JP4871740B2 - 抗α9インテグリン抗体とその用途 - Google Patents
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Description
(1)ヒトα9インテグリンおよびマウスα9インテグリンを特異的に認識するモノクローナル抗体。
(2)ヒトおよび/またはマウスα9インテグリンとα9インテグリンのリガンドとの結合を阻害する上記(1)に記載のモノクローナル抗体。
(3)α9インテグリンのリガンドがオステオポンチンである上記(2)に記載のモノクローナル抗体。
(4)受託番号FERM BP−10195、FERM BP−10196、FERM BP−10197、またはFERM BP−10198で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される上記(1)から(3)のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
(5)上記(1)から(4)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
(6)上記(1)から(4)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物。
(7)請求項1から4のいずれかに記載のモノクローナル抗体および抗α4インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物。
(8)炎症性疾患の予防および/または治療剤である、上記(6)または(7)に記載の医薬組成物。
(9)上記(1)から(4)のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含有する、炎症性疾患の診断剤。
(10)α9インテグリンを過剰発現する細胞を抗原として用いることを特徴とする、上記(1)から(4)のいずれかに記載のモノクローナル抗体の製造方法。
(11)α9インテグリンを過剰発現する抗原として用いた細胞とは別の種の細胞を用いることを特徴とする、上記(5)に記載のハイブリドーマ細胞の製造方法。
(12)α9インテグリン結合性機能分子(例えば、OPN、VCAM-1、テネイシンC、ファイブロネクチン、pp-vWF、tTGなど)を有効成分として含有する、細胞および/または組織のリモデリングの抑制および/または促進剤。
(13)α9インテグリン発現細胞および/または組織(例えば、腫瘍細胞、好中球、平滑筋など)とα9インテグリン結合性機能分子(例えば、OPN、VCAM-1、テネイシンC、ファイブロネクチン、pp-vWF、tTGなど)とを接触させることを特徴とする細胞および/または組織のリモデリングの抑制および/または促進方法。
また、本発明の抗α9インテグリン抗体と抗α4インテグリン抗体の両者を含有する医薬組成物は、さらに改善された炎症性疾患の治療効果を奏する。本発明ではマウスα9インテグリン、ヒトα9インテグリンに対するそれぞれのモノクローナル抗体を作製した。抗マウスα9インテグリン抗体では、動物実験に使用することができ、抗ヒトα9インテグリン抗体では治療薬として使用することが可能となる。
遺伝子発現細胞のスクリーニングは通常であれば、タンパク質レベルや遺伝子レベルで行うが、今回は、α9インテグリンの機能である細胞接着能を用いたスクリーニングにより、ヒトまたはマウスα9インテグリンをそれぞれ細胞膜上に過剰発現する細胞株を樹立した。
ヒトまたはマウスα9インテグリン発現細胞は、マウスあるいはハムスターへそれぞれ免疫に使用することができた。
マウスα9インテグリンに対する抗体を作製するために、シリアンハムスターに免疫することを考えた。そのために、ハムスターの卵巣由来細胞であるCHO−K1細胞へマウスα9インテグリンの遺伝子導入を行い、ハムスター内で主にマウスα9インテグリンに対する抗体のみの抗体価を増加させる実験系を構築した。
ヒトα9インテグリンに対する抗体は、CHO−K1細胞へヒトα9インテグリンの遺伝子導入を行い、マウス内でヒトα9インテグリンに対する抗体を増加させる実験系を構築した。
種々のハイブリドーマからマウスα9インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、免疫した細胞の親細胞(CHO−K1)とは異なる細胞(NIH3T3)にα9インテグリンを発現させた細胞をスクリーニングに使用した。さらにα9インテグリンと同じインテグリンファミリーに属するマウスα4インテグリンをNIH3T3細胞に発現させた細胞を用いて、α9インテグリン以外のインテグリンとは交差反応性を示さないクローンを選抜することにより、効率的にマウスα9インテグリンに特異的に反応する抗体を得た。
