JP5306659B2 - 抗ヒトα9インテグリン抗体とその用途 - Google Patents
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Description
M−1)などが知られている。また、α4インテグリンが特異的に認識するリガンドとしてファイブロネクチンのCS−1ドメイン、MadCAM−1(α4β7)などが知られている。一方、α9インテグリンが特異的に認識するリガンドは、テネイシンC、プラスミンなどが知られている。
(1)配列番号1〜12のうちのいずれかのアミノ酸配列を含有する、抗ヒトα9インテグリン抗体。
(2)配列番号1、3、5、7、9、または11のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα9インテグリン抗体。
(3)配列番号1、3、5、7、9、および11のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα9インテグリン抗体。
(4)配列番号2、4、6、8、10、または12のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα9インテグリン抗体。
(5)配列番号2、4、6、8、10、および12のアミノ酸配列を含有する抗ヒトα9インテグリン抗体。
(6)重鎖の相補性決定領域(CDRH)におけるアミノ酸配列として配列番号1〜6のいずれかのアミノ酸配列を、軽鎖の相補性決定領域(CDRL)におけるアミノ酸配列として配列番号7〜12のいずれかのアミノ酸配列を含有する抗ヒトα9インテグリン抗体。
(7)ヒトα9インテグリンと、α9インテグリンのリガンドとの結合を阻害する、上記(1)〜(6)のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体。
(8)モノクローナル抗体である、上記(1)〜(7)のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体。
(9)キメラ抗体である、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体。
(10)ヒト化抗体である、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体。
(11)ヒト抗体である、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体。
(12)受託番号FERM BP−10830またはFERM BP−10831で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα9インテグリン抗体。
(13)上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
(14)上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体および抗ヒトα4インテグリン抗体の両方を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
(15)上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
(16)上記(1)〜(12)のいずれかに記載の抗ヒトαインテグリン抗体を産生する細胞。
(17)受託番号FERM BP−10830またはFERM BP−10831で標示されるハイブリドーマ細胞。
(18)α9インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチドを用いることを特徴とする、α9インテグリンの活性を阻害する化合物のスクリーニング方法。
α4インテグリンに対する抗体であるTysabri(登録商標)(natalizumab)は2004年11月にバイオジェン・アイデック(Biogen Idec Inc.、米マサチューセッツ州)とエラン(Elan Corporation、アイルランド)が多発性硬化症治療薬として米食品医薬品局(FDA)から承認を受けている。また、Tysabri(登録商標)はクローン病、リウマチ様関節炎等の疾患を対象として臨床開発されている。なお、P4C2という抗ヒトα4β1インテグリン・モノクローナル抗体が実験室レベルで用いられている。
α9インテグリンに対する抗体を作製するために、マウス線維芽細胞であるNIH−3T3細胞へ遺伝子導入を行い、ヒトα9インテグリンを過剰発現する細胞株を樹立し、この細胞を抗原としてマウスに免疫した。
細胞融合で得られた種々のハイブリドーマからヒトα9インテグリンのみに反応するクローンを効率よく得るために、同じインテグリンファミリーであるヒトα4インテグリンをCHO−K1細胞に発現させた細胞を用いて他のインテグリンとは交差反応性を示さず、親細胞(CHO−K1)の細胞表面抗原とは反応しないクローンを選抜することにより、効率的にヒトα9インテグリンに特異的に反応する阻害抗体を得た。
本発明は、ヒトα9インテグリンに対するモノクローナル抗体を提供する。本発明において、「抗体」とは、抗原であるα9インテグリンまたはその部分ペプチドに特異的に結合する抗体分子全体またはその断片(例えば、Fab、Fab′、F(ab′)2、などの断片)を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、本発明においてはモノクローナル抗体を意味する。また、本発明において「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体を包含する。
[α9インテグリン(抗原)]
抗原は、免疫される動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常1〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、マウス、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等が挙げられるが、本発明ではマウスが好適に用いられる。
[抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合]
