-1轴抑制抗体。可以施用任何治疗有效量的抗体。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约0.1mg/kg与约50mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约1mg/kg与约40mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约5mg/kg与约30mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约5mg/kg与约20mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约5mg/kg与约15mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量为约5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg。在一个实施例中，可每两周一次施用约10mg/kg剂量的德瓦鲁单抗。

在某些实施方案中，可以向个体施用约100毫克与约1000毫克之间的固定剂量水平的PD-1轴抑制剂。在某些实施方案中，可以向个体施用约200毫克与约800毫克之间、约200毫克与约600毫克之间、约200毫克与约500毫克之间、约300毫克与约500毫克之间的固定剂量水平的PD-1轴抑制剂。在某些实施方案中，向个体施用约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000毫克的固定剂量水平的PD-1轴抑制剂。在某些实施方案中，可依适合单一疗法的水平向个体施用PD-1轴抑制剂。举例而言，可每两周约240毫克或每四周约480毫克的剂量施用纳武单抗。在另一个实施例中，可每三周一次以约200毫克施用派姆单抗。

治疗方法

本文所公开的抗体为适用于治疗癌症或肿瘤的抗体。治疗是指力图改善或减轻所治疗的病况的方法。关于癌症治疗，其包括但不限于减小肿瘤体积、减少肿瘤体积生长、提高无恶化存活期或总体预期寿命。在某些实施方案中，治疗将影响所治疗的癌症的缓解。在某些实施方案中，治疗涵盖作为意欲预防先前所治疗的癌症或肿瘤的复发或恶化的防止性或维持剂量的用途。本领域技术人员应理解，虽然抗体可以是安全且有效的，但并非所有个体均将对所施用的治疗作出同等反应，尽管如此，这些个体仍被视为受治疗。

本文所描述的方法亦涵盖通过施用PD-1轴抑制剂与骨膜蛋白结合抗体的组合来治疗患有癌症的个体的方法。在某些实施方案中，可分开施用PD-1轴抑制剂及骨膜蛋白结合抗体。在某些实施方案中，可在治疗同一天分开施用PD-1轴抑制剂及骨膜蛋白结合抗体。在某些实施方案中，可各自根据其自身施用时程来分开施用PD-1轴抑制剂及骨膜蛋白结合抗体。在某些实施方案中，分开施用时程经设计以使各抑制剂的PK/PD特征达至最大。在某些实施方案中，骨膜蛋白结合抗体包含NB0828或具有NB0828的CDR的抗体。在某些实施方案中，PD-1轴抑制剂包含埃本利单抗(CAS#2249882-54-8)或具有如本文所公开的埃本利单抗的CDR的抗体。

在某些实施方案中，癌症或肿瘤为实体癌症或实体肿瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤为血液癌症或血液肿瘤。在某些实施方案中，癌症或肿瘤包含乳房肿瘤、心脏肿瘤、肺肿瘤、小肠肿瘤、结肠肿瘤、脾肿瘤、肾脏肿瘤、膀胱肿瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、胰脏肿瘤、皮肤肿瘤、骨骼肿瘤、骨髓肿瘤、血液肿瘤、胸腺肿瘤、子宫肿瘤、睾丸肿瘤或肝脏肿瘤。在某些实施方案中，可用本发明的抗体治疗的肿瘤或癌症包含腺瘤、腺癌、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、胚细胞瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、神经管胚细胞瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和/或畸胎瘤。在某些实施方案中，肿瘤/癌症选自以下的群：肢端雀斑痣性黑色素瘤、光化性角化症、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌瘤、星形胶质细胞肿瘤、巴氏腺癌(Bartholin gland carcinoma)、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细管类癌、癌瘤、癌肉瘤、胆管癌、软骨肉瘤、囊腺瘤、内胚层窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜基质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜肉瘤、尤文肉瘤(Swing’s sarcoma)、局灶性结节性增生、胃泌素瘤、生殖系肿瘤、神经胶母细胞瘤、升糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝脏腺瘤、肝脏腺瘤病、肝细胞癌、胰岛素病(insulinite)、上皮内瘤形成、上皮内鳞状细胞瘤形成、创伤性鳞状细胞癌、大细胞癌、脂肪肉瘤、肺癌瘤、淋巴母细胞白血病、淋巴球性白血病、平滑肌肉瘤、黑素瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、神经鞘肿瘤、神经管胚细胞瘤、神经髓上皮瘤、间皮瘤、黏液表皮样癌瘤、骨髓白血病、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状浆液腺癌、垂体肿瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、前列腺癌、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌瘤、鳞状细胞癌、小细胞癌、软组织癌瘤、生长抑素分泌肿瘤、鳞状癌瘤、鳞状细胞癌、未分化癌瘤、葡萄膜黑素瘤、疣状癌瘤、阴道/外阴癌瘤、血管活性肠肽瘤(VIPpoma)及威尔姆氏肿瘤(Wilm’stumor)。在某些实施方案中，欲用一或多种本发明抗体治疗的肿瘤/癌症包含脑癌、头颈癌、结肠直肠癌、急性骨髓白血病、前驱体B细胞急性淋巴母细胞白血病、膀胱癌、星形细胞瘤(优选II级、III级或IV级星形细胞瘤)、神经胶母细胞瘤、多形性神经胶母细胞瘤、小细胞癌及非小细胞癌(优选非小细胞肺癌)、肺腺癌、转移性黑色素瘤、雄激素非依赖性转移性前列腺癌、雄激素依赖性转移性前列腺癌、前列腺腺癌及乳癌(优选乳房导管癌和/或乳房癌)。在某些实施方案中，用本发明的抗体治疗的癌症包含神经胶母细胞瘤。在某些实施方案中，用一或多种本发明的抗体治疗的癌症包含胰脏癌。在某些实施方案中，用一或多种本发明的抗体治疗的癌症包含卵巢癌。在某些实施方案中，用一或多种本发明的抗体治疗的癌症包含肺癌。在某些实施方案中，用一或多种本发明的抗体治疗的癌症包含前列腺癌。在某些实施方案中，用一或多种本发明的抗体治疗的癌症包含结肠癌。在某些实施方案中，所治疗的癌症包含神经胶母细胞瘤、胰脏癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或肺癌。在某一实施方案中，癌症为相对其他治疗的难治癌症。在某一实施方案中，所治疗的癌症为复发性的。在某一实施方案中，癌症为复发性/难治性神经胶母细胞瘤、胰脏癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或肺癌。