種々のハイブリドーマからヒトα9インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、遺伝子導入CHO−K1に反応を示し、CHO−K1細胞に反応しないクローンを選抜した。また、ヒトα4インテグリン遺伝子導入CHO−K1細胞に反応しないことを確認することで、ヒトα9インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得た。
本発明はα9インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。本発明において「抗体」とは、抗原であるα9インテグリンまたはその部分ペプチドに結合し得る抗体分子全体またはその断片(例えば、FabまたはF(ab’)2断片)を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明においてはモノクローナル抗体を意味する。また、本発明において「抗体」は、ヒト抗体、ヒト型化抗体、キメラ抗体を包含する。
本発明において抗原として使用するα9インテグリンは、(1)ヒトやその他の哺乳動物のα9インテグリンを発現するあらゆる細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するタンパク質、(2)α9インテグリンをコードする遺伝子DNA、好ましくはcDNAを細菌、酵母、動物細胞等の細胞株に導入、発現させた組換えタンパク質であってもよく、また(3)合成タンパク質であってもよい。
を意味する。さらに、そのような置換、欠失、修飾及び付加の複数を有する変異ポリペプチドであってもよい。
抗原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常1〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、マウス、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、本発明ではハムスターが好適に用いられる。
ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ヒト等に由来する細胞が用いられる。例えばマウスミエローマP3U1、P3X63−Ag8、P3X63−Ag8−U1、P3NS1−Ag4、SP2/0−Ag14、P3X63−Ag8−653等があげられるが、抗体産生細胞とミエローマ細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。ミエローマ細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。本発明ではP3X63−Ag8−653が好適に用いられる。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI 1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業(株))あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬(株))などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常、5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%CO2下で行なうことができ
る。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができるAntibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えばプロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.(Amersham Biosciences)等が挙げられる。
得られた抗体を、公知の方法または市販のキットを用いて各種標識化(例えば、ビオチン標識、FITC標識、APC標識)できる。本発明では、Biotin Labeling Kit(同仁化学)を用いたビオチン標識が好適に用いられる。
本発明は上記のモノクローナル抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明のモノクローナル抗体を有効成分として含有してなる医薬組成物は、癌、例えば癌細胞の増殖、転移、そして炎症性疾患、例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病)および自己免疫疾患等の予防および/または治療剤として用いることができる。
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物はまた、臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の治療にも用いることができる。
投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
