CN103937770A - 一种重组表达的ADAM15h融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种真核细胞重组表达的去整合素金属蛋白酶ADAM15完整胞外段及其制备方法与应用，目的是提供一种可用于生产、研究用的ADAM15蛋白。本发明所提供的重组ADAM15h蛋白，是由pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系后表达得到的ADAM15h融合蛋白。本发明提供了该重组ADAM15h融合蛋白的制备方法，即用pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系，被转化的宿主细胞系经培养筛选出重组ADAM15h高效表达克隆，得到重组ADAM15h融合蛋白。本发明还提供了从细胞培养上清中纯化ADAM15h融合蛋白的方法及利用切割荧光底物检测重组ADAM15h酶活的活性检测方法。

Description

一种重组表达的ADAM15h融合蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种重组融合表达的去整合素金属蛋白酶ADAM15片段及其制备方法与应用，特别涉及一种可以在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中可溶、稳定表达的ADAM15h及其制备方法与应用。 
背景技术
金属蛋白酶去整合素家族(A Disintegrin And Metalloproteinase，ADAM)，又称MDC(metalloproteinase/disintergrin/cystein-rich)，是近年来新发现的一类含有多个功能结构域的跨膜糖蛋白家族。该家族蛋白与蛇毒金属蛋白酶(snake venom metallop roteinase，SVMP)家族具有很高的同源性，其结构相似，通常由800-1200个氨基酸组成，包括前导域、类金属蛋白酶功能域、去整合素功能域、富含半胱氨酸功能域、类表皮生长因子功能域、跨膜域和C端的胞质尾区结构域等。 
ADAM家族蛋白在细胞间相互识别和相互作用中发挥重要作用。研究表明，ADAM蛋白在多种组织和器官中表达分布，参与了多种生理、病理过程，如精卵结合、神经发育、肌管形成等。在细胞外基质蛋白的水解、细胞间和细胞与基质间的粘连、细胞融合、迁移、信号传导、生物活性因子释放等细胞活动中具有重要的生理作用。同时，ADAM家族成员还是胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞(ASC)分子网络中关键的调控因子，参与受精卵ESC的整合、分化、裂解，以及肌肉、神经等组织ASC的迁移、分化等过程。 
另外，ADAM家族蛋白通过调节基因表达、调控胞内外环境、激活酶原和解除抑制剂等途径参与恶性肿瘤的发生及演变。在30多种ADAM家族成员中，ADAM15(metargidin)被发现与人类多种实体瘤，如胃癌、肠癌、乳腺癌和前列腺癌等的发生和发展密切相关。作为ADAM家族中唯一一个在去整合素结构域含有RGD(Arg-Gly-Asp)基序的成员，ADAM15具有典型的药物分子靶点结构与特征，对于抗肿瘤药物的研制具有重要指导意义。然而，由于天然来源的ADAM15蛋白十分有限，如何获得高表达量的重组ADAM15蛋白或其片段，进而深入研究其在肿瘤发生发展中的分子机制已成为肿瘤新型药物开发领域的研究热点。 
重组蛋白可以在原核生物表达体系和真核细胞表达体系中进行表达生产。对于结构比较简单，蛋白翻译后修饰很少或翻译后修饰对蛋白结构和活性没有 影响的蛋白，可以直接采用原核表达体系，如大肠杆菌进行生产表达。这类表达方法具有产量高、成本低的优点。对于结构相对比较复杂，蛋白翻译后修饰很重要的蛋白通常需要采用真核细胞表达系统进行表达生产，但是此类表达系统有蛋白产量低，生产成本高的缺点。 
真核细胞表达体系包括哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞/杆状病毒表达体系，其中以哺乳动物细胞表达出的蛋白与人的生理状态下蛋白结构最接近、活性最高。常用的哺乳动物细胞表达体系包括瞬时表达体系和稳定表达体系，瞬时表达体系可以采用人HEK293细胞，或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等，其主要方法是将大量的表达载体DNA质粒通过试剂转染进入细胞内进行短时间内的蛋白表达。而稳定表达体系是通过筛选DNA质粒整合到细胞染色体上的稳定表达克隆并建立稳定表达细胞株进行培养表达。常用的稳定表达宿主细胞系有人HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、BHK细胞、SP2/0细胞等。其中，CHO(dhfr-)系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，当携带dhfr基因的表达质粒转染CHO细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，dhfr可被叶酸类似物氨甲喋呤(Amethopterin，MTX)所抑制，不断提高MTX浓度，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系，结果会导致与dhfr串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。 
