WO2007077934A1

WO2007077934A1 - 抗ペリオスチン抗体およびそれを含有するペリオスチンが関与する疾患の予防または治療用医薬組成物

Info

Publication number: WO2007077934A1
Application number: PCT/JP2006/326280
Authority: WO
Inventors: Yoshiaki Taniyama; Ryuichi Morishita; Naruto Katsuragi
Original assignee: Asubio Pharma Co., Ltd.; Osaka University
Priority date: 2005-12-28
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2007-07-12
Also published as: AU2006334029B2; AU2006334029A1; JP5019464B2; EP1978034B2; KR101363695B1; CA2635849C; JPWO2007077934A1; EP1978034B1; KR20080099248A; EP1978034A1; RU2008130898A; BRPI0620747A2; CA2635849A1; CN101389656A; EP1978034A4

Abstract

　本発明は、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体、特に抗細胞接着作用を中和する能力を有する抗ペリオスチン抗体、ならびに該抗体を用いたペリオスチン関連疾患の予防または治療薬を提供する。また、該抗体を用いたサンプル中の該ペリオスチンの検出および定量方法、ならびに該方法により該ペリオスチン量を測定することによるペリオスチン関連疾患の診断方法を提供する。

Description

明細書

抗ぺリオスチン抗体およびそれを含有するべリオスチンが関与する疾患の予防または治療用医薬組成物

発明の詳細な説明

[0001]

技術分野

[0002] 本発明は、抗細胞接着作用を有するペリオスチンに対する抗体、特に抗細胞接着作用を中和する能力を有する抗ぺリオスチン抗体に関する。更に詳しくは、心肥大組織をはじめとして組織再構築の間質において特異的に発現する、抗細胞接着作用を有するぺリオスチンのスプライシングバリアントを認識する抗ぺリオスチン抗体であつて、心不全などのべリオスチンが関与する疾患の予防もしくは治療またはこれらの疾患の診断に有用な抗体に関する。

背景技術

[0003] 慢性心不全は、心筋収縮力の低下により、心臓が各臓器へ十分量の血液を拍出できない状態に陥る疾患である。従来、その治療には、心筋収縮力を増加させるジギタリス製剤等の強心剤が使用されてきた。しかし、これらの薬剤は心筋エネルギーの過剰消費により、長期投与においては生命予後を悪ィ匕させることが明らかになつている。そのため、最近では、心不全状態で亢進している交感神経系ゃレニン'アンジォテンシン 'アルドステロン系による心臓への過剰な負荷を軽減させる利尿剤や β遮断薬、アンジォテンシン阻害薬による治療が主流になってきている。しかし、依然として、心不全患者は激しい運動ができないなど日常生活が制限され、生活の質を保つことができず、さらに、心不全患者の生命予後を十分に担保できていないため、生活の質の改善および長期生命予後の改善が可能である有効な新規心不全治療薬の開発が望まれている。

[0004] 一方、ぺリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質の一種であり、分子量約 9万のポリペプチドからなる。各ポリペプチド鎖には、シグナル配列、システィンリッチドメイン、 4回繰り返しドメイン、 C末端ドメインが含まれている。 [0005] ぺリオスチンは、当初、骨芽細胞特異的因子 2 (OSF— 2)と呼ばれ、マウス骨芽細胞株 MC3T3— E1細胞に特異的に発現している遺伝子として分離同定されたが（特許文献 1、非特許文献 1)、後に現在の名称であるべリオスチンと呼ばれるようになり、骨芽細胞における接着促進活性が報告された (非特許文献 2)。

[0006] 初期の研究では、ぺリオスチンは骨組織に特異的に発現する細胞外マトリックスであると考えられていた。しかし、現在では骨組織のみならず心不全 (非特許文献 3、非特許文献 4)、動脈瘤 (非特許文献 5)、高転移性癌 (非特許文献 6、非特許文献 7、非特許文献 8)、子癇前症 (非特許文献 9)等の発症にお、て極めて高く発現しており、また正常糸且織においてもごく僅かであるが発現していることが明らかになつている。また、いくつかのぺリオスチンスプライシングバリアントが骨芽細胞で発現していることも明らかになつている (非特許文献 1、非特許文献 2、非特許文献 10、特許文献 3)

[0007] ぺリオスチンの作用について、細胞接着作用に関しては、 811アミノ酸力成るペリォスチンスプライシングバリアント（図 1における PN— 2に相当）（非特許文献 2)および 782アミノ酸力成るぺリオスチンスプライシングバリアント（非特許文献 11)が細胞接着作用を有すると報告されていた。これに対し、 838アミノ酸カゝら成るぺリオスチンスプライシングバリアント（図 1における PN— 1に相当）は、該ペリオスチンスプライシングノリアントをコーティングしたプレートには心線維芽細胞が接着しないこと、すなわち細胞接着活性を有しな、こと、正常ラットに比べ心不全モデルラットにお、て 838ァミノ酸力も成るぺリオスチンスプライシングバリアント（図 1における PN - 1に相当）の遺伝子発現が有意に増加して、ること、加えてそれが心拡大を惹起させる増悪因子であること、およびこのタンパク質の発現を抑制すると有意に生存率が上昇したことが報告されている（非特許文献 3)。さらに、 838アミノ酸カゝら成るぺリオスチンスプライシングバリアントに対するアンチセンスヌクレオチドを用いて、該ぺリオスチンスプライシングバリアントの発現を抑制することによる心不全の予防剤または治療剤について報告されている (特許文献 2)。

[0008] このように、ぺリオスチン遺伝子の発現が心不全の病態に関連することが示唆されているが、ぺリオスチンスプライシングバリアントの構造と心不全の関連については不明である。そこで、本発明者らは、抗体を用いて心不全病態に関与するべリオスチンの構造を明らかにすることを試みた。

[0009] ぺリオスチン抗体については、ぺリオスチンの細胞遊走阻害に関する抗体 (非特許文献 12)およびべリオスチンによる細胞の増殖抑制活性を有する抗体 (非特許文献 13)が報告されている。しかし、ペリオスチンの細胞接着活性に関与する領域の構造に関する抗体の報告は未だなぐまた、ペリオスチンの細胞接着活性と心不全などの疾患との関係につ、ての報告も何らなされて、な、。

特許文献 1：特開平 5 - 268982号公報

特許文献 2：再公表特許 WO02,020055号公報

特許文献 3 :国際公開 WO2005Z019471号公報

非特許文献 l : Takeshita S. et al.， Biochem J (1993) 294, 271-8

非特許文献 2 : Horiuchi K. et al., J. Bone Miner. Res. (1999) 14, 1239-49 非特許文献 3 : Katsuragi N. et al., Circulation (2004) 110, 1806-13

非特許文献 4 : Wang D. et al., Hypertension (2003) 42, 88-95

非特許文献 5 : Peters DG. et al., Stroke (2001) 32, 1036-42

非特許文献 6 : Shao R. et al., Mol Cell Biol. (2004) 24, 3992-4003

非特許文献 7 : Gonzalez HE. et al., Arch Otolaryngol Head Neck Surg. (2003) 129, 754-9

非特許文献 8 : Sasaki H. et al., Breast Cancer Res Treat. (2003) 77, 245-52 非特許文献 9 : Sasaki H. et al., Am J Obstet Gynecol. (2002) 186, 103-8 非特許文献 10 : Litvin J. et al., J Cell Biochem. (2004) 92, 1044-61

非特許文献 l l : Gillan L. et al., Cancer Res. (2002) 62, 5358-64

非特許文献 12 : Lindner V.et al., Arterioscler Thromb Vase Biol. (2005) 25, 77-83 非特許文献 13 : Tai IT. et al., Carcinogenesis (2005) 26, 908-15

発明の開示

[0010] 本発明の目的は、生活の質の改善および長期生命予後の改善が可能である有効な新規心不全の予防剤または治療剤等を提供することである。詳しくは、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体を提供することである。また、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードする DNA、該 DNAを含有する組換えべクタ一、該組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体ならびに該形質転換体を培養し、該培養物力ゝら該抗体を採取することによる該抗体の製造方法を提供する。さらに、該抗体を含有する抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。さらに、該医薬組成物を患者に投与することからなる抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防または治療方法、ならびに該疾患の診断方法を提供する。

[0011] 本発明者らは、細胞接着活性を有しないペリオスチンスプライシングバリアント (PN

1)が抗細胞接着活性、すなわち接着した細胞を剥離する活性を有することを明らかにし、また、一方、細胞接着活性を有するぺリオスチン (PN— 2)は抗細胞接着活性を有さない、すなわち接着した細胞を剥離しないことを確認した。そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンスプライシングバリアント (PN— 1)と、抗細胞接着活性を示さないぺリオスチン (PN— 2)において、その構造と細胞接着における活性の相違に注目し、抗細胞接着活性を有するぺリオスチンスプライシングバリアントに特異的に存在する領域を阻害することにより、抗細胞接着活性を有するペリオスチン関連疾患の予防または治療が可能であると考えた。つまり、該領域に対する阻害物質力抗細胞接着活性を有するペリオスチン関連疾患の予防または治療剤として有用であると考えた。

[0012] 心不全時に発現が亢進するぺリオスチンスプライシングバリアントを調べた結果、スプライシングバリアントが形成される C-末端ドメインは、 exon (ェクソン） 15から 23で構成されているが、ラットでは、下記（1)から (4)が存在することが明らかとなった。

(1)全てを保持して、るもの（PN— 1と呼ぶ；配列番号 1として示す 838アミノ酸力もなる； cDNA配列を配列番号 6として示す）、

(2) Exon— 17が欠失しているもの（PN— 2と呼ぶ；配列番号 5として示す 811アミノ酸力なる； PN— 1から配列番号 3で示される 27アミノ酸 (Exon— 17)が欠失しているもの； cDNA配列を配列番号 7として示す）、

(3) Exon— 21が欠失して!/、るもの（PN— 3と呼ぶ； 810アミノ酸力もなる）、

(4) Exon— 17と Exon— 21が欠失して!/、るもの（PN— 4と呼ぶ； 783アミノ酸からなる )

また、ラット以外でも、マウス及びヒトについて PN— 1及び PN— 2が見出されている（マウス PN— 1：配列番号 8 (アミノ酸配列）、配列番号 9 (cDNA配列）；マウス PN— 2：配列番号 10 (アミノ酸配列）、配列番号 11 (cDNA配列）；ヒト PN— 1 :配列番号 12 (c DNA配列）；ヒト PN— 2 :配列番号 13 (アミノ酸配列）、配列番号 14 (cDNA配列））。そして、これらのうち、ラットの心肥大糸且織では PN— 1が多く発現しており、 PN—2および PN— 3の発現量は少なかった。そこで、本発明者らは、？？^ー^？？^ー？の構造上異なる部位であり、 PN— 1のみに存在する Exon— 17部位の阻害物質として、該部位がコードするアミノ酸配列部分を特異的に認識する抗体の作製を検討した。

[0013] 抗体を作製するためには、免疫原として用いる物質が親水性であることが必要であり、また、タンパク質のような大きなポリペプチドの一部分を用いて抗体を作製する際には、免疫原として使用する部分が、該タンパク質の表面に出ており、ェピトープ部分を構成していることが必要である。そこで、 Exon— 17ペプチド鎖を抗原として用いることの可能性を検討するために、最初に、バイオインフォマティクス分野で汎用されている accelrys社のソフト、 Mac Vector 7.2を使用してェピトープ検索を行なった。その結果、 "親水性（Hydrophilicity) "、 "表面への露出のしゃすさ（Surface Probability) "および"抗原性（Antigenicity) "から見て、 Exon— 17領域の TTKIITKLVEPKIKVIQ GSLQPIIKTE (配列番号 3)は殆どが疎水性領域であり、タンパク質分子の表面に出ている可能性が非常に低いことが示唆され、抗原性を有しておらず、抗体が作製できないと考えられ、実際に抗体を作製することは困難であることが予想された。

[0014] し力しながら、本発明者らは、 PN—1の機能を特異的に阻害するためには、 PN— 1に特異的に存在する Exon— 17がコードするペプチド領域に対する抗体の使用が最適であるとの考えのもと、 Exon— 17がコードするアミノ酸配列に対する抗体の作製を遂行した。 Exon— 17領域がコードするペプチドを構成する 27アミノ酸力もなるペプチドを合成し、ゥサギに免疫させ、得られた血清から IgG画分を精製し、抗 Exon — 17ペプチドポリクローナル抗体を作製した。次に 80%コンフルェントに培養した心線維芽細胞にぺリオスチンタンパク質 PN— 1を添加すると、ほぼ 100%の細胞の脱離 (すなわち、抗細胞接着活性)が観察された。この実験系に抗 Exon— 17ペプチド抗体を投与した結果、ぺリオスチンタンパク質 PN— 1による細胞の脱離を抑制したことから、該抗 Exon— 17ペプチド抗体はぺリオスチンタンパク質 PN— 1に対する中和活性を持つ抗体で有ることが明らかとなった。次に、急性心筋梗塞モデルラットを作製し、抗 Exon— 17ペプチド抗体を週に一度投与し続けたところ、モデル作製後 4週間で心臓の拡大が有意に抑えられ、また心機能が改善されることが明らかとなった。さら〖こ、モデル作製後 8週間でも、上述の効果が持続すること、および心線維化が抑制されることが明ら力となった。これにより、抗 Exon— 17ペプチド抗体が心不全病態の進行とともに起こる心拡大および心線維化を抑制する活性、ならびに心機能を改善させる活性を持つ抗体であることが明らかとなり、本発明を完成するに至った。