ol)adduct of hydrogenated castor oil)〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、癌、例えば癌細胞の増殖、転移、そして炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトー
デス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、α9インテグリンを特異的に認識することができるので、被検液中のα9インテグリンの定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどによる定量、免疫染色などに使用することができる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて測定系を構築すれ
ばよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
α9インテグリンの検出、被検細胞内におけるα9インテグリンの挙動の分析等に使用することができる。
[マウスα9、α4インテグリンcDNAのクローニング]
α4インテグリン遺伝子はマウス12.5日胚、α9インテグリンはB16−BL6細胞(マウスメラノーマ細胞)の全RNAからランダムプライマーを用いて逆転写し、得られたcDNAを鋳型としてPCR法によりクローニングを行った。クローニングに用いたプライマーを以下に示す。
mα4Integin-5': 5'-CGTGGATCCGAGCGCATGGCTGCGGAAGCGAGGTGC-3'(配列番号:3)
mα4Integin-3': 5'-CAGCTCGAGTCAGTCATCATTGCTTTTGCTGTTGAC-3'(配列番号:4)
mα9Integin-5': 5'-GTCAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCTGGGCTG-3'(配列番号:5)
mα9Integin-3': 5'-CGGTCTAGACACGGTGGGTCACTGGTTTTTCTGGAC-3'(配列番号:6)
α4インテグリン遺伝子はヒト好中球、α9インテグリンはヒト末梢単核球から抽出した全RNAからランダムプライマーを用いて逆転写し、得られたcDNAを鋳型としてPCR法によりクローニングを行った。クローニングに用いた
プライマーを以下に示す。
hα4Integin-5': 5'-ACGCTCGAGTGTACCATGTTCCCCACCGAGAGCGCA-3'(配列番号:11)
hα4Integin-3': 5'-TCATCTAGATTAATCATCATTGCTTTTACT-3'(配列番号:12)
hα9Integin-5': 5'-TCGAAGCTTCTGGGGATGGGCGGCCCGGCT-3'(配列番号:13)
hα9Integin-3': 5'-ACCTCTAGATCACTGGTTTTTCTGGACCCA-3'(配列番号:14)
[α9インテグリン、α4インテグリン恒常発現細胞株の樹立]
ハムスターに免疫するために、ハムスター卵巣由来細胞株であるCHO−K1細胞にα4インテグリンcDNAを含むマウスα4インテグリン/pcDNA3.1、またはマウスα9インテグリンcDNAを含むα9インテグリン/pcDNA3.1を導入し、OPNのSVVYGLRペプチドとの接着効果能によるスクリーニングで、マウスα9インテグリンを恒常的に発現するCHO−K1細胞(マウスα9/CHO−K1細胞)を3クローン(6F1、12C3、4N2)、NIH3T3細胞(マウスα9/NIH3T3細胞)を4クローン(21H、7A3、11C3、21D3)樹立した。
[抗α9インテグリン抗体を用いたFACS解析]
マウスα9/CHO−K1細胞自体を抗原として用い、シリアンハムスター(7−8週齢、雌)3匹に1×107細胞/回/匹を合計5回免疫した。脾細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞であるX63−Ag8−653とPEG法にて細胞融合し、HAT培地で選択した。モノクローナル抗体の産生は、細胞ELISA法にてスクリーニングを行った。免疫に使用した細胞をスクリーニングに使用するとバックグラウンドが高くなることや偽陽性が多くなることが予想されたので、マウスα9/NIH3T3細胞に反応し、且つ、マウスα4/NIH3T3細胞に反応しないクローンを抗α9インテグリン抗体とした。限界希釈法を2回繰り返すことによりモノクローナル抗体を樹立した。その結果、抗マウスα9インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞4クローン(11L2B、12C4’58、18R18D、55A2C)を樹立した。
[細胞染色の検討]