在某些实施方案中，可通过适合于施用含抗体的药物组合物的任何途径向对抗体有需要的个体施用抗体，诸如例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、瘤内或脑内施用等。在某些实施方案中，静脉内施用抗体。在某些实施方案中，皮下施用抗体。在某些实施方案中，瘤内施用抗体。在某些实施方案中，以适合的剂量时程施用抗体，例如每周一次、每周两次、每月一次、每月两次、每两周一次、每三周一次或每月一次等。在某些实施方案中，每三周一次施用抗体。可以任何治疗有效量施用抗体。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约0.1mg/kg与约50mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约1mg/kg与约40mg/kg之间。在某些实施方案中，治疗上可接受的量在约5mg/kg与约30mg/kg之间。治疗有效量包括足以减轻与待治疗的疾病或病痛相关的一或多种症状的量。

组合疗法的剂量时程

可以多种方式施用包含骨膜蛋白结合抗体或多肽及PD-1轴抑制剂的组合治疗。可同时以相同时程或在不同时间且以不同时程施用骨膜蛋白结合抗体或多肽及PD-1轴抑制剂。当同时施用时，可借助于包含骨膜蛋白结合多肽及PD-1轴抑制剂的单独调配物或单一调配物来施用。可混合施用模式，例如可静脉内施用骨膜蛋白结合多肽，同时可经口或通过非经肠注射施用PD-1轴抑制剂。在某些实施方案中，静脉内、非经肠、皮下、瘤内或经口施用骨膜蛋白结合多肽。在某些实施方案中，静脉内、非经肠、皮下、瘤内或经口施用PD-1轴抑制剂。

当以相同时程向个体施用组合治疗时，可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用骨膜蛋白结合多肽及PD-1轴抑制剂。可分开或以单一调配物形式施用骨膜蛋白结合多肽及PD-1轴抑制剂。可分开或以单一调配物形式施用NB0828及PD-1轴抑制剂。

当以不同时程向个体施用组合治疗时，可交替施用骨膜蛋白结合多肽及PD-1轴抑制剂。在某些实施方案中，可在施用骨膜蛋白多肽之前向个体施用PD-1轴抑制剂一或多次。可在施用PD-1轴抑制剂的1天、2天、3天、4天、5天或6天内施用骨膜蛋白结合多肽。可在施用PD-1轴抑制剂的1周、2周、3周或4周内施用骨膜蛋白结合多肽。可在施用PD-1轴抑制剂的1天、2天、3天、4天、5天或6天内施用NB0828抗体。可在施用PD-1轴抑制剂的1周、2周、3周或4周内施用NB0828抗体。

可在施用PD-1轴抑制剂之前向个体施用骨膜蛋白结合多肽一或多次。在某些实施方案中，可在施用骨膜蛋白结合多肽的1天、2天、3天、4天、5天或6天内施用PD-1轴抑制剂。在某些实施方案中，可在施用骨膜蛋白结合多肽的1周、2周、3周或4周内施用PD-1轴抑制剂。在某些实施方案中，可在施用NB0828抗体的1天、2天、3天、4天、5天或6天内施用PD-1轴抑制剂。在某些实施方案中，可在施用NB0828抗体的1周、2周、3周或4周内施用PD-1轴抑制剂。

