KR101429783B1 - 항 인간 α９ 인테그린 항체와 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 α9 인테그린을 특이적으로 인식하는 항체(특히, 단일클론 항체), 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체; 상기 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포; 상기 단일클론 항체의 제조방법; 상기 하이브리도마 세포의 제조방법; 상기 항 인간 α9 인테그린 항체를 함유하는 치료제; 상기 인간 α9 인테그린 항체를 함유하는 진단제; 인간 α9 인테그린의 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝방법 등에 관한 것이다.

Description

항 인간 α９ 인테그린 항체와 그 용도{Antihuman α9 integrin antibody and use of the same}
본 발명은 인간 α9 인테그린을 특이적으로 인식하는 항체(특히, 단일클론 항체), 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체; 상기 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포; 상기 단일클론 항체의 제조방법; 상기 하이브리도마 세포의 제조방법; 상기 항 인간 α9 인테그린 항체를 함유하는 치료제; 상기 인간 α9 인테그린 항체를 함유하는 진단제; 인간 α9 인테그린의 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝방법 등에 관한 것이다.
생물체는 생명 현상을 영위하는 최소의 기능 단위인 세포, 같은 작용을 하는 세포가 모여서 조직을 구성하고, 각종 조직이 모여서 협동하여 일정 기능을 갖는 기관을 형성하고, 전체적으로 조화 통일된 생명 활동을 영위하고 있다. 많은 조직은 기본적으로 세포와 세포외 매트릭스로 구성되어 있어, 세포와 세포외 매트릭스가 접착하는 세포와 세포외 매트릭스간 접착과 세포간 접착에 의해 구조를 유지하고 있다. 세포외 매트릭스에 관해서는, 지금까지 생물 활성은 없어, 단순한 충전제로 생각되어져 왔지만, 실은 거의 모든 조직에서 중요한 역할을 하고 있다는 것이 명확해졌다. 세포와 세포외 매트릭스간 접착 활성이 알려지게 되어, 세포의 디딤재 로서의 역할뿐 아니라, 다양한 세포 기능의 조절이나 조직, 기관의 항상성 유지에 관여하고 있는 것이 시사되어, 그 중요성이 보다 인식되어지게 되었다.
세포와 세포외 매트릭스를 연결하는 접착은, 인테그린으로 대표되는 막관통 세포접착 단백질을 매개로 행해진다. 인테그린은 α사슬과 β사슬의 1:1 헤테로 이량체로 구성되며, 현재까지 α사슬 18종류, β사슬 8종류가 발견되어, 그들의 조합으로 24종류 이상이 동정 확인되어 있다. 각 인테그린은 각각이 특이적인 세포외 매트릭스(리간드)를 인식하는 것이 알려져 있다. 또한, 인테그린을 포함하는 막관통 세포접착 단백질의 역할은 세포와 세포외 매트릭스의 접착, 고정 뿐 아니라, 세포외 매트릭스로부터의 정보를 세포내 시그널로 변환하여, 세포의 증식, 운동, 세포사, 분화 등의 조절을 담당하고 있는 것이 해명되고 있다.
인테그린은 리간드에 대한 특이성이나 기능으로부터 서브패밀리로 분류되어, 콜라겐 수용체, 라미닌 수용체, 피브로넥틴이나 비트로넥틴 등에 포함되는 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 인식하는 RGD 수용체, 백혈구에만 존재하는 백혈구 특이적 수용체로 구별된다(Hynes RO. 2002. Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110: 673-87; Miyasaka M. 2000. New edition of Adhesion Molecule handbook. Shujunsya.). α4와 α9 인테그린은, 이들 중 어느 것에도 속하지 않는 서브패밀리로 α4 인테그린 서브패밀리라고 불리고 있다(Elise L. Palmer, Curzio Rfiegg, Ronald Ferrando, Robert Pytela, Sheppard D. 1993. Sequence and Tissue Distribution of the Integrin a9 Subunit, a Novel Partner of 131 That Is Widely Distributed in Epithelia and Muscle. The Journal of Cell Biology 123: 1289-97).
세포외 매트릭스(ECM)의 일종인 오스테오폰틴(osteopontin; 이하, OPN이라 약칭한다)은 분자량 약 41 kDa의 분비형 산성 인산화당 단백질로서, 유즙, 뇨(尿), 신세뇨관, 파골세포(osteoclast), 골아세포(osteoblast), 매크로파지, 활성화 T세포, 종양조직 등에 널리 발현이 인정되고 있는 분자이다. 분자 중앙부에 세포접착서열 GRGDS와 인간 OPN에서는 SVVYGLR 서열, 마우스 OPN에서는 SLAYGLR 서열, 그 직후에는 트롬빈 절단부위를 가지고 있어, GRGDS 서열을 매개로 RGD 수용체의 인테그린과, SVVYGLR 서열 또는 SLAYGLR 서열을 매개로 α4(α4β1)와 α9(α9β1) 인테그린과 접착한다.
α4β1은 트롬빈으로 절단되어 있지 않은 OPN(비절단형 OPN)과 트롬빈으로 절단된 N 말단 프래그먼트(절단형 OPN)의 양쪽에 결합하고, α9β1은 절단형 OPN에만 결합한다는 양식의 차이도 발견되고 있다(Y. Yokosaki et al., (1999) The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334; P. M. Green et al., (2001) FEBS Letters 503, 75-79; S. T. Barry et al., (2000) Experimental Cell Research 258, 342-351). α4 및 α9 인테그린은 OPN 이외에도 많은 공통된 리간드를 가지고 있다. 피브로넥틴의 EDA 부위, 프로펩티드-폰 빌레브란트 인자(pp-vWF), 조직형 트랜스글루타미나아제(tTG), 제XIII 혈액응고인자, 그리고 Vascular Cell Adhesion Molecule-1(VCAM-1) 등이 알려져 있다. 또한, α4 인테그린이 특이적으로 인식하는 리간드로서 피브로넥틴의 CS-1 도메인, MadCAM-1(α4β7) 등이 알려져 있다. α9 인테그린이 특이적으로 인식하는 리간드는 테나신 C, 플라스민 등이 알려 져 있다.
α4와 α9 인테그린 및 β1의 인테그린 서브유닛의 아미노산 서열은 공지로 GenBank에 등록되어 있다. 또한, 이들의 인테그린은 종간에서 아미노산 서열의 유사성이 높은 것이 알려져 있다.
WO02/081522에는 OPN 결손 마우스나 OPN에 대한 중화항체를 사용한 OPN 기능 억제에 의한, 류머티즘 유사 관절염이나 간염의 치료효과에 대해 개시되어 있다. 또한, 이 공보에는, 염증성 질환 발증에는 α4 인테그린, α9 인테그린의 인식 서열인 SVVYGLR 서열이 중요한 것, OPN에 대한 수용체가 면역담당 세포 등에서 발현하여, 염증성 질환에 관련되어 있다는 것이 개시되어 있다.
발명의 개시
현재, 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 및 골질환의 치료제는 다양하게 알려져 있지만, 보다 개선된 치료효과를 갖는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 및 골질환의 예방제 및/또는 치료제 등을 개발하는 것이 요망되고 있었다.
이에, 본 발명자들은 인테그린, 특히 α9 인테그린에 착안하여 각종 연구를 행한 결과, α9 인테그린에 대한 특이적 저해항체가 암 억제효과, 항염증효과를 갖는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 즉, 구체적으로는, 본 발명은 이하에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체, 그의 생산세포, 상기 항체를 함유하는 치료제, α9 인테그린 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝방법 등을 제공한다.
(1) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 인식하는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(2) 중쇄의 상보성 결정영역(CDRH)에서의 CDRH 1이 서열번호 16, 17, 18, 19 또는 41의 아미노산 서열이고, CDRH 2가 서열번호 20, 21, 22, 23, 또는 42의 아미노산 서열이며, CDRH 3가 서열번호 24, 25, 26, 27 또는 43의 아미노산 서열이고, 경쇄의 상보성 결정영역(CDRL)에서의 CDRL 1이 서열번호 28, 29, 30, 31 또는 44의 아미노산 서열이며, CDRL 2가 서열번호 32, 33, 34, 35 또는 45의 아미노산 서열이고, CDRL 3가 서열번호 36, 37, 38, 39 또는 46의 아미노산 서열인 항 인간 α9 인테그린 항체.
