JP5066087B2 - 抗ヒトα９インテグリン抗体とその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトα９インテグリンを特異的に認識する抗体（特に、モノクローナル抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにヒト抗体；前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞；前記モノクローナル抗体の製造方法；前記ハイブリドーマ細胞の製造方法；前記抗ヒトα９インテグリン抗体を含有する治療剤；前記ヒトα９インテグリン抗体を含有する診断剤；ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等に関する。

生物体は、生命現象を営む最小の機能単位である細胞、同じ働きをする細胞が集まって組織を構成し、種々の組織が集まって協同して一定の機能を有する器官を形成し、全体として調和統一のとれた生命活動を営んでいる。多くの組織は、基本的に細胞と細胞外マトリックスから構成されており、細胞と細胞外マトリックスが接着する細胞と細胞外マトリックス間接着と細胞間接着により構造を保っている。細胞外マトリックスに関しては、これまで生物活性はなく、単なる詰め物と考えられてきたが、実はほとんど全ての組織で重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。細胞と細胞外マトリックス間接着活性が知られるようになり、細胞の足場としての役割だけでなく、様々な細胞機能の調節や組織、器官の恒常性維持に関与していることが示唆され、その重要性がより認識されるようになってきた。
細胞と細胞外マトリックスを連結する接着は、インテグリンに代表される膜貫通細胞接着タンパク質を介して行われる。インテグリンはα鎖とβ鎖の１：１のヘテロ二量体で構成され、現在までにα鎖１８種類、β鎖８種類が発見され、それらの組合せで、少なくとも２４種類が同定確認されている。各インテグリンはそれぞれが特異的な細胞外マトリックス（リガンド）を認識することが知られている。また、インテグリンを含む膜貫通細胞接着タンパク質の役割は、細胞と細胞外マトリックスの接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。
インテグリンはリガンドに対する特異性や機能からサブファミリーに分類され、コラーゲン受容体、ラミニン受容体、ファイブロネクテンやビトロネクチンなどに含まれるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を認識するＲＧＤ受容体、白血球にのみに存在する白血球特異的受容体に区別される（Ｈｙｎｅｓ ＲＯ．２００２．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ，Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｍａｃｈｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ １１０：６７３−８７；Ｍｉｙａｓａｋａ Ｍ．２０００．Ｎｅｗ ｅｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｓｈｕｊｕｎｓｙａ．）。α４とα９インテグリンは、これらにどれにも属さないサブファミリーでありα４インテグリンサブファミリーと呼ばれている（Ｅｌｉｓｅ Ｌ．Ｐａｌｍｅｒ，Ｃｕｒｚｉｏ Ｒｆｉｅｇｇ，Ｒｏｎａｌｄ Ｆｅｒｒａｎｄｏ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｐｙｔｅｌａ，Ｓｈｅｐｐａｒｄ Ｄ．１９９３．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａ９ Ｓｕｂｕｎｉｔ，ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐａｒｔｎｅｒ ｏｆ １３１ Ｔｈａｔ Ｉｓ Ｗｉｄｅｌｙ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ａｎｄ Ｍｕｓｃｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １２３：１２８９−９７）。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の一種であるオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ；以下、ＯＰＮと略称する）は分子量約４１ｋＤａの分泌型酸性リン酸化糖タンパク質であり、乳汁、尿、腎尿細筆、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、腫瘍組織などに広く発現が認められている分子である。分子中央部に細胞接着配列ＧＲＧＤＳとヒトＯＰＮではＳＶＶＹＧＬＲ配列、マウスＯＰＮではＳＬＡＹＧＬＲ配列、その直後にはトロンビン切断部位を有しており、ＧＲＧＤＳ配列を介してＲＧＤ受容体のインテグリンと、ＳＶＶＹＧＬＲ配列あるいはＳＬＡＹＧＬＲ配列を介してα４（α４β１）とα９（α９β１）インテグリンと接着する。
α４β１はトロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＮ末端フラグメント（切断型ＯＰＮ）の両方に結合し、α９β１は切断型ＯＰＮにのみ結合するという様式の差も見出されている（Ｙ．Ｙｏｋｏｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７４，３６３２８−３６３３４；Ｐ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５０３，７５−７９；Ｓ．Ｔ．Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５８，３４２−３５１）。α４およびα９インテグリンは、ＯＰＮ以外にも多くの共通するリガンドを有している。ファイブロネクチンのＥＤＡ部位、プロペプチド−フォンビルブラントファククー（ｐｐ−ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第ＸＩＩＩ血液凝固因子そしてＶａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）などが知られている。また、α４インテグリンが特異的に認識するリガンドとしてファイブロネクテンのＣＳ−１ドメイン、ＭａｄＣＡＭ−１（α４β７）などが知られている。α９インテグリンが特異的に認識するリガンドは、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。
α４とα９インテグリンおよびβ１のインテグリンサブユニットのアミノ酸配列は公知でＧｅｎＢａｎｋに登録されている。また、これらのインテグリンは種間でアミノ酸配列の類似性が高いことが知られている。
ＷＯ０２／０８１５２２には、ＯＰＮ欠損マウスやＯＰＮに対する中和抗体を用いたＯＰＮ機能抑制による、リウマチ様関節炎や肝炎の治療効果について開示されている。また、この公報には、炎症性疾患発症にはα４インテグリン、α９インテグリンの認識配列であるＳＶＶＹＧＬＲ配列が重要であること、ＯＰＮに対する受容体が免疫担当細胞などにおいて発現し、炎症性疾患に開連していることが開示されている。

現在、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患の治療薬は種々知られているが、より改善された治療効果を有する癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患の予防薬および／または治療薬等を開発することが望まれていた。
そこで、本発明者らはインテグリン、特にα９インテグリンに着目し、種々の研究を行った結果、α９インテグリンに対する特異的阻害抗体が癌抑制効果、抗炎症効果を有することを見出し、本発明を完成した。すなわち、具体的には、本発明は以下に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体、その産生細胞、前記抗体を含有する治療剤、α９インテグリン活性を阻害する化合物のスクリーニング方法等を提供する。
（１）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列から選択される１以上のアミノ酸配列を認識する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（２）重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）におけるＣＤＲＨ１が配列番号１６、１７、１８、１９または４１のアミノ酸配列で、ＣＤＲＨ２が配列番号２０、２１、２２、２３または４２のアミノ酸配列で、ＣＤＲＨ３が配列番号２４、２５、２６、２７または４３のアミノ酸配列であり、軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＬ）におけるＣＤＲＬ１が配列番号２８、２９、３０、３１または４４のアミノ酸配列で、ＣＤＲＬ２が配列番号３２、３３、３４、３５または４５のアミノ酸配列で、ＣＤＲＬ３が配列番号３６、３７、３８、３９または４６のアミノ酸配列である抗ヒトα９インテグリン抗体。