在某些实施方案中，可每周一次向个体施用骨膜蛋白结合多肽，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂。在某些实施方案中，可每两周一次向个体施用骨膜蛋白结合多肽，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂。在某些实施方案中，可每三周一次向个体施用骨膜蛋白结合多肽，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂。在某些实施方案中，可每四周一次向个体施用骨膜蛋白结合多肽，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂。在某些实施方案中，可每周一次向个体施用PD1轴抑制剂，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用骨膜蛋白结合多肽。在某些实施方案中，可每两周一次向个体施用PD1轴抑制剂，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用骨膜蛋白结合多肽。在某些实施方案中，可每三周一次向个体施用PD1轴抑制剂，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用骨膜蛋白结合多肽。在某些实施方案中，可每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用骨膜蛋白结合多肽。在某些实施方案中，可在施用PD-1轴抑制剂之前向个体施用NB0828一或多次。在某些实施方案中，可每周一次向个体施用NB0828，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂。在某些实施方案中，可每两周一次向个体施用NB0828，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂。在某些实施方案中，可每三周一次向个体施用NB0828，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂。在某些实施方案中，可每四周一次向个体施用NB0828，且可每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次向个体施用PD1轴抑制剂。

根据本发明的组合治疗可包含以下组合，其中活化成分(例如骨膜蛋白结合多肽及PD-1的抑制剂)中之一者或两者本身并不有效，但在作为组合治疗之一部分施用时是有效的。在某些实施方案中，以单一疗法无效但与骨膜蛋白结合多肽组合有效的含量施用PD-1的抑制剂。在某些实施方案中，以单一疗法无效但与NB0828抗体组合有效的含量施用PD-1的抑制剂。在某些实施方案中，以单一疗法无效但与PD-1的抑制剂组合有效的含量施用骨膜蛋白结合多肽。在某些实施方案中，以单一疗法无效但与PD-1的抑制剂组合有效的含量施用NB0828抗体。在某些实施方案中，以单一疗法无效但组合形式有效的含量施用骨膜蛋白结合多肽及PD-1的抑制剂两者。在某些实施方案中，以单一疗法无效但组合形式有效的含量施用NB0828及PD-1的抑制剂两者。

药学上可接受的赋形剂、载剂及稀释剂

在某些实施方案中，本发明的抗骨膜蛋白抗体包括于包含一或多种药学上可接受的赋形剂、载剂及稀释剂的药物组合物中。在某些实施方案中，将本发明的抗体悬浮于无菌溶液中来施用。在某些实施方案中，溶液包含0.9％NaCl。在某些实施方案中，溶液进一步包含以下中的一或多者：缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸盐、丁二酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐及羟基甲氨基甲烷(Tris)；界面活性剂，例如聚山梨醇酯80(Tween 80)、聚山梨醇酯20(Tween 20)及泊洛沙姆188(poloxamer 188)；多元醇/双糖/多糖，例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖及聚葡萄糖40；氨基酸，例如甘氨酸或精氨酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸、甲硫氨酸；或螯合剂，例如EDTA或EGTA。

在某些实施方案中，本发明的抗体冻干运送/储存且在施用之前复原。在某些实施方案中，冻干抗体调配物包含增积剂，诸如甘露糖醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、聚葡萄糖40或其组合。冻干调配物可含于由玻璃或其他适合非反应性材料构成的小瓶中。抗体在调配时，不论复原或不复原，均可在某一pH下，一般在小于7.0下缓冲。在某些实施方案中，pH值可在4.5与6.5、4.5与6.0、4.5与5.5、4.5与5.0、或5.0与6.0之间。

本文亦描述试剂盒，其包含适合容器中的本文所描述抗体中的一或多者及一或多种选自以下的额外组分：使用说明书、稀释剂、赋形剂、载剂及施用装置。

在某些实施方案中，本文描述一种制备癌症治疗的方法，其包含混杂一或多种药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂及本发明的抗体。在某些实施方案中，本文描述一种制备用于储存或运送的癌症治疗的方法，其包含冻干本发明的一或多种抗体。

实施例

以下说明性实施例表示本文所述的组合物及方法的实施方案且不意谓以任何方式限制。

实施例1-抗体生成及筛选

使用全人类噬菌体库进行噬菌体呈现抗体发现操作以分离针对骨膜蛋白的结合子。简言之，使用重组人类骨膜蛋白、重组小鼠骨膜蛋白或其组合进行三轮淘选，重点为鉴别小鼠交叉反应结合子。根据此淘选策略，鉴别与小鼠骨膜蛋白交叉反应的78序列特有ScFv，且以人类IgG1格式产生以便在细胞附着分析中进行功能筛选。参见图1。

在4℃下在96孔培养盘上涂布重组人类或小鼠骨膜蛋白隔夜。次日，将培养盘用PBS洗涤且在37℃下用2％BSA封闭1小时。在封闭之后，将抗体添加至培养盘中且在37℃下培育30分钟。培育之后，接着将50,000个IMR90人类肺纤维母细胞或50,000个MLG小鼠纤维母细胞添加至孔中且使其在37℃下培育2小时。接着用PBS洗涤培养盘两次且使用IncuCyte平台测量孔的汇合度。通过500nM的高浓度单次剂量筛选，将21个IgG鉴别为得到>50％抑制，如图1中所示，且继续结合筛选以测定相对于人类及小鼠骨膜蛋白的亲和力，如下表1中所示。