[0015] 本発明は、前記の課題を解決するものとして、心不全時等の心臓に特異的に発現する抗細胞接着活性を有するぺリオスチンに対する抗体、特に該ぺリオスチンスプライシング部位を抗原とする抗体を提供するものである。

[0016] すなわち、本発明としては、以下を挙げることができる。

(1)抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体。

(2)配列番号 1または配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンに対する抗体。

(3)配列番号 3または配列番号 4で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンに対する抗体。

(4)配列番号 34で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンに対する抗体。

(5)抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域に対する抗体。

(6)配列番号 3もしくは配列番号 4で示されるアミノ酸配列またはその一部力なるぺプチドに対する抗体。

(7)配列番号 34で示されるアミノ酸配列、或いはその一部のアミノ酸配列を有するぺプチドに対する抗体。

(8)抗体が、配列番号 3または配列番号 4で示されるアミノ酸配列、或いはその一部の部位を特異的に認識する抗体である、 (1)〜（7)の、ずれかに記載の抗体。

(9)抗体が、配列番号 34で示されるアミノ酸配列、或いはその一部の部位を特異的に認識する抗体である、 (1)〜（7)のいずれかに記載の抗体。

(10)配列番号 26で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体。

(11)抗体が、抗細胞接着活性を中和する能力を有する抗体である、（1)〜（10)のいずれかに記載の抗体。

(12)抗体力ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、（1)〜（11)のいずれかに記載の抗体。

(13)抗体力モノクローナル抗体である、（12)のいずれかに記載の抗体。

(14)ハイプリドーマ細胞株 FERM BP— 10718により産生される抗体。

(15) (13)に記載のモノクローナル抗体の部分断片からなる抗体断片。

(16) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体又は（15)に記載の抗体断片と、蛋白質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。

(17) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体を産生するノ、イブリドーマ。

(18)ハイプリドーマ細胞株 FERM BP— 10718である、（17)に記載のハイプリドーマ。

(19) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、（15)に記載の抗体断片又は（16)に記載の抗体又は抗体断片と蛋白質が結合している誘導体をコードする DNA。

(20) (19)に記載の DNAを含有する組換えベクター。

(21) (20)に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。

(22) (21)に記載の形質転換体を培養し、培養物中に（1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、 (15)に記載の抗体断片もしくは（16)に記載の抗体又は抗体断片と蛋白質が結合している誘導体を生成させ、該培養物から該抗体、該抗体断片、もしくは抗体又は抗体断片と蛋白質が結合している誘導体を採取することを特徴とする、抗体、抗体断片もしくは抗体又は抗体断片と蛋白質が結合している誘導体の製造方法。

(23) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、（15)に記載の抗体断片又は（16)に記載の誘導体を含有する医薬組成物。

(24) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、（15)に記載の抗体断片又は（16)に記載の誘導体を含んでなる、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬糸且成物。 (25)前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、腎炎、膝炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である、 (24)に記載の医薬組成物。

(26) (23)の医薬組成物を患者に投与することからなる、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防または治療方法。

(27)前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、腎炎、膝炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である、 (26)に記載の予防または治療方法。

(28) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、（15)に記載の抗体断片又は（16)に記載の誘導体を用いて、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を診断する方法。

(29)前記抗体が標識ィ匕抗体である、 (28)に記載の診断方法。

(30)前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、腎炎、膝炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である、（28)または（29)に記載の診断方法

(31)標識ィ匕された、（1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、（15)に記載の抗体断片又は（16)に記載の誘導体。

(32) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、（15)に記載の抗体断片又は（16)に記載の誘導体を用いて、サンプル中の抗細胞接着活性を有するぺリオスチンを定量する方法。

(33) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、（15)に記載の抗体断片又は（16)に記載の誘導体を用いて、サンプル中の抗細胞接着活性を有するぺリオスチンを検出する方法。

(34) (1)〜（14)のいずれかに記載の抗体、（15)に記載の抗体断片又は（16)に記載の誘導体を含む、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の診断薬。

[0017] また、本願発明にお、て「配列番号〇で示されるアミノ酸配列」 t 、う場合、そのアミノ酸配列のうち、 1又は数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されている場合も包含する。

図面の簡単な説明

[0018] [図 1]図 1は、ラットのペリオスチンのスプライシングノリアントを示す模式図である。

[図 2]図 2は、ラット PN— 1の抗細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例 2)。

[図 3]図 3は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体のラット PN— 1活性阻害について測定した結果を示す図である（実施例 3)。

[図 4-1]図 4一 1は、急性心筋梗塞モデル作成後 4週間後における抗ラット Exon— 1 7ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 4：前壁厚、後壁厚)。

[図 4-2]図 4一 2は、急性心筋梗塞モデル作製後 4週間後における抗ラット Exon— 1 7ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 4：拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能)。

[図 4- 3]図 4一 3は、急性心筋梗塞モデル作製後 4週間後における抗ラット Exon— 1 7ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 4：心拍数、梗塞エリア)。

[図 5-1]図 5— 1は、急性心筋梗塞モデル作製後 8週間後における抗ラット Exon— 1 7ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 4：前壁厚、後壁厚)。

[図 5- 2]図 5— 2は、急性心筋梗塞モデル作製後 8週間後における抗ラット Exon— 1 7ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 4：拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能)。

[図 5- 3]図 5— 3は、急性心筋梗塞モデル作製後 8週間後における抗ラット Exon— 1 7ペプチド抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 4：心拍数、梗塞ヱリア)。 [図 6-1]図 6— 1は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例 4： LVP、心拍数)。

[図 6-2]図 6— 2は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例 4： ( + ) dP/d (一 ) dP/dt)。

[図 6-3]図 6— 3は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの血行動態を示す図である（実施例 4 : SBP、 DBP、 LVEDP) ₀

[図 7]図 7は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの組織学的に検討した結果を示す図である（実施例 4)。

[図 8]図 8は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの心筋細胞の短軸径を示す図である（実施例 4)。

[図 9-1]図 9— 1は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例 4： G3PDH)。

[図 9-2]図 9— 2は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例 4 : ET— 1ZG3、 Angiotensinoge nZG3)。

[図 9-3]図 9— 3は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例 4 : a -MHC/G3, β MHCZ G3)。

[図 9-4]図 9— 4は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例 4: Col—lZG3、 Col—mZG3)。

[図 9-5]図 9— 5は、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体によって処置したモデルラットの遺伝子発現解析の結果を示す図である（実施例 4:TGF— β ZG3、 TNF- a /G 3)。

[図 10]図 10は、ヒト PN— 1の抗細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例 15)。

[図 11]図 11は、抗ヒト Exon - 17モノクローナル抗体のヒト PN - 1活性阻害につ!/、て測定した結果を示す図である（実施例 16)。

[図 12- 1]図 12— 1は、急性心筋梗塞モデル作製後 4週間後における抗ヒト Exon— 1 7モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 1 7 :前壁厚、後壁厚)。

[図 12- 2]図 12— 2は、急性心筋梗塞モデル作製後 4週間後における抗ヒト Exon— 1 7モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 1 7 :拡張末期心内径、収縮末期心内径、心機能)。

[図 12- 3]図 12— 3は、急性心筋梗塞モデル作製後 4週間後における抗ヒト Exon— 1 7モノクローナル抗体による心拡大の抑制を測定した結果を示す図である（実施例 1 7 :心拍数、梗塞エリア)。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 1つの態様において、本発明は、抗細胞接着活性を有するぺリオスチンに対する抗体を提供する。ここで、ぺリオスチンは、細胞外マトリックスの一種であり、いくつかのスプライシングバリアントの存在が知られており、そのいくつかは、心不全時等の心臓に特異的に発現する。心不全時等の心臓に特異的に発現するぺリオスチンスプライシングバリアントの機能を阻害する物質、すなわち阻害剤として、本発明においては、特異性が高い、ヒトへの安全性が高い、などの理由から、抗体を使用できる。本発明では、心不全時等の心臓に特異的なスプライシングバリアントが形成される C-末端ドメインの Exon— 17領域がコードするアミノ酸配列からなるペプチドをィ匕学合成したものを抗原として、抗体を作製できる力係るペプチドは、ぺリオスチンタンパク質の酵素消化や遺伝子工学的手法などによっても得られ、その由来は問わない。

[0020] 本発明におヽて、「抗細胞接着活性を有する」とは、接着してヽる細胞を剥離若しくは脱離させる作用を有することである。また、「抗細胞接着活性を有さない」とは、接着している細胞を剥離若しくは脱離させることがないことであり、この時、細胞は接着状態を維持することとなる。抗細胞接着活性の有無は、心線維芽細胞などの細胞を培養プレートで培養して該細胞を培養プレートに接着させた後、検定用試料を添カロして培養、洗浄して剥離した細胞を除去した後に、残存している細胞を染色し、接着していた細胞の残存状態を確認することにより、判断することができる。

[0021] また、本発明において、抗細胞接着活性を有するぺリオスチンとしては、好ましくは、配列番号 1 (ラットぺリオスチン PN— 1、 838アミノ酸）、配列番号 2 (ヒトぺリオスチン PN— 1、 836アミノ酸：ラットぺリオスチンよりも N末端のシグナル配列が 2アミノ酸少ない）、または配列番号 8 (マウスべリオスチン PN— 1)のアミノ酸配列力なるぺリオスチンを挙げることができる。また、抗細胞接着活性を有するペリオスチンとして、配列番号 3 (ラットぺリオスチンの Exon— 17がコードする 27アミノ酸）、配列番号 4 (ヒトペリォスチンの Exon— 17がコードする 27アミノ酸）または配列番号 21 (マウスペリオスチンの Exon— 17がコードする 27アミノ酸)で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンを挙げることもできる。さらに、配列番号 22 (ヒトぺリオスチンの Exon— 17がコードするアミノ酸配列の N末端から 1番目から 9番目、 9アミノ酸）、配列番号 23 (ラットペリォスチンの Exon— 17がコードするアミノ酸配列の N末端から 1番目から 9番目、 9アミノ酸）、または配列番号 24 (マウスべリオスチンの Exon— 17がコードするアミノ酸配列の N末端から 1番目から 9番目、 9アミノ酸)で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンを挙げることができる。さらに、配列番号 34 (ヒトぺリオスチンの Exon— 17がコードするアミノ酸配列の N末端から 1番目から 6番目、 6アミノ酸)で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンを挙げることができる。

[0022] ぺリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域としては、例えば Exon— 17のスプライシング部位を挙げることができる。具体的には、例えば、配列番号 1で示されるァミノ酸配列を有するぺリオスチンの配列番号 3で示されるアミノ酸配列部分 (配列番号 1の 672〜698アミノ酸）、配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンの配列番号 4で示されるアミノ酸配列部分 (配列番号 2の 670〜696アミノ酸）、配列番号 8で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンの配列番号 21で示されるアミノ酸配列部分 (配列番号 8の 672〜698アミノ酸）が挙げられ、さらに、配列番号 22または配列番号 23で示されるアミノ酸配列、並びに配列番号 34 (配列番号 22または配列番号 23 で示されるアミノ酸配列、並びに配列番号 22または配列番号 23の N末端アミノ酸残基 1番目から 6番目のアミノ酸配列）が挙げられる。

[0023] 本発明の好ましい態様において、「抗細胞接着に関与する部位を特異的に認識できる」とは、好適には、上記の Exon— 17のスプライシング部位を含むぺリオスチンの抗細胞接着に関与する領域を特異的に認識できることを意味する。例えば、ペリオスチンの抗細胞接着に関与する部位を特異的に認識できる抗体としては、配列番号 1 で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンの配列番号 3で示されるアミノ酸残基部分 (配列番号 1の 672〜698アミノ酸）、配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンの配列番号 4で示されるアミノ酸残基部分 (配列番号 2の 670〜696アミノ酸 )、配列番号 8で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンの配列番号 21で示されるアミノ酸残基部分 (配列番号 8の 672〜698アミノ酸）、またはその一部に対する抗体を好適〖こ挙げることができる。さらに、配列番号 22または配列番号 23で示されるアミノ酸配列、或いはその一部を有するポリペプチドに対する抗体を挙げることができる。さらに、配列番号 22または配列番号 23の N末端アミノ酸残基 1番目から 6番目のアミノ酸配列（配列番号 34)を有するぺリオスチンに対する抗体を挙げることができる。

[0024] 「ペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域を阻害する」とは、上述の「ペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域」が有する作用な！/ヽし活性を阻害することであり、具体的には、例えば、上述の抗細胞接着活性に関与する部位を特異的に認識できる抗体を用いて、ぺリオスチンの有する作用な、し活性を阻害することである。

[0025] 1つの態様において、本発明の抗体は、上記のような抗原を用いて得られるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体である。ここで、「モノクローナル抗体」とは、前述の抗原に反応性を有する任意のモノクローナル抗体であって、「モノクローナル抗体」には、前記の抗原を、マウス、ラット、ノ、ムスター、モルモットあるいはゥサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクローナル抗体（キメラ抗体)及びヒトイヒモノクローナル抗体（ヒト化抗体； CDR-g rafted抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジエニック動物等を用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体 (ヒト抗体)も包含される。また、本発明の抗体は、 IgG (lgGl,IgG2, IgG3,IgG4)、 IgM、 IgA、 IgDあるいは IgE等のいずれのアイソタイプを有するモノクロ一ナル抗体をも包含する。好ましくは、 IgG (IgGl,IgG2,IgG3,IgG4)または IgMである。