(3) 서열번호 16, 20, 24, 28, 32 또는 36의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중 하나 이상을 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(4) 서열번호 16, 20, 24, 28, 32 또는 36의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR)을 모두 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(5) 서열번호 17, 21, 25, 29, 33 또는 37의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중 하나 이상을 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(6) 서열번호 17, 21, 25, 29, 33 또는 37의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR)을 모두 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(7) 서열번호 18, 22, 26, 30, 34 또는 38의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중 하나 이상을 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(8) 서열번호 18, 22, 26, 30, 34 또는 38의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR)을 모두 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(9) 서열번호 19, 23, 27, 31, 35 또는 39의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중 하나 이상을 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(10) 서열번호 19, 23, 27, 31, 35 또는 39의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR)을 모두 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(11) 서열번호 41, 42, 43, 44, 45 또는 46의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중 하나 이상을 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(12) 서열번호 41, 42, 43, 44, 45 또는 46의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR)을 모두 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
(13) 인간 α9 인테그린과 α9 인테그린의 리간드와의 결합을 저해하는 상기 (1) 내지 (12)에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체.
(14) 수탁번호 FERM BP-10510, FERM BP-10511, FERM BP-10512, FERM BP-10513 또는 FERM BP-10832로 표시되는 하이브리도마 세포에 의하여 생산되는 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체.
(15) 단일클론 항체인 상기 (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체.
(16) 키메라 항체인 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체.
(17) 인간화 항체인 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체.
(18) 인간 항체인 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체.
(19) 상기 (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체를 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 또는 골질환의 치료제.
(20) 상기 (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체와 항 인간 α4 인테그린 항체 양쪽을 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 또는 골질환의 치료제.
(21) 상기 (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 항 인간 α9 인테그린 항체를 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 또는 골질환의 진단제.
(22) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열로부터 선택되는 1종 이상의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드를 사용하는 것을 특징으로 하는, α9 인테그린의 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝방법.
발명의 효과
본 발명의 항체는 α9 인테그린 기능 억제에 의하여, 암(예를 들면 암세포의 증식, 전이), 염증성 질환(예를 들면 관절 류머티즘, 변형성 관절증, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화, 다발성 경화증, 염증성 장질환(궤양성 대장염, 클론병)), 감염증(예를 들면 간염), 자기면역질환(예를 들면 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 근염, 자기면역성 갑상선질환, 세뇨관 간질성 신염, 중증 근무력증) 및 골질환(예를 들면 골다공증) 등에 대한 치료효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 항 α9 인테그린 항체와 항 α4 인테그린 항체 양자를 함유하는 의약 조성물은, 더욱 개선된 암, 염증성 질환 등의 치료효과를 나타낸다. 본 발명의 항체는 세포나 조직에서의 α9 인테그린의 발현을 병리학적으로 검출할 수 있는 것으로부터, 진단제로서도 이용할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1(도1a 및 1b)은 항 인간 α9 인테그린 항체의 상보인식영역(CDR)을 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 항 인간 α9 인테그린 항체 5 클론의 세포접착 저해효과를 인간 α9 인테그린 발현세포에서 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 항 인간 α9 인테그린 항체와 항 인간 α4 인테그린 항체를 공존시켰을 때의 암세포(인간·흑색종 세포)의 세포접착 저해효과를 나타내는 도면이다.
도 4는 항 마우스 α9 인테그린 항체의 류머티즘 병태 모델에서의 류머티즘의 치료효과를 나타내는 도면이다.
도 5는 항 마우스 α9 인테그린 항체의 관절염 치료효과를, 마우스 관절염 모델에서 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 항 마우스 α9 인테그린 항체에 의한 관절염 억제상을 나타낸다.
도 7은 항 α9 인테그린 항체의 관절염 발증 후의 치료효과에 대하여 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 항 마우스 α9 인테그린 항체의 관절염 발증 후의 치료효과에서의 작용 메커니즘을 검토하기 위하여, 관절부 사이토카인의 변화량을 PCR로 측정하여 조사한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 마우스 관절염 모델에서의 Th17의 관여에 대해 조사하기 위하여, 마우스 서혜 림프절(inguinal lymph)의 IL-17 및 RORγt의 발현을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
[발명의 경위]
α4 인테그린에 대한 항체인 Tysabri(등록상표)(natalizumab)는 2004년 11월에 바이오젠·아이덱(Biogen Idec Inc., 미 메사추세츠주)과 엘란(Elan Corporation, 아일랜드)이 다발성 경화증 치료제로서 미식품의약품국(FDA)으로부터 승인을 받았다. 또한, Tysabri(등록상표)는 클론병, 류머티즘 유사 관절염 등의 질환을 대상으로 하여 임상 개발되어 있다. 또한, P4C2라는 항 인간 α4β1 인테그린·단일클론 항체가 실험실 레벨에서 사용되고 있다.
그러나, α9 인테그린에 대한 항체는 인간 및 모르모트의 α9 인테그린에 특이성을 나타내는 Y9A2라 불리는 단일클론 항체(A. Wang et al, (1996) Am. J. Respir., Cell Mol. Biol. 15, 664-672)가 실험용으로서 제공되고 있지만, 임상적으로 사용되고 있지는 않다.
본 발명에서는 이하의 사항을 주의 깊게 진행시킴으로써, 인간의 α9 인테그린에 특이적으로 반응하는 항체를 얻을 수 있었다.
(1) 인간 α9 인테그린 과잉발현주의 제작
α9 인테그린에 대한 항체를 제작하기 위하여, 햄스터의 난소 유래 세포인 CHO-K1 세포로 유전자 도입을 행하고, 인간 α9 인테그린을 과잉발현하는 세포주를 수립하여, 이 세포를 항원으로서 마우스에 면역하였다.
(2) 하이브리도마의 스크리닝
세포융합으로 얻어진 각종 하이브리도마로부터 인간 α9 인테그린에만 반응하는 클론을 효율적으로 얻기 위하여, 동일한 인테그린 패밀리인 인간 α4 인테그린을 CHO-K1 세포에 발현시킨 세포를 사용하여 다른 인테그린과는 교차 반응성을 나타내지 않고, 친세포(CHO-K1)의 세포 표면 항원과는 반응하지 않는 클론을 선발함으로써, 효율적으로 인간 α9 인테그린에 특이적으로 반응하는 저해 항체를 얻었다.
[본 발명의 항 α9 인테그린 항체]
본 발명은 인간 α9 인테그린에 대한 단일클론 항체를 제공한다. 본 발명에 있어서 「항체」란, 항원인 α9 인테그린 또는 그의 부분 펩티드에 결합할 수 있는 항체분자 전체 또는 그의 단편(예를 들면, Fab, Fab’, F(ab’)2 등의 단편)을 의미하고, 다중클론 항체여도 되고 단일클론 항체여도 된다. 바람직하게는, 본 발명에 있어서는 단일클론 항체를 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서 「항체」는, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 포함한다.
본 발명에서의 「단일클론 항체」란, 항원에 대하여 고도로 특이적으로, 단일 항원을 인식하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서 「항체 단편」이란, 전장 항체의 일부를 가리키며, 항원 결합영역 또는 가변영역을 말한다. 예를 들면, 항체 단편에는 Fab, Fab’, F(ab’)2, 및 Fv 단편이 포함된다. 이들의 항체 단편은 항체의 파파인 소화, 펩신 소화 등 일반적으로 알려져 있는 방법으로 제작할 수 있다.
상기 「키메라 항체」란, 본 발명에서 얻어진 항 인간 α9 인테그린 항체의 정상영역을 인간의 항체와 동일한 정상영역을 가지도록 유전자공학적으로 개변한 인간·마우스·키메라 항체(유럽특허공개공보 EP0125023 참조)를 가리킨다. 「인간화 항체」란, 본 발명에서 얻어진 항 인간 α9 인테그린 항체의 H사슬과 L사슬의 상보인식영역 이외의 일차구조를 인간의 항체에 대응하는 일차구조로 유전자공학적으로 개변한 항체를 말한다. 「인간 항체」란, 인간의 항체 생산에 관여하는 유전자를 도입한 트랜스제닉 동물을 사용하여 제작한 단일클론 항체(유럽특허공개공보 EP0546073 참조)를 의미한다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 먼저, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 인식하는 항 인간 α9 인테그린 항체를 제공한다. 본 발명의 바람직한 태양에 의한 항체는, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열로부터 선택되는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6개의 아미노산 서열을 인식한다. 본 발명의 바람직한 항체는, (1) 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 10, 및 서열번호 11의 아미노산 서열; (2) 서열번호 5; (3) 서열번호 7; (4) 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 13의 아미노산 서열 (5) 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 10, 및 서열번호 13의 아미노산 서열; (6) 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 15의 아미노산 서열; (7) 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 10, 및 서열번호 13; (8) 서열번호 11의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 특이적으로 인식한다.
