JP5781504B2 - 細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列rgdに特異的なヒト化抗体およびそれらの使用 - Google Patents
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本明細書で使用する用語「抗体」は、所望の抗原またはRGD配列などの所望の配列と免疫特異的に結合することができる抗体分子を指し、これは抗体分子全体を包含し、抗体の抗原結合断片を含んだ抗体の断片を包含することができる。
RGD配列を免疫特異的に認識する抗体は、当技術分野で知られている任意の適切な方法によって作製することができる。
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作に関して当技術分野でよく知られている方法、例えば組換えDNA技法、部位特異的突然変異誘発法、PCRなどを使用することによって操作することができる(例えば、いずれもその全容を参照によって本明細書に組み込む、Sambrook et al., 上記、およびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY中に記載された技法を参照)。抗体にはエピトープ結合ドメイン領域または任意の部分にアミノ酸の置換、欠失および/または挿入などの突然変異を導入して、生物活性を向上または低減することができる。
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、マウスモノクローナル抗体に由来するV領域およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を有する抗体などである。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野で知られている。例えば、参照によってそれらの全容を本明細書に組み込む、Morrison, Science, 229: 1202, 1985; Oi et al., BioTechniques, 4: 214 1986; Gillies et al., J. Immunol.Methods, 125: 191-202, 1989、米国特許第5,807,715号、同第4,816,567号、および同第4,816,397号を参照。
マウスV遺伝子のクローニングおよび配列決定
様々な方法が、標的マウスモノクローナル抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングするのに利用可能である。例えば、SMART RACE cDNA増幅キット(BD Biosciences、CA)またはGeneRacerキット(Invitrogen、CA)を使用した5’RACE(cDNA末端の迅速増幅)法が一般に使用されている。5’RACE用の遺伝子特異的プライマーは、それがVHおよびVLのすぐ下流に結合することができるように、標的モノクローナル抗体のH鎖およびL鎖のアイソタイプに基づいて調製することができる。したがって、5’RACEプライマーは、γ1、γ2a、γ2bまたはγ3などのマウスにおけるそれぞれの亜型に特異的であるように設計することができる。あるいは、全ての亜型に共通なプライマーを、亜型間のコンセンサスまたは非常に相同的な領域に基づいて設計することができる。Tsurushita中では、以下の5’RACEプライマーが例として開示される:
(i)5’−GCCAGTGGATAGACTGATGG−(配列番号82)(マウスγ1、γ2a、γ2bおよびγ3H鎖のクローニング用)
(ii)5’−GATGGATACAGTTGGTGCAGC−(配列番号83)(マウスkL鎖のクローニング用)。
VHおよびVLの配列に基づいて、CDRの立体配座構造を維持するのにおそらく重要である標的抗体のフレームワーク残基を、例えばR.Levy et al., 1989, Biochemistry28: 7168-7175によって記載された方法によって、およびB.Zilber et al., 1990, Biochemistry29: 10032-10041によって記載された方法によって最初に同定する。典型的には、VHおよびVLのそれぞれは14個の構造上有意なセグメントに分けられ、これらは免疫グロブリンスーパーファミリーのドメイン構造を含むβ鎖およびループ様構造である。標的抗体由来の各セグメントのアミノ酸配列を、PDBデータベースにおける知られている構造の対応する抗体セグメントと合わせる(H.M.Berman et al., 2000, Nucleic Acids Res.28: 235-342参照)。多重配列アラインメントによって、標的セグメントのそれぞれと最高の配列相同性を有する対応するセグメントを選択し、V領域の三次元モデルを構築する。構造を最適化するために、このモデルを多サイクルの共役勾配法によるエネルギー最小化に施す(例えば、ENCADを使用して、またはPress et al., 1990, "Numerical Recipes, Cambridge University Press, Cambridgeによって記載されたように、Weiner et al., 1981, J.Comp.Chem.2: 287-303によるAMBER、BioMolecularModellingで利用可能な3D-JIG-SAW、またはCancer Research UKによって運営される「BMM」ウェブサイト、またはSwiss Institute of Bioinformatics, Genevaによって運営されるExPASy Proteomics Serverウェブサイトで利用可能なSWISS-MODEL)。
V領域の構造のモデル化と並行して、それぞれマウスVHおよびVLのcDNAクローニングから推定したアミノ酸配列を、データベース、例えばKabatデータベース(Johnson et al., 2000, Nucleic Acids Res.28: 214-218を参照)、GenBankなどにおけるヒトV領域の配列と比較する。マウスの配列と少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも95%同一の全体配列同一率を有するヒトFRは、例えばSmith−Watermanのアルゴリズム(Gusfield, 1997, "Algorithms on Strings, Trees, and Sequences", Cambridge University Press, Cambridgeによる)、またはBLAST(Karlin et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA87: 2264-2268による)などを使用して検索することができる。これらのヒトの配列は、cDNAベースおよびタンパク質由来配列に基づいてよいが、しかしながら、生殖細胞系の使用が好ましいことが多い。cDNAベース、タンパク質由来配列の体細胞超突然変異と関係がある潜在的免疫原性を排除する際に、それが有用である可能性があるからである。代替では、Queen et al.(1989、上記)中に記載されたように、コンセンサスフレームワーク配列の使用によって、cDNAベースまたはタンパク質由来配列から得たフレームワーク中のこのような超突然変異残基を同定し除去することもできる。生殖細胞系VHセグメントをアクセプターフレームワークとして使用する場合、15および16ではなく第14染色体上にコードされるVHセグメントを使用しなければならない。第14染色体上のセグメントのみが機能的VHを生成するからである。