[0026] 抗原に上記ペプチドを用いる場合には、それ自身抗原として用いることも可能である力抗原性を高めるために、上記ペプチドをポリビュルピロリドン、ラテックス、ポリメチルメタタリレートなどの巨大分子の物質に吸着させて免疫する方法、 KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin:スカシ貝へモシァニン）や BSA (牛血清アルブミン）などのキヤリァー蛋白に結合して用いる方法等があり、 V、ずれの方法をも使用することができる。一般的にはペプチドをキヤリヤー蛋白に結合して用いる方法が好ましぐ結合方法は公知の方法を用いることができる（例えば、「続医薬品の開発、 14卷、廣川書店、 199 1」）。ペプチドはキャリアー蛋白と結合させて方向性を持たせるために、ペプチドの C 末端または N末端にシスティン基を導入し、システィン基を介してキャリアー蛋白と結合させる方法が用いられる。この目的に合った結合方法であれば当技術分野において一般に用いられている架橋剤を用いることができる。スクシンィミジル一 4— (N—マレイミドメチル）シクロへキサン一 1 カルボキシレート（以下「SMCC」と略す）や 3 マレイミドベンゾイツクアシッド一 N ヒドロキシサクシンイミドエステル（MBS)などが適している。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタインによる細胞融合法 (G.Kohler et al Nature (1975) 256,495-7)により作製されたハイブリドーマを培養して分泌させ、その培養液力も分離することにより調製される。すなわち、 Exon— 17がコードするアミノ酸配列を有するペプチド等で哺乳動物を免疫した後、この動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させハイプリドーマを得る。 Exon— 17に結合する抗体を産生するハイプリドーマの検索は、例えばノ、イブリドーマ上清について抗原を固定したマイクロプレートを用いる酵素免疫測定法 (以下「ELISA」と略す）によって行われる。免疫に使用する動物としては特に制限はなぐ各種の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、ネコ、ィヌ等を使用することができる。モノクローナル抗体の作製には、上記の免疫動物のうち、取扱い易さ等の理由により一般には Balb/cマウスが用いられる力他の系統のマウスを使用することもできる。その際、免疫に用いる抗原の濃度は、十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選択し、好ましくは 1〜： LOO /z gの抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、フロイント完全アジュバントある、はフロイント不完全アジュバント等の懸濁液とし、動物に腹腔内注射または皮下注射などによって投与する。投与は 2〜4週毎に 1〜数回行う。最終免疫は通常 1〜： LOO /z gの抗原を添加した生理食塩溶液を静脈注射または皮下注射などにより投与して行われる。最終免疫の数日後に細胞融合のため免疫した動物から抗原産生細胞、例えばリンパ球、好ましくは脾臓細胞またはリンパ節細胞を取り出す。次に、抗体産生細胞として脾臓細胞を用いた場合について説明する力脾臓細胞以外の抗体産生細胞も同様に細胞融合に供し得る。細胞融合は、最終免疫 3〜4日後に無菌的に取り出した脾臓力調製した脾臓細と適当なミエローマ細胞を融合促進剤の存在下で細胞融合させる。融合に用いるミエローマ細胞は、哺乳動物からのものでよいが、一般には、免疫に用いた動物と同じ種の動物に由来するものが好適であり、既に公知の種々の細胞株、例えばマウスでは SP2/0-Agl4(SP2) [[Nature, 276, 269(1978)]、 NS- 1- Ag4/1 (NS- 1)、 P3- X63Ag8U.l (P3U1) [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1— 7(1978) :ATCCから入手可、 ATCC No. CRL— 1597]、 P3— NS1- 1- Ag4- 1、 P3- X63Ag8 (P3)、 FO、 X63Ag8.653 (X63.653)、 210.RCY3.Agl.2.3、 S194/5XXO.BU1, SKO_007、 GM15006TG-A12等が好適に使用され、ラットでは Y3. Agl.2.3等が好適に使用される。好ましい融合促進剤として例えば、平均分子量が 10 00〜6000のポリエチレングリコール（PEG)のほかセンダイウィルスも使用できる。融合時の脾臓細胞とミエローマ細胞の混合比率は、一般に 10 : 1〜2： 1の範囲が好ましい。

融合した細胞よりハイプリドーマの分離は、未融合の脾臓細胞、未融合のミエローマ細胞及び融合した細胞の混合物を未融合のミエローマ細胞が生存できない選択培地で、未融合の細胞が死滅するまでの適当な時間 (約 1週間)培養することにより行える。選択培地は、例えば HAT培地 (ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）が使用される。この選択培地中では、未融合のミエローマ細胞は死滅し、また未融合の脾臓細胞は、非腫瘍性細胞であるので、一定期間後 (約 1週間後)死滅するので、生育できる細胞を選択することによりハイプリドーマを得ることができる。目的の抗体を産生するハイブリドーマは、通常の限界希釈法によって、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローンィ匕が行える。このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、生育に適した培地中で生育でき、また超低温冷凍庫や液体窒素中などで容易に長期に保存が可能である。このようにして得られたハイプリドーマは、栄養培地中あるいは哺乳動物の腹腔内で増殖させることにより抗体を産生させることができ、産生した抗体は培養上清あるいはその哺乳動物の腹水または血清力も精製することができる。本発明のハイプリドーマとしては、例えば、平成 18年 11月 1日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに FERM BP— 10718として寄託されているハイプリドーマを使用することができる。抗体の精製は、遠心分離、透析、硫酸アンモ-ゥム等による塩析、 DEAE力ラム等によるイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、ァフィユティークロマトグラフィ一などの一般的な単離、精製方法を用いて行うことができる。力べして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはォクテル口-一（Ouchterlony)法、 ELISA法、または RIA法が挙げられる。ォクテル口-一法は簡便ではある力モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、 ELISA法または RIA法を用いる場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種ィムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のァイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット (例えば、マウスタイパーキット;バイオラッド社製)等を利用することもできる。さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び 280nmにおける吸光度 [1.4 (OD280) =ィムノグロブリン lmg/ml]より算出する方法により行うことができる。この様にして得られた本発明のモノクローナル抗体は、配列番号 1または配列番号 2で示されるアミノ酸配列、配列番号 3または配列番号 4で示されるアミノ酸配列、配列番号 34で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチン (PN— 1)、配列番号 3 または配列番号 4で示されるアミノ酸配列力なるペプチド、または配列番号 34で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、アミノ酸配列 YTTKIITKW (配列番号 26)力もなるペプチド、すなわちヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号 4)における N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列力なるペプチド、およびヒトぺリオスチン PN— 1のアミノ酸配列（配列番号 2)における N末端力も 669 番目のチロシンから 679番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識して結合することができる。すなわち、ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号 4)の N末端のスレオニンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列部位 (TTKIITKW；配列番号 22)或ヽはその一部を特異的に認識することができる。さらに好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトぺリオスチン Exon— 17 ペプチド鎖（配列番号 4)の N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKW;配列番号 26)力なるペプチドにおいて、 Ν末端から 1 番目および 8〜10番目のアミノ酸をァラニンに置換したペプチドを認識して結合することができる。すなわち、ヒトぺリオスチン Εχοη— 17ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号 4)またはラットぺリオスチン Εχοη— 17ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号 3) の少なくとも Ν末端から 1番目のトレオニンから 6番目のトレオニンまでのアミノ酸配列部位 (配列番号 34)またはその一部を特異的に認識することができる。さらに、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトぺリオスチン 1タンパク質の抗細胞接着作用を抑制または阻害する、すなわちヒトぺリオスチン— 1タンパク質の抗細胞接着作用を中和する活性を有する。さらに、心不全時等に引き起こされる心拡大、心肥大および心線維化を抑制し、心機能を改善させることができる。

本発明の抗体としてポリクローナル抗体を使用する場合、ポリクローナル抗体は通常行われている方法、例えば「日本生化学会編、新生化学実験講座 12、東京化学同人、 1992」記載の方法によって得ることができる。免疫動物としては、特に限定されるものではないが、馬、山羊、羊、ゥサギ、モルモット、マウス、 -ヮトリなどが挙げられる。免疫動物としてゥサギを用いる場合には、抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントまたは水酸ィ匕ァルミ-ゥムアジュバントなどの懸濁液とし、 10〜1000 _§7回7匹を注射し、さらに 2〜 4週間後に追加免疫注射を 1〜3回行い、抗血清を得る。注射は多数箇所の皮下に行うのが好ましい。抗血清力ポリクローナル抗体の調製は、上記モノクローナル抗体の精製と同様の方法で行うことができる。この様にして得られた本発明のポリクローナル抗体は、配列番号 1または配列番号 2で示されるアミノ酸配列、配列番号 3または配列番号 4で示されるアミノ酸配列、配列番号 34で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチン (ΡΝ— 1)、配列番号 3または配列番号 4で示されるアミノ酸配列力なるペプチド、または配列番号 34で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明のポリクローナル抗体は、アミノ酸配列 YTTKIITKW( 配列番号 26)からなるペプチド、すなわちヒトぺリオスチン Εχοη— 17ペプチド鎖のァミノ酸配列（配列番号 4)における Ν末端から 1番目のチロシンから 9番目のパリンまでのアミノ酸配列からなるペプチド、およびヒトぺリオスチン ΡΝ— 1のアミノ酸配列（配列番号 2)における N末端から 669番目のチロシンから 679番目のバリンまでのァミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識して結合することができる。すなわち、ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号 4)の N末端のスレオニンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列部位（TTKIITKW;配列番号 22)或いはその一部を特異的に認識することができる。さらに好ましくは、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトぺリオスチン Exon 17ペプチド鎖（配列番号 4)の N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKW;配列番号 26)力なるペプチドにおいて、 N末端から 1番目および 8〜 10番目のアミノ酸をァラニンに置換したペプチドを認識して結合することができる。すなわち、ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号 4)またはラットぺリオスチン Exon— 17ぺプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号 3)の少なくとも N末端から 1番目のトレオニンから 6 番目のトレオニンまでのアミノ酸配列部位 (配列番号 34)またはその一部を特異的に認識することができる。さらに、本発明のポリクローナル抗体は、ヒトぺリオスチン一 1タンパク質の抗細胞接着作用を抑制または阻害する、すなわちヒトぺリオスチン— 1タンパク質の抗細胞接着作用を中和する活性を有する。さらに、心不全時等に引き起こされる心拡大、心肥大および心線維化を抑制し、心機能を改善させることができるヒト型抗体の作製

免疫グロブリン G (以下、単に「IgG」という。）は、分子量約 23000の軽ポリペプチド鎖 (以下「軽鎖」と!、う）、分子量約 50000の重ポリペプチド鎖（以下「重鎖」と、う）の各 2 本ずつから構成される。重鎖、軽鎖とも約 110残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を持ち、これらは IgGの 3次元構造の基本単位 (以下、「ドメイン」という。）を構成する。重鎖および軽鎖は、それぞれ連続した 4個、および 2個のドメインカゝら構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、ァミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きぐこのドメインは可変ドメイン (variable domain:以下、「Vドメイン」という。）と呼ばれる。 IgGのァミノ末端においては、重鎖、軽鎖の Vドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウス IgGの定常領域はヒ HgGの定常領域とは異なつているので、マウス IgGはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体 (Human Anti Mouse Antibody：以下「HAMA」と!、う。 )応答が起こる（Sc hroff RW. et al Cancer Res. (1985)45,879-85)。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したまま HAMA応答を起こさなヽように抗体分子を修飾する必要がある。 X線結晶構造解析の結果によれば、一般に、このようなドメインは 3本から 5本の β鎖からなる逆平行 ι8シートが二層重なり合った長円筒状の構造をとる。可変領域では、重鎖、軽鎖の Vドメインそれぞれにっき各 3個のループが集合し、抗原結合部位を形成する。この各ノレープは相ネ性決定領域（complementarity determining region:以下、「CDR 」という。）と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域の CDR以外の部分は、一般に、 CDRの構造を保持する役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。カバトらは、重鎖、軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、配列の保存性に基づき、それぞれの一次配列を CDRおよびフレームワークに分類した表を作成した（Kabatt et a 1. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E.A.)。また、各フレームワークは、アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さらに、ヒトとマウスの間で対応するフレームヮークが存在することも見、だされた。このような IgGの構造的特徴に関する研究力も以下のヒト化抗体の作製法が考案された。研究初期の段階では、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提案された (Morrison SL. et al Pr oc Natl Acad Sci U S A. (1984)81,6851-5)。し力し、そのようなキメラ抗体は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むので、特に長期間投与した場合には HAMA応答を誘導しうる（Begent et al., Br. J. Cancer, (1990)62, 487)。

ヒトに対し HAMA応答を発現する可能性のある、非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸残基を更に少なくする方法として、 CDR部分のみをヒト由来の抗体に組み込む方法が提案された（Peter T et al. Nature, (1986) 321, 522- 5)が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活性を保持するには CDRのみの移植では不十分であった。一方、チヨッチアらは、 1987年、 X線結晶構造解析データを用い、（a) CDRのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位と CDR自体の構造を維持する部位とが存在し、 CDRの取り得る三次元構造は、複数の典型的なパターン (カノ-カル構造）に分類されること、 (b)カノ-カル構造のクラスは、 CDRのみならずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした（Chothia C. et al. J. Mol. Biol. (1987)196, 901-17)。この知見に基づき、 CDR移植法を用いる場合、 CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された（特表平 4-502408号)。一般に、移植すべき CDRを有する非ヒト哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、 CDRが移植される側のヒト抗体は「ァクセプター」と定義され、 CDR移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限り CDRの構造を保存し、免疫グロブリン分子の活性を保持することにある。この目的を達成するためには、（a)ァクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべき力、及び、（b)ドナーのフレームワーク力もいずれのアミノ酸残基を選択すべき力の 2点に留意する必要がある。