（３）配列番号１６、２０、２４、２８、３２または３６のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（４）配列番号１６、２０、２４、２８、３２または３６のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を全て有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（５）配列番号１７、２１、２５、２９、３３または３７のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（６）配列番号１７、２１、２５、２９、３３または３７のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を全て有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（７）配列番号１８、２２、２６、３０、３４または３８のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（８）配列番号１８、２２、２６、３０、３４または３８のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を全て有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（９）配列番号１９、２３、２７、３１、３５または３９のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１０）配列番号１９、２３、２７、３１、３５または３９のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を全て有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１１）配列番号４１、４２、４３、４４、４５または４６のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１２）配列番号４１、４２、４３、４４、４５または４６のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を全て有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１３）ヒトα９インテグリンとα９インテグリンのリガンドとの結合を阻害する上記（１）ないし（１２）に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１４）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１０、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１３またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３２で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１５）モノクローナル抗体である上記（１）ないし（１４）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１６）キメラ抗体である上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１７）ヒト化抗体である上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１８）ヒト抗体である上記（１）ないし（１３）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
（１９）上記（１）ないし（１８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
（２０）上記（１）ないし（１８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体と抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を有効成分として含む癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
（２１）上記（１）ないし（１８）のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
（２２）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列から選択される１以上のアミノ酸配列を含有するペプチドを用いることを特徴とする、α９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
発明の効果
本発明の抗体は、α９インテグリン機能抑制により、癌（例えば癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病））、感染症（例えば肝炎）、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体と抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された癌、炎症性疾患等の治療効果を奏する。本発明の抗体は、細胞や組織におけるα９インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、診断薬としても利用できる。

図１（図１―１及び１−２）は、抗ヒトα９インテグリン抗体の相補認識領域（ＣＤＲ）を解析した結果を示す図である。
図２は、抗ヒトα９インテグリン抗体５クローンの細胞接着阻害効果をヒトα９インテグリン発現細胞で調べた結果を示す図である。
図３は、抗ヒトα９インテグリン抗体と抗ヒトα４インテグリン抗体を共存させた時の癌細胞（ヒト・メラノーマ細胞）の細胞接着阻害効果を示す図である。
図４は、抗マウスα９インテグリン抗体のリウマチ病態モデルにおけるリウマチの治療効果を示す図である。
図５は、抗マウスα９インテグリン抗体の関節炎治療効果を、マウス関節炎モデルで調べた結果を示す図である。
図６は、抗マウスα９インテグリン抗体による関節炎抑制像を示す。
図７は、抗α９インテグリン抗体の関節炎発症後の治療効果について調べた結果を示す図である。
図８は、抗マウスα９インテグリン抗体の関節炎発症後の治療効果における作用機作を検討するために、関節部のサイトカインの変化量をＰＣＲで測定して調べた結果を示す図である。
図９は、マウス関節炎モデルにおけるＴｈ１７の関与について調べるために、マウス鼠径リンパ節のＩＬ−１７及びＲＯＲγｔの発現を測定した結果を示す図である。

［発明の経緯］
α４インテグリンに対する抗体であるＴｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）は２００４年１１月にバイオジェン・アイデック（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．、米マサチューセッツ州）とエラン（Ｅｌａｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、アイルランド）が多発性硬化症治療薬として米食品医薬品局（ＦＤＡ）から承認を受けている。また、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）はクローン病、リウマチ様関節炎等の疾患を対象として臨床開発されている。なお、Ｐ４Ｃ２という抗ヒトα４β１インテグリン・モノクローナル抗体が実験室レベルで用いられている。
しかし、α９インテグリンに対する抗体はヒトおよびモルモットのα９インテグリンに特異性を示すＹ９Ａ２と呼ばれるモノクローナル抗体（Ａ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ、，（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５、６６４−６７２）が実験用として供されているが、臨床的に用いられていない。
本発明では、以下の点を注意深く進めることにより、ヒトのα９インテグリンに特異的に反応する抗体を得ることができた。
（１）ヒトα９インテグリン過剰発現株の作製
α９インテグリンに対する抗体を作製するために、ハムスターの卵巣由来細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞へ遺伝子導入を行い、ヒトα９インテグリンを過剰発現する細胞株を樹立し、この細胞を抗原としてマウスに免疫した。