为测定重组人类或小鼠骨膜蛋白的相对亲和力，在4℃下在maxisorp培养盘上涂布这些蛋白质隔夜。次日，在37℃下用酪蛋白封闭缓冲液封闭培养盘1小时。向培养盘中滴定各抗体且使其在室温下结合1小时。用PBST洗涤培养盘4次，随后与HRP结合的抗人类Fc二级抗体一起在室温下培育30分钟。接着用PBST再次洗涤培养盘4次且接着使用TMB底物及1MHCl显影。通过此筛选，选择与人类及小鼠骨膜蛋白两者的结合EC50值＜1nM的4个纯系(用粗体及斜体标记的表1)。

实施例2-NB0828及序列变异体的生成

在细胞附着分析中在剂量反应中再测试4个候选物以测定IC50值。通过此筛选，将NB0627鉴别为特别适合的IgG(表2)。

NB0627接着转化为效应沉默IgG4PAA同型，生成主候选物NB0828。NB0828的序列分析鉴别VH区中的两种转译后修饰的倾向。第一去酰胺化位点位于CDR-H2处，且第二氧化位点位于CDR-H3处。因此，为了试图移除这些倾向，生成若干单突变体及双突变体且测量其结合及活性。NB0828及其变异体的IC50及EC50值的结果概述列于表3中。

实施例3-小鼠膀胱MB49及结肠CT26肿瘤模型中NB0828的体内功效

在两个独立肿瘤模型(膀胱MB49及结肠CT26肿瘤模型)中测试NB0828的功效。简言之，将250,000个MB49细胞皮内注射至雌性C57BL/6小鼠的侧腹，或在雌性Balb/C小鼠的侧腹皮内注射50,000个CT26细胞。肿瘤植入后第3天，用NB0828(50mg/kg，3QW)或媒剂对照(PBS)腹膜内处理小鼠。在测径规测量之后每周两次评定肿瘤体积且将其计算为(长度×宽度²)/2。当肿瘤尺寸在任何单一方向上超过15mm或由于肿瘤溃疡而将小鼠安乐死，以作为人道终点。

如图2及图5中所示，NB0828在两个模型中在减少肿瘤生长方面均具有一定作用。在MB49模型中，肿瘤生长的此减少与较低百分比的瘤内颗粒球性骨髓细胞(如图3中所示)及较低胶原蛋白含量(如图4中所示)相关。如同MB49模型一样，CT26模型显示颗粒球性骨髓细胞减少。另外，NB0828减少肿瘤浸润性巨噬细胞的出现，且存在的巨噬细胞由于NB0828处理而向M1表型偏移，如图6中所示。在CT26小鼠模型中，NB0828处理亦与更高量的肿瘤浸润性CD8+及CD4+T细胞及肿瘤浸润性T细胞中的显著更高的干扰素γ分泌相关，如图7中所示。

免疫表型分型

如所描述，在第3天开始用NB0828或媒剂对照处理MB49或携带CT26肿瘤的小鼠。对于所示数据，在肿瘤植入MB49及CT26后第20天及第18天分别进行免疫表型分型。切除肿瘤，移除皮肤，且在使用Miltenyi小鼠肿瘤解离酶混合物(Miltenyi Biotec,CAT#130-110-187)以酶促方式消化之前使用刮刀刀片进行机械断裂。经消化的样品穿过40μm滤网，在RPMI中洗涤，随后在RPMI+10％FBS中进行第二次洗涤。接着将细胞再悬浮以用于计数，且每样品最多接种2×10⁶个白血球且加以染色以用于通过流式细胞术进行分析。为了评估CT26模型中的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞功能，在抗CD28及布雷菲尔德菌素A(Brefeldin A)存在下在37℃下用AH1肽[H2-L^d限制gp70(423-431)MuLV抗原决定基，由CT26细胞表达的免疫显性CD8+T细胞抗原决定基]刺激来自肿瘤的经消化单细胞悬浮液5小时。在刺激之后，使用流式细胞测量术通过标准表面/胞内染色方法使细胞染色以检测CD8+T细胞产生的IFN-γ。用于评定所示细胞群的流动染色组包括于以下表4中。存活性染色剂(Thermo Fisher，存活/死亡可固定紫色染色剂(Live/Dead Fixable Violet Stain))用于允许探查仅存活细胞事件，且包括泛白血球标记CD45以允许对免疫隔室内的群体进行标准化。相关免疫群体在表型上/功能上如下定义：总骨髓细胞(CD45+CD11b+)、粒细胞(CD45+CD11b+Gr-1hi或CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C lo)、巨噬细胞(CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C lo/neg F4/80+)、M1巨噬细胞(MHC II+CD206-)、M2巨噬细胞(MHC II-CD206+)、CD8+TILs(CD45+CD11b-CD3+CD90.2+CD8+)、CD4+TIL(CD45+CD11b-CD3+CD90.2+CD4+)、IFN-γ+CD8+TIL(CD45+CD11b-CD3+CD8+IFN-γ+)。使用中间荧光强度(Median Fluorescent Intensity，MFI)测定来自IFN-γ+CD8+TIL的IFN-γ染色强度。

