CN107405331A - 使用α9整联蛋白拮抗剂从骨髓干细胞龛迁移和释放HSC - Google Patents

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Abstract

造血干细胞动员是一种将造血干细胞刺激出骨髓空间的过程，在HSC可以动员之前，它们必须从它们所位于并且通过粘着相互作用而保留其中的BM干细胞龛被迁移和释放。因此，在本发明的一个方面，提供了一种用于在体内或离体增强HSC及其前体和祖细胞从BM干细胞结合配体迁移的方法，所述方法包括在体内或离体向BM干细胞龛施用有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。一旦动员到外周血(PB)，HSC可以被收集用于移植。增强HSC动员的方法也可以改善血液病的治疗。

Description

使用α9整联蛋白拮抗剂从骨髓干细胞龛迁移和释放HSC
技术领域
本发明涉及增强造血干细胞(HSC)及其前体和祖细胞从骨髓(BM)干细胞龛的迁移和释放，以及用于增强HSC及它们的前体及其祖细胞从BM和干细胞龛的迁移和释放的方法。本发明还涉及用于增强HSC及它们的前体及其祖细胞的迁移和释放的组合物。本发明包括已经通过所述方法和组合物迁移和释放的HSC及它们的前体和祖细胞的细胞群以及所述细胞群用于治疗血液病和HSC及其前体和祖细胞的移植的用途。
发明背景
BM干细胞龛内的HSC调节和保留是通过HSC表面受体与周围细胞如成骨细胞和窦状内皮细胞所表达的其相应配体之间的相互作用来介导的。使用功能测定及体内和离体成像进行的BM内的HSC的空间分布分析表明它们优先集中于骨内膜龛内的最靠近于骨/BM界面之处。值得注意的是，与经典的Lin-Sca-1+ckit+CD150+CD48-表型相同、但与骨内膜BM分离的HSC相对于从中央髓腔分离的HSC具有更大的归龛潜力和增强的长期、多谱系造血重构。因此，用于动员的骨内膜HSC的治疗靶向应提供更好的移植结果。
BM血生成位置涉及原始造血细胞与基质细胞介导的BM干细胞龛的造血微环境之间的发育调节的粘着相互作用。在稳态条件下，HSC通过与基质元件(如VCAM-1和骨桥蛋白(Opn))的粘着相互作用保留在BM龛中，导致原始造血祖细胞在BM中的生理保留。粘合剂相互作用的干扰可导致保留在BM中的HSC的释放，并引起干细胞/祖细胞从骨髓龛的释放，并最终通过动员进入循环。白细胞从骨髓最终至外周血的生理性流出或转移，以及少量干细胞/祖细胞从正常骨髓环境至循环的逃逸，是一个对其知之甚少的现象。细胞从骨髓的血管外空间至循环的移动可能需要可逆的粘附与迁移步骤的协调序列。在该过程中，由干细胞/祖细胞或骨髓中的基质细胞表达的粘着分子的所有组成成分是至关重要的。由不同刺激触发的祖细胞的粘附和/或迁移的改变可能导致它们在骨髓和外周血之间的移动或再分配。
释放和动员HSC的特定群体可以允许在各种情况下使用，包括移植、基因治疗、疾病、包括癌症如白血病、包括乳腺癌的肿瘤性癌症的治疗、或组织和皮肤的修复。然而，为了动员HSC，需要可以一开始从BM移出HSC的快速和选择性的动员方案。HSC的特异性细胞群从BM干细胞龛的迁移和释放可以提供更长期的多谱系的造血重构。
将动员的外周血(PB)造血干细胞(HSC)移植到接受血液病治疗的患者中已经基本上取代了传统的骨髓(BM)移植。通过5天时间的重组粒细胞集落刺激因子(G-CSF)实现HSC动员的一些临床实践，据信这可以刺激切割CXCR4/SDF-1相互作用的蛋白酶的生成。然而，G-CSF在大量患者中无效，并且与几种副作用相关，如骨痛、脾脏肿大、罕见情况下的脾破裂、心肌梗死和脑缺血。
G-CSF的这些固有缺点推动了鉴别基于小分子的替代的动员策略的各种努力。例如，FDA批准的CXCR4拮抗剂AMD3100(Plerixafor；MozobilTM)已被证明能够快速动员HSC，而只具有受限的毒性问题。然而，AMD3100的临床动员仅与G-CSF组合才有效，并且寻找快速、选择性的和不依赖G-CSF的动员方案仍然是具有临床兴趣的课题。虽然临床上G-CSF是最广泛使用的动员剂，但其缺点还包括潜在的毒副作用、相对较长的治疗过程(连续注射5-7天)和患者的不同响应性。
然而，为了实现动员，HSC必须从其对BM干细胞龛的附着中释放出来。对于龛功能和HSC在龛环境保持而言重要的分子包括VCAM-1、骨桥蛋白(Opn)和Tenasin-C。
整联蛋白如α4β1涉及HSC的动员。具体来说，由HSC表达的α4β1(VLA-4)和α9β1整联蛋白通过与骨内膜区域内的VCAM-1和骨桥蛋白(Opn)结合而参与干细胞静止和龛停留。虽然α9β1整联蛋白在HSC动员中的作用未知，但使用非甾体抗炎药(NSAID)的Opn的下调以及整联蛋白α4或G-CSF的选择性抑制已经验证了与整联蛋白结合的Opn/VCAM-1是HSC动员的有效标靶。然而，各种特征、诸如与小分子如整联蛋白的结合表明它们是截然不同的分子。
在Pepinsky等人(2002)中，α4β1和α9β1整联蛋白的结合特征有明显差异。Pepinsky表明，与EGTA治疗相比，结合小分子N-苯-磺酰基-(L)-脯氨酰基-(L)-O-(1-吡咯烷基羰基)酪氨酸(BOP)的差异是明显的。该治疗抑制单克隆抗体9EG7与α4β1的结合，而刺激9EG7与α9β1的结合。最显著的是，整联蛋白对于结合α4β1(表观Kd为10nM)的VCAM-1的亲和力与对于α9β1(表观Kd>10μM)的差异估计>1000倍。α9β1和α4β1与骨桥蛋白的结合也有差异。
因此，本发明的目的是鉴定快速和选择性的HSC的迁移和释放的化合物，以及不依赖G-CSF从而改善HSC的迁移和释放(导致改善的HSC的动员)的方案。通过将这些化合物靶向特定HSC群体，可以改善重构和移植结果。
本说明书中包含的文献、作品、材料、装置、物品等的讨论仅用于提供本发明的背景的目的。不建议或表示任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分，或者是在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在的与本发明相关的领域中的普通知识。
发明概述
在本发明的一个方面，提供了一种用于增强在体内或离体HSC及其前体和祖细胞从BM干细胞结合配体迁移的方法，所述方法包括在存在或不存在G-CSF的情况下，在体内或离体将有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂施用于BM干细胞龛。
优选地，HSC的迁移导致HSC从BM干细胞结合配体的释放，其使HSC能够从BM向PB移动，从而增强HSC的动员。通过使用进一步加强HSC至PB的动员的动员剂能协助动员的进一步刺激。
优选地，HSC是骨内膜祖细胞，其选自CD34+细胞、CD38+细胞、CD90+细胞、CD133+细胞、CD34+CD38-细胞、谱系–定型CD34-细胞或CD34+CD38+细胞。
优选α9整联蛋白的拮抗剂或其活性部分是α9β1整联蛋白或其活性部分。
在另一个实施方案中，所述方法还包括施用α4整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。优选地，α4整联蛋白是α4β1的拮抗剂或其活性部分。
在另一个实施方案中，拮抗剂与α9和α4交叉反应，并且任选地与α9β1和α4β1交叉反应。任选地，拮抗剂是α9β1/α4β1或其活性部分的拮抗剂。
优选地，拮抗剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其具有下式：
其中
X选自键和–SO2–；
R1选自H、烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R2选自H和取代基；
R3选自H和C1-C4烷基；
R4选自H和–OR6；
R5选自H和–OR7；
条件是当R4是H时，则R5是–OR7，且当R4是–OR6时，则R5是H；
R6选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R8、–C(O)R9和–C(O)NR10R11；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R8选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R9选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R10和R11与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
优选地，式(I)的化合物为
或其可药用盐。
更优选地，式(I)的化合物为
或其可药用盐。
最优选地，式(I)的化合物为
或其可药用盐。
在另一个实施方案中，提供了用于增强来自BM干细胞结合配体的HSC的迁移、释放或动员的组合物，所述组合物包含如本文所述的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
在本发明的又一个方面，提供了从受试者收获HSC的方法，所述方法包括：
在存在或不存在G-CSF的情况下，向受试者施用有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂，其中所述有效量增强HSC及其前体和祖细胞从BM干细胞龛中的BM干细胞结合配体的迁移；
动员迁移的HSC到PB；并从PB收获HSC。
在本发明的另外方面，提供了用于治疗受试者血液学障碍的方法，所述方法包括在存在或不存在G-CSF的情况下，向受试者施用治疗有效量的本文描述的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂或包含从受试者收获的HSC的细胞组合物，所述受试者施用了如本文所述的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂以增强HSC从BM至PB的迁移、释放或动员。
在另一个优选的实施方案中，所述血液病是造血性肿瘤性疾病，并且所述方法涉及化学增敏HSC以改变HSC的易感性，使得已经变得无效的化学治疗剂变得更有效。
另一个方面，提供了将HSC移植到患者内的方法，所述方法包括
向受试者施用α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂，以从BM干细胞结合配体迁移HSC；
将HSC从BM释放和动员至PB；
从受试者的PB收获HSC；和
将HSC移植到患者身上。
在本发明的具体实施方案的以下描述中本发明的其它方面将对本领域技术人员而言变得显而易见。
附图
为了进一步理解本发明的方面和优点，应结合附图参考下文的详细描述。
图1显示LN18衍生的细胞系的产生。通过人胶质母细胞瘤LN18细胞系的逆转录病毒转导产生过表达人整联蛋白α4β1和α9β1的稳定的LN18细胞。通过逆转录病毒载体递送α4shRNA实现了亲本和α9β1转导的LN18细胞中背景α4表达的沉默。
图2显示α4β1和α9β1LN18细胞的抗体染色。将对照LN18 SiA4，LN18α4β1和LN18α9β1细胞用小鼠同种型对照、小鼠抗人α4抗体或小鼠抗人α9β1抗体染色，然后用Alexa Fluor 594缀合的山羊抗小鼠IgG1进行二次标记。将细胞用DAPI(蓝色)复染色。
图3显示用化合物22和R-BC154对于对照(无整联蛋白；交叉点虚线)、α4β1(圆形–短划线虚线)和α9β1(正方形-实线)LN18细胞的饱和结合实验：(a)在1mM Ca2+/Mg2+(空心符号)的存在下的化合物22，和(b)在1mM Ca2+/Mg2+(空心符号)或1mM Mn2+(实心符号)的存在下的R-BC154。所示数据表示为平均荧光强度(MFI)±SEM(n＝3)。(c)在Ca2+/Mg2+和Mn2+条件下用50nM R-BC154(红色)染色的过表达和对照LN18细胞的荧光显微镜图像。将细胞用DAPI(蓝色)复染色。
图4显示了R-BC154的阳离子依赖性结合。将LN18α9β1细胞用仅在TBS缓冲液中的给定浓度的R-BC154(黑色条)、1mM Ca2+/Mg2+(红色条)或1mM Mn2+(蓝色条)处理。获得的数据来自单一实验，并表示为％最大荧光。
图5显示R-BC154结合LN18细胞的动力学测量。测定在TBS缓冲液中的1mM Ca2+/Mg2 +(空心符号)和1mM Mn2+(实心符号)存在下，在37℃下通过用50nM R-BC154处理细胞0,0.5,1,2,3,5,10,15和20分钟，R-BC154与(a)α4β1(圆形-短划线虚线)和(b)α9β1(正方形，实线)整联蛋白的结合速率。(c)测定在TBS缓冲液中的1mM Ca2+/Mg2+(空心符号)和1mM Mn2+(实心符号)存在下，在0,2.5,5,15,30,45和60分钟，R-BC154与α4β1(圆形-短划线虚线)和α9β1(正方形，实线)整联蛋白的结合的解离速率。所示数据表示为％最大荧光平均值±SEM(n＝3)，并绘制为时间的函数。将结合速率数据拟合为对于所有曲线的两相关联函数(R2>0.997)。将解离速率数据拟合为对于除α4β1(Ca2+/Mg2+)之外的所有曲线的单相指数衰减函数，将其拟合为两相指数衰减函数(R2>0.999)。
图6显示从从未处理的(灰线)和注射R-BC154(10mg/kg)(红线)的C57B1/6小鼠分离的(a)骨髓造血祖细胞(LSK)和(b)HSC(LSKSLAM)的流式细胞术直方图。数据代表3种生物样品。从(c)未处理的和(d)注射R-BC154的小鼠分离的FACS分选的祖细胞(Lineage-Sca-1+c-Kit+)的荧光显微镜图像(插图)。Sca-1+(蓝色)，c-Kit+(绿色)，R-BC154+(红色)。
图7显示R-BC154在体外优先结合鼠和人类造血祖细胞。(a)R-BC154(1)的化学结构。(b)在1mM Ca2+/Mg2+存在下，R-BC154对于对照SiA4(α4敲低；黑色)，α4β1(红色)和α9β1(蓝色)转导的LN18细胞系结合的代表性流式细胞术直方图。(c)描述骨内膜(红色)和中心(蓝色)BM的股骨的示意图和BM Lin-Sca+c-kit+(LSK)和LSKCD150+CD48-(LSKSLAM)的代表性流式细胞术图。(d)在10mM EDTA(去活化；黑色)和1mM Ca2+/Mg2+(活化；绿色)存在下用R-BC154(10nM)染色的LSK和LSKSLAM细胞的直方图。未染色的LSK和LSKSLAM细胞以灰色描绘。(e)R-BC154与从在10mM EDTA(去活化；黑色)和1mM Ca2+/Mg2+(活化；绿色)存在下染色的中心和骨内膜BM收获的LSK和LSKSLAM细胞结合。未染色的细胞以灰色描绘。数据表示为％最大平均荧光强度(MFI)±SEM(n＝3)，并且代表至少3个单独的实验。(f)在不存在阳离子的情况下，R-BC154与中心(蓝色)和骨内膜(红色)LSK细胞结合。点虚线阴影曲线表示未染色的LSK细胞。(g)在1mM Ca2+/Mg2+结合的存在下，比较R-BC154与来自中心(蓝色条)和骨内膜(红色条)BM的淋巴样(B220+和CD3+)和骨髓(Gr1Mac1+)、LSK和LSKSLAM细胞的结合。数据代表2个单独的实验。单因素ANOVA p<0.0001(h)R-BC154结合来自wt(黑色条)和α4 -/-/α9 -/-条件性KO小鼠(白色条)的中心和骨内膜LSK和LSKSLAM细胞。(i)在1mM Ca2+/Mg2+(绿色；活化)和不存在阳离子(黑色；未活化)的情况下，R-BC154与人单核细胞(MNC)的剂量响应结合。(j)表达CD34+和CD38-的人MNC的代表性流式细胞术图。门控群体代表谱系定型细胞(P1＝CD34-)，造血祖细胞(P2＝CD34+CD38+)和富集的干细胞和祖细胞(P3＝CD34+CD38-)。(k)在1mM Ca2+/Mg2+(绿色；活化)和不存在阳离子(黑色；未活化)的情况下，R-BC154结合CD34-,CD34+CD38-和CD34+CD38-细胞。未染色的细胞以灰色描绘。数据来自3个单独的脐血供体，并表示为归一化MFI(平均值±SEM)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005和****p<0.001。
图8显示在10mM EDTA和1mM Ca2+/Mg2+存在下，用R-BC154(10nM)处理的WBM的门控淋巴样(B220+和CD3+)，骨髓(Gr1Mac1+)和谱系群体的直方图。未染色的细胞以灰色描绘。数据为平均值±SEM(n＝3)。
图9显示R-BC154通过骨内膜龛内的内在活化的α4/α9整联蛋白原位靶向HSC和祖细胞。(a)R-BC154对于来自从注射R-BC154的小鼠收获的中心(蓝色)和骨内膜(红色)BM的门控LSK细胞结合的代表性直方图。描绘了R-BC154hi群体。来自未注射小鼠的LSK细胞以黑色显示。(b)体内时间段实验，描述从骨内膜(红色)和中心(蓝色)BM(每时间点n＝3)分离的LSK和LSKSLAM细胞内的R-BC154hi细胞的比例。p值(双向方差分析)表示在给定时间点的中心和骨内膜的比较。数据为平均值±SEM。(c)注射R-BC154后5分钟(n＝3)分离自骨内膜(红色条)和中心(蓝色条)BM的淋巴样(B220+和CD3+)和骨髓(Gr1+和Mac1+)后代中的R-BC154hi细胞％。数据是平均值±SEM，代表2次独立实验。(d)体内R-BC154结合依赖于LSK细胞上的α4和α9整联蛋白表达。来自注射R-BC154的wt和α4 -/-/α9 -/-条件性KO小鼠的谱系耗尽的FACS分选的Sca-1+c-kit+细胞的荧光显微镜图像(左)。R-BC154(红色)；Sca-1-PB(蓝色)；c-kit(绿色)。来自注射R-BC154的wt(红色)和α4 -/-/α9 -/-条件性KO小鼠(灰色)的门控LSK细胞的流式细胞术直方图(右)。来自未注射小鼠的LSK细胞以黑色显示。数据表示2个单独的实验。(e)皮下给药后的时间过程R-BC154与PB和BM中的LSK细胞结合。数据为平均值±SEM(n＝3)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005和****p<0.001。
图10显示(a)在注射后15和30分钟，用R-BC154处理的小鼠的外周血中WBC含量、(b)LSK含量和(c)LSKSLAM含量的分析。数据是平均值±SEM，不显著(单因素方差分析)。
图11显示小分子α9β1/α4β1整联蛋白拮抗剂BOP快速动员HSC和祖细胞。(a)α9β1/α4β1整联蛋白拮抗剂BOP(2)的化学结构。(b)在1mM Ca2+/Mg2+存在下，BOP对R-BC154与α4β1(点虚线)和α9β1(实线)LN18细胞的竞争性抑制。计算的IC50值为描绘的插图。(c)在1mM Ca2+/Mg2存在下，使用BOP，R-BC154与骨内膜LSK和LSKSLAM细胞的竞争性替代。数据是平均值±SEM(n＝3)。在90分钟内在用BOP(10mg/kg)处理的小鼠的外周血中(d)WBC、(e)LSK和(f)LSKSLAM含量的分析。数据是平均值±SEM(每个时间点n＝5)。
发明详述
造血干细胞动员是一种将造血干细胞从骨髓空间(例如髋骨和胸骨)刺激到血液中的过程，因此它们可用于将来的再灌注的收集，或者它们自然地从骨髓排出移动至身体各处进入器官(诸如脾脏)中以提供血细胞。鉴于能够人工激发HSC进入血液中的活性剂的发现(在此可以将它们收集起来并用于移植等目的)，可以将这种经常伴随着各种血液病的有趣的自然现象改变为治疗法的有用组成部分。化合物如G-CSF和FDA批准的CXCR-4拮抗剂AMD 3100已经显示出可动员HSC。然而，这种治疗可能导致毒性问题和各种副作用。
在HSC可以动员之前，它们必须从它们所位于并且通过粘着相互作用而保留其中的BM干细胞龛被迁移和释放。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种用于在体内或离体增强HSC及其前体和祖细胞从BM干细胞结合配体迁移的方法，所述方法包括在体内或离体将有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂施用于BM干细胞龛。
在稳态条件下，HSC位于称为BM干细胞龛的BM中的专门位置。在这里，它们作为静止的干细胞存在，随后在它们被释放，准备进入PB并且进入组织中开始分化。HSC通过粘着分子或结合配体(例如但不限于VCAM-1、Opn和Tenacin-C)保留在BM干细胞龛中。HSC/BM干细胞龛相互作用的管理有助于HSC迁移和释放至BM干细胞龛并最终到PB。
因此，本发明提供了通过破坏HSC和BM干细胞龛环境之间的粘着相互作用和结合配体来从BM干细胞龛中的相互作用中迁移和释放HSC的方法。然后，细胞变得可用于动员至PB，或者它们可留在BM中。
BM干细胞龛包括骨内膜龛和中央髓腔。骨内膜干细胞龛位于骨髓的骨内膜，在这里成骨细胞是HSC功能如增殖和静止的主要调节因子。此外，相当一部分HSC与内皮龛中的窦状内皮细胞密切相关，在那里它们准备进入外周血并开始分化。中央髓腔是骨的中央腔，负责形成红细胞和白细胞，也称为骨髓。
申请人已经发现，至少通过用小分子拮抗剂抑制α9整联蛋白，HSC及其前体和祖细胞可以从BM干细胞龛优选迁移至骨内膜龛中，或者动员进入具有长期多谱系植入潜力的PB中。令人惊讶地发现，α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂的使用显著增加了至少CD34+干细胞和祖细胞向血液中的迁移和释放。
申请人已经开发了一种基于一系列N-苯基磺酰基脯氨酸二肽的荧光小分子整联蛋白拮抗剂R-BC154(1)(图1a)，其结合活化的人和鼠α9β1和α4β1整联蛋白以及BM HSC和祖细胞(图1a)。申请人假定，该家族化合物将靶向强效的骨内膜HSC用于动员，其基于α9β1/α4β1和骨内膜BM内的Opn之间的限制性相互作用。现已发现，R-BC154(1)及其非标记衍生物BOP(2)通过在体内内在活化的α9β1/α4β1整联蛋白优先结合并动员小鼠和人类HSC和祖细胞。因此，使用α9β1/α4β1整联蛋白抑制剂的骨内膜HSC的治疗靶向为用于干细胞移植应用的当前动员策略提供了有希望的替代方案。
整联蛋白是非共价连接的αβ异二聚体跨膜蛋白，其主要功能为细胞粘着和细胞信号传导过程的介质。在哺乳动物中，已经鉴定了18个α链和8个β链，迄今描述了至少24种不同和独特的αβ组合。
α4β1整联蛋白(很晚期抗原-4；VLA-4)主要在白细胞上表达，已知是血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)、纤连蛋白和骨桥蛋白(Opn)的受体。α4β1整联蛋白是白细胞募集、迁移和活化的关键调节因子，在炎症和自身免疫性疾病中起重要作用。因此，重点致力于开发用于治疗哮喘、多发性硬化和克罗恩病的α4β1整联蛋白功能的小分子抑制剂，其中几名候选物进行了到I期和II期临床试验。