目前，重组ADAM15胞外段在sf21昆虫细胞中已有表达，其去整合素结构域蛋白片段在大肠杆菌、毕赤酵母表达系统中也成功表达，重组ADAM15在哺乳动物细胞体内表达还未见有报道，更没有相关文献涉及构建稳定株、生产完整ADAM15胞外段重组蛋白。 
本发明提供了一种可以成功在真核细胞表达体系中高效获得可溶表达的完整ADAM15胞外段蛋白的方法。通过与多聚组氨酸片段融合表达，可以方便地使用镍柱纯化，从而实现商业化生产。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种可在真核细胞中高效表达的去整合素金属蛋白酶ADAM15胞外段蛋白的方法。该蛋白为融合表达的蛋白，其具体结构为C端his融合的ADAM15(即ADAM15h)，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，由该核苷酸编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。 
本发明所提供的ADAM15h，是由pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系后表达得到的ADAM15h融合蛋白。 
ADAM15cDNA是使用人脾脏cDNA文库通过PCR方法制备的。宿主细胞系是动物细胞；优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和/或人胚肾(HEK)细胞；最优选 为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 
本发明的第二个目的是提供一种制备重组ADAM15h融合蛋白的方法。 
本发明所提供的制备重组ADAM15h融合蛋白的方法，是用pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系，被转化的宿主细胞系经培养筛选出重组ADAM15h表达克隆，得到重组蛋白ADAM15h。其中，宿主细胞系是动物细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和/或人胚肾(HEK)细胞。宿主细胞系的培养方法包括悬浮培养、将细胞固定在培养烧瓶或瓶子或生物反应器上培养等。 
所筛选出的重组蛋白ADAM15h表达克隆是CHO ADAM15h-G8-11。所述CHO ADAM15h-G8-11是通过在培养基中加入增量氨甲喋吟(MTX)选择得到的。按照本发明提供方法生产的ADAM15h，培养上清中可获得10mg/L以上的蛋白产量。 
本发明提供了纯化重组ADAM15h融合蛋白的方法。可以使用Ni柱亲和纯化。 
本发明还提供了对纯化ADAM15h蛋白进行活性检测的方法。即测定该蛋白切割荧光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2能力的方法。 
按照本发明提供方法得到的ADAM15h可用于研究该家族蛋白的生物功能、作用机理，更可进一步用于抗肿瘤药物的研发。 
附图说明
图1.ADAM15h纯化蛋白的SDS-PAGE图(还原胶) 
图2.纯化的ADAM15-His的Western印迹分析图 
图3.重组人ADAM15ELISA检测标准曲线图 
图4.重组ADAM15h与PTK6，SRC，mouseSRC及LYN的结合趋势图 
具体实施方式
实施例1、重组ADAM15h的CHO细胞系的构建 
(1)表达载体的构建 
ADAM15cDNA是使用人脾脏cDNA文库通过PCR方法制备的，它可以被克隆进pMD18-T载体中，即获得pMD-ADAM15。核昔酸序列是用储存在基因库中的序列(Gene Bank NM_207191.1)验证的。使用该pMD-ADAM15 DNA作为模板，通过PCR方法用正引物(CTGAAGCTTACCATGCGGCTGGCGCT)和反引物(GGATCTAGATTTAATGGTGATGATGGTGGTGATGGTGGTGATGAGCTGTGGTCAGGGAGCTGGTT)制备的用于ADAM15表达的2130bp ADAM15cDNA。上游引物包括用 于克隆的HindIII酶切位点序列，下游引物包含有10His标签和XbaI位点序列。该cDNA被克隆进pSCT载体(该载体带有dhfr及neo基因)中以制备pSCT-ADAM15h，ADAM15h的序列通过基因库序列再次得到验证。 
(2)pSCT-ADAM15h转染进表达宿主中 
①pSCT-ADAM15h质粒DNA的制备 