Queen et al.(1989、上記)によれば、CDRの約4〜6Å以内のフレームワークアミノ酸を同定することが必要である。これらの残基は、正確なCDR構造を支えるおそらく重要なフレームワーク残基であると考えられるからである。このようなプロセスは、原子座標からの原子間距離を計算する国立科学財団(NSF)によって運営されるMolecular Visualization Freewareウェブサイトで利用可能なRASMOLなどのコンピュータプログラムを使用して、またはコンピュータモデルの手検測によって実施することができる。重要なフレームワーク位置におけるアミノ酸がマウスドナー配列とヒトアクセプター配列の間で異なる場合、マウスドナーのそれらを通常ヒト残基に置換する。しかしながら、このような残基がCDR構造を支持するのに最小の貢献度を有する場合、対応するヒト残基を典型的に使用する。さらに、選択したヒトアクセプターが、V領域配列の約10〜20%未満に生じる「異常な」アミノ酸を含有する場合、それらは親和性成熟中の体細胞超突然変異の結果である可能性があり、ドナー残基と置換してヒトにおける潜在的免疫原性を回避しなければならない。
薬剤としてヒト化抗体を与えるため、効率良く一貫した生成系をしたがって調製する必要がある。例えば、ヒト化抗体に適した発現ベクターはH鎖およびL鎖配列を挿入することによって調製し、発現ベクターでトランスフェクトした高生産性細胞系は、作業用細胞バンク(WCB)の安定した半永久的供給源として働く、マスター細胞バンク(MCB)の種細胞として得ることができる。次いで、ヒト化抗体は、WCB由来の作業用細胞を培養し培養培地を回収することによって調製することができる。
本発明は、RGD配列を免疫特異的に認識する前に記載したヒト化抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物を提供する。活性成分として本発明のヒト化抗体を含む医薬組成物は、癌、例えば癌細胞の増殖または転移、および炎症疾患、例えば慢性関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患(潰瘍性大腸炎およびクローン病)、自己免疫疾患などだけには限られないが、これらを含めたRGDタンパク質と関係がある障害または疾患を予防および/または治療するための作用物質として使用することができる。
本発明のヒト化抗体を含む医薬組成物は、癌、例えば癌細胞の増殖または転移、および炎症疾患、例えば慢性関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫などの診断薬として、または臓器移植後の慢性拒絶反応、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ベーチェット病、多発性筋炎、増殖性糸球体腎炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患の診断薬として使用することができる。本発明のヒト化抗体はRGD配列を特異的に認識することができ、したがってこれらを使用して、試験流体中のRGDタンパク質の定量化、特にサンドイッチイムノアッセイ、競合アッセイ、イムノメトリー、ネフェロメトリーなど、免疫染色などによる定量化を可能にすることができる。これらの免疫法を本発明のアッセイ法に適用する際に、何らかの特定条件、手順などを言及することは必要とされない。当技術分野で通常の技術的考慮事項を従来の条件および手順に加えることによって、アッセイシステムを構築することで十分である。これらの一般的な技術的意義の詳細に関しては、総説、教本などを参照することができる。
これはマウス33E10およびヒト33E10と共通のCDRH1のアミノ酸配列を示す。
これはマウス33E10およびヒト33E10と共通のCDRH2のアミノ酸配列を示す。
これはマウス33E10およびヒト33E10と共通のCDRH3のアミノ酸配列を示す。
これはマウス33E10およびヒト33E10と共通のCDRL1のアミノ酸配列を示す。
これはマウス33E10およびヒト33E10と共通のCDRL2のアミノ酸配列を示す。
これはマウス33E10およびヒト33E10と共通のCDRL3のアミノ酸配列を示す。
これはSpeIおよびHindIII部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むHu33E10VH5遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含むHu33E10VH5遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはSpeIおよびHindIII部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むHu33E10VH7遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含むHu33E10VH7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはSpeIおよびHindIII部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むHu33E10VH7.8遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含むHu33E10VH7.8遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはNheIおよびEcoRI部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むHu33E10VL6遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含むHu33E10VL6遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはNheIおよびEcoRI部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むHu33E10VLv2遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含むHu33E10VLv2遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはHu33E10重鎖および軽鎖cDNAのPCR増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド[CMV2]を示す。
これはHu33E10重鎖および軽鎖cDNAのPCR増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド[JΝΤ026]を示す。