虽然这种相关的β1整联蛋白α9β1与α4β1共享许多结构和功能特性，并且也结合若干同样的配体(包括VCAM-1和Opn)，但整联蛋白α4β1和α9β1之间存在使得它们不同的差异。与主要表达在白细胞上的表达受限的α4β1不同的是，α9β1的细胞表达普遍存在。
例如，小分子与α9β1和α4β1整联蛋白的结合已被证明是不同的。如本文实施例所示，最大的差异在于解离率动力学。与α4β1相比，α9β1拮抗剂(R-BC154)以及BOP显示出明显降低的对于α9β1的解离率。R-BC154的详述在本文的实施例2中举例说明(图5c)，BOP的详述在Pepinsky等(2002)中列举(图4b)。
之前，已经表明α4β1和α9β1整联蛋白均被造血干细胞(HSC)表达。整联蛋白α4β1和α9β1主要参与HSC与骨髓的螯合和募集以及HSC静止的维持，这是长期再生干细胞的关键特征。
通过α4β1和α9β1整联蛋白的HSC调节通过与VCAM-1和Opn的相互作用介导，VCAM-1和Opn由骨衬成骨细胞、内皮细胞和骨髓环境的其它细胞表达和/或分泌。然而，如Pepinsky等人(2002)所述，α4β1和α9β1之间对VCAM-1和Opn的结合亲和力的差异显著不同。α4β1的小分子抑制剂已被认为是有效的HSC动员剂。然而，尽管α4β1和α9β1之间的结构和功能具有相似性，但结合特征是不同的，因此α9β1整联蛋白在这方面的作用尚未开发。
在本发明的一个优选实施方案中，α9整联蛋白的拮抗剂是α9β1整联蛋白的拮抗剂。整联蛋白α9是人类中的由ITGA9基因编码的蛋白质。该基因编码α整联蛋白。整联蛋白是由介导细胞功能的α链和β链组成的异二聚体整合膜糖蛋白。α9亚单位与β1亚单位形成异二聚体复合物，形成α9β1整联蛋白。因此，优选α9整联蛋白的拮抗剂是α9β1整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
如本文所用，α9β1整联蛋白的活性部分或α4β1整联蛋白的活性部分是保留整联蛋白活性的α9β1蛋白或α4β1蛋白的一部分。也就是说，该部分是α9β1蛋白或α4β1蛋白的一部分，其小于完整的蛋白质，但仍然可以以与完整α9β1或α4β1蛋白相同或相似的方式起作用。在本文中使用术语“α9整联蛋白”或“α4整联蛋白”或“α9β1整联蛋白”或“α4β1整联蛋白”的情况下，其还包括所提及的其任何活性部分。
在本发明的另一个实施方案中，α9整联蛋白、优选α9β1整联蛋白的拮抗剂也是α4整联蛋白、优选α4β1整联蛋白的拮抗剂。希望本发明的α9整联蛋白拮抗剂可以抑制α9β1整联蛋白和α4β1整联蛋白的活性。因此，优选拮抗剂是α9β1/α4β1整联蛋白拮抗剂。
α9整联蛋白、优选α9β1整联蛋白的拮抗剂可以与α4整联蛋白、优选α4β1整联蛋白的拮抗剂相同或不同。如果拮抗剂相同，可以使用单一拮抗剂来抑制α9整联蛋白和α4整联蛋白二者的活性。可以同时或依次使用分离的拮抗剂来抑制α9整联蛋白、优选α9β1整联蛋白和α4整联蛋白、优选α4β1整联蛋白。
在本发明的另一个实施方案中，以下是优选的：α9整联蛋白、优选α9β1整联蛋白和α4整联蛋白、优选α4β1整联蛋白在与整联蛋白拮抗剂相互作用之前被活化。拮抗剂优选与内在活化的整联蛋白相互作用。因此，期望α9整联蛋白是内在活化的。优选地，α9β1整联蛋白是内在活化的。如上所述，期望α9β1整联蛋白/α4β1整联蛋白同时或相继地被活化，使得整联蛋白拮抗剂通过骨内膜龛中内在活化的α9/α4整联蛋白靶向HSC和祖细胞。
在本发明的另一个实施方案中，α9整联蛋白的拮抗剂，优选α9β1整联蛋白的拮抗剂，更优选α9β1/α4β1整联蛋白的拮抗剂包含具有下式的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中
X选自键和–SO2–；
R1选自H、烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R2选自H和取代基；
R3选自H和C1-C4烷基；
R4选自H和–OR6；
R5选自H和–OR7；
条件是当R4是H时，则R5是–OR7，且当R4是–OR6时，则R5是H；
R6选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R8、–C(O)R9和–C(O)NR10R11；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R8选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R9选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R10和R11与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
在式(I)化合物的一组实施方案中:
R4是H；
R5是–OR7；
且X、R1、R2、R3和R7如在式(I)中所定义。
在该类实施方案中，式(I)的化合物可具有式(II)的结构:
其中:
X选自键和–SO2–；
R1选自H、烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R2选自H和取代基；
R3选自H和C1-C4烷基；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
在式(I)或式(II)的化合物的一组实施方案中:
R7选自C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自–CN、–O(C1-C4烷基)和任选地被取代的杂芳基；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n是1或2。
在式(I)或式(II)的化合物的一些实施方案中，R7选自C1-C4烷基。
如本文所述的用于式(I)或式(II)的基团的示例性的C1-C4烷基可以是直链或支链的。在一些实施方案中，C1-C4烷基可选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基。
在一些实施方案中，R7可以是甲基或叔丁基，使得–OR7是–OCH3或–OC(CH3)3。
在式(I)或式(II)的化合物的一些实施方案中，R7是–(CH2)n-R12。在该类实施方案中，R12可选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN，且n是1至3范围内的整数。
在式(I)或式(II)的化合物的一些实施方案中，R7是–(CH2)n-R12，其中R12可选自–CN、–O(C1-C4烷基)和任选地被取代的杂芳基，且n是1或2。
在式(I)或式(II)的化合物的一些实施方案中，R7是–(CH2)n-R12，其中:
R12是–OCH3，且n是2，或
R12是任选地被取代的四唑基(优选5-四唑基)，且n是1。
在式(I)或式(II)的化合物的一些实施方案中，R7是–C(O)R13。在该类实施方案中，R13可选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基。
在一组实施方案中，R13可以是任选地被取代的5-或6-元的环烷基环。示例性的环烷基环可以是环戊基或环己基。
在一组实施方案中，R13可以是任选地被取代的芳基环。示例性的芳基环是苯基。
在一组实施方案中，R13可以是任选地被取代的杂芳基环。示例性的杂芳基环是吡咯基。
在式(I)或式(II)的化合物的一些实施方案中，R7是–C(O)NR14R15。
在式(I)或式(II)的化合物的一些实施方案中，其中R7是–C(O)NR14R15，R14和R15可各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基。
在式(I)或式(II)的化合物的一些特定的实施方案中，其中R7是–C(O)NR14R15，R14和R15各自是乙基或异丙基。
在式(I)或式(II)的化合物的一个特定的实施方案中，其中R7是–C(O)NR14R15，R14和R15之一是甲基，且R14和R15的另一个是苯基。
在式(I)或式(II)的化合物的一些实施方案中，其中R7是–C(O)NR14R15，R14和R15与它们所连接的氮一起可形成任选地被取代的杂环烷基环。在一种形式中，任选地被取代的杂环烷基环可以是任选地被取代的5-至7-元的杂环烷基环。特别的杂环烷基环可选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基环。
在式(I)或式(II)的化合物的特定的实施方案中，R7是–C(O)NR14R15，其中R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的吡咯烷基环。
在式(I)或式(II)的化合物的一些特定的实施方案中:
R7选自C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自C1-C4烷基、–CN、–O(C1-C4烷基)和5-四唑基；
R13是2-吡咯基；
R14和R15各自独立地是C1-C4烷基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的吡咯烷基或吗啉基环；且
n是1或2。
在式(I)的化合物的一组实施方案中，X是–SO2-。在该类实施方案中，式(I)的化合物可具有式(III)的结构:
其中:
R1选自H、烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R2选自H和取代基；
R3选自H和C1-C4烷基；
R4选自H和–OR6；
R5选自H和–OR7；
条件是当R4是H时，则R5是–OR7，且当R4是–OR6时，则R5是H；
R6选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R8、–C(O)R9和–C(O)NR10R11；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R8选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R9选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R10和R11与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
在式(III)的化合物的一些实施方案中，R4是H，且R5是OR7，提供式(IIIa)的化合物:
其中
R1、R2和R3如式(III)中所定义；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
在式(IIIa)的一些实施方案中，R7选自C1-C4烷基(优选甲基或叔丁基)、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；其中
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n是整数，其选自1、2和3。
在式(IIIa)的特定的实施方案中，R7是–C(O)NR14R15，其中R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环。在一种形式中，任选地被取代的杂环烷基环可以是任选地被取代的5-至7-元的杂环烷基环。特别的杂环烷基环可选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基环。
在式(I)的一个特定的实施方案中，X是–SO2-，R4是H，且R5是-OR7，其中R7是–C(O)NR14R15，且R14和R15与它们所连接的氮一起形成吡咯烷基环。在该类实施方案中，式(I)的化合物可具有式(IIIb)的结构:
其中R1、R2和R3如本文所定义。
在如本文所述的式(I)、(II)、(III)、(IIIa)或(IIIb)的化合物的一组实施方案中，R1是任选地被取代的芳基。在一些实施方案中，R1是任选地被取代的苯基。
在一组实施方案中，R1是被至少一个卤素基团取代的苯基。卤素取代基可选自氯、氟、溴或碘、优选氯。
在一些实施方案中，R1是被多个卤素基团取代的苯基。所述卤素取代基可位于苯基环的3-和5-位。
在一个实施方案中，式(I)的化合物可具有式(IVa)或(IVb)的结构:
其中在(IVa)和(IVb)中的每一个中，R2、R3和R7如在式(I)中所定义。
在式(IVa)或(IVb)的化合物的一组实施方案中:
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
在如本文所述的式(I)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IVa)或(IVb)的化合物的一些实施方案中，R3是H。
在其中R3是H的实施方案中，式(I)的化合物可具有式(V)的结构:
其中:
X选自键和–SO2–；
R1选自H、烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R2选自H和取代基；R4选自H和–OR6；
R5选自H和–OR7；
条件是当R4是H时，则R5是–OR7，且当R4是–OR6时，则R5是H；
R6选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R8、–C(O)R9和–C(O)NR10R11；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R8选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R9选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R10和R11与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
在式(V)的化合物的一些实施方案中，R4是H，且R5是OR7，提供式(Va)的化合物:
其中
X、R1、R2和R7如式(V)中所定义。
在式(Va)的化合物的一些实施方案中，R7选自C1-C4烷基(优选甲基或叔丁基)、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；其中R12、R13、R14、R15和n如本文对式(V)所定义。
在式(Va)的化合物的特定的实施方案中，R7是–C(O)NR14R15，其中R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环。在一种形式中，任选地被取代的杂环烷基环可以是任选地被取代的5-至7-元的杂环烷基环。特别的杂环烷基环可选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基环。
在式(V)或(Va)的化合物的一些实施方案中，X是–SO2-。
在式(Va)的化合物的一个特定的实施方案中，X是–SO2-，R3和R4各自是H，且R5是–OR7，其中R7是–C(O)NR14R15，且R14和R15与它们所连接的氮一起形成吡咯烷基环。在该类实施方案中，式(V)的化合物可具有式(Vb)的结构:
在式(V)或(Va)的化合物的一组实施方案中，R1是任选地被取代的芳基、优选任选地被取代的苯基。任选的取代基优选是至少一个选自氯、氟、溴或碘的卤素基团，优选氯。
在一组实施方案中，R1是被至少一个卤素基团取代的苯基。在一些实施方案中，R1是被多个卤素基团取代的苯基。卤素取代基优选位于苯基环的3-和5-位。
在一个实施方案中，式(V)的化合物可具有式(VIa)或(VIb)的结构:
其中在(VIa)和(VIb)中的每一个中，R2和R7如在式(V)中所定义。
在式(VIa)或(VIb)的化合物的一组实施方案中:
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
在式(VIa)或(VIb)的化合物中的另一组实施方案中，R7选自甲基、叔丁基、–(CH2)n-R12，其中R12选自–CN、–CH3、-C(CH3)3和任选地被取代的杂芳基(优选5-四唑基)，且n是1或2。
在式(VIa)或(VIb)的化合物中的另一组实施方案中，R7是–C(O)R13，其中R13选自任选地被取代的环烷基(优选环戊基或环己基)、任选地被取代的芳基(优选苯基)和任选地被取代的杂芳基(优选吡咯基)。
在式(VIa)或(VIb)中的另一个实施方案中，R7是–C(O)NR14R15，其中R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环。在一种形式中，任选地被取代的杂环烷基环可以是任选地被取代的5-至7-元的杂环烷基环。特别的杂环烷基环可选自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基和吗啉基环。
在一个特定的实施方案中，式(I)的化合物具有式(VII)的结构:
其中R2和R3如在式(I)中所定义。
在式(I)的化合物的一组实施方案中，R3是H，提供以下式(VIII)的化合物:
其中R2选自H和取代基。
在式(I)的化合物的一种形式中，R2是H，提供以下式(IX)的化合物或其可药用盐:
在一个优选的特定实施方案中，式(I)的化合物是以下式的化合物或其可药用盐:
如本文所述，在式(I)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IVb)、(V)、(Va)、(Vb)、(VIa)、(VIb)、(VII)、或(VIII)的化合物中，R2在一些实施方案中可以是取代基。
在一组实施方案中，R2是取代基，其选自任选地被取代的杂芳基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的环烷基、羟基、氨基和叠氮基，或R2是具有式(A)的结构的取代基:
其中
Y是任选地被取代的杂芳基或任选地被取代的杂芳基-C(O)NH-；
连接基选自–(CH2)p–和–(CH2CH2O)p–或其任意组合；
p每次出现时为1至4的范围内的整数；且
Z是荧光团(优选罗丹明基团)。
在式(I)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IVb)、(V)、(Va)、(Vb)、(VIa)、(VIb)、(VII)或(VIII)的化合物的一些实施方案中，R2是任选地被取代的杂芳基。适合的任选地被取代的杂芳基可包含5至10个环原子和至少一个选自O、N和S的杂原子。任选地被取代的杂芳基可以是单环或二环。
在一些实施方案中，R2可以是杂芳基，其选自吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、四唑、吲唑、4,5,6,7-四氢吲唑和苯并咪唑、
在式(I)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IVb)、(V)、(Va)、(Vb)、(VIa)、(VIb)、(VII)或(VIII)的化合物的一些实施方案中，R2是任选地被取代的杂环烷基。适合的任选地被取代的杂环烷基可包含3至10个环原子、优选4至8个环原子和至少一个选自O、N和S的杂原子。任选地被取代的杂环烷基可以是单环或二环。
在一些实施方案中，R2可以是任选地被取代的杂环烷基，其选自任选地被取代的氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、吗啉和硫吗啉。
在一些实施方案中，R2可以是任选地被取代的哌啶。在一些实施方案中，哌啶可以被至少一个C1-C4烷基取代基取代。在一些实施方案中，C1-C4烷基取代基可以是甲基。
在一些实施方案中，R2可选自2-甲基哌啶、3-甲基哌啶、4-甲基哌啶、3,5-二甲基哌啶和3,3-二甲基哌啶。
当R2是任选地被取代的杂芳基或任选地被取代的杂环烷基时，R2可以通过杂芳基或杂环烷基环上的杂原子连接于式(I)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IVb)、(V)、(Va)、(Vb)、(VIa)、(VIb)、(VII)或(VIII)的化合物的吡咯烷环。例如，当R2是选自吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、四唑、吲唑、4,5,6,7-四氢吲唑和苯并咪唑的杂芳基时，或当R2是选自任选地被取代的氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷、吗啉和硫吗啉的任选地被取代的杂环烷基时，则R2通过杂芳基或杂环烷基的氮(N)杂原子以共价方式连接于化合物的剩余部分。
在式(I)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IVb)、(V)、(Va)、(Vb)、(VIa)、(VIb)、(VII)或(VIII)的化合物的一些实施方案中，R2是具有式(A)的结构的取代基:
其中
Y是任选地被取代的杂芳基；或任选地被取代的杂芳基-C(O)NH-；
连接基选自–(CH2)p–和–(CH2CH2O)p–或其任意组合；
p每次出现时为1至4的范围内的整数；且
Z是荧光团(优选罗丹明基团)。
在一些实施方案中，Y可选自三唑或三唑-C(O)NH-。
在一些实施方案中，Y可以是三唑或三唑-C(O)NH-，使得式(A)的结构为式(A1)或(A2):
在一些实施方案中，连接基可选自–(CH2)p–和–(CH2CH2O)p–或其任意组合，其中p每次出现时为1至4的范围内的整数。
在一些实施方案中，连接基可以为式(A3)或(A4):
其中p每次出现时为1至4的范围内的整数。
在式(A)、(A1)、(A2)、(A3)或(A4)的一些实施方案中，Z是罗丹明荧光团，其选自以下基团:
在一个特定的实施方案中，式(I)的化合物具有以下结构:
在另一个特定的实施方案中，式(I)的化合物具有以下结构:
不希望受理论所束缚，据信本文所述式的化合物中的吡咯烷氨基甲酸酯部分对于确保对α9整联蛋白、更特别α9β1整联蛋白或其活性部分的高结合亲和力是重要的。还认为羧酸官能度对于拮抗剂活性是必需的。
在上面的描述中，使用了许多术语，这些术语是技术人员熟知的。然而，为了清楚起见，许多术语定义如下。
如本文所用，术语“未取代的”是指不存在取代基或仅有的取代基是氢。