胶原蛋白含量

通过羟脯氨酸的定量使用

总胶原蛋白分析(QuickZymeBiosciences,Leiden,The Netherlands,目录号:QZBtotcol1)评定肿瘤的总胶原蛋白含量。对于样品制备，当肿瘤已达至终点时将MB49肿瘤自携带肿瘤的小鼠切除，且在液氮中速冻且在分析之前储存在-80℃下。将肿瘤物称重且以200mg肿瘤/ml HCl再悬浮于6M HCl中，涡旋并在95℃下培育20小时。冷却各管，在13,000RPM下离心10分钟，且收集上清液。根据制造商的建议方案将上清液稀释于Milli Q水中，随后稀释于4M HCl，且使用所供应的缓冲剂及检测试剂以技术方式以一式两份涂铺以供检测羟脯氨酸。测量OD570 nm值并将其与使用所供应的胶原蛋白生成的标准曲线比较以计算各样品中胶原蛋白的量。各样品的经计算的总胶原蛋白(μg)除以肿瘤进料的总质量(mg)以对肿瘤样品的数据进行标准化。

实施例4-小鼠结肠MC38肿瘤模型中NB0828的体内功效

在小鼠结肠MC38肿瘤模型中测试NB0828在减少肿瘤生长方面的功效，其中结果显示于图8中。NB0828在改变肿瘤微环境方面亦有效以增加CD8+T细胞、减少肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的出现且提高促发炎1型巨噬细胞的比率，如图9A及图9C中所示。这些变化在此模型中引起NB0828功效，因为在NB0828治疗期间CD8+T细胞的耗尽逆转了NB0828的有利效应，如9D中所示。总体而言，此数据表明NB0828使CD8+T细胞增加至肿瘤部位、减少TAM且增加浸润性肿瘤中的促发炎M1巨噬细胞表型。

实施例5-小鼠结肠MC38肿瘤模型中NB0828及抗PD-1抗体的体内功效

当与PD-1官能性阻断抗体组合施用时，在小鼠结肠MC38肿瘤模型中测试NB0828在减少肿瘤生长方面的功效。图10A至C显示，与单独抗PD-1相比，抗PD-1与NB0828的组合进一步减少肿瘤生长(10A)且提高总存活率(相比于8/42，10B完全反应(CR)为16/43)。展现对NB0828及抗PD-1组合处理的完全反应的存活小鼠免受使用10×MC38肿瘤细胞进行的再攻击，其表明存活小鼠已获得对肿瘤的免疫记忆。

当用抗PD-1与NB0828的组合处理已建立的单独对抗PD-1治疗具有抗性的MC38肿瘤的小鼠时，抗性逆转，如图11中所示。如图12中所示，NB0828与抗PD-1的组合提高CD8+T细胞的浸润及功能(图12A及图12B)、减少TAM积聚(图12C)且提高肿瘤内剩余巨噬细胞的促发炎表型的比率(图12D)。肿瘤微环境中的这些修饰与NB0828一致，从而通过提高CD8 T细胞反应及减少免疫抑制性巨噬细胞来克服抗PD-1抗性。

虽然本文中已展示及描述本发明的优选实施方案，但本领域技术人员将显而易知，这些实施方案仅借助于实施例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将进行大量变化、更改及替代。应理解，本文所描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实践本发明。

本说明书中所提及的所有公开案、专利申请案、颁布的专利及其他文献均以引用的方式并入本文中，其引用程度就如同已特定地且个别地将各个公开案、专利申请案、颁布的专利或其他文献以全文引用的方式并入本文中一般。正文中所含的以引用的方式并入的定义若与本发明中的定义矛盾，则将其排除在外。

序列表

<110> 勃林格殷格翰国际加拿大公司

<120> 使用PD-1轴抑制剂及抗骨膜蛋白抗体治疗癌症的方法

<130> 01-3435-WO-1

<140>

<141>

<150> 62/899,066

<151> 2019-09-11

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 2

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1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 3

Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Asn Thr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 4

Ile Ser Ala Tyr Gln Gly Asn Thr

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 5

Ile Ser Ala Tyr Thr Gly Asn Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 6

Ile Ser Ala Tyr Asp Gly Asn Thr

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 7

Asp Ile Leu Val Val Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 8

Asp Val Leu Val Val Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 9

Asp Met Leu Val Val Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 10

Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn Arg

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 11

Ser Asn Asp

1

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<400> 12

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Thr Tyr Val

1 5 10

<210> 13

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

多肽

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Met Leu Val Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

多肽

<400> 14

Gln Ser Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Arg Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Ala Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Ser Thr Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 15

<211> 836

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 未知的说明:

骨膜蛋白序列

<400> 15

Met Ile Pro Phe Leu Pro Met Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ile Val

1 5 10 15

Asn Pro Ile Asn Ala Asn Asn His Tyr Asp Lys Ile Leu Ala His Ser

20 25 30

Arg Ile Arg Gly Arg Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln

35 40 45

Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys Tyr Phe Ser Thr Cys Lys Asn Trp Tyr

50 55 60

Lys Lys Ser Ile Cys Gly Gln Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys

65 70 75 80

Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Leu

85 90 95

Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr

100 105 110

Thr Gln Arg Tyr Ser Asp Ala Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly

115 120 125

Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Asp Asn

130 135 140

Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg Gly Leu Glu Ser Asn Val Asn Val Glu

145 150 155 160

Leu Leu Asn Ala Leu His Ser His Met Ile Asn Lys Arg Met Leu Thr

165 170 175

Lys Asp Leu Lys Asn Gly Met Ile Ile Pro Ser Met Tyr Asn Asn Leu

180 185 190

Gly Leu Phe Ile Asn His Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val Asn Cys

195 200 205

Ala Arg Ile Ile His Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His

210 215 220

Val Ile Asp Arg Val Leu Thr Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln Asp Phe

225 230 235 240

Ile Glu Ala Glu Asp Asp Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ile Thr

245 250 255

Ser Asp Ile Leu Glu Ala Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr Leu Phe

260 265 270

Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu

275 280 285

Arg Ile Met Gly Asp Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His

290 295 300

Ile Leu Asn Thr Leu Gln Cys Ser Glu Ser Ile Met Gly Gly Ala Val

305 310 315 320

Phe Glu Thr Leu Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Asp Gly Asp

325 330 335

Ser Ile Thr Val Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val

340 345 350

Thr Asn Asn Gly Val Ile His Leu Ile Asp Gln Val Leu Ile Pro Asp

355 360 365

Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr Thr Phe

370 375 380

Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ala Leu Arg Pro Asp

385 390 395 400

Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser Asp Asp

405 410 415

Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His

420 425 430

Ile Leu Lys Val Lys Val Gly Leu Asn Glu Leu Tyr Asn Gly Gln Ile

435 440 445

Leu Glu Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr

450 455 460

Ala Val Cys Ile Glu Asn Ser Cys Met Glu Lys Gly Ser Lys Gln Gly

465 470 475 480

Arg Asn Gly Ala Ile His Ile Phe Arg Glu Ile Ile Lys Pro Ala Glu

485 490 495

Lys Ser Leu His Glu Lys Leu Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ser Thr Phe

500 505 510

Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala Asp Leu Lys Glu Leu Leu Thr Gln Pro

515 520 525

Gly Asp Trp Thr Leu Phe Val Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys Gly Met

530 535 540

Thr Ser Glu Glu Lys Glu Ile Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ala Leu Gln

545 550 555 560

Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Phe Ile Gly Lys Gly

565 570 575

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580 585 590

Ile Phe Leu Lys Glu Val Asn Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys

595 600 605

Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val

610 615 620

Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu

625 630 635 640

Leu Glu Ile Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val

645 650 655

Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Val Thr Val Tyr Thr Thr Lys

660 665 670

Ile Ile Thr Lys Val Val Glu Pro Lys Ile Lys Val Ile Glu Gly Ser

675 680 685

Leu Gln Pro Ile Ile Lys Thr Glu Gly Pro Thr Leu Thr Lys Val Lys

690 695 700

Ile Glu Gly Glu Pro Glu Phe Arg Leu Ile Lys Glu Gly Glu Thr Ile

705 710 715 720

Thr Glu Val Ile His Gly Glu Pro Ile Ile Lys Lys Tyr Thr Lys Ile

725 730 735

Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr Glu Lys Glu Thr Arg Glu Glu

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Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys Tyr Thr Arg Ile Ser Thr Gly

755 760 765

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Thr Lys Val Thr Lys Phe Ile Glu Gly Gly Asp Gly His Leu Phe Glu

785 790 795 800

Asp Glu Glu Ile Lys Arg Leu Leu Gln Gly Asp Thr Pro Val Arg Lys

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Leu Gln Ala Asn Lys Lys Val Gln Gly Ser Arg Arg Arg Leu Arg Glu

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Gly Arg Ser Gln

835

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 任意氨基酸

<400> 16

Ile Ser Ala Tyr Xaa Gly Asn Thr

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> 任意氨基酸

<400> 17

Asp Xaa Leu Val Val Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

6xHis tag

<400> 18

His His His His His His

1 5

<210> 19

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

多肽

<400> 19

Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Ser

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Ser Asn Val Asn Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

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Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

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385 390 395 400

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405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

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435 440 445

<210> 20

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明: 合成

多肽

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Val Ser

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

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Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.一种治疗罹患癌症的个体的方法，该方法包括对所述个体施用(a)PD-1轴抑制剂；和(b)骨膜蛋白抑制剂。

2.根据权利要求1的方法，其中该骨膜蛋白抑制剂包含结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段。

