KR101604877B1 - 항ａｄａｍ－１５항체 및 그의 이용 - Google Patents

Abstract

[과제] 지금까지의 항암제 개발의 관점과 상이한 관점, 즉, 암세포의 세포-세포간 접착에 초점을 맞춘 암의 치료약을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 발명은, 암세포의 증식, 및 암세포의 세포-세포간 접착을 억제하는, 부작용이 저감된 암의 치료약을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하여, 항암제로서 이용 가능한 항체 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[해결수단] ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 서열 또는 루프영역을 인식하지 않는 항체 등 ADAM-15 및 인테그린 αvβ3 의존성 세포접착을 저해하는 항체 등, ADAM-15 및 인테그린 α9β1 의존성 세포접착을 저해하는 항체 등.

Description

항ＡＤＡＭ－１５항체 및 그의 이용{Anti-ADAM-15 antibodies and utilization of the same}

본 발명은 ADAM-15(A Disintegrin And Metalloprotease)를 특이적으로 인식하는 항체 및 당해 항체의 단편(이하, 총칭하여 「항체 등」이라 한다), 그 항체 등을 코드하는 DNA, 그 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 그 벡터로 형질전환한 세포, 상기 항체 등을 생산하는 세포, 상기 항체 등의 제조방법, 상기 항체 등을 함유하는 의약 조성물, 상기 항체 등을 함유하는 진단약에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 인간 ADAM-15를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체; 상기 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포; 상기 단일클론 항체의 제조방법; 상기 하이브리도마 세포의 제조방법; 상기 항체를 함유하는 치료제; 상기 항체를 함유하는 진단제 등에 관한 것이다.

ADAM은 시스테인 잔기를 많이 포함하는 디스인테그린 도메인과, 금속 프로테아제 유사 도메인을 포함하는 분자로, 금속 프로테아제 활성 뿐 아니라 접착분자활성도 발휘할 수 있는 기능성 단백질인 것으로부터 주목을 모으고 있다. ADAM의 대부분은 막관통 도메인을 가지고 세포막에 국재하여, 세포표면에 있어서의 분자제어에 매우 중요한 역할을 하고 있다. ADAM 패밀리 단백질은, 현재 30종 이상이 동정되어 있고, 그 막외부가 세포접착, 세포융합, 단백질분해, 세포내 시그널전달의 기능을 갖는 것으로부터, 수정, 신경발생, 근아세포융합, 사이토카인이나 다른 막단백질의 막외부의 절단에 관여하고 있다고 생각되고 있다. 특히, ADAM 패밀리 단백질은, 뱀 독 디스인테그린과 구조가 비슷한 막 계류 단백질인 것으로부터, 세포간 및 세포-매트릭스 상호작용에 관여하는 다양한 생물학상의 과정(예를 들면, 수정, 근발생, 및 신경발생 등)에 관계하고 있다. 지금까지, 신규한 ADAM 분자의 탐색과 그의 기능 해명 및 그의 제어방법에 관하여, 창약상의 관점에서 정력적인 연구가 행해져 왔다.

예를 들면, ADAM-1 및 ADAM-2는, 난자의 인테그린을 매개로 함으로써, 난자와 정자의 수정에 관여한다고 생각되고 있다(비특허문헌 1 참조). ADAM-10은 노치 시그널(Notch signal)의 제어에 관여하고, 신경형성에 중요한 역할을 하고 있는 것, 및 막단백의 프로세싱, 더 나아가서는 세포외 매트릭스 성분의 분해에 관여하는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 2 참조). 최근에는, 연골 세포외기질 어그리칸(aggrecan)의 분해효소로 생각되고 있던 어그리카나아제의 1종이 정제, 클로닝되고, 그것이 ADAM 패밀리의 분자인 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3 참조). 따라서, ADAM-10의 효소활성을 제어함으로써, 관절염이나 변형성 관절증의 치료약 개발이 기대된다. ADAM-13은 아프리카발톱개구리에 있어서, 발생기에 발현하여, 그 형태형성에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 4 참조). 현재, 포유동물 유래의 ADAM-13은 보고되어 있지 않다. ADAM-17은 종양괴사인자(TNF)의 전환효소(가용성 TNF의 생성효소)로서 알려져 있다. TNF의 이상 항진에 의해 기인하는 질환(염증, 발열, 순화기계 이상, 이식편대 숙주반응, 자기면역질환 등)의 예방 및/또는 치료약으로서, ADAM-17의 저해제가 정력적으로 연구되고 있다. ADAM-17 그 자체, 및 ADAM-17의 저해제의 스크리닝방법에 대해서는 이미 개시되어 있다(특허문헌 1 및 특허문헌 2 참조).

ADAM-15는 ADAM 패밀리 단백질에 속하는, 분자량 약 90 KDa의 막관통형 당단백질이다. ADAM-15는 그 디스인테그린영역을 매개로, 세포와 세포의 접착에 관여하는 접착분자로서의 기능을 구비하는 것이 명확해져 있다(비특허문헌 5 참조). 20 이상 있는 ADAM 패밀리 단백질 중, 인간 ADAM-15만이 디스인테그린영역에 RGD 트리펩티드 서열을 갖고, 재조합형 인간 ADAM-15와 인테그린 αvβ3와의 특이적인 상호작용은, RGD 서열에 의존하는 것이 시사되어 있다. 또한, ADAM-15는 인테그린(αvβ3, α5β1, αIIβ3, α9β1)과 상호작용하여, 세포-세포간 접착에 관여할 가능성이 시사되고 있다. 또한, 디스인테그린영역의 RGD 서열을 포함하는, 481번째~492번째의 아미노산 서열(RPTRGDCDLPEF)(루프서열)에 있어서의, R481, C487, D488, L489, P490, E491 또는 및 F492가 알라닌으로 치환된 ADAM-15는, α9β1 인테그린과의 상호작용능이 저하된다. 이 사실로부터, ADAM-15에 있어서의 R481, C487, D488, L489, P490, E491 및 또는 F492가, ADAM-15와 α9β1 인테그린의 상호작용에 필요한 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 6 참조).

유전자 재조합 ADAM-15 디스인테그린 도메인을 투여하면, 유방암 세포의 증식이 저해되는 것으로부터, ADAM-15와 인테그린의 상호작용이, 암세포의 증식에 관여하고 있는 것으로 생각된다(비특허문헌 7 참조).

또한, ADAM-15는 세포유주(細胞遊走)에도 관여하는 것으로 생각되고 있다. 예를 들면, ADAM-15를 과잉발현한 NIH3T3 세포에서는, 유주가 저하되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 8 참조). 또한, Jurkat 세포에 ADAM-15를 과잉발현시키면, 세포응집이 증가하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9 참조). 또한, ADAM-15는, 세포접착분자인 VE 카드헤린(cadherin)과 공(共)국재하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10 참조). 이들 사실로부터, ADAM-15는 세포간 접착에 중요한 역할을 갖는 것으로 생각되고 있다.

ADAM-15는 전신의 조직에서 발현되고 있는데, 혈관 내피 세포에서도 발현되고 있어, ADAM-15 녹아웃 마우스에서는, 혈관신생이 억제되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 11 참조). 또한, HUVEC를 VEGF로 자극하면, VEGFR-2와 ADAM-15의 발현이 증가하는 것으로부터, ADAM-15와 혈관신생의 관여가 시사되고 있다(비특허문헌 12 참조).

ADAM-15와의 관여가 보고되어 있는, 세포증식, 세포유주, 세포간 접착, 혈관신생은 각각 암 및 암의 전이와 밀접하게 관계하고 있는 것으로부터, ADAM-15가 암 및 암의 전이와 관여하고 있는 것으로 생각된다.

또한, ADAM-15는 관절류머티즘이나 동맥경화 등에서 발현이 항진되고 있는 것으로부터, 조직수복과정에 관여하는 것으로 생각된다. 또한, ADAM-15는, 심근경색발증 후 조기에 경색부위 및 비경색부위에서 그 발현이 항진되고 있는 것으로부터, 심장에 있어서의 조직수복과정에 관여하는 것으로 생각된다.

그러나, ADAM-15의 구조와 이들 ADAM-15의 다채로운 기능의 관계에 대해서 상세하게 보고된 것은 없어, ADAM-15의 기능이, 어느 구조에 의해 발휘되고 있는지에 대해서는 알려져 있지 않았다.

또한, ADAM-15에 대한 단일클론 항체로서, 예를 들면, R&D사로부터 판매되고 있는 23G9 등이 알려져 있으나, 이들 항체와 ADAM-15의 기능의 관계는 보고되어 있지 않았다. 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하는 항체는, 지금까지 보고되어 있지 않았다.

현재, 암의 치료약으로서 수많은 의약이 알려져 있으나, 그 대부분은 부작용이 강한 것으로부터, 보다 부작용이 저감되면서 치료효과를 갖는 암의 예방약 및/또는 치료약 등의 개발이 요망되고 있다. 지금까지의 항암제는, 암세포에 대해 특이적인 살세포작용 또는 세포증식 억제작용을 구비함으로써, 부작용이 적으며 또한 암을 치료할 수 있는 약제로서 개발되어 왔다. 그러나, 실제로는 많은 이러한 약제가 아직 정상세포에도 작용하여, 심각한 부작용을 초래하고 있었다.

특허문헌 1 : 미국특허 제5830742호

특허문헌 2 : 미국특허 제6013466호

비특허문헌 1 : Almeida, E.A. et al., Cell, 81, 1095-1104, 1995

비특허문헌 2 : Wen, C. et al., Development, 124, 4759-4767, 1997

비특허문헌 3 : Tortorella, M. D. et al., Science, 284, 1664-1666, 1999

비특허문헌 4 : Alfandari, D. et al., Dev.Biol., 182, 314-330, 1997

비특허문헌 5 : Zhang, X.P. et al., J. Biol.Chem. 273, 7345-7350, 1998; Nath, D. et al., J. Cell Sci. 112, 579-587,1999 P.468-473.

비특허문헌 6 : Eto, K. et al. J. Biol. Chem. 277, 17804-17810, 2002

비특허문헌 7 : Trochon-Joseph, V., et al., Cancer Res, 64, 2062-2069, 2004

비특허문헌 8 : Herren, B., et al., Exp Cell Res, 271, 152-160, 2001

비특허문헌 9 : Charrier, L., et al., J Biol Chem, 282, 16948-16958, 2007

비특허문헌 10 : Ham, C., et al., Exp Cell Res, 279, 239-247, 2002

비특허문헌 11 : Horiuchi, K., et al., Mol Cell Biol, 23, 5614-5624, 2003

비특허문헌 12 : Komiya, K., et al., Arthritis Res Ther, 7, R1158-1173, 2005

본 발명은 지금까지의 항암제 개발의 관점과 상이한 관점, 즉, 암세포의 세포-세포간 접착에 초점을 맞춘 암의 치료약을 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 발명은, 암세포의 증식, 및 암세포의 세포-세포간 접착을 억제하는, 부작용이 저감된 암의 치료약을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하여, 항암제로서 이용 가능한 항체 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자 등은, ADAM-15를 인식하는 항체에 대해서, 예의 검토를 행한 결과, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하는 항체에, 암세포 증식 억제작용 및 세포접착 저해작용이 있는 것을 발견하였다. 본 발명자 등은, 당해 항체의 암세포 증식 억제작용 및 세포접착 저해작용이 ADAM-15와 인테그린의 결합에 의해 발휘되는 것으로 생각하고, 추가적으로 연구를 행한 결과, 놀랍게도, 당해 항체는 지금까지 ADAM-15의 인테그린 결합부위로 생각되어 온, 디스인테그린 도메인 중의 RGD 서열, 및 루프서열을 인식하지 않는 것을 발견하였다. 본 발명자 등은, 이들 연구성과로부터, 지금까지 알려져 있던 ADAM-15의 인테그린 결합부위와는 상이한 부위를 인식하는 항체에 암세포 증식 억제작용 및 세포접착 저해작용이 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은, 이하에 기재된 ADAM-15를 특이적으로 인식하는 항체 등, 그 항체 등을 코드하는 DNA, 그 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 그 벡터로 형질전환한 세포, 상기 항체 등을 생산하는 세포, 상기 항체 등의 제조방법, 상기 항체 등을 함유하는 의약 조성물, 상기 항체 등을 함유하는 진단약을 제공한다.

(1) ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 서열을 인식하지 않는 항체 또는 그의 단편.

(2) ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 루프영역을 인식하지 않는 항체 또는 그의 단편.

(3) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 항체 또는 그의 단편으로서, ADAM-15 및 인테그린 αvβ3 의존성 세포접착을 저해하는 항체 또는 그의 단편.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편으로서, ADAM-15 및 인테그린 α9β1 의존성 세포접착을 저해하는 항체 또는 그의 단편.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 단편으로서, 암세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 그의 단편.

(6) 상기 항체가 단일클론 항체인, 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편.

(7) 상기 항체가, 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및/또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편.

(8) 상기 항체가, 수령번호 FERM ABP-10950으로 특정되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체인, 상기 (6)에 기재된 항체 또는 그의 단편.

(9) 상기 항체가 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인, 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편.

(10) 상기 항체 단편이 F(ab')₂, Fab', Fab, 단일쇄 Fv(scFv), 디설피드 결합 Fv(dsFv) 또는 이들의 중합체, 또는 이량체화 V영역(Diabody)인, 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편.

(11) 상기 항체의 단편이 항체의 CDR 서열을 포함하는 펩티드인, 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편.

(12) 상기 CDR 서열이, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 또는 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는, 상기 (11)에 기재된 항체 또는 그의 단편.

(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편을 코드하는 DNA.

(14) 상기 (13)에 기재된 DNA를 함유하는 재조합 벡터.

(15) 상기 (14)에 기재된 제조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 형질전환 세포.

(16) 하이브리도마 세포계인, 상기 (15)에 기재된 세포.

(17) 수령번호 FERM ABP-10950으로 특정되는 하이브리도마 세포계인, 상기 (16)에 기재된 세포.

(18) 상기 (15) 또는 (16)에 기재된 세포를 배양하고, 배양물 중에서 항체 또는 그의 단편을 생성시켜, 배양물로부터 항체 또는 그의 단편을 추출하는 것을 특징으로 하는, 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편의 제조방법.

(19) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편을 유효성분으로서 함유하는, 의약 조성물.

(20) 세포증식, 세포유주, 세포간 접착, 또는, 혈관신생에 기인하는 질환의 치료약 또는 예방약인, 상기 (19)에 기재된 의약 조성물.

(21) 항암제 또는 암 전이 억제제인, 상기 (19)에 기재된 의약 조성물.

(22) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그의 단편을 구비하는 진단약.

(23) 세포증식, 세포유주, 세포간 접착, 또는, 혈관신생에 기인하는 질환의 진단약인, 상기 (22)에 기재된 진단약.

본 발명의 항ADAM-15 항체 등은, 우수한 ADAM-15 기능 억제작용을 나타내는 것으로부터, 세포증식, 세포유주, 세포간 접착, 혈관신생에 기인하는 질환의 치료효과를 나타내는 것으로 생각되고 있다. 따라서, 본 발명의 항체 등은, 암(예를 들면, 암세포의 증식, 전이), 염증성 질환(예를 들면, 관절류머티즘, 변형성 관절증, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화, 다발성 경화증, 염증성 장질환(궤양성 대장염, 크론병 등)), 감염증(예를 들면, 간염), 자기면역질환(예를 들면, 전신성 홍반성 루프스, 다발성 근염, 자기면역성 갑상선 질환, 요세관 간질성 신염, 중증 근무력증) 및 골질환(예를 들면, 골다공증) 등에 대한 치료효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 항체는, 세포나 조직에 있어서의 ADAM-15의 발현을 병리학적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시형태에 의하면, ADAM-15와 결합하는 항체 등으로서, 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 서열을 인식하지 않는 항체 등, 및 ADAM-15와 결합하는 항체 등으로서, 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 루프영역을 인식하지 않는 항체 등이 제공된다.