（２）ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合で得られた種々のハイブリドーマからヒトα９インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、同じインテグリンファミリーであるヒトα４インテグリンをＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現させた細胞を用いて他のインテグリンとは交差反応性を示さず、親細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）の細胞表面抗原とは反応しないクローンを選抜することにより、効率的にヒトα９インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得た。
［本発明の抗α９インテグリン抗体］
本発明はヒトα９インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。本発明において「抗体」とは、抗原であるα９インテグリンまたはその部分ペプチドに結合し得る抗体分子全体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）_２、などの断片）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明においてはモノクローナル抗体を意味する。また、本発明において「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を包含する。
本発明における「モノクローナル抗体」抗原に対して高度に特異的であり、単一の抗原を認識するものをいう。
本発明において、「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片にはＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）_２、およびＦｖ断片が含まれる。これらの抗体断片は抗体のパパイン消化、ペプシン消化など一般的に知られている方法で作製することができる。
上記「キメラ抗体」とは、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変したヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）を指す。「ヒト化抗体」とは、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体を言う。「ヒト抗体」とは、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスゲニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）を意味する。
より具体的には、本発明は、まず、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列から選択される１以上のアミノ酸配列を認識する抗ヒトα９インテグリン抗体を提供する。本発明の好ましい態様による抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列から選択される２以上、３以上、４以上、５以上または６個のアミノ酸配列を認識する。本発明の好ましい抗体は、（１）配列番号２、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１１のアミノ酸配列；（２）配列番号５；（３）配列番号７；（４）配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号１３のアミノ酸配列（５）配列番号５、配列番号７、配列番号１０、および配列番号１３のアミノ酸配列；（６）配列番号２、配列番号５、配列番号７、配列番号８、および配列番号１５のアミノ酸配列；（７）配列番号５、配列番号７、配列番号１０、および配列番号１３；（８）配列番号１１のアミノ酸配列のアミノ酸配列を特異的に認識する。
また、本発明の好ましい態様による抗体は、配列番号１６、２０、２４、２８、３２または３６のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する。さらに好ましい抗体は、配列番号１６、２０、２４、２８、３２または３６のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、２以上、３以上、４以上、５以上または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体であり、特に好ましい抗体は、（１）配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、および配列番号３６のアミノ酸配列；（２）配列番号１６、配列番号２０、および配列番号２４のアミノ酸配列；（３）配列番号２８、配列番号３２、および配列番号３６のアミノ酸配列；（４）配列番号２０、および配列番号２４のアミノ酸配列；または（５）配列番号２４、および配列番号３６のアミノ酸配列；のアミノ酸配列を含有する。
また、本発明の他の態様による抗体は、配列番号１７、２１、２５、２９、３３または３７のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する。さらに好ましい抗体は、配列番号１７、２１、２５、２９、３３または３７のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、２以上、３以上、４以上、５以上または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体であり、特に好ましい抗体は、（１）配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、および配列番号３７のアミノ酸配列；（２）配列番号１７、配列番号２１、および配列番号２５のアミノ酸配列（３）配列番号２９、配列番号３３、および配列番号３７のアミノ酸配列（４）配列番号２１、および配列番号２５のアミノ酸配列；または（５）配列番号２５、および配列番号３７のアミノ酸配列；のアミノ酸配列を含有する。
また、本発明の他の態様による抗体は、配列番号１８、２２、２６、３０、３４または３８のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する。さらに好ましい抗体は、配列番号１８、２２、２６、３０、３４または３８のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、２以上、３以上、４以上、５以上または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体であり、特に好ましい抗体は、（１）配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、および配列番号３８のアミノ酸配列；（２）配列番号１８、配列番号２２、および配列番号２６のアミノ酸配列（３）配列番号３０、配列番号３４、および配列番号３８のアミノ酸配列（４）配列番号２２、および配列番号２６のアミノ酸配列；または（５）配列番号２６、および配列番号３８のアミノ酸配列；のアミノ酸配列を含有する。
また、本発明の他の態様による抗体は、配列番号１９、２３、２７、３１、３５または３９のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する。さらに好ましい抗体は、配列番号１９、２３、２７、３１、３５または３９のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、２以上、３以上、４以上、５以上または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体であり、特に好ましい抗体は、（１）配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、および配列番号３９のアミノ酸配列；（２）配列番号１９、配列番号２３、および配列番号２７のアミノ酸配列（３）配列番号３１、配列番号３５、および配列番号３９のアミノ酸配列（４）配列番号２３、および配列番号２７のアミノ酸配列；または（５）配列番号２７、および配列番号３９のアミノ酸配列；のアミノ酸配列を含有する。
また、本発明の他の態様による抗体は、配列番号４１、４２、４３、４４、４５または４６のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、少なくとも一つを有する。さらに好ましい抗体は、配列番号４１、４２、４３、４４、４５または４６のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち、２以上、３以上、４以上、５以上または６個を有する抗ヒトα９インテグリン抗体であり、特に好ましい抗体は、（１）配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４６のアミノ酸配列；（２）配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３のアミノ酸配列（３）配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６のアミノ酸配列（４）配列番号４２、および配列番号４３のアミノ酸配列；または（５）配列番号４３、および配列番号４６のアミノ酸配列；のアミノ酸配列を含有する。