3.根据权利要求2的方法，其中该骨膜蛋白抑制剂包含结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段包含：

a)包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1)；

b)包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中的任一者中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2)；

c)包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中的任一者中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3)；

d)包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1)；

e)包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2)氨基；及

f)包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3)。

4.根据权利要求3的方法，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段是嵌合性或人源化的。

5.根据权利要求3或4的方法，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段为IgG抗体。

6.根据权利要求3或4的方法，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段为Fab、F(ab)₂、单域抗体或单链可变片段(scFv)。

7.根据权利要求3至6中任一项的方法，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区及免疫球蛋白轻链可变区：

a)其中该免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列；及

b)其中该免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:13的天冬酰胺编号55为天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸，且其中SEQ ID NO:13的甲硫氨酸编号100为甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。

8.一种治疗罹患癌症的个体的方法，该方法包括对所述个体施用(a)PD-1轴抑制剂；和(b)骨膜蛋白抑制剂。

9.根据权利要求8的方法，其中该骨膜蛋白抑制剂包含结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段。

10.根据权利要求9的方法，其中该骨膜蛋白抑制剂包含结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段，该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区及免疫球蛋白轻链可变区：

11.根据权利要求10的方法，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段是嵌合性或人源化的。

12.根据权利要求10或11的方法，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段为IgG抗体。

13.根据权利要求10或11的方法，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段为Fab、F(ab)₂、单域抗体或单链可变片段(scFv)。

14.根据权利要求3至13中任一项的方法，其中在使用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞细胞进行的细胞黏附分析中，该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段的IC50小于约50纳摩尔浓度。

15.根据权利要求1至14中任一项的方法，其中该PD-1轴抑制剂为PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂，为结合至PD-1的抗体或其片段。

16.根据权利要求15的方法，其中该PD-1轴抑制剂为结合至PD-1的抗体或其片段。

17.根据权利要求15的方法，其中该结合至PD-1的抗体或其片段包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链及含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链。

18.根据权利要求15的方法，其中该结合至PD-1的抗体或其片段包含派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、皮立珠单抗(pidilizumab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、AMP-514(MEDI0680)或埃本利单抗(ezabenlimab)或其PD-1结合片段。

19.根据权利要求15的方法，其中该PD-1轴抑制剂为特异性结合PDL-1或PDL-2的抗体。

20.根据权利要求9的方法，其中该特异性结合PDL-1或PDL-2的抗体包含德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、BMS-936559(MDX-1105)、AMP-224、西米普利单抗(cemiplimab)(REGN2810)、特瑞普利单抗(toripalimab)(JS001-PD-1)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)(SHR-1210)、多塔利单抗(dostarlimab)(TSR-042)、西利单抗(cetrelimab)(JNJ-63723283)或FAZ053、或其PDL-1或PDL-2结合片段。

21.根据权利要求15的方法，其中PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂包含结合PD-1、PDL-1或PDL-2的Fc-融合蛋白质。

22.根据权利要求21的方法，其中该Fc-融合蛋白质包含AMP-224或其PD-1结合片段。

23.根据权利要求8的方法，其中PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂包含PD-1、PDL-1或PDL-2的小分子抑制剂。

24.根据权利要求23的方法，其中经由PD-1、PDL-1或PDL-2进行的信号传导的小分子抑制剂包含以下中的一或多者：N-{2-[({2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]吡啶-3-基}甲基)氨基]乙基}乙酰胺(BMS 202)；(2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)-5-甲基苯甲基)-D-丝氨酸盐酸盐；(2R,4R)-1-(5-氯-2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)苯甲基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基吲哚；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基-1h-吲哚；L-α-谷氨酰胺、N2,N6-双(L-丝氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-苏氨酰基-L-丝氨酰基-L-α-谷氨酰基-L-丝氨酰基-L-苯丙氨酰基)-L-赖氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-精氨酰基-L-缬氨酰基-L-苏氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-亮氨酰基-L-丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-异亮氨酰基-L-赖氨酰基；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶甲酸；甘氨酰胺，N-(2-巯基乙酰基)-L-苯丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-脯氨酰基-L-组氨酰基-L-亮氨酰基-N-甲基甘氨酰基-L-色氨酰基-L-丝氨酰基-L-色氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-L-精氨酰基-L-半胱氨酰基-，环(1→14)-硫醚；或其衍生物或类似物。

25.根据权利要求1至24中任一项的方法，其中在用呈单一疗法形式的检查点抑制剂治疗之后，该个体已罹患进行性疾病。

26.根据权利要求25的方法，其中该检查点抑制剂包含PD-1进入抑制剂。

27.根据权利要求1至26中任一项的方法，其中分开施用该PD-1轴抑制剂及该骨膜蛋白抑制剂。

28.根据权利要求1至27中任一项的方法，其中在同一天施用该PD-1轴抑制剂及该骨膜蛋白抑制剂。

29.根据权利要求1至27中任一项的方法，其中不在同一天施用该PD-1轴抑制剂及该骨膜蛋白抑制剂。

30.根据权利要求1至29中任一项的方法，其中该癌症包含神经胶母细胞瘤、胰脏癌、乳癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、子宫颈癌、前列腺癌或肺癌。