これはHu33E10重鎖および軽鎖cDNAのPCR増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド[JNT080]を示す。
これはHu33E10重鎖および軽鎖cDNAのPCR増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド[JNT082]を示す。
これはHu33E10重鎖および軽鎖cDNAのPCR増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド[JNT084]を示す。
これはHu33E10重鎖および軽鎖cDNAのPCR増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド[JNT097]を示す。
これはHu33E10重鎖および軽鎖cDNAのPCR増幅および配列決定に使用したオリゴヌクレオチド[JNT098]を示す。
これはNS0−Hu33E10−4およびNS0−Hu33E10−6において発現されるVH7およびγ−1重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す。
これはNS0−Hu33E10−4およびNS0−Hu33E10−6において発現されるVH7およびγ−1重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはNS0−Hu33E10−5において発現されるVH7.8およびγ−1重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す。
これはNS0−Hu33E10−5において発現されるVH7.8およびγ−1重鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはNS0−Hu33E10−4およびNS0−Hu33E10−5において発現されるVL6およびkappa軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す。
これはNS0−Hu33E10−4およびNS0−Hu33E10−5において発現されるVL6およびkappa軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはNS0−Hu33E10−6において発現されるVLv2およびkappa軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列を示す。
これはNS0−Hu33E10−6において発現されるVLv2およびkappa軽鎖定常領域に関するコード領域のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これは33E10VLのアミノ酸配列を示す。
これはHu33E10VLv2のアミノ酸配列を示す。
これはマウス33E10VHcDNAのヌクレオチド配列を示す。
これはマウス33E10VHcDNAのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはマウス33E10VLcDNAのヌクレオチド配列を示す。
これはマウス33E10VLcDNAのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはSpeIおよびHindIII部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含む設計33E10VH遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含む設計33E10VH遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはNheIおよびEcoRI部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含む設計33E10VL遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含む設計33E10VL遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これは33E10VHのアミノ酸配列を示す。
これはヒト化33E10(Hu33E10)VH1のアミノ酸配列を示す。
これは33E10VLのアミノ酸配列を示す。
これはヒト化33E10(Hu33E10)VL1のアミノ酸配列を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ220]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ206]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ207]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ208]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ209]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ210]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ211]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ212]を示す。
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これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ214]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ215]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ216]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ217]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ218]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ219]を示す。
これはHu33E10VH1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ221]を示す。
これはHu33E10VL1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ116]を示す。
これはHu33E10VL1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ193]を示す。
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これはHu33E10VL1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ196]を示す。