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマ細胞が生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI 1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業(株))あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬(株))などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常、5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%CO2下で行なうことができる。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えばプロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.(Amersham Biosciences)等が挙げられる。
得られた抗体を、公知の方法または市販のキットを用いて各種標識化(例えば、ビオチン標識、FITC標識、APC標識)できる。本発明では、Biotin Labeling Kit(同仁化学)を用いたビオチン標識が好適に用いられる。
インテグリンの役割は、細胞と細胞外マトリックス(ECM)の接着、固定のみならず、細胞外マトリックスからの情報を細胞内シグナルに変換し、細胞の増殖、運動、細胞死、分化などの調節を担っていることが解明されてきている。従って、得られたモノクローナル抗体は、ECMとα9インテグリンとの結合を阻害することにより、ECMからの情報の細胞内シグナル伝達を遮断できることから、ECMが関与する疾患の治療が可能である。α9インテグリンに結合するECM、およびα9リガンドとしてOPN、ファイブロネクチン、プロペプチド−フォンビルブラントファククー(pp−vWF)、組織型トランスグルタミナーゼ(tTG)、第XIII血液凝固因子、Vascular Ce11 Adhesion Molecul
e-1(VCAM−1)、テネイシンC、プラスミンなどが知られている。これらのECMとα9インテグリンを発現している細胞や癌細胞を用い、得られたモノクローナル抗体の存在下での結合阻害をin vitroで観察することにより、本発明のモノクローナル抗体の対象疾患を見出すことができる。
本発明の抗体(特に、モノクローナル抗体)を有効成分とする製剤は、癌(例えば癌細胞の増殖、転移)、炎症性疾患(例えば関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、綿維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎、クローン病))、感染症(例えば肝炎)、自己免疫疾患(例えば全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、自己免疫性甲状腺疾患、尿細管間質性腎炎、重症筋無力症)および骨疾患(例えば骨粗鬆症)等の治療剤(therapeutic agent)または予防剤(prophylactic agent)として用いることができる。
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる医薬組成物は、炎症性疾患、例えばリウマチ関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫等の診断剤、また臓器移植後の慢性拒絶反応抑制、全身性自己免疫疾患・エリテマトーデス・ぶどう膜炎・ベーチェト病・多発性筋炎・糸状体増殖性腎炎・サルコイドーシス等の自己免疫疾患の診断剤として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、α9インテグリンを特異的に認識することができるので、被検液中のα9インテグリンの定量、特にサンドイッチ免疫測定法、競合法、あるいはイムノメトリック法などによる定量などに使用することができる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要としない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
本発明の抗体が認識するヒトα9インテグリン上のエピトープを利用して、ヒトα9インテグリンの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。具体的には、本発明は、ヒトα9インテグリンのアミノ酸配列を含有するペプチド(以下、「ペプチドA」という)を用いることを特徴とする、ヒトα9インテグリンの活性を阻害する低分子化合物のスクリーニング方法を提供する。
[ヒトα9インテグリンに対する抗体の作製]
ヒトα9インテグリンに対する抗体作製は、以下のようにしてBALB/cマウス3匹に対して免疫を行った。まず、ヒトα9インテグリン発現細胞(ヒトα9/NIH−3T3細胞)を3×106細胞/匹を腹腔内投与し、さらにその1週間後と2週間後に、ヒトα9/NIH−3T3細胞を3×106細胞/匹を腹腔内投与した。さらに一週間後、ヒトα9/NIH−3T3細胞を2×106細胞/匹を静脈内投与した。ヒトα9/CHO−K1細胞及びヒトα9インテグリンを内在的に発現するヒトメラノーマ細胞株(G361細胞)に反応し、且つ、ヒトα4インテグリン発現CHO−K1細胞に反応しないクローンを抗α9インテグリン抗体とした。その結果、抗ヒトα9インテグリン抗体を産生するハイブリドーマ細胞2クローン(K33N、M35A)を樹立した。
[抗ヒトα9インテグリン抗体の相補認識領域(CDR)の解析]
ヒトα9インテグリン抗体(K33N、M35A)を産生するハイブリドーマからmRNAを抽出して、逆転写によってcDNAを作製した。このcDNAを鋳型とし、ScFvクローニング用プライマー(Light Primer Mix、Heavy Primer Mix;アマシャムバイオサイエンス社)を用いてPCRを行い、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域をそれぞれ伸長・増幅した。次に、PCR産物を常法に基づいてpCRII TOPO vectorに組み込んだ。これをシ
ークエンスしてアミノ酸配列を決定した。各抗体について3回ずつ上記の操作を行った。
[CDRH1]
K33N: SYYMN(配列番号1)
M35A: SYWIH(配列番号2)
[CDRH2]
K33N: WIFPGSGNTKYNEKFKGK(配列番号3)
M35A: EINPSSGRTNFIENFETK(配列番号4)