본 발명의 항체 등은, 본 발명의 항체 등으로서 이용 가능한 한, ADAM-15 이외의 물질로 결합(또는 인식)해도 되나, 바람직하게는, ADAM-15와 특이적으로 결합(또는 인식)하는 항체 등이다. 여기서, 항체가, 어느 한 단백질 또는 그의 단편에 「특이적으로 결합(또는 인식)하는」이란, 그 항체가 다른 아미노산 서열에 대한 그의 친화성보다도, 이들 단백질 또는 그의 단편의 특정 아미노산 서열에 대해 실질적으로 높은 친화성으로 결합하는 것을 의미한다. 여기서, 「실질적으로 높은 친화성」이란, 목적하는 측정장치 또는 방법에 의해, 그 특정 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로부터 구별하여 검출하는 것이 가능한 정도로 높은 친화성을 의미한다. 실질적으로 높은 친화성으로 결합하는 경우의 결합상수(K_a)로서는, 예를 들면, 적어도 10⁷ M^-1이고, 바람직하게는 적어도 10⁸ M^-1이며, 보다 바람직하게는 적어도 10⁹ M^-1이다. 이러한 결합상수로서, 더욱이 보다 바람직하게는, 10¹⁰ M^-1, 10¹¹ M^-1, 10¹² M^-1 또는 그보다 높은, 예를 들면, 10¹³ M^-1 또는 그보다 높은 것이다.

본 발명의 항체 등이 인식하는 ADAM-15로서는, 특별히 한정은 없으나, 바람직하게는 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼, 인간 등의 포유동물의 ADAM-15이고, 보다 바람직하게는 인간 ADAM-15이다. 이들 ADAM-15의 아미노산 서열 및 그것을 코드하는 뉴클레오티드서열의 정보는, GenBank와 같은 유전자서열 데이터베이스로부터 공개 입수 가능하다(예를 들면, GeneID: 8751(Homo sapiens), 11490(Mus musculus), 57025(Rattus norvegicus) 등).

또한, 본 발명의 항체 등이 인식하는 ADAM-15는, ADAM-15와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 여기서 「실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드」란, 천연형의 ADAM-15, 바람직하게는 인간 ADAM-15와 실질적으로 동등한 생물학적 성질을 갖는 폴리펩티드로서, 그 아미노산 서열 중의 복수 개의 아미노산, 바람직하게는 1~10개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1~수 개(예를 들면, 1~5개, 1~4개, 1~3개, 1~2개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입되어 있는 아미노산 서열을 갖는 변이 폴리펩티드, 및 그 천연형 ADAM-15, 바람직하게는 인간 ADAM-15의 아미노산 서열 중에, 복수 개의 아미노산, 바람직하게는 1~10개의 아미노산, 보다 바람직하게는 1~수 개(예를 들면, 1~5개, 1~4개, 1~3개, 1~2개)의 아미노산이 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이 폴리펩티드를 의미한다. 또한, ADAM-15와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 상기의 치환, 결실, 삽입 및 부가 중, 복수의 변이를 갖는 변이 폴리펩티드여도 된다.

또한, 본 발명의 다른 실시형태에 의하면, ADAM-15를 인식하는 항체 등으로서, ADAM-15 및 인테그린 αvβ3 의존성 세포접착을 저해하는 항체 등, 및 ADAM-15 및 인테그린 α9β1 의존성 세포접착을 저해하는 항체 등이 제공된다. ADAM-15와 인테그린은, 동일 세포 표면 상에 발현된 것이어도 되고, 각각 상이한 세포의 표면 상에 발현된 것이어도 되나, 바람직하게는, 각각 상이한 세포의 표면 상에 발현된 것이다.

본 발명의 항체는, 다중클론 항체여도 되고, 단일클론 항체여도 되나, 바람직하게는, 단일클론 항체이다. 본 발명에 있어서, 「단일클론 항체」는, 항원에 대해 고도로 특이적으로, 단일 항원을 인식하는 것이다.

또한, 본 발명의 항체는, 비인간 동물의 항체, 비인간 동물의 항체의 아미노산 서열과 인간 유래의 항체의 아미노산 서열을 갖는 항체, 및 인간 항체를 포함한다. 비인간 동물의 항체로서는, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 개, 원숭이, 양, 염소, 닭, 집오리 등의 항체를 들 수 있고, 바람직하게는, 하이브리도마를 제작할 수 있는 동물의 항체이며, 보다 바람직하게는 마우스의 항체이다. 비인간 동물의 항체의 아미노산 서열과 인간 유래의 항체의 아미노산 서열을 갖는 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체를 들 수 있다. 상기에 있어서, 「키메라 항체」란, 비인간 동물 유래의 항ADAM-15 항체의 정상영역(constant region)을 인간의 항체와 동일한 정상영역을 갖도록 유전자공학적으로 개변한 항체를 말하고, 바람직하게는, 인간·마우스·키메라 항체(유럽특허 공개공보 EP0125023 참조)이다. 「인간화 항체」란, 비인간 동물 유래의 항인간 ADAM-15 항체의 H쇄와 L쇄의 상보인식영역(CDR) 이외의 1차 구조를 인간의 항체에 대응하는 1차 구조로 유전자공학적으로 개변한 항체를 말한다. 여기서, CDR이란, Kabat 등("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E.등, U.S. Department of Health and Human Services, 1983) 또는 Chothia 등(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987)의 정의에 따른 것이다. 「인간 항체」란, 완전히 인간 유래의 항체 유전자의 발현산물인 인간 항체를 말하고, 예를 들면, 인간의 항체 생산에 관여하는 유전자를 도입한 형질전환 동물을 사용하여 제작한 단일클론 항체(유럽특허 공개공보 EP0546073 참조) 등을 들 수 있다. 치료 대상이 인간이고, ADAM-15 항체 생산 동물이 마우스인 경우에는, 바람직하게는 인간·마우스의 키메라 항체 또는 인간화 항체이고, 보다 바람직하게는, 인간 단일클론 항체이다.

본 발명의 항체의 면역글로불린(immunoglobulin) 클래스는 특별히 한정되지 않고, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, IgY 중 어느 면역글로불린 클래스여도 된다. 또한, 본 발명의 항체는 어느 아이소타입의 항체도 포함하는 것이다.

본 발명은 또한, 하나의 실시형태에 있어서, 항ADAM-15 항체의 단편을 제공한다. 여기서, 「항체의 단편」이란, 항체의 일부분(예: 도메인)으로서, 항체의 항원으로의 작용(예: 결합능, 중화능)을 보유·유지(保持)하는 것을 말한다. 이러한 항체의 단편으로서는, 예를 들면, F(ab')₂, Fab', Fab, 단일쇄 Fv(이하, 「scFv」라 한다), 디설피드 결합 Fv(이하, 「dsFv」라 한다) 또는 이들의 중합체, 이량체화 V영역(이하, 「Diabody」라 한다), 또는 CDR을 포함하는 펩티드를 들 수 있다. F(ab')₂는 IgG를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하여 얻어지는 단편 중, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. Fab'는 그 F(ab')의 힌지영역의 디설피드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. sdFv는 하나의 VH와 하나의 VL이 펩티드 링커로 연결된 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드이다. dsFv는 VH 및 VL 중 시스테인 잔기로 치환된 아미노산 잔기가 디설피드 결합을 매개로 결합하고 있는 항원 결합 활성을 갖는 단편이다. Diabody는 scFv가 이량체화된 단편이다. 본 발명의 Diabody는, 단일 특이성 항체(monospecific antibody)여도 되고, 이중 특이성 항체(bispesific antibody)여도 된다. 이량체화되어 있는 scFv는 동일해도 되고, 상이해도 된다.

본 발명의 항체의 단편으로서는, 또한, 항ADAM-15 항체의 일부를 포함하는 펩티드가 포함된다. 여기서, 「항체의 일부를 포함하는 펩티드」란, 항체를 구성하는 아미노산 서열의 일부의 아미노산 서열을 구비하는 펩티드로서, 항체의 항원으로의 작용(예: 결합능, 중화능)을 보유·유지하는 것을 말한다. 항체의 일부를 포함하는 펩티드는, 그 항체에 유래하지 않는 아미노산 서열을 포함하고 있어도 된다. 항ADAM-15 항체의 일부를 포함하는 펩티드로서, 바람직하게는 항ADAM-15 항체의 CDR 서열을 포함하는 펩티드이다. 여기서, CDR 서열을 포함하는 펩티드란, 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3로부터 선택되는 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 말한다. 항ADAM-15 항체의 일부를 포함하는 펩티드로서, 보다 바람직하게는, 중쇄 가변 영역의 CDR3 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다.

본 발명의 항ADAM-15 항체의 대표예의 중쇄 및 경쇄는, 각각 서열번호 12 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 본 발명의 항ADAM-15 항체의 대표예의 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3는, 각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17, 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 항체는, ADAM-15의 기능을 저해하는 것으로부터, ADAM-15 관련 질환의 치료약 및 예방약으로서 사용할 수 있다. 여기서, 「ADAM-15 관련 질환」이란, 세포증식, 세포유주, 세포침윤, 세포간 접착, 또는 혈관신생에 기인하는 질환을 말하고, 이러한 질환으로서는, 예를 들면, 암(식도암, 갑상선암, 방광암, 대장암, 위암, 췌장암, 흉부암, 간장암, 폐암, 유방암, 신경아세포종, 신경교아종, 자궁암, 난소암, 전립선암, 빌름스종양) 및 그의 전이, 자궁내막증 등의 세포증식 또는 혈관신생에 기인하는 질환; 관절염, 감염증(간염 등), 기관지천식, 섬유증, 자기면역질환(예를 들면 전신성 홍반성 루프스(SLE), 다발성 근염(PM), 자기면역성 갑상선 질환, 요세관 간질성 신염, 중증 근무력증(EAMG), 장기 특이적 자기면역질환 등), 류머티스성 관절염(만성 관절류머티즘(RA), 변형성 관절증(OA)), 다발성 경화증(재발 완화형 다발성 경화증 등), 염증성 장염(궤양성 대장염, 크론병 등), 진행성 전신성 경화증(PSS), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 피부근염(DM), 결절성 동맥주위염(PN), 갑상선 질환(바세도우병 등), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 원발성 담즙성 간경변(PBC), 돌발성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역 용혈성 빈혈, 근위축성 측색경화증(ALS), I형 당뇨병, 이식시의 거부반응, 수술 후의 유착, 자궁내막증, 건선, 낭창, 알레르기, 천식, 호중구 기능 이상 등의 염증성 질환 또는 세포유주에 기인하는 질환; 혈관 재건술 후 재협착, 심장 관동맥 혈관 폐색성 질환, 뇌혈관 폐색성 질환, 신혈관 폐색성 질환, 말초혈관 폐색성 질환, 동맥경화, 뇌경색 등의 혈관 폐색성 질환 또는 혈관 내막 비후에 기인하는 질환을 들 수 있다. 본 발명의 ADAM-15 관련 질환으로서, 바람직하게는 암이다.

본 발명의 항체는, ADAM-15 관련 질환의 진단약으로서 사용할 수 있다. 진단약으로서 사용하는 경우, 사용하는 항체 또는 그의 단편은, ADAM-15를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 단편인 것이 바람직하다.

1. 항ADAM-15 항체 제작

본 발명의 항체는, 예를 들면, ADAM-15, 또는 ADAM-15의 일부를 갖는 펩티드를, 필요에 따라 면역부활제(예를 들면, 광유 또는 알루미늄 침전물과 가열 사균 또는 리포다당체, 프로인트 완전 애쥬번트, 또는 프로인트 불완전 애쥬번트 등)와 함께, 비인간 포유동물 또는 조류에 면역함으로써 제작할 수 있다.

면역원으로서 사용하는 ADAM-15는, 바람직하게는 포유동물의 ADAM-15이고, 특히 바람직하게는 인간 ADAM-15이다. 본 발명에 있어서 항원으로서 사용하는 ADAM-15는, (1) 인간이나 기타 포유동물의 ADAM-15를 발현하는 모든 세포, 또는 그들의 세포가 존재하는 모든 조직에 유래하는 단백질, (2) ADAM-15를 코드하는 유전자 DNA, 바람직하게는 cDNA를 세균, 효모, 동물세포 등의 세포주에 도입, 발현시킨 재조합 단백질, 또는 (3) 합성 단백질로서 얻을 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 항체의 제작에 사용하는 면역원은, ADAM-15를 코드하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등에 도입하고, 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항체의 제작에 사용하는 면역원으로서, ADAM-15를 세포막 상에 과잉발현시킨 세포 자체를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 제작에 사용하는 면역원으로서, ADAM-15를 발현한 세포의 막 분획 등을 사용하는 것도 가능하다. ADAM-15를 세포막 상에 과잉발현시킨 세포는, ADAM-15를 코드하는 유전자(예를 들면, cDNA)를 공지의 유전자공학기술을 사용하여 클로닝하고, ADAM-15를 세포막 상에 과잉발현함으로써 얻을 수 있다. 또한, ADAM-15를 세포막 상에 과잉발현시킨 세포의 막 분획은, ADAM-15를 발현시킨 세포(바람직하게는, 과잉발현시킨 세포)를 파괴하고 그 막 분획을 추출함으로써 얻을 수 있다.

면역원으로서, ADAM-15의 일부를 갖는 펩티드를 사용하는 경우에는, 이들 펩티드를 코드하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등에 도입하고, 발현시킴으로써 면역원을 얻을 수 있다. ADAM-15의 일부를 갖는 펩티드로서, 바람직하게는 ADAM-15의 루프영역을 포함하는 펩티드이다.

또한, ADAM-15 또는 ADAM-15의 일부를 갖는 펩티드는, Fmoc법 또는 Boc법 등을 사용하여 화학합성에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, ADAM-15 또는 ADAM-15의 일부를 갖는 펩티드의 C 말단의 아미노산을 폴리스티렌 담체에 고정화하고, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc기) 또는 tert-부톡시카르보닐기(Boc기)로 보호된 아미노산을, 디이소프로필카르보디이미드(DIC) 등의 축합제를 사용하여 반응시킴으로써 결합시키고, 세정, 탈보호의 공정을 반복함으로써, 목적하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.

또한, ADAM-15 또는 ADAM-15의 일부를 갖는 펩티드는, 자동 펩티드 합성기를 사용하여 합성하는 것도 가능하다. 이러한 펩티드 합성기로서는, 예를 들면, PSSM-8(시마즈제작소): 모델 433A 펩티드 신세사이저(어플라이드 바이오시스템즈사(Applied Biosystems, Inc.)); ACT396Apex(어드밴스드 켐텍사(Advanced ChemTech Inc.)) 등을 들 수 있다.

또한, ADAM-15와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 제조방법으로서는, 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오티드 부위 돌연변이 도입법(gapped duplex법), 아질산 또는 아황산처리에 의해 랜덤으로 점 돌연변이를 도입하는 방법, Ba131 효소 등에 의해 결실 변이체를 제작하는 방법, 카세트 변이법, 링커 스캐닝법, 미스인코포레이션법, 미스매치 프라이머법, DNA 세그먼트 합성법 등을 들 수 있다.

면역원은 면역되는 동물에 대해 투여에 의해 항체 생산이 가능한 부위에 단독 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여시에는, 항체 생산능을 높이기 위해, 완전 프로인트 애쥬번트나 불완전 프로인트 애쥬번트를 투여해도 된다.

면역동물로서는, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 개, 원숭이, 양, 염소, 닭, 집오리 등의 하이브리도마를 제작하는 것이 가능한 동물이라면 특별히 한정은 없으나, 바람직하게는, 마우스 또는 랫트이고, 보다 바람직하게는 마우스이다.