将pSCT-ADAM15h DNA转染进DH5a[supE44，ΔlacU169(080lacZΔM15)，hsdR17，recAl，endAl，gyrA96，thi-1，relAl)大肠杆菌中之后，在含有100ug/mL氨卞青霉素的100mL LB培养基中培养转化体。通过使用QUIAPREP质粒Midi试剂盒(Quiagen，USA)，从该培养物中制备pSCT-ADAM15h质粒DNA。用PvuI消化制备得到线性pSCT-ADAM15h DNA。 
②CHO细胞的制备 
在MW12中用DMEM+10％FBS+HT+pro培养基培养CHO-DG44细胞，用血细胞计数器确定细胞数，调节细胞数为4.8X105个/mL细胞，继续在C02培养箱中培养18小时。 
③转染 
在室温下将含有1.2ug的pSCT-ADAM15h DNA和3.6ul Sinofection(北京义翘神州生物技术有限公司即Sino Biological Inc.，)的混合物培养20分钟。然后将该混合物加入到宿主细胞中，于37℃培养6小时。6hs后，去除培养基，加入1mL新鲜的DMEM+FBS+HT+pro培养。第2天用胰酶将细胞消化下来后计数，按1e3/w接种在96微孔板中，用含10％dFBS的DMEM+pro培养6h后，补加G418使其终浓度达到0.8mg/ml，培养基每2～3天换一次液，持续10天后耐G418的克隆逐步形成。用双抗夹心ELISA检测单克隆上清中ADAM15h表达量，选取表达量高的20个克隆进行MTX加压扩增ADAM15h基因。 
(3)ADAM15h基因的扩增 
通过在培养基中逐渐加入增量的MTX，扩增在转化细胞中转导的ADAM15h基因。最初在存在10nM MTX的培养基中培养，直到细胞达到融合状态。然后通过类似方式将MTX的浓度逐步增加到300nM。在每一步，使用ELISA检测确定ADAM15h表达水平。ADAM15h的水平随着MTX浓度的增加而增加。 
(4)亚克隆及ADAM15h生产细胞的选择 
选择300nM MTX下表达量高的克隆CHO-ADAM15h-G8进行单细胞克隆。将细胞计数后按0.5c/w接种至MW96，用IMDM+10％dFBS+300nM MTX培养，约15天后，单细胞克隆长大，用生长培养基换液，ELISA检测不同单细胞克隆的表达量，选择表达量高细胞生长好的3株克隆传至MW24中扩大培养。 
将选出的3株克隆悬浮驯化。综合细胞生长情况和ADAM15h表达水平确定生产细胞株CHO-ADAM15h-G8-11，冻存细胞。按照传统方法对培养上清用镍柱(Ni)纯化，将纯化后样品在还原条件下进行聚丙烯酞胺电泳和Western印迹分析，结果如图1和图2所示，表明产生的重组人ADAM15h与理论推测的ADAM15片段聚丙烯酞胺电泳和Western印迹分析图谱一致。 
实施例2、重组人ADAM15的ELISA检测 
通过ELISA方法检测重组人ADAM15的蛋白浓度，本实验检测所需蛋白及抗体均来自Sino Biological Inc.，具体操作步骤见下： 
(1)用包被液将兔抗人ADAM15单抗稀释至2ug/ml后包被在酶标板上，100ul/孔，4℃过夜。 
(2)弃去孔内液体，甩干，按300ul/孔加入洗液，洗板2次。 
(3)按300ul/孔加入封闭液，室温反应1小时。 
(4)重复步骤(2)。 
(5)将重组人ADAM15标准品稀释到1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.125ng/ml、0.0625ng/ml及0.03125ng/ml，同时将ADAM15样品进行相应的稀释，稀释后的样本按100ul/孔进行点样，室温反应2小时。 
(6)将HRP标记兔抗人ADAM15多抗稀释到1ug/ml，按100ul/孔进行加液，室温反应1小时。 
(7)重复步骤(2)。 
(8)加入200ul/孔的底物溶液，室温下避光反应20min。 
(9)加入50ul/孔的终止液，轻敲酶标板以混匀溶液。 
(10)立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。以OD-B值为横坐标，ADAM15-his标准品的浓度为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值计算出样品相应的浓度。标准曲线图见图3，该曲线的线性范围：OD-B在0.039～0.960之间；标准品的曲线方程：y＝1.011x+0.026。 
(11)按照上述ELISA检测方法测得CHO-ADAM15h-G8-11克隆培养上清中ADAM15h的纯度为10.7mg/L～16.1mg/L。 
实施例3、重组ADAM15h的纯化 
重组ADAM15h蛋白用Ni柱亲和纯化，具体方法为： 
(1).平衡柱子：5个柱体积平衡buffer(PH7.0 20mM PBS 500mM Nacl 20mM咪唑 0.4mM PMSF 10％甘油)平衡Ni柱。 
(2).上样，5个柱体积平衡buffer冲洗Ni柱。 
(3).洗脱：5-10个柱体积的Elution Buffer(B1：PH7.0 20mM PBS 500mM Nacl 50mM咪唑 0.4mM PMSF 10％甘油；B2：PH7.020mM PBS 500mM Nacl 500mM咪唑 0.4mM PMSF 10％甘油)洗脱目的蛋白。 