[0031] クィーンらは、ドナーのフレームワークのアミノ酸残基力以下の基準の少なくともひとつに該当する場合、 CDR配列とともにァクセプターに移植するデザインの方法を提唱した（特表平 4-502408号）：

(a)ァクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナ一の対応するアミノ酸がァクセプターの前記位置において普通であること

(b)該アミノ酸が CDRのひとつのすぐ近くであること

(c)該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいて CDRの約 3A以内に側鎖原子を有し、そして抗原とまたはヒト化抗体の CDRと相互作用することができると予想されること。

[0032] 本発明の抗 Exon— 17モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードする DNAは、上記抗 Exon— 17モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞より mRNAを調製し、該 mRNAを逆転写酵素で cDNAに変換してから、該抗体の重鎖または軽鎖をコードする DNAをそれぞれ単離することにより得ることができる。

[0033] ヒト抗体の作製

本発明における「ヒト抗体」ある、は「ヒト免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンを構成する H鎖の可変領域 (VH)及び H鎖の定常領域 (CH)並びに L鎖の可変領域 (VL) 及び L鎖の定常領域 (CL)を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するィムノグロブリンである。換言すれば、 H鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、軽鎖がヒト免疫グロプリン軽鎖遺伝子に由来するものである抗体を意味する。ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジエニックマウスは、既報 (Mendez MJ et al.Nature Genetics(1997)15, 146-56, Green LL et al. N ature Genetics(1994)7, 13-21,表平 4- 504365号公報；国際出願公開 W094/25585 号公報；日経サイエンス、 6月号、第 40〜第 50頁、 1995年； Nils Lonberg et al. Nature (1994) 368, 856-9,及び特表平 6-500233号公報）に記載の方法に従って作製することがでさる。

[0034] 本発明で使用される抗体は、抗体の分子全体に限らず、抗細胞接着活性を有するペリオスチンの該活性を阻害 (抑制）するものであれば、抗体の断片または誘導体であってもよい。

[0035] 抗体断片としては、例えば、 Fab, F(ab')、 Fv、一本鎖抗体 (_scFv)、ジスルフイド安

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定化抗体 (dsFv)、 CDRを含有するペプチド等を挙げることができる。

[0036] 本発明の抗体断片のうち Fab、 F(ab')等は、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害

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する抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理して得ることができ、また、得られた抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。

[0037] 本発明の抗体断片のうち scFvは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域を、適当なペプチドリンカ一等を用いて連結し、作製することができる。また、上記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする遺伝子、および L鎖または L鎖 V領域をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。

[0038] 本発明の抗体断片のうち dsFvは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリペプチドを該システィン残基間でジスルフイド結合を介して結合させた抗体断片であり、システィン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測により選択することができる。該抗体断片をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。

[0039] 本発明の抗体断片のうち CDRを含有するペプチドは、ぺリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体の H鎖または L鎖の CDR領域のうち、少なくとも 1つの CDR領域以上を含んで構成される。また複数の CDR領域を適当なペプチドリンカ一を介する等の方法により結合させてもよい。該 CDRを含有するペプチドは、これをコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。また、 Fmoc法または tBoc法等の化学合成によっても作製できる。

[0040] また、本発明では、上述の抗体または抗体断片に、蛋白質または低分子化合物を結合させた誘導体を使用することができ、これら修飾は、公知の方法で行うことができる。

[0041] 本発明の抗体、抗体断片および該抗体または該抗体断片が蛋白質と結合している誘導体をコードする DNAは、常法により決定することができる。また、常法により、該 DNAを含有する組換えベクターを作製し、該組換えベクターを常法により宿主細胞に導入することにより形質転換体を作製することができる。さらに、常法により、該形質転換体を培養し、培養物中に抗体、抗体断片、および抗体または抗体断片と蛋白質が結合している誘導体を生成させ、該培養物から抗体、抗体断片、および抗体または抗体断片と蛋白質が結合している誘導体を採取することにより、抗体、抗体断片、および抗体または抗体断片と蛋白質が結合している誘導体を製造することができる

[0042] 1つの態様にぉ、て、本発明の抗体、抗体断片又は誘導体は、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を予防または治療するために使用することができる。抗細胞接着活性を有するぺリオスチンが関与する疾患とは、疾患の病態時に抗細胞接着活性を有するペリオスチンの遺伝子の発現が高ぐ該遺伝子によりコードされる蛋白質の産生が増加している疾患である。また、該遺伝子または蛋白質の増加により、病態が悪ィ匕する疾患のことである。このような抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患としては、特に限定されるものではないが、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しょう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、腎炎 (急性及び慢性)、脾炎 (急性及び慢性)、肝炎 (急性及び慢性)、肝線維症または肺線維症を挙げることができる。また、本発明の抗体を適用できる癌としては、これに限定されるものではないが、例えば、乳癌、大腸癌、肺癌、悪性黒色腫、骨癌、脾臓癌、胃癌、皮膚癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、結腸癌、子宮癌、卵管癌、食道癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、及び腎臓癌を挙げることができ、特に好適には、乳癌、大腸癌、肺癌、及び悪性黒色腫を挙げることができる。

[0043] 本発明はまた、上記の抗体をマーカー標識することにより作製した心不全などの抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の診断薬である。ここでマーカ一としては、酵素、放射性同位元素、蛍光色素等を用いることができる。ここで用いる酵素としては、ターンオーバー数 (turn over number)が大きぐかつ酵素と結合しても安定であること、基質と特異的に反応して発色させることができる等の条件を満たす物であれば特に制限されるものではなぐ通常の酵素免疫アツセィ (EIA)に用いられる酵素を使用することができる。好ましい酵素の例としては、ペルォキシダーゼ、 j8 - ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースォキシダーゼ、ァセチルコリンエステラーゼ、グルコース 6—リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。

[0044] これら酵素と抗体との結合は、マレイミドィ匕合物等の架橋剤を用いる公知の方法により行うことができる。基質としては、使用する酵素に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルォキシダーゼを使用する場合には、 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフエノール等を用いることができる。マーカーとして用いる放射性同位元素としては、 1251や 3H等の通常のラジオィムノアッセィ（RIA)で用いられて!/、るものを使用することができる。蛍光色素としては、フルォレツセンスイソチオシァネート（FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネート (TRITC)等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、本診断薬は、不全心間質を特異的に染色することが可能な、免疫組織学的染色として使用することができる。また、放射性同位体を標識した場合には、体内に投与することによって、心不全時の病変部を画像ィ匕するために使用することもできる。

[0045] 本発明はまた、本発明の抗体、抗体断片又は誘導体を用いることによる、ヒト又は動物の血液力血清を調製した生体試料のサンプル中、すなわち血清中における抗細胞接着活性を有するぺリオスチンを検出または定量する方法であり、さらに検出又は定量することによる心不全などの抗細胞接着活性を有するぺリオスチンが関与する疾患の診断方法である。本方法において、いわゆるサンドイッチ ELISA法 (Enzy me-linked immunosorbent assay:酵素免疫測定法）によって抗細胞接着活性を有するぺリオスチンを検出することができる。本発明の診断キットを用いる場合には、まず抗ぺリオスチン一次抗体を固相化したプレートに試料を接触させて両者を結合させ、この結合体にマーカー標識した抗ぺリオスチン二次抗体を結合させ、この三者の結合体におけるマーカーのシグナル強度を測定することにより、抗細胞接着活性を有するペリオスチンを検出または定量することができる。、特に抗細胞接着活性を有するぺリオスチンは、心不全等の病態時に特異的に発現するスプライシングノリアントであるので、その産生をモニターすることにより心不全等における病態の診断をすることができる。

[0046] このように、本発明の抗体を標識ィ匕して、二次抗体として使用する事が可能である。

[0047] 本発明の抗体、抗体断片または誘導体を有効成分として含有する医薬組成物は、通常の製剤化の際に用いられる担体ゃ賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。

[0048] 本発明に係る医薬組成物の有効成分は、公知の薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤等と混合して医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法によつて投与するのが好ましい。本発明の医薬組成物は、例えば、有効成分を生理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、安定剤、希釈剤、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シ口ップ剤等と、適宜混和することにより製造することができ、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤等として用いることができる。錠剤等に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチンのような結合剤、コーンスターチのような潤沢剤等を用いることができ、また糖衣又は医溶性若しくは腸溶性物質のフィルムにより被膜してもよヽ。カプセルの剤型である場合には、前記の組成物に更に液状担体を含有させることができる。注射のための無菌組成物も、通常の処方を適用して製造することができる。注射用の水性液としては、ブドウ糖などを含む等張液などが挙げられ、ポリエチレングリコールのような適当な溶解補助剤などと併用してもよい。また、緩衝剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤、無痛化剤などと配合してもよい。経口投与において、消化管内で有効成分が分解を受けやすい場合、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分をリボソーム中に包容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻腔内、舌下、肺などの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は、座剤、点鼻剤、舌下剤、経肺剤といった形態で投与することができる。

[0049] 本発明の医薬組成物の投与量は、治療に用いられる場合、治療に有効な投与量が決められるが、当該投与量は投与対象者の年齢、体重、症状の程度および投与経路等によって異なり、個々の場合に応じて決められる。通常、経口投与による場合、成人一日当たりの投与量は 0. 1〜： LOOOmg程度であり、これを 1ないし数回に分けて投与すればよい。持続静脈内投与においては 0. 0: gZkgZmin〜l. 0 μ g/ kgZminの範囲で投与することができ、 0. 025 μ gZkgZmin〜0. 1 μ g/kg/mi nで投与するのが望まし、。

[0050] 以下、実施例を用いて本発明について詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

[実施例]

[製造例 1]サブトラクシヨン法によるべリオスチンの検索

1 - 1 心不全病態モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取雄性ダール食塩感受性ラット (Dahl-S) (清水実験材料)を 6週齢より 8%高食塩含有食で飼育し、心肥大期（11週齢)および心不全期（14週齢）に各 3匹の左心室を採取した。

[0051] 1 - 2 mRNAの調整

総 RNAは上記左心室約 500mgから ISOGEN (二ツボンジーン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって調整した。次に心肥大期、心不全期それぞれ 3匹分を合わせた総 RNA約 400 gより Fast Track 2. 0 Kit (インビトロジェン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって mRNAを精製し、それぞれ約 3 μ gの mRNAを回収した。

[0052] 1 - 3 cDNAサブトラクシヨン

cDNAサブトラクシヨンは、 PCR— Select cDNA subtraction kit (クローンテック社）により、説明書に記載の方法にしたがって行った。すなわち、上記 1—2で得られた mRNAそれぞれ 2 gより cDN Aを合成し、制限酵素 Rsalで消化した。次に、 14週齢から合成された cDNAをテスター cDNA、 11週齢から合成された cDNAをドライバー cDNAとし、テスター cDNAに kit添付の 2種類のアダプターを別々に連結させた後、サブトラタトハイブリダィゼーシヨンを行った。次に、アダプターに相補的なプライマーを用いて PCRを行ヽ、発現量に違、のある cDNA断片を特異的に増幅させ、増幅産物 1を得た。

[0053] また、同様のサブトラクシヨンを 11週齢から合成された cDNAをテスター cDNA、 1 4週齢カゝら合成された cDNAをドライバー cDNAとして行ヽ、得られた増幅産物を増幅産物 2とした。

[0054] 1 -4 ドットブロットスクリーニング

A.ドットブロットの作製

増幅産物 1を PCR IIベクター（インビトロジェン社）に TAクローユングし、挿入断片の入ったクローンを選択した。各クローンの挿入断片を増幅した PCR反応後、それぞれ 1 μ Lを熱処理後、 2枚のナイロンメンブレンフィルター（ベーリンガー社）にドットブロットし、 UVクロスリンカ一 (ストラタジーン社）により固定した。

[0055] B. cDNAプローブの作製増幅産物 1を制限酵素 Rsal及び Eael、 Smalで消化し、アダプターを除去し、 DIG ノ、イブライム DNAラベリング Z検出キット II (ベーリンガー社)を用いて説明書に記載の方法に従って DIG— dUTPでランダムプライム標識を行、、 cDNAプローブ 1を作製した。増幅産物 2より同様にして、 cDNAプローブ 2を作製した。

[0056] C.スクリーニング

上記 Aで作製したドットブロットメンブランの 1枚を cDNAプローブ 1、他の 1枚を cD NAプローブ 2とハイブリダィゼーシヨンを行った。具体的には、ベーリンガー社の DI Gハイプライム DNAラベリング/検出キット IIを用いて、説明書に記載の方法にした力^、、 DIGイージーハイブ液中 42°Cでー晚ハイブリダイセーシヨンを行った。 2 X SS C、 0. 1⁰/₀SDSで室温【こて 5分 f¾2回、 0. 1 X SSC, 0. 1⁰/₀SDSで 68。C【こて 15分間 2回洗浄した後、キットに添付のブロッキングバッファ一中でアルカリホスファターゼ標識抗 DIG抗体と反応後、 CSPD ready -to useを加えて化学発光を進行させ、 X線フィルムを露光させた。 cDNAプローブ 1でのシグナルが cDNAプローブ 2でのシグナルより強、クローンをポジティブクローンとして選択し、塩基配列の決定を行つた。

[0057] 1 - 5 塩基配列の決定

基目 il列は、 THERMO Sequenase II dye terminator cycle sequenc ing kit (アマシャムフアルマシア社）を用いて自動 DNA配列読み取り装置モデル 3 73A(PE Applied Biosystems社)で解析することにより決定した。得られた遺伝子配列を GenBanKのデータバンクに照会した結果、クローンの 1つ（SF014)がマウスペリオスチン（GenBank Accession No. D13664)と 86%ホモロジ一のある遺伝子であることが判明した。