동물로의 면역원의 투여는, 예를 들면, 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피내 주사, 근육내 주사 또는 족척(足蹠) 주사에 의해 행할 수 있는데, 바람직하게는, 피하 주사 또는 복강내 주사이다. 사용하는 면역원의 양은, 항체를 생산할 수 있는 양이라면 특별히 한정은 없으나, 바람직하게는 0.1~1000 ㎍이고, 보다 바람직하게는 1~500 ㎍이며, 보다 더욱 바람직하게는 10~100 ㎍이다. 면역은 1회 또는 적당한 간격을 두고 수회 행할 수 있다. 통상 1~6주 간격으로 1회의 면역을 합계 2~10회 정도 행하고, 바람직하게는 1~5주간에 1회의 면역을 합계 2~5회 행하며, 보다 바람직하게는 3주간에 1회의 면역을 합계 3회 행한다. 마지막 면역으로부터 1~2주간 후에, 면역한 동물의 안와 또는 꼬리정맥으로부터 채혈을 행하고, 그 혈청을 사용하여 항체가의 측정을 행한다. 항체가의 측정은, 당업자에게 주지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 방사성 동위원소 면역정량법(RIA법), 고상효소 면역정량법(ELISA법), 형광항체법, 수신 혈구응집 반응법을 들 수 있고, 바람직하게는, ELISA법이다. 본 발명의 항체는 충분한 항체가를 나타내는 동물의 혈청으로부터 정제함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 단일클론 항체는, 상기 방법에 의해 면역한 면역감작 동물로부터 얻은 항체 생산 세포와, 골수종계 세포(미엘로마 세포)를 융합함으로써 얻어지는 하이브리도마를 배양함으로써 얻을 수 있다. 당해 융합방법으로서는, 예를 들면, 밀스테인 등의 방법(Galfre, G. & Milstein,C.,Methods Enzymol.73:3-46,1981)을 들 수 있다.

사용하는 항체 생산 세포는, 상기 방법에 의해 면역하여 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 마우스 또는 랫트의 비장, 췌장, 림프절, 말초혈로부터 채취할 수 있고, 바람직하게는, 비장으로부터 채취한다.

사용하는 골수종계 세포는, 예를 들면, 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 토끼 또는 인간 등의 포유동물에 유래하는 세포로서, 인 비트로(in vitro)에서 증식 가능한 세포라면 특별히 한정은 없다. 이러한 세포로서는, 예를 들면, P3-X63Ag8(X63)(Nature, 256, 495, 1975), P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)(Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976), P3X63Ag8U1(P3U1)(Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978), P3X63Ag8.653(653)(J. Immunol., 123, 1548, 1979), Sp2/0-Ag14(Sp2/O)(Nature, 276, 269, 1978), Sp2/O/FO-2(FO-2)(J. Immunol. Methods, 35, 1, 1980) 등을 들 수 있고, 바람직하게는, 항체 생산 세포와 동종 동물 유래의 세포이며, 보다 바람직하게는, 항체 생산 세포와 동계통의 동물 유래의 세포이다. 예를 들면, 마우스 유래의 골수종계 세포로서, 바람직하게는 P3U1 또는 P3X63-Ag8-653이다. 미엘로마 세포는 동결보존하거나, 말, 토끼 또는 소태아혈청을 첨가한 일반적인 배지에서 계대하여 유지할 수 있다. 또한, 세포융합에 사용되는 골수종계 세포로서는, 대수증식기의 세포가 바람직하다.

항체 생산 세포와 미엘로마 세포를 융합시켜서 하이브리도마를 형성시키는 방법으로서는, 폴리에틸렌글리콜(이하, 「PEG」라 한다) 등을 사용하는 방법(PEG법), 센다이 바이러스를 사용하는 방법, 전기융합장치를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

예를 들면, PEG법의 경우, 전술한 방법에 따라 얻어진 항체 생산 세포 및 골수종 세포를, 배지, PBS(Phosphate Buffered Saline) 등으로 세정 후, 30~60%의 PEG(평균분자량 1000~6000) 등의 세포응집성 매체를 포함하는 적당한 배지 또는 완충액 중에서, 비장세포와 골수종 세포를 1:2~10:1(바람직하게는, 5:1~10:1)의 혼합비로 현탁하고, 온도 약 25~37℃, pH 6~8의 조건하에서, 약 30초~3분간 정도 반응시킨다(Elsevier Publishing, 1988), 반응종료 후, PEG 용액을 제거하고 배지에 재현탁하여, 셀 웰 플레이트 중에 파종하고 배양을 계속한다.

단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별은, 공지 또는 그에 준하는 방법에 따라 행할 수 있다. 통상, HAT(히포크산틴(Hypoxanthine)-아미노프테린(aminopterin)-티미딘(thymidine))를 첨가한 동물세포용 배지에서 선택적으로 증식시킴으로써, 하이브리도마 세포의 선별을 행할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로서는, 하이브리도마 세포를 생육할 수 있는 것이라면 어떠한 배지를 사용해도 된다. 예를 들면, 1~20%, 바람직하게는 10~20%의 소태아혈청을 포함하는 RPMI 1640 배지, 1~10%의 소태아혈청을 포함하는 GIT 배지(와코순약공업(주)) 또는 하이브리도마 배양용 무혈청배지(SFM-101, 닛스이제약(주)) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는, 통상 20~40℃, 바람직하게는 약 37℃이다. 배양시간은, 통상 5일~3주간, 바람직하게는 1주간~2주간이다. 배양은 통상 5% CO₂하에서 행할 수 있다.

배양 후, 배양상청을 채취하고, ELISA 등에 의해, 항원 단백질에 결합하고, 비항원 단백질에 결합하지 않는 샘플을 선택한다. 예를 들면, 「신임상 면역실험 조작법」(part 3)(과학평론사, 1997)에 기재된 세포 ELISA법을 사용하여 확인 및 스크리닝을 행할 수 있다. 이러한 클론으로부터 한계희석법을 1~5회, 바람직하게는 2~4회 반복함으로써 단일 세포화를 행하여, 안정하게 높은 항체가를 나타내는 세포를 선택할 수 있다.

본 발명의 단일클론 항체는, 전술한 방법에 의해 얻어진 하이브리도마를 인 비트로에서 배양하고, 배양액을 정제함으로써 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 단일클론 항체는, 사전에 프리스탄을 복강 내에 투여한 동계 동물 또는 면역 불완전 동물에 하이브리도마를 이식한 후, 복수화(腹水化)시켜, 채취한 복수를 정제하는 것으로도 얻을 수 있다.

얻어진 항체는, 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등의 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적절히 선택, 조합시킴으로써, 항체를 분리, 정제할 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 친화성 크로마토그래피를 사용하는 칼럼으로서는, 예를 들면, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F.(Amersham Biosciences)를 들 수 있다. 또한, IgY 및 IgM의 경우에는, 메르캅토피리딘을 리간드로 한 칼럼을 사용할 수 있다. 또한, 항체의 클래스에 상관없이, ADAM-15 고상화 칼럼, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 상호작용 크로마토그래피 등을 사용하는 것도 가능하다. 단일클론 항체의 정제는, 예를 들면, 원심분리 후, 프로테인 A 칼럼 또는 프로테인 G 칼럼 등을 사용하여 IgG 분획을 회수함으로써 행할 수 있다.

2. 인간형 키메라 항체·인간화 항체·인간 항체의 제작

(1) 인간형 키메라 항체

본 발명의 인간형 키메라 항체는, ADAM-15와 결합하고, ADAM-15의 기능을 저해하는 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 VH 및 VL을 코드하는 DNA를 조제하고, 이것을 인간 유래 면역글로불린의 정상영역 cDNA와 결합하여 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주세포에 당해 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다(Morrison, S.L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984).

비인간 동물 유래 단일클론 항체의 VH 및 VL을 코드하는 DNA는, 예를 들면, 다음의 방법에 의해 얻을 수 있다. 당해 단일클론 항체를 생산하는 동물 B세포로부터 mRNA를 추출한다. mRNA의 추출은, 당업자에게 주지의 방법으로 행할 수 있고, 예를 들면, 구아니딘-초원심법(Chirgwin, J. M. 등, Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979), AGPC법(Chomczynski, P 등, Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987) 등에 의해 RNA를 조제한 후, mRNA 퓨리피케이션 키트(Purification Kit)(파마시아사제, 다카라바이오사제) 등에 의해 정제함으로써 행할 수 있다. 추출한 mRNA로부터 올리고 dT 프라이머를 사용함으로써 cDNA를 제작하여 벡터에 삽입한다. 벡터에 삽입한 cDNA 중에서, 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 일부를 프로브로서 사용하여, 비인간 동물 유래 단일클론 항체를 코드하고 있는 cDNA를 단리한다. 단리된 cDNA의 염기서열을 결정함으로써, 목적의 VH 및 VL을 코드하는 DNA 서열을 얻을 수 있다.

또한, 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 VH 및 VL을 코드하는 DNA를 얻는 다른 방법으로서, 다음의 방법을 들 수 있다. 전술한 방법으로 얻어진 cDNA를, VH 또는 VL을 증폭 가능한 프라이머(예를 들면, 비인간 동물로서, 마우스를 이용하는 경우, 마우스 H쇄 정상영역(C영역)과 하이브리다이즈하는 프라이머 및 마우스 L쇄 γ쇄 정상영역의 보존서열과 하이브리다이즈하는 프라이머 등(R. Orlandi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833, 1989))을 사용하여 PCR법으로 증폭함으로써, 또는, 단일클론 항체를 생산하는 동물 B세포로부터 mRNA를 추출하고, 당해 VH 또는 VL을 증폭 가능한 프라이머를 사용하여 RT-PCR법으로 당해 VH 또는 VL을 증폭시킨다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적의 DNA 단편을 추출한다. 목적의 DNA 단편의 추출은, 예를 들면, 아가로오스 겔 전기영동 후에 목적의 DNA의 사이즈를 나타내는 밴드를 잘라내고, 당해 겔 절편으로부터 DNA를 추출함으로써 행할 수 있다. 당해 벡터 및 추출한 DNA를 제한효소로 처리한 후, 추출한 DNA를 벡터에 삽입하고, 삽입된 DNA가 코드하는 DNA 서열을 결정함으로써, 목적의 VH 및 VL을 코드하는 DNA 서열을 얻을 수 있다.

인간형 키메라 항체의 인간 항체 CH 및 CL로서는, 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들면, 인간 γ1, γ2의 CH 및 인간 κ의 CL을 들 수 있다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 유전자로서는, 염색체 DNA 또는 cDNA를 사용할 수 있다. 전술한 방법에 의해 얻어진 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 VH 및 VL을 코드하는 DNA는, 예를 들면, 각각 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA와 결합하여, 동물세포용 발현 벡터에 삽입함으로써, 본 발명의 키메라 항체를 발현하는 벡터를 제작할 수 있다.

인간형 키메라 항체의 발현에 사용하는 인핸서 및 프로모터로서는, 면역글로불린 유전자 자신의 인핸서 및 프로모터 또는 비면역글로불린용 인핸서 및 프로모터를 들 수 있다. 예를 들면, 비인간 동물로서 마우스를 사용하는 경우, 면역글로불린 유전자의 발현 조절기구는 마우스와 인간에서 공통인 것으로부터, J 유전자와 C 유전자 사이에 존재하는 마우스 또는 인간의 인핸서 서열을 포함하는 형태로 재조합 DNA를 제작하는 것도 가능하다.

동물세포용 발현 벡터로서는, 예를 들면, pSV2-gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209, 1422, 1980)를 사용할 수 있다. 전술한 방법에 의해 제작한 본 발명의 인간형 키메라 항체의 H쇄 및 L쇄를 코드하는 유전자는, 동일 벡터에 삽입되어 있어도 되고, 상이한 벡터에 삽입되어 있어도 된다.

(2) 인간화 항체

본 발명의 인간화 항체는, ADAM-15와 결합하여, ADAM-15의 활성을 저해하는 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코드하는 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임워크 영역(FR)에 이식한 V영역을 코드하는 DNA를 구축하고, 구축한 DNA를 인간 유래 면역글로불린의 정상영역 cDNA와 결합하여 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주세포에 당해 벡터를 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다(L. Rieohmann 등, Nature, 332, 323, 1988; Kettleborough, C. A. 등, Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., Immunol. Today., 21, 397-402, 2000 참조).

비인간 동물 유래 단일클론 항체의 CDR은, 전술한 방법에 의해 얻어진 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 VH 및 VL을 코드하는 DNA 서열로부터 예측되는 아미노산 서열과, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열과 비교하여, 각 CDR의 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 기지의 항체의 아미노산 서열은, 예를 들면, 프로테인·데이터·뱅크 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 항체의 아미노산 서열로부터 얻을 수 있다.

또한, 인간 항체의 FR로서는, 이식 후의 항체가 본 발명의 효과를 나타내는 것이라면 특별히 한정은 없으나, 바람직하게는, 인간화 항체의 V영역이 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 V영역과 유사한 입체구조로 되는 인간 항체의 FR, 또는 사용하는 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 FR의 아미노산 서열과 상동성이 높은 인간 항체 FR이다. 선택한 인간 항체의 FR을 갖는 인간화 항체의 V영역이, 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 V영역과 유사한 입체구조가 될 수 있는지 여부는, 예를 들면, 선택한 인간 항체의 FR을 포함하는 V영역의 DNA 서열 정보를 토대로 컴퓨터 모델링에 의해 입체구조를 예측하고, 사용한 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 V영역의 입체구조와의 비교를 행함으로써 판단할 수 있다. 사용하는 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 FR의 아미노산 서열은, 전술한 방법에 의해 얻어진 VH 및 VL을 코드하는 DNA 서열로부터 예측되는 아미노산 서열 및 CDR의 아미노산 서열의 정보로부터 얻을 수 있다. 또한, 인간화 항체의 V영역이 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 V영역과 유사한 입체구조가 되는 인간 항체의 FR, 또는 사용하는 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 FR의 아미노산 서열과 상동성이 높은 인간 항체 FR로 하기 위해, 얻어진 인간 항체의 FR의 아미노산 서열에 적절히 변이를 도입하는 것도 가능하다.

사용하는 인간화 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열은, 비인간 동물 유래 단일클론 항체의 CDR의 아미노산 서열과 인간 항체의 FR의 아미노산 서열을 결합한 아미노산 서열에 대응하는 DNA 서열로서 설계한다. 인간화 항체의 V영역을 코드하는 DNA는, 설계한 DNA 서열을 토대로, 당업자에게 주지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 설계한 DNA를 토대로 100 bp 전후의 길이의 DNA 단편을 합성 DNA로서 화학합성하고, 당해 DNA 단편을 PCR로 증폭함으로써 얻을 수 있다. 또한, 당해 100 bp 전후의 DNA 단편을 리가아제 등의 효소를 사용하여 결합시키고, 설계된 인간화 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열의 양 말단의 서열을 코드하는 프라이머를 사용하여 PCR을 행해, 목적하는 길이의 DNA 단편을 추출하는 것으로도 얻을 수 있다. 또한, PCR을 사용하는 인간화 항체의 V영역을 코드하는 DNA는, CDR 그래프팅으로서 알려지는 방법으로도 얻을 수 있다. 또한, 사용하는 인간화 항체의 V영역을 코드하는 DNA는, 부위 특이적 변위에 의해 CDR을 코드하는 DNA를 인간 항체의 V영역의 DNA에 삽입하는 것으로도 얻을 수 있다. 부위 특이적 변이는, 예를 들면 진 테일러 사이트 다이렉티드 뮤타제네시스 시스템(Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System)(인비트로젠사), 트랜스포머(Transformer) 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(클론테크사), 사이트 다이렉티드 뮤타제네시스 시스템(Site-Directed Mutagenesis System)(다카라바이오사) 등을 사용하여, 당해 키트의 설명에 따름으로써 행할 수 있다.