또한, 본 발명의 바람직한 태양에 의한 항체는, 서열번호 16, 20, 24, 28, 32 또는 36의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 하나 이상을 갖는다. 더욱 바람직한 항체는, 서열번호 16, 20, 24, 28, 32 또는 36의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6개를 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체이고, 특히 바람직한 항체는, (1) 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 및 서열번호 36의 아미노산 서열; (2) 서열번호 16, 서열번호 20, 및 서열번호 24의 아미노산 서열; (3) 서열번호 28, 서열번호 32, 및 서열번호 36의 아미노산 서열; (4) 서열번호 20, 및 서열번호 24의 아미노산 서열; 또는 (5) 서열번호 24, 및 서열번호 36의 아미노산 서열; 의 아미노산 서열을 함유한다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 의한 항체는, 서열번호 17, 21, 25, 29, 33 또는 37의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 하나 이상을 갖는다. 더욱 바람직한 항체는, 서열번호 17, 21, 25, 29, 33 또는 37의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6개를 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체이고, 특히 바람직한 항체는, (1) 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 25, 및 서열번호 37의 아미노산 서열; (2) 서열번호 17, 서열번호 21, 및 서열번호 25의 아미노산 서열 (3) 서열번호 29, 서열번호 33, 및 서열번호 37의 아미노산 서열 (4) 서열번호 21, 및 서열번호 25의 아미노산 서열; 또는 (5) 서열번호 25, 및 서열번호 37의 아미노산 서열; 의 아미노산 서열을 함유한다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 의한 항체는, 서열번호 18, 22, 26, 30, 34 또는 38의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중 하나 이상을 갖는다. 더욱 바람직한 항체는, 서열번호 18, 22, 26, 30, 34 또는 38의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 2 이상, 3 이상, 4 이상 5 이상 또는 6개를 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체이고, 특히 바람직한 항체는, (1) 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 26, 및 서열번호 38의 아미노산 서열; (2) 서열번호 18, 서열번호 22, 및 서열번호 26의 아미노산 서열 (3) 서열번호 30, 서열번호 34, 및 서열번호 38의 아미노산 서열 (4) 서열번호 22, 및 서열번호 26의 아미노산 서열; 또는 (5) 서열번호 26, 및 서열번호 38의 아미노산 서열; 의 아미노산 서열을 함유한다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 의한 항체는, 서열번호 19, 23, 27, 31, 35 또는 39의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 하나 이상을 갖는다. 더욱 바람직한 항체는, 서열번호 19, 23, 27, 31, 35 또는 39의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상 또는 6개를 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체이고, 특히 바람직한 항체는, (1) 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 및 서열번호 39의 아미노산 서열; (2) 서열번호 19, 서열번호 23, 및 서열번호 27의 아미노산 서열 (3) 서열번호 31, 서열번호 35, 및 서열번호 39의 아미노산 서열 (4) 서열번호 23, 및 서열번호 27의 아미노산 서열; 또는 (5) 서열번호 27, 및 서열번호 39의 아미노산 서열; 의 아미노산 서열을 함유한다.
또한, 본 발명의 다른 태양에 의한 항체는, 서열번호 41, 42, 43, 44, 45, 또는 46의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 하나 이상을 갖는다. 더욱 바람직한 항체는, 서열번호 41, 42, 43, 44, 45 또는 46의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR) 중, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 또는 6개를 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체이고, 특히 바람직한 항체는, (1) 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43, 및 서열번호 46의 아미노산 서열; (2) 서열번호 41, 서열번호 42, 및 서열번호 43의 아미노산 서열 (3) 서열번호 44, 서열번호 45, 및 서열번호 46의 아미노산 서열 (4) 서열번호 42, 및 서열번호 43의 아미노산 서열; 또는 (5) 서열번호 43, 및 서열번호 46의 아미노산 서열; 의 아미노산 서열을 함유한다.
본 발명에서 특히 바람직한 항체는, 수탁번호 FERM BP-10510, FERM BP-10511, FERM BP-10512, FERM BP-10513 또는 FERM BP-10832로 표시되는 하이브리도마 세포에 의하여 생산되는 항 인간 α9 인테그린 항체이다.
이하, 항 α9 인테그린 단일클론 항체의 제작에 대하여 상세하게 기술하나, 이 항체의 제작은 이것에 한정되는 것은 아니다.
[α9 인테그린(항원)]
본 발명에서 항원으로서 사용하는 α9 인테그린은, (1) 인간이나 그 외의 포유동물의 α9 인테그린을 발현하는 모든 세포, 또는 그들의 세포가 존재하는 모든 조직에 유래하는 단백질, (2) α9 인테그린을 코드하는 유전자 DNA, 바람직하게는 cDNA를 세균, 효모, 동물세포 등의 세포주에 도입, 발현시킨 재조합 단백질이어도 되고, 또한 (3) 합성 단백질이어도 된다.
또한, 본 발명의 α9 인테그린에는, 각종 포유동물의 α9 인테그린의 아미노산 서열, 특히 바람직하게는 인간 α9 인테그린의 아미노산 서열(서열번호: 40)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다.
여기서 「실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」란, 천연형의 α9 인테그린, 특히 바람직하게는 인간 유래의 α9 인테그린과 실질적으로 동등한 생물학적 성질을 갖는 한, 이 아미노산 서열 중의 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 수 개(예를 들면, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 수식되어 있는 아미노산 서열을 갖는 변이 폴리펩티드, 및 이 천연형의 α9 인테그린, 특히 바람직하게는 인간 유래의 α9 인테그린의 아미노산 서열 중에, 복수개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 특히 바람직하게는 1 내지 수 개(예를 들면, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개)의 아미노산이 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 이와 같은 치환, 결실, 수식 및 부가의 복수를 갖는 변이 폴리펩티드여도 된다.
본 발명의 α9 인테그린, 특히 인간 유래의 α9 인테그린은 유전자 재조합 기술 외에, 화학적 합성법, 세포배양방법 등과 같은 당해 기술분야에 있어서 공지의 방법 또는 그의 수식방법을 적절히 사용함으로써 제조할 수 있다.
또한, 변이 폴리펩티드의 제조방법으로서는, 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드 부위 돌연변이 도입법(gapped duplex법), 아질산 및 아황산처리에 의하여 랜덤으로 점돌연변이를 도입하는 방법, Ba131 효소 등에 의하여 결실 변이체를 제작하는 방법, 카세트 변이법, 링커 스캐닝법, 미스인코퍼레이션법, 미스매치 프라이머법, DNA 세그먼트 합성법 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 α9 인테그린에는 이 α9 인테그린의 「일부」도 포함된다. 여기서 「일부」란, OPN, 테나신-C, VCAM-1 등의 α9 인테그린 리간드와 결합하기 위하여 필요한 영역을 포함하는 부분으로, 구체적으로는 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째부터 980번째를 포함하는 부분을 말한다. 이 α9 인테그린의 「일부」는, 후술하는 당해 기술분야에 있어서 공지의 방법 또는 그의 수식방법에 따라, 유전자 재조합기술 또는 화학적 합성법에 의하여 제조하는 것도 가능하며, 또한 세포배양방법에 의하여 단리한 α9 인테그린, 특히 바람직하게는 인간 유래의 α9 인테그린을 단백질 분해효소 등에 의하여 적절하게 절단함으로써 제조할 수 있다.
항원으로서는 또한, α9 인테그린을 재조합 기술에 의하여 세포막 상에 과잉발현하는 세포 자체, 또는 그 막 분획 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 α9 인테그린에는, 인간 α9 인테그린의 아미노산 서열(서열번호: 40)과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드도 포함된다. 서열번호: 40으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로서, 구체적으로는, 서열번호: 1부터 15로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, 인간 α9 인테그린을 들 수 있다. 또한, 특히 본 발명에서는 인간 α9 인테그린을 재조합 기술에 의하여 세포막 상에 과잉발현하는 세포 자체가 적합하게 사용된다. 따라서, 후술하는 바와 같은, 인간 α9 인테그린을 코드하는 유전자(예를 들면, cDNA)를 공지의 유전자공학기술을 사용하여 클로닝하고, 인간 α9 인테그린을 세포막 상에 과잉발현하는 세포 자체, 또는 그 세포막 분획을 항원으로서 조제하는 경우도 있다.
[항체 생산세포의 조제]
항원은 면역되는 동물에 대하여 투여에 의해 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여할 때에 항체 생산능을 높이기 위하여, 완전 프로인트 애쥬번트나 불완전 프로인트 애쥬번트를 투여해도 된다. 투여는 통상 1~6주마다 1회씩, 합계 2~10회 정도 행해진다. 사용되는 온혈동물로서는, 예를 들면, 마우스, 원숭이, 토끼, 개, 모르모트, 랫트, 햄스터, 양, 염소, 닭 등을 들 수 있지만, 본 발명에서는 마우스가 바람직하게 사용된다.
치료의 대상이 인간이고, α9 인테그린 저해항체 생산동물이 마우스인 경우에는, 인간 마우스 키메라 항체나 인간화 항체를 사용하는 것이 바람직하고, 또한, 항체 생산에 관여하는 인간유전자를 도입한 마우스 등의 트랜스제닉 동물을 사용하여 인간형 단일클론 항체를 제작하여 사용하는 것이 바람직하다.