在整个说明书中使用的术语“任选地取代的”表示该基团可以或可以不被一个或多个非氢取代基进一步取代或稠合(以形成稠合的多环体系)。在某些实施方案中，取代基是一个或多个独立地选自以下的基团：卤素、＝O、＝S、-CN、-NO2、-CF3、-OCF3、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、杂烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、杂环烯基、芳基、杂芳基、环烷基烷基、杂环烷基烷基、杂芳基烷基、芳基烷基、环烷基烯基、杂环烷基烯基、芳基烯基、杂芳基烯基、环烷基杂烷基、杂环烷基杂烷基、芳基杂烷基、杂芳基杂烷基、羟基、羟基烷基、烷基氧基、烷基氧基烷基、烷基氧基环烷基、烷基氧基杂环烷基、烷基氧基芳基、烷基氧基杂芳基、烷基氧基羰基、烷基氨基羰基、烯基氧基、炔基氧基、环烷基氧基、环烯基氧基、杂环烷基氧基、杂环烯基氧基、芳基氧基、苯氧基、苄氧基、杂芳基氧基、芳基烷基氧基、氨基、烷基氨基、酰氨基、氨基烷基、芳基氨基、磺酰氨基、亚磺酰基氨基、磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、亚磺酰基、烷基亚磺酰基、芳基亚磺酰基、氨基亚磺酰基氨基烷基、C(＝O)OH、-C(＝O)Re、C(＝O)ORe、C(＝O)NReRf、C(＝NOH)Re、C(＝NRe)NRfRg、NReRf、NReC(＝O)Rf、NReC(＝O)ORf、NReC(＝O)NRfRg、NReC(＝NRf)NRgRh、NReSO2Rf、-SRe、SO2NReRf、-ORe、OC(＝O)NReRf、OC(＝O)Re和酰基，
其中Re和Rf、Rg和Rh各自独立地选自H、C1-C4烷基、C1–C12卤代烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C1-C10杂烷基、C3-C6环烷基、C3-C12环烯基、C5-C6杂环烷基、C1–C12杂环烯基、C6芳基和C1-C5杂芳基，或者当Re和Rf与它们所连接的原子一起时形成具有3至12个环原子的环状或杂环环系统。
在某些实施方案中，任选的取代基可以选自卤素、烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、-C(O)Re、-C(O)ORe、-C(O)NReRf、-ORe、-OC(O)NReRf、OC(O)Re和酰基，其中Re和Rf各自独立地选自H、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C5-C6杂环烷基、C6芳基和C1-C5杂芳基，或当Re和Rf与它们所连接的原子一起时形成具有3至12个环原子的环状或杂环环系统。
除非另有说明，作为基团或部分基团的“烷基”是指直链或支链的脂族烃基，优选C1–C12烷基，更优选C1-C10烷基，最优选C1-C4。适当的直链和支链的C1-C4烷基取代基的实例包括甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。所述基团可以是端基或桥连基。
作为基团或基团的一部分的“芳基”是指(i)优选每个环具有5至12个原子的任选地被取代的单环或稠合多环芳族碳环(具有环原子全部为碳原子的环结构)。芳基的实例包括苯基、萘基等；(ii)任选地被取代的部分饱和的双环芳族碳环部分，其中苯基和C5-7环烷基或C5-7环烯基稠合在一起形成环状结构，如四氢萘基、茚基或茚满基。该基团可以是端基或桥连基。通常，芳基是C6-C18芳基。
“键”是化合物或分子中的原子之间的连接。在本文所述的式(I)化合物的一组实施方案中，所述键是单键。
除非另有说明，“环烷基”是指饱和的单环或稠合或螺环多环，碳环优选每个环含有3至9个碳，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。它包括单环系统(如环己基)、双环体系如萘烷以及多环体系如金刚烷。环烷基通常为C3-C12烷基。该基团可以是端基或桥连基。
“卤素”表示氯、氟、溴或碘。
“杂芳基”单独或作为基团一部分是指包含在芳环中具有一个或多个作为环原子的杂原子、其余环原子为碳原子的芳环(优选为5或6元芳环)的基团。合适的杂原子可以选自氮、氧和硫。所述基团可以是单环或双环杂芳基。杂芳基的实例包括噻吩、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并咪唑、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、萘并[2,3-b]噻吩、呋喃、异中氮茚(isoindolizine)、氧杂蒽酮(xantholene)、phenoxatine、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、四唑、吲哚、异吲哚、1H-吲唑、嘌呤、喹啉、异喹啉、2,3-二氮杂萘、萘啶、喹喔啉、噌啉、咔唑、菲啶、吖啶、吩嗪、噻唑、异噻唑、吩噻嗪、噁唑、异噁唑、呋咱、吩噁嗪、2-、3-或4-吡啶基、2-、3-、4-、5-或8-喹啉基、1-、3-、4-或5-异喹啉基、1-、2-或3-吲哚基、和2-或3-噻吩基。杂芳基通常是C1-C18杂芳基。该基团可以是端基或桥连基。
“杂环烷基”是指在至少一个环中含有至少一个选自氮、硫、氧的杂原子、优选1-3个杂原子的饱和单环、双环或多环。每个环优选为3-至10-元，更优选为4-至7-元。合适的杂环烷基的实例包括吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基和吗啉代。该基团可以是端基或桥连基。
应理解，式(I)化合物家族为异构体形式，其包括非对映异构体、对映异构体和互变异构体、以及“E”或“Z”构型的几何异构体或E和Z异构体的混合物。还应当理解，一些异构形式如非对映异构体、对映异构体和几何异构体可以通过物理和/或化学方法和由本领域技术人员分离。对于存在几何异构可能性的那些化合物而言，虽然将认识到其它异构体可能为正确结构归属，但是申请人已经画出了化合物所认为的异构体。
公开的实施方案的一些化合物可作为单一立体异构体、外消旋物和/或对映异构体和/或非对映异构体的混合物存在。所有此类单立体异构体、外消旋物及其混合物旨在为描述和要求保护的主题范围内。
此外，式(I)在适用的情况下旨在涵盖化合物的溶剂化和非溶剂化形式。因此，每个式包括具有指定结构的化合物，包括水合物和非水合形式。
式(I)还旨在包括化合物的药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”指保持以上鉴定的化合物的所需生物活性的盐，并且包括药学上可接受的酸加成盐和碱加成盐。式(I)的化合物的适合药学上可接受的酸加成盐可由无机酸或有机酸制备。此类无机酸的实例为盐酸、硫酸和磷酸。适当有机酸可选自脂肪族、环脂族、芳族、杂环、羧酸和磺酸类有机酸，其实例为甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、延胡索酸、马来酸、烷基磺酸和芳基磺酸。类似地，碱加成盐可以通过本领域熟知的方法使用有机或无机碱来制备。合适的有机碱的实例包括单胺如甲胺、乙胺、三乙胺等。合适的无机碱的实例包括NaOH、KOH等。在Remington'sPharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing Co.,Easton，PA1995中可找到另外关于药学上可接受的盐的信息。在试剂为固体的情况下，本领域的技术人员应理解发明化合物、试剂和盐可呈不同结晶或多晶型物形式存在，其全部旨在为本发明和指定式的范围内。
在本发明的另一个优选实施方案中，提供了一种用于在体内或离体增强HSC及其前体和其祖细胞从BM干细胞结合配体的释放的方法，所述方法包括在体内或离体向BM干细胞龛施用有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
一旦HSC从BM干细胞结合配体迁移，它们不再锚定到BM上，并且可以从BM中释放并进入细胞周期进行增殖和分化。或者，它们可以保留在BM中并进入BM中的细胞周期。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种在在体内或离体增强HSC及其前体和其祖细胞从BM干细胞龛的动员的方法，所述方法包括在在体内或离体向BM干细胞龛施用有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
由于HSC被迁移和释放，HSC可以被动员到PB。移动和释放对于实现动员至关重要。加强的HSC的释放将使更多的细胞被动员。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述方法在存在或不存在G-CSF的情况下进行。优选地，所述方法在不存在G-CSF的情况下进行。
虽然临床上G-CSF是对于HSC最广泛使用的动员剂，但其缺点包括潜在的毒副作用、相对长的治疗过程(连续注射5-7天)和患者的可变响应性。因此，本发明的优点是可以在不存在G-CSF的情况下进行有效的动员，基本上可以避免毒副作用。
本发明中使用的“造血干细胞”是指能够最终分化为所有血细胞(包括红细胞、白细胞、巨核细胞和血小板)的多能干细胞。这可能涉及分化成祖细胞或胚细胞的中间阶段。因此，术语“造血干细胞”、“HSC”、“造血祖细胞”、“HPC”、“祖细胞”或“胚细胞”在本发明中可互换使用，并描述具有降低的分化潜能但仍然能够成熟成不同的特定谱系的细胞(例如骨髓或淋巴谱系)的HSC。“造血祖细胞”包括红细胞系爆发形成单位、粒细胞、红细胞、巨噬细胞、巨核细胞集落形成单位、粒细胞、红细胞、巨噬细胞和粒细胞巨噬细胞集落形成单位。
本发明涉及增强HSC及其前体和其祖细胞从BM干细胞结合配体的迁移。一旦迁移，细胞可以从BM干细胞龛被释放，在那里它们可以保留或优选被释放并被动员到PB中。这些细胞具有造血重构能力。本发明提供了一种通过从BM干细胞结合配体(优选最靠近骨内膜龛内的骨/BM界面)或从中央髓腔迁移HSC来增强HSC动员的方法。更优选地，从骨内膜龛内的骨/BM界面动员HSC，因为这些细胞已被证明相对于从中央髓腔分离的HSC给予更长的、多谱系造血重构。
迁移、释放或动员的细胞类型还可以在鼠群体中找到，其选自富集Lin-Sca-1+ckit+(本文称为LSK)细胞的BM衍生祖细胞或富集LSKCD150+CD48-细胞(这里称为LSKSLAM)的干细胞。这些等同的鼠群体提供了可以通过使用α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂从BM干细胞龛迁移、释放或动员的细胞类型的指示。优选地，所述细胞类型等同于在富集LSKCD150+CD48-细胞(LSKSLAM)的干细胞中发现的那些细胞类型。
优选地，被迁移、释放或动员的细胞是骨内膜祖细胞，并且选自CD34+、CD38+、CD90+、CD133+、CD34+CD38-细胞、谱系-定型CD34-细胞或CD34+CD38+细胞。
本发明可以在在体内或离体进行。即α9拮抗剂，优选α9β1的拮抗剂，更优选α9β1/α4β1的拮抗剂可以在体内施用于有需要的受试者或施用于离体样品以从BM动员HSC。
本文所用的“受试者”包括所有动物，包括哺乳动物和其他动物，包括但不限于伴侣动物、农场动物和动物园动物。术语“动物”可以包括任何存活的多细胞脊椎动物生物、包括例如哺乳动物、鸟、猿猴、狗、猫、马、牛、啮齿动物等的类别。同样，术语“哺乳动物”包括人类和非人类的哺乳动物。
本发明涉及增强HSC迁移、释放或动员。如本文使用的“增强”是指细胞或生物体的性能的改善或特定参数的其他生理上有益的增加。有时，可以将现象的增强量化为特定参数的测量值的减小。例如，干细胞的迁移可以被测量为在循环系统中循环的干细胞的数量的减少，但是这仍然可以表示这些细胞迁移到它们可以执行或促进有益的生理结果的身体区域的增强，所述有益的生理结果包括但不限于分化为替代或矫正损失或损坏的功能的细胞。同时，由于HSC从BM迁移到PB，增强可被测量为外周血中任何一种细胞类型的增加。增强可指循环干细胞数量减少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％以上，或者可表示循环干细胞数量增加15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或大于50％。干细胞迁移的增强可导致或被测量为非造血系的细胞群减少例如15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％或细胞群更大的减少或细胞群的响应。换言之，增强的参数可以被认为是干细胞的转运。在一个实施方案中，增强的参数是干细胞从诸如BM的组织源释放。在一个实施方案中，增强的参数是干细胞的迁移。在另一个实施方案中，参数是干细胞的分化。
在一个实施方案中，静脉内、皮内、皮下、肌内、透皮、粘膜或腹膜内施用α9整联蛋白拮抗剂；任选地，静脉内或皮下施用所述拮抗剂。
在本发明的另一个方面提供了一种组合物，其用于增强来自受试者的BM干细胞龛中BM干细胞结合配体的HSC的迁移，所述组合物包含本文所述的α9整联蛋白的拮抗剂。更优选地，拮抗剂是如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂。最优选地，拮抗剂是如本文所述的α4β1/α9β1整联蛋白拮抗剂。
在一个优选的实施方案中，组合物增强HSC从BM干细胞龛中的BM干细胞结合配体的释放。更优选地，该组合物增强HSC从BM干细胞龛至PB的迁移或动员。
所述组合物可以是药物组合物，其还包含药学上可接受的载体。在组合物中如本文所述的α9整联蛋白的拮抗剂可以单独提供或与α9整联蛋白、α4整联蛋白、α9β1整联蛋白、α4β1整联蛋白的另外的拮抗剂组合提供，或者其可以是α9β1/α4β1整联蛋白的组合拮抗剂。拮抗剂可以相同或不同，但都将起至少α9整联蛋白的拮抗剂的作用。
在本发明的另一个方面提供了如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于增强HSC及其前体和其祖细胞从患者BM干细胞结合配体的迁移。
本文描述的方法包括组合物和药物组合物的制备和使用，其包含作为用于增强HSC及其前体和其祖细胞从BM干细胞结合配体的迁移的活性成分的本文所述的α9整联蛋白的拮抗剂。优选地，增强了HSC的释放。更优选地，增强HSC动员。药物组合物通常包含药学上可接受的载体。如本文所用的措辞“药学上可接受的载体”包括本领域技术人员已知的可与药物施用配伍的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中，例如生长因子例如G-CSF。
药物组合物通常被配制成可与预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内，皮内，皮下，透皮(局部)，透粘膜，腹膜内和直肠施用。优选地，将如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂皮下施用。
在一些实施方案中，将药物组合物配制成将本文所述的α9整联蛋白拮抗剂靶向递送至骨髓、优选至BM干细胞龛、更优选至BM干细胞龛的骨内膜龛。例如，在一些实施方案中，可将如本文所述的α9整联蛋白的拮抗剂配制在脂质体纳米混悬剂和包合配合物(例如与环糊精)中，其可以更有针对性地递送至BM同时减少副作用。
药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
在本发明的另一个方面，提供了从受试者收获HSC的方法，所述方法包括：
将有效量的如本文所述的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂施用于受试者，其中所述有效量增强HSC及其前体和祖细胞从BM干细胞龛中的BM干细胞结合配体的迁移；
将迁移的HSC动员至PB；和
从PB收获HSC。
优选地，在没有G-CSF的情况下施用α9整联蛋白拮抗剂。
如本文所述的化合物如α9β1整联蛋白拮抗剂的增强HSC及其前体和其祖细胞从BM干细胞龛中的BM干细胞结合配体的迁移用途，能使得细胞最终动员至PB用于进一步收集。细胞可以自然地从BM中动员和排出，或者这些细胞可以通过使用其它HSC动员剂(例如但不限于白细胞介素-17、环磷酰胺(Cy)、多西他赛和粒细胞集落刺激因子(G-CSF))被激发而动员。
在一个实施方案中，认为细胞一旦被收获，就可以返回到身体以补充或补足患者的造血祖细胞群(同源或自体移植)，或者被移植到另一个患者以补充其造血祖细胞群(异源的或同种异体移植)。在个体经过化疗期之后的情况中，这可能是有利的。此外，还有一些遗传病症，如地中海贫血、镰状细胞性贫血、先天性角化不良、舒-戴二氏综合征和Diamond-Blackfan贫血，其中HSC和HPC数量降低。因此，本发明的方法在增强HSC漂移、释放或动员中可能是有用的和适用的。
骨髓移植的接受者可能具有有限的骨髓储备，例如老年受试者或者以前暴露于免疫降低治疗如化学疗法的受试者。与对照血细胞水平相比，他们可能具有降低的血细胞水平或具有发展为降低的血液细胞水平的风险。如本文所用，术语“对照血细胞水平”是指在改变受试者中的血细胞水平的事件之前的或实质上不存在所述事件的受试者的血细胞平均水平。改变受试者血细胞水平的事件包括例如贫血、创伤、化疗、骨髓移植和放射治疗。例如，受试者由于例如创伤而导致贫血或失血。
通常，向供体施用有效量的α9整联蛋白拮抗剂如α9β1整联蛋白拮抗剂、更优选α9β1/α4β1整联蛋白拮抗剂，以诱导HSC从BM的迁移、释放或优选动员，以及至PB的释放和动员。一旦将HSC动员至PB，血液的收集和HSC的分离可以使用通常可用于供血的方法进行，例如但不限于对于血库可使用的那些技术。在一些实施方案中，一旦从已经使用如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂治疗的受试者获得了PB或BM，则可以使用标准方法如血液成分部分清除或白细胞分离术从其中分离HSC。
优选地，α9整联蛋白拮抗剂的有效量在25-1000μg/kg体重、更优选50-500μg/kg体重、最优选50-250μg/kg体重的范围内。有效量可以选自50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250μg/kg体重。
取决于α9整联蛋白拮抗剂的所用量，迁移、释放或优选动员可立即发生。然而，可以在施用后约1小时内收获HSC。α9整联蛋白拮抗剂的实际时间和量可以根据多种因素而变化，包括但不限于受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的响应性、期望的临床效果)和施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验和使用对照曲线来确定有效量。
本发明认为的术语“对照曲线”被认为是指通过在相同条件下测量不同浓度的α9整联蛋白拮抗剂的HSC迁移、释放或动员特征而产生的统计学和数学上相关的曲线，并且其中细胞可以以规则的时间间隔收获和计数。本发明考虑的这些“对照曲线”可以用作在随后的情况下评价不同施用浓度的一种方法。
本发明认为的术语“收获造血干细胞”、“收获造血祖细胞”、“收获HSC”或“收获HPC”被认为是指从PB中分离细胞并被认为是本领域技术人员会明白的技术。任选地收集、分离细胞，并任选地进一步扩增，产生甚至更大的HSC群体和分化的后代。
在本发明的另一个方面，提供了包含由本文所述的方法获得的HSC的细胞组合物，所述方法包括施用有效量的本文所述的α9整联蛋白拮抗剂以增强HSC从BM到PB的迁移、释放或动员。
由于HSC的迁移增加，假定更多的HSC可以被释放到BM干细胞龛，以便随后动员到PB。因此，从已经向BM干细胞龛施用有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂的受试者收获的细胞组合物将富含HSC。
优选地，细胞组合物将富含骨内膜龛的细胞，并且是选自CD34+、CD38+、CD90+、CD133+、CD34+CD38-细胞、谱系-定型CD34-细胞或CD34+CD38+细胞的骨内膜祖细胞。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗血液病的方法，所述方法包括施用包含由本文所述方法获得的HSC的细胞组合物，所述方法包括施用有效量的如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂，以增强HSC从BM向PB的迁移、释放或动员。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗受试者血液病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本文所述的α9整联蛋白拮抗剂施用于受试者以加强HSC从BM到PB的迁移、释放或动员。
在另一个优选的实施方案中，所述血液病是造血性肿瘤性疾病，并且所述方法涉及化学敏化HSC以改变HSC的易感性，使得已经变得无效的化学治疗剂变得更有效。
白血病治疗中长期存在的问题是以下概念：处于休眠状态的恶性细胞可能逃避细胞毒性剂的作用，使其能够驱动复发。虽然对控制癌细胞休眠已经做了很多努力，但很少有人专注于微环境的作用，特别是骨髓干细胞龛。最近，已经有数据证明已知在骨髓中锚定正常造血干细胞的细胞外基质分子骨桥蛋白，也在支持白血病细胞、特别是急性淋巴细胞性白血病(ALL)的休眠中起作用(通过将它们锚定在骨髓微环境的关键区域中)。此外，额外的数据显示复发的ALL具有显著升高的整联蛋白α4β1的水平。本文提供的数据表明，与α9β1及其细胞外基质配体相互作用竞争的药物将诱导这些细胞进入细胞周期，使其易受细胞毒性化疗的侵袭。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括治疗需要增加干细胞数量的血液病患者的方法。在一些其他的实施方案中，受试者被预定为或计划捐献干细胞如HSC，例如用于异源或自体移植。通常，所述方法包括将治疗有效量的本文所述的α9整联蛋白拮抗剂施用于需要或已经确定需要所述治疗的受试者。施用用于治疗这些受试者的治疗有效量的本文所述的α9整联蛋白拮抗剂、优选α9β1拮抗剂、更优选α9β1/α4β1整联蛋白拮抗剂将导致PB或BM中HSC的数量和/或频率增加。
本文所用的“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)靶向的病症、疾病或障碍(统称为“疾病”)，即使治疗最终不成功。那些需要治疗的人可能包括那些已经患有疾病的人、以及那些容易患有疾病或要预防疾病的人。
“有效量”是足以实现PB或BM中HSC的数量和/或频率的显著增加或减少的量。有效量可以以一种或多种施用、应用或剂量施用。