인간화 항체의 인간 항체 CH 및 CL로서는, 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 사용할 수 있다. 예를 들면, 인간 γ1, γ2의 CH 및 인간 κ의 CL을 들 수 있다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 유전자로서는, 염색체 DNA 또는 cDNA를 사용할 수 있다. 전술한 방법에 의해 얻어진 인간화 항체의 V영역을 코드하는 DNA는, 예를 들면, 각각 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA와 결합하고, 동물세포용 발현 벡터에 삽입함으로써, 본 발명의 인간화 항체를 발현하는 벡터를 제작할 수 있다.

인간화 항체의 발현에 사용하는 인핸서 및 프로모터로서는, 면역글로불린 유전자 자신의 인핸서 및 프로모터 또는 비면역글로불린용 인핸서 및 프로모터를 들 수 있다. 예를 들면, 비인간 동물로서 마우스를 사용하는 경우, 면역글로불린 유전자의 발현 조절기구는 마우스와 인간에서 공통인 것으로부터, J 유전자와 C 유전자 사이에 존재하는 마우스 또는 인간의 인핸서 서열을 포함하는 형태로 재조합 DNA를 제작하는 것도 가능하다.

동물세포용 발현 벡터로서는, 예를 들면, pSV2-gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209, 1422, 1980)를 사용할 수 있다. 전술한 방법에 의해 제작한 본 발명의 인간화 항체의 H쇄 및 L쇄를 코드하는 유전자는, 동일 벡터에 삽입되어 있어도 되고, 상이한 벡터에 삽입되어 있어도 된다.

또한, 전술한 인간형 키메라 항체, 인간화 항체의 제작에 있어서 사용되는, 비인간 동물 유래 단일클론 항체는, ADAM-15와 결합하여, ADAM-15의 활성을 저해하는 항체라면 특별히 한정은 없으나, 바람직하게는 마우스 단일클론 항체이다.

(3) 인간 항체

인간 항체는, 예를 들면, 인간 항체 파지 라이브러리 또는 인간 항체 생산 형질 전환 마우스를 이용함으로써 얻을 수 있다(도미츠카 등, Nature Genet., 15, 146-156(1997)).

인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B세포 유래의 각종 서열을 갖는 항체 유전자풀로부터 VH 유전자 및 VL 유전자를 파지 유전자에 도입함으로써, 인간 항체의 Fab 또는 scFv 등을 융합 단백질로서 표면에 제시시킨 파지의 라이브러리이다. 이러한 인간 항체 파지 라이브러리로서는, 정상의 인간이 갖는 항체의 VH 유전자 및 VL 유전자를 말초혈 림프구 등으로부터 RT-PCR에 의해 증폭하고, 라이브리러화함으로써 얻어진 나이브·비면역 라이브러리(캠브리지 안티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology)사; 메디컬 리서치 카운실(Medical Research Council);다이악스(Dyax)사 등), 인간 B세포 내의 기능적인 특정 항체 유전자를 선택하고, V유전자 단편의 CDR3 영역 등의 항원 결합 영역의 부분을 적당한 길이의 랜덤한 아미노산 서열을 코드하는 올리고뉴클레오티드에 의해 치환하여, 라이브러리화한 합성 라이브러리(바이오인벤트(BioInvent)사; 크루셀(Crucell)사; 모르포시스(Morphosys)사), 및 암, 자기면역질환 또는 감염증 환자, 또는, 대상 항원을 백신으로서 접종한 사람의 림프구로부터 제작한 라이브러리인, 면역 라이브러리를 들 수 있다.

예를 들면, 나이브 인간 항체 파지 라이브러리는, 이하의 방법에 의해 제작할 수 있다. 사람의 말초혈로부터 mRNA를 조제하고, 면역글로불린의 γ, μ, κ, λ쇄의 정상영역에 특이적인 프라이머를 사용하여, V유전자의 cDNA를 합성하고, 각 V유전자를 V유전자 패밀리에 특이적인 DNA 프라이머의 세트를 사용하여 합성해서, 그들을 (Gly4Ser)₃ 등의 링커 펩티드를 코드하는 링커 DNA를 사용하여 PCR에 의해 연결하고, scFV유전자를 합성한다. 합성한 scFV유전자를, 양측에 벡터 도입용 제한효소 사이트를 사용하여, pCANTAb5E 등의 파지미드 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 대장균으로 형질전환하여, 헬퍼 파지에 의한 레스큐를 행한다.

인간 항체 파지 라이브러리를 이용하는 경우, 예를 들면, 표적이 되는 ADAM-15를 고상에 고정화하고, 파지 항체 라이브러리를 반응시켜서, 비결합의 파지를 세정 제거한 후, 결합한 파지를 회수함으로써, 목적하는 클론을 얻을 수 있다(패닝). 또한, 얻어진 파지를 증폭시키고, 증폭시킨 라이브러리에 대해서 추가적으로 패닝을 반복해서 행함으로써, 얻어진 클론의 정도(精度)를 올릴 수 있다. 얻어진 클론의 VH 유전자 및 VL 유전자를 해석함으로써, 이들 유전자 서열을 갖는 완전한 인간 항체를 제작하는 것도 가능하다.

인간 항체 생산 형질전환 마우스는, 내인성 면역글로불린(Ig) 유전자를 녹 아웃한 마우스에 인간 항체의 Ig 유전자를 도입한 마우스이다. 인간 항체 생산 형질전환 마우스는, 예를 들면, 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 인간-마우스 하이브리드 세포를 48시간 콜세미드(방추사 형성 저해제) 처리함으로써, 1~수 개의 염색체가 핵막에 싸인 구조체인, 마이크로셀을 형성한다. 사이토칼라신 B 존재하에서 단리된 마이크로셀을 염색체 수용세포(마우스 ES 세포)와 폴리에틸렌글리콜에 의해 융합하고, 마이크로셀 하이브리드 ES 세포를 제작하여, 마우스 배(胚)로 주입한다.

인간 항체 생산 형질전환 마우스를 면역동물로 하여, 전술한 항 ADAM-15 항체 제작방법에 준하여 항원을 면역함으로써, 항 ADAM-15 인간 항체를 얻을 수 있다.

3. 항체 단편의 제작

본 발명의 항체의 단편(F(ab')₂, Fab', Fab, scFv, dsFv 또는 이들의 중합체, Diabody, 또는 CDR을 포함하는 펩티드)은, 이하의 방법에 의해 제작할 수 있다.

본 발명의 F(ab')₂ 단편은, 본 발명의 ADAM-15에 결합하는 IgG 항체를 단백질 분해효소 펩신으로 처리하고, H쇄의 234번째의 아미노산 잔기로 절단함으로써, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편으로서 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 F(ab')₂ 단편은, 후술하는 Fab'를 티오에테르 결합 또는 디설피드 결합시킴으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 Fab' 단편은, 전술한 방법에 의해 얻어진 본 발명의 ADAM-15에 결합하는 F(ab')₂를 환원제인 디티오트레이톨 처리하여 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 Fab' 단편은, 본 발명의 ADAM-15에 결합하는 항체의 Fab'를 코드하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 숙주세포에 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 Fab 단편은, 본 발명의 ADAM-15에 결합하는 항체를 단백질 분해효소 파파인으로 처리하고, H쇄의 224번째의 아미노산 잔기로 절단함으로써, H쇄의 N말단측의 약 절반의 영역과 L쇄의 전체 영역이 디설피드 결합에 의해 결합된 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편으로서 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 Fab 단편은, 본 발명의 ADAM-15에 결합하는 항체의 Fab를 코드하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 숙주세포에 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 scFv는, 본 발명의 ADAM-15에 결합하는 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 취득하고, 이들 유전자 사이에 링커 서열을 코드하는 DNA를 삽입하며, scFv를 코드하는 DNA를 구축하여, 당해 DNA를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 숙주세포에 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 링커의 길이는, VH와 VL이 회합할 수 있는 길이라면 특별히 한정은 없으나, 바람직하게는 10~20 잔기이고, 보다 바람직하게는 15 잔기이다. 또한, 링커의 서열은, VH와 VL의 2개의 도메인의 폴리펩티드 사슬의 폴딩을 저해하지 않는 것이라면 특별히 한정은 없으나, 바람직하게는, 글리신 및/또는 세린으로 되는 링커이고, 보다 바람직하게는 GGGGS(G:글리신, S:세린) 또는 그의 반복서열이다.

본 발명의 dsFv는, VH 및 VL 중의 각각 1 아미노산 잔기를 부위 특이적 돌연변이에 의해 시스테인 잔기로 치환하고, VH 및 VL을 당해 시스테인 잔기간 디설피드 결합으로 결합시킴으로써 얻을 수 있다. 치환하는 아미노산은, 입체구조에 입각하여 항원 결합에 영향이 없는 아미노산 잔기라면 특별히 한정은 없다.

본 발명의 Diabody는, 전술한 scFv를 코드하는 DNA에 있어서, 링커의 아미노산 서열이 8 잔기 이하(바람직하게는 5 잔기)가 되도록 구축하여, 당해 DNA를 발혀 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 숙주세포에 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다. 이중 특이적(bispecific) Diabody는, 상이한 2종류의 scFv의 VH 및 VL의 DNA를 조합시켜서 scFv를 제작함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의, CDR을 포함하는 펩티드는, 본 발명의 ADAM-15에 결합하는 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 구축하여, 당해 DNA를 발현 벡터에 삽입하고, 당해 벡터를 숙주세포에 도입하여 발현시킴으로써 얻을 수 있다.

4. ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 서열을 인식하지 않는 항체 등의 선택

본 발명의 ADAM-15에 결합하는 항체 등은, 전술한 방법에 의해 얻어진 항체 등 중, 목적하는 에피토프를 인식하는 항체 등을 선택함으로써 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 ADAM-15를 인식하는 항체 등은, 전술한 항 ADAM-15 항체 제작방법에 있어서, 항원으로서 목적하는 에피토프 서열(바람직하게는, 디스인테그린 도메인 서열)을 갖는 펩티드를 투여함으로써 얻을 수 있다.

ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하는 항체 등은, 당업자에게 주지의 방법에 의해 선택함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하는 항체 등은, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 펩티드와, 상기 방법에 의해 얻어진 항체 등과의 결합 활성을 측정하여, 결합 활성이 높은 항체 등을 선택함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 항ADAM-15 항체 등과 ADAM-15의 디스인테그린 도메인의 결합에 있어서의 결합상수(K_a)로서는, 예를 들면, 적어도 10⁷M^-1이고, 바람직하게는 적어도 10⁸M^-1이며, 보다 바람직하게는 적어도 10⁹M^-1이다. 이러한 결합상수로서, 더욱 보다 바람직하게는 10¹⁰M^-1, 10¹¹M^-1, 10¹²M^-1 또는 그것보다 높은, 예를 들면, 10¹³M^-1 또는 그것보다 높은 것이다. 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하는 항체 등은, ADAM-15를 구성하는 아미노산 중, ADAM-15의 디스인테그린 도메인에 알라닌 돌연변이(mutation)를 도입한 전장 ADAM-15 변이체 또는 ADAM-15 변이체 단편을 제작하여, 당해 변이체 등과 상기 방법에 의해 얻어진 항체 등과의 결합 활성을 측정하여, 당해 항체 등과 전장 ADAM-15 또는 ADAM-15 단편과의 결합 활성과 비교하여, 변이체와의 결합 활성이 낮은 항체 등을 선택함으로써 얻을 수 있다.

ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한 ADAM-15의 디스인테그린 내의 RGD 서열을 인식하지 않는 항체 등은, 상기 방법에 의해 얻어진 ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하는 항체 등 중에서, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 서열을 인식하지 않는 항체 등을 당업자에게 주지의 방법으로 선택함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한 ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 서열을 인식하지 않는 항체 등은, ADAM-15를 구성하는 아미노산 중, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 서열의 적어도 1 아미노산에 알라닌 돌연변이를 도입한 전장 ADAM-15 변이체 또는 ADAM-15 변이체 단편을 제작하고, 당해 변이체 등과 얻어진 항체 등의 결합 활성을 측정하여, 전장 ADAM-15 또는 ADAM-15 단편과의 결합 활성과 비교해서, 결합 활성이 변화되지 않는 항체 등을 선택함으로써 얻을 수 있다.

5. ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한 ADAM-15 디스인테그린 도메인 내의 루프영역을 인식하지 않는 항체의 선택

ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한 ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 루프영역을 인식하지 않는 항체 등은, 상기 방법에 의해 얻어진 DAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하는 항체 등 중에서, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 루프영역을 인식하지 않는 항체 등을 당업자에게 주지의 방법에 의해 선택함으로써 얻을 수 있다. 예를 들면, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한 ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 루프영역을 인식하지 않는 항체 등은, ADAM-15를 구성하는 아미노산 중, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 루프영역의 적어도 1 아미노산 내에 알라닌-돌연변이를 도입한 전장 ADAM-15 변이체 또는 ADAM-15 변이체 단편을 제작하고, 당해 변이체 등과 얻어진 항체 등의 결합 활성을 측정하여, 전장 ADAM-15 또는 ADAM-15 단편과의 결합 활성과 비교해서, 결합 활성이 변화되지 않는 항체 등을 선택함으로써 얻을 수 있다.

얻어진 항체와 ADAM-15 또는 그의 단편 또는 그들의 변이체의 결합은, 당업자에게 주지의 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 방법으로서, 예를 들면, 웨스턴 블로팅, X선 결정해석 외에, 비아코아 시스템(비아코아사)을 들 수 있다.

6. ADAM-15 및 인테그린 αvβ3 의존성 세포접착의 저해활성 측정

얻어진 항체가 ADAM-15 및 인테그린 αvβ3 의존성 세포접착을 저해하는지 여부는, 예를 들면, 얻어진 항체의 존재하/비존재하에 있어서의, ADAM-15 재조합 단백질을 고상화한 플레이트로의, 인테그린 αvβ3 발현세포의 결합을 비교함으로써 조사할 수 있다. 대조로서 항인테그린 αvβ3 항체의 존재하/비존재하에 있어서의, ADAM-15 재조합 단백질을 고상화한 플레이트로의, 인테그린 αvβ3 발현세포의 결합을 측정함으로써, 측정하고 있는 세포접착이, 인테그린 αvβ3 의존성 세포접착인지 여부를 알 수 있다.

7. ADAM-15 및 인테그린 α9β1 의존성 세포접착

얻어진 항체가 ADAM-15 및 인테그린 αvβ3 의존성 세포접착을 저해하는지 여부는, 예를 들면, 얻어진 항체의 존재하/비존재하에 있어서의, ADAM-15 재조합 단백질을 고상화한 플레이트로의, 인테그린 α9β1 발현세포의 결합을 비교함으로써 조사할 수 있다. 대조로서 항인테그린 α9β1 항체의 존재하/비존재하에 있어서의, ADAM-15 재조합 단백질을 고상화한 플레이트로의, 인테그린 α9β1 발현세포의 결합을 측정함으로써, 측정하고 있는 세포접착이, 인테그린 α9β1 의존성 세포접착인지 여부를 알 수 있다.

5. 의약 조성물

얻어진 항체 등은, ADAM-15와 인테그린의 결합을 저해함으로써, 정보의 세포 내 시그널 전달을 차단할 수 있는 것으로부터, 이러한 시그널이 관여하는 질환의 치료약으로서 사용할 수 있다. ADAM-15와 인테그린을 발현하고 있는 세포나 암세포를 사용하여, 얻어진 항체 등의 존재하에서의 결합 저해를 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 관찰함으로써, 본 발명의 항체 등의 대상질환을 발견할 수 있다.