[0058] [製造例 2]ラットぺリオスチン cDNAのクローユング

ラットぺリオスチン cDNAの単離は λ gtllベクターに挿入された rat aor ta cDNA library (クローンテック社）より作製した約 4000クローンのファージサブプール 10個（計約 4万クローン）を SF014の塩基配列を基に設計したプライマー（1) 5， - GTTCATTGAAGGTGGCGATGGTC - 3 ' (配列番号 15)、（2) 5，一 GA GATAAAATCCCTGCATGGTCCT- 3 ' (配列番号 16)を用いて PCR ^タリーユングを行い、 3個のポジティブなサブプールを得た。そのうち 1個のサブプールを上記 PCRによって増幅された断片を AlkPhos Direct™ (アマシャムフアルマシア社）を用いてアルカリフォスファターゼ標識したプローブを用いてハイブリダィゼーシヨンによるスクリーニングを行い、 1個のポジティブクローンラットぺリオスチン # 1を得た。その挿入断片を pBluescript II (ストラタジーン社)の EcoRI部位に組み込み、製造例 1 5の方法に従って全塩基配列を決定した。

[0059] 得られたクローンの長さは約 3kbであり、マウスべリオスチン（GenBank Accessio n No. D13664)の 292番から 3' 末端までに相当するものであり、 5' 末端が欠けたクローンであることが示唆された。

[0060] そこで、 SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (クローンテック社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって、 rat aorta cDNAを铸型として、上記プライマー（2) 5， - GAGATAAAATCCCTGCATGGTCCT- 3 ' (配列番号 16)とラットぺリオスチン # 1の塩基配列を基に設計したプライマー（3) 5'— CACGGTCG ATGACATGGACAACACC - 3 ' (配列番号 17)を用いて 5'—RACE反応を行つた。得られた PCR産物をインビトロジェン社の PCR IIベクターに TAクローユングし、ラットぺリオスチン 5 'RACE # 1と命名した。塩基配列を製造例 1—5の方法にしたがって決定した。

[0061] その結果、ラットぺリオスチン 5 'RACE # 1は最初に得られたラットぺリオスチン # 1より 5，方向に約 300bp長いクローンであり、 5，一末端はマウスべリオスチン（GenB ank Accession No. D13664)の 5，一末端より 15bp長いクローンであった。さらにラットぺリオスチン 5 'RACE # 1の塩基配列を基に設計したプライマー (4) 5'— ACGGAGCTCAGGGCTGAAGATG - 3 ' (配列番号 18)と上記プライマー（3) 5 ， - C ACGGTCGATGAC ATGGACAACACC - 3 ' (配列番号 17)を用いて上記 rat aorta cDNA libraryより作製した約 4万クローンのファージサブプール 10 個（計約 40万クローン）を PCR ^クリーニングすることにより 2個のポジティブなサブプールを得た。そのうち 1個のサブプールを上記 PCRによって増幅される断片をプロ一ブとしてハイブリダィゼーシヨンによるスクリーニングを行い 1個のポジティブクローンを得、ラットぺリオスチン # 2と命名した。挿入断片を pBluescriptll (ストラタジーン社）の EcoRI部位に組み込み、塩基配列を製造例 1 5の方法にしたがって決定した。

[0062] 得られたクローンの長さは約 2. 6kbであり、 5' 末端は 5'— RACEで得られたクローンと同一であつたが、 3，一末端はマウスべリオスチン（GenBank Accession N o. D13664)の 2410番までに相当するクローンであった。また、先に得られたラットペリオスチン 5 ' RACE # 1の塩基配列とラットぺリオスチン # 2の相当する領域の塩基配列は全く同一であった.ラットぺリオスチン # 1とラットぺリオスチン # 2よりラットぺリオスチン cDNAの完全長を完成させた。この完全長 cDNAの塩基配列とこの塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号 6及び 1に示す。

[0063] [製造例 3] Myc-His-ラットペリオスチン融合タンパク質発現ベクターの構築

製造例 2で得られたラットペリオスチン遺伝子のコード領域から翻訳されるタンパク質のカルボキシル末端に Mycェピトープと 6個のヒスチジンタグを有し、 CMVプロモ一ターを有する発現ベクターを作製した。

[0064] まず、 pTracer— CMV2ベクター（インビトロジェン社）を制限酵素 EcoRIと EcoRV で消化したベクター断片に、製造例 2で得られたラットペリオスチン 5 'RACE # 1を制限酵素 EcoRIと Hindmで消化して得られた約 500bpの断片と製造例 2で得られたラットぺリオスチン # 1を制限酵素 Hindlllと Hpalで消化して得られた約 2780bpの断片をライゲーシヨンキット（宝酒造 (株)）を用いて連結し、得られたプラスミドを _PTm cer— CMV2/ラットぺリオスチンと命名した。このようにして作製した pTracer— CM V2Zラットぺリオスチンを制限酵素 EcoRIと Smalで消化し、ラットぺリオスチン遺伝子のコード領域を含む約 2330bpの断片を得、製造例 2で得られたラットぺリオスチン # 1を铸型としてその配列を基に設計したプライマー（5) 5' -GACCCGGGAAGA ACGCATCATC- 3' (配列番号 19)とラットぺリオスチンの終止コドンの直前に Bst ΕΠサイトが挿入されるように設計したプライマー（6) 5， -TGGGTGACCCTGAG AACGGCCTTCTCTTGATC - 3 ' (配列番号 20)を用いて PCRを行い、精製後、制限酵素 Smalと BstEIIで消化して約 270bpの断片を得た。上記の 2つの断片を、発現ベクター構築用のプラスミド pcDNA4/Myc— His/type C (インビトロジェン社)を制限酵素 EcoRIと BstEIIで消化したベクター断片に、ライゲーシヨンキット（宝酒造 (株)）を用ヽて連結し、得られたプラスミドを pcDNA4ZMyc— HisZラットペリォスチンと命名した。挿入部分の全塩基配列は製造例に記載の方法により確認した

[0065] [製造例 4]バキュロウィルス用発現ベクターの構築

製造例 3で得られたプラスミド pcDNA4ZMyc— HisZラットぺリオスチンを、制限酵素 Sacl及び Pmelで消化し、ペプチド断片 rat PN— l/Myc— Hisを切り出した。これを、 pFastBacHTc (インビトロジェン社）を制限酵素 Saclと Kpnl (blunting)で消化して得られたベクター断片に、ライゲーシヨンキット (宝酒造 (株)）を用いて連結し、得られた発現ベクターを pFastBacZラットぺリオスチン lZMyc— Hisと命名した。挿入部分の塩基配列は製造例 1 5に記載の方法により確認した。

[0066] [製造例 5]組換えバキュロウィルスの調製および培養

Escherichia coliの DH10BAC細胞を、製造例 5で得られた pFastBacZラットペリオスチン— l/Myc— Hisで形質転換し、組換えバキュロウィルスを調製した。得られたバキュロウィルスは、電気泳動および PCRにより、目的のものが挿入されていることを確認した。

[0067] この組換えバキュロウィルスを MOI = 0. 1にて感染させた昆虫 Sf9細胞（2 X 10⁶ c ells/mL)を、無血清培地（Sf— 900IISFM (インビトロジェン社製） 2000mL中にゲンタマイシンを 50 g/mLの濃度になるように添加）中、 28°Cで 4〜5日培養した後、培養上清を回収した。

[0068] [製造例 6]ラットぺリオスチンタンパク質の精製

製造例 5で得られた培養上清 2000mLを平衡化バッファー（50mM酢酸ナトリウムバッファー pH6. 0 0. 1M塩化ナトリウム）で平衡化した SPsepharose Fast Flo w lOmL bedに供し、得られた Flow Through (通過分画）を SPセファロース通過分画とした。

[0069] 平衡化バッファーで 280nmの吸光度力 ^付近になるまで（約 lOOmL)洗浄し、 SP セファロース洗浄分画とした。

[0070] 溶出バッファー（50mMリン酸 2水素ナトリウム（pH8. 0)、 0. 5M塩ィ匕ナトリウム、 5 mMイミダゾール） lOOmLで溶出し、 SPセファロース溶出分画とした。

次に、 lOOmLの SPセファロース溶出分画を、 50mMリン酸ナトリウムバッファー pH 8. 0、 0. 5M塩化ナトリウムおよび 5mMイミダゾールで平衡化した Ni— NTAagaros e 5mL bedに供し、得られた通過分画を Ni— NTAァガロース通過分画とした。

[0071] 洗浄バッファー（50mL リン酸 2水素ナトリウム pH8. 0、 0. 5M塩ィ匕ナトリウム、 5 mMイミダゾール）約 50mLで洗浄し、 Ni— NTAァガロース洗浄分画とした。

[0072] 溶出バッファ一は以下の通り（（1) 50mMリン酸 2水素ナトリウム、 0. 5M塩化ナトリゥム、 20mMイミダゾール、以降イミダゾール量が（2) 30mM、（3) 40mM、 (4) 50m M、（5) 60mM)とし、それぞれ約 25mLで溶出し、 Ni— NTAァガロース溶出分画（ 1)〜（6)とした。

[0073] ウェスタンプロット法により目的蛋白が含まれることが確認された分画を、 lmL以下に濃縮した。

[0074] 次に、脱気した PBS (―) (137 mM NaCl、 8. 1 mM Na2HP04、 2. 68 mM KC 1、 1. 47 mM KH2P04)で平衡化したゲルろ過カラム（Sephacryl S— 200HR Φ 11mm X 95cm;容量： 90bed)に上記濃縮試料を供し、 PBS (―)で溶出し、凍結乾燥することにより、ラットペリオスチン精製タンパク質を得た。

実施例 1

[0075] ラット Exon— 17ペプチド鎖の合成およびポリクローナル抗体の作製

ノーマルの SDラットの心臓に PN— 1遺伝子を高発現させると心拡大が惹起され、またダール心不全モデルラットの心臓にラットぺリオスチンのアンチセンスオリゴヌタレォチドを投与すると生存率が改善されたことに加え、報告されてきた PN— 2とは異なり、ラット PN—1には細胞接着作用が無いことが明ら力となったことを受け、ラット PN - 1に特異的な構造は夫々の配列比較力も Exon— 17配列であると同定した。この E xon— 17を構成するアミノ酸配列の N末端に Cys残基を付加したペプチドを、純度 8 0%以上にて 10mg、化学合成した。キャリアタンパク質として KLH6mgを結合させたものをゥサギ (Kbl:JW)に免疫させた。免疫方法は初回免疫には FCA (フロイント完全アジュバント)を使用し、 2次免疫以降は FIA (フロイント不完全アジュバント)を使用した。また、投与部位は背部皮下 20ケ所、投与週は 0、 2、 4、 6週、投与量は初回免疫では 800 gペプチド/匹、 2次免疫以降では 400 gペプチド/匹にて免疫した。抗体力価は ELISA法にて測定し投与週 7週目に全血清を集めた。その後、合成べプチドを用いたァフィ二ティーカラムを作製し、 Exon— 17ペプチドに特異的に反応する抗体のみを回収した。以降、上記の、ラットぺリオスチンの Exon— 17がコードするペプチドに対するポリクローナル抗体を、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体と称する実施例 2

in vitroにおけるラット PN— 1の抗細胞接着活性の有無の検討

文献記載の方法（Ruwhof C, van Wamel AE, Egas JM, van der Laarse A. Mol Cell Biochem. 2000 May; 208(1- 2):89- 98、 Ashizawa N, Graf K, Do YS, Nunohiro T, Giac helli CM, Meehan WP, Tuan TL, Hsueh WA. J Clin Invest. 1996 Nov. 15;98(10):22 18-27)と同様な方法にて、ラットの心線維芽細胞を取得した。具体的には、生後 1〜 2日齢の SDラット 20匹をエーテル麻酔し、胸部をエタノールで消毒した。心臓を摘出し PBS (—）を入れたディッシュに入れ心臓を横断するように切って血液を出し、更に PBS ( -)で 3回洗浄後、出来るだけ PBS ( -)を捨て鋏にて細力べ刻んだ。次に、 PB S (—）：コラゲナーゼ /トリプシンを 1 : 1で混合し、 37°Cで 15分間振盪した後、更にピペッティングを行い出来る限り細胞を分離させた。次に、白金メッシュを遠心管に置いて細胞分離液をろ過し、 10mlの 10%血清入り M199培地と 10mlの PBS (―)で白金メッシュを洗浄した。その後、遠心管を 1500rpmで 10分間遠心分離し、沈殿物として得られた細胞を、 10%血清入り M199培地 20mlで攪拌しディッシュに播いた。 3 7°C、 1時間放置後ディッシュに接着した細胞をラット心線維芽細胞として採取した。上述のラット心線維芽細胞を、 96穴プレートに 6. 4 10⁴個/100 1ずっ播き、一夜培養後、培養液を 10 μ gZmlのシクロへキシミド（cycloheximide)を加えた 10% FBS添加 DMEM培地に変更し、 37°C、 1時間培養した。その後、予め 37°Cに温めた DMEM培地（serum free：無血清培地）で細胞を 2度洗!ヽ、終濃度 10 μ g/ml になるように製造例にしたがって製造したラットぺリオスチンタンパク質を DMEM培地（serum free)に添加した。陽性コントロールとして細胞接着促進作用を有するフィブロネクチンを、陰性コントロールとして BSA (ゥシ血清アルブミン）を用いた。 37°Cで 1時間培養後の顕微鏡観察においてラットぺリオスチンタンパク質を添加した群は完全に細胞が剥がれたため、 PBS (—）にて 2度洗った後、 10%中性緩衝ホルマリン液にて 30分間細胞を固定した。その後、 PBS (―)にて 3度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて 30分間細胞を染色した。その後、 550nmのプレートリーダー（BIO— RAD、 Model 680 MICRO PLATE READER)を用いて細胞の染色度を測定した（図 2)。その結果、コントロールであるフイブロネクチンおよび BSAを投与した群ならびに無添加群では接着して！/ヽた細胞の剥離は起こらず、抗細胞接着作用が見られなかったが、ラット PN—1を添加した群では細胞の剥離が認められたことから、ラット PN 1は接着細胞の剥離作用、すなわち抗細胞接着作用を有して!/、ることが明らかとなった。