本文所用的“治疗有效量”是指足以在被治疗的受试者中达到期望的效果的特定组合物或组合物中活性剂的量。例如，这可以是对增强补充、修复或恢复组织的HSC的迁移有效的量。在另一个实施方案中，“治疗有效量”是有效增强HSC转运的量，例如增加HSC的释放，正如血流中循环干细胞水平升高所证明的那样。在另一个实施方案中，“治疗有效量”是有效地增强HSC从循环系统到各种组织或器官的归龛和迁移的量，如血液中循环HSC和/或与归龛和迁移相关的表面标记的表达的水平的降低可以证明。治疗有效量可以根据多种因素而变化，包括但不限于受试者的生理状况(包括年龄，性别，疾病类型和阶段，一般身体状况，对给定剂量的响应性，期望的临床效果)和施用途径。临床和药理领域的技术人员将能通过常规实验来确定治疗有效量。
组合物可以每天一次或多次至每周一次或多次施用；包括每隔一天一次施用。技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于先前的治疗、受试者的一般健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，用有效量的本文所述的组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。
在一些实施方案中，所述施用将导致PB中HSC的数量增加约10-200倍。
化合物的剂量、毒性和治疗功效可以通过标准药物程序来确定，例如在细胞培养物或实验动物中，例如用于测定LD50(对群体50％致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的标准药物程序。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD50/ED50的比例。优选表现出高治疗指数的化合物。虽然可以使用显示出毒性副作用的化合物，但应注意设计将这些化合物靶向至受侵袭组织的部位的递送系统，以最小化对未受侵袭细胞的潜在损伤，从而减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人的一系列剂量。这些化合物的剂量优选在包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和使用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量最初可以从细胞培养测定来判断。可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，其包括在细胞培养物中测定的IC50(即，如本文所述的α9整联蛋白的拮抗剂浓度达到症状的半最大抑制的浓度)。这些信息可用于更精确地确定人体中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。
在一些实施方案中，本文所述的治疗方法包括施用另一种HSC动员剂，例如选自但不限于白细胞介素-17、环磷酰胺(Cy)、多西他赛和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的动员剂。优选，可以施用α9整联蛋白的拮抗剂与G-CSF。
在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用分离的干细胞，如将细胞重新引入同一受试者，或者将细胞移植到第二受试者，例如HLA型匹配的第二受试者，同种异体移植。
本发明包括将α9整联蛋白拮抗剂直接施用于患者以动员他们自己的HSC或使用来自α9整联蛋白拮抗剂治疗的已经从其中收获HSC的另一供体的HSC。
在一些实施方案中，施用如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂的受试者是健康的。在其他实施方案中，受试者患有疾病或生理状况，如免疫抑制、慢性疾病、创伤性损伤、退行性疾病、感染或其组合。在某些实施方案中，受试者可能患有皮肤、消化系统、神经系统、淋巴系统、心血管系统、内分泌系统的疾病或病症或其组合。
在特定的实施方案中，受试者患有骨质疏松症、阿尔茨海默病、心肌梗死、帕金森病、创伤性脑损伤、多发性硬化、肝硬化或其组合。
施用治疗有效量的本文所述的α9整联蛋白拮抗剂可以预防、治疗和/或减轻关于任何上述病症的严重性或以其他方式提供有益的临床益处，但本文所述的α9整联蛋白拮抗剂的方法和用途的应用不限于这些用途。在多个实施方案中，组合物和方法在如骨、软骨、腱和韧带等骨骼组织以及退行性疾病如帕金森病和糖尿病的治疗中发现治疗效用。增强干细胞从血液到组织的释放、循环、归龛和/或迁移可导致更有效地将HSC递送到缺陷部位以提高修复效率。
在一些实施方案中，可以使用HSC、PB或BM有效治疗的受试者包括通常可以用骨髓或干细胞移植治疗的任何受试者，例如患有癌症、例如成神经细胞瘤(未成熟神经细胞引起并主要影响婴儿和儿童的癌症)、骨髓发育不良、骨髓纤维化、乳腺癌、肾细胞癌或多发性骨髓瘤的受试者。例如，可以将所述细胞移植到对放射治疗或化疗治疗有抗性的患有癌症的受试者中，例如，以恢复被用于治疗癌症的高剂量化学疗法和/或放射治疗所破坏的干细胞，或者移植至G-CSF治疗的非应答者以动员HSC。
在一些实施方案中，受试者具有造血肿瘤性疾病。如本文所用，术语“造血肿瘤疾病”包括涉及造血起源的增生/赘生性细胞的疾病，例如由骨髓、淋巴或红细胞谱系或其前体细胞引起的疾病。在一些实施方案中，疾病由分化不良的急性白血病，例如成红细胞白血病和急性巨核细胞白血病引起。另外的示例性骨髓疾病包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)、慢性髓性白血病(CML)；淋巴恶性肿瘤包括但不限于包括B谱系ALL和T谱系ALL的急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、多毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。恶性淋巴瘤的其他形式包括但不限于霍奇金病和中等/高级别(侵略性)非霍奇金淋巴瘤及其变体，外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、巨粒淋巴细胞白血病(LGF)，霍奇金病和里德-斯特伯格病。通常，所述方法将包括施用细胞组合物，或迁移、释放或动员干细胞以恢复被高剂量化学疗法和/或放射治疗(例如用于治疗疾病的治疗)破坏的干细胞。或者，HSC从BM干细胞龛迁移、释放或动员，并在进入BM或PB中的细胞周期时化学敏化。优选地，造血肿瘤疾病是ALL。
在一些实施方案中，BM、PB或HSC用于治疗患有自身免疫性疾病、例如多发性硬化(MS)、重症肌无力、自身免疫性神经病、硬皮病、再生障碍性贫血和系统性红斑狼疮的受试者。
在一些实施方案中，被治疗的受试者具有非恶性疾病，如再生障碍性贫血、包括镰状细胞性贫血的血红蛋白病或免疫缺陷病症。
本发明还提供给药方案。在一个实施方案中，给药方案取决于待治疗的疾病状态的严重性和应答性，治疗过程从单次施用持续到经过数天和/或数周的重复施用。在另一个实施方案中，给药方案取决于受试者的外周血流中循环的CD34+HSC的数量。在另一个实施方案中，给药方案取决于受试者的外周血流中循环的骨髓来源的干细胞的数量。例如，HSC从BM的移动程度可能取决于已经在PB中循环的HSC的数量。
本发明还提供了增强受试者HSC转运的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂。在一个实施方案中，HSC的转运水平与受试者的外周血中循环的CD34+HSC的数量有关。在另一个实施方案中，HSC的转运水平与受试者的外周血中循环的骨髓来源的HSC的数量有关。
本发明还提供了在向受试者施用如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂后，诱导循环HSC(如骨内膜祖细胞，且选自CD34+、CD38+、CD90+、CD133+、CD34+CD38-细胞、谱系-定型CD34-细胞或CD34+CD38+细胞)群的瞬时增加的方法。在一个实施方案中，将如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂提供给受试者将增强该受试者的HSC在施用后一定时间段内的释放，例如少于12天、少于6天、少于3天、少于2天、或少于1天、少于12小时、少于6小时、少于约4小时、少于约2小时、或少于约1小时。
在一个实施方案中，施用如本文所述的α9整联蛋白拮抗剂导致HSC在施用后约30分钟至约90分钟释放进入循环。优选地，HSC的释放将在施用后约60分钟。在另一个实施方案中，释放的HSC进入循环系统并增加受试者体内循环HSC的数量。在另一个实施方案中，循环HSC数量与正常基线相比增加百分数可以是约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约100％或与对照相比增加超过约100％。在一个实施例中，对照是来自同一受试者的基线值。在另一个实施方案中，对照是未治疗的受试者或用安慰剂或药理学载体治疗的受试者中的循环干细胞或HSC的数量。
在本发明的另一个方面，提供了将HSC移植至患者的方法，所述方法包括
向受试者施用α9整联蛋白拮抗剂以从BM干细胞结合配体迁移HSC；
从BM到PB释放和动员HSC；
从受试者的PB收获HSC；和
将HSC移植至患者。
在一个实施方案中，认为收获后的细胞提供可以返回到身体以补充或补足受试者的造血祖细胞群的细胞组合物，或者移植到另一个受试者以补充其造血祖细胞群。在个体经过化疗期之后的情况中，这可能是有利的。
在一个实施方案中，所述方法具体涉及移植HSC的亚型。这些细胞具有造血重构能力并且存在于干细胞龛中的BM中。本发明提供了一种从干细胞龛(优选最靠近骨内膜龛内的骨/BM界面)或从中央髓腔移植HSC的方法。更优选地，从骨内膜龛内的骨/BM界面移植HSC，因为这些细胞已被证明相对于从中央髓腔分离的HSC给予更长的、多谱系的造血重构。优选地，移植的细胞在干细胞龛，更优选中心或骨内膜龛中找到。
可移植的细胞的等同类型可以在鼠群体中找到，其选自包含富集Lin-Sca-1+ckit+(本文称为LSK)细胞的BM衍生的祖细胞或富集LSKCD150+CD48-细胞(这里称为LSKSLAM)的干细胞。
优选地，移植的细胞是骨内膜祖细胞，且选自CD34+、CD38+、CD90+、CD133+、CD34+CD38-细胞、谱系-定型CD34-细胞或CD34+CD38+细胞。
本说明书中包含的文献、作品、材料、装置、物品等的讨论仅用于提供本发明的背景的目的。不建议或表示任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分，或者是在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在的与本发明相关的领域中的普通知识。
当本说明书(包括权利要求书)中使用术语“包括”时，它们将被解释为说明所述特征、整数、步骤或组分的存在、但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组分或其组的存在。
现在将参考以下非限制性实施例更充分地描述本发明。
实施例
方法
(i)流式细胞术
使用如J.Grassinger等人Blood，2009,114,49-59中所述的LSR II(BDBiosciences)进行流式细胞术分析。在585nm检测R-BC154，并用黄绿激光器(561nm)激发。对于BM和PB分析，以10-20k个细胞事件/秒的速率分析了高达5×106个细胞。对于PBLSKSLAM分析，节省了1×106个事件。细胞分选在Cytopeia Influx(BD)进行，如J.Grassinger等人之前所述。
(ii)细胞系
如前J Grassinger等人Blood，2009,114,49-59所述，使用pMSCV-hITGA4-IRES-hITGB1和pMSCV-hITGA9-IRES-hITGB1载体，通过逆转录病毒转导，产生过表达整联蛋白α4β1(LN18α4β1)或α9β1(LN18α9β1)的稳定的LN18细胞(ATCC号：CRL-2610)，并将其保持在补充有在10％FBS中的2mM L-谷氨酸的DMEM中。通过使用2.5μg/ml的PE-Cy5缀合的小鼠抗人α4抗体(BD Bioscience)或20μg/ml小鼠抗人α9β1抗体(Millipore)在PBS-2％FBS中，通过两轮FACS来选择转导的细胞，然后加入0.5μg/ml的PE-缀合的山羊抗小鼠IgG(BD Bio-science)。如上所述，使用pSM2c-shITGA4(Open Biosystems)进行在LN18和LN18α9β1细胞中的α4表达的沉默。使用FACS对α4沉默的LN18细胞(对照细胞系；LN18 SiA4)和LN18α9β1(LN18α9β1SiA4)进行就α4表达而言的阴性选择。
(ⅲ)免疫组织化学
(a)抗体染色。
将LN18 SiA4(对照细胞系)、LN18α4β1和LN18α9β1细胞用2.5μg/ml的小鼠抗人α4抗体(BD Bioscience)、4μg/ml的小鼠抗人α9β1抗体(Millipore)或4μg/ml的小鼠同种型对照(BD Bioscience)在PBS-2％FBS中染色1小时，然后用5μg/ml的Alexa Fluor 594缀合的山羊抗小鼠IgG1染色1小时，然后用PBS-2％FBS洗涤三次。
(b)抗体混合物。
为了分析与鼠祖细胞(LSK；Lineage-Sca-1+c-kit+)和HSC(LSKSLAM；LSKCD150+CD48-)结合的R-BC154，将BM和PB细胞用谱系混合物(抗Ter119，抗B220，抗CD3，抗Gr-1，抗Mac-1)、抗Sca-1、抗c-kit、抗CD48和抗CD150进行免疫标记。对于谱系分析，分别将细胞进行染色，对于T细胞使用抗CD3，对于B细胞使用抗-B220，对于巨噬细胞使用抗-Mac-1，对于粒细胞使用抗Gr-1。或者，还使用含有抗CD3/B220(缀合PB)和抗B220/Gr1/Mac-1(缀合AF647)的混合物进行谱系分析，由此将B220+细胞鉴定为+/+细胞，CD3+细胞是+/-，Gr1/Mac-1+细胞是-/+群。为了从脐带血MNCs或来自人源化NSG小鼠的BM和PB分析人WBC，将细胞用含有抗huCD3/CD14/CD15(全部缀合AF488)、抗CD14/CD15/CD19/CD20(全部缀合AF647)、抗huCD45-PB、抗muCD45-BV510和抗huCD34-PECy7的谱系混合物进行免疫标记。所用缀合抗体的完整列表详见表1和表2。
表1.抗小鼠抗体
表2.抗人抗体
抗体 缀合物 克隆 同种型 供应商 Cat#
CD3 AF647 OKT3 小鼠IgG2a BioLegend 317312
CD14 AF488 M5E2 小鼠IgG2a BioLegend 301811
CD14 AF488 M5E2 小鼠IgG2a BD Biosciences 557700
CD15 AF488 H198 小鼠IgM BioLegend 301910
CD19 AF488 HIB19 小鼠IgG1 BioLegend 557697
CD19 AF647 HIB19 小鼠IgG1 BioLegend 302220
CD20 AF488 2H7 小鼠IgG2b BioLegend 302316
CD20 AF647 2H7 小鼠IgG2b BioLegend 302318
CD34 FITC 8G12 小鼠IgG1 BD Biosciences 348053
CD34 PECy7 8G12 小鼠IgG1 BD Biosciences 348791
CD38 PECy7 HB7 小鼠IgG1 BD Biosciences 347687
CD45 PB HI30 小鼠IgG1 Biolegend 304029
CD45 BV650 HI30 小鼠IgG1 BD Biosciences 563717
CD45 PE J.33 小鼠IgG1 Immunotech 2078
(c)R-BC154(25)染色。
在含有1mM CaCl2-MgCl2或1mM MnCl2的TBS-2％FBS(50mM TrisHCl，150mM NaCl，2mM葡萄糖，10mM Hepes，pH 7.4)中，用R-BC154(50nM)处理培养的LN18 SiA4(对照细胞系)、LN18α4β1和LN18α9β1细胞，并在37℃下孵育20分钟，然后用TBS-2％FBS洗涤三次。将染色的细胞用PBS中的4％多聚甲醛固定5分钟，用水洗涤三次，然后用2.5μg/ml的DAPI染色。将细胞装载至Vectorshield中，用水洗涤，盖玻片，并且在4℃下储存过夜，然后用荧光显微镜(Olympus BX51)拍摄图像。
(iv)饱和结合实验
将培养的α4β1、α9β1和对照LN18细胞(0.5×106个细胞)用100μl在TBS-2％FBS(不含阳离子，或含1mM CaCl2-MgCl2或1mM MnCl2)中的0、1、3、10、30和100nM的化合物22或25(R-BC154)处理。将细胞在37℃下孵育60分钟，用TBS-2％FBS洗涤一次，干燥沉淀并重悬于相关结合缓冲液中，用于流式细胞术分析。将平均通道荧光相对于浓度作图，并使用GraphPadPrism 6拟合于一点饱和配体结合曲线。从该曲线确定解离常数Kd。
(v)离解速率(Off-rate)动力学测定
将含有α4β1或α9β1LN18细胞(0.5×106个细胞)的Eppendorf小瓶用50nM R-BC154(100μl，含有1mM CaCl2-MgCl2或1mM MnCl2的TBS-2％FBS)在37℃处理30分钟，用相关的结合缓冲液洗涤一次并干燥沉淀。在37℃下用500nM的未标记的竞争性抑制剂(100μl，含有1mM CaCl2-MgCl2或1mM MnCl2的TBS-2％FBS)处理细胞，持续所指明的时间(0、2.5、5、15、30、45、60分钟)。用冷TBS-2％FBS(含有相关阳离子)稀释细胞，通过离心沉淀，洗涤一次，重新混悬(约200μl)于结合缓冲液中，用于流式细胞术分析。将平均通道荧光对时间作图，使用GraphPad Prism 6将数据拟合为单相或两相指数衰减函数。离解速率koff从曲线外推。
(vi)结合速率(On-rate)动力学测量
将含有在含有1mM CaCl2-MgCl2或1mM MnCl2的50μl TBS-2％FBS中的α4β1或α9β1LN18细胞(0.5×106细胞)的Eppendorf小瓶，在37℃下在加热块中预活化20分钟。向每个管中加入在相关TBS-2％FBS(具有相关阳离子)中的100nM R-BC154(50μl-终浓度＝50nM)，在37℃下孵育0、0.5、1、2、3、5、10、15和20分钟后，通过加入3ml TBS-2％FBS(具有相关阳离子)来淬灭管。用TBS-2％FBS(具有相关阳离子)洗涤一次细胞，离心沉淀，并重新混悬于相关结合缓冲液中(200μl)，用于流式细胞分析。将平均通道荧光相对时间作图，使用GraphPad Prism 6将数据拟合为单相或两相关联函数。观察的结合速率kobs从曲线外推，kon使用以下计算而得：
(kobs-koff)/[R-BC154＝50nM]。
(vii)小鼠
C57BL/6小鼠是Monash Animal Services(Monash University，Clayton，澳大利亚)培育的。小鼠6-8周龄，性别匹配实验。所有实验均由蒙纳士动物研究平台道德委员会(Monash Animal Research Platform ethics committee)(MARP/2012/128)批准。
C57Bl/6(C57)、RFP、GFP和α4 flox/flox/α9 flox/flox vav-cre小鼠是在Monash AnimalServices(Monash University,Clayton,Australia)培育的。红色荧光蛋白(RFP)小鼠由澳大利亚悉尼的儿童医学研究所(Children’s Medical Research Institute)的PatrickTam教授提供。条件性α4 flox/flox/α9 flox/flox小鼠最初是通过将α4 flox/flox小鼠(ThaliaPapayannopoulou华盛顿大学医学系/血液学系Seattle,WA的赠品)与α9 flox/flox小鼠(SF加利福尼亚大学医学系Sheppard院长友善赠送)和vav-cre老鼠(墨尔本WEHI Institute的Warren Alexander友善赠送)杂交繁育产生的。NODSIL2Rγ-/-(NSG)小鼠是内部获得(Australian Regenerative Medicine Institute)。通过尾静脉注射新鲜分选的脐带血CD34+细胞(>150k)与2×106个辐照的单核支持细胞，产生人源化NSG小鼠。移植后4-5周，使NSG小鼠眼出血，并评估huCD45和muCD45以及CD34植入。对于使用C57B1/6小鼠的移植实验，以分开的剂量(每次5.25Gy)、6小时的间隔、在移植前24小时，给予辐照。总共使用2×105辐照(15Gy)C57BM细胞作为每个接受体的载体细胞。所有实验均由Monash Animal Services伦理委员会批准。
(viii)体内骨髓结合测定
将PBS(10mg kg-1)中的R-BC154(25)静脉内注射到C57小鼠中。5分钟后，分离骨髓细胞，如先前在D.N.Haylock等人的Stem cells，2007,25,106-1069和J.Grassinger等人，Cytokine，2012,58,218-225中所述。简而言之，切除一股股骨、胫骨和髂嵴并清除肌肉。去除骨骺的和干骺端的区域后，用PBS-2％FBS冲洗骨，得到全骨髓，用PBS-2％FBS洗涤，然后免疫标记，用于流式细胞术。为了分析R-BC154结合，选择以下抗体组合，以使发射光谱重叠最小化。为了染色祖细胞(LSK；Lineage-Sca-1+c-kit+)和HSC(LSKSLAM；LSKCD150+CD48-)，将细胞用谱系混合物(CD3、Ter-119、Gr-1、Mac-1、B220；所有抗体缀合APC-Cy7)、抗Sca-1-PB、抗c-kit-AF647、抗CD48-FITC和抗CD150-BV650标记。
(ix)造血细胞分离。
如先前在J.Grassinger等人，Cytokine，2012,58,218-225和D.N.Haylock等人，Stem cells，2007,25,1062-1069中所述分离骨内膜和中枢鼠骨髓细胞的群体。简而言之，切除一股骨、胫骨和髂骨，并清除肌肉。去除骨骺的和干骺端的区域后，用PBS-2％FBS冲洗骨，得到骨髓细胞。使用研钵和研杵将冲洗好的长骨以及骨骺和干骺碎片合并并粉碎。使用胶原酶I(3mg/ml)和分散酶II(4mg/ml)在37℃下在轨道振荡器中以750rpm消化骨碎片。5分钟后，将骨碎片用PBS洗涤一次，用PBS 2％FBS洗涤一次，以收集骨内膜骨髓细胞。通过眼后穿刺收集外周血，并在室温下使用NH4Cl裂解缓冲液裂解红细胞5分钟。用PBS2％FBS洗涤分离的细胞群，然后如以上在抗体混合物中所述染色，用于流式细胞术。
(x)人CD34+细胞的分离