본 발명의 항체 등(특히, 단일클론 항체)을 유효성분으로 하는 제제는, 암(식도암, 갑상선암, 방광암, 대장암, 위암, 췌장암, 흉부암, 간장암, 폐암, 유방암, 신경아세포종, 신경교아종, 자궁암, 난소암, 전립선암, 빌름스종양) 및 그의 전이, 자궁내막증 등의 세포증식 또는 혈관신생에 기인하는 질환; 관절염, 감염증(간염 등), 기관지천식, 섬유증, 자기면역질환(예를 들면 전신성 홍반성 루프스(SLE), 다발성 근염(PM), 자기면역성 갑상선 질환, 요세관 간질성 신염, 중증 근무력증(EAMG), 장기 특이적 자기면역질환 등), 류머티스성 관절염(만성 관절류머티즘(RA), 변형성 관절증(OA)), 다발성 경화증(재발 완화형 다발성 경화증 등), 염증성 장염(궤양성 대장염, 크론병 등), 진행성 전신성 경화증(PSS), 쇼그렌 증후군, 피부근염(DM), 결절성 동맥주위염(PN), 갑상선 질환(바세도우병 등), 길랭-바레 증후군, 원발성 담즙성 간경변(PBC), 돌발성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역 용혈성 빈혈, 근위축성 측색경화증(ALS), I형 당뇨병, 이식시의 거부반응, 수술 후의 유착, 자궁내막증, 건선, 낭창, 알레르기, 천식, 호중구 기능 이상 등의 염증성 질환 또는 세포유주에 기인하는 질환; 혈관 재건술 후 재협착, 심장 관동맥 혈관 폐색성 질환, 뇌혈관 폐색성 질환, 신혈관 폐색성 질환, 말초혈관 폐색성 질환, 동맥경화, 뇌경색 등의 혈관 폐색성 질환 또는 혈관 내막 비후에 기인하는 질환 등의 치료제(therapeutic agent) 또는 예방제(prophylactic agent)로서 사용할 수 있다.

상기 방법에 의해 얻어진 항체 등은, 필요에 따라 정제한 후, 통상의 방법에 따라 제제화하여, 각종 질환 등의 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 항체를 의약으로서 사용하는 경우, 투여부위로서는, 경구 투여, 구강내 투여, 기도내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 혈관내(정맥내) 투여 등을 들 수 있다. 본 발명의 항체는, 단독으로 투여되어도 되고, 약사상 및 약리학적으로 허용되는 담체(「의약품 첨가물 사전」약사일보사,「Handbook of Pharmaceutical Excipients」APhA Publications사 참조), 희석제 또는 첨가제 등을 사용한 의약 조성물로서 투여되어도 된다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은, 비경구 투여 또는 경구에 적합한 제형으로서 제공된다.

비경구 투여를 위한 조성물로서는, 예를 들면, 주사제, 점비제, 좌제, 첩부제, 연고 등을 들 수 있다. 주사제는, 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등의 제형을 포함한다. 이러한 주사제는, 공지의 방법에 따라, 예를 들면, 상기 항체 등을 통상 주사제에 사용되는 무균의 수성 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제할 수 있다. 주사용 수성액으로서는, 예를 들면, 생리식염수, 포도당, 자당, 만니톨, 기타 보조약을 포함하는 등장액 등을 사용할 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면, 알코올(예, 에탄올), 폴리알코올(예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온 계면활성제[예, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, HCO-5-(polyoxyethylene(50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)] 등과 병용할 수 있다. 유성액으로서는, 예를 들면, 참기름, 대두유 등을 사용할 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질, 벤질알코올 등과 병용할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플, 바이알, 시린지에 충전된다. 직장 투여에 사용되는 좌제는, 상기 항체를 통상의 점비약용 기제, 좌약용 기제에 혼합함으로써 조제된다. 또한, 상기 항체를 적당한 부형제를 첨가함으로써, 동결건조제제를 조제하고, 사용시, 주사용수, 생리식염수 등으로 용해하여 주사액으로 하는 것도 가능하다. 또한, 일반적으로 항체 등의 단백질의 경구 투여는 소화기에 의해 분해되기 때문에 곤란해지나, 항체 단편이나 수식한 항체 단편과 제형의 창의 고안에 의해, 경구 투여의 가능성도 있다. 경구 투여의 제제로서는, 예를 들면, 캡슐제, 정제, 시럽제, 과립제 등을 들 수 있다.

상기 비경구용 의약 조성물은, 활성성분의 투여량에 적합한 투약 단위의 제형으로 조제되는 것이 적합하다. 이러한 투약 단위의 제형으로서는, 주사제(앰플, 바이알, 프리필드·시린지), 점비제, 좌제 등이 예시되고, 각각의 투약단위 제형당 통상 5~500 ㎎, 바람직하게는 주사제에서는 5~100 ㎎, 기타 제형에서는 10~250 ㎎의 상기 항체 등이 함유되어 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 투여대상, 대상질환, 증상, 투여 루트 등에 따라 적절히 선택할 수 있으나, 예를 들면, 암환자의 예방 및/또는 치료를 위해 사용하는 경우에는, 본 발명의 항체를 1회량으로 하여, 통상 0.01~20 ㎎/㎏ 체중 정도, 바람직하게는 0.1~10 ㎎/㎏ 체중 정도, 더욱 바람직하게는 0.1~5 ㎎/㎏ 체중 정도를, 1월 1~10회 정도, 바람직하게는 1월 1~5회 정도, 정맥 주사에 의해 투여하는 것이 매우 적합하다. 다른 비경구 투여 및 경구 투여의 경우도 이것에 준한 양을 투여할 수 있다. 증상이 특히 심한 경우에는, 그 증상에 따라 증량 또는 투여횟수를 증가시켜도 된다.

6. 진단약

본 발명의 항체 등은, ADAM-15를 특이적으로 인식할 수 있기 때문에, 피검액 중의 ADAM-15의 정량에 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 등을 구비하는 진단약은, 염증성 질환, 예를 들면 류머티스관절염, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 암 전이, 동맥경화, 다발성 경화증, 육아종 등의 진단제, 또한 장기이식 후의 만성 거부반응 억제, 전신성 자기면역질환·홍반성 루프스·포도막염·베체트병·다발성 근염·사상체 증식성 신염·우육종증(sarcoidosis) 등의 자기면역질환의 진단제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 진단약은, 항체 분자를 사용한 공지의 방법을 토대로 할 수 있다. 이러한 방법으로서는, 예를 들면, ELISA(Catty, Raykundalia, 1989), 방사면역측정법(radioimmunoassay)(Catty, Murphy, 1989), 면역조직화학적방법(Heider 등, 1993), 이뮤노메트릭법, 또는 웨스턴 블롯 등을 들 수 있다. 본 발명의 진단약의 검체로서는, 예를 들면, 생검으로서 피험자로부터 채취한 조직시료 또는 액체를 사용할 수 있다. 사용되는 생검은, ADAM-15의 면역학적 측정의 대상이 되는 것이라면 특별히 한정은 없고, 예를 들면, 조직, 혈액, 뇨, 장액(漿液), 수액(髓液), 관절액, 안방수(眼房水), 누액, 타액 또는 그들의 분획물 또는 처리물을 들 수 있다. 본 발명의 진단약에 의한 분석은, 정성적, 정량적 또는 반정량적으로 행할 수 있다.

얻어진 항체를 진단약으로서 사용하기 위해, 예를 들면, 공지의 방법 또는 시판의 키트를 사용함으로써 각종 표지화(예를 들면, 비오틴 표지, FITC 표지, APC 표지)할 수 있다. 이러한 표지로서, 바람직하게는 Biotin Labeling Kit(도진화학)를 사용한 비오틴 표지이다.

이들 개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 측정방법에 적용하는데 있어서는, 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요로 하지 않는다. 각각의 방법에 있어서의 통상의 조건, 조작법에 당업자의 통상의 기술적 배려를 더하여 측정계를 구축하면 된다. 이들 일반적인 기술수단의 상세에 대해서는, 총설, 서적 등을 참조할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명의 항체 등을 사용함으로써, ADAM-15를 감도 좋게 정량할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 등을 사용하는, 생체 내에서의 ADAM-15의 정량법을 이용함으로써, ADAM-15 관련 각종 질환의 예지, 유무, 정도, 예후, 의약품의 효과 등을 진단할 수 있다. 예를 들면, ADAM-15의 농도의 증감이 검출된 경우는, ADAM-15 관련 질환, 예를 들면 염증성 질환일 가능성이 높거나 또는 장래 이환(罹患)할 가능성이 높다고 진단할 수 있다.

기타, 본 발명의 항체 등은, ADAM-15를 정제하기 위해 사용하는 항체 칼럼의 제작, 정제시의 각 분획에 포함되는 ADAM-15의 검출, 피검세포 내에 있어서의 ADAM-15의 거동 분석 등에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 실시예를 나타내나, 본 발명은 이것에 한정되는 것은 아니다.

이하의 실시예에 있어서 특별히 언급하지 않는 경우, 세포배양용 배지로서는 다음의 배지를 사용하였다. CHO-K1 세포를 배양하는 경우, 5% FCS 함유 D-MEM Ham's F-12 배지(Wako);인간 α9 integrin 항상적으로 발현시킨 CHO 세포(ha9/CHO)를 배양하는 경우, 600 ㎍/㎖ G418, 5% FCS 함유 D-MEM Ham's F-12 배지;인간 신장암 세포주(NRC-12) 및 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S:435S)를 배양하는 경우, 10% FCS 함유 TIL 배지(IBL);COS-7 세포를 배양하는 경우, 10% FCS 함유 D-MEM(Wako)배지.

실시예

(실시예 1) 인간 α9 인테그린 항상적 발현주의 제작

인간 α9 인테그린 유전자는 G361 세포로부터 추출한 토탈 RNA로부터, ReverTraAce(TOYOBO)를 사용하여 합성한 cDNA를 주형으로 PCR을 행함으로써 클로닝하였다. 인간 α9 인테그린 유전자의 클로닝은 5'측 단편과 3'측 단편으로 분할하여, 이하의 프라이머를 사용해서 행하였다.

인간 α9 인테그린 유전자 5'측 단편

센스 프라이머:5'-TTTTAAGCTTGCCACCATGGGCGGCCCGGCTG-3'(서열번호:1)

안티센스 프라이머:5'-AAACTGCAGTCCGGAGCACTGGATTTATCTTCT-3'(서열번호:2)

인간 α9 인테그린 유전자 3'측 단편

센스 프라이머:5'-AAATCCGGATGTTTGGTCCATATC-3'(서열번호:3)

안티센스 프라이머:5'-AAATCTAGATCACTGGTTTTTCTGGACCCAGTC-3'(서열번호:4)

인간 α9 인테그린 유전자 5'측 단편의 PCR 산물은 HindIII와 PstI를, 3'측 단편의 PCR 산물은 EcoRV를 사용하여 37℃에서 1시간, 제한효소 처리하여, 각각을 pBluescript SK(+)벡터(Stratagene)에 삽입하고, 플라스미드 추출을 행하였다(5'측 단편:α9F/pBS, 3'측 단편:α9R/pBS). 각각의 플라스미드를 AccIII와 XbaI를 사용하여 37℃에서 1시간, 제한효소 처리하였다. α9 단편을 정제하여, α9F/pBS의 AccIII, XbaI 부위에 도입하였다. 이 플라스미드를 HindIII와 XbaI로 제한효소 처리함으로써 인서트 부위를 잘라내고, pcDNA3.1(+)벡터(Invitrogen)에 도입하였다(α9/pcDNA3.1(+)).

α9/pcDNA3.1(+)를 Lipofectamine-2000(Invitrogen)을 사용하여 CHO-K1 세포에 유전자 도입하고, Geneticin G418(Invitrogen)이 600 ㎍/㎖가 되도록 조정한 10% FCS(SIGMA-Aedrich) 함유 DMEM Ham's F-12(WAKO)에 의해 약제 내성 세포를 선별하였다. 선별된 세포는 플로우 사이토메트리에 의해 스크리닝을 하고, 한계희석을 반복함으로써 인간 α9 인테그린을 항상적으로 발현하는 CHO-K1 세포를 수립하였다(이하, 「hα9/CHO 세포」라 한다).

(실시예 2) 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인/pGEX-6P-1의 제작

인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인의 DNA 사슬을 PCR법으로 복제하였다. HUVEC의 cDNA 1 μL를 주형으로 하고, 각각 0.5 μL의 100 μM 센스 프라이머와 100 μM 안티센스 프라이머, 8 μL의 2.5 mM dNTP mix, 0.5 μL의 EX-Tag 폴리머라아제(2.5 U/100 μL: Takara), 10 μL의 10×PCR 버퍼를 79.5 μL의 초순수에 첨가하고, PCR 반응액을 조정하였다. 서멀 사이클러를 사용하여, 94℃에서 5분을 1사이클, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분을 35사이클, 72℃에서 5분을 1사이클로 PCR 반응을 행하였다. 사용한 프라이머는 이하와 같다.

센스 프라이머:5'-CCTATGGCTGCTTTCTGC-3'(서열번호:5)

안티센스 프라이머:5'-CATGCACACAGCTTGCCC-3'(서열번호:6)

PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 목적의 밴드를 잘라내, DNA 정제 키트(Wizard SV Gel and PCR Clearn-up System:PROMEGA)를 사용해서 정제하였다. 제작한 DNA 사슬을 TA 클로닝에 의해 복제하였다. TA 클로닝의 방법은 이하와 같다. 1 μL의 PCR 산물, 0.5 μL의 pCRII-TOPO 벡터(Invitrogen), 1 μL의 salt solution(Invitrogen)을, 3.5 μL의 멸균수에 첨가하고, 반응액을 조정하여, 실온에서 5분 정치한 후에, JM-109로 형질전환하였다. 이와 같이 제작한, 인간 ADAM-15 disintegrin domain/TOPO를 주형으로 하고, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인의 DNA 사슬에 BamHI/XhoI 부위를 부가하였다. 0.5 μL의 주형 DNA, 각각 0.2 μL의 100 μM 센스 프라이머와 100 μM 안티센스 프라이머, 8 μL의 2.5 mM dNTP mix, 0.5 μL의 EX-Tag 폴리머라아제(2.5 U/100 μL:Takara), 10 μL의 10×PCR 버퍼를, 80.6 μL의 초순수에 첨가하고, PCR 반응액을 조정하였다. 서멀 사이클러를 사용하여, 94℃에서 5분을 1사이클, 94℃에서 1분, 53℃에서 1분, 72℃에서 30초를 35사이클, 72℃에서 5분을 1사이클로 PCR 반응을 행하였다. 사용한 프라이머는 이하와 같다.

센스 프라이머:5'-AAGGATCCGCTGCTTTCTGCGGA-3'(서열번호:7)

안티센스 프라이머:5'-ATTCTCGAGATCCCCTAGGCTGACAT-3'(서열번호:8)

PCR 산물을 2% 아가로오스 겔로 전기영동하고, 목적의 밴드를 잘라내, DNA 정제 키트(Wizard SV Gel and PCR Clearn-up System:PROMEGA)를 사용하여 정제하였다. 제작한 DNA 사슬을 BamHI/XhoI로 제한효소 처리한 pGEX-6P-1 벡터에 삽입하였다. 이것을 JM-109로 형질전환하고, 복제하였다. 그 후, midi prep 키트(QIAGEN)를 사용하여 정제하였다.

(실시예 3) 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인-GST 단백질의 제작

실시예 2에서 제작한, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인/pGEX-6P-1을 JM-109로 형질전환하고, 암피실린(SIGMA-Ardrich)을 첨가한 LB 배지에서 증식시켜, 대수 증식기에 200 μM IPTG(Amersham Bioscience)를 첨가함으로써 GST 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 대장균을 회수 후, NETN-150 버퍼(50mM Tris pH7.2, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 0.5% NP-40)에 현탁하고, 소니케이션을 걸음으로써 단백질을 추출하였다. 원심 후, 그 상청을 글루타티온 세파로오스 비즈 4B(Amersham Bioscience)에 첨가하고, 4℃에서 2시간 전도혼화(轉倒混和)하였다. 비즈를 NETN-100 버퍼(50mM Tris pH7.2, 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5%NP-40)로 세정하고, 환원형 글루타티온용액(100mM Tris pH8.8, 20mM Reduced Glutathione(Wako))으로 용출하여, 이것을 GST 융합 단백질로 하였다. 또한, GST를 절단한 단백질을 제작할 때에는, 대장균에서 발현시킨 단백질을 글루타티온 세파로오스 비즈에 흡착시킬 때까지는 동일한 방법으로 행하고, 비즈를 NETN-100 버퍼로 세정한 후에, prescission protease(Amersham Bioscience)를 사용하여 효소처리함으로써 GST를 절단하였다.