本発明において特に好ましい抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１０、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１１、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１３またはＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３２で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα９インテグリン抗体である。
以下、抗α９インテグリンモノクローナル抗体の作製について詳述するが、該抗体の作製はこれに限定されることはない。
［α９インテグリン（抗原）］
本発明において抗原として使用するα９インテグリンは、（１）ヒトやその他の哺乳動物のα９インテグリンを発現するあらゆる細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、（２）α９インテグリンをコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質であってもよく、また（３）合成タンパク質であってもよい。
また、本発明のα９インテグリンには、各種哺乳動物のα９インテグリンのアミノ酸配列、特に好ましくはヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号：４０）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンと実質的に同等の生物学的性質を有する限り、該アミノ酸配列中の複数個のアミノ酸、好ましくは１ないし１０個のアミノ酸、特に好ましくは１ないし数個（例えば、１ないし５個、１ないし４個、１ないし３個、１ないし２個））のアミノ酸が置換、欠失および／または修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチド、ならびに該天然型のα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンのアミノ酸配列中に、複数個のアミノ酸、好ましくは１ないし１０個のアミノ酸、特に好ましくは１ないし数個（例えば、１ないし５個、１ないし４個、１ないし３個、１ないし２個））のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドを意味する。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異ポリペプチドであってもよい。
本発明のα９インテグリン、特にはヒト由来のα９インテグリンは、遺伝子組換え技術のほか、化学的合成法、細胞培養方法等のような当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法を適宜用いることにより製造することができる。
また、変異ポリペプチドの製造方法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド部位突然変異導入法（ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法）、亜硝酸あるいは亜硫酸処理によってランダムに点突然変異を導入する方法、Ｂａ１３１酵素等により欠失変異体を作製する方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマー法、ＤＮＡセグメント合成法などを挙げることができる。
また、本発明のα９インテグリンには、該α９インテグリンの「一部」も包含される。ここで「一部」とは、ＯＰＮ、テネイシン−Ｃ、ＶＣＡＭ−１等のα９インテグリンリガンドと結合するために必要な領域を含む部分であり、具体的には配列番号：１で表されるアミノ酸配列の２９番目から９８０番目を含む部分をいう。該α９インテグリンの「一部」は、後述する当該技術分野において公知の方法あるいはその修飾方法に従って、遺伝子組換え技術または化学的合成法により製造することもできるし、また細胞培養方法により単離したα９インテグリン、特に好ましくはヒト由来のα９インテグリンをタンパク分解酵素等により適切に切断することで製造することができる。
抗原としてはまた、α９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体、あるいはその膜画分等を用いることができる。
本発明のα９インテグリンには、ヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号：４０）と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。配列番号：４０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとして、具体的には、配列番号：１から１５に表されるアミノ酸配列を有する、ヒトα９インテグリンがあげられる。また、特に本発明ではヒトα９インテグリンを組換え技術により細胞膜上に過剰発現する細胞自体が好適に用いられる。したがって、後述するような、ヒトα９インテグリンをコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を公知の遺伝子工学技術を用いてクローニングし、ヒトα９インテグリンを細胞膜上に過剰発現する細胞自体、またはその細胞膜画分を抗原として調製する場合もある。
［抗体産生細胞の調製］
抗原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常１〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、マウス、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、本発明ではマウスが好適に用いられる。
治療の対象がヒトであり、α９インテグリン阻害抗体産生動物がマウスの場合には、ヒトマウスキメラ抗体やヒト化抗体を用いるのが望ましく、さらには、抗体産生に関与するヒト遺伝子を導入したマウス等のトランスジェニック動物を用いてヒト型モノクローナル抗体を作成して用いるのが望ましい。
［抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合］
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒト等に由来する細胞が用いられる。例えばマウスミエローマＰ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３等があげられるが、抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。本発明ではＰ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３が好適に用いられる。
抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などがあげられる。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞とミエローマ細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウェルプレート中に播種して培養を続ける。
［ハイブリドーマ細胞の選別］
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常、５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％ＣＯ_２下で行なうことができる。
本発明のモノクローナル抗体の産生は、新臨床免疫実験操作法（ｐａｒｔ ３）、科学評論社、１９９７に記載される細胞ＥＬＩＳＡ法を用いて確認およびスクリーニングできる。免疫に用いた細胞をスクリーニングに使用するとバックグラウンドが高くなることや偽陽性が多くなることが予想される場合、免疫に用いた細胞とは別の細胞で過剰発現するヒトα９インテグリンに反応し、かつ、ヒトα４インテグリンを過剰発現する細胞に反応しないクローンを抗ヒトα９インテグリン抗体とすることができる。このようなクローンから限界希釈法を１から５回、好適には２から４回繰り返すことによりモノクローナル抗体を調製できる。
［抗体の分離精製］
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）等が挙げられる。
［抗体の標識化］