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これはHu33E10VL1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ205]を示す。
これはHu33E10VL1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ101]を示す。
これはHu33E10VL1遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド[JNJ117]を示す。
これはSpeIおよびHindIII部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むHu33E10VH1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含むHu33E10VH1遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはNheIおよびEcoRI部位と隣接するシグナルペプチドおよびイントロン配列をコードする配列を含むHu33E10VL1遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはシグナルペプチドを含むHu33E10VL1遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これは5’RACEプライマーのヌクレオチド配列を示す。
これは5’RACEプライマーのヌクレオチド配列を示す。
これはGeneRacer5’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
これは33E10VH3’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
これは33E10VL3’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
これは33E10VH5’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
これは33E10VH3’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
これは33E10VL5’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
これは33E10VL3’プライマーのヌクレオチド配列を示す。
これはHu33E10VH5遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはHu33E10VH5遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはHu33E10VH7遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはHu33E10VH7遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはHu33E10VH7.8遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはHu33E10VH7.8のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはHu33E10VL6遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはHu33E10VL6遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
これはHu33E10VLv2遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
これはHu33E10VLv2遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を示す。
マウス33E10ハイブリドーマ細胞を、7.5%CO2インキュベーター中で37℃において、10%ウシ胎児血清(FBS;HyClone、Logan、UT)を含有するTIL培地I(Immuno−Biological Laboratories、群馬、日本)中で増殖させた。全RNA(total RNA)は、供給者のプロトコールに従いTRIzol試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA)を使用して約3×106個のハイブリドーマ細胞から抽出した。オリゴdTプライマー処理cDNAは、供給者のプロトコールに従いGeneRacerキット(Invitrogen)を使用して合成した。33E10重鎖および軽鎖に関する可変領域cDNAは、マウスγ−1およびkappa鎖定常領域とそれぞれアニーリングする3’プライマー、およびGeneRacerキット中に供給されたGeneRacer5’プライマー(5’−CGACTGGAGCACGAGGACACTGA−3’(配列番号84))を使用して、Phusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs、Beverly、MA)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅した。重鎖可変領域(VH)のPCR増幅用に、3’プライマーは配列5’−GCCAGTGGATAGACAGATGG−3’(配列番号85)を有する。軽鎖可変領域(VL)のPCR増幅用に、3’プライマーは配列5’−GATGGATACAGTTGGTGCAGC−3’(配列番号86)を有する。増幅したVHおよびVLcDNAは配列決定用にpCR4Blunt−TOPOベクター(Invitrogen)にクローニングした。可変領域のDNA配列決定はTocore(Menlo Park、CA)で実施した。数個の重鎖および軽鎖クローンを配列決定し、典型的なマウス重鎖および軽鎖可変領域と相同的な独自の配列を同定した。33E10VHおよびVLの推定アミノ酸配列と共にコンセンサスcDNA配列をそれぞれ図1および2中に示す。
33E10VHをコードする遺伝子を、鋳型として33E10VHcDNA、5’プライマーとして5’−GGGACTAGTACCACCATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATT−3’(配列番号87)(SpeI部位に下線を引く)、および3’プライマーとして5’−GGGAAGCTTGAAGTTAGGACTCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC−3’(配列番号88)(HindIII部位に下線を引く)(図3)を使用してPCRによって、スプライスドナーシグナルおよび適切な隣接制限酵素部位を含むエクソンとして作製した。同様に、33E10VLをコードする遺伝子を、鋳型として33E10VLcDNA、5’プライマーとして5’−GGGGCTAGCACCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG−3’(配列番号89)(NheI部位に下線を引く)、および3’プライマーとして5’−GGGGAATTCTTTGGATTCTACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC−3’(配列番号90)(EcoRI部位に下線を引く)(図4)を使用してPCRによって、スプライスドナーシグナルおよび適切な隣接制限酵素部位を含むエクソンとして作製した。