(실시예 4) 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단백질(RAA 치환체)의 제작

인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인에 있어서의 RGD 서열을 RAA 서열로 치환한 단백질(이하, 「인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단백질(RAA 치환체)」라 한다)은, 다음의 방법에 의해 제작하였다. 실시예 2에서 제작한, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인/pGEX-6P-1을 주형으로 하여 각각 1.25 μL의, 100 ㎍/㎖의 센스 프라이머와 100 ㎍/㎖의 안티센스 프라이머, 1 μL의 2.5 mM dNTP mix, 1 μL의 pfu turbo 폴리머라아제(2.5 U/μL), 5 μL의 10×PCR 버퍼를, 40.4 μL의 초순수에 첨가하고, PCR 반응을 조정하였다. 서멀 사이클러를 사용하여, 95℃에서 30초를 1사이클, 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 5분 30초를 18사이클, 72℃에서 7분을 1사이클로 PCR 반응을 행하였다. 사용한 프라이머는 이하와 같다.

센스 프라이머:5'-CAGTGTCCTACCAGAGCTGCTTGTGACTTGCCTG-3'(서열번호:9)

안티센스 프라이머:5'-CAGGCAAGTCACAAGCAGCTCTGGTAGGACGACACTG-3(서열번호:10)

그 후, QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Invitrogen)의 매뉴얼에 따라, DpnI로 제한효소 처리하고, pGEX-6P-1 벡터에 삽입하였다. 이것을 JM-109로 형질전환하고, 복제하였다. 그 후, midi prep 키트(QIAGEN)를 사용하여 정제하였다. 그 후, 실시예 3과 동일한 방법에 의해 GST 융합 단백질을 제작하고, GST를 prescission protease로 효소처리함으로써 GST를 제거한 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단백질(RAA 치환체)을 제작하였다.

(실시예 5) 항인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단일클론 항체(8F7)의 제작

실시예 3에서 제작한, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인-GST 단백질을 BALB/c 마우스(암컷, 7주령: SAMKYO LABO SERVICE CORPORATION)에 합계 4회 면역하였다. 초회는 100 ㎍의 단백질을 완전 프로인트 애쥬번트(SIGMA)로 유화하고, 이후는 50 ㎍의 단백질을 불완전 프로인트 애쥬번트(SIGMA)로 유화하여, 마우스에 면역하였다. 4회 면역 후, 마우스로부터 채혈하고, 그 혈청을 사용하여 항체가 측정을 ELISA에 의해 행하였다. 그 후, 50 ㎍의 단백질을 PBS에 용해하여, 추가 면역하였다.

면역 후, 마우스로부터 비장을 적출하고, 비장세포와 X63-Ag8-653 미엘로마 세포를, 폴리에틸렌글리콜(IBL)을 사용하여 세포융합시켰다. 그 후, HAT 배지에서 선택배양하여, 하이브리도마의 콜로니 형성이 확인된 후에, 그 배양상청을 사용하여 항원 단백질에 대한 결합성을 ELISA법에 의해 스크리닝하였다. ELISA법에 있어서는, 항원으로서 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인-GST 단백질을 각 웰에 50 ng 고상에 고정하고, 1차 항체로서 2배 희석한 하이브리도마의 배양상청을 사용하였다. 양성 콜로니를 2회, 한계희석함으로써 단일 클론을 얻었다. 얻어진 클론의 배양상청을 항원 칼럼으로 정제하여, 단일클론 항체(클론명:8F7, 이하, 「8F7」이라 한다)를 수립하였다. 이 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 수령번호 FERM ABP-10950(수탁번호 FERM BP-10950)으로서, 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6(우편번호 305-8566), 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 2008년 2월 13일자로 기탁되어 있다.

제작한 8F7의 항원 특이성을 ELISA법으로 확인하였다. ELISA법에 있어서는, GST, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인-GST 단백질, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 루프영역-GST 단백질, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단백질, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단백질(RAA 치환체), 및 마우스 오스테오폰틴 N-하프-GST 단백질을 각각 10 ㎍/㎖로부터 단계 희석하여 고상에 고정하고, 1차 항체로서 0.1 ㎍/㎖로 조정한 8F7을 사용하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. ELISA법에 의한 검토에서는, GST에 교차반응을 나타내나, 그 반응은 미약하다. 한편, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인-GST에 대한 반응이 강한 것이 확인되었다. 또한, 디스인테그린 도메인 내에서도, 인테그린과의 접착에 필요하다고 여겨지는 루프영역(이하, 「루프영역」이라 한다)에 대해서는, 결합하지 않는 것이 나타내어졌다.

또한, 제작한 8F7의 항원 특이성을 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 인간 ADAM-15/pOTB7(Invitrogen으로부터 구입)을 XhoI와 BamHI로 제한효소 처리하고, 마찬가지로 제한효소 처리한 pcDNA 3.1(+)벡터(Invitrogen)로 재조합하였다. 이것을 JM-109로 형질전환하고, 복제하였다. 그 후, midi prep 키트(QIAGEN)를 사용하여 정제함으로써, 인간 ADAM-15/pcDNA 3.1(+)를 얻었다. COS-7 세포를 6 ㎝ 배양 플레이트에서 80% 컨플루언트까지 배양하고, 4 ㎍의 인간 ADAM-15/pcDNA 3.1(+)와 20 μL의 Lipofectamine-2000(Invitrogen)을 첨가한 3 ㎖의 OPTI-MEM 배지(GIBCO)를 사용하여 37℃에서 6시간 배양하였다. 그 후, 3 ㎖의 10% FCS 함유 DMEM 배지로 교환하고, 37℃에서 48시간 배양함으로써, 인간 ADAM-15 도입 COS-7 세포를 얻었다.

제작한 ADAM-15를 일과성으로 과잉발현시킨 COS-7 세포, 및 유전자를 도입하지 않은 COS-7 세포를, 프로테아제 인히비터(complete mini:Roche) 함유 LIPA 버퍼로 용해하고, 세포용해액을 10% SDS로 전기영동하여, PVDF막(MILLIPORE)에 전사하였다. 전사한 PVDV막을 5% 스킴밀크/TBS-T에 의해 실온에서 1시간 블로킹반응을 행한 후에, TBS-T로 3회 세정하여, 실시예 5에서 제작한 8F7(0.5 ㎍/㎖)을 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. TBS-T로 3회 세정하고, 10000배 희석한 2차 항체(anti-mouse IgG HRP 표지:Jackson immunoresearch)를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. TBS-T로 3회 세정하여, ECL용액(GE imaginationwork)을 실온에서 5분간 반응시키고, 암실에서 필름으로 전사하여, 현상하였다.

결과를 도 2에 나타낸다. 웨스턴 블롯에 의한 검토에서는, 인간 ADAM-15를 일과성으로 과잉발현시킨 COS-7의 세포용해액만으로 밴드가 검출된 것으로부터, 8F7이 인간 ADAM-15를 특이적으로 인식하고 있는 것이 나타내어졌다.

(실시예 6) 항ADAM-15 단일클론 항체 23G9과 8F7의 결합 활성 비교

상기 ELISA법과 동일한 방법에 의해 시판되고 있는 항ADAM-15 단일클론 항체인, 23G9(R&D사)과 8F7의 결합 활성을 비교하였다.

결과를 도 3에 나타낸다. 8F7은 ADAM-15의 디스인테그린 도메인에 대해, RGD 서열 비의존적으로 높은 결합 활성을 나타내었다. 한편으로, 23G9은, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인(d.d.) 및 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인-GST 단백질(d.d.-GST)에 대한 결합 활성이, GST에 대한 결합 활성보다도 낮은 것으로부터, ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고 있지 않은 것이 나타내어졌다. 따라서, 8F7은 지금까지 알려져 있던 항ADAM-15 항체와는 다른 결합부위에 결합함으로써, 지금까지 발견되지 않은 ADAM-15를 저해하는 것에 의한 각종 기능을 구비하는 것이 시사되었다.

(실시예 7) hα9/CHO 세포를 사용한 세포접착 및 세포접착 저해시험

GST를 제거한 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 재조합 단백질, 또는 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단백질(RAA 치환체)을, PBS로 0~5 ㎍/mL로 조제하여, 96 웰 플레이트의 각 웰에 50 μL씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하여, 고상화시켰다. 그 후, 0.5% BSA/PBS를 각 웰에 200 μL씩 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트함으로써 블로킹반응을 행하였다. PBS로 세정 후, 실시예 1에서 제작한 hα9/CHO 세포, 또는 비유전자 도입 CHO-K1 세포를 0.25% BSA 함유 배지(D-MEM Ham's F-12)에서 1×10⁵ cells/㎖로 조제하여, 각 웰에 200 μL씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하여 고상에 고정화시킨 단백질에 접착시켰다. 그 후, 사전에 37℃로 데워 둔 PBS로 세정하여, 접착되지 않은 세포를 제거하였다. 크리스탈 바이올릿을 각 웰에 50 μL씩 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이트함으로써, 세포를 고정, 염색하였다. 수돗물로 세정 후, 20% 초산수를 각 웰에 100 μL씩 첨가하고, 세포를 용해 후, 플레이트 리더로 590 nm의 흡광도를 측정하였다.

세포접착시험과 동일한 방법으로 GST를 제거한 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 재조합 단백질(2.5 ㎍/㎖로 조제)을 고상화시켜, 블로킹반응을 행하였다. ADAM-15를 저해하는 것에 의한 세포접착 저해활성시험에 있어서는, 고상화한 단백질에 농도를 0~10 ㎍/㎖까지 단계 희석시킨 8F7을 첨가하였다. 37℃에서 20분간 인큐베이트하고, 세포를 접착시켰다. 그 후, 세포접착시험과 동일한 방법으로 세포접착을 검토하였다.

hα9/CHO 세포, 및 비유전자 도입 CHO-K1 세포(대조)의, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인(이하, 「d.d.」라 한다), 및 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인(RAA 치환체)(이하, 「d.d.-RAA」라 한다)에 대한 접착시험의 결과를 도 4A에 나타낸다. hα9/CHO 세포는, d.d.를 고상화한 경우, 그 고상화 농도 의존적으로 세포접착활성이 높아졌다. 또한, hα9/CHO 세포는, d.d.-RAA를 고상화한 경우에도, d.d.를 고상화한 경우와 거의 동등한 세포접착활성을 나타내는 것으로부터, hα9/CHO 세포와 d.d.의 상호작용은, d.d.의 RGD 서열에 비의존성인 것이 나타내어졌다. 여기서, CHO-K1 세포는 내재적으로 αvβ1 인테그린, αvβ5 인테그린, α5β1 인테그린 등 RGD 서열에 결합하는 인테그린을 발현하고 있다(Eto, K., Huet, C., Tarui, T., Kupriyanov, S., Liu, H. Z., Puzon-McLaughlin, W., Zhang, X. P., Sheppard, D., Engvall, E., and Takada, Y. Functional classification of ADAMs based on a conserved motif for binding to integrin alpha 9beta 1: implications for sperm-egg binding and other cell interactions. J Biol Chem, 277: 17804-17810, 2002.). 따라서, CHO-K1 세포의 d.d. 또는 d.d.-RAA 고상화 표면으로의 세포접착이 이들 인테그린에 의한 것인지 여부에 대해서 검토하였다. 그 결과, 비유전자 도입 CHO-K1 세포는, d.d. 및 d.d.-RAA의 고상화 유무에 상관없이, 낮은 세포접착활성을 나타내었다. 이 사실로부터, hα9/CHO의 ADAM-15 디스인테그린 도메인 고상화 표면으로의 접착은, α9 인테그린을 매개로 한 접착으로 생각된다. 또한, hα9/CHO의 ADAM-15 디스인테그린 도메인 고상화 표면으로의 접착은, d.d.-RAA에서도 감소하지 않는 것으로부터, α9 인테그린과 ADAM-15 디스인테그린 도메인을 매개로 한 접착은, ADAM-15 디스인테그린 도메인의 RGD 서열에는 비의존성으로 생각된다.

또한, 8F7 항체에 의한, hα9/CHO 세포의 d.d. 및 d.d-RAA 고상화 표면으로의 접착 저해시험의 결과를 도 4B에 나타낸다. 8F7 항체는, 농도 의존적으로, d.d. 및 d.d.-RAA에 대한 hα9/CHO의 세포접착을 저해하였다. 상기 결과로부터, hα9/CHO 세포의 d.d. 및 d.d.-RAA 고상화 표면으로의 접착은, α9 인테그린을 매개로 한 접착으로 생각되는 것으로부터, 8F7은 인간 ADAM-15와 인간 α9β1 인테그린의 상호작용을 억제하는 것이 확인되었다.

(실시예 8) 인간 신장암 세포주 NRC-12 세포에 있어서의 인테그린의 발현

인간 신장암 세포주 NRC-12 세포를 사용하여, 8F7의 RGD 비의존적인 접착을 억제할 수 있는지를 검토하기 위해, NRC-12 세포에 있어서의 integrin의 발현을 플로우 사이토메트리로 확인하였다. 0.5% BSA, 0.01 NaN₃/PBS(FACS 버퍼)로 세포를 5×10⁶ cells/㎖로 조정하여, 96웰 V 바닥 플레이트의 각 웰에 100 ㎖씩 첨가하고, 플레이트 원심기로 세포를 회수하였다. 그 후, CFBS를 각 웰에 100 ㎖씩 첨가하고, 얼음 위에서 30분간 인큐베이트함으로써, 세포막 표면 상의 Fc 리셉터를 블로킹하였다. 1차 항체를 0.5 ㎍ 첨가하고, 얼음 위에서 20분간 인큐베이트하였다. FACS 버퍼로 2회 세정 후, 200배 희석한 2차 항체(anti-mouse IgG FITC 표지:Jackson immunoresearch)를 각 웰에 100 μL씩 첨가하고, 얼음 위에서 20분간 인큐베이트하였다. FACS 버퍼로 2회 세정 후, 7-AAD(50 ㎍/㎖)를 각 웰에 20 μL씩 첨가하고, 얼음 위에서 20분간 인큐베이트하였다. FACS 버퍼로 3회 세정 후, 세포를 메쉬에 통과시키고, 최종적으로 500 μL의 FACS 버퍼에 용해하였다. 그 후, FACS 캘리버(일본 벡톤·딕킨슨)를 사용하여, FL-1을 검출하고, cell quest로 해석하였다.

결과를 도 5에 나타낸다. 인간 신장암 세포주 NRC-12 세포에는, α9β1 인테그린의 발현은 보이지 않고, αvβ3 인테그린, α5β1 인테그린 등 RGD 서열에 결합하는 인테그린이 발현되고 있었다.

(실시예 9) 인간 신장암 세포주 NRC-12 세포를 사용한 세포접착 및 세포접착 저해시험

실시예 6과 동일한 방법에 의해, 인간 신장암 세포주 NRC-12 세포의, d.d., 고상화한 d.d.와 합성 펩티드(GRGDS)의 혼합물(d.d.+GRGDS), d.d.와 합성 펩티드(GRGES)의 혼합물(d.d.+GRGES), 합성 펩티드(GRGDS)를 BSA(소혈청 알부민)와 결합시킨 것(GRGDS-BSA), 합성 펩티드(GRGDS)를 BSA(소혈청 알부민)과 결합시킨 것과 합성 펩티드(GRGDS)의 혼합물(GRGDS-BSA+GRGDS), 또는 합성 펩티드(GRGDS)를 BSA(소혈청 알부민)와 결합시킨 것과 합성 펩티드(GRGES)의 혼합물(GRGDS-BSA+GRGES)로의 세포접착 활성을 측정하였다. 또한, 실시예 6과 동일한 방법에 의해, 인간 신장암 세포주 NRC-12 세포의, d.d 고상화 표면으로의 세포접착에 대한, 8F7의 저해활성을 측정하였다.