[항체 생산세포와 골수종 세포와의 세포융합]
골수종 세포로서는, 마우스, 랫트, 인간 등에 유래하는 세포가 사용된다. 예를 들면 마우스 골수종 P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2/0-Ag14, P3X63-Ag8-653 등을 들 수 있지만, 항체 생산세포와 골수종 세포는 동종 동물, 특히 동계통의 동물 유래인 것이 바람직하다. 골수종 세포는 동결보존하거나, 말, 토끼 또는 소 태아혈청을 첨가한 일반적인 배지에서 계대(繼代)하여 유지할 수 있다. 세포융합에는 대수증식기의 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 P3X63-Ag8-653이 적합하게 사용된다.
항체 생산세포와 골수종 세포를 융합시켜서 하이브리도마를 형성시키는 방법으로서는, 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하는 방법, 센다이 바이러스를 사용하는 방법, 전기융합장치를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 예를 들면 PEG법의 경우, 약 30~60%의 PEG(평균 분자량 1000~6000)를 포함하는 적당한 배지 또는 완충액 중에 비장세포와 골수종 세포를 1~10:1, 바람직하게는 5~10:1의 혼합비로 현탁하고, 온도 약 25~37℃, pH 6~8의 조건하에서, 약 30초~3분간 정도 반응시키면 된다. 반응 종료 후, PEG 용액을 제거하고 배지에 재현탁하여, 셀 웰 플레이트 중에 파종하여 배양을 계속한다.
[하이브리도마 세포의 선별]
단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별은, 공지 또는 그것에 준하는 방법에 따라 행할 수 있다. 통상, HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)를 첨가한 동물세포용 배지에서 행할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는, 하이브리도마 세포가 생육할 수 있는 것이라면 어떤 배지를 사용해도 된다. 예를 들면, 1~20%, 바람직하게는 10~20%의 소 태아혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지, 1~10%의 소 태아혈청을 포함하는 GIT 배지(와코순약공업(주)) 또는 하이브리도마 배양용 무혈청배지(SFM-101, 닛스이제약(주)) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는 통상 20~40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 배양시간은 통상, 5일~3주간, 바람직하게는 1주간~2주간이다. 배양은 통상 5% CO2하에서 행할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체의 생산은, 신 임상면역실험조작법(part 3), 과학평론사, 1997에 기재되는 세포 ELISA법을 사용하여 확인 및 스크리닝할 수 있다. 면역에 사용한 세포를 스크리닝에 사용하면 백그라운드가 높아지는 것이나 위양성(僞陽性)이 많아지는 것이 예상되는 경우, 면역에 사용한 세포와는 별도의 세포에서 과잉발현하는 인간 α9 인테그린에 반응하고, 또한, 인간 α4 인테그린을 과잉발현하는 세포에 반응하지 않는 클론을 항 인간 α9 인테그린 항체로 할 수 있다. 이와 같은 클론으로부터 한계희석법을 1에서 5회, 바람직하게는 2에서 4회 반복함으로써 단일클론 항체를 조제할 수 있다.
[항체의 분리정제]
얻어진 항체는 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 된다. 예를 들면 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등의 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 이들에 한정되는 것은 아니다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다.
[항체의 표지화]
얻어진 항체를, 공지의 방법 또는 시판의 키트를 사용하여 각종 표지화(예를 들면, 비오틴 표지, FITC 표지, APC 표지)할 수 있다. 본 발명에서는, Biotin Labeling Kit(도진도화학)를 사용한 비오틴 표지가 바람직하게 사용된다.
이와 같이 하여 얻어진 단일클론 항체는 필요에 따라 정제한 후, 통상의 방법에 따라 제제화하여, 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 및 골질환 등의 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다. 이들의 예방 및/또는 치료제로서의 제형은 주사제, 점적용제 등의 비경구 제제로 할 수 있고, 창의 고안에 의하여 경구제제로서 사용할 수 있다. 또한, 제제화에 있어서는, 약사상 및 약학적으로 허용되는 범위 내에서, 제형에 적합한 담체, 희석제 또는 첨가제 등을 사용할 수 있다.
[항체의 약리학적 효과]
인테그린의 역할은, 세포와 세포외 매트릭스(ECM)의 접착, 고정 뿐 아니라, 세포외 매트릭스로부터의 정보를 세포내 시그널로 변환하여, 세포의 증식, 운동, 세포사, 분화 등의 조절을 담당하고 있는 것이 해명되어 오고 있다. 따라서, 얻어진 단일클론 항체는, ECM과 α9 인테그린과의 결합을 저해함으로써, ECM으로부터의 정보의 세포내 시그널 전달을 차단할 수 있는 것으로부터, ECM이 관여하는 질환의 치료가 가능하다. α9 인테그린에 결합하는 ECM, 및 α9 리간드로서 OPN, 피브로넥틴, 프로펩티드-폰 빌레브란트 인자(pp-vWF), 조직형 트랜스글루타미나아제(tTG), 제XIII 혈액응고인자, Vascular Cell Adhesion Molecule-1(VCAM-1), 테나신 C, 플라스민 등이 알려져 있다. 이들의 ECM과 α9 인테그린을 발현하고 있는 세포나 암세포를 사용하여, 얻어진 단일클론 항체의 존재하에서의 결합 저해를 인 비트로(in vitro)로 관찰함으로써, 본 발명의 단일클론 항체의 대상질환을 발견할 수 있다.
한편, 항 인간 α9 인테그린 항체를 인간에 대한 치료용 의약품으로서 사용하는 경우, 그 효과의 확인이 필요한 전(前)임상개발단계에서 인 비보(in vivo)의 병태 모델 동물에서는 인간의 항원에 대한 항체의 효과를 확인할 수 없다. 즉, 인간에 투여하여 치료효과를 확인하는 임상시험을 행하기 전에, 대상질환에 대한 치료효과를 확인하는 동물실험이 요구된다. 마우스는 그 유전적 배경이 명확해진 계통이 많아, 인간의 질환과 거의 동일한 질환을 관찰할 수 있는 병태 모델이 많이 알려져 있기 때문에, 실험 동물로서 바람직하다. 그러나, 일반적으로 항체 의약품은 인간의 항원에 대한 항체로, 마우스의 동일한 대상의 항원과 교차반응을 나타내는 경우는 적어, 마우스의 대상항원에 대한 항체를 조제하여, 그것을 사용하여 동물실험을 행함으로써, 인간에서 사용하는 항체의 약리효과, 임상시험을 위한 투여량의 추정, 대상항원 이외로의 반응성, 부작용의 발증 등을 관찰하여, 인간에서의 작용을 반영할 수 있다. 구체적으로는, 항 마우스 α9 인테그린 항체를 병태 모델의 마우스에 투여함으로써, 항 인간 α9 인테그린 항체의 대상질환이 명확해진다.
[항체를 함유하는 의약]
본 발명의 항체(특히, 단일클론 항체)를 유효성분으로 하는 제제는, 암, 예를 들면 암세포의 증식, 전이, 염증성 질환(예를 들면 관절 류머티즘, 변형성 관절증, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화, 다발성 경화증, 염증성 장질환(궤양성 대장염, 클론병)), 감염증(예를 들면 간염), 자기면역질환(예를 들면 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 근염, 자기면역성 갑상선질환, 세뇨관 간질성 신염, 중증 근무력증) 및 골질환(예를 들면 골다공증) 등의 치료제로서 사용할 수 있다. 여기서, 「치료」라는 용어는 「예방」이라는 의미를 포함하는 의미로 사용된다.
투여량은 투여대상, 대상질환, 증상, 투여루트 등에 따라서도 다르지만, 예를 들면, 암환자의 예방 및/또는 치료를 위하여 사용하는 경우에는, 본 발명의 항체를 1회량으로서, 통상 0.01~20 ㎎/㎏ 체중 정도, 바람직하게는 0.1~10 ㎎/㎏ 체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1~5 ㎎/㎏ 체중 정도를, 1개월에 1~10회 정도, 바람직하게는 1개월에 1~5회 정도, 정맥주사에 의하여 투여하는 것이 적절하다. 다른 비경구투여 및 경구투여의 경우도 이것에 준하는 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 중한 경우에는, 그 증상에 따라 증량 또는 투여횟수를 증가시켜도 된다.
본 발명의 항체는 그 자체 또는 적당한 의약 조성물로서 투여할 수 있다. 상기 투여에 사용되는 의약 조성물은, 상기 항체 또는 그의 염과 약리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것이다. 이와 같은 조성물은 비경구 투여 또는 경구에 적합한 제형으로서 제공된다.