得られた抗体を、公知の方法または市販のキットを用いて各種標識化（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）できる。本発明では、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（同仁化学）を用いたビオチン標識が好適に用いられる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、必要により精製した後、常法に従って製剤化し、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。これらの予防および／または治療剤としての剤形は注射剤、点滴用剤などの非経口製剤とすることができ、創意工夫により経口製剤として使用することができる。また、製剤化に当たっては、薬事上および薬学的に許容される範囲内で、剤形に適した担体、希釈剤もしくは添加剤などを使用することができる。
［抗体の薬理学的効果］
インテグリンの役割は、細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。従って、得られたモノクローナル抗体は、ＥＣＭとα９インテグリンとの結合を阻害することにより、ＥＣＭからの情報の細胞内シグナル伝達を遮断できることから、ＥＣＭが関与する疾患の治療が可能である。α９インテグリンに結合するＥＣＭ、およびα９リガンドとしてＯＰＮ、ファイブロネクチン、プロペプチド−フォンビルブラントファククー（ｐｐ−ｖＷＦ）、組織型トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、第ＸＩＩＩ血液凝固因子、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＶＣＡＭ−１）、テネイシンＣ、プラスミンなどが知られている。これらのＥＣＭとα９インテグリンを発現している細胞や癌細胞を用い、得られたモノクローナル抗体の存在下での結合阻害をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察することにより、本発明のモノクローナル抗体の対象疾患を見出すことができる。
一方、抗ヒトα９インテグリン抗体をヒトに対する治療用医薬品として用いる場合、その効果の確認が必要な前臨床開発段階におけるｉｎ ｖｉｖｏの病態モデル動物ではヒトの抗原に対する抗体の効果が確認できない。すなわち、ヒトに投与して治療効果を確認する臨床試験を行う前に、対象疾患に対する治療効果を確認する動物実験が要求される。マウスはその遺伝的背景が明らかとなっている系統が多く、ヒトの疾患とほぼ同一の疾患を観察することができる病態モデルが数多く知られているので、実験動物として好適である。しかし、一般的に抗体医薬品は、ヒトの抗原に対する抗体であり、マウスの同じ対象の抗原と交差反応を示すことは少なく、マウスの対象抗原に対する抗体を調製して、それを用いて動物実験を行うことにより、ヒトで用いる抗体の薬理効果、臨床試験に向けた投与量の推定、対象抗原以外への反応性、副作用の発症などを観察し、ヒトにおける作用を反映することができる。具体的には、抗マウスα９インテグリン抗体を病態モデルのマウスに投与することにより、抗ヒトα９インテグリン抗体の対象疾患が明らかになる。
［抗体を含有する医薬］
本発明の抗体（特に、モノクローナル抗体）を有効成分とする製剤は、癌、例えば癌細胞の増殖、転移、炎症性疾患（例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病））、感染症（例えば肝炎）、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば骨粗鬆症）等の治療剤として用いることができる。ここで、「治療」という用語は「予防」という意味を含む意味で用いられる。
投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、癌患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１〜１０回程度、好ましくは１月１〜５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。このような組成物は、非経口投与または経口に適する剤形として提供される。
すなわち、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、その他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体を通常の点鼻薬用基剤、坐薬用基剤に混合することによって調製される。なお、一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため、困難とされるが、抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により、経口投与の可能性もある。
上記の非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルド・シリンジ）、点鼻剤、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。例えば、本発明の医薬製剤は、上記抗体に加えて、抗ヒトα４インテグリン抗体を含有させることができる。この場合の混合比は特に限定されないが、例えば、抗ヒトα９インテグリン抗体：抗ヒトα４インテグリン抗体の比率を１〜９９：９９〜１の比率の範囲内で調整することができる。
［本発明のモノクローナル抗体を含有する診断剤］
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、α９インテグリンを特異的に認識することができるので、被検液中のα９インテグリンの定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによる定量などに使用することができる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＬＬＰＬまたはその塩の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、α９インテグリンを感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体を用いる、生体内でのα９インテグリンの定量法を利用することにより、α９インテグリンが関連する各種疾患の診断をすることができる。例えば、α９インテグリンの濃度の増減が検出された場合は、α９インテグリンが関連する疾患、例えば炎症性疾患である可能性が高いまたは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、体液や組織などの被検体中に存在するα９インテグリンを特異的に検出するために使用することができる。また、α９インテグリンを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画に含まれるα９インテグリンの検出、被検細胞内におけるα９インテグリンの挙動の分析等に使用することができる。
［ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法］
本発明の抗体が認識するヒトα９インテグリン上のエピトープを利用して、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。具体的には、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列から選択される１以上のアミノ酸配列を含有するペプチド（以下、「ペプチドＡ」という）を用いることを特徴とする、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する低分子化合物のスクリーニング方法を提供する。
ペプチドＡとしては、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸配列から選択される２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、または８個のアミノ酸配列を有するものが好ましい。ペプチドＡは公知の合成法によって合成することができる。さらに好ましいペプチドＡは、（１）配列番号２、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のアミノ酸配列；（２）配列番号５、配列番号７、配列番号８、および配列番号１１のアミノ酸配列；（３）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１４のアミノ酸配列；（４）配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、および配列番号１４のアミノ酸配列；（５）配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号１３のアミノ酸配列；（６）配列番号１０、および配列番号１３のアミノ酸配列、かまたは（７）配列番号５、および配列番号７のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含有する。