결과를 도 6에 나타낸다. 인간 신장암 세포주 NRC-12 세포는, ADAM-15의 d.d. 및 합성 펩티드 GRGDS-BSA에 RGD 서열 의존적으로 접착하였다. 또한, 8F7 항체는, 농도 의존적으로, d.d. 고상화 표면에 대한 인간 신장암 세포주 NRC-12 세포의 접착을 저해하였다. 전술한 바와 같이, 인간 신장암 세포주 NRC-12 세포는, α9β1 인테그린을 발현하지 않고, RGD 서열에 결합하는 인테그린(αvβ3 인테그린, α5β1 인테그린)을 발현하는 것으로부터, 8F7은 d.d.와 인테그린의 RGD 의존적인 상호작용에 의한 세포접착을 억제한다고 생각된다.

(실시예 10) 인간 유방암 세포주 435S에 있어서의 인테그린의 발현

인간 유방암 세포주 435S(MDA-MB-435S)에 있어서의 ADAM-15와 integrin의 발현을 플로우 사이토메트리로 확인하였다. 플로우 사이토메트리는, 실시예 7에 기재된 방법에 준하여 행하였다.

결과를 도 7에 나타낸다. 인간 유방암 세포주 435S에 있어서, ADAM-15, αvβ3 인테그린, α5β1 인테그린, α9β1 인테그린의 발현을 검토한 바, 모든 분자가 발현되고 있는 것이 확인되었다. 그러나, 그 발현 레벨에 차가 있어, αvβ3 인테그린, α5β1 인테그린은, α9β1 인테그린과 비교하여, 발현 레벨이 높았다.

(실시예 11) 인간 유방암 세포주 435S 세포를 사용한 세포접착 및 세포접착 저해시험

인간 유방암 세포주 435S에서의 인테그린의 발현을 확인할 수 있었기 때문에, 이들 인테그린이 기능적인지 여부를 세포접착시험에 의해 검토하였다. 즉, d.d. 또는 d.d.-RAA에 대한 435S의 세포접착을 이하의 방법에 의해 측정하였다. d.d., d.d.-RAA, 인간 테네이션 C 분자 내에 존재하는 3번째의 피브로넥틴 type III 도메인의 재조합 단백(hTNfn3)의 RGD 서열을 RAA로 치환한 단백(hTNfn3(RAA)), 또는 GRGDS-BSA를, PBS로 0~5 ㎍/mL로 조제하여, 96웰 플레이트의 각 웰에 50 μL씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하여, 고상화시켰다. 그 후, 0.5% BSA/PBS를 각 웰에 200 μL씩 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트함으로써 블로킹반응을 행하였다. PBS로 세정 후, 인간 유방암 세포주 435S 세포를 0.25% BSA 함유 배지(TIL)에서 1×10⁵ cells/㎖로 조제하여, 각 웰에 200 μL씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하여 고상화시킨 단백질에 접착시켰다. 그 후, 사전에 37℃로 데워 둔 PBS로 세정하여, 접착되지 않은 세포를 제거하였다. 크리스탈 바이올릿을 각 웰에 50 μL씩 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이트함으로써, 세포를 고정, 염색하였다. 수돗물로 세정 후, 20% 초산수를 각 웰에 100 μL씩씩 첨가하고, 세포를 용해 후, 플레이트 리더로 590 nm의 흡광도를 측정하였다.

인간 유방암 세포주 435S 세포를 사용한 세포접착시험의 결과를 도 8A에 나타낸다. 인간 유방암 세포주 435S는 d.d. 또는 d.d.-RAA에 접착되었으나, 그 접착률은 낮았다.

지금까지의 보고에서, 인테그린은 2가 이온(Mn, Mg, Ca 이온 등)에 의해 활성화되는 것이 증명되어 있다. 또한, ADAM-15와 인테그린의 접착에는 2가 이온에 의한 인테그린의 활성화가 필요한 것도 보고되어 있다(Eto, K et al. RGD-independent binding of integrin alpha9beta1 to the ADAM-12 and -15 disintegrin domains mediate cell-cell interaction. J Biol. Chem. 275: 34922-34930,2000). 이에, 전술한 인간 유방암 세포주 435S 세포를 사용한 세포접착시험에 있어서, Mn 이온을 사용함으로써, 인테그린을 활성화시켰다.

결과를 도 8B에 나타낸다. Mn 이온 첨가에 의해, d.d. 또는 d.d.-RAA에 대한 인간 유방암 세포주 435S 세포의 접착률이 증가하였다.

(실시예 12) 인간 유방암 세포주 435S 세포를 사용한 세포접착 저해시험

인간 유방암 세포주 435S 세포를 사용한 세포접착 저해시험에 있어서는, Mn 이온을 사용함으로써, 인테그린을 활성화시켰다. 세포접착시험과 동일한 방법으로 d.d. 또는 d.d.-RAA(6.25 ㎍/㎖로 조제)를 고상화시켜, 블로킹반응을 행하였다. ADAM-15를 저해하는 것에 의한 세포접착 저해활성시험에 있어서는, 고상에 고정한 단백질에 8F7을 첨가하였다. 또한, 인테그린을 저해하는 것에 의한 세포접착 저해활성시험에 있어서는, 인간 유방암 세포주 435S 세포 2×10⁴ 세포에, 인간 α9β1 인테그린에 대한 항체인 Y9A2(chemicon), 또는 인간 αvβ3 인테그린에 대한 항체인 LM-609(chemicon)를 첨가하고, 37℃에서 20분간 인큐베이트하였다. 그 후, 세포접착시험과 동일한 방법으로 세포를 각 웰에 첨가하여 세포접착을 측정하였다.

결과를 도 9에 나타낸다. 8F7과 인테그린에 대한 항체를 사용하여 세포접착 저해시험을 행한 결과, d.d.에 대한 세포접착은, αvβ3 인테그린에 대한 항체에 의해 억제되었다. 그러나, α9β1 인테그린에 대한 항체로는 억제되지 않았다. 한편으로, d.d.-RAA에 대한 세포접착은, α9β1 인테그린에 대한 항체로 억제되었다. 또한, 8F7은 d.d.에 대한 세포접착과 d.d.-RAA에 대한 세포접착의 양쪽을 억제하였다. 즉, RGD 서열을 포함하는 d.d.에는, αvβ3 인테그린 등, RGD 리셉터를 매개로 하여 결합하고 있고, α9β1 인테그린을 매개로 하는 결합은 보이지 않았다. 한편으로, RGD 서열을 포함하지 않는 d.d.-RAA에 대해서는, α9β1 인테그린을 매개로 한 결합이 보였다.

전술한 바와 같이, 플로우 사이토메트리에 의해 유방암 세포주 435S 세포에 있어서의 인테그린의 발현을 확인한 결과에서는, α9β1 인테그린과 비교하여, αvβ3 인테그린, 및 α5β1 인테그린이 강하게 발현되고 있다. 이들 사실로부터, 유방암 세포주 435S 세포에 있어서의 ADAM-15와 인테그린의 결합에서는, αvβ3 인테그린이나 α5β1 인테그린이 우위적으로 작용할 것으로 예상된다.

(실시예 13) 세포증식시험

인간 유방암 세포주 435S 세포(MDA-MB-435S:435S)를 10% FCS 함유 TIL 배지에서 2×10⁴ cells/㎖로 조정하여, 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL씩 뿌리고, 37℃에서 하룻밤 배양한 후, FCS 불함유 TIL 배지로 교환하여, 동일하게 하룻밤 배양하였다. 배지를 제거하고, 5% FCS 함유 TIL 배지에서 20 ㎍/㎖로 조정한 항체(실시예 5에서 제작한 8F7, 또는 항인간 αvβ3 인테그린 항체 LM-609(chemicon)를 각 웰에 100 μL씩 첨가하고, cell counting kit-8(DOUJINDO)을 각 웰에 10 μL씩 첨가하였다. 37℃에서 2시간 30분 인큐베이트한 후에 플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 이것을 0시간으로 하고, 항체를 포함하는 5% FCS 함유 TIL 배지에서 48시간 배양한 세포에 있어서도, 동일한 방법으로 실험을 행하였다. 450 nm(48시간)/450 nm(0시간)의 비율을 산출하여, 이들 비율을 항체 비첨가군과 비교하였다.

결과를 도 10에 나타낸다. 8F7을 첨가함으로써, 인간 유방암 세포주 435S 세포의 세포증식률이 약 20% 저하되었다. 이 사실로부터, ADAM-15와 인테그린의 상호작용이 유방암 세포의 세포증식에 촉진적으로 작용하고 있는 것이 시사되었다. ADAM-15 디스인테그린 도메인 재조합 단백질을 작용시키면, 유방암 세포의 증식이 저해되는 것이 보고되어 있어, 본 실험의 결과와 일치하였다.

(ELISA법)

본 명세서에 기재된 실시예에 있어서, ELISA법은 다음의 방법에 의해 행하였다. 먼저, 항원을 96웰 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 고상화시켰다. 그 후, PBS로 3회 세정하고, 1% BSA, 0.05% NaN₃/PBS를 200 ㎖/well로 첨가함으로써 블로킹반응을 행하였다. 0.05% Tween/PBS로 5회 세정 후, 1% BSA, 0.05% Tween/PBS로 희석한 1차 항체를 각 웰에 100 μL씩 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 0.05% Tween/PBS로 7회 세정 후, 1% BSA, 0.05% Tween/PBS로 1000배 희석한 2차 항체(anti-mouse IgG HRP 표지: Jackson immunoresearch)를 50 ㎖/well로 첨가하고, 37℃에서 30분 반응시켰다. 0.05% Tween/PBS로 9회 세정 후, o-페닐렌디아민용액(Wako)을 50 ㎖/well로 첨가하고, 실온, 암소에서 15분 반응시켰다. 2 N 황산으로 반응 정지 후, 플레이트 리더를 사용하여 OD490의 흡광도를 측정하였다.

항체가 측정에 있어서는, 항원으로서 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인-GST 단백질을 각 웰에 50 ng 고상화시키고, 1차 항체로서, 항원을 면역한 마우스의 혈청을 1000~1000000배 희석해서 사용하였다.

(통계학적 처리)

본 명세서에 있어서의 세포접착 저해시험에 있어서는, 항체 비첨가군의 OD590을 기준으로 하여, 항체 첨가군에서 얻어진 OD590의 비율을 산출하였다. 세포증식시험에 있어서는, 각각 48시간 후, 0시간의 값을 산출하고, 항체 비첨가군에서 얻어진 비율을 기준으로 하여, 항체 첨가군의 비율을 산출하였다. 이들 실험은 모두 3회씩 행하고, 스튜던트의 t검정을 행하였다.

(실시예 14) 인간 유방암 세포주 435S 세포를 사용한 세포침윤 저해시험

8F7의 세포침윤에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포침윤시험을 행하였다. 세포침윤시험은 매트리겔 인베이션 챔버(BD사)를 사용해서 행하였다. 무혈청의 TIL 배지(면역생물연구소사)를 웰과 인서트에 500 ㎖씩 첨가하고, 인서트를 웰에 침지하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션함으로써, 매트리겔을 수화(水和)하였다. 그 후, 인서트 내의 배지를 흡인 제거하고, 화학유인물질을 750 ㎖ 첨가한 별도의 웰에 침지하였다. 화학유인물질은 인간 섬유아육종 세포주 HT-1080 세포주의 배양상청을 사용하였다. 무혈청의 TIL 배지에서 1×10⁵ 개/㎖로 조정한 435S 세포 현탁액을 인서트에 500 ㎖ 첨가하고, 37℃에서 22시간 인큐베이션함으로써 침윤을 유도하였다. 항체에 의한 세포침윤의 저해효과를 조사하는 경우는, 유방암 세포를 인서트에 첨가하기 전에, 8F7 항체 또는 대조 항체를 10 ㎎/㎖가 되도록 첨가하고, 37℃에서 20분 인큐베이션하여, 435S 세포 현탁액을 인서트에 첨가하였다. 침윤 후에, 인서트 내의 세포 현탁액을 흡인 제거하고, 면봉으로 매트리겔과 비침윤 세포를 닦아내었다. 그 후, 냉각한 메탄올에 인서트를 침지하고, -80℃에서 20분 인큐베이션함으로써, 침윤세포를 고정하였다. 고정 후, 김자용액(무토화학주식회사)에 인서트를 15분 침지하여, 침윤세포를 염색하였다. 수돗물로 세정 후, 인서트로부터 필터를 떼어내어, 슬라이드 상에 놓고, 마운트제로 봉입하였다. 광학현미경으로 필터 하층의 침윤면을 관찰하고, 핵이 관찰되는 세포를 침윤세포로서 계수하였다. 또한, 6 시야를 계수하여, 그 평균값을 산출하였다.

결과를 도 11에 나타낸다. 항체를 첨가하지 않은 경우의 침윤세포 수를 기준으로 항체 첨가군에서 얻어진 침윤세포 수의 비율을 산출하였다. 또한, 이들 실험은 3회씩 행하고, 스튜던트의 t검정을 행하였다. 대조 항체 첨가시에는 침윤세포 수는 거의 변화되지 않은 것에 대해, 8F7 항체 첨가시에는 침윤세포의 비율이 30% 정도까지 감소하고 있어, 통계적인 유의차를 가지고 8F7이 세포침윤에 대해 저해효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 15) 항체의 아미노산 서열 해석

하이브리도마 세포를, illustra Quickprep Micro mRNAPurification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스사)를 사용하여 RNA를 추출하고, SuprScriptFirst-strand cDNA for RT-PCR 키트(인비트로젠사)로 cDNA를 제작하였다. Heavy primer 증폭 키트(아머샴 바이오사이언스사) 및 Lightprimer 증폭 키트(아머샴 바이오사이언스사)를 사용하여 PCR을 행하고, 항체의 중쇄(Heavy chain) 및 항체의 경쇄(Light chain)의 cDNA를 신장시켜, 중쇄의 PCR 산물을 pTA 벡터(도요보세키사)로, 그리고 경쇄의 PCR 산물을 Mighty Cloning Kit <Blunt End>(다카라바이오사)에 삽입하고, cDNA 서열, 아미노산 서열을 결정하였다. CDR 영역은 Kabat numbering system을 이용해서 결정하였다.

전술한 방법으로 얻어진 cDNA 서열을 토대로 primer를 제작하고, GeneRacer Kit(인비트로젠사)를 사용하여 항체의 중쇄 및 항체의 경쇄의 5'RACE 및 3'RACE를 행해, 항체 유전자의 전장 해석을 행하였다. 그 결과, 중쇄와 경쇄, CDR 영역의 아미노산 서열은 이하와 같이 되었다(도 12 및 도 13도 참조).