免疫組織化学を行うためにマウスより種々の生体組織を摘出し、O.C.T. コンパウンド(ティシューテック)にて包埋し、液体窒素にて凍結後、コールドトーム(サクラ)にて5μm厚に薄切した。薄切した組織を一昼夜風乾した後、-20℃のアセトンにて固定し、正常ヤギ血清にて非特異反応のブロックを行った。次に抗α9インテグリン抗体クローン12C4’58をそれぞれ一次抗体として2μg/mlの濃度で室温1時間反応させ、PBSで500倍希釈したビオチン化ヤギ抗シリアンハムスターIgG抗体(ジャクソン)を二次抗体として添加し、室温で30分反応させた。ベクターステインABCキット(ベクターラボラトリー)を用いて室温で30分間反応後、DAB+基質キット(ダコ)を室温で1から5分間程度反応させ検出を行った。組織はその後、ヘマトキシリン(和光)による核染色を行いカバーガラスと包埋剤でマウントした。マウス脳、肝臓、肺、筋肉の染色像を図3に示す。染色像一覧(図4)に示したように、脳の脈絡叢、肺の血管内皮・平滑筋・肺胞マクロファージ、肝臓の類洞細胞、腎臓の血管内皮・平滑筋・糸球体、胃の平滑筋・粘膜筋板、筋肉の血管内皮・筋繊維芽細胞・リンパ管そして子宮の血管内皮・平滑筋・動脈平滑筋等の細胞でα9インテグリンの発現が見られた。本結果より本発明で見出された抗α9インテグリン抗体は、免疫染色に使用できることが分かり、診断薬としての有用性が期待できる。
[細胞接着阻害効果の検討]
樹立した4種類の抗マウスα9インテグリン抗体が細胞接着阻害活性を有するか調べるために、GRGDS、テネイシンC、SVVYGLRペプチドとマウスα9/NIH3T3細胞を用いて細胞接着阻害試験を行った。GRGDSペプチドに含まれるRGD配列は多くのECMに共通して存在する細胞接着部位である。テネイシンCの細胞接着部位であるAEIDGIELペプチドは、α9インテグリンは接着することができるが、α4インテグリンは接着することができない。ヒトOPNのSVVYGLRペプチドは、α4、α9インテグリンと接着することができる。これら3種類のペプチド固相によるマウスα9/NIH3T3細胞に対する細胞接着におけるそれぞれの抗α9インテグリン抗体の接着阻害能を検討した。
次に図5で阻害効果の見られた11L2B、12C4’58、55A2Cの3種類の阻害効果の比較を行った。AEIDGIELペプチドとSVVYGLRペプチドの固相を5μg/mlで固定し、阻害抗体の濃度を細胞接着阻害試験にて比較検討した。図6に示すように55A2Cが最も阻害能が高いことが分かった。50%阻害濃度(IC50)をも図6に示す。
[競合阻害試験によるエピトープ解析]
実施例5の細胞接着阻害試験により、各抗α9インテグリン抗体の阻害活性に差がある結果が得られている。このことは、これらの抗体はα9インテグリン上のそれぞれ異なるエピトープを認識していることを示唆している。そこで、抗体のビオチン化を行い、競合阻害試験によるエピトープ解析を行った。ビオチン化抗体として12C4’58と18R18Dを用いて、当該2クローンと全クローンとのエピトープの差異を検討した。図7に示したように、両抗体とも、同一クローンによる競合では完全にビオチン化抗体の結合は阻害された。ビオチン化18R18Dを用いた際には、全クローンで阻害することができなかった。一方で12C4’58では55A2Cより一部、結合が阻害されることが分かり、12C4’58と55A2Cでは一部エピトープが重複していることが示唆された。
[培養細胞株におけるα9インテグリンの発現解析]
培養細胞上でのα9インテグリン発現を調べるために、マウスメラノーマ培養細胞であるB16−F1とB16−F10、B16−BL6でFACS解析を行った。その結果、図8に示すように、B16−F1、B16−F10、B16−BL6全ての細胞においてα9インテグリンの発現を確認することができた。
[好中球におけるα9インテグリンの発現解析]
α9インテグリンはヒト好中球において高発現していることが既に報告されている。そこで、マウス好中球上におけるα9インテグリン発現を解析するために、チオグチコレート誘導腹腔細胞を回収しマウス好中球の発現解析に使用した。Mac−1+Gr−1+の細胞を好中球とし、その細胞群におけるα9インテグリンの発現をFACS解析した。図10に示すように、C57BL/6、BALB/c、CBA、C3H全系統マウスでα9インテグリン発現を確認することはできなかった。この結果からマウス好中球上には通常ではα9インテグリンが発現していないことが明らかとなった。
[α4インテグリンとα9インテグリンの発現様式の解析]
α4インテグリンとα9インテグリンは同じインテグリンサブファミリーに属し、多くのリガンドを共有していることから、類似する機能を発揮することが示唆されている。また、マウス肝内白血球中に存在するNKT細胞が、α4とα9インテグリンを同時に発現する事がmRNAレベルの解析によって既に報告されている( Diao H, Kon S, Iwabuchi K, Kimura C, Morimoto J, Ito D, Segawa T, Maeda M, Hamuro J, Nakayama T, Taniguchi M, Yagita H, Van Kaer L, Onoe K, Denhardt D, Rittling S, T. U. 2004. Osteopontin as a mediator of NKT cell function in T cell-mediated liver diseases. Immunity 21: 539-50))。そこで、α4インテグリンとα9インテグリンは同一細胞上に実際に発現しているのかを確認するために、マウス肝浸潤白血球を分離し両インテグリン抗体による二重染色を行った。その結果、図11に示すように、α4インテグリンは全肝内白血球の約39%程度が発現しており、α9インテグリンは全肝浸潤白血球の約12%程度が発現していた。α9インテグリンはα4インテグリン発現細胞の約74%に発現している