즉, 비경구 투여를 위한 조성물로서는, 예를 들면, 주사제, 점비제, 좌제 등이 사용되고, 주사제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등의 제형을 포함한다. 이와 같은 주사제는 공지의 방법에 따라, 예를 들면, 상기 항체 또는 그의 염을 통상 주사제에 사용되는 무균의 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제한다. 주사용의 수성액으로서는, 예를 들면, 생리식염수, 포도당, 자당, 만니톨, 그 외의 보조제를 포함하는 등장액 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예를 들면, 알코올(예, 에탄올), 폴리알코올(예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제[예, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, HCO-50(polyoxyethylene(50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] 등과 병용해도 된다. 유성액으로서는, 예를 들면, 참기름, 대두유 등이 사용되고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질, 벤질알코올 등을 병용해도 된다. 조제된 주사액은, 통상, 적당한 앰플, 바이알, 시린지에 충전된다. 직장 투여에 사용되는 좌제는, 상기 항체를 통상의 점비제용 기제, 좌제용 기제에 혼합함으로써 조제된다. 또한, 일반적으로 항체 등의 단백질의 경구투여는 소화기에 의하여 분해되기 때문에 곤란한 것으로 여겨지지만, 항체 단편이나 수식한 항체 단편과 제형의 창의 고안에 의하여, 경구투여의 가능성도 있다.
상기의 비경구용 의약 조성물은, 활성성분의 투여량에 적합하도록 투약단위의 제형으로 조제되는 것이 바람직하다. 이와 같은 투약단위의 제형으로서는, 주사제(앰플, 바이알, 프리필드·시린지), 점비제, 좌제 등이 예시되고, 각각의 투약단위는 제형당 통상 5~500 ㎎, 특히 주사제의 경우는 5~100 ㎎, 그 외의 제형의 경우는 10~250 ㎎의 상기 항체가 함유되어 있는 것이 바람직하다.
또한 상기한 각 조성물은 상기 항체와의 배합에 의하여 바람직하지 않은 상호작용을 발생시키지 않는 한 다른 활성성분을 함유해도 된다. 예를 들면, 본 발명의 의약제제는, 상기 항체에 더하여 항 인간 α4 인테그린 항체를 함유시킬 수 있다. 이 경우의 혼합비는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 항 인간 α9 인테그린 항체: 항 인간 α4 인테그린 항체의 비율을 1~99:99~1의 비율의 범위 내에서 조정할 수 있다.
[본 발명의 단일클론 항체를 함유하는 진단제]
본 발명의 단일클론 항체를 함유해서 되는 의약 조성물은, 염증성 질환, 예를 들면 류머티즘 관절염, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 암 전이, 동맥경화, 다발성 경화증, 육아종 등의 진단제, 또한 장기이식 후의 만성 거절반응 억제, 전신성 자기면역질환·홍반성 루푸스·포도막염·베체트병·다발성 근염·사상체 증식성 신염·사르코이도시스 등의 자기면역질환의 진단제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체는 α9 인테그린을 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 중의 α9 인테그린의 정량, 특히 샌드위치 면역측정법, 경합법, 면역메트릭법(immunometric method) 또는 네프로메트리법(nephrometry method) 등에 의한 정량 등에 사용할 수 있다. 이들 각각의 면역학적 측정법을 본 발명의 측정방법에 적용하는데 있어서는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요로 하지 않는다. 각각의 방법에 있어서 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 더하여 LLPL 또는 그의 염의 측정계를 구축하면 된다. 이들의 일반적인 기술 수단의 상세에 대해서는, 총설, 성서 등을 참조할 수 있다.
이상과 같이, 본 발명의 항체를 사용함으로써 α9 인테그린을 감도 좋게 정량할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 사용하는, 생체 내에서의 α9 인테그린의 정량법을 이용함으로써, α9 인테그린이 관련하는 각종 질환을 진단할 수 있다. 예를 들면, α9 인테그린의 농도의 증감이 검출된 경우는, α9 인테그린이 관련하는 질환, 예를 들면 염증성 질환일 가능성이 높거나 또는 장래 이환할 가능성이 높다고 진단할 수 있다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는, 체액이나 조직 등의 피검체 중에 존재하는 α9 인테그린을 특이적으로 검출하기 위하여 사용할 수 있다. 또한, α9 인테그린을 정제하기 위하여 사용하는 항체 칼럼의 제작, 정제시의 각 분획에 포함되는 α9 인테그린의 검출, 피검세포내에서의 α9 인테그린 거동의 분석 등에 사용할 수 있다.
[인간 α9 인테그린의 활성을 저해하는 화합물의 스크리닝방법]
본 발명의 항체가 인식하는 인간 α9 인테그린 상의 에피토프를 이용하여, 인간 α9 인테그린의 활성을 저해하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 서열을 함유하는 펩티드(이하, 「펩티드 A」라고 한다)를 사용하는 것을 특징으로 하는, 인간 α9 인테그린의 활성을 저해하는 저분자 화합물의 스크리닝방법을 제공한다.
펩티드 A로서는, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15의 아미노산 서열로부터 선택되는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 또는 8개의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다. 펩티드 A는 공지의 합성법에 의하여 합성할 수 있다. 더욱 바람직한 펩티드 A는, (1) 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 및 서열번호 12의 아미노산 서열; (2) 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 11의 아미노산 서열; (3) 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 14의 아미노산 서열; (4) 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 10, 서열번호 13, 및 서열번호 14의 아미노산 서열; (5) 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 13의 아미노산 서열; (6) 서열번호 10, 및 서열번호 13의 아미노산 서열, 또는 (7) 서열번호 5, 및 서열번호 7의 아미노산 서열의 아미노산 서열을 함유한다.
본 발명의 스크리닝방법에 있어서는, 예를 들면, (i) 펩티드 A와, 인간 α9 인테그린의 리간드(예를 들면, 테나신 C, 플라스민 등)를 접촉시킨 경우와 (ii) 펩티드 A와, 리간드 및 시험 화합물을 접촉시킨 경우의 비교를 행한다. 공정 (i)과 (ii)의 비교는, 예를 들면, 펩티드 A에 대한 리간드의 결합량을 측정함으로써 행한다. 그와 같은 결합량의 비교를 용이하게 하기 위하여, 공지의 수법에 의하여 표지한 리간드를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 방법에 의하여 얻어진 후보 화합물에 대하여, 인간 α9 인테그린 활성의 저해 여부를 확인하는 실험을 행하여, 인간 α9 인테그린의 활성을 저해하는 화합물을 얻는다.
여기서 피험물질로서는, 폴리펩티드, 단백질, 생체 유래의 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 미생물 배양물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 등을 사용할 수 있고, 신규 화합물이어도 되고 공지의 화합물이어도 된다.
선택되는 화합물은 본 발명의 항체와 마찬가지로, 암, 염증성 질환, 감염증, 자기면역질환 및 골질환 등의 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다.
이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이것은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1)
[인간 α9 인테그린에 대한 항체의 제작]
인간 α9 인테그린에 대한 항체 제작은, Subtractive Immunization법(Williams C.V., Stechmann C.L., McLoon S.C., Biotechniques. (1992) 12: 842-847)을 참고로 하여 BALB/c 마우스 3마리에 대하여 면역을 행하였다. 먼저, CHO-K1 세포를 4×106 세포/마리 복강 내 투여하고, 다음날과 그 다음날, 시클로포스파미드를 4 ㎎/마리, 복강 내 투여하였다. 시클로포스파미드 투여 2주 후, 인간 α9 인테그린 발현세포(인간 α9/CHO-K1 세포)를 2×106 세포/마리 복강 내 투여하고, 또한 그 2주 후, 인간 α9/CHO-K1 세포를 3×106 세포/마리 복강 내 투여하였다. 인간 α9/CHO-K1 세포에 반응하고, 또한, 인간 α4 인테그린 발현 CHO-K1 세포에 반응하지 않는 클론을 항 α9 인테그린 항체로 하였다. 그 결과, 항 인간 α9 인테그린 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 5 클론(1K11, 21C5, 24I11, 25B6, 28S1)을 수립하였다.
여기서 얻어진 하이브리도마 세포 1K11, 21C5, 24I11 및 25B6는 2006년 2월 15일에, 28S1은 2007년 5월 29일에 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6 (우편번호 305-8566), 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 각각 수탁번호 FERM BP-10510, 10511, 10512, 10513 및 FERM BP-10832로서 수탁되어 있다.