33E10VHおよびVLエクソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれマウス生殖細胞JH3およびJK1配列に由来した(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH公開番号91−3242、米国厚生省、1991)。PCR増幅断片はQIAquickゲル抽出キット(Qiagen、Valencia、CA)を使用してゲル精製し、(VHに関して)SpeIおよびHindIIIまたは(VLに関して)NheIおよびEcoRIで消化し、キメラ33E10IgGl/κ抗体の産生用にヒトγ−1およびkappa定常領域を保持する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。生成した発現ベクター、pCh33E10の概略構造は図5中に示す。
33E10可変領域のヒト化を、Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86: 10029-10033、1989)によって概説されたように実施した。最初に、33E10可変領域の三次元分子モデルをコンピュータプログラムの助力によって構築した。次に、ヒト可変領域配列に対する相同性検索に基づいて、33E10VHと高い相同性を有するU03400(GenBank受託番号)のヒトVHアミノ酸配列を、ヒト化33E10VHのフレームワークを得るためのアクセプターとして選択した。同様に、X72452(GenBank受託番号)のヒトVLアミノ酸配列を33E10VLのヒト化用のアクセプターとして選択した。
キメラおよびヒト化33E10IgG1/κ抗体のそれぞれを安定的に産生する細胞系を得るために、発現ベクターpCh33E10およびpHu33E10−1をそれぞれ、マウスミエローマ細胞系NS0(European Collection of Animal Cell Cultures、Salisbury、Wiltshire、UK)の染色体に導入した。7.5%CO2インキュベーター中で37℃において、NS0細胞を10%FBSを含有するDME培地中で増殖させた。NS0細胞への安定したトランスフェクションは、Bebbington et al.(Bio/Technology10: 169-175、1992)中に記載されたエレクトロポレーションによって実施した。トランスフェクション前に、それぞれの発現ベクターはFspIを使用して線状化した。約107個の細胞を10μgの線状化プラスミドでトランスフェクトし、10%FBSを含有するDME培地中に縣濁し、数枚の96ウェルプレートに平板培養した。24〜48時間後、選択培地(10%FBSを含有するDME培地、HT培地サプリメント(Sigma、St.Louis、MO)、0.25mg/mlキサンチンおよび1μg/mlミコフェノール酸)を施した。選択開始後約10日で、培養上清を抗体産生に関してアッセイした。
hOPN5−BSAとCh33E10およびHu33E10−VHl/VL6IgG1/κ抗体の結合をELISAによって調べた。抗原として、ウシ血清アルブミンと結合した合成オリゴペプチド(Cys−Val−Asp−Thr−Tyr−Asp−Gly−Arg−Gly−Asp−Ser−Val−Val−Tyr−Gly−Leu−Arg−Ser;Gene Techno Scienceにより提供された)(hOPN5−BSA)を使用した。典型的な実験では、0.2MのNa2C03バッファー(pH9.4)に溶かした100μl/ウェルの1μg/mlのhOPN5−BSAで4℃において一晩、ELISAプレートをコーティングし、洗浄バッファーで洗浄し、300μl/ウェルのブロッキングバッファーで室温において1時間ブロッキングした。洗浄バッファーで洗浄した後、ELISAバッファーに適切に希釈したサンプルを100μl/ウェルでELISAプレートに施した。4℃において一晩ELISAプレートをインキュベートし洗浄バッファーで洗浄した後、100μl/ウェルの1/2,000希釈HRP結合ヤギ抗ヒトγ鎖ポリクローナル抗体(SouthernBiotech)を使用して、結合した抗体を検出した。室温で1時間のインキュベーションおよび洗浄バッファーでの洗浄後、発色現像は100μl/ウェルのABTS基質を加えることによって実施し、100μl/ウェルの2%シュウ酸で停止させた。吸光度は405nmで読み取った。
どのヒト化VH1およびVL6遺伝子がHu33E10−VHl/VL6の抗原結合親和性の消失の原因であるかを確認するために、1つがマウスVHおよびヒト化VL6(MoHu33E10)からなり、および他方がヒト化VH1およびマウスVL(HuMo33E10)からなる、2つの組換えIgG1/κ抗体を作製した。MoHu33E10およびHuMo33E10抗体の分析によって、Hu33E10−VH1/VL6の親和性の消失は大部分はVH1遺伝子に原因があり、部分的にはVL1遺伝子に原因があったことが分かった(ここでデータ示す)。
VL1遺伝子の予備突然変異分析によって、Hu33E10−VH1/VL6の結合親和性の消失に貢献するいかなる特定のフレームワークアミノ酸残基も確認することはできなかったが(データ示さず)、VL1遺伝子は部分的には親和性消失の原因であることが疑われた。VL1遺伝子をさらに特徴付ける代わりに、異なるヒトフレームワークに基づく新たなヒト化33E10VL(VLv2)を設計した(図19)。VLv2用に、M29467のヒトアミノ酸配列(GenBank受託番号)をアクセプターとして選択した。CDRとの有意な相互作用が予想された位置22および37では、マウス33E10VLのアミノ酸残基はヒト化型で保持された。NheIおよびEcoRI部位と隣接するHu33E10VLv2遺伝子(図20)はGenScript USA Inc.(Piscataway、NJ)で合成された。VL6遺伝子とVLv2遺伝子は、同じシグナルペプチド配列およびスプライスドナーシグナルを共有する(図14および20)。
PCRマイコプラズマ検出セット(Takara Bio USA、Madison、WT)を用いた試験によって、NS0−Ch33E102C11、NS0−Hu33E10−45D3、NS0−Hu33E10−51E5およびNS0−Hu33E10−6−I−15はいずれも、マイコプラズマの存在に関して陰性であったことを示した。
hOPN5−BSAに対するHu33E10−VH7/VLv2IgG1/κの親和性は、Ch33E10IgG1/κの親和性の3倍以内であったと決定した。