(4).待所有的样品完成以上操作后，取样品电泳。电泳检测结果见图1。 
实施例4、重组ADAM15h蛋白活性验证 
1.通过结合实验分析验证重组ADAM15h蛋白的活性 
(1)包被10ug/ml的PTK6-GST(Sino Biological Inc.)，用不同浓度生物素化的ADAM15-his蛋白与之结合，加入HRP标记的链亲和素(Vector Laboratories)，加入底物溶液，放置20min后终止，在450nm波长下读光密度值。 
(2)包被10ug/ml的SRC-GST(Sino Biological Inc.)，用不同浓度生物素化的ADAM15-his蛋白与之结合，加入HRP标记的链亲和素，加入底物溶液，放置20min后终止，在450nm波长下读光密度值。 
(3)包被10ug/ml的Mouse SRC-GST(Sino Biological Inc.)，用不同浓度生物素化的ADAM15-his蛋白与之结合，加入HRP标记的链亲和素，加入底物溶液，放置20min后终止，在450nm波长下读光密度值。 
(4)包被10ug/ml的LYN-GST(Sino Biological Inc.)，用不同浓度生物素化的ADAM15-his蛋白与之结合，加入HRP标记的链亲和素，加入底物溶液，放置20min后终止，在450nm波长下读光密度值。 
(5)以ADAM15h蛋白浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标做图。结果见图4，从图4可以看出，CHO表达的重组ADAM15h与其相互作用分子PTK6，SRC，mouseSRC及LYN都有很好的结合。 
2.通过测定切割荧光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2的能力检测重组ADAM15h酶活性。 
(1)用分析缓冲液(50mM Tris，10mM CaCl2，150mM NaCl，pH7.5)将重组ADAM15h稀释至100ug/ml。 
(2)等体积混合1.5ug/ml的thermolysin和稀释的重组ADAM15h，使thermolysin终浓度为0.75ug/ml、重组ADAM15h终浓度为50ug/ml。 
(3)37℃孵育30min。 
(4)加入0.05mM的phosphoramidon以终止反应。 
(5)室温放置15min。 
(6)用分析缓冲液将活化的重组ADAM15h稀释至10ng/ul. 
(7)用分析缓冲液将荧光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2稀释至40uM。 
(8)酶标黑孔板中放置50ul 10ng/ul的重组ADAM15h，加入50μl 40 μM的底物以起始反应。以含50μl分析缓冲液和50μl 40μM底物的孔作为对照。 
(9)分别在320nm激发光、405nm发射光下动力学顶读检测5min。 
(10)计算比活： 
(11)按照上述方法检测由CHO细胞表达得到的重组ADAM15h比活＞2.5pmoles/min/μg。 

Claims (9)

1.一种重组表达的ADAM15h蛋白，是由pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系后表达得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组ADAM15h蛋白，其特征在于：所述宿主细胞系为动物细胞。
3.根据权利要求1所述的重组ADAM15h蛋白，其特征在于：所述宿主细胞系为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
4.一种制备权利要求1所述重组ADAM15h蛋白的方法，是用pSCT-ADAM15h转化宿主细胞系，被转化的宿主细胞系经培养筛选出重组ADAM15h表达克隆，得到重组ADAM15h融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞系的培养筛选方法包括贴壁培养、悬浮培养或生物反应器上培养。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述筛选出的重组ADAM15h表达克隆是CHO ADAM15h-G8-11，该克隆是通过在培养基中加入增量氨甲喋吟(MTX)选择得到的。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括纯化重组ADAM15h的方法，即使用Ni柱亲和纯化的方法。
8.一种检测权利要求1所述重组ADAM15h蛋白的方法，其特征在于以纯化的重组ADAM15h与相关蛋白SRC、PTK6、LYN结合进行检测。
9.一种检测权利要求1所述重组ADAM15h蛋白的方法，其特征在于以纯化的重组ADAM15h与荧光肽底物Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2作用检测酶活性的方法。
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