(실시예 2)
[항 인간 α9 인테그린 항체의 에피토프 해석]
인간 α9 인테그린의 N 말단으로부터, 1-12번째의 아미노산 서열의 펩티드, 4-15번째의 아미노산 서열의 펩티드, 7-18번째의 아미노산 서열의 펩티드와 같이, 3 아미노산씩 C 말단방향으로 슬라이드시킨 아미노산 12개로 되는 펩티드를 C6 스페이서에 배치하고, 추가적으로 βAla를 2개 결합한 셀룰로오스 막 상에서, 5 nmol/spot이 되도록 조제하였다. Blocking buffer(Milk/0.05% Tween 20 in PBS)로 막을 블로킹한 후, 통상의 방법을 토대로 조제한 퍼옥시다아제 표지 항 인간 α9 인테그린 항체(1K11, 21C5, 24I11 및 25B6) 1.0 ㎍/mL 용액 10 mL에 막을 실온에서, 3시간 침지하였다. 막을 세정액(T-TBS)으로 세정한 후, ECL detection Reagent로 실온에서, 1분간 반응시켰다. 효소반응 생성물의 형광을 관찰하고, 형광 강도로부터 에피토프를 동정하였다. 또한, 대조로서 항 인간 α9 인테그린 항체로서 시판되고 있는 Y9A2를 사용하였다.
이하의 표 1에 나타내는 바와 같이, 1K11은 인간 α9 인테그린의 아미노산 서열(서열번호 40의 79번째-96번째(서열번호 2), 160번째-177번째(서열번호 5), 238번째-252번째(서열번호 7), 277번째-294번째(서열번호 8), 454번째-471번째(서 열번호 10) 및 556번째-573번째(서열번호 11)를, 21C5는 79번째-96번째(서열번호 2), 124번째-141번째(서열번호 3), 160번째-177번째(서열번호 5), 238번째-252번째(서열번호 7), 277번째-294번째(서열번호 8), 409번째-432번째(서열번호 9), 454번째-471번째(서열번호 10), 556번째-573번째(서열번호 11), 592번째-621번째(서열번호 12), 706번째-723번째(서열번호 14) 및 931번째-951번째(서열번호 15)를, 24I11은 79번째-96번째(서열번호 2), 142번째-156번째(서열번호 4), 160번째-177번째(서열번호 5), 238번째-252번째(서열번호 7), 277번째-294번째(서열번호 8), 556번째-573번째(서열번호 11), 706번째-723번째(서열번호 14) 및 931번째-951번째(서열번호 15)를, 25B6는 40번째-51번째(서열번호 1), 160번째-177번째(서열번호 5), 208번째-225번째(서열번호 6), 238번째-252번째(서열번호 7) 및 646번째-657번째(서열번호 13)를 인식하고, 이들의 항체는 일부분의 펩티드가 아닌, 입체구조를 인식하고 있는 것이 시사되었다. 또한, 본 발명에서 얻어진 항 인간 α9 인테그린 항체는 대조로 한 Y9A2와 반응하는 펩티드가 상이한 것으로부터, Y9A2와는 상이한 에피토프를 인식하는 항체라고 말할 수 있다.
Figure 112009007157788-pct00001
(실시예 3)
[항 인간 α9 인테그린 항체의 상보인식영역(CDR)의 해석]
인간 α9 인테그린 항체(1K11, 21C5, 24I11, 25B6, 28S1)를 생산하는 하이브리도마로부터 mRNA를 추출하여, 역전사에 의하여 cDNA를 제작하였다. 이 cDNA를 주형으로 하고, ScFv 클로닝용 프라이머(Light Primer Mix, Heavy Primer Mix; 아머샴 바이오사이언스사)를 사용하여 PCR을 행하고, 항체의 중쇄와 경쇄의 가변영역을 각각 신장·증폭하였다. 다음으로, PCR 산물을 통상의 방법을 토대로 pCR II TOPO vector로 삽입하였다. 이것을 시퀀스하여 아미노산 서열을 결정하였다. 각 항체에 대하여 3회씩 상기의 조작을 행하였다.
도 1에 나타내는 바와 같이, 1K11은 중쇄의 CDR이 DYNMD(서열번호 16), DINPNNGGTIYNQKFQG(서열번호 20) 및 SGVISTDY(서열번호 24)이고, 경쇄의 CDR이 RASQEISGYLI(서열번호 28), AASTLDS(서열번호 32) 및 YANYPP(서열번호 36)으로 구성되며, 21C5는 중쇄의 CDR이 DYYMY(서열번호 17), TISDGGNYTYYPDSVKG(서열번호 21) 및 DRDGSSLFAY(서열번호 25)이고, 경쇄의 CDR이 KASQDVNIAVA(서열번호 29), WASTRHT(서열번호 33) 및 HYNTPW(서열번호 37)로 구성되며, 24I11은 중쇄의 CDR이 DTYVH(서열번호 18), NIDPANGNTKYDPKFQG(서열번호 22) 및 WLRHFYYAMDY(서열번호 26)이고, 경쇄의 CDR이 RASENIYYSLA(서열번호 30), NANSLED(서열번호 34) 및 AYDVPY(서열번호 38)로 구성되며, 25B6는 중쇄의 CDR이 SYGVH(서열번호 19), VIWSGGSTNYNSALMS(서열번호 23) 및 DYGNYPWFAY(서열번호 27)이고, 경쇄의 CDR이 KASQDVNTAVA(서열번호 31), SASYRYT(서열번호 35), 및 HYSTPC(서열번호 39)로 구성되며, 28S1은 중쇄의 CDR이 GYGVN(서열번호 41), MIWGDGITEYNSALKSR(서열번호 42) 및 DASSGYGFAY(서열번호 43)이고, 경쇄의 CDR이 TASSSVSSSYLH(서열번호 44), STSNLAS(서열번호 45) 및 YHRSPY(서열번호 46)로 구성되어 있는 것이 판명되었다.
참고를 위하여 CDR과 서열번호의 대응을 표 2에 나타낸다.
Figure 112009007157788-pct00002
(실시예 4)
[항 인간 α9 인테그린 항체의 세포접착 저해효과]
세포접착할 때에는 α9 인테그린이 OPN, 피브로넥틴, 테나신 C, VCAM-1 등의 세포외 매트릭스(ECM)를 포함하는 α9 리간드와 결합하는 것으로부터, 얻어진 항 인간 α9 인테그린 항체가 세포접착을 저해할 때의 대상이 될 수 있는 세포외 매트릭스를 검토하였다.
hOPN (RAA)N-half는 인간 OPN의 GRD 서열을 RAA 서열로 변환시켜서 트롬빈 절단부위까지의 N말단 영역을 GST 융합 단백질로서 대장균으로부터 정제하고, 프리시전 프로테아제(아머샴 바이오사이언스사)를 사용하여 GST를 절단, 제거한 단백질이다. VCAM-1은 R&D System사로부터 입수하였다. 테나신 C는 α9 인테그린에 대한 테나신 C 접착서열영역인 AEIDGIEL 펩티드, 인간 피브로넥틴은, α9 인테그린과의 접착에 중요한 EDA 영역 내 부분 펩티드인 CPEDGIHELFP 펩티드를 합성하고, BSA와 결합시킨 것을 이용하였다. 인간 α9 인테그린 고발현 세포로서 인간 α9 인테그린을 발현한 CHO-K1 세포(인간 α9/CHO-K1)를 사용하였다.
1.25~5.0 ㎍/mL의 테나신 C, 피브로넥틴, VCAM-1 또는 hOPN (RAA) N-half를 96 웰 플레이트에 50 ㎕씩 첨가하고, 37도에서 1시간 정치함으로써 고정화하였다. 블로킹액(0.5% BSA/PBS)으로 블로킹 후, PBS로 한 번 세정하고, 0.25% BSA 첨가 D-MEN으로 현탁한 인간 α9/CHO-K1 세포와 얻어진 단일클론 항체를 혼합하고, 세포 1.0×105개/ml, 항체농도 10 ㎍/mL가 되도록 200 ㎕씩 첨가하였다. 37℃, 5% CO2하에서 1시간 반응 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛(WAKO, Osaka, Japan)/20% 메탄올용액을 50 ㎕씩 웰에 첨가하고, 실온에서 30분간 방치함으로써 세포의 고정과 염색을 행하였다. 증류수로 플레이트를 세정 후, 20% 초산용액으로 전용하고, 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 음성 대조로서 인간·오스테오폰틴에 대한 단일클론 항체(5A1), 양성 대조로서 시판의 항 인간 α9 인테그린 항체 Y9A2를 사용하였다.
도 2에 그 결과를 나타낸다. 테나신 C 관여의 세포접착은 21C5, 24I11, 25B6 및 28S1로 저해되었지만, 1K11로는 저해되지 않았다. 피브로넥틴 관여의 세포접착은 21C5, 25B6 및 28S1로 저해되고, 24I11로 약간의 저해가 관찰되었지만, 1K11로는 저해되지 않았다. VCAM-1 관여의 세포접착은 21C5, 24I11, 25B6 및 28S1에서 저해가 관찰되었지만, 1K11로는 저해되지 않았다. hOPN (RAA) N-half 관여의 세포접착은 21C5, 24I11, 25B6 및 28S1로 저해되었지만, 1K11로는 저해되지 않았다.