[CDRH3]
K33N: SWVSYERGYYFDY(配列番号5)
M35A: LAYGNYSWFAY(配列番号6)
[CDRL1]
K33N: RASENIYYSLA(配列番号7)
M35A: RASETVDSYGNTFMH(配列番号8)
[CDRL2]
K33N: NANSLED(配列番号9)
M35A: LASNLES(配列番号10)
[CDRL3]
K33N: KQAYDVPYT(配列番号11)
M35A: QQNNEDPYT(配列番号12)
ハイブリドーマ細胞(K33N)を10%牛胎児血清(FBS;HyClone)含有TIL Media I培地(免疫生物研究所)で7.5%CO2、37℃で培養し、増殖させた。 全RNAは、Invitrogenのプロトコールに従い、TRIzol試薬(Invitrogen)を用い、約3×106個のハイブリドーマ細胞から抽出した。 オリゴdT-プライマーを使用した逆転写反応でのcDNAの作製は、GeneRacer Kit(Invitrogen)を用い、Invitrogenのプロトコールに従った。H鎖とL鎖の可変領域cDNAは、マウス定常領域γ1とκにそれぞれ相当する3' primerおよびGeneRacer Kit 添付のGeneRacer 5' primer(5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'(配列番号14))を用い、Phusion DNA polymerase(New England Biolabs)を使用し、PCRで増幅した。 H鎖可変領域(VH)のPCR増幅のための3' primaerは 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(配列番号15)である。L鎖可変領域(VL)のPCR増幅のための3' primerは、5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(配列番号16)である。増幅したVHとVLの cDNAは配列決定のためにpCR4Blunt-TOPO vector(Invitrogen)中でサブクローニングした。可変領域のDNA配列解析はTocore(Menlo Park)で行った。
ハイブリドーマ細胞(M35A)を培養、増殖させた後、細胞の全RNAはRNAiso(タカラバイオ社)を用いて、Acid Guanidine-Phenol-Chloroform法(AGPC法)で抽出した。抽出したRNAは常法によりDNase I 処理を行った後、フェノールクロロホルム処理を行い、DNase I を除き、エタノール沈殿で精製した。得られたRNA は再度蒸留水に懸濁して解析に用いた。DNase I 処理後の RNA 約1μg を鋳型に、Random Primer(9mer)を用いて逆転写酵素Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H free)で逆転写反応を行った。可変領域のPCR 増幅には、各逆転写反応液の一部を鋳型とし、H 鎖はプライマーHeavy Primer 1 とHeavy Primer 2(アマシャムバイオサイエンス社)を、L 鎖にプライマーLight Primer Mix(アマシャムバイオサイエンス社)をそれぞれ用い、PCR 酵素にはタカラTaKaRa LA Taq を使用した。
[抗ヒトα9インテグリン抗体の細胞接着阻害効果]
細胞接着する際にはα9インテグリンがOPN、ファイブロネクチン、テネイシンC、VCAM−1などの細胞外マトリックス(ECM)を含むリガンドと結合することから、得られた新規な抗ヒトα9インテグリン抗体の細胞接着阻害をα9インテグリン発現細胞(ヒトメラノーマ細胞G361)とリガンドの結合阻害で検討した。
[抗ヒトα9インテグリン抗体の認識部位の差異]
新規に作製した抗ヒトα9インテグリン抗体K33Nの細胞接着阻害効果がY9A2と同様な挙動を示したので、ヒトα9インテグリン発現細胞(hα9/CHO)に対する両抗体の競合反応をFACSで検出することにより、認識部位の差異を調べた。
Claims (10)
- 配列番号1、3、および5のアミノ酸配列をそれぞれ重鎖の相補性決定領域(CDRH)のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3として含有する当該重鎖の抗原結合領域であって、受託番号FERM BP−10830で標示されるハイブリドーマにより産生される抗ヒトα9インテグリン抗体の当該重鎖の抗原結合領域を含有し、配列番号7、9、および11のアミノ酸配列をそれぞれ軽鎖の相補性決定領域(CDRL)のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3として含有する当該軽鎖の抗原結合領域であって、受託番号FERM BP−10830で標示されるハイブリドーマにより産生される抗ヒトα9インテグリン抗体の当該軽鎖の抗原結合領域を含有する、抗ヒトα9インテグリン抗体。
- ヒトα9インテグリンと、α9インテグリンのリガンドとの結合を阻害する、請求項1に記載の抗ヒトα9インテグリン抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1または2に記載の抗ヒトα9インテグリン抗体。
- キメラ抗体である、請求項1〜3のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体。
- 受託番号FERM BP−10830で標示されるハイブリドーマ細胞により産生される抗ヒトα9インテグリン抗体。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体および抗ヒトα4インテグリン抗体の両方を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の治療剤。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗ヒトα9インテグリン抗体を有効成分として含む、癌、炎症性疾患、感染症、自己免疫疾患または骨疾患の診断剤。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗ヒトαインテグリン抗体を産生する細胞。
- 受託番号FERM BP−10830で標示されるハイブリドーマ細胞。
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