如先前在Nilsson，S.K等人Blood 106,1232-1239(2005)和Grassinger，J等人Blood 114,49-59，(2009)所述，从脐带血分离单核细胞(MNC)。将MNC与含有小鼠抗人CD3、CD11b、CD14、CD16、CD20、CD24和CD235a(BD)的谱系抗体混合物孵育，然后用Dynal绵羊抗小鼠IgG珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)以每个细胞2个珠子的比例处理5分钟，进行两轮，然后在4℃下恒定旋转10分钟。富集的MNC用通过FACS纯化的CD34-异硫氰酸荧光素(FITC)CD34+细胞染色。
(xi)体外和体内R-BC154结合。
对于体外标记实验，将来自C57小鼠、条件性α4 -/-/α9 -/-小鼠和人源化NODSCIDIL2Rγ-/-小鼠和人脐带血MNC的5×106BM细胞，用R-BC154(最多100nM)在含有1mM CaCl2/MgCl2(活化)或10mM EDTA(去活化)的PBS(0.5％BSA)中，以40×106个细胞/ml在4℃下处理20分钟。将细胞用冷PBS(2％FBS)洗涤，然后在流式细胞术分析之前如“抗体混合物”中所述免疫标记。对于体内实验，C57BL/6小鼠、α4 -/-/α9 -/-vav-cre小鼠和人源化NODSCIDIL2Rγ-/-小鼠，以100ul/10gm鼠体重，接受静脉内或皮下注射的R-BC154(10mg/kg)，并以如上所述进行分析。
通过荧光显微镜检查，在分选的祖细胞群(LSK细胞)，进行了R-BC154结合分析，其中从未处理的和R-BC154注射的小鼠收获的BM细胞为去除B220、Gr-1、Mac-1和Ter-119的谱系，用抗Sca-1-PB和抗c-kit-FITC染色，并在Sca1+c-kit+上进行分选。使用Olympus BX51显微镜对分选的细胞进行成像。
(xii)竞争性抑制试验。
在37℃用50nM R-BC154(80μl，在含有1mM CaCl2/MgCl2的PBS-2％FBS中)处理α4β1和α9β1LN18细胞(1-2×105个细胞)10分钟，用PBS洗涤，通过离心沉淀，然后用0、0.01、0.1、0.3、1、10、100和300nM的BOP(80μl，含有1mM CaCl2/MgCl2的PBS-2％FBS)处理。将细胞在37℃下孵育90分钟，用PBS洗涤，通过离心沉淀，并重悬于PBS(200μl)中，用于流式细胞术分析。将％最大平均荧光强度(MFI)相对于BOP的对数浓度作图，将数据拟合到配体结合S形剂量-响应曲线，并从图形获得IC50值。对于结合至LSK和LSKSLAM细胞的R-BC154的竞争性替代，在37℃下，用在PBS(含有0.5％BSA和1mM CaCl2/MgCl2)中的500nM BOP处理从注射了R-BC154的小鼠分离的WBM细胞，进行45分钟，然后进行流式细胞术分析。
(xiii)动员方案
对于动员实验，所有小鼠以100μl/10gm体重进行皮下注射，并且使用EDTA涂覆的注射器通过喉部出血收获PB。
(a)R-BC154和BOP。小鼠接受单次注射所指定剂量的新鲜制备的R-BC154和BOP在盐水中的溶液，然后在所指定时间通过喉部出血收获PB。
(b)G-CSF。小鼠以250μg/kg每天两次(500ug/kg/天)接受G-CSF，间隔6-8小时连续4天。接受G-CSF和BOP的组接受如上所述的标准G-CSF方案，然后在收获前1小时单次注射BOP。对照小鼠接受等体积的盐水。
(xiv)动员人源化NODSIL2Rγ(NSG)小鼠
通过尾静脉注射新鲜分选的脐带血CD34+细胞(>150k)与2×106个辐照的单核支持细胞，产生人源化NSG小鼠。移植后4-5周，使NSG小鼠眼出血并评价huCD45和muCD45。在这些条件下，如通过流式细胞术分析基于相对于总％CD45的％huCD45所确定，实现了>90％的人源化。给予人源化NSG小鼠至少1周时间来在实验前进行恢复。在“动员方案”中指定的相关条件下动员小鼠，随后如“抗体混合物”中所述通过喉出血、裂解和免疫标记收集PB。
(xv)低和高增殖潜力的集落形成细胞测定
如先前在J.Grassinger等人Cytokine，2012,58,218-225和Bartelmez，S.H.等人Experimental hematology，17,240-245(1989)中所述，分析了低和高增殖潜力的集落形成细胞(分别为LPP-CFC和HPP-CFC)。简言之，将动员的PB裂解，并将4000WBC置于35mm培养皿中的含有重组小鼠干细胞因子以及重组人集落刺激因子-1、白细胞介素-1α(IL-1α)和IL-3的双层营养琼脂培养系统中。培养物在37℃下在5％O2，10％CO2，85％N2的湿润培养箱中孵育。特别例举了LPP-CFC和HPP-CFC的14天的孵育，如J.Grassinger等人(2012)中先前所述。
(xvi)长期移植测定
(a)限制性稀释分析。
将RFP小鼠用BOP(n＝15)进行处理，1小时后收获PB。将每个处理组的每一供体小鼠的PB合并，裂解并以原始血容量的1/3溶于PBS中。将辐照的WBM填充细胞(2×105/小鼠)以指定的移植体积加入裂解的PB的等分试样中，然后用PBS充满以允许200μl注射/小鼠。通过尾静脉注射施用于辐照的C57BL/6小鼠，并在移植后6、12和20周评价多系谱RFP植入。
(b)竞争性初始和次级移植测定。
如“动员方案”所述，分别用BOP(1小时)和G-CSF(每天两次，共4天)处理RFP(n＝5)和GFP(n＝5)小鼠。然后收集PB，并将RFP和GFP组中的血液合并，裂解，洗涤并重新混悬于PBS中至原始血容量的1/3。将等体积的RFP和GFP血液混合，以允许每只小鼠移植500μl的RFP和GFP血液。加入辐照的WBM填充细胞(2×105/小鼠)，并用PBS填充混合物以允许200μl注射/小鼠。通过尾静脉注射向辐照的C57BL/6接受体(n＝5)施用，并在移植后6、12和20周评价RFP和GFP植入。取出20周时，将来自每个初始接受体(n＝5)的WBM细胞(股骨的第1/10)移植到辐照的C57次级接受体(n＝4/初始接受者)中，并在移植后6、12和20周评价多系谱植入。
(xvii)统计分析
当适用于数据集时，将数据使用学生氏t检验、单向或双向ANOVA进行分析。为了确定干细胞再生频率，使用L-CALC软件(Stem Cell Technologies)进行Poisson分析。对Log-rank(Mantel-Cox)检验用于比较存活曲线。p<0.05被认为是显著的。
实施例1：α9β1整联蛋白拮抗剂的制备
(a)拮抗剂化合物的合成
可以使用如下所述的反应途径和合成流程来制备各种实施方案的试剂。在以下实施例中详细描述了实施方案的具体化合物的制备，但是技术人员将认识到所描述的化学反应可以容易地适应于制备各种实施方案的许多其它试剂。例如，非示例性化合物的合成可以通过本领域技术人员显而易见的修饰来成功地进行，例如，通过适当地保护干扰基团，通过改变为本领域已知的其它合适的试剂，或通过对反应条件进行常规变化。有机合成中合适的保护基列表可见于T.W.Greene's Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley&Sons，1991。或者，本文公开的或本领域已知的其它反应将被认为可用于制备各种实施方案的其它化合物。
可以根据本领域已知的技术获得或制备用于合成化合物的试剂。
方法、流程和实施例中的符号、缩写和惯例与当代科学文献中使用的符号、缩写和惯例一致。具体而言，可以在实施例和整个说明书中使用以下缩写，但并不意味着要进行限制。
·Ac(乙酰基)
·BOP(N-(苯磺酰基)-L-O-(1-吡咯烷基羰基)酪氨酸)
·Cbz(羧基苄基)
·CDCl3(氘代氯仿)
·CHCl3(氯仿)
·CuAAC(铜(I)-催化的叠氮炔环加成)
·DCC(N，N'-二环己基碳二亚胺)
·DCM(二氯甲烷)
·DIAD(偶氮二羧酸二异丙酯)
·DIPEA(二异丙基乙胺)
·DMF(N，N-二甲基甲酰胺)
·DMSO(二甲基亚砜)
·EtOAc(乙酸乙酯)
·EtOH(乙醇)
·FTIR(傅里叶变换红外光谱)
·g(克)
·h(小时)
·HATU(O-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐)
·HBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐)
·HCl(盐酸)
·HPLC(高压/高效液相色谱)
·HRMS(高分辨率质谱)
·Hz(赫兹)
·K2CO3(碳酸钾)
·L(升)
·MeOH(甲醇)
·mg(毫克)
·MHz(兆赫兹)
·min(分钟)
·mL(毫升)
·mM(毫摩尔)
·mol(摩尔)
·Ms(甲磺酸盐/酯)
·Na2SO4(硫酸钠)
·NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)
NMR(核磁共振)
·PEG(聚乙二醇)
·pet.spirits(石油精油)
·ppm(百万分之一)
·psi(磅/平方英寸)
·SN2(亲核取代，双分子)
·TBTA(三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺)
·TEA(三乙胺)
·TFA(三氟乙酸)
·Tf(三氟甲磺酸盐/酯)
·THF(四氢呋喃)
·TLC(薄层色谱)
·UV(紫外线)
·RM(反应混合物)
·Rt(保留时间)
·室温(室温)
除非另有说明，否则所有温度均以℃(摄氏度)表示。除非另有说明，否则所有反应均在室温下进行。
除非另有说明，否则所有起始原料、试剂和溶剂都是从商业来源获得的，不经进一步纯化地使用。从Genscript获得N-(苄氧基羰基)-L-脯氨酰基-L-O-(叔丁基醚)酪氨酸甲酯26。所有无水反应在干燥氮气氛下进行。通过在J.C.Meyer制造的Solvent DispensingSystem上通过两个连续的活化的中性氧化铝柱来干燥乙醚、二氯甲烷、四氢呋喃和甲苯，并基于Grubbs及其同事的原始设计。石油精油是指在40-60℃沸腾的馏分。在Merck预涂覆的0.25mm二氧化硅铝背板上进行薄层色谱(TLC)，并通过以下显影：用UV光，和/或在茚三酮溶液或磷钼酸溶液中浸渍，然后加热。反应产物的纯化通过快速色谱法使用Merck SilicaGel60(230-400目)或反相C18硅胶进行。在Reichert-Jung Thermovar热台显微镜熔点仪上记录熔点。在Perkin Elmer Model 341旋光仪上记录光旋转。使用ThermoNicolet 6700光谱仪使用配有钻石窗的SmartATR(衰减全反射)附件获得FTIR光谱。在BrukerAV400光谱仪上分别在400和100MHz下记录质子(1H)和碳(13C)NMR光谱。1H NMR以ppm为单位，使用溶剂作为内标(CDCl3，7.26ppm)。使用溶剂作为内标(CDCl3，77.16ppm)，质子去偶13C NMR(100MHz)以ppm报告。采用电喷雾离子化技术在WATERS QTOF II(CMSE，Clayton，VIC 3168)或Finnigan混合LTQ-FT质谱仪(Thermo Electron Corp.，Bio21 Institute，University ofMelbourne，Parkville，VIC 3010)上获得高分辨率质谱(ESI)。
实施例1A：N-(苯磺酰基)-L-脯氨酰基-L-O-(1-吡咯烷基羰基)酪氨酸(BOP)的制备
BOP的合成从二肽26开始，如下面的流程1所示：
在0℃下使用三氟乙酸对叔丁基保护基26进行脱保护，得到酚27，水处理后，将其未经进一步纯化用于下一个步骤。苯酚27与1-吡咯烷羰基氯的反应在碳酸钾的存在下顺利进行，历经两步骤以良好的收率(74％)得到氨基甲酸酯28。3小时内完成Cbz保护基的氢解，经快速色谱后得到收率极佳的胺(85％)。然后将胺29与苯磺酰氯在碱存在下反应，经快速色谱后得到收率极佳的磺酰胺30(96％)。最后，使用氢氧化钠皂化甲酯部分30，然后在Amberlyst树脂上进行离子交换，经快速色谱后得到BOP，收率81％。
作为举例，我们提供了从二肽26开始形成BOP的实际反应条件。
步骤1：N-(苄氧基羰基)-L-脯氨酰基-L-O-酪氨酸甲酯(27)
在0℃将TFA(1.27mL，16.6mmol)滴加至N-(苄氧基羰基)-L-脯氨酰基-L-O-(叔丁基醚)酪氨酸甲酯26(0.80g，1.66mmol；定制肽合成，来自Genscript)在干燥CH2Cl2(10mL)中的混悬液中。将该混合物缓慢温热至室温，并搅拌3小时，此时TLC(70:30EtOAc/石油精油)表明原料完全消耗。将该混合物用EtOAc稀释，并用H2O、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并减压浓缩。将残余物用甲苯(×3)浓缩，得到粗品N-(苄氧基羰基)-L-脯氨酰基-L-O-酪氨酸甲酯27(700mg)，为无色油状物，其不经进一步纯化用于下一步骤。
步骤2：N-(苄氧基羰基)-L-脯氨酰基-L-O-(1-吡咯烷基羰基)酪氨酸甲酯(28)
将1-吡咯烷羰基氯(147μL，1.38mmol)加入到粗苯酚27(393mg，0.922mmol)和K2CO3(256mg，1.84mmol)在DMF(5mL)中的混合物中。将该混合物在50℃搅拌过夜，用EtOAc/H2O稀释，分离有机相。将有机层用5％HCl、饱和的NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并减压浓缩。将残余物经快速色谱法(70％EtOAc/石油精油)纯化，得到无色泡沫状的氨基甲酸酯28(355mg，74％)，将其未经进一步纯化用于下一步骤。
步骤3:L-脯氨酰基-L-O-(1-吡咯烷基羰基)酪氨酸甲酯(29)
将Cbz保护的二肽28(356mg，0.681mmol)和10％Pd/C(50％H2O，150mg)在MeOH(30mL)中的混合物用H2吹扫三次。将该混合物在H2气氛下搅拌3小时，这时TLC(10％MeOH/CH2Cl2)表明原料完全消耗，将该混合物通过一层Celite过滤，并将滤液减压浓缩。将残余物经快速色谱(5％至10％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到胺29(224mg，85％)，为无色油状物。δH(400MHz,CDCl3)1.64-1.78(2H,m),1.82-1.92(5H,m),2.16-2.25(1H,m),2.97-3.15(4H,m),3.39(2H,t,J＝6.5Hz),3.49(2H,t,J＝6.5Hz),3.65(3H,s),4.03(1H,dd,J＝5.7,8.3Hz)4.72(1H,dd,J＝7.8,13.3Hz),5.69(1H,br s),6.99(2H,d,J＝8.3Hz),7.13(2H,d,J＝8.3Hz),8.41(1H,d,J＝7.9Hz)。
步骤4:N-(苯磺酰基)-L-脯氨酰基-L-O-(1-吡咯烷基羰基)酪氨酸甲酯(30)
将DIPEA(95μL，0.546mmol)加入到胺D(71mg，0.182mmol)、PhSO2Cl(35μL，0.273mmol)和DMAP(2.2mg，0.018mmol)在CH2Cl2(3mL)中的搅拌的溶液中。将该混合物在室温下搅拌4小时，减压浓缩，将残余物经快速色谱(2.5％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到无色泡沫状的产物E(93mg，96％)。δH(400MHz,CDCl3)1.42-1.56(3H,m),1.90-2.05(5H,m),3.03(1H,dd,J＝7.6,14.0Hz),3.10-3.16(1H,m),3.26(1H,dd,J＝5.6,14.0Hz),3.35-3.40(1H,m),3.45(2H,t,J＝6.5Hz),3.54(2H,t,J＝6.5Hz),3.77(3H,s),4.08(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz),4.82(1H,dt,J＝5.7,11.6Hz),7.06(2H,d,J＝8.7Hz),7.13(2H,d,J＝8.7Hz),7.25(1H,d,J＝7.5Hz；被溶剂峰遮蔽),7.52-7.57(2H,m),7.61-7.65(1H,m),7.83-7.85(2H,m)。
步骤5:N-(苯磺酰基)-L-脯氨酰基-L-O-(1-吡咯烷基羰基)酪氨酸(BOP)
将0.1M NaOH(3.2mL，0.162mmol)加入到酯30(86mg，0.162mmol)在MeOH(10mL)中的溶液中，将该混合物在室温下搅拌过夜。将该反应用Amberlyst树脂(H+形式)终止，过滤，并将滤液减压浓缩。将粗制的产物经快速色谱(10％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到产物BOP(68mg，81％)，为无色玻璃状物。δH(400MHz,d4-MeOH)1.47-1.55(1H,m),1.59-1.72(2H,m),1.77-1.85(1H,m),1.93-2.00(4H,m),3.11(1H,dd,J＝7.8,13.7Hz),3.18-3.24(1H,m),3.27(1H,dd,J＝5.0,13.7Hz),3.35-3.44(3H,m),3.56(2H,d,J＝6.5Hz),4.14(1H,dd,J＝4.0,8.5Hz),4.69(1H,m),7.04(2H,d,J＝8.5Hz),7.27(2H,d,J＝8.5Hz),7.60(2H,t,J＝7.6Hz),7.69(1H,t,J＝7.4Hz),7.86(2H,d,J＝7.4Hz)。
对于体外和体内实验，通过用0.98当量NaOH(0.01M NaOH)处理BOP的游离酸在MeOH中的溶液将BOP转化为钠盐。将该溶液通过0.45μm注射器过滤器单元过滤，将产物冻干，得到钠盐，为松散无色粉末。δH(400MHz,D2O)1.47-1.59(2H,m),1.68-1.83(2H,m),1.87-1.92(4H,m),3.01(1H,dd,J＝7.7,13.8Hz),3.18-3.26(2H,m),3.34-3.40(3H,m),3.48-3.51(2H,m),4.06(1H,dd,J＝4.4,8.7Hz),4.43(1H,dd,J＝5.0,7.7Hz),7.04(2H,d,J＝8.5Hz),7.27(2H,d,J＝8.5Hz),7.61(2H,t,J＝8.1Hz),7.73(1H,t,J＝7.5Hz),7.78(2H,d,J＝7.5Hz)。
实施例1B：具有PEG间隔基的荧光标记的整合素拮抗剂的制备(化合物22)
BOP的荧光标记的一般策略是基于以下有效策略：在BOP的C4位置安装反式构型的双功能PEG连接基，用于随后与荧光标记的缀合。
内酯4以前被报道为通过直接酰化保护的氨基酸获得基于4-顺式-羟基脯氨酸的二肽的通用合成子。随后活化4-顺式-羟基，然后用亲核试剂进行SN2替代，提供所需的4-反式构型的脯氨酸衍生物。因此，我们设想可以从内酯4和酪氨酸衍生物7开始获得多种BOP的C4-官能化衍生物(流程2)。通过在使用DIAD和PPh3的Mitsunobu条件下处理N-苯基磺酰基-反式-4-羟基-L-脯氨酸，容易地制备内酯4。通过以下合成酪氨酸衍生物7：在K2CO3存在下，用吡咯烷碳酰氯处理保护的5，得到中间体6，然后除去Cbz保护基。内酯4在双相条件下暴露于酪氨酸衍生物7，以89％产率得到作为单一的非对映异构体的二肽8。该方法利用双环内酯的活化性质，并且允许净转化为4-顺式-羟基脯氨酸二肽，而不需要使用脱水肽偶联。安装PEG连接基的初步尝试集中于用氨基PEG衍生物10直接替代顺式构型的三氟甲磺酸酯9，其可以容易地从商业上可获得的4,7,10-三氧杂-1,13-十三烷二胺获得。已经报道了用胺SN2替代4-顺式-三氟甲磺酸酯产生相应的反式氨基脯氨酸衍生物，这在目前的情况下在给定的所得连接基的低空间体积下是有吸引力的。因此，在用PEG衍生物10处理之前，将化合物8的羟基转化为相应的三氟甲磺酸酯9，得到聚乙二醇化产物11，尽管产率令人失望(27％超过2步)(流程2)。
虽然在形成三氟甲磺酸酯9或PEG衍生物10期间没有分离出主要副产物，但N-烷基化反应的差的产率的可能合理理由是中间形成三氟甲磺酰亚胺酯。因此，还研究了缺乏仲酰胺的简化的顺式羟基化合物12。
先前已经描述了在脯氨酸残基的4-位引入N-连接的芳族杂环(例如咪唑，三唑，四唑和苯并咪唑)。基于这一观察，我们预期通过三唑的PEG连接基的连接对于α9β1整联蛋白结合也是可以容忍的。因此，这将允许使用在炔属官能化PEG衍生物15和反式叠氮基整联蛋白拮抗剂18之间的Cu(I)催化的叠氮化物炔环加成(CuAAC)反应来安装PEG连接基，如下面的流程3所示：
通过在DCC偶联条件下与丙酸缩合，从10一步获得炔官能化的PEG衍生物15(流程2a)。反式叠氮官能化二肽18的合成容易地从内酯4实现(流程2b)。用在MeOH中的Na2CO3处理4，得到顺式-羟基脯氨酸酯12，产率为80％。将12的顺式醇转化为相应的甲磺酸酯，随后用叠氮化钠替代，得到反式叠氮基脯氨酸酯16，产率为88％，经两步。将16的甲酯的水解得到脯氨酸17，然后在标准HBTU偶联条件下与酪氨酸衍生物7反应，得到93％的产率的二肽18。或者，二肽18也可从顺式醇8获得(来自流程1)。方便地，醇8的甲磺酰化和随后的叠氮化物替代顺利进行，从而提供产物18，而不需要色谱纯化。
在获得PEG炔15和叠氮化物18的情况下，注意力转向使用CuAAC反应对它们偶合，如下面的流程4所示：
令人满意的是用CuSO4、抗坏血酸钠和Cu(I)-稳定配体三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)处理15和18，得到几乎定量产率的1,4-二取代的三唑19。甲酯19的水解得到酸20，然后通过氢解除去Cbz基团，得到完全脱保护的PEG-官能化的整联蛋白拮抗剂21，产率良好(87％，经2步)。最后，在水性条件下用NHS-罗丹明处理胺21，得到荧光标记的整联蛋白拮抗剂22，产率为38％，为5-和6-羧基四甲基罗丹明区域异构体的5:1混合物，经C18反相色谱纯化。
作为举例，我们提供了从N-苯基磺酰基-反式-4-羟基-L-脯氨酸开始形成荧光标记的BOP衍生物22的实际反应条件。
步骤1：(1S,4S)-5-(苯磺酰基)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-3-酮(4)
在0℃和N2下，将二异丙基偶氮羧酸二异丙酯(1.87mL，9.48mmol)在20分钟内滴加到N-苯基磺酰基-反式-4-羟基-L-脯氨酸(2.45g，9.03mmol)和三苯基膦(2.49g，9.48mmol)在CH2Cl2(150mL)中的溶液中。将反应物加热至室温并搅拌过夜，减压浓缩，残余物通过快速色谱法(50:50EtOAc/石油精油)纯化，得到无色固体的内酯4(1.77g，78％)。光谱数据与先前报道的数值相同。