31.一种结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段，其用于亦接受PD-1轴抑制剂治疗的患者。

32.根据权利要求31的用途，其中该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段包含：

33.根据权利要求31的用途，其中该结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段是嵌合性或人源化的。

34.根据权利要求31至33中任一项的用途，其中该结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段为IgG抗体。

35.根据权利要求31至33中任一项的用途，其中该结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段为Fab、F(ab)₂、单域抗体或单链可变片段(scFv)。

36.根据权利要求31至35中任一项的用途，其中该结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链及免疫球蛋白轻链：

a)其中该免疫球蛋白重链可变区包含与13中所示的氨基酸序列有至少约90％、95％、97％、99％或100％一致性的氨基酸序列；及

37.一种结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段，其用于亦接受PD-1轴抑制剂治疗的患者，其中该结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链及免疫球蛋白轻链：

38.根据权利要求37的用途，其中该结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段是嵌合性或人源化的。

39.根据权利要求37或38的用途，其中该结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段为IgG抗体。

40.根据权利要求37或38的用途，其中该结合骨膜蛋白的重组抗体或其抗原结合片段为Fab、F(ab)₂、单域抗体或单链可变片段(scFv)。

41.根据权利要求31至40中任一项的用途，其中在用人类肺纤维母细胞和/或小鼠纤维母细胞细胞进行的细胞黏附分析中，该结合骨膜蛋白的抗体或其抗原结合片段的IC50小于约50纳摩尔浓度。

42.根据权利要求31至41中任一项的用途，其中该PD-1轴抑制剂为PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂。

43.根据权利要求42的用途，其中该PD-1轴抑制剂为结合至PD-1的抗体或其片段。

44.根据权利要求42的用途，其中该结合至PD-1的抗体或其片段包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链及含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链。

45.根据权利要求43的用途，其中该结合至PD-1的抗体或其片段包含派姆单抗、纳武单抗、皮立珠单抗、替雷利珠单抗、斯巴达珠单抗、AMP-514(MEDI0680)或埃本利单抗、或其PD-1结合片段。

46.根据权利要求42的用途，其中该PD-1轴抑制剂为特异性结合PDL-1或PDL-2的抗体。

47.根据权利要求46的用途，其中该特异性结合PDL-1或PDL-2的抗体包含德瓦鲁单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、BMS-936559(MDX-1105)、AMP-224、西米普利单抗(REGN2810)、特瑞普利单抗(JS001-PD-1)、卡瑞利珠单抗(SHR-1210)、多塔利单抗(TSR-042)、西利单抗(JNJ-63723283)、或其PDL-1或PDL-2结合片段。

48.根据权利要求31至41中任一项的用途，其中PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂包含结合PD-1、PDL-1或PDL-2的Fc-融合蛋白质。

49.根据权利要求48的用途，其中该Fc-融合蛋白质包含AMP-224或其PD-1结合片段。

50.根据权利要求42的用途，其中PD-1、PDL-1或PDL-2信号传导的抑制剂包含PD-1、PDL-1或PDL-2的小分子抑制剂。

51.根据权利要求50的用途，其中经由PD-1、PDL-1或PDL-2进行的信号传导的该小分子抑制剂包含以下中的一或多者：N-{2-[({2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]吡啶-3-基}甲基)氨基]乙基}乙酰胺(BMS 202)；(2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)-5-甲基苯甲基)-D-丝氨酸盐酸盐；(2R,4R)-1-(5-氯-2-((3-氰基苯甲基)氧基)-4-((3-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧杂环己烯-6-基)-2-甲基苯甲基)氧基)苯甲基)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基吲哚；3-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1-苯基-1h-吲哚；L-α-谷氨酰胺、N2,N6-双(L-丝氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-苏氨酰基-L-丝氨酰基-L-α-谷氨酰基-L-丝氨酰基-L-苯丙氨酰基)-L-赖氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-精氨酰基-L-缬氨酰基-L-苏氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-亮氨酰基-L-丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺酰基-L-异亮氨酰基-L-赖氨酰基；(2S)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基[1,1’-联苯]-3-基)甲氧基]苯基]甲基]-2-哌啶甲酸；甘氨酰胺，N-(2-巯基乙酰基)-L-苯丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺酰基-L-脯氨酰基-L-组氨酰基-L-亮氨酰基-N-甲基甘氨酰基-L-色氨酰基-L-丝氨酰基-L-色氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-N-甲基-L-正亮氨酰基-L-精氨酰基-L-半胱氨酰基-，环(1→14)-硫醚；或其衍生物或类似物。

52.根据权利要求31至51中任一项的用途，其中该个体罹患癌症。

53.根据权利要求52的用途，其中该癌症包含神经胶母细胞瘤、胰脏癌、乳癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、子宫颈癌、前列腺癌或肺癌。