ことが分かった。
[OPNのB16−BL6細胞との接着様式の検討]
B16−BL6細胞をはじめ多くの細胞がα4インテグリンとα9インテグリンを同時に発現している。またα4インテグリンとα9インテグリンはOPNやVCAM−1等リガンドを共有していることから、現在臨床応用されつつあるα4インテグリン機能抑制だけでは、その機能がα9インテグリンによりレスキューされてしまうことが予想される。そこで、抗α4インテグリン抗体と抗α9インテグリン抗体の併用によるSVVYGLRペプチドとB16−BL6細胞との接着阻害効果の相乗効果を検討した。
的に疾患治療効果を得ることができることが推察され、新たな治療法となりうる可能性を示すことができた。
[抗α9インテグリン抗体による肝炎治療効果]
これまで我々は、OPN機能阻害により肝炎が治療できることを示している(特許文献1)。そこで、抗α9インテグリン抗体クローン11L2Bおよび抗α4インテグリン抗体R1-2 (Pharmingen)を用いた治療実験を行った。肝炎はコンカナバリンA (ConA)(Vector社) を200μg静脈内投与し、12時間後の血中AST値、ALT値をGPT/ALT−PIIIとGOT/AST−PIII(富士フイルム)を用いて測定した。抗体は、ConAを投与する3時間前に200μgを静脈内投与した。図13に示すように、抗α9インテグリン抗体によりAST値、ALT値の減少が見られ、治療効果を見出すことができた。さらに、その治療効果は抗α4インテグリン抗体との併用により亢進させることができた。抗α9インテグリン抗体により肝炎治療ができることが分かった。
[腱線維芽細胞を用いた抗α9インテグリン抗体によるMMP-13の変化]
マウス膝蓋腱から、腱線維芽細胞を回収しα9インテグリンの発現をFACSと細胞染色により検討した。抗α9インテグリン抗体はクローン18R18D、抗α4インテグリン抗体はR1-2を用いた。図14に示すように腱線維芽細胞にはα9インテグリンが発現していることが分かった。α4インテグリンは発現していなかった。
MMP-13はコラゲナーゼとも呼ばれ、マウスにおけるコラゲナーゼはMMP-13が代表的なMMPであるが、ヒトにおいてはMMP-1やMMP-8, MMP-13が関係している。MMP-13は関節炎(特に関節リウマチ(RA)や変形性関節症(OA))の増悪化に強く関与することが示されている(Skotnicki JS, DiGrandi MJ, Levin JI. Design strategies for the identification of MMP-13 and Tace inhibitors. Curr Opin Drug Discov Devel. (2003) 6:742-59. Review.)。抗α9インテグリン抗体によりMMP-13の転写が抑制できるという本知見から、抗α9インテグリン抗体を用いることにより、関節炎が治療できることが強く示唆できる。
[癌細胞株の増殖における抗α9インテグリン抗体の機能]
図2で示すように、B16-BL6はα9インテグリンが強く発現している。また、MMP-13は癌の増悪に関与している(Ala-aho R, Kahari VM. Collagenases in cancer.Biochimie. (2005) 87:273-86. Review.)という報告もある。そこで、樹立した4種類の抗マウスα9インテグリン抗体の癌細胞の細胞増殖阻害活性をを検討した。細胞培養用の96ウェルプレート(ベクトンアンドディッキンソン)にB16-BL6細胞を10% FCS/DMEMで5x104cells/mLに調製し、抗マウスα9インテグリン抗体、抗マウスα4インテグリン抗体を10μg/mlで添加後、細胞-抗体懸濁液を100μLずつウェルに添加した。37℃、5% CO2存在下で24時間培養し、各ウェルに10μLずつセルカウンティングキット8(同仁化学研究所)を添加し、さらに37℃、5% CO2存在下で1時間培養し、O.D.450の吸光度を計測し細胞数を定量的に解析した。図17に示すように、12C4’58が最も阻害活性が高く、35%程度B16-BL6細胞の増殖を抑制した。55A2CとR1-2も20%程度、増殖を抑制することができた。
[抗ヒトα9インテグリン抗体の機能解析]