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）ペプチドＡと、ヒトα９インテグリンのリガンド（例えば、テネイシンＣ、プラスミンなど）とを接触させた場合と（ｉｉ）ペプチドＡと、リガンドおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なう。工程（ｉ）と（ｉｉ）の比較は、例えば、ペプチドＡに対するリガンドの結合量を測定することにより行う。そのような結合量の比較を容易にするために、公知の手法によって標識したリガンドを用いることが好ましい。このような方法によって得られた候補化合物について、ヒトα９インテグリンの活性を阻害するか否かの確認実験を行って、ヒトα９インテグリンの活性を阻害する化合物を得る。
ここで被験物質としては、ポリペプチド、タンパク質、生体由来の非ペプチド性化合物、合成化合物、微生物培養物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等を用いることができ、新規化合物であっても、公知の化合物であっても良い。
選択される化合物は、本発明の抗体同様、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患および骨疾患等の予防および／または治療剤として用いることができる。

以下に実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
［ヒトα９インテグリンに対する抗体の作製］
ヒトα９インテグリンに対する抗体作製は、Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ法（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｃ．Ｖ．，Ｓｔｅｃｈｍａｎｎ Ｃ．Ｌ．，ＭｃＬｏｏｎ Ｓ．Ｃ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．（１９９２）１２：８４２−８４７）を参考にしてＢＡＬＢ／ｃマウス３匹に対して免疫を行った。まず、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を４Ｘ１０^６細胞／匹腹腔内投与し、次の日とその次の日、シクロホスファミドを４ｍｇ／匹、腹腔内投与した。シクロホスファミド投与２週間後、ヒトα９インテグリン発現細胞（ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を２Ｘ１０^６細胞／匹を腹腔内投与し、さらにその２週間後、ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を３Ｘ１０^６細胞／匹を腹腔内投与した。ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞に反応し、且つ、ヒトα４インテグリン発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞に反応しないクローンを抗α９インテグリン抗体とした。その結果、抗ヒトα９インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞５クローン（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）を樹立した。
ここで得られたハイブリドーマ細胞１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１および２５Ｂ６は、２００６年２月１５日に、２８Ｓ１は、２００７年５月２９日に茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１０、１０５１１、１０５１２、１０５１３およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３２として寄託されている。
（実施例２）
［抗ヒトα９インテグリン抗体のエピトープ解析］
ヒトα９インテグリンのＮ末端から、１−１２番目のアミノ酸配列のペプチド、４−１５番目のアミノ酸配列のペプチド、７−１８番目のアミノ酸配列のペプチドというふうに、３アミノ酸ずつＣ末端方向にスライドさせたアミノ酸１２個からなるペプチドをＣ６スペーサーを配置して、さらにβＡｌａを２つ結合したセルロース膜上で、５ｎｍｏｌ／ｓｐｏｔになるよう調製した。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｋ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ ｉｎ ＰＢＳ）で膜をブロッキングした後、常法に基づいて調製したペルオキシダーゼ標識抗ヒトα９インテグリン抗体（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１および２５Ｂ６）１．０μｇ／ｍＬ溶液１０ｍＬに膜を室温、３時間浸した。膜を洗浄液（Ｔ−ＴＢＳ）で洗浄した後、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｇｅｎｔで室温、１分間反応させた。酵素反応生成物の蛍光を観察し、蛍光強度からエピトープを同定した。なお、対照として抗ヒトα９インテグリン抗体として市販されているＹ９Ａ２を用いた。
以下の表１に示すように、１Ｋ１１はヒトα９インテグリンのアミノ酸配列（配列番号４０の７９番目−９６番目（配列番号２）、１６０番目−１７７番目（配列番号５）、２３８番目−２５２番目（配列番号７）、２７７番目−２９４番目（配列番号８）、４５４番目−４７１番目（配列番号１０）および５５６番目−５７３番目（配列番号１１）を、２１Ｃ５は７９番目−９６番目（配列番号２）、１２４−１４１番目（配列番号３）、１６０番目−１７７番目（配列番号５）、２３８番目−２５２番目（配列番号７）、２７７番目−２９４番目（配列番号８）、４０９番目−４３２番目（配列番号９）、４５４番目−４７１番目（配列番号１０）、５５６番目−５７３番目（配列番号１１）、５９２番目−６２１番目（配列番号１２）、７０６番目−７２３番目（配列番号１４）および９３１番目−９５１番目（配列番号１５）を、２４Ｉ１１は７９番目−９６番目（配列番号２）、１４２番目−１５６番目（配列番号４）、１６０番目−１７７番目（配列番号５）、２３８番目−２５２番目（配列番号７）、２７７番目−２９４番目（配列番号８）、５５６番目−５７３番目（配列番号１１）、７０６番目−７２３番目（配列番号１４）および９３１番目−９５１番目（配列番号１５）を、２５Ｂ６は４０番目−５１番目（配列番号１）、１６０番目−１７７番目（配列番号５）、２０８番目−２２５番目（配列番号６）、２３８番目−２５２番目（配列番号７）および６４６番目−６５７番目（配列番号１３）を認識し、これらの抗体は一部分のペプチドでなく、立体構造を認識していることが示唆された。なお、本発明で得られた抗ヒトα９インテグリン抗体は対照としたＹ９Ａ２と反応するペプチドが異なることから、Ｙ９Ａ２とは異なるエピトープを認識する抗体であるといえる。
（実施例３）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の相補認識領域（ＣＤＲ）の解析］
ヒトα９インテグリン抗体（１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６、２８Ｓ１）を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを抽出して、逆転写によってｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳｃＦｖクローニング用プライマー（Ｌｉｇｈｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ、Ｈｅａｖｙ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ；アマシャムバイオサイエンス社）を用いてＰＣＲを行い、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれ伸長・増幅した。次に、ＰＣＲ産物を常法に基づいてｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒに組み込んだ。これをシークエンスしてアミノ酸配列を決定した。各抗体について３回ずつ上記の操作を行った。