(실시예 5)
[항 인간 α4 인테그린 항체와 항 인간 α9 인테그린 항체의 공존하에서의 세포접착 저해효과]
α4 및 α9 인테그린은 많은 공통하는 ECM에 결합한다. 이에, 양쪽의 인테그린에 대한 항체가 존재함으로써, 세포접착 저해효과의 증강이 생각되어진다. 이에, 항 인간 α4 인테그린 항체와 항 인간 α9 인테그린 항체의 공존하에서의 암 전이 억제효과를 in vitro로 조사하기 위하여, α4 인테그린과 α9 인테그린을 발현하고 있는 암세포인 인간·흑색종 세포(G361)와 ECM의 접착에 미치는 양 항체의 영향을 검토하였다.
ECM으로서 VCAM-1(1.25 ㎍/mL)을, 항 인간 α4 인테그린 항체는 P1H4를 사용하여, 실시예 4와 동일하게 실시하였다.
도 3에 그 결과를 나타낸다. VCAM-1이 관여하는 세포접착은 모두 항체에서 저해되지 않았지만, 항 인간 α4 인테그린 항체가 공존하면, 양성 대조(Y9A2), 21C5 및 24I11에서 저해가 보였다. 많은 α9 인테그린을 발현하고 있는 세포는 α4 인테그린도 발현하고 있는 것으로부터, 항 인간 α4 인테그린 항체와 항 인간 α9 인테그린 항체를 병용함으로써 세포접착의 억제가 가능해져, 암 침윤을 포함하여 많은 질환억제의 증강효과를 기대할 수 있는 것으로 시사되었다.
(실시예 6)
[항 마우스 α9 인테그린 항체의 항 류머티즘효과]
7주령의 자성(雌性) 마우스(Balb/c)에 항 마우스 α9 인테그린 항체(55A2C), 대조로서 정상 Hamster IgG(이후 NHG로 생략)를 각각 3마리에 400 ㎍/마리를 복강 내 투여하였다. 24시간 후에 관절염 야기용 타입 II 콜라겐 단일클론 항체 칵테일(Chondrex사)을 2 ㎎/mouse 정맥 투여하였다. 타입 II 콜라겐 단일클론 항체 칵테일을 투여하고나서 72시간 후에, 다시 55A2C 또는 NHG 400 ㎍/마리를 복강 내 투여하였다. 동시에 LPS 50 ㎍/마리를 복강 내 투여하였다. LPS 투여 3일 전부터 LPS 투여 후 6일째까지 마우스를 관찰하고, 우드의 방법(F. D. Wood, C. M. Pearson, A Tanaka, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 35, 456 (1969))에 준하여 관절염의 정도를 채점하고, 스코어를 기록하였다.
도 4에 그 결과를 나타낸다. 대조의 NHG에서는 스코어가 상승하고, 류머티즘의 발증이 관찰되었지만, 항 마우스 α9 인테그린 항체에서는 류머티즘의 발증을 완전히 억제하는 것이 시사되었다. 따라서, 항 α9 인테그린 항체는 류머티즘의 발증이나 악화를 억제하는 치료효과를 갖는 것을 알 수 있었다.
(실시예 7)
[항 마우스 α9 인테그린 항체의 관절염 치료효과]
면역계를 제어하는 헬퍼 T 세포는 종래 Th1과 Th2로 크게 구별되는 것으로 생각되어지고 있지만, 최근, Th17 세포나 억제성 T 세포 등이 존재하는 것이 밝혀졌다. 또한, 인터루킨(IL)-23에 의하여 증가하는 Th17 세포만이 파골세포를 늘리는 작용을 갖는 것을 알 수 있었다. Th17세포는 IL-17을 생산함으로써 주위 세포의 염증을 일으키는 동시에 파골세포 분화인자 RANKL(receptor of activator of NF-κB ligand)을 늘림으로써, 파골세포가 생기기 쉬운 환경을 만들어내고 있다. 또한, IL-23이나 17의 유전자를 파괴한 마우스에서는, 염증성 골파괴가 생기지 않았던 것으로부터, 이들 인자가 골파괴에 중요한 역할을 담당하는 것이 보고되어 있다. 이에, 항 α9 인테그린 항체의 Th17에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 마우스의 관절염 모델과 항 마우스 α9 인테그린 항체로 검토하였다.
6주령의 자성 마우스(Balb/c)에 항 마우스 α9 인테그린 항체(18R18D, 55A2C), 대조로서 Normal Hamster IgG(이후 NHG로 생략)를 각각 3마리에 400 ㎍/마리를 복강 내 투여하였다. 18R18D는 세포접착 억제능을 갖지 않는 항 α9 인테그린 항체이고, 55A2C는 세포접착 억제능을 갖는 항체이다. 24시간 후에 관절염 야기용 타입 II 콜라겐 단일클론 항체 칵테일(Chondrex사)을 2 ㎎/mouse 정맥 투여하였다. 타입 II 콜라겐 단일클론 항체 칵테일을 투여하고나서 72시간 후에, 다시 55A2C 또는 NHG 400 ㎍/마리를 복강 내 투여하였다. 동시에 LPS 50 ㎍/마리를 복강 내 투여하였다. LPS 투여 3일 전부터 LPS 투여 후 6일째까지 마우스를 관찰하고, 우드의 방법(F. D. Wood, C. M. Pearson, A Tanaka, Int. Arch. Allergy ppl. Immunol. 35, 456(1969))에 준하여, 즉, 「0: 증상 없음, 1: 사지의 손가락·발가락 등 소관절이 하나만 종창 발적, 2: 소관절 2개 이상, 또는 손목이나 발목 등의 비교적 큰 관절이 종창 발적, 3: 하나의 손이나 발 전체가 종창 발적, 4: 추가적으로 하나의 손이나 발의 전체적인 종창이 최대한에 도달하여 있음」의 평가 항목을 사용하여, 관절염의 정도를 채점하고, 스코어를 기록하였다.
도 5에 그 결과를 나타낸다. NHG와 18R18D에서는 스코어가 상승하고, 관절염의 발증이 관찰되었지만, 항 마우스 α9 인테그린 항체 55A2C에서는 관절염의 발증을 극적으로 억제하는 것을 알 수 있었다. 항 α9 인테그린 항체는 관절염의 발증 예방효과와 함께 악화의 억제효과를 갖는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 6에 항 α9 인테그린 항체에 의한 관절염 억제상을 나타낸다. LPS 투여 후 6일째에, 55A2C 투여에 의해 관절의 종창이 억제된 것을 알 수 있다.
다음으로, 항 α9 인테그린 항체의 관절염 발증 후의 치료효과를 검토하였다. 관절염 야기용 타입 II 콜라겐 단일클론 항체 칵테일(Chondrex사)을 2 ㎎/mouse 정맥 투여하고, 72시간 후에 LPS 50 ㎍/마리를 복강 내 투여하였다. 그 3일 후에 55A2C 또는 NHG를 복강 내 투여(400 ㎍/마리)하고, 스코어를 조사하였다. 그 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이, 관절염 발증 후에 항 α9 인테그린 항체를 투여해도 관절염의 치료효과가 있는 것을 알 수 있었다.
이상의 사실로부터, 항 α9 인테그린 항체는 관절염에 대하여 발증 예방효과뿐 아니라, 발증 후의 치료효과도 갖는 것이 시사되었기 때문에, 그 작용 메커니즘에 대하여 검토하였다. 관절염 발증 마우스에 항 α9 인테그린 항체를 투여한 후, 지족(肢足) 관절 병변부의 사이토카인(IL-6, TNF-α, IL-1β, IFN-γ 및 TGF-β)의 변화량을 실시간 PCR로 측정하였다. 그 결과, 55A2C 투여군은 NHG 투여군과 비교하여 IL-6, IL-1β 및 TGF-α의 mRNA의 발현이 유의하게 억제되어 있었다(도 8). 이들의 사이토카인은 Th17의 분화에 중요한 것이 보고되어 있어, 항 α9 인테그린 항체에 의한 관절염 억제효과는, α9 인테그린의 기능 저해에 의해, Th17로의 분화에 중요한 사이토카인 생산이 억제된 것에 기인하는 것으로 추측할 수 있었다.