抗ヒトα9インテグリン抗体がFACSにて使用可能かをヒトα9/CHO-K1細胞、CHO-K1細胞、内在的にα9インテグリンを発現するヒト好中球を用いて検討した。ヒト好中球はFACSの方法は図2と同様な方法で行ったが、Fc受容体との非特異反応のブロックは、50%ヤギ血清を用いて行った。二次抗体はFITCラベルした抗マウスIgG抗体を使用した。その結果、図19に示すようにすべての抗ヒトα9インテグリン抗体はヒトα9/CHO-K1細胞とヒト好中球上のα9インテグリンを検出することができた。またすべての抗体は、ヒトα4/CHO-K1細胞には反応しなかった。これらの結果から、全ての抗ヒトα9インテグリン抗体が細胞上に発現するヒトα9インテグリンタンパク質をFACSにて検出できることがわかった。
α9インテグリンのリガンドである、OPNとTenascin-C機能ペプチドを用いて、細胞接着試験を行った。細胞は、ヒトα9/CHO-K1細胞を用いて、各種抗α9インテグリン抗体の阻害能の検討を行った。ペプチドは5μg/mlで固相し、抗体は5μg/mlで阻害を行った。図20に示すようにOPNに対する接着阻害試験では、クローン21C5が最も効果的な阻害活性を示した。1K11, 24I11の阻害効果は低かった。一方で、Tenascin-Cに対する接着阻害能は、Y9A2が最も効果的に阻害活性を示した。今回作製した抗α9インテグリン抗体4クローンはTenascin-Cに対してはあまり阻害活性を示さなかった。
既にヒトα9インテグリンに対する中和抗体Y9A2は報告され、Chemicon社から製品化されているが、Y9A2は、ヒトα9インテグリンを遺伝子導入したマウス線維芽細胞株L cellを通常の免疫法(腹腔内投与)で作製している。本発明の抗ヒトα9インテグリン抗体はsubtractive immunization法で作製しており、免疫方法が異なっている。さらに図19で示すように、クローン21C5は、ヒトα9/CHO-K1細胞のFACS図の検出パターンが異なっており、また、図20で示すように、細胞接着試験の阻害効果様式も異なっていることから、今回作製した抗α9インテグリン抗体4クローンはY9A2とはエピトープが異なっていると考えられる。
マウスα9インテグリンの機能を阻害する抗体の作製と疾患・病態におけるα9インテグリンの機能を解明する目的で、マウスα9インテグリンに対する4種のモノクローナル抗体と抗ヒトα9インテグリン抗体を4種類作製した。これらの抗体を用いた研究で以下のことを明らかにすることができた。
(2)抗マウスα9インテグリン抗体クローン12C4'58が免疫染色に利用できることが分かった。
(3)マクロファージ様細胞であるRAW264.7細胞、メラノーマ細胞であるB16−F1、B16−F10、B16−BL6細胞でα9インテグリンは発現していた。マウス好中球ではα9インテグリン発現が観察されず、ヒトで発現が確認できたことから、好中球上のα9インテグリンの発現には種間で差があることが示された。脾細胞のB220-CD3-細胞群やB220+CD3+細胞群において、一部α9インテグリンを発現する細胞群が存在した。また肝臓浸潤白血球のα9インテグリン発現は、α4インテグリン発現細胞上に多く見られた。
(4)α9とα4インテグリンが同時に存在し、両者が認識するリガンドが存在する場合、その接着能は相補的であった。
(5)抗マウスα9インテグリン抗体により、肝炎治療効果を見出すことができ、その効果は抗マウスα4インテグリン抗体により亢進した。
(6)腱線維芽細胞上にα9インテグリンの発現していることが分かり、腱線維芽細胞をトロンビン切断型OPNで刺激すると、MMP-13発現が亢進することが分かった。そのMMP-13亢進は、抗α9インテグリン抗体で阻害がかかることが分かった。
(7)B16-BL6細胞の増殖を抗α9インテグリン抗体で抑制できることが分かった。また、VCAM-1刺激による細胞増殖は、抗α9インテグリン抗体と抗α4インテグリン抗体を同時に併用投与することにより、単独投与を比べ、増殖抑制効果が亢進した。
(8)作製した4種の抗ヒトα9インテグリン抗体は、全てFACS解析に利用可能であり、それぞれ異なる細胞接着阻害能を有した。また、FACSや接着阻害試験により、既存の抗ヒトα9インテグリン抗体Y9A2と異なる反応性を示したことから、エピトープが異なることが考えられた。
Claims (4)
- 受託番号FERM BP−10196、FERM BP−10197、またはFERM BP−10198で標示されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体。
- 受託番号FERM BP−10196、FERM BP−10197、またはFERM BP−10198で標示されるハイブリドーマ細胞。
- 受託番号FERM BP−10197のモノクローナル抗体を含有する、肝炎の予防および/または治療剤である医薬組成物。
- さらに抗α4インテグリン抗体を含有する、請求項3に記載の医薬組成物。
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