実施例 3

[0077] in vitroにおける抗ラット Exon— 17ペプチド抗体の中和活性の検討

実施例 2と同様の方法で得た SDラット由来の心線維芽細胞を、 96穴プレートに 6. 4 X 10⁴個 Z100 μ 1ずつ播き、一夜培養後、培養液を 10 μ gZmlの cycloheximid eを加えた 10%FBS添加 DMEM培地に変更し、 37°C、 1時間培養した。その後、予め 37°Cに温めた DMEM培地（serum free)で細胞を 2度洗い、終濃度 10 μ g/ml のラットぺリオスチンタンパク質と抗ラット _Exon— 17ペプチド抗体を終濃度 10 μ gZ mlおよび 100 /z gZmlになるように DMEM培地（serum free)に添カ卩した。陽性コントロールとしてラットぺリオスチンタンパク質のみを、陰性コントロールとして BSAを用いた。 37°Cで 1時間培養後の顕微鏡観察においてラットぺリオスチンタンパク質のみを添加した群はほぼ完全に細胞が剥がれたため、 PBS (—）にて 2度洗った後、 10 %中性緩衝ホルマリン液にて 30分間細胞を固定した。その後、 PBS (—）にて 3度洗つた後、クリスタルバイオレットを用いて 30分間細胞を染色した。その後、 550nmのプレートリーダー（BIO—RAD、 Model 680 MICRO PLATE READER)を用いて細胞の染色度を測定した（図 3)。その結果、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体は、 P N— 1による接着細胞の剥離を抑制する、つまり PN— 1の抗細胞接着作用を抑制する、すなわちラット PN— 1の抗細胞接着作用を中和する活性を有した抗体であることが半 lj明した。

実施例 4

[0078] 急性心筋梗塞モデルラットを用いた抗ラット Exon— 17ペプチド抗体の効果体重 250〜300gのォスのルイスラットを用いて、ペントバルビタール麻酔薬（0. lm lZlOOg)を腹腔に投与し充分麻酔が力かった後に、ラット用手術台に固定した。経口より気管挿管しラット用のベンチレーターに接続し (一回換気量 3ml、 80回/分)、胸骨左第 3肋間より皮膚を横切開して、その下にある大胸筋も横切開を加え、ラット用開胸器を用いて肋間を広げて心臓を露出させた。

[0079] その後、左房の下付近にある左冠動脈を直径 5mmの曲針を用いて 1.0シルクで縛つた。この時、左冠動脈の還流領域である前壁および側壁が赤色から白色に変化し冠血流が充分に遮断されており、同部位の壁運動が消失したことを目視下に確認し（シャムオペ群では針を冠動脈に通した後、糸で縛らず針を抜いた)、第 3肋骨および第 4肋骨を 3.0シルクにて縛り固定した (この時肺を拡張させ胸郭の肺の外にある空気を出し、肺が拡張しやすいようにして力縛った)。更に同様に皮膚の切開部位を 3.0 シルクにて縫い付けて力しばらく観察し、意識が回復し自発呼吸が出てきたことを確認して力も抜管した。

[0080] 以上の手順により、順次、急性心筋梗塞モデルを作製した。

[0081] 翌日、イソフルレンによる経鼻麻酔下に経皮的心臓超音波検査を行な、、梗塞サイズが左室全周の 20%に満たな、小さな梗塞モデルを除外した。その他の梗塞モデルを心機能の悪い順に序列し、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体投与群とコントロール抗体 (ゥサギ IgG)投与群に交互に群分けし、各 200 gずつを尾静脈より投与した。

[0082] 抗体は、モデル作製の翌日に投与し、更に初回投与の 6日毎に計 4回、各群に投与した。

[0083] 一方、 1週間毎に 8週間後まで経胸壁的に心臓超音波検査で心臓を評価した。 8週間後には、ペントバルビタール麻酔薬下に気管挿管しベンチレーターに乗せた上で、左頸部より皮膚切開を行い、頸部の筋肉をピンセットで分けて、左総頸動脈を露出させ、左頸動脈起始部を糸かけて止血した上で、遠位部に小ハサミにて動脈に穴をあけ、同部位よりラット用のミラーカテーテルを挿入し左心室内に圧モニターのある力テーテルの先端が届くようにして、コンピューターに接続し、心機能および血圧等を測定した。 [0084] モデル作製の 4週後の心臓超音波検査の結果では、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体を投与した群ではゥサギ IgGを投与したコントロール群に比べ、有意に、心臓の前壁厚および後壁厚が薄くなることが抑制され、拡張末期心内径および収縮末期心内径の拡大が抑制され、ならびに心臓の収縮機能の指標である EF値が上昇した。つまり、心拡大が抑えられ、心機能が改善したことが明らかとなった（図 4—1〜図 4— 3)。さらに、モデル作製の 8週後の心臓超音波検査の結果においても、上記の 4週後の結果と同様に、心拡大の抑制および心機能の改善が確認された（図 5— 1〜図 5— 3 )。この結果より、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体投与後約 4週間後においても、該抗体による心拡大の抑制および心機能の改善効果が維持されることが示唆された。次に、血行動態においては、コントロール IgG抗体投与群に比べ抗ラット Exon— 17 ペプチド抗体投与群では最大内圧変化率（（ + ) dP/dT)、最小内圧変化率（（—） d PZdT)及び左室拡張末期圧 (LVEDP)に有意な差が得られたことから、心機能の改善が示唆された。（図 6—1〜図 6— 3)。マッソントリクローム染色した心臓切片において、抗ラット Exon— 17ペプチド抗体を投与した群ではコントロール IgG抗体を投与した群に比べ、青色に染まる部位が減少しており、線維化が抑制された（図 7)。また、心筋細胞の短軸径の計測により抗ラット Exon— 17ペプチド抗体を投与した群ではコントロール IgG抗体を投与した群に比べ、有意に心筋細胞の短軸径の菲薄化が抑制されたことが明らかとなった（図 8)。この結果は心臓超音波検査における結果と相関している。さらに、梗塞部位と非梗塞部位に分けた遺伝子発現解析の結果、非梗塞部位において、中和抗体投与群におけるエンドセリン— 1 (ET—1)、 Collagen type I、 III、 TGF— betaの発現量力コントロール抗体投与群に比べ有意に減少し、 sham群とほぼ同等になり、改善効果がみられた（図 9—1〜図 9— 5)。

実施例 5

[0085] ヒトぺリオスチン- lcDNAの完全長クローユング

ヒト心臓由来 Total RNA (クロンテック社製、 Catalog No. 64100—1、 Lot No. 4 120493) 1 μ gから作製した cDNAをテンプレートとして、全長クロー-ング用プライマーセンス鎖 5'- AAGCTAGCCACCATGATTCCCTTTTTACCCAT- 3' (配列番号 2 7)とアンチセンス鎖 5' -AACTCCACAATTTCCCTCAT-3' (配列番号 28)を用いて KOD plus DNAポリメラ一セ（東洋紡社製）により PCRを行い、得られた PCR産物を Zero Blunt TOPO PCR Cloning kit (インビトロジェン社製）を用いてクローン化した。

[0086] このクローン群からヒトぺリオスチン Exon— 17に相当する領域でセンス鎖 5'-TAAC CAAAGTTGTGGAACCAA-3' (配列番号 29)を、また、 Exon—21に相当する領域でアンチセンス鎖 5'- TGTGTCTCCCTGAAGCAGTC- 3' (配列番号 30)を作製し、これらのプライマーを用いて検出されるクローンを選別した。次に、選別したクローンの塩基配列を決定しスプライシングの起きてヽな、クローンを選別し、ヒトぺリオスチン一 lcDNAの完全長クロー-ングを完成させ、得られたクローンは pCR4Zヒトペリオスチン一 1と命名した。

実施例 6

[0087] in vitro翻訳用ヒトぺリオスチン一 1発現ベクターの構築

実施例 5で得られたプラスミド pCR4Zヒトぺリオスチン一 1を、制限酵素 Pme I及び Not Iで消化し、 DNA断片ヒトぺリオスチン一 1を切り出し blunting処理を行った。これを、 CATCACCATCACCATCACTAA(6 X His +終止コドン）（配列番号 31)を予め挿入した pTNT発現ベクター（プロメガ社製）のマルチクロー-ングサイトの Mlu I サイトを酵素消化後 blunting処理を行、、ライゲーシヨンキット (宝酒造 (株)社製)を用いて連結した。

[0088] 次に、 Hisタグとのフレームを合わせる目的で合成リンカ一（sense鎖 5'-CTAGAAG

(配列番号 32)と antisense鎖 5'- GGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGCTGAGAAC GACCTTCCCTTAATCGTCTT-3' (配列番号 33) )を作製し、制限酵素 Xba Iと Sm a Iで消化したベクター断片にライゲーシヨンキットを用いて連結した。連結部分の塩基配列を確認し、得られた発現ベクターを pTNTZヒトぺリオスチン一 1/Hisと命名した。

実施例 7

[0089] in vitro翻訳によるタンパク質の合成

実施例 6で得られた発現ベクターは TNT SP6 Quick Coupled Transcription /Translation Systems (プロメガ社製）に供して in vitroでのタンパク質の合成を行った。詳しくは pTNTZヒトぺリオスチン一 lZHis発現ベクター 2 gに対し、 SP6 Quick Master Mixを 40ml、 ImMメチォニンを 1 μ 1、 DEPC処理水にて総量 50 μ 1とし、 30°Cで 90分間反応させ精製するまで 80°Cで保存した。

実施例 8

[0090] ヒトぺリオスチンタンパク皙（PN— 1)の精製

実施例 7で得られた合成タンパク質は MagZ Protein Purification System (プロメガ社製)を用いて精製した。詳しくは実施例 7で得られた合成タンパク質に MagZ B inding/Wash bufferを 2倍量カ卩え良く混ぜた試料を MagZ Binding Particleに添加した。これを 4°Cで 1時間撹拌した後、上清を除いて MagZ Binding/Wash bu fferにて 4回 MagZ Binding Particleを洗浄後、 MagZ Elution bufferにて合成タンパク質を溶出し使用するまで一 80°Cで保存した。

実施例 9

[0091] ヒトぺリオスチンの Exon— 17ペプチド鎖に対するモノクローナル抗体の作製

(1) 杭原の作製

ヒトぺリオスチン Exon— 17を構成するアミノ酸配列（配列番号 4)の N末端に Cys残基を付加したペプチド (抗原ペプチド;配列番号 25)を、 Fmoc法にて化学合成し、純度 90%以上の抗原ペプチド 10mgを得た。この抗原ペプチド 5mgにキャリアタンパク質として KLH (CALBIOCHEM社製） 5mgを結合させ、抗原溶液を得た。すなわち、 KLHを PBS (0. 01M)に溶解して 3. 3mg/mLに調整し、 0. 2524mg/m Lの MBS溶液（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）を滴下して室温で 60分間攪拌し反応させた。ジクロロメタンを用いてフリーの MBSを除き、 KLH— MBを得た。この KLH— MB5mgと、 0. 01Mリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 2)に溶解した抗原ぺプチド 5mgとを混合し、 4°Cで 12時間攪拌して反応させ、抗原溶液を得た。

(2)

6週齢の BALBZc雌性マウス 3匹の両足に、（1)で得られた KLH結合抗原べプチド 100 gを含む抗原溶液 50 1と、 FCA (フロイント完全アジュバント） 50 1との混合乳濁液全量を皮下注射した。その後 2週間間隔で 2回、用時調製した上記抗原溶液と FIA (フロイント不完全アジュバント）との混合乳濁液を両足に投与した。その後、そのマウスを頸椎脱臼により致死させ、無菌的に足部リンパ節を採取した。

RPMI培地 (コージンノィォ株式会社製)を供給しながら上記リンパ節を破砕し、孔径約 10 μ mのメッシュを通過させて RPMI培地に懸濁状態のリンパ節細胞を得た。これを 1000rpm、 10分間の遠心分離にかけて、リンパ節細胞を沈殿画分として得た。この沈殿画分に、 0. 84 %の塩化アンモ-ゥム溶液に 20mMの HEPES緩衝液（p H 7. 4)を加えた溶液 lmlを入れて溶血させ、赤血球を除いた後、 1, 000rpm、 5 分間の遠心分離にかけた。得られた沈殿画分 (細胞画分)を RPMI培地で数回洗浄し、細胞融合に用いた。

(3) ミエローマ細胞の調製

8-ァザグァニン耐性でかつィムノグロブリン非分泌型のマウスミエローマ細胞株 P3 X63Ag8U. 1 (P3U1株）を、 20%のゥシ胎児血清 (FCS)を含む RPMI培地で、 1 0%CO ' 37°Cインキュベーター内で培養し、対数増殖期にある細胞を集め、 1, 00