図１に示すように、１Ｋ１１は重鎖のＣＤＲがＤＹＮＭＤ（配列番号１６）、ＤＩＮＰＮＮＧＧＴＩＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号２０）およびＳＧＶＩＳＴＤＹ（配列番号２４）で、軽鎖のＣＤＲがＲＡＳＱＥＩＳＧＹＬＩ（配列番号２８）、ＡＡＳＴＬＤＳ（配列番号３２）およびＹＡＮＹＰＰ（配列番号３６）で構成され、２１Ｃ５は重鎖のＣＤＲがＤＹＹＭＹ（配列番号１７）、ＴＩＳＤＧＧＮＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号２１）およびＤＲＤＧＳＳＬＦＡＹ（配列番号２５）で、軽鎖のＣＤＲがＫＡＳＱＤＶＮＩＡＶＡ（配列番号２９）、ＷＡＳＴＲＨＴ（配列番号３３）およびＨＹＮＴＰＷ（配列番号３７）で構成され、２４Ｉ１１は重鎖のＣＤＲがＤＴＹＶＨ（配列番号１８）、ＮＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号２２）およびＷＬＲＨＦＹＹＡＭＤＹ（配列番号２６）で、軽鎖のＣＤＲがＲＡＳＥＮＩＹＹＳＬＡ（配列番号３０）、ＮＡＮＳＬＥＤ（配列番号３４）およびＡＹＤＶＰＹ（配列番号３８）で構成され、２５Ｂ６は重鎖のＣＤＲがＳＹＧＶＨ（配列番号１９）、ＶＩＷＳＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号２３）およびＤＹＧＮＹＰＷＦＡＹ（配列番号２７）で、軽鎖のＣＤＲがＫＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３１）、ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号３５）およびＨＹＳＴＰＣ（配列番号３９）で構成され、２８Ｓ１は重鎖のＣＤＲがＧＹＧＶＮ（配列番号４１）、ＭＩＷＧＤＧＩＴＥＹＮＳＡＬＫＳＲ（配列番号４２）およびＤＡＳＳＧＹＧＦＡＹ（配列番号４３）で、軽鎖のＣＤＲがＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号４４）、ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号４５）およびＹＨＲＳＰＹ（配列番号４６）で構成されていることが判明した。
参考のためにＣＤＲと配列番号との対応を表２に示す。
（実施例４）
［抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着阻害効果］
細胞接着する際にはα９インテグリンがＯＰＮ、ファイブロネクチン、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１などの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含むα９リガンドと結合することから、得られた抗ヒトα９インテグリン抗体が細胞接着を阻害する際の対象となりえる細胞外マトリックスを検討した。
ｈＯＰＮ（ＲＡＡ）Ｎ−ｈａｌｆはヒトＯＰＮのＧＲＤ配列をＲＡＡ配列に変換させてトロンビン切断部位までのＮ末領域をＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌から精製し、プレシジョンプロテアーゼ（アマシャムバイオサイエンス社）を用いてＧＳＴを切断、除去したタンパク質である。ＶＣＡＭ−１はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手した。テネイシンＣはα９インテグリンに対するテネイシンＣ接着配列領域であるＡＥＩＤＧＩＥＬペプチド、ヒトファイブロネクチンは、α９インテグリンとの接着に重要なＥＤＡ領域内部分ペプチドであるＣＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰペプチドを合成し、ＢＳＡと結合させたものを利用した。ヒトα９インテグリン高発現細胞としてヒトα９インテグリンを発現したＣＨＯ−Ｋ１細胞（ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１）を用いた。
１．２５〜５．０μｇ／ｍＬのテネイシンＣ、ファイブロネクチン、ＶＣＡＭ−１またはｈＯＰＮ（ＲＡＡ）Ｎ−ｈａｌｆを９６ウエルプレートに５０μｌずつ添加し、３７度で１時間静置することにより固定化した。ブロッキング液（０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳ）にてブロッキング後、ＰＢＳで１度洗浄し、０．２５％ ＢＳＡ添加Ｄ−ＭＥＭで懸濁したヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と得られたモノクローナル抗体とを混合し、細胞１．０×１０^５個／ｍｌ、抗体濃度１０μｇ／ｍＬとなるように２００μｌずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ_２下で１時間反応後、０．５％ クリスタルバイオレット（ＷＡＫＯ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）／２０％メタノール溶液を５０μｌずつウェルに加え、室温で３０分間放置することにより細胞の固定と染色を行った。蒸留水でプレートを洗浄後、２０％ 酢酸溶液にて転溶し、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、陰性対照としてヒト・オステオポンチンに対するモノクローナル抗体（５Ａ１）、陽性対照として市販の抗ヒトα９インテグリン抗体Ｙ９Ａ２を用いた。
図２にその結果を示す。テネイシンＣ関与の細胞接着は２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６および２８Ｓ１で阻害されたが、１Ｋ１１では阻害されなかった。ファイブロネクチン関与の細胞接着は２１Ｃ５、２５Ｂ６および２８Ｓ１で阻害され、２４Ｉ１１で若干の阻害が観察されたが、１Ｋ１１では阻害されなかった。ＶＣＡＭ−１関与の細胞接着は２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６および２８Ｓ１で阻害が観察されたが、１Ｋ１１では阻害されなかった。ｈＯＰＮ（ＲＡＡ）Ｎ−ｈａｌｆ関与の細胞接着は２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６および２８Ｓ１で阻害されたが、１Ｋ１１では阻害されなかった。
（実施例５）
［抗ヒトα４インテグリン抗体と抗ヒトα９インテグリン抗体の共存下での細胞接着阻害効果］
α４およびα９インテグリンは多くの共通するＥＣＭに結合する。そこで、両方のインテグリンに対する抗体が存在することにより、細胞接着阻害効果の増強が考えられる。そこで、抗ヒトα４インテグリン抗体と抗ヒトα９インテグリン抗体の共存下における癌転移抑制効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで調べるため、α４インテグリンとα９インテグリンを発現している癌細胞であるヒト・メラノーマ細胞（Ｇ３６１）とＥＣＭとの接着に及ぼす両抗体の影響を検討した。
ＥＣＭとしてＶＣＡＭ−１（１．２５μｇ／ｍＬ）を、抗ヒトα４インテグリン抗体はＰ１Ｈ４を用い、実施例４と同様に実施した。
図３にその結果を示す。ＶＣＡＭ−１が関与する細胞接着は全て抗体で阻害されなかったが、抗ヒトα４インテグリン抗体が共存すると、陽性対照（Ｙ９Ａ２）、２１Ｃ５および２４Ｉ１１で阻害が見られた。多くのα９インテグリンを発現している細胞はα４インテグリンをも発現していることからから、抗ヒトα４インテグリン抗体と抗ヒトα９インテグリン抗体を併用することで細胞接着の抑制が可能となり、癌浸潤を含め多くの疾患抑制の増強効果が期待できると示唆された。
（実施例６）
［抗マウスα９インテグリン抗体の抗リウマチ効果］
７週齢の雌性マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に抗マウスα９インテグリン抗体（５５Ａ２Ｃ）、コントロールとして正常Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ（以後ＮＨＧと省略）をそれぞれ３匹に４００μｇ／匹を腹腔内投与した。２４時間後に関節炎惹起用タイプＩＩコラーゲンモノクローナル抗体カクテル（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）を２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ静脈投与した。タイプＩＩコラーゲンモノクローナル抗体カクテルを投与してから７２時間後に、再び５５Ａ２ＣまたはＮＨＧ ４００μｇ／匹を腹腔内投与した。同時にＬＰＳ ５０μｇ／匹を腹腔内投与した。ＬＰＳ投与３日前からＬＰＳ投与後６日目までマウスを観察し、Ｗｏｏｄの方法（Ｆ．Ｄ．Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｍ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ａ Ｔａｎａｋａ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３５，４５６（１９６９））に準じて関節炎の程度を採点し、スコアを記録した。
図４にその結果を示す。コントロールのＮＨＧではスコアが上昇し、リウマチの発症が観察されたが、抗マウスα９インテグリン抗体ではリウマチの発症を完全に抑制することが示唆された。従って、抗α９インテグリン抗体はリウマチの発症や増悪を抑制する治療効果を有することがわかった。
（実施例７）
［抗マウスα９インテグリン抗体の関節炎治療効果］