步骤2：(S)-4-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基吡咯烷-1-羧酸酯(6)
将1-吡咯烷羰基氯(336μL，3.04mmol)加入到含有酪氨酸5(500mg，1.52mmol)和K2CO3(420mg，3.04mmol)在CH3CN(9mL)中的混合物的BiotageTM微波小瓶中。将混合物在微波反应器中加热至100℃45分钟，用H2O稀释，然后搅拌30分钟。将水层用EtOAc(2×20mL)萃取，将合并的有机相用饱和NaHCO3水溶液洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩。将残余物重结晶(EtOAc/石油精油)，得到无色晶体状的氨基甲酸酯6(484mg，75％)，mp 116-117℃；[α]D+42.5(c0.81在CHCl3中)；δH(400MHz,CDCl3)1.94(4H,m,(CH2)2),3.09(2H,m),3.47(2H,t,J＝6.5Hz),3.55(2H,t,J＝6.5Hz),3.71(3H,s),4.64(1H,m),5.10(2H,s),5.22(1H,d,J＝8.0Hz),7.03-7.38(9H,m)；δC(100MHz,CDCl3)25.0,25.8,37.5,46.3,46.4,52.3,54.8,67.00,121.9(2C),128.1(2C),128.1,128.5(2C),130.0(2C),132.4,136.2,150.6,153.0,155.6,171.9；ν/cm-1 3331,2954,1719,1698；1511,1402,1345,1216,1061,1020,866,754,699；HRMS(ESI+)m/z 449.1686(C23H26N2NaO6[M+Na]+理论值449.1689)。
步骤3：(S)-4-(2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基吡咯烷-1-甲酸酯(7)
将保护的酪氨酸6(950mg，1.13mmol)和Pd/C(10％，50mg)在MeOH(40mL)中的的混合物用H2吹扫三次。将混合物在H2气氛下搅拌2小时，此时TLC表明原料完全消耗。将混合物通过硅藻土层过滤，并将滤液在减压下浓缩，得到无色油状的粗制胺7(637mg，98％)，其静置固化。通过快速色谱法(5:95至10:90MeOH/CH2Cl2)进一步纯化一小部分，用于表征[α]D-11.6(c 1.09在MeOH中)；δH(400MHz,CDCl3)1.97(4H,m),2.91(1H,dd,J＝7.1,13.6Hz),3.02(1H,dd,J＝6.1,13.6Hz),3.42(2H,t,J＝6.5Hz),3.43(2H,t,J＝6.5Hz),3.68(3H,s),4.84(2H,br s),3.70(1H,dd,J＝6.2,7.1Hz),7.05(2H,m),7.21(2H,m)；δC(100MHz,CDCl3)25.9,26.7,41.1,47.5,47.5,52.4,56.7,123.0(2C),131.2(2C),135.6,151.6,155.1,176.1；ν/cm-1 3311,2954,2878,1714,1510,1399,1344,1214,1168,1086,1062,1020,864,755；HRMS(ESI+)m/z 293.1497(C15H20N2O4SH[M+H]+理论值293.1496)。
步骤4：4-((S)-2-((2S,4S)-4-羟基-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酰胺基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基吡咯烷-1-甲酸酯(8)
将甲苯/H2O(5:1,6mL)中的内酯4(466mg，1.84mmol)和胺7(510mg，1.76mmol)在80℃下搅拌2天，然后用EtOAc稀释，并用1M HCl、饱和NaHCO3水溶液性、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(100％EtOAc至5％MeOH/EtOAc)纯化，得到无色泡沫状的醇8(851mg，89％)，[α]D-31.4(c 1.66在MeOH中)；δH(400MHz,CDCl3)1.57(1H,m),1.89-2.00(5H,m),2.94(1H,dd,J＝9.5,14.0Hz),3.13(1H,dd,J＝4.0,10.5Hz),3.23(1H,d,J＝10.5Hz),3.35(1H,dd,J＝5.0,14.0Hz),3.40(2H,t,J＝6.5Hz),3.51-3.56(3H,m),3.78(3H,s),4.03(1H,m),4.12(1H,d,J＝9.0Hz),4.75(1H,m),6.99(2H,d,J＝8.3Hz),7.07(1H,d,J＝7.5Hz),7.19(2H,8.3Hz),7.51-7.63(3H,m),7.83(2H,d,J＝7.5Hz)；δC(100MHz,CDCl3)25.1,25.9,37.0,37.6,46.5,46.6,52.6,53.3,57.8,61.7,69.7,122.5(2C),127.9(2C),129.4(2C),130.5(2C),133.4,133.8,136.3,150.2,154.1,171.6,171.7；ν/cm-13408,1743,1718,1701,1663；HRMS(ESI+)m/z 568.1723(C26H31NaN3O8S[M+Na]+理论值568.1730)。
步骤5：4-((R)-3-甲氧基-3-氧代-2-((2S,4R)-4-((3-氧代-1-苯基-2,8,11,14-四氧杂-4-氮杂十七烷基-17-基)氨基)-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)丙基)苯基吡咯烷-1-甲酸酯(11)
在N2、在-20℃下，将醇8(105mg，0.19mmol)溶于干燥CH2Cl2(2mL)中。在30分钟内滴加DIPEA(99μL，0.57mmol)，然后滴加Tf2O(50μL,0.57mmol)。将反应在-20℃下搅拌2小时，然后用饱和NaHCO3水溶液终止，用EtOAc稀释，分离有机相。将有机相用H2O，2％柠檬酸，NaHCO3饱和水溶液、盐水洗涤。将水相用EtOAc萃取(2次)，将合并的有机相干燥(MgSO4)，将残余物减压浓缩，得到粗制的三氟甲磺酸酯9。向该残留物中加入在干燥THF(200μL)中的PEG胺10(141mg，0.39mmol)，并将反应物在室温下搅拌过夜。将混合物用10％的丁-2-醇/EtOAc(20mL)稀释，将有机相用NaHCO3饱和水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并减压浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(2％至3％MeOH/CH2Cl2)纯化，得到11(46mg，27％，经2步)，为无色油状物。通过C18-硅胶色谱(40％H2O/MeCN)进一步纯化一小部分进行表征，δH(400MHz,CDCl3)1.40(1H,m),1.55(2H,m),1.77(2H,m),1.93(4H,m),2.12(1H,m),2.43(2H,m),2.82(1H,dd,J＝7.8,9.2Hz),2.94(1H,m),3.02(1H,dd,J＝7.8,14.0Hz),3.23-3.32(4H,m),3.38(2H,t,J＝6.1Hz),3.44(2H,t,J＝6.6Hz),3.46–3.60(14H,m),3.76(3H,s),4.09(1H,dd,J＝3.0,8.9Hz),4.85(1H,td,J＝5.7,7.8Hz),5.07(2H,s),5.42(1H,brs),7.05(2H,d,J＝8.6Hz),7.14(2H,d,J＝8.6Hz),7.21(1H,d,J＝7.8Hz),7.28–7.35(5H,br m),7.53(2H,t,J＝7.5Hz),7.60(1H,br t,J＝7.04),7.81(1H,br d,J＝7.05Hz)；δC(100MHz,CDCl3)25.1,25.9,29.6,30.1,36.5,37.5,39.4,45.9,46.5,46.6,52.6,53.3,54.7,56.5,61.6,66.6,69.8,69.7,70.3,70.3,70.67,70.72,122.0(2C),128.1(2C),128.2(2C),128.6(3C),129.4(2C),130.2(2C),133.0,133.5,136.0,137.0,150.7,153.2,156.6,170.9,171.6；ν/cm-1 3334,2877,2341,1706,1521.HRMS(ESI+)m/z 904.3770(C44H59NaN5O12S[M+Na]+理论值904.3779)。
步骤6：(2S,4S)-4-羟基-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(12)
将内酯4(1.74g，6.88mmol)和Na2CO3(3.65g，34.4mmol)的混合物在室温下在MeOH(50mL)中搅拌过夜。将残余物浓缩，溶于EtOAc(100mL)中，分离有机相和H2O。将水相用EtOAc(2×30mL)萃取，将合并的有机相用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到无色固体状的甲酯12(1.57g，80％)。光谱数据与报道的值一致，将物质不经进一步纯化即可使用。
步骤7：(2S,4R)-4-叠氮基-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酸甲酯(16)
在0℃、N2下，将MsCl(304μL，3.93mmol)加入到醇12(934mg，3.27mmol)和三乙胺(620μL，4.48mmol)在干燥CH2Cl2(20mL)中的混合物中。将混合物搅拌2小时，用CH2Cl2稀释，依次用5％HCl、饱和NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，减压浓缩，得到粗的淡黄色油状物甲磺酸酯。将该残余物溶于DMSO(13ml)中，用NaN3(638mg，9.81mmol)处理，并将混合物在80℃下搅拌过夜。将反应物用EtOAc稀释，并用H2O、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并浓缩。将残余物通过重结晶(MeOH)纯化，得到16(874mg，86％，经2个步骤)，为无色针状物，mp 98-100℃,[α]D-33.4(c 1.02在CHCl3中)；δH(400MHz,CDCl3)2.17-2.21(2H,m),3.43(1H,ddd,J＝0.7,3.0,11.0Hz),3.71(1H,dd,J＝5.0,11.0Hz),3.76(3H,s),4.18-4.22(1H,m),4.30(1H,t,J＝7.5Hz),7.53-7.58(2H,m),7.61-7.65(1H,m),7.87-7.89(2H,m)；δC(100MHz,CDCl3)36.5,52.9,53.2,59.45,59.51,127.6(2C),129.3(2C),133.3,137.6,171.9；ν/cm-1 2101,1747,1445,1345,1207,1158,1095,1017,758,722,696；HRMS(ESI+)m/z 311.0808(C12H14N4O4SH[M+H]+理论值311.0809)；m/z 328.1073(C12H14N4O4SNH4[M+NH4]+理论值328.1074。
步骤8：(2S,4R)-4-叠氮基-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酸(17)
用0.2M NaOH(12.3mL，2.45mmol)处理在3:1EtOH/THF(40mL)中的甲酯16(586mg，1.89mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时，然后减压浓缩。将粗物质用乙醚稀释，分离水相。将有机层用0.2M NaOH(2×10mL)萃取，将合并的含水萃取液用10％HCl酸化。将水层用CHCl3(4×30mL)萃取，将合并的有机相用盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩。将粗物质通过快速色谱法(5％MeOH/CH2Cl2，具有0.5％AcOH)纯化，得到无色油状的酸17(492mg，88％)，[α]D-34.4(c 0.82在MeOH中)；δH(400MHz,CDCl3)2.18-2.32(2H,m),3.40(1H,m),3.73(1H,dd,J＝4.8,11.5Hz,H5'),4.22(1H,m,H4),4.29(1H,t,J＝7.7Hz),7.56(2H,m),7.64(1H,m),7.88(2H,m),10.72(1H,br s)；δC(100MHz,CDCl3)36.1,53.4,59.5,127.6(2C),129.4(2C),133.6,136.9,176.6；ν/cm-1 3500-2500,2107,1731；HRMS(ESI+)m/z 319.0472(C11H12N4NaO4S[M+Na]+理论值319.0472)。
步骤9：4-((S)-2-((2S,4R)-4-叠氮基-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)苯基吡咯烷-1-甲酸酯(18)
将O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)(693mg，1.83mmol)加入到搅拌的酸17(491mg，1.66mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(578μL，3.32mmol)在DMF(6mL)的混合物中，在N2下搅拌10分钟。然后滴加在DMF(6mL)中的胺7(484mg，1.66mmol)，将合并的混合物加热至室温，并搅拌过夜。将混合物用EtOAc稀释，依次用5％HCl、饱和NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩。通过快速色谱法(3％MeOH/CH2Cl2)纯化残余物，得到浅黄色泡沫状的二肽7(928mg，98％)，[α]D-4.6(c 0.85在CHCl3中)；δH(400MHz,CDCl3)1.67(1H,m),1.86-1.98(4H,m),2.04(1H,dt,J＝5.5,13.2Hz),2.99(1H,dd,J＝8.5,14.0Hz),3.19(1H,dd,J＝4.5,10.9Hz),3.30(1H,dd,J＝5.514.0Hz),3.44(2H,t,J＝6.5Hz),3.48(1H,dd,J＝5.5,11.5Hz),3.53(2H,t,J＝6.5Hz),3.78(3H,s),3.82(1H,m),4.09(1H,dd,J＝5.5,8.4Hz),4.87(1H,dt,J＝8.3,8.3,5.5Hz),7.05,7.15(4H,2×d,J＝8.5Hz),7.19(1H,d,J＝8.2Hz),7.53-7.57(2H,m),7.62-7.66(1H,m),7.83-7.86(2H,m)；δC(100MHz,CDCl3)25.1,25.9,35.6,37.5,46.4,46.6,52.7,53.1,53.8,58.9,61.1,122.1(2C),128.0(2C),129.5(2C),130.2(2C),132.9,133.7,136.0,150.7,153.1,169.9,171.5；ν/cm-1 3316,2975,2880,2105,1716,1682；HRMS(ESI+)m/z593.1789(C26H30N6NaO7S[M+Na]+理论值593.1789)。
通过醇8合成18
在0℃、N2下，将甲磺酰氯(92μL，1.18mmol)加入到醇8(251mg，0.394mmol)和三乙胺(170μL，1.22mmol)在无水CH2Cl2中的搅拌混合物中。将反应在0℃下搅拌1小时，然后升温至室温并再搅拌1小时。将反应用CH2Cl2稀释，依次用5％HCl、饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机相干燥(MgSO4)并减压浓缩得到中间体甲磺酸酯(4-((S)-3-甲氧基-2-((2S,4S)-4-((甲基磺酰基)氧基)-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-氧代丙基)苯基吡咯烷-1-甲酸酯(270mg，定量)，无需进一步纯化即可使用。[α]D-13.5(c 1.0在CHCl3中)；δH(400MHz,CDCl3)1.81(1H,m),1.89-1.96(4H,m),2.63(1H,br d),2.82(3H,s),3.06-3.18(2H,m),3.44(2H,t,J＝6.4Hz),3.50-3.55(3H,m),3.68(1H,dt,J＝1.3,12.5Hz),3.71(3H,s),4.63(1H,dd,J＝2.0,10.1Hz),4.73(1H,dd,J＝6.7,13.4Hz),5.02(1H,tt,J＝1.4,4.7Hz),7.07(2H,d,J＝8.6),7.16(2H,d,J＝8.6Hz),7.39(1H,d,J＝7.5Hz),7.56(2H,t,J＝7.6Hz),7.64-7.68(1H,m),7.81-7.84(2H,m)；δC(100MHz,CDCl3)25.1,25.9,35.5,37.4,38.9,46.5,46.5,52.5,54.0,55.4,61.0,78.0,122.1(2C),128.0(2C),129.8(2C),130.1(2C),132.8,134.1,135.4,150.7,153.1,169.8,171.3；ν/cm-1 3409,2954,2880,1715,1678,1511；HRMS(ESI+)m/z 646.1497(C27H33NaN3O10S2[M+Na]+理论值646.1505)。
将上述甲磺酸酯(97mg，0.16mmol)溶于DMSO(1.5mL)中，用NaN3(30.4mg，0.47mmol)处理，将混合物在80℃下搅拌过夜。将反应物用EtOAc稀释，并用H2O、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并浓缩，得到叠氮化物18(82mg，92％)。光谱数据与上文对化合物18报道的数据一致。
步骤10：4-((R)-3-甲氧基-3-氧代-2-((2S,4R)-4-(4-((3-氧代-1-苯基-2,8,11,14-四氧杂-4-氮杂十七烷-17-基)氨基甲酰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)丙基)苯基吡咯烷-1-甲酸酯(19)
将抗坏血酸钠(4.4mg，22.2μmol)、CuSO 4(224μL，2.24μmol，0.01M，在H2O中)和TBTA(281μL，2.81μmol，在THF中，0.01M)依次加入到叠氮化物18(32mg，56.1μmol)和炔15(15mg，61.8μmol)在DMF(1mL)中的混合物中。将反应在60℃下搅拌2小时，然后用EtOAc(20mL)稀释。将有机相用饱和NaHCO3水溶液、盐水洗涤，干燥(MgSO4)并减压浓缩。将残余物通过快速色谱法(21:2:1:1EtOAc/丙酮/MeOH/H2O)纯化，得到无色油状的三唑产物19(54mg，99％)[α]D+10.7(c 1.0在CHCl3中)；δH(400MHz,CDCl3)1.72-1.94(8H,m),2.14(1H,dt,J＝12.8,13.9Hz),2.54(1H,ddd,J＝2.3,6.5,12.9Hz),2.92(1H,dd,J＝10.0,13.9Hz),3.29(2H,dd,J＝6.0,12.3Hz),3.38(1H,dd,J＝4.8Hz,13.9Hz),3.41-3.63(19H,m),3.80(3H,s),3.83(1H,m),4.29(1H,dd,J＝2.0,8.7Hz),4.65(1H,m),4.94(1H,dt,J＝4.9,9.8Hz),5.06(2H,br s),5.44(1H,br t,J＝5.7Hz),7.04(2H,d,J＝8.5Hz),7.23(2H,d,J＝8.5Hz),7.28-7.33(5H,m),7.38-7.43(2H,m),7.52(2H,t,J＝7.7Hz),7.62(1H,t,J＝7.5Hz),7.79(2H,d,J＝7.3Hz),8.18(1H,s)；δC(100MHz,CDCl3)25.1,25.9,29.4,29.5,33.7,37.2,37.9,39.4,46.4,46.6,52.7,53.2,53.6,57.9,60.7,66.5,69.7,69.7,70.3,70.5,70.6,70.7,122.2(2C),126.1,127.7(2C),128.1,128.2,128.5(3C),129.7(2C),130.3(2C),133.1,133.9,135.5,136.9,143.2,150.6,153.3,156.6,159.8,169.0,171.5；ν/cm-1 3331,2951,2875,1714,1667,1575,1512；HRMS(ESI+)m/z 999.3891(C47H60NaN8O13S[M+Na]+理论值999.3893)。
步骤11：(R)-2-((2S,4R)-4-(4-((3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙氧基)氨基甲酰基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-(4-((吡咯烷-1-羰基)氧基)苯基)丙酸(21)