2

Orpm、 5分間の遠心分離にかけて沈殿画分として細胞のみを取得し、 RPMI培地に懸濁させた。

(4) 細胞の融合

(2)で得た免疫化リンパ節細胞 10⁸〜3 X 10⁸個を含む RPMI培地と、（3)で得たミエローマ細胞 10⁸個を含む RPMI培地とを混合した後、 1, 000rpm、 10分間の遠心分離にかけた。上清を静かに除いて沈殿画分として細胞を取得し、これに 25% (wZv) のポリエチレングリコール 1500 (PEG 1500、ベーリンガー社製） lmlを加えた後、更に RPMI培地をゆっくりと加えて総量を 10mlとした。これに 20% FCSを含む RP Ml培地 10mlをカ卩えて、少し静置させた後、 1, 000rpm、 5分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿画分 (細胞画分）に 20% FCSを含む RPMIを加えて細胞濃度が 10⁶ 個 Zmlになるように調整した細胞懸濁液を、コーユング社製の 96穴培養プレートに 2 00 LZwellずつ分注した。 5%CO ' 37°Cインキュベータ一中で 24時間培養後、

2

HAT溶液 (インビトロジェン社製)を添加した後、更に 2週間培養した。

(5) ELISA法によるスクリーニング

培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性 wellのスクリーニングを行った。 [0092] アツセィ用の抗原溶液には、（1)で得られた抗原ペプチド 2mgに、キャリアタンパク質として卵白アルブミン (OVA)を結合させたコンジュゲートを用いた。

[0093] 96穴マイクロタイタープレート（ファルコン 353912)の各 wellを、上記コンジユゲート: L g Zmlで 4°C下一夜静置してコーティングした。このプレートを洗浄後、（4)の培養上清（モノクローナル抗体を含む） 50 μ 1を各 wellに滴下し、 37°Cのインキュべ一ター内で 2時間放置した後、 PBS (—）（リン酸緩衝液）で洗浄した。これにアルカリフォスターゼ結合ヒッジ抗マウス IgG抗体 (Zymed社製）を加え、 37°Cインキュベータ一で 1時間放置し、 PBS (—）で洗浄後、発色基質剤 (ALP)を加えて 20分間発色させ、プレートリーダー（BIO—RAD、 Model 680 MICRO PLATE READER)で各 wellの OD490nmの吸光度 (抗体価）を測定し、抗原ペプチドとの反応性を確認し、培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性 wellを決定した。

(6) 杭体産牛.細胞のクローニング

(5)の ELISA法で抗原ペプチドとの反応性が確認された陽性 well内の細胞から、限界希釈法により、抗体産生細胞株のクローユングを行った。すなわち、陽性 well内の細胞を 96穴培養プレートの各 wellに撒き込み、 5%CO ' 37°Cインキュベーター

2

内で 2週間培養した。各 wellの培養上清について、（5)の方法と同様に、 ELISA法にて、抗原ペプチドとの反応性を確認し、陽性 wellについて、再度、限界希釈法によるクロー-ングを行い、抗原ペプチドとの反応性が高ぐ細胞コロニーの発育が良好な 30個の細胞を得た。これら細胞を 24穴培養プレートに移し、 5%CO ' 37°Cインキ

2

ュベータ一内で 2週間培養した。培養上清について、再び、（5)の方法と同様に、 EL ISA法にて、抗原ペプチドとの反応性 (抗体価）を確認した。 OD490nmの吸光度が高かった lOwell内の細胞、すなわち 10個のハイプリドーマ細胞株を、抗体産生細胞として有用であると判断し、選別した。

[0094] [化 1] ハイプリドーマ細胞株

このようにして得た抗体産生細胞は、本発明抗体である抗ヒト Exon— 17モノクロ一ナル抗体を常時産生するので、この抗体産生細胞を培養した培養液の上清液は、直接、本発明抗体溶液として使用することができる。なお、上記の抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞株 (ハイブリドーマ) Noj (SBM337)は、平成 18年 11月 1日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに FERM BP— 10718として寄託されている。

(7)ヒトぺリオスチンタンパク皙 (PN—1) の結合件の確認

(6)で得られた抗体産生細胞 10個が産生する抗体と、ヒトぺリオスチンタンパク質（ PN—1)との結合性について、ドットプロット法にて確認した。すなわち、実施例 8で得られた合成タンパク質（30 μ g/ml)を 5 μ 1ずつ Hybond- ECL-トロセルロースメンブレン（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、 TBS溶液（10m M Tris— HCl (pH8. 0)、 150mM NaCl)で 1回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製)を加えて、室温で 1時間振盪した。メンブレンに（6)で得られたモノクローナル抗体 (一次抗体)の 1 μ gZml濃度溶液を加えて 3時間振盪した後、 TBS溶液で 10分間振盪洗浄を 4回行った。メンブレンに HRP標識抗マウス IgG抗体 (プロメガ社製）（二次抗体)の 0.4mgZml濃度溶液を加えて室温にて 1時間振盪した後、メンブレンを TBS溶液で 10分間振盪洗浄を 4回行った。検出用試薬 (ECL plus western blotting detection system、 GEヘルスケァノヽィォサイエンス株式会社製)を加えて 1分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、（6)でクローユングした抗体産生細胞 10個全て力ヒトぺリオスチン PN— 1と結合することが確認された。

(8) モノクローナル杭体の大畺調製精製

BALBZcマウスの腹腔内にプリスタン [2,6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン (和光純薬製)] 0.5mlを投与し、 2〜3週間飼育した。予め、対数増殖期に維持しておいたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ No.lおよび No.3を回収し、培養上清を除いた沈殿画分の細胞に FCS不含の RPMI培地を加え、細胞数が 1 X 10⁷個/ mlになるように細胞液を調製した。この細胞液を、プリスタン前投与した BALBZcマウスの腹腔中に注入し、 3週間後頃力も漏出した腹水を腹部より注射器で回収した。採取した腹水を、孔径 0.22 m φのフィルターを用いて濾過した後、濾液をプロテイン G-セファロースカラム (Millipore、 11511324)によるァフィユティークロマトグラフィーによつて常法に従い精製し、抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体 2種を調製した。

実施例 10

杭ヒト Exon— 17モノクローナル杭体のヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖における認識き β位解析

得られたモノクローナル抗体 2種（No.lおよび No.3)についてヒトぺリオスチン Exon —17ペプチド鎖における認識部位の解析 (ェピトープの同定)を行った。すなわち、セルロースメンブレン上に、ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖（配列番号 4 ; 1位のスレオニンから 27位のグルタミン酸まで）の N末端から一 9番目のフエ-ルァラニンから、 C末端から 9番目のイソロイシンまでの計 45個のアミノ酸力もなるアミノ酸配列にお!、て、下記のアミノ酸 10個力もなるペプチド 36種を膜結合型ペプチドアレイを作製した（シグマアルドリッチジャパン株式会社カスタム Spotsサービス)。

[化 2]

FKEIPVTVYT

KEIPVTVYTT

EIPVTVYTTK

IPV VYTTKI

PVTVYTTKI I

VTVYTTKIIT VYTTKI ITK

VYTTKIITKV

YTTKIITKW

TTKIITKWE

TKIITKWEP

KI ITKWEPK

IITKWEPKI

ITKWEPKIK

TKWEPKIKV

KWEPKIKVI

WEPKIKVIE

VEPKIKVIEG

EPKIKVIEGS

PKIKVIEGSL

KIKVIEGSLQ

IKVIEGSLQP

KVIEGSLQPI

VIEGSLQPI I

IEGSLQPIIK

EGSLQPI IKT

GSILQPIIKTE

SLQPIIKTEG

LQPIIKTEGP

QPIIKTEGPT

PI IKTEGPTL

IIKTEGPTLT

IKTEGPTLTK

KTEGPTLTKV

TEGPTLTKVK

EGPTLTKV I [0098] このメンブレンを少量のメタノール中で 5分間放置した後、 TBS溶液で 3回洗浄した。ブロッキングバッファー (カゼイン、 SPOTsに添付)をカ卩えて、室温で 2時間攪拌した。メンブレンに実施例 9 (8)で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の 1 μ g/ml 濃度溶液を加えて 3時間振盪した後、 TBS溶液中で 10分間振盪洗浄を 3回行った。メンブレンに HRP標識抗マウス IgG抗体 (プロメガ社製）（二次抗体）の 0. 4 ^ g/ml 濃度溶液を加えて 2時間インキュベートした後、メンブレンを TBS溶液で 5分間振盪洗浄を 3回行った。検出用試薬（SuperSignal West Pico, Pierce社製）をカ卩えて 1 分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、モノクローナル抗体 No.lおよび No.3は、アミノ酸配列 YTTKIITKW (配列番号 26)力なる合成ペプチド No. 9、すなわちヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号 4)における N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでであり、ヒトぺリオスチン PN— 1 のアミノ酸配列（配列番号 2)におけるの N末端から 669番目のチロシンから 679番目のノ《リンまでのアミノ酸配列力なるペプチドとのみ反応し、結合した。

実施例 11

[0099] 抗ラット Exon— 17ポリクローナル抗体のヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖における認識部位解析

実施例 1で作製したポリクローナル抗体について、実施例 10と同様に、ヒトペリオスチン Exon— 17ペプチド鎖における認識部位の解析 (ェピトープの同定)を行った。その結果、実施例 10のモノクローナル抗体と同様に、該ポリクローナル抗体は合成ペプチド No. 9とのみ反応し、モノクローナル抗体と同様の部位を特異的に認識していることが明ら力となった。従って、ラットぺリオスチン Exon— 17ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製しても、ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作製しても、同様な特異性をもつ抗体が得られることが示唆された。

実施例 12

[0100] ラットペリオスチンタンパク質（PN— 1)との結合性の確認

得られたモノクローナル抗体 2種（No.1および No.3)について、ラットぺリオスチンタンパク質 (PN—1)との結合性について、ドットプロット法にて確認した。すなわち、製造例 6で得られた精製タンパク質（30 μ g/ml)を 5 μ 1ずつ Hybond- ECL-トロセルロースメンブレン（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、 TBS溶液（10mM Tris— HCl (pH8. 0)、 150mM NaCl)で 1回洗浄した。ブロッキングバッファー (ブロックエース、雪印乳業株式会社製)を加えて、室温で 1時間振盪した。メンブレンにモノクローナル抗体 (一次抗体)の: L gZml濃度溶液を加えて 3時間振盪した後、 TBS溶液で 10分間振盪洗浄を 4回行った。メンブレンに HRP標識抗マウス IgG抗体 (プロメガ社製）（二次抗体)の 0.4 gZml濃度溶液を加えて室温にて 1 時間振盪した後、メンブレンを TBS溶液で 10分間振盪洗浄を 4回行った。検出用試薬 (ECL plus western blotting detection system, GEへノレスケアバイオサイエンス株式会社製)を加えて 1分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、得られたモノクローナル抗体 2種はラットペリオスチン PN— 1とも結合することが確認された。

実施例 13

[0101] 抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体のェピトープ解析

実施例 10の結果から、抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体のェピトープ部分はヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖（配列番号 4)の N末端のスレオニンから 9番目のノ《リンまでのアミノ酸配列（丁1¾11丁! \^;配列番号22)を認識していることが明らかとなり、また実施例 12の結果において、抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体がラットぺリオスチンタンパク質 (PN—1)とも結合することが確認された。このことから、抗ヒト Ex on— 17モノクローナル抗体のェピトープ部分はヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖（配列番号 4)の N末端のスレオニンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列（ΤΤΚΠ TKW;配列番号 22)のうち、ヒトとラットの種間においてアミノ酸に相違がない部分、すなわち、ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖 (配列番号 4)またはラットペリオスチン Exon— 17ペプチド鎖（配列番号 3)の N末端のスレオニンから 7番目のリジンまでのアミノ酸配列の全部またはその一部分を認識していることが示唆された。そこで、さらに詳細にェピトープ部分を解析するために、ァラニンスキャンの手法にて解析を行つた o

[0102] ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖（配列番号 4)の N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKW;配列番号 26)のうち、一部のアミノ酸をァラニンに変換した下記 10種のペプチドを純度 80%以上で合成した。

# 1 YTTKIITKW

# 2 ATTKIITKAA

# 3 AATKIITKAA

# 4 AAAKIITKAA

# 5 AAAAIITKAA

# 6 AAAAAITKAA

# 7 ATTKIITAAA

# 8 ATTKIIAAAA

# 9 ATTKIAAAAA

# 10 ATTKAAAAAA

lmgの合成ペプチドを PBS (—）50 1で可溶化させ、 1. 5 1ずつ Hybond- ECL ニトロセルロースメンブレン（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、 TBS溶液で 1回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製)を加えて、室温で 1時間振盪した。メンブレンに実施例 9 (8)で得られたモノクローナル抗体 (一次抗体)の 1 _μ gZml濃度溶液を加えて 3時間振盪した後、 TBS 溶液で 10分間振盪洗浄を 4回行った。メンブレンに HRP標識抗マウス IgG抗体 (プ口メガ社製）（二次抗体)の 0. 4 gZml濃度溶液を加えて室温にて 1時間振盪した後、メンブレンを TBS溶液で 10分間振盪洗浄を 4回行った。検出用試薬 (SuperSig nal West Pico, Pierce社製)を加えて 1分間反応させ、化学発光法により検出したその結果、該モノクローナル抗体は、上記合成ペプチド # 7 (ヒトぺリオスチン Exon 17ペプチド鎖 (配列番号 4)の N末端から 1番目のチロシンから 9番目のパリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKW;配列番号 26)力なるペプチドにおいて、 N末端から 1番目および 8〜： L0番目のアミノ酸をァラニンに置換したペプチド）と強く反応し、 # 1 (ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖の（配列番号 4)の N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKW;配列番号 26)力なるペプチド）および # 2 (ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖（配列番号 4)の N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKW;配列番号 26)力なるペプチドにおいて、 N末端から 1番目および 9〜10番目のァミノ酸をァラニンに置換したペプチド）とは弱く反応し、 # 3 (ヒトペリオスチン Exon— 17 ペプチド鎖（配列番号 4)の N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKW;配列番号 26)力なるペプチドにおいて、 N末端から 1 〜2番目および 9〜10番目のアミノ酸をァラニンに置換したペプチド）および # 8 (ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖（配列番号 4)の N末端から 1番目のチロシンから 9番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKW;配列番号 26)からなるペプチドにおいて、 N末端から 1番目および 7〜10番目のアミノ酸をァラニンに置換したぺプチド)とは更に弱く反応した。