(중쇄)

[CDRH1]

SYNMH(서열번호 15)

[CDRH2]

AIYPGDGDTSYNQKFKG(서열번호 16)

[CDRH3]

DRGDYGYGFAY(서열번호 17)

(경쇄)

[CDRL1]

RSSQSLVHSNGNTYLH(서열번호 18)

[CDRL2]

KVSNRFS(서열번호 19)

[CDRL3]

SQNTHVPPWT(서열번호 20)

본 발명의 항ADAM-15 항체 등은, 우수한 ADAM-15 기능 억제작용을 나타내는 것으로부터, 세포증식, 세포유주, 세포침윤, 세포간 접착, 혈관신생에 기인하는 질환의 치료약 또는 예방약으로서 이용할 수 있다. 특히, 본 발명의 항체는, 암(예를 들면, 암세포의 증식, 전이), 염증성 질환(예를 들면, 관절류머티즘, 변형성 관절증, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화, 다발성 경화증, 염증성 장질환(궤양성 대장염, 크론병 등)), 감염증(예를 들면, 간염), 자기면역질환(예를 들면, 전신성 홍반성 루프스, 다발성 근염, 자기면역성 갑상선 질환, 요세관 간질성 신염, 중증 근무력증) 및 골질환(예를 들면, 골다공증) 등에 대한 치료약 또는 예방약으로서 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는, 세포나 조직에 있어서의 ADAM-15의 발현을 병리학적으로 검출할 수 있는 것으로부터, 상기 각종 질환의 진단약으로서 이용할 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 항인간 ADAM-15 단일클론 항체 8F7의 결합 특이성을 ELISA법에 의해 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중, 세로축은 490 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 고상화된 폴리펩티드의 농도를 나타낸다. GST, 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인-GST 단백질(d.d.-GST), 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 루프영역-GST 단백질(loop-GST), 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단백질(d.d.), 인간 ADAM-15 디스인테그린 도메인 단백질(RAA 치환체)(d.d.-RAA), 및 마우스 오스테오폰틴 N-하프-GST 단백질(mOPN N-half-GST)을 각각 10 ㎍/㎖로부터 단계 희석하여 고상에 고정하고, 1차 항체로서 0.1 ㎍/㎖로 조정한 8F7을 사용하였다. 베이스 라인으로서 PBS만의 흡광도를 사용하였다.

도 2는 인간 ADAM-15 단일클론 항체 8F7의 결합 특이성을 웨스턴 블롯에 의해 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중, (+)는 ADAM-15를 유전자 도입한 COS-7의 세포용액 샘플을 나타내고, (-)는 유전자 도입하지 않은 COS-7의 세포용액 샘플을 나타낸다. 또한, 화살표는 목적의 밴드를 나타낸다.

도 3은 8F7과 23G9의 ADAM-15 디스인테그린 도메인으로의 결합 활성을 ELISA법에 의해 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중, 세로축은 490 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 고상화된 폴리펩티드의 농도를 나타낸다. 또한, hTNC-GST는 인간·테네이신 C-GST 단백질을 나타낸다.

도 4는 8F7의 RGD 서열 비의존성 세포접착 저해활성을 측정한 결과를 나타낸다. A는 CHO-K1 및 hα9/CHO의, hADAM-15 디스인테그린 도메인으로의 세포접착을 측정한 결과를 나타낸다. 도면 중, 세로축은 590 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 고상화된 폴리펩티드의 농도를 나타낸다. B는 hα9/CHO의, hADAM-15 디스인테그린 도메인으로의 세포접착에 대한, 8F7의 저해활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도면 중, 세로축은 590 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 고상화된 폴리펩티드의 농도를 나타낸다.

도 5는 인간 신장암 세포주 NRC-12에 있어서의 인테그린의 발현을 플로우 사이토메트리에 의해 측정한 결과를 나타낸다. α9β1 인테그린은 Y9A2, αvβ3 인테그린은 LM609, α5β1 인테그린은 JBS5를 사용해서 검출하였다.

도 6은 8F7의 RGD 서열 의존성 세포접착 저해활성을 측정한 결과를 나타낸다. A는 NRC-12와 hADAM-15 디스인테그린 도메인의 세포접착을 검토한 결과를 나타낸다. 도면 중, 세로축은 590 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 고상화된 폴리펩티드의 농도를 나타낸다. B는 NRC-12의, hADAM-15 디스인테그린 도메인으로의 세포접착에 대한, 8F7의 저해활성을 측정한 결과를 나타낸다. 도면 중, 세로축은 590 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 고상화된 폴리펩티드의 농도를 나타낸다.

도 7은 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S)에 있어서의 인테그린의 발현을 플로우 사이토메트리에 의해 측정한 결과를 나타낸다. α9β1 인테그린은 Y9A2, αvβ3 인테그린은 LM609, α5β1 인테그린은 JBS5를 사용해서 검출하였다.

도 8은 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S)를 사용한 세포접착시험의 결과를 나타낸다. A는 hADAM-15 디스인테그린 도메인으로의 세포접착을 측정한 결과를 나타낸다. 도면 중, 세로축은 590 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 고상화된 폴리펩티드의 농도를 나타낸다. B는 Mn 이온 존재하에서, hADAM-15 디스인테그린 도메인으로의 세포접착을 측정한 결과를 나타낸다. 도면 중, 세로축은 590 nm에 있어서의 흡광도를 나타내고, 가로축은 고상화된 폴리펩티드의 농도를 나타낸다.

도 9는 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S)를 사용한 세포접착 저해시험의 결과를 나타낸다. A는 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S)의 ADAM-15의 디스인테그린 도메인으로의 접착을 8F7으로 저해한 결과를 나타낸다. B는 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S)의 ADAM-15의 디스인테그린 도메인(RAA 치환체)으로의 접착을 8F7으로 저해한 결과를 나타낸다. C는 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S)의 ADAM-15의 디스인테그린 도메인으로의 접착을 Y9A2 또는 LM609로 저해한 결과를 나타낸다. D는 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S)의 ADAM-15의 디스인테그린 도메인(RAA 치환체)으로의 접착을 Y9A2 또는 LM609로 저해한 결과를 나타낸다. 모든 도면에 있어서, 도면 중, 세로축은 항체 비첨가를 100%로 한 경우의 세포접착률을 나타내고, 가로축은 투여한 항체를 나타낸다.

도 10은 인간 유방암 세포주(MDA-MB-435S)의 세포증식에 있어서의 ADAM-15의 기능 및 8F7에 의한 당해 기능의 저해활성을 측정한 결과를 나타낸다. 각 항체는 20 ㎍/mL로 첨가하였다. 도면 중, 세로축은 48시간 후의 세포증식률을 나타낸다.

도 11은 인간 유방암 세포주 435S 세포를 사용한 세포침윤 저해시험의 결과를 나타낸다.

도 12는 항인간 ADAM-15 항체(8F7) 중쇄의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열은 싱글 레터 코드로 나타내었다. 시그널 서열은 이탤릭체로, 항체의 N 말단에 상당하는 아미노산 잔기(Q)는 이중 하선으로 나타내었다. Kabat numbering system에 의해 유추되는 CDR은 하선으로 나타내었다. 또한, 항체의 가변부와 정상부 경계의 아미노산 잔기(A)는 볼드체 하선으로 나타내었다.

도 13은 항인간 ADAM-15 항체(8F7) 경쇄의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열은 싱글 레터 코드로 나타내었다. 시그널 서열은 이탤릭체로, 항체의 N 말단에 상당하는 아미노산 잔기(D)는 이중 하선으로 나타내었다. Kabat numbering system에 의해 유추되는 CDR은 하선으로 나타내었다. 또한, 항체의 가변부와 정상부 경계의 아미노산 잔기(R)는 볼드체 하선으로 나타내었다.

독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 BP-10950 20080213

SEQUENCE LISTING <110> Gene Techno Science Co., Ltd. National University Corporation Hokkaido University <120> Anti ADAM-15 antibody and use thereof <130> PCT09-0003 <150> JP2008-033354 <151> 2008-02-14 <160> 20 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 1 ttttaagctt gccaccatgg gcggcccggc tg 32 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 2 aaactgcagt ccggagcact ggatttatct tct 33 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 3 aaatccggat gtttggtcca tatc 24 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 4 aaatctagat cactggtttt tctggaccca gtc 33 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 5 cctatggctg ctttctgc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Primer <400> 6 catgcacaca gcttgccc 18 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense Primer <400> 7 aaggatccgc tgctttctgc gga 23 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> 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att tat cca gga gat ggt gat act tcc tac aat 240 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 cag aaa ttc aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac att cat ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Ile His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga gac agg ggg gac tac ggc tac ggg ttt gct tac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Gly Phe Ala Tyr 115 120 125 tgg ggc caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc aaa acg aca ccc 432 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140 cca tct gtc tat cca ctg gcc cct gga tct gct gcc caa act aac tcc 480 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser 145 150 155 160 atg gtg acc ctg gga tgc ctg gtc aag ggc tat ttc cct gag cca gtg 528 Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 aca gtg acc tgg aac tct gga tcc ctg tcc agc ggt gtg cac acc ttc 576 Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 cca gct gtc ctg cag tct gac ctc tac act ctg agc agc tca gtg act 624 Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr 195 200 205 gtc ccc tcc agc acc tgg ccc agc gag acc gtc acc tgc aac gtt gcc 672 Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala 210 215 220 cac ccg gcc agc agc acc aag gtg gac aag aaa att gtg ccc agg gat 720 His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp 225 230 235 240 tgt ggt tgt aag cct tgc ata tgt aca gtc cca gaa gta tca tct gtc 768 Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val 245 250 255 ttc atc ttc ccc cca aag ccc aag gat gtg ctc acc att act ctg act 816 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr 260 265 270 cct aag gtc acg tgt gtt gtg gta gac atc agc aag gat gat ccc gag 864 Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu 275 280 285 gtc cag ttc agc tgg ttt gta gat gat gtg gag gtg cac aca gct cag 912 Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln 290 295 300 acg caa ccc cgg gag gag cag ttc aac agc act ttc cgc tca gtc agt 960 Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser 305 310 315 320 gaa ctt ccc atc atg cac cag gac tgg ctc aat ggc aag gag ttc aaa 1008 Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys 325 330 335 tgc agg gtc aac agt gca gct ttc cct gcc ccc atc gag aaa acc atc 1056 Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 tcc aaa acc aaa ggc aga ccg aag gct cca cag gtg tac acc att cca 1104 Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro 355 360 365 cct ccc aag gag cag atg gcc aaa gga taa 1134 Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Gly 370 375 <210> 12 <211> 377 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Ile His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Gly Phe Ala Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro 130 135 140 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser 145 150 155 160 Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala 210 215 220 His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp 225 230 235 240 Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val 245 250 255 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr 260 265 270 Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu 275 280 285 Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln 290 295 300 Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser 305 310 315 320 Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys 325 330 335 Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro 355 360 365 Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Gly 370 375 <210> 13 <211> 720 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(720) <400> 13 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 gta cac agt aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cac aag cca 192 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu His Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 tct caa aat aca cat gtt cct ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag 384 Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 ctg gaa atc aaa cgg gct gat gct gca cca act gta tcc atc ttc cca 432 Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 130 135 140 cca tcc agt gag cag tta aca tct gga ggt gcc tca gtc gtg tgc ttc 480 Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 160 ttg aac aac ttc tac ccc aaa gac atc aat gtc aag tgg aag att gat 528 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp 165 170 175 ggc agt gaa cga caa aat ggc gtc ctg aac agt tgg act gat cag gac 576 Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 180 185 190 agc aaa gac agc acc tac agc atg agc agc acc ctc acg ttg acc aag 624 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys 195 200 205 gac gag tat gaa cga cat aac agc tat acc tgt gag gcc act cac aag 672 Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys 210 215 220 aca tca act tca ccc att gtc aag agc ttc aac agg aat gag tgt tag 720 Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 14 <211> 239 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu His Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp 165 170 175 Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys 195 200 205 Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys 210 215 220 Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Ser Tyr Asn Met His 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Asp Arg Gly Asp Tyr Gly Tyr Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Trp Thr 1 5 10

Claims (23)

1. ADAM-15의 디스인테그린 도메인을 인식하고, 또한, ADAM-15의 디스인테그린 도메인 내의 RGD 서열을 인식하지 않으며,
   각각 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하고,
   각각 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
2. 제1항에 있어서,
   상기 항체가, 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 단편.
3. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 단편으로서, ADAM-15 및 인테그린 αvβ3 의존성 세포접착을 저해하는 항체 또는 그의 단편.
4. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 단편으로서, ADAM-15 및 인테그린 α9β1 의존성 세포접착을 저해하는 항체 또는 그의 단편.
5. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 단편으로서, 암세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 단편.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 항체가 단일클론 항체인 항체 또는 그의 단편.
7. 제6항에 있어서,
   상기 항체가, 수탁번호 FERM BP-10950으로 특정되는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 단일클론 항체인 항체 또는 그의 단편.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 항체가 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인 항체 또는 그의 단편.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 항체 단편이, F(ab')₂, Fab', Fab, 단일쇄 Fv(scFv), 디설피드 결합 Fv(dsFv) 또는 이들의 중합체, 또는 이량체화 V영역(Diabody)인 항체 또는 그의 단편.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체의 단편이 항체의 CDR 서열을 포함하는 펩티드인 항체 또는 그의 단편.
11. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 단편을 코드하는 DNA.
12. 제11항의 DNA를 함유하는 재조합 벡터.
13. 제12항의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 얻어지는 형질전환 세포.
14. 제13항에 있어서,
    하이브리도마 세포계인 세포.
15. 제14항에 있어서,
    수탁번호 FERM BP-10950으로 특정되는 하이브리도마 세포계인 세포.
16. 제13항의 세포를 배양하고, 배양물 중에서 항체 또는 그의 단편을 생성시켜, 배양물로부터 항체 또는 그의 단편을 추출하는 것을 특징으로 하는, 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 단편의 제조방법.
17. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 단편을 유효성분으로서 함유하며, 세포증식, 세포유주, 세포침윤, 세포간 접착, 또는 혈관신생에 기인하는 질환의 치료약 또는 예방약인 의약 조성물로서,
    상기 질환이;
    식도암, 갑상선암, 방광암, 대장암, 위암, 췌장암, 흉부암, 간장암, 폐암, 유방암, 신경아세포종, 신경교아종, 자궁암, 난소암, 전립선암 및 빌름스종양으로부터 선택되는 암 및 그의 전이; 자궁내막증; 관절염, 감염증, 간염, 기관지천식, 섬유증; 전신성 홍반성 루프스(SLE), 다발성 근염(PM), 자기면역성 갑상선 질환, 요세관 간질성 신염, 중증 근무력증(EAMG) 및 장기 특이적 자기면역질환으로부터 선택되는 자기면역질환; 만성 관절류머티즘(RA), 변형성 관절증(OA), 다발성 경화증으로부터 선택되는 류머티스성 관절염; 궤양성 대장염, 크론병으로부터 선택되는 염증성 장염; 진행성 전신성 경화증(PSS), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 피부근염(DM), 결절성 동맥주위염(PN), 갑상선 질환, 바세도우병, 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 원발성 담즙성 간경변(PBC), 돌발성 혈소판 감소성 자반병, 자기면역 용혈성 빈혈, 근위축성 측색경화증(ALS), I형 당뇨병, 이식시의 거부반응, 수술 후의 유착, 건선, 낭창, 알레르기, 천식; 호중구 기능 이상; 혈관 재건술 후 재협착, 심장 관동맥 혈관 폐색성 질환, 뇌혈관 폐색성 질환, 신혈관 폐색성 질환, 말초혈관 폐색성 질환, 동맥경화 및 뇌경색으로부터 선택되는 혈관 폐색성 질환 또는 혈관 내막 비후에 기인하는 질환;
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 의약 조성물.
18. 삭제
19. 제17항에 있어서,
    항암제 또는 암 전이 억제제인 의약 조성물.
20. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 단편을 구비하고,
    세포증식, 세포유주, 세포침윤, 세포간 접착, 또는 혈관신생에 기인하는 질환의 진단약으로서,
    상기 질환이;
    류머티스관절염, 간염, 기관지천식, 섬유증, 당뇨병, 암 전이, 동맥경화, 다발성 경화증, 육아종으로부터 선택되는 염증성 질환; 장기이식 후의 만성 거부반응; 및 전신성 자기면역질환, 홍반성 루프스, 포도막염, 베체트병, 다발성 근염, 사상체 증식성 신염, 우육종증(sarcoidosis)으로부터 선택되는 자기면역질환;
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 진단약.
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