将NaOH水溶液(1.13mL，0.225mmol，0.2M)加入到搅拌的甲酯19(110mg，0.113mmol)在EtOH/THF(2:1,3mL)中的混合物中，并在室温下搅拌过夜。将反应用1M HCl终止，用EtOAc稀释并分离有机相。将水相用CHCl3萃取两次，将合并的有机相干燥(MgSO4)并减压浓缩，得到粗制的酸20(100mg)。将粗制的酸和10％Pd/C(50mg，50％H2O)在MeOH/H2O(5:1，12mL)中的混合物在H2气氛下在室温下搅拌2小时。将混合物通过硅藻土层过滤，减压浓缩，将残余物用C18反相柱(100％H2O至50％MeOH/H2O)纯化。将纯化的物质冻干，得到无色蓬松粉末的胺21(81.3mg，87％，经两步)，[α]D-16.0(c 0.49在MeOH中)；δH(400MHz,D2O)1.81(4H,m),1.91(4H,m),2.38(1H,m),2.98-3.09(4H,m),3.21-3.30(3H,m),3.30(2H,m),3.45(2H,t,J＝6.8Hz),3.59-3.66(12H,m),3.89(1H,d,J＝12.9Hz),4.04(1H,dd,J＝4.8,12.9Hz),4.41(1H,t,J＝8.2Hz),4.53(1H,dd,J＝5.3,7.4Hz),5.00(1H,br s),6.99(2H,d,J＝8.5Hz),7.306-7.356(4H,m),7.43-7.50(3H,m),7.99(1H,s)；δC(100MHz,D2O带有丙酮)25.2,25.8,27.2,29.1,35.5,36.9,37.2,38.3,47.1,47.1,49.5,55.1,56.7,60.4,61.7,68.9,69.3,70.1,70.2,70.3,122.6(2C),125.8,127.5(2C),130.2(2C),131.2(2C),134.5,135.1,135.6,142.9,150.4,155.6,161.9,173.2,175.8；ν/cm-1 3382,3064,2950,2878,1706,1658,1511；HRMS(ESI+)m/z 829.3550(C38H52N8O11S[M+H]+理论值829.3549)。
步骤12：5(6)-羧基四甲基罗丹明标记的化合物(22)
用5(6)-羧基四甲基罗丹明N-琥珀酰亚胺酯(NHS-罗丹明，Thermo Scientific)(8.9mg，16.9μmol)处理胺21(9.5mg，11.3μmol)在0.2M NaHCO3(1mL)中的混合物，并将混合物在室温下搅拌过夜。用乙酸终止反应物，浓缩，将残余物通过反相色谱(50％MeOH/H2O至100％MeOH)纯化，得到冻干后的紫色粉末状的罗丹明标记的化合物22(5.3mg，38％)。将化合物22分离为区域异构体的5:1混合物；δH(400MHz，d4-甲醇)主要异构体：1.80-1.99(9H,m),2.37(1H,dt,J＝6.6,13.5Hz),2.70(1H,m),3.08(1H,dd,J＝7.5,13.9Hz),3.22-3.26(1H,m),3.26(6H,s),3.27(6H,s),3.35(2H,t,J＝6.3Hz),3.43(2H,t,J＝6.3Hz),3.48-3.66(17H,m),3.74(1H,dd,J＝3.7,12.0Hz),3.91(1H,dd,J＝6.0,12.0Hz),4.45(1H,t,J＝7.1Hz),4.61(1H,t,J＝5.6Hz),4.94(1H,m),6.86(2H,br s),6.95-6.99(4H,m),7.16(2H,d,J＝9.5Hz),7.28(2H,d,J＝8.1Hz),7.35-7.42(3H,m),7.51(1H,t,J＝7.3Hz),7.60-7.63(2H,m),8.06-8.08(2H,m),8.56(1H,s)；δC(100MHz，d4-甲醇)主要异构体：25.9,26.7,30.4,36.6,38.0,38.1,38.9,40.9(4C),47.47,47.53,55.9,60.3,62.3,70.3,70.5,71.35,71.4,71.6(2C),97.3(2C),114.8(2C),115.2(2C),122.7(4C),126.3,128.6(2C),130.0,130.1,130.5(2C),131.1,131.7(4C),132.5(2C),134.4(2C),136.0,137.2,137.3,138.1,144.0,151.6,155.1,158.7(2C),159.0(2C),161.6,162.0,168.7,172.6；HRMS(ESI+)m/z1241.4970(C63H72N10O15SH[M+H]+理论值1241.4972)。
实施例1C:R-BC154(化合物25)的制备
还合成了缺乏PEG-间隔基的化合物25(R-BC154)，如以下流程5所示：
因此，用NaOH水解甲酸酯18，得到去保护的叠氮化物抑制剂23，随后在CuSO4、抗坏血酸钠和TBTA的存在下与N-丙炔基硫代罗丹明B 24反应，得到荧光标记的25(R-BC154)，通过HPLC纯化后产率为43％(流程4)。
作为举例，我们提供了从甲酯18开始形成荧光标记的BOP衍生物25的实际反应条件。
步骤1:(S)-2-((2S,4R)-4-叠氮基-1-(苯基磺酰基)吡咯烷-2-甲酰氨基)-3-(4-((吡咯烷-1-羰基)氧基)苯基)丙酸(23)
用0.2M NaOH(4.05mL，0.811mmol)处理在EtOH(10mL)中的甲酯18(420mg，0.737mmol)，并在室温下搅拌1小时。将该混合物减压浓缩以除去EtOH，将水相用10％HCl酸化。将水相用CHCl3(4×10mL)萃取，将合并的有机相用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并减压浓缩。经快速色谱(10％MeOH/CH2Cl2，带有0.5％AcOH的)纯化粗物质，得到浅黄色泡沫状的酸23(384mg，94％)。[α]D-0.7(c 1.00在CHCl3中)；δH(400MHz,CDCl3)1.67-1.73(1H,m),1.89-1.96(5H,m),3.10(1H,dd,J＝8.0,13.8Hz),3.21(1H,dd,J＝4.0,11.5Hz),3.38(1H,dd,J＝5.3,14.0Hz),3.44-3.55(5H,m),3.81(1H,m),4.11(1H,t,J＝6.5Hz),4.89(1H,m),7.05,7.22(4H,2×d,J＝8.0Hz),7.41(1H,d,J＝6.8Hz),7.53-7.64(3H,m),7.85(2H,d,J＝7.5Hz)；δC(100MHz,CDCl3)25.0,25.8,36.1,36.8,46.5,46.6,53.2,53.9,58.9,61.2,122.0(2C),128.0(2C),129.4(2C),130.5(2C),133.6,133.7,136.0,150.5,153.6,170.9,173.7；ν/cm-1 3329,2977,2881,2105,1706,1672；HRMS(ESI+)m/z 557.1817(C25H29N7O6S[M+H]+理论值557.1813)。
步骤2:R-BC154(25)
用CuSO4(86μL，0.86μmol，0.01M，在H2O中)、抗坏血酸钠(430μL，4.3μmol，0.01M，在H2O中)和三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)(108μL，1.08μmol，0.01M，在DMF中)处理在DMF(2mL)中的叠氮化物23(12mg，22μmol)和N-丙炔基硫代罗丹明B 24(14mg，24μmol)。将该混合物在60℃下搅拌2小时，此时TLC表明形成新的荧光产物。将该混合物减压浓缩，并将残余物经快速色谱(40:10:1CHCl3/MeOH/H2O，带有0.5％AcOH)部分纯化。将该物质通过HPLC(15分钟内，50％-98％MeCN/H2O(0.1％TFA)梯度洗脱；Rt＝14.9分钟)进一步纯化，得到纯的25(10.6mg，43％)，为紫色玻璃状物，δH(400MHz,d4-甲醇)1.27-1.31(12H,dt,J＝7.0,3.5Hz),1.91-1.98(4H,m),2.29-2.35(1H,m),2.71-2.78(1H,m),3.08(1H,dd,J＝7.5,13.8Hz),3.22(1H,dd,J＝5.3,13.8Hz),3.41(2H,t,J＝6.5Hz),3.54(2H,t,J＝6.5Hz),3.63-3.70(8H,m),3.85(1H,dd,J＝3.5,12.0Hz),3.97(1H,dd,J＝5.6,11.6Hz),4.21(2H,d,J＝1.4Hz),4.41(1H,t,J＝7.3Hz),4.72(1H,dd,J＝5.4,7.5Hz),5.08(1H,m),6.91(2H,t,J＝2.2Hz),6.98-7.04(4H,m),7.11(2H,t,J＝9.0Hz),7.30(2H,d,J＝8.6Hz),7.40(1H,d,J＝8.0Hz),7.44(2H,t,J＝7.5Hz),7.58-7.68(4H,m),8.00(1H,dd,J＝1.9,8.0Hz),8.37(1H,d,J＝1.8Hz)；δC(100MHz,d4-甲醇)12.9(4C),25.9,26.7,37.1,37.6,39.0,46.8(4C),47.5,47.6,54.8,55.7,60.3,62.1,97.0(2C),115.0(2C),115.26,115.29,122.9(2C),123.9,127.5,128.6(2C),129.3,130.5(2C),131.6(2C),132.3,133.8,133.9,134.4,135.26,135.34,138.3,144.1,144.8,146.9,151.7,155.2,157.16,157.17,157.2,157.8,159.4,173.1,173.8；ν/cm-1 3088-3418,2977,2876,1711,1649,1588；HRMS(ESI+)m/z 1174.3447(C55H61N9NaO13S3[M+Na]+理论值1174.3443)。对于体外和体内测试，25的游离酸(11.7mg，9.97μmol)溶于0.01M NaOH(997μL，9.97μmol)中，将深紫色溶液通过0.45μm注射器过滤器单元过滤。将产物冻干，得到25的钠盐(11.6mg，99％)，为松散的紫色粉末。
实施例2：化合物22和25(R-BC154)对于α4β1和α9β1的体外结合。
为了评估R-BC154对于分选的祖细胞群体(LSK细胞)的结合，从未处理和处理的(R-BC154；10mg/kg)小鼠(每组3只小鼠)收获全骨髓。将谱系阳性细胞使用谱系混合物(B220，Gr-1，Mac-1和Ter-119)进行免疫标记，然后根据制造商的说明书，用绵羊抗大鼠共轭Dynabeads(Invitrogen)进行免疫磁性选择除去。用抗Sca-1-PB和抗c-kit-FITC染色所产生的谱系贫化细胞。使用Cytopeia Influx(BD Biosciences)细胞分选仪将免疫标记的细胞在Sca-1+c-kit+上进行分选，并使用Olympus BX51显微镜进行成像。
随着可获得荧光探针化合物22和25(R-BC154)，使用产生的过表达α4β1和α9β1的人成胶质细胞瘤LN18细胞系，评估整联蛋白依赖性细胞结合特性。简而言之，通过人胶质母细胞瘤LN18细胞系的逆转录病毒转导产生过表达整联蛋白α4β1和α9β1的稳定的LN18细胞。通过逆转录病毒载体递送α4shRNA实现亲本和α9β1转导的LN18细胞中背景α4表达的沉默(JGrassinger等，Blood，2009,114,49-59)。(见图1和图2)。
当在生理模拟条件(1mM Ca2+/Mg2+)下，用化合物22和R-BC154(25)处理每个LN18细胞系时，发现两种化合物以剂量依赖性方式结合α4β1和α9β1LN18细胞(图3a和b)。在对照细胞系中几乎没有观察到结合，其缺乏整联蛋白表达，表明结合是整联蛋白特异性的。(图3a和b)。PEG连接的化合物22和R-BC154(25)都结合α9β1整联蛋白，其比α4β1整联蛋白的选择性更高，如通过其计算的解离常数(Kd)所确定。具体地说，在Ca2+/Mg2+条件下，化合物22结合α9β1(Kd＝8.4nM)，比α4β1(Kd＝20.1nM)的亲和力高2.4倍，R-BC154对于α9β1(Kd＝12.7nM)的亲和力相比对于α4β1(Kd＝38.0nM)的亲和力高3倍(图3a和b)。
有趣的是，当与化合物22相比时，R-BC154分别与α4β1和α9β1整联蛋白的结合亲和力分别降低1.9倍和1.5倍。
这些结果表明α4β1和α9β1整联蛋白确实可以耐受这类基于N-苯基磺酰基脯氨酸的整联蛋白拮抗剂在脯氨酸残基的4-位上的显著的空间位阻。该观察结果表明，PEG连接基的并入可能具有最小的益处。
R-BC154对α9β1/α4β1整联蛋白的惊人的高亲和力促进了对于其结合特性的进一步探索。与许多整联蛋白配体一样，R-BC154的亲和力和结合动力学也依赖于整联蛋白的活化状态，其可以通过二价金属阳离子来调控。如预期的那样，在没有阳离子的情况下没有观察到整联蛋白结合(图4)。然而，在1mM Mn2+的存在下，已知诱导整联蛋白采用更高亲和力结合确认的条件，观察到对于过表达α4β1和α9β1的LN18细胞系的更大的总体结合(图3b和c)。另外，与Ca2+/Mg2+条件(Kd＝38.0nM)相比，在Mn2+活化下，观察到R-BC154与α4β1(Kd＝12.4nM)的结合亲和力增加3.1-倍(图3b)。尽管通过添加Mn2+诱导的α9β1整联蛋白结合的总体水平较高，但与Ca2+/Mg2+条件相比，结合亲和力的最小变化是明显的(分别为Kd＝14.4nM相比12.7nM)(图3b)。
通过测量R-BC154结合的动力学进一步研究了α4β1和α9β1整联蛋白的生物化学性质的差异。结合率测量显示，Ca2+/Mg2+条件下相比Mn2+条件，R-BC154相对于α4β1和α9β1整联蛋白的结合较快(图5a和b)。对于结合速率常数(kon)的计算表明，生理条件下，R-BC154对于α4β1整联蛋白(kon＝0.094nM-1min-1)的结合比对于α9β1的结合(kon＝0.061nM-1min-1)更快(表3)。然而，Mn2+活化下，对于α4β1(kon＝0.038nM-1min-1)和α9β1整联蛋白观察到相似的kon值(表3)。
通过解离实验测定R-BC154结合的解离速率动力学。在Ca2+/Mg2+和Mn2+状态下，与其α9β1(koff＝0.054和<0.01min-1)对应物相比，R-BC154-α4β1复合物(koff＝0.717和0.014min-1)的解离速率更快(图5c和表3)。此外，与Ca2+/Mg2+条件相比，在Mn2+存在下，R-BC154与α4β1和α9β1整联蛋白结合的koff值显著较慢，60分钟后大于60％的R-BC154仍然结合(图5c)。在这些条件下观察到的较慢的解离速率表明Mn2+用于稳定配体结合构象，并且与使用放射性标记底物的先前报道一致。因此，尽管Ca2+/Mg2+条件下观察到更快的结合速率和解离速率，但Mn2+活化与对于α4β1和α9β1整联蛋白结合的较低的结合和解离速率有关。因此，使用R-BC154在Ca2+/Mg2+条件下体外筛选小分子整联蛋白抑制剂的竞争性抑制测定是优选的，因为在Mn2+活化下极度缓慢的解离速率将需要更长的孵育时间。
这些结果表明，与α9β1相比，虽然α4β1整联蛋白与这类基于N-苯基磺酰基脯氨酸的拮抗剂的结合略快，但对α9β1整联蛋白观察到更长时间的结合(表3)。因此，在生理相关条件下，这种双重α9β1/α4β1整联蛋白抑制剂可能被预期在体内对α9β1整联蛋白依赖性相互作用的作用产生更大的影响，因为它们对α9β1的解离率显著降低，尽管观察到对于α4β1整联蛋白的较高的结合率。
表3在Ca2+/Mg2+或Mn2+条件下，过表达α4β1和α9β1的LN18细胞的R-BC154结合性质的总结
条件 akobs(min-1) bkoff(min-1) ekon(nM-1min-1)
α4β1细胞 1mM Ca2+/Mg2+ 5.426 c0.717 0.094
1mM Mn2+ 1.891 0.014 0.038
α9β1细胞 1mM Ca2+/Mg2+ 3.117 0.054 0.061
1mM Mn2+ 2.035 d<0.01 ～0.04
a观察到的结合率(kobs)表示结合的快速期，分别占R-BC154与α4β1和α9β1整联蛋白结合的>60％和>80％。b将图5c中所示解离实验的数据拟合到单相指数衰减函数(除非另有说明)，解离速率常数(koff)从曲线外推。c在Ca2+/Mg2+存在下将R-BC154与α4β1LN18细胞结合的解离数据拟合为两相解离曲线，并从曲线的快速相位求出koff，其中解离度大于60％。d在Mn2+活化下，R-BC154-α9β1整联蛋白复合物的解离太慢(120分钟后>55％仍然结合；数据未显示)，以准确计算解离速率；基于“100分钟”的近似半衰期估计koff值。e使用公式(kobs-koff)/[R-BC154浓度＝50nM]计算结合速率常数(kon)。
实施例3：化合物25(R-BC154)与骨髓HSC和祖细胞的体内结合
体外结合数据表明，R-BC154是高亲和力α4β1和α9β1整联蛋白拮抗剂，其结合活性高度依赖于整联蛋白的活化。该实施例测试R-BC154是否可用于体内结合实验以调查α9β1/α4β1整联蛋白对定义的HSC群体的活性。迄今为止，评估HSC上的整联蛋白活性主要依赖于使用荧光标记抗体的骨髓细胞或纯化HSC的体外或离体染色。虽然离体染色提供HSC整联蛋白表达的确认，但是骨髓内天然状态下的整联蛋白活化的研究只能通过体内结合实验来确定，因为复杂的骨髓微环境在体外不能被充分重建。
为了评估R-BC154和这类基于N-苯基磺酰基脯氨酸的模拟肽是否可以直接结合HSC，将R-BC154(10mg kg-1)静脉内注射入小鼠，并使用多色流式细胞术分析用于表型定义的骨髓祖细胞(LSK细胞；谱系-Sca-1+c-Kit+)和HSC(LSKSLAM细胞；LSKCD48-CD150+)的R-BC154标记(图6a和b)。与来自未注射的小鼠的骨髓相比，从注射R-BC154的小鼠中分离的祖细胞和HSC群观察到由于R-BC154结合而增加的细胞相关荧光。此外，还通过对纯化的祖细胞(Lineage-Sca-1+c-Kit+)群进行荧光显微镜检查证实了体内R-BC154结合(图6c和d)。R-BC154标记的祖细胞显示荧光晕，指示R-BC154结合主要是细胞表面，这与整联蛋白结合一致。体内结合结果表明，这类α9β1/α4β1整联蛋白拮抗剂能够与非常稀少的造血祖细胞和HSC群(分别仅占小鼠骨髓内单核细胞的0.2％和0.002％)结合。
通过结合VCAM-1和Opn，α4β1和α9β1整联蛋白被认为是骨髓中HSC的携带重要的调节剂。(J.Grassinger等人，Blood，2009,114,49-59)。已证实纳摩尔抑制强度的BOP抑制α4β1和α9β1整联蛋白与VCAM-1和Opn的体外结合。这些使用R-BC154的体内结合结果表明HSC表达的α4β1和α9β1整联蛋白为原位活性结合构象。这表明小分子α9β1/α4β1整联蛋白拮抗剂如化合物22和25不仅直接与骨髓HSC结合，而且还能够抑制α9β1/α4β1依赖性粘附相互作用，并且可能用作诱导骨髓HSC进入外周循环的有效药物，如下面所示。
实施例4：R-BC154体外优先结合小鼠和人造血祖细胞
在上述实施例中已经显示，R-BC154(图7a)仅在二价金属阳离子如Ca2+、Mg2+或Mn2+存在下结合过表达人α9β1和α4β1整联蛋白(图7b)的人成胶质细胞瘤LN18细胞，所述二价金属阳离子诱导体外高亲和力整联蛋白结合所需的构象变化。为了确定是否需要活化整联蛋白以结合中心和骨内膜BM祖细胞(Lin-Sca-1+ckit+细胞；LSK)和HSC(LSKCD150+CD48-细胞；LSKSLAM)(图7c)，在1mM Ca2+/Mg2+存在下评价R-BC154结合(图7d)。在这些条件下，与其骨内膜对应物相比，观察到与中心LSK和LSKSLAM的更强的结合(p<0.005)(图7e)。通过与EDTA共处理使表面整联蛋白失活而完全消除活性，表明对于与HSC和祖细胞结合的有效的R-BC154而言需要整联蛋白活化(图7e)。在不存在活化阳离子和EDTA的情况下，R-BC154结合于骨内膜LSK细胞仍然是明显的，但不是结合于中心LSK(图7f)。这些结果表明由HSC表达的整联蛋白和从骨内膜BM分离的祖细胞在收获后保持活化。
由于整联蛋白α4β1在所有白细胞上普遍表达，并且α9β1已知在嗜中性粒细胞上广泛表达，因此评价了与谱系-定型的造血细胞结合的R-BC154。发现：在外源性活化下在从中心和骨内膜BM区域分离的所有谱系定型淋巴(B220+和CD3+)和骨髓(Gr1/Mac1+)后代观察到活化依赖性结合(图8)。然而，该结合相对于LSKSLAM(p<0.0001)和LSK(p<0.0001)细胞显著较低(图7g)。为了确认结合HSC和祖细胞是否是α4β1和α9β1整联蛋白依赖性的，用R-BC154处理在造血细胞(α4 flox/floxα9 flox/floxvav-cre小鼠)中的无α4和α9整联蛋白的BM细胞。LSK(p<0.005)和LSKSLAM(p<0.005)α4 -/-/α9 -/-细胞基本上不存在结合，这证实了R-BC154活性需要这两种整联蛋白(图7h)。
在人类脐带血单核细胞(MNC)上也证实了R-BC154的二价阳离子和剂量依赖性结合(图7i)。在活化条件下，与谱系-定型CD34-细胞相比，在富集CD34+CD38-细胞的干细胞上观察到更大的结合，尽管相对于CD34+CD38-祖细胞的程度较小(图7j和7k)。这些结果表明结合鼠类和人的造血细胞的R-BC154是二价金属阳离子依赖性的，并且在体外外源活化下相对于HSC也偏向造血祖细胞。
实施例5：R-BC154通过骨内膜龛之内的原位内在活化的α4/α9整联蛋白靶向HSC和祖细胞
整联蛋白以多种活化状态存在，其干细胞龛的调节是复杂的，不能在体外精确模拟或重现。为了评估BM之内的HSC和祖细胞表达的α9β1/α4β1整联蛋白是否被内在地和差异化地原位活化，对C57B1/6小鼠在免疫标记LSKSLAM之前注射R-BC154。来自中心和骨内膜BM区域的LSK细胞被通过用i.v.施用R-BC154有效标记(图9a)。然而，骨内膜BM中的LSK和LSKSLAM细胞与其中心BM对应物相比，显示出更大比例的R-BC154hi细胞(图9b)，并且与在不存在活化二价金属阳离子的情况下进行的体外实验一致(参见图7f)。淋巴样(B220+和CD3+)和骨髓样(Gr1+和Mac1+)后代在骨内膜BM中也表现出较大比例的R-BC154hi细胞，表明增强的整联蛋白活化不仅限于原始造血细胞群(图9c)。在α4 -/-/α9 -/-LSK细胞中没有R-BC154的结合是明显的，证实了α4和α9整联蛋白对体内活性的要求(图9d)。这些数据表明α9β1/α4β1整联蛋白不仅是必需的，而且也被骨内膜BM区域的细胞内在地和差异化地活化。
实施例6-小分子α9β1/α4β1整联蛋白拮抗剂快速动员HSC和祖细胞
存在几种用于评估新的动员剂诱导HSC进入PB的能力的小鼠测定法，如Herbert，K.E.等人Biol Blood Marrow Tr 14,603-621(2008)中所述。尽管正常PB中的LSK和LSKSLAM细胞分别仅占循环WBC的～0.005％和～0.0005％，但已经显示出来自PB的LSK和LSKSLAM的分选产生了集落形成细胞(CFC)，因此包含能够造血重构的细胞容量。因此，PB中LSK和LSKSLAM含量的测定最初用作干细胞和祖细胞含量的替代测量。