実施例 14

[0104] 抗ラット Exon— 17ポリクローナル抗体のヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチド鎖における認識部位解析

実施例 1で作製したポリクローナル抗体について、実施例 13と同様に、ヒトペリオスチン Exon— 17ペプチド鎖における認識部位の解析 (ェピトープの同定)を行った。その結果、実施例 13のモノクローナル抗体と同様に、該ポリクローナル抗体は合成ペプチド No. # 7と強く反応し、 # 1および # 2とは弱く反応し、 # 3および # 8とは更に弱く反応し、モノクローナル抗体と同様の部位を特異的に認識して、ることが明ら力となった。従って、ラットぺリオスチン Exon— 17ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製しても、ヒトぺリオスチン Exon— 17ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作製しても、同様な特異性をもつ抗体が得られることが示唆された。

実施例 15

[0105] in vitroにおけるヒトぺリオスチン ίの杭細胞榇羞活件の有無の檢討

実施例 2と同様に、ヒト心線維芽細胞 (大日本製薬 (株)社製、 catalog No. CS— ABI- 5118) ^ 96穴プレートに 6. 4 X 10⁴個 ZlOO /z 1ずつ播き、一夜培養後、培養液を 10 μ gZmlのシクロへキシミド（cycloheximide)をカ卩えた 10%FBS添カロ CS C培地 (Cell System Corporation製)に変えて、 37°C、 1時間培養した。その後、予め 37°Cに温めた CSC培地（serum free)で細胞を 2度洗い、終濃度 1 μ gZmlになるように実施例にしたがって作製したヒトぺリオスチン一 1タンパク質を CSC培地（s erum free)に添加した。陽性コントロールとして細胞接着促進作用を有するフイブ口ネクチンを、陰性コントロールとして細胞接着作用を持たない BSA (ゥシ血清アルブミン）を用いた。 37°Cで 3. 5時間培養後の顕微鏡観察においてヒトぺリオスチンタンパク質を添加した群は完全に細胞が剥がれたため、 PBS (—）にて 2度洗った後、 10% 中性緩衝ホルマリン液にて 30分間細胞を固定した。その後、 PBS (—）にて 3度洗つた後、クリスタルバイオレットを用いて 30分間細胞を染色した。その後、 550nmのプレートリーダー（BIO—RAD、 Model 680 MICRO PLATE READER)を用いて細胞の染色度を測定した（図 10)。その結果、コントロールであるフイブロネクチンおよび BSAを投与した群ならびに無添加群では抗細胞接着作用が見られな力つたが、ヒトぺリオスチン— 1タンパク質を添加した群では細胞の剥離が認められたことから、ヒトぺリオスチン一 1タンパク質は抗細胞接着作用を有していることが明らかとなった。実施例 16

in vitroにおける抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体の中和活性の検討

実施例 3と同様に、ヒト心線維芽細胞を、 96穴プレートに 6. 4 10⁴個 100 1ずっ播き、一夜培養後、培養液を 10 gZmlの cycloheximideをカ卩えた 10%FBS添加 CSC培地に変更し、 37°C、 1時間培養した。その後、予め 37°Cに温めた CSC培地（serum free)で細胞を 2度洗い、終濃度 1 μ gZmlのヒトぺリオスチン 1タンパク質と抗ヒト £ 011—17モノクローナル抗体( .1ぉょび .3)を終濃度20

なるように CSC培地（serum free)に添加した。陽性コントロールとしてヒトペリオスチン 1タンパク質のみを、陰性コントロールとして BSAを用いた。 37°Cで 3. 5時間培養後の顕微鏡観察においてヒトぺリオスチンタンパク質のみを添加した群はほぼ完全に細胞が剥がれたため、 PBS (—）にて 2度洗った後、 10%中性緩衝ホルマリン液にて 30分間細胞を固定した。その後、 PBS (―)にて 3度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて 30分間細胞を染色した。その後、 550nmのプレートリーダー（BIO— R AD、 Model 680 MICRO PLATE READER)を用いて細胞の染色度を測定した（図 11)。その結果、抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体は、ヒトぺリオスチン一 1タンパク質の抗細胞接着作用を抑制する、すなわちヒトぺリオスチン— 1タンパク質の抗細胞接着作用を中和する活性を有した抗体であることが判明した。

また、上述のように、ヒトぺリオスチン 1タンパク質の Exon— 17に対する抗体であり、かつ、 Exon— 17の N末端 1番目力も 6番目のアミノ酸配列或いはその一部を特異的に認識する抗体により、ヒトぺリオスチン 1タンパク質の抗細胞接着作用が抑制されたことから、 Exon— 17、少なくとも Exon— 17の N末端 1番目から 6番目のアミノ酸配列からなるペプチド部分又はその一部が、ヒトぺリオスチン— 1タンパク質の抗細胞接着作用に関与する領域を構成していることが示唆された。

実施例 17

[0107] 急件心筋粳案モデルラットを用いた杭ヒト Exon— 17モノクローナル杭体の効果

実施例 4と同様に、体重 250〜300gのォスのルイスラットを用いて、ペントバルビタール麻酔薬 (0. lmlZlOOg)を腹腔に投与し充分麻酔が力かった後に、ラット用手術台に固定した。経口より気管挿管しラット用のベンチレーターに接続し (一回換気量 3ml、 80回/分)、胸骨左第 3肋間より皮膚を横切開して、その下にある大胸筋も横切開を加え、ラット用開胸器を用いて肋間を広げて心臓を露出させた。

[0108] その後、左房の下付近にある左冠動脈を直径 5mmの曲針を用いて 1.0シルクで縛つた。この時、左冠動脈の還流領域である前壁および側壁が赤色から白色に変化し冠血流が充分に遮断されており、同部位の壁運動が消失したことを目視下に確認し ( シャムオペ群では針を冠動脈に通した後、糸で縛らず針を抜いた)、第 3肋骨および第 4肋骨を 3.0シルクにて縛り固定した (この時肺を拡張させ胸郭の肺の外にある空気を出し、肺が拡張しやすいようにして力縛った)。更に同様に皮膚の切開部位を 3.0 シルクにて縫い付けて力しばらく観察し、意識が回復し自発呼吸が出てきたことを確認して力も抜管した。

[0109] 以上の手順により、順次、急性心筋梗塞モデルを作製した。

[0110] 翌日、イソフルレンによる経鼻麻酔下に経皮的心臓超音波検査を行ない、梗塞サイズが左室全周の 20%に満たな、小さな梗塞モデルを除外した。その他の梗塞モデルを心機能の悪い順に序列し、抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体 (No.3)投与群とコントロール抗体 (ゥサギ IgG)投与群に交互に群分けし、各 200 gずつを尾静脈より投与した。

[0111] 抗体は、モデル作製の翌日に投与し、更に初回投与の 6日毎に計 4回、各群に投与した。

[0112] 一方、 1週間毎に 4週間後まで経胸壁的に心臓超音波検査で心臓を評価した。モデル作製の 4週後の心臓超音波検査の結果では、抗ヒト Exon— 17モノクローナル抗体を投与した群ではゥサギ IgGを投与したコントロール群に比べ、有意に、心臓の前壁厚および後壁厚が薄くなることが抑制され、拡張末期心内径および収縮末期心内径の拡大が抑制され、ならびに心臓の収縮機能の指標である FS値或いは EF値が上昇した。つまり、心拡大が抑えられ、心機能が改善したことが明らかとなった（図 1 2—1〜図 12— 3)。

また、上述のように、急性心筋梗塞モデルラットにおいて、ヒトペリオスチン一 1タンパク質の Exon— 17に対する抗体であり、かつ、少なくとも Exon—17の N末端 1番目力 6番目のアミノ酸配列或いはその一部を含んで構成されているェピトープを持つ抗体により、心拡大の抑制および心機能の改善効果が示されたことから、ヒトペリオスチン 1タンパク質の Exon— 17、特に少なくとも Exon— 17の N末端 1番目から 6番目のアミノ酸配列力なるペプチド部分又はその一部を含む領域が、心筋梗塞後の心拡大および心機能の悪ィ匕に関与する領域であることが示唆された。

産業上の利用可能性

[0113] 抗細胞接着活性を有するぺリオスチンに対する抗体を用いることにより、心不全などの疾患で発現が増大する抗細胞接着活性を有するペリオスチンの作用を抑制し、病態の増悪ィ匕の抑制および組織の機能の改善を行うことにより、ぺリオスチンが関与する疾患の予防および治療を行うことができる。また、患者サンプル中の該ぺリオスチン量を測定することにより、疾患の有無および病状の進行程度を知ることができる。

Claims

請求の範囲

[I] 抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体。

[2] 配列番号 1または配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンに対する抗体。

[3] 配列番号 3または配列番号 4で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンに対する抗体。

[4] 配列番号 34で示されるアミノ酸配列を有するぺリオスチンに対する抗体。

[5] 抗細胞接着活性を有するペリオスチンの抗細胞接着活性に関与する領域に対する抗体。

[6] 配列番号 3もしくは配列番号 4で示されるアミノ酸配列またはその一部からなるぺプチドに対する抗体。

[7] 配列番号 34で示されるアミノ酸配列或いはその一部のアミノ酸配列を有するぺプチドに対する抗体。

[8] 抗体が、配列番号 3または配列番号 4で示されるアミノ酸配列、或いはその一部の部位を特異的に認識する抗体である、請求項 1〜7の、ずれか 1項に記載の抗体。

[9] 抗体が、配列番号 34で示されるアミノ酸配列或いはその一部の部位を特異的に認識する抗体である、請求項 1〜7のいずれ力 1項に記載の抗体。

[10] 配列番号 26で示されるアミノ酸配列からなるペプチドと結合する抗体。

[II] 抗体が、抗細胞接着活性を中和する能力を有する抗体である、請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の抗体。

[12] 抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒトイ匕抗体またはヒト抗体である、請求項 1〜： L 1の、ずれか 1項に記載の抗体。

[13] 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項 12のいずれか 1項に記載の抗体。

[14] ハイプリドーマ細胞株 FERM BP— 10718により産生される抗体。

[15] 請求項 13に記載のモノクローナル抗体の部分断片からなる抗体断片。

[16] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体又は請求項 15に記載の抗体断片と、蛋白質又は低分子の薬剤とを結合させた抗体の誘導体。

[17] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。

[18] ハイプリドーマ細胞株 FERM BP— 10718である、請求項 17に記載のハイブリド一マ。

[19] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片もしくは請求項 16に記載の抗体または抗体断片と蛋白質が結合している誘導体をコードする DNA。

[20] 請求項 19に記載の DNAを含有する組換えベクター。

[21] 請求項 20に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。

[22] 請求項 21に記載の形質転換体を培養し、培養物中に請求項 1〜14のいずれか 1 項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片もしくは請求項 16に記載の抗体または抗体断片と蛋白質が結合している誘導体を生成させ、該培養物から該抗体、該抗体断片もしくは抗体または抗体断片と結合している誘導体を採取することを特徴とする、抗体、抗体断片もしくは抗体または抗体断片と結合している誘導体の製造方法。

[23] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片又は請求項 16に記載の誘導体を含有する医薬組成物。

[24] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片又は請求項 16に記載の誘導体を含んでなる、抗細胞接着活性を有するぺリオスチンが関与する疾患を予防または治療するための医薬組成物。

[25] 前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しよう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、腎炎、膝炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である、請求項 24に記載の医薬組成物。

[26] 請求項 23の医薬組成物を患者に投与することからなる、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患の予防または治療方法。

[27] 前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しよう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、腎炎、膝炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である、請求項 26に記載の予防または治療方法。

[28] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片又は請求項 16に記載の誘導体を用いて、生体試料中のぺリオスチン量を測定することからなる、抗細胞接着活性を有するペリオスチンが関与する疾患を診断する方法。

[29] 前記抗体が標識化抗体である、請求項 28に記載の診断方法。

[30] 前記疾患が、心不全、心筋梗塞、心拡大、心肥大、心線維化、心筋症、心筋炎、弁膜症、癌、動脈瘤、動脈硬化、中枢神経変性疾患、腎臓病、関節リウマチ、骨粗しよう症、肺気腫、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患 (COPD)、腎炎、膝炎、肝炎、肝線維症または肺線維症である、請求項 28または 29に記載の診断方法

[31] 標識化された、請求項 1〜14のいずれ力 1項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片又は請求項 16に記載の誘導体。

[32] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片又は請求項 16に記載の誘導体を用いて、サンプル中の抗細胞接着活性を有するぺリオスチンを定量する方法。

[33] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片又は請求項 16に記載の誘導体を用いて、サンプル中の抗細胞接着活性を有するぺリオスチンを検出する方法。

[34] 請求項 1〜14のいずれか 1項に記載の抗体、請求項 15に記載の抗体断片又は請求項 16に記載の誘導体を含む、抗細胞接着活性を有するぺリオスチンが関与する疾患の診断薬。