한편, 본 관절염 모델에서의 Th17의 관여에 대하여 조사하기 위하여, 정상 마우스와 LPS 투여 후 1일째, 3일째, 6일째의 마우스(BALB/c, 6주령, 자성)의 마우스 서혜 림프절의 IL-17 및 RORγt(retinoic acid-related orphan receptor γt: 핵 내 리셉터에서, Th17 분화에 관여하는 전사인자)의 발현을 측정하였다. 그 결과, 관절염 악화에 동반하여 유의하게 IL-17, RORγt의 mRNA의 발현이 항진하는 것으로부터, 본 관절염 모델에서의 Th17의 관여가 시사되었다(도 9). 이에, 항 α9 인테그린 항체에 의한 α9 인테그린의 기능 억제가 Th17의 분화에 미치는 영향을 검토하기 위하여, 항 α9 인테그린 항체 투여 후, 지족 관절 병변부의 IL-17 및 RORγt 발현량을 실시간 PCR로 측정하였다. 도 8에 나타내는 바와 같이, 항 α9 인테그린 항체에서 양자의 발현이 유의하게 억제되어 있었다. 즉, 항 α9 인테그린 항체는 Th17의 분화를 억제하는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 항체는 α9 인테그린 기능 억제에 의하여, 암(예를 들면 암세포의 증식, 전이), 염증성 질환(예를 들면 관절 류머티즘, 변형성 관절증, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화, 다발성 경화증, 염증성 장질환(궤양성 대장염, 클론병)), 감염증(예를 들면 간염), 자기면역질환(예를 들면 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 근염, 자기면역성 갑상선질환, 세뇨관 간질성 신염, 중증 근무력증) 및 골질환(예를 들면 골다공증) 등에 대한 치료효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 항 α9 인테그린 항체와 항 α4 인테그린 항체의 양자를 함유하는 의약 조성물은, 더욱 개선된 암, 염증성 질환 등의 치료효과를 나타낸다. 본 발명의 항체는 세포나 조직에서의 α9 인테그린의 발현을 병리학적으로 검출할 수 있는 것으로부터, 진단제로서도 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Gene Techno Science Co., Ltd. <120> Anti-human alpha 9 integrin antibody and its use <130> PCT07-0036 <150> JP 2006-191836 <151> 2006-07-12 <160> 46 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Gln Gly Pro Ala Asp Ser Phe Phe Gly Tyr Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Ser Pro Gly Ala Val Phe Lys Cys Arg Val His Thr Asn Pro Asp 1 5 10 15 Arg Arg <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Trp Met Gly Val Ser Leu Ala Arg Gln Pro Lys Ala Asp Gly Arg Val 1 5 10 15 Leu Ala <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Ala His Arg Trp Lys Asn Ile Tyr Tyr Glu Ala Asp His Ile 1 5 10 15 <210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Phe Cys Tyr Ile Ile Pro Ser Asn Leu Gln Ala Lys Gly Arg Thr 1 5 10 15 Leu Ile <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Met Gly Ala Pro Gly Ser Phe Tyr Trp Ala Gly Thr Ile Lys Val 1 5 10 15 Leu Asn <210> 7 <211> 15 <212> 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Gln Pro Val Asn Cys Leu Asn Val Thr Thr 485 490 495 Cys Phe Ser Phe His Gly Lys His Val Pro Gly Glu Ile Gly Leu Asn 500 505 510 Tyr Val Leu Met Ala Asp Val Ala Lys Lys Glu Lys Gly Gln Met Pro 515 520 525 Arg Val Tyr Phe Val Leu Leu Gly Glu Thr Met Gly Gln Val Thr Glu 530 535 540 Lys Leu Gln Leu Thr Tyr Met Glu Glu Thr Cys Arg His Tyr Val Ala 545 550 555 560 His Val Lys Arg Arg Val Gln Asp Val Ile Ser Pro Ile Val Phe Glu 565 570 575 Ala Ala Tyr Ser Leu Ser Glu His Val Thr Gly Glu Glu Glu Arg Glu 580 585 590 Leu Pro Pro Leu Thr Pro Val Leu Arg Trp Lys Lys Gly Gln Lys Ile 595 600 605 Ala Gln Lys Asn Gln Thr Val Phe Glu Arg Asn Cys Arg Ser Glu Asp 610 615 620 Cys Ala Ala Asp Leu Gln Leu Gln Gly Lys Leu Leu Leu Ser Ser Met 625 630 635 640 Asp Glu Lys Thr Leu Tyr Leu Ala Leu Gly Ala Val Lys Asn Ile Ser 645 650 655 Leu Asn Ile Ser Ile Ser Asn Leu Gly Asp Asp Ala Tyr Asp Ala Asn 660 665 670 Val Ser Phe Asn Val Ser Arg Glu Leu Phe Phe Ile Asn Met Trp Gln 675 680 685 Lys Glu Glu Met Gly Ile Ser Cys Glu Leu Leu Glu Ser Asp Phe Leu 690 695 700 Lys Cys Ser Val Gly Phe Pro Phe Met Arg Ser Lys Ser Lys Tyr Glu 705 710 715 720 Phe Ser Val Ile Phe Asp Thr Ser His Leu Ser Gly Glu Glu Glu Val 725 730 735 Leu Ser Phe Ile Val Thr Ala Gln Ser Gly Asn Thr Glu Arg Ser Glu 740 745 750 Ser Leu His Asp Asn Thr Leu Val Leu Met Val Pro Leu Met His Glu 755 760 765 Val Asp Thr Ser Ile Thr Gly Ile Met Ser Pro Thr Ser Phe Val Tyr 770 775 780 Gly Glu Ser Val Asp Ala Ala Asn Phe Ile Gln Leu Asp Asp Leu Glu 785 790 795 800 Cys His Phe Gln Pro Ile Asn Ile Thr Leu Gln Val Tyr Asn Thr Gly 805 810 815 Pro Ser Thr Leu Pro Gly Ser Ser Val Ser Ile Ser Phe Pro Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Ser Gly Gly Ala Glu Met Phe His Val Gln Glu Met Val Val 835 840 845 Gly Gln Glu Lys Gly Asn Cys Ser Phe Gln Lys Asn Pro Thr Pro Cys 850 855 860 Ile Ile Pro Gln Glu Gln Glu Asn Ile Phe His Thr Ile Phe Ala Phe 865 870 875 880 Phe Thr Lys Ser Gly Arg Lys Val Leu Asp Cys Glu Lys Pro Gly Ile 885 890 895 Ser Cys Leu Thr Ala His Cys Asn Phe Ser Ala Leu Ala Lys Glu Glu 900 905 910 Ser Arg Thr Ile Asp Ile Tyr Met Leu Leu Asn Thr Glu Ile Leu Lys 915 920 925 Lys Asp Ser Ser Ser Val Ile Gln Phe Met Ser Arg Ala Lys Val Lys 930 935 940 Val Asp Pro Ala Leu Arg Val Val Glu Ile Ala His Gly Asn Pro Glu 945 950 955 960 Glu Val Thr Val Val Phe Glu Ala Leu His Asn Leu Glu Pro Arg Gly 965 970 975 Tyr Val Val Gly Trp Ile Ile Ala Ile Ser Leu Leu Val Gly Ile Leu 980 985 990 Ile Phe Leu Leu Leu Ala Val Leu Leu Trp Lys Met Gly Phe Phe Arg 995 1000 1005 Arg Arg Tyr Lys Glu Ile Ile Glu Ala Glu Lys Asn Arg Lys Glu 1010 1015 1020 Asn Glu Asp Ser Trp Asp Trp Val Gln Lys Asn Gln 1025 1030 1035 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gly Tyr Gly Val Asn 1 5 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Met Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Glu Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 Arg <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Asp Ala Ser Ser Gly Tyr Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Tyr His Arg Ser Pro Tyr 1 5

Claims (22)

  1. 서열번호 18, 22, 26, 30, 34 및 38의 아미노산 서열을 함유하는 상보성 결정영역(CDR)을 모두 갖는 항 인간 α9 인테그린 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    인간 α9 인테그린과 α9 인테그린의 리간드와의 결합을 저해하는 항 인간 α9 인테그린 항체.
  3. 수탁번호 FERM BP-10512로 표시되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 항 인간 α9 인테그린 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단일클론 항체인 항 인간 α9 인테그린 항체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    키메라 항체인 항 인간 α9 인테그린 항체.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간화 항체인 항 인간 α9 인테그린 항체.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체인 항 인간 α9 인테그린 항체.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    암, 염증성 질환, 간염, 자기면역질환 또는 골다공증의 치료 또는 진단을 위한 항 인간 α9 인테그린 항체.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항 인간 α9 인테그린 항체를 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 간염, 자기면역질환 또는 골다공증의 치료제.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항 인간 α9 인테그린 항체와 항 인간 α4 인테그린 항체 양쪽을 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 간염, 자기면역질환 또는 골다공증의 치료제.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항 인간 α9 인테그린 항체를 유효성분으로서 포함하는 암, 염증성 질환, 간염, 자기면역질환 또는 골다공증의 진단제.
  12. 수탁번호 FERM BP-10512로 표시되는 하이브리도마 세포.
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