最初，在i.v.施用(<5分钟)之后快速清除R-BC154促使对于其他施用方式的评估，以及s.c.注射是否会在体内提供持续的结合活性，从而允许最大的动员效率。与i.v.注射相比，在s.c.处理后30分钟观察到持续结合BM LSK(图9e)。与其BM相应物相比，对于PB中的LSK观察到最小结合，进一步证明有效活化和整联蛋白依赖性结合需要干细胞龛(图9e)。然而，没有发现用R-BC154处理的小鼠在PB中WBC，LSK或LSKSLAM的数量显著增加(图10)。使用非荧光标记的BOP(2)进一步研究了用α9β1/α4β1整联蛋白抑制剂的HSC动员(图11a)。基于使用R-BC154和过表达的LN18细胞系(图11b)的竞争性抑制测定，BOP被证明是α9β1和α4β1整联蛋白的有效抑制剂，并且可以抑制与VCAM-1和凝血酶切割的Opn的整联蛋白依赖性粘附。此外，BOP有效抑制α9β1和α4β1整联蛋白对于HSC和祖细胞的结合，通过R-BC154在活化条件下与LSK和LSKSLAM结合的竞争性替代证实(图11c)。将BOP(10mg/kg)施用于C57BL/6小鼠长达90分钟，与盐水对照相比，PB WBC(图11d)，LSK(图11e)和LSKSLAM(图11f)显著增加。与R-BC154不同，使用BOP观察到更大和更持续的动员，可能是由于其较高的结合亲和力和较慢的解离速率。
已知HSC表达几种整联蛋白亚型，包括αvβ3,αLβ2,α2β1,α5β1,α6β1,α4β1和α9β1，其中许多已参与在BM中的HSC保留。在上述实施例中，提供了证据证明使用小分子拮抗剂BOP抑制α9β1/α4β1整联蛋白，通过抑制与VCAM-1和Opn的整联蛋白依赖性结合而诱导长期再生HSC的快速动员。
以前的研究已经证实，使用中和抗体或小分子抑制剂对整联蛋白α4β1和VCAM-1相互作用的抑制在小鼠和灵长类动物中动员HSC，而靶向动员的特异性细胞类型和这些靶细胞在BM中的位置还没有被探索。使用仅在用二价金属阳离子活化时与α4β1和α9β1整联蛋白结合的荧光小分子整联蛋白拮抗剂(R-BC154)，首次显示了：小鼠和人类HSC上的这两种β1整联蛋白的活化状态在体内是内在活化的，并通过骨内膜龛区别指定。
由于干细胞龛的概念最初是由Schofield在1978年推测的，所以骨内膜BM的功能特征已得到深入的研究。这些研究已经突显出骨内膜龛作为缺氧环境，其中细胞成分如成骨细胞及其相关细胞外基质蛋白是HSC维护和功能的重要龛特异性的调节剂。这些实施例显示包括HSC和祖细胞在内的骨内膜龛的BM细胞表达α9β1/α4β1整联蛋白，其具有比中央髓腔内所观察到的更高的亲和结合状态。虽然这种差异的整联蛋白活性的生理相关性仍然是未知的，但是这些观察结果与以前的报道一致，即凝血酶切割的Opn(trOpn)和α4β1和α9β1整联蛋白之间的HSC依赖性结合仅限于骨内膜骨髓。
骨内膜增强的整联蛋白活化不是原始HSC和祖细胞特异性的，且不太可能仅限于α9β1和α4β1整联蛋白。在不受理论限制的情况下，对于在骨内膜BM内观察到的增强的整联蛋白活化的一个可能的解释是其与骨很接近。与其矿物质含量高的其他微环境细胞区分开来的骨骼，是钙和镁无机盐以及锰等痕量金属的主要储存位点，所有这些都已知会诱导α9β1和α4β1整联蛋白采用更高亲和力的配体结合构象。因此，以下是合理的：从骨内膜表面发出的Ca2+(和可能的Mg2+和Mn2+)的高离子梯度对观察到的增强的整联蛋白结合活性是负责的。事实上，这一概念以前被援引以合理解释通过G蛋白偶联的钙感受受体(CaR)识别细胞外Ca2+来实现骨内膜BM内HSC的优先定位。总体而言，这些观察结果进一步限定了骨内膜龛的独特性质，差异性影响，其导致看起来表型相同的细胞，并为治疗性靶向用于干细胞治疗的干细胞龛提供验证。
总之，证明BOP是α4β1和α9β1整联蛋白的小分子抑制剂，能够有效、快速地动员具有长期多谱系植入潜力的HSC。
虽然本发明的上述书面描述使得普通技术人员能够制备和使用目前被认为是最佳方式的方案，但是普通技术人员将理解和认可存在本文具体实施方案、方法和实施例的变型、组合和等同物。因此，本发明不应受上述实施方案、方法和实施例的限制，而是如本文广泛描述的本发明的范围和主旨内的所有实施方案和方法的限制。
参考
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2.D.N.Haylock,B.Williams,H.M.Johnston,M.C.P.Liu,K.E.Rutherford,G.A.Whitty,P.J.Simmons,I.Bertoncello and S.K.Nilsson,Stem Cells,2007,25,1062–1069.
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8.Cao,B.等人Design,synthesis and binding properties of a fluorescentalpha(9)beta(1)/alpha(4)beta(1)integrin antagonist and its application as anin vivo probe for bone marrow haemopoietic stem cells.Org.Biomol.Chem.12,965-978,doi:Doi 10.1039/C3ob42332h(2014).
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10.Schofield,R.Relationship between Spleen Colony-Forming Cell andHaematopoietic Stem-Cell-Hypothesis.Blood Cells 4,7-25(1978)

Claims (71)

1.用于在体内或离体增强HSC及其前体和其祖细胞从BM干细胞结合配体迁移的方法，所述方法包括在体内或离体向BM干细胞龛施用有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法还增强HSC及其前体和其祖细胞从BM干细胞龛的释放。
3.根据权利要求1或2的的方法，其中所述方法还增强HSC从BM干细胞龛的动员。
4.根据权利要求1至4中任意一项的方法，其中所述α9整联蛋白是α9β1整联蛋白或其活性部分。
5.根据权利要求1至4中任意一项的方法，其还包括施用α4整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
6.根据权利要求5的方法，其中所述α4整联蛋白是α4β1的拮抗剂或其活性部分。
7.根据权利要求1至6中任意一项的方法，其中所述拮抗剂与α9和α4交叉反应,并任选地与α9β1和α4β1交叉反应。
8.根据权利要求1至7中任意一项的方法，其中所述拮抗剂是具有下式的式(I)的化合物或其可药用盐:
其中
X选自键和–SO2–；
R1选自H、烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R2选自H和取代基；
R3选自H和C1-C4烷基；
R4选自H和–OR6；
R5选自H和–OR7；
条件是当R4是H时，则R5是–OR7，且当R4是–OR6时，则R5是H；
R6选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R8、–C(O)R9和–C(O)NR10R11；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R8选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R9选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R10和R11与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
9.根据权利要求8的方法，其中:
R4是H；且
R5是–OR7。
10.根据权利要求8或权利要求9的方法，其中:
R7选自C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自C1-C4烷基、–CN、–O(C1-C4烷基)和任选地被取代的杂芳基；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基、任选地被取代的芳基或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n是1或2。
11.根据权利要求8至10中任意一项的方法，其中:
R7选自C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自C1-C4烷基、–CN、–O(C1-C4烷基)和5-四唑基；
R13是2-吡咯基；
R14和R15各自独立地是C1-C4烷基或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的吡咯烷基或吗啉基环；且
n是1或2。
12.根据权利要求8至11中任意一项的方法，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
13.根据权利要求8至12中任意一项的方法，其中R1为任选地被取代的苯基。
14.根据权利要求13的方法，其中所述苯基任选地被至少一个卤素基团取代。
15.根据权利要求8至14中任意一项的方法，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
16.根据权利要求8至15中任意一项的方法，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
17.根据权利要求1至16中任意一项的方法，其中在不存在G-CSF的情况下，施用拮抗剂。
18.根据权利要求1至17中任意一项的方法，其中静脉内、皮内、皮下、肌内、透皮、透粘膜或腹膜内施用所述α9整联蛋白拮抗剂；任选地静脉内或皮下施用拮抗剂。
19.根据权利要求5至18中任意一项的方法，其中同时、连续或组合施用所述α9整联蛋白拮抗剂与α4整联蛋白拮抗剂。
20.根据权利要求1至19中任意一项的方法，其中所述HSC源自骨髓。
21.根据权利要求20的方法，其中所述HSC源自干细胞龛，任选地源自骨髓的中心或骨内膜龛。
22.根据权利要求1至21中任意一项的方法，其中所述HSC为骨内膜祖细胞，选自CD34+细胞,CD38+细胞,CD90+细胞,CD133+细胞,CD34+CD38-细胞、谱系-定型CD34-细胞或CD34+CD38+细胞。
23.用于增强HSC从BM干细胞结合配体的迁移的组合物，所述组合物包含α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
24.根据权利要求23的组合物，其还增强HSC从BM干细胞结合配体的释放。
25.根据权利要求24的组合物，其还增强从BM干细胞龛至PB的HSC的动员。
26.根据权利要求23至25中任意一项的组合物，其中所述α9整联蛋白是α9β1整联蛋白或其活性部分。
27.根据权利要求23至26中任意一项的组合物，其还包含α4整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
28.根据权利要求27的组合物，其中所述α4整联蛋白是α4β1的拮抗剂或其活性部分。
29.根据权利要求23至28中任意一项的组合物，其中所述拮抗剂与α9和α4交叉反应，任选地与α9β1和α4β1交叉反应。
30.根据权利要求23至29中任意一项的组合物，其中所述α9整联蛋白拮抗剂是具有下式的式(I)的化合物或其可药用盐:
其中
X选自键和–SO2–；
R1选自H、烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R2选自H和取代基；
R3选自H和C1-C4烷基；
R4选自H和–OR6；
R5选自H和–OR7；
条件是当R4是H时，则R5是–OR7，且当R4是–OR6时，则R5是H；
R6选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R8、–C(O)R9和–C(O)NR10R11；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R8选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R9选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R10和R11与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
31.根据权利要求30的组合物，其中:
R4是H；且
R5是–OR7。
32.根据权利要求23或31的组合物，其中:
R7选自C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自–CN、–O(C1-C4烷基)和任选地被取代的杂芳基；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基、任选地被取代的芳基或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n是1或2。
33.根据权利要求23至32中任意一项的组合物，其中:
R7选自C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自C1-C4烷基、–CN、–O(C1-C4烷基)和5-四唑基；
R13是2-吡咯基；
R14和R15各自独立地是C1-C4烷基或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的吡咯烷基或吗啉基环；且
n是1或2。
34.根据权利要求23至33中任意一项的组合物，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
35.根据权利要求23至34中任意一项的组合物，其中R1是任选地被取代的苯基。
36.根据权利要求35的组合物，其中所述苯基任选地被至少一个卤素基团取代。
37.根据权利要求23至36中任意一项的组合物，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
38.根据权利要求23至37中任意一项的组合物，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
39.根据权利要求30至38中任意一项的组合物，用于在没有G-CSF的情况下施用。
40.根据权利要求30至39中任意一项的组合物，用于静脉内、皮内、皮下、肌内、透皮、透粘膜或腹膜内施用；任选地静脉内或皮下施用所述组合物。
41.根据权利要求30至40中任意一项的组合物，其中同时、连续或组合施用所述α9整联蛋白拮抗剂与α4整联蛋白拮抗剂。
42.根据权利要求30至41中任意一项的方法，其中所述HSC源自骨髓。
43.根据权利要求30至42中任意一项的方法，其中所述HSC源自干细胞龛，任选地源自骨髓的中心或骨内膜龛。
44.根据权利要求30至43中任意一项的方法，其中所述HSC为骨内膜祖细胞，选自CD34+细胞,CD38+细胞,CD90+细胞,CD133+细胞,CD34+CD38-细胞、谱系-定型CD34-细胞或CD34+CD38+细胞。
45.从受试者收获HSC的方法，所述方法包括:
向受试者施用有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂，其中所述有效量增强HSC及其前体和其祖细胞从BM干细胞龛中的BM干细胞结合配体的迁移；
动员迁移的HSC到PB；和
从PB收获HSC。
46.根据权利要求45的方法，其中在没有G-CSF情况下施用所述α9整联蛋白拮抗剂。
47.根据权利要求45的方法，其中还通过使用其他HSC动员剂来动员HSC，所述其他HSC动员剂例如但不限于白细胞介素-17、环磷酰胺(Cy)、多西他赛和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
48.根据权利要求45或46的方法，其中整联蛋白拮抗剂的有效量在25–1000μg/kg体重、更优选50-500μg/kg体重、最优选50-250μg/kg体重的范围内。
49.细胞组合物，其包含由根据权利要求45至48中任意一项的方法获得的HSC。
50.用于治疗血液病的方法，所述方法包括施用根据权利要求23至44的细胞组合物或根据权利要求49的细胞组合物。
51.治疗受试者的血液病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的α9整联蛋白或其活性部分的拮抗剂以增强HSC从BM向PB的迁移、释放或动员。
52.根据权利要求51的方法，其中所述α9整联蛋白是α9β1整联蛋白或其活性部分。
53.根据权利要求51或52的方法，其还包括施用α4整联蛋白或其活性部分的拮抗剂。
54.根据权利要求53的方法，其中所述α4整联蛋白是α4β1的拮抗剂或其活性部分。
55.根据权利要求51至54中任意一项的方法，其中所述拮抗剂与α9和α4交叉反应，任选地与α9β1和α4β1交叉反应。
56.根据权利要求50至55中任意一项的方法，其中所述拮抗剂是具有下式的式(I)的化合物或其可药用盐:
其中
X选自键和–SO2–；
R1选自H、烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R2选自H和取代基；
R3选自H和C1-C4烷基；
R4选自H和–OR6；
R5选自H和–OR7；
条件是当R4是H时，则R5是–OR7，且当R4是–OR6时，则R5是H；
R6选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R8、–C(O)R9和–C(O)NR10R11；
R7选自H、C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R8选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R9选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的杂环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R10和R11与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；
R12选自任选地被取代的烷基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的杂芳基、–O(C1-C4烷基)、–C(O)-(C1-C4烷基)、–C(O)O-(C1-C4烷基)和–CN；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基和任选地被取代的芳基，或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n每次出现时为1至3范围内的整数。
57.根据权利要求56的方法，其中:
R4是H；且
R5是–OR7。
58.根据权利要求56或权利要求57的方法，其中:
R7选自C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自–CN、–O(C1-C4烷基)和任选地被取代的杂芳基；
R13选自任选地被取代的环烷基、任选地被取代的芳基和任选地被取代的杂芳基；
R14和R15各自独立地选自C1-C4烷基、任选地被取代的芳基或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的杂环烷基环；且
n是1或2。
59.根据权利要求56至58中任意一项的方法，其中:
R7选自C1-C4烷基、–(CH2)n-R12、–C(O)R13和–C(O)NR14R15；
R12选自C1-C4烷基、–CN、–O(C1-C4烷基)和5-四唑基；
R13是2-吡咯基；
R14和R15各自独立地是C1-C4烷基或
R14和R15与它们所连接的氮一起形成任选地被取代的吡咯烷基或吗啉基环；且
n是1或2。
60.根据权利要求56至59中任意一项的方法，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
61.根据权利要求56至60中任意一项的方法，其中R1是任选地被取代的苯基。
62.根据权利要求61的方法，其中所述苯基任选地被至少一个卤素基团取代。
63.根据权利要求56至62中任意一项的方法，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
64.根据权利要求56至63中任意一项的方法，其中式(I)的化合物为
或其可药用盐。
65.根据权利要求51至64中任意一项的方法，其中在没有G-CSF情况下施用所述拮抗剂。
66.根据权利要求51至65中任意一项的方法，其中静脉内、皮内、皮下、肌内、透皮或透粘膜施用所述α9整联蛋白拮抗剂；任选地静脉内或皮下施用所述拮抗剂。
67.根据权利要求51至66中任意一项的方法，其中同时、连续或组合施用所述α9整联蛋白拮抗剂与α4整联蛋白拮抗剂。
68.根据权利要求51至67中任意一项的方法，其中所述血液病选自免疫抑制、慢性疾病、创伤性损伤、退行性疾病、感染或其组合；皮肤、消化系统、神经系统、淋巴系统、心血管系统、内分泌系统的疾病或病症或其组合；骨质疏松症、阿尔茨海默病、心肌梗死、帕金森病、创伤性脑损伤、多发性硬化、肝硬化或其组合；成神经细胞瘤、骨髓发育不良、骨髓纤维化、乳腺癌、肾细胞癌或多发性骨髓瘤；造血肿瘤性疾病；自身免疫性疾病；或非恶性疾病。
69.根据权利要求68的方法，其中所述血液病为选自B谱系ALL和T谱系ALL的急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、多毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。
70.将HSC移植到患者内的方法，所述方法包括
向受试者施用α9整联蛋白拮抗剂以从BM干细胞结合配体迁移HSC；
释放和动员HSC从BM到PB；
从受试者的PB收获HSC；和
将HSC移植至患者。
71.根据权利要求70的方法，其中所述HSC为骨内膜祖细胞，且选自CD34+、CD38+、CD90+、CD133+、CD34+CD38-细胞、谱系-定型CD34-细胞或CD34+CD38+细胞。
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