図27は、ヒト化抗OPN抗体が、hOPN5−BSAとMDA−MB−435Sの接着を阻害したことを示す。MDA−MB−435Sヒト乳癌細胞系はアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から得て、10%ウシ胎児血清を補充したDMEM中で培養した。96ウェルプレートは37℃において1時間hOPN5−BSA(2μg/ml)でコーティングし、次に室温において1時間0.5%BSAで処理した。ヒト免疫グロブリンG1kappa、Ch33E10、Hu33E10−VH7.8/VL6(EJ3−1−1)、Hu33E10−VH7/VL6(E3−1)、Hu33E10−VH7/VLv2(SP−2)、およびマウス33E10抗体を0.25%BSA、DMEM中に溶かし、100μl/mlで始めて様々な濃度で処理し、37℃において20分間連続2倍希釈した。2×104個のMDA−MB−435S細胞をそれぞれのウェルに加えた。37℃で1時間のインキュベーション後、培地を除去し、(37℃まで温めた)温かいPBSで軽く二回洗浄した。接着細胞は固定し、20%メタノールに溶かした0.5%クリスタルバイオレットで染色し、20%酢酸で溶かした。吸光度は590nmで測定した。抗体を加えずに、阻害率はこの吸光度で標準化した。
マウス抗RGDモノクローナル抗体を産生する33E10および35B6として本明細書に示すハイブリドーマは、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従い、2005年10月27日に茨城県つくば市東1−1−1中央第6(郵便番号:305−8566)に位置する産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに寄託され、それぞれ受託番号FERMBP−10440およびFERMBP−10441を与えられ、これらはいずれもその全容を参照によって本明細書に組み込む。
Claims (23)
- RGD配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合断片であって、
(i)VHを含むH鎖であって、前記VHが配列番号92、94または96のアミノ酸配列を含むH鎖、および
(ii)VLを含むL鎖であって、前記VLが配列番号98または100のアミノ酸配列を含むL鎖を含むヒト化抗体またはその抗原結合断片。 - 前記VHが配列番号91、93または95のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、前記VLが配列番号97または99のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VHが配列番号94のアミノ酸配列を含み、前記VLが配列番号100のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
- 前記H鎖が配列番号25または27のアミノ酸配列を含み、前記L鎖が配列番号29または31のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
- 前記H鎖が配列番号25のアミノ酸配列を含み、前記L鎖が配列番号31のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸分子であって、配列番号92、94または96のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号91、93または95のヌクレオチド配列を含む、請求項6に記載の単離核酸分子。
- 請求項1に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸分子であって、配列番号98または100のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号97または99のヌクレオチド配列を含む、請求項8に記載の単離核酸分子。
- 請求項1に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸分子であって、配列番号25または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号24または26のヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の単離核酸分子。
- 請求項1に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸分子であって、配列番号29または31のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 前記ヌクレオチド配列が配列番号28または30のヌクレオチド配列を含む、請求項10に記載の単離核酸分子。
- 前記核酸分子が1つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結した、請求項6または8に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記核酸分子が1つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結した、請求項10または12に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項14または15に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
- ヒト化抗体またはその抗原結合断片を調製するための方法であって、ヒト化抗体またはその抗原結合断片が発現されるような条件下で請求項16に記載の宿主細胞を培養すること、および発現したヒト化抗体を回収することを含む方法。
- 細胞接着を阻害するための組成物であって、請求項1から5のいずれか一項に記載のヒト化抗体または抗原結合断片を含む組成物。
- 細胞との細胞外マトリックスタンパク質の結合に干渉するための組成物であって、請求項1から5のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片を含む組成物。
- 前記組成物がRGDタンパク質と関係がある障害または疾患の治療または診断に使用される、請求項18または19に記載の組成物。
- RGDタンパク質と関係がある障害または疾患を予防または治療するための医薬組成物であって、有効量の請求項1から5のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片を含み、前記RGDタンパク質と関係がある障害または疾患が、癌、慢性関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、または自己免疫疾患である、医薬組成物。
- 試験サンプル中のRGDタンパク質を検出するための方法であって、試験サンプル中のRGDタンパク質との、請求項1から5のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片の結合をアッセイすることを含む方法。
- RGDタンパク質と関係がある障害または疾患をin vivoで診断するための組成物であって、有効量の請求項1から5のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその抗原結合断片を含み、前記RGDタンパク質と関係がある障害または疾患が、癌、慢性関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、または自己免疫疾患である、組成物。
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