免疫系を制御するヘルパーＴ細胞は、従来、Ｔｈ１とＴｈ２に大別されると考えられていたが、最近、Ｔｈ１７細胞や抑制性Ｔ細胞などが存在することが明らかになった。また、インターロイキン（ＩＬ）−２３によって増加するＴｈ１７細胞だけが破骨細胞を増やす作用を持つことがわかった。Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−１７を産生することで、周囲の細胞の炎症を引き起こすと同時に破骨細胞分化因子ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ）を増やすことで、破骨細胞ができやすい環境を作り出している。さらに、ＩＬ−２３や１７の遺伝子を破壊したマウスでは、炎症性骨破壊が生じなかったことから、これらの因子が骨破壊に重要な役割を果たすことが報告されている。そこで、抗α９インテグリン抗体のＴｈ１７へ及ぼす影響を調べるため、マウスの関節炎モデルと抗マウスα９インテグリン抗体で検討した。
６週齢の雌性マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に抗マウスα９インテグリン抗体（１８Ｒ１８Ｄ、５５Ａ２Ｃ）、コントロールとしてＮｏｒｍａｌ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ（以後ＮＨＧと省略）をそれぞれ３匹に４００μｇ／匹を腹腔内投与した。１８Ｒ１８Ｄは細胞接着抑制能を有さない抗α９インテグリン抗体であり、５５Ａ２Ｃは、細胞接着抑制能を有する抗体である。２４時間後に関節炎惹起用タイプＩＩコラーゲンモノクローナル抗体カクテル（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）を２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ静脈投与した。タイプＩＩコラーゲンモノクローナル抗体カクテルを投与してから７２時間後に、再び５５Ａ２ＣまたはＮＨＧ ４００μｇ／匹を腹腔内投与した。同時にＬＰＳ ５０μｇ／匹を腹腔内投与した。ＬＰＳ投与３日前からＬＰＳ投与後６日目までマウスを観察し、Ｗｏｏｄの方法（Ｆ．Ｄ．Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｍ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ａ Ｔａｎａｋａ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ ｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，４５６（１９６９））に準じて、すなわち、「０：症状無し、１：四肢の指など小関節が一本のみ腫脹発赤、２：小関節２本以上、あるいは手首や足首などの比較的大きな関節が腫脹発赤、３：１本の手や足全体が腫脹発赤、４：さらに１本の手や足の全体的な腫脹が最大限に達している」の評価項目を用いて、関節炎の程度を採点し、スコアを記録した。
図５にその結果を示す。ＮＨＧと１８Ｒ１８Ｄではスコアが上昇し、関節炎の発症が観察されたが、抗マウスα９インテグリン抗体５５Ａ２Ｃでは関節炎の発症を劇的に抑制することが分かった。抗α９インテグリン抗体は関節炎の発症予防効果とともに増悪の抑制効果を有することがわかった。また、図６に抗α９インテグリン抗体による関節炎抑制像を示す。ＬＰＳ投与後６日目で、５５Ａ２Ｃ投与により関節の腫脹が抑制されたことがわかる。
次に、抗α９インテグリン抗体の関節炎発症後の治療効果を検討した。関節炎惹起用タイプＩＩコラーゲンモノクローナル抗体カクテル（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社）を２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ静脈投与し、７２時間後にＬＰＳ ５０μｇ／匹を腹腔内投与した。その３日後に５５Ａ２ＣあるいはＮＨＧを腹腔内投与（４００μｇ／匹）し、スコアを調べた。その結果、図７に示すように、関節炎発症後に抗α９インテグリン抗体を投与しても、関節炎の治療効果があることがわかった。
以上のことから、抗α９インテグリン抗体は関節炎に対して発症予防効果だけでなく、発症後の治療効果も有することが示唆されたので、その作用機作について検討した。関節炎発症マウスに抗α９インテグリン抗体を投与した後、肢足関節病変部のサイトカイン（ＩＬ−６，ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−β）の変化量をリアルタイムＰＣＲで測定した。その結果、５５Ａ２Ｃ投与群はＮＨＧ投与群と比較してＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＴＧＦ−αのｍＲＮＡの発現が有意に抑制されていた（図８）。これらのサイトカインはＴｈ１７の分化に重要であることが報告されており、抗α９インテグリン抗体による関節炎抑制効果は、α９インテグリンの機能の阻害により、Ｔｈ１７への分化に重要なサイトカイン産生が抑えられたことに起因すると推測できた。
一方、本関節炎モデルにおけるＴｈ１７の関与について調べるために、正常マウスとＬＰＳ投与後１日目、３日目、６日目のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、６週齢、雌性）のマウス鼠径リンパ節のＩＬ−１７及びＲＯＲγｔ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ γｔ：核内レセプターで、Ｔｈ１７分化に関与する転写因子）の発現を測定した。その結果、関節炎増悪に伴って有意にＩＬ−１７、ＲＯＲγｔのｍＲＮＡの発現が亢進することから、本関節炎モデルでのＴｈ１７の関与が示唆された（図９）。そこで、抗α９インテグリン抗体によるα９インテグリンの機能抑制がＴｈ１７の分化に及ぼす影響を検討するため、抗α９インテグリン抗体投与後、肢足関節病変部のＩＬ−１７およびＲＯＲγｔ発現量をリアルタイムＰＣＲで測定した。図８に示すように、抗α９インテグリン抗体で両者の発現が有意に抑制されていた。すなわち、抗α９インテグリン抗体はＴｈ１７の分化を抑制することがわかった。

本発明の抗体は、α９インテグリン機能抑制により、癌（例えば癌細胞の増殖、転移）、炎症性疾患（例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病））、感染症（例えば肝炎）、自己免疫疾患（例えば全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症）および骨疾患（例えば骨粗鬆症）等に対する治療効果を奏する。また、本発明の抗α９インテグリン抗体と抗α４インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された癌、炎症性疾患等の治療効果を奏する。本発明の抗体は、細胞や組織におけるα９インテグリンの発現を病理学的に検出できることから、診断薬としても利用できる。
［配列表］

Claims (10)

1. 配列番号１８、２２、２６、３０、３４および３８のアミノ酸配列を含有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を全て有する抗ヒトα９インテグリン抗体。
2. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１２で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される請求項１に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
3. モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
4. キメラ抗体である請求項１に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
5. ヒト化抗体である請求項１に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
6. ヒト抗体である請求項１に記載の抗ヒトα９インテグリン抗体。
7. 請求項１ないし６のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
8. 請求項１ないし６のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体と抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を有効成分として含む癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
9. 請求項１ないし６のいずれかに記載の抗ヒトα９インテグリン抗体を有効成分として含む癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
10. 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０５１２で標示されるハイブリドーマ細胞。