KR20120078725A - 세포 외 기질 단백질의 아미노산 서열 ｒｇｄ에 특이적인 인간화된 항체 및 그의 용도 - Google Patents

세포 외 기질 단백질의 아미노산 서열 ｒｇｄ에 특이적인 인간화된 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 인간화된 항체를 제공한다. 이들 항체 중 일부는 상기 RGD 단백질의 생물학적 작용을 억제하여, RGD 단백질과 관련된 다양한 질환 또는 질병, 예를 들어 암, 예를 들어 암 세포의 성장 또는 전이 및 염증성 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 자궁내막증, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장 질병(궤양성 대장염 및 크론병), 자가면역 질병 등에 대해 치료 효과를 나타낸다.

Description

세포 외 기질 단백질의 아미노산 서열 ＲＧＤ에 특이적인 인간화된 항체 및 그의 용도{HUMANIZED ANTIBODIES SPECIFIC FOR AMINO ACID SEQUENCE RGD OF AN EXTRACELLULAR MATRIX PROTEIN AND THE USES THEREOF}
1. 발명의 분야
본 명세서를 통해, 몇몇 문헌들을 본 명세서 내에서 참고로 하고 있다. 상기 문헌들의 기재내용은 전체로서 본 명세서 내에 참고로 인용된다.
본 발명은 세포 외 기질 단백질의 아미노산 서열 RGD(Arg-Gly-Asp)를 면역특이적으로 인식하는 인간화된 항체, 및 암, 염증성 질병, 자가면역 질병, 감염성 질병, 골 질병 등을 포함한 다양한 질병(disease) 또는 질환(disorder)에 대한 그의 치료 및 진단학적 용도에 관한 것이다.
2. 발명의 배경
세포 유착(cell adhesion)은 다세포 기관의 생명을 지속하는데 중요한 역할을 한다. 다세포 기관의 세포 유착은 세포-세포 외 기질(이후부터 "ECM"이라 약기한다) 유착과 세포-세포 유착으로 분류된다. 세포-ECM 유착은 인테그린에 의해 매개되고 세포-세포 유착은 카데린(cadherin), 클라우딘(claudin) 및 넥틴에 의해 매개되는 것으로 설명되어 왔다.
막통과 유착 단백질(transmembrane adhesion protein), 예를 들어 인테그린은 세포-ECM 유착을 구성한다. 인테그린은 α 및 β 쇄의 이종 이량체를 형성하는 것으로 보고되었다. 적어도 α 쇄의 18 가지 유형, β 쇄의 8 가지 유형 및 αβ 이종 이량체의 24 가지 유형이 지금까지 동정되고 확인되었다. 인테그린의 각 유형은 특정 리간드를 인식한다고 알려져있다. 인테그린을 포함한 막통과 유착 단백질은 세포 유착 이외에, ECM으로부터 세포 내로의 세포 내 신호 전달, 및 증식, 이동성 및 분화의 조절과 관련이 있다(F.G. Giancotti, et al., Science, 285, 1028-1032, 1999).
다수의 단백질들이 ECM 단백질로서 공지되어 있으며, 이들은 콜라겐(예를 들어 I 내지 XIX 유형), 비-콜라겐성 당단백질(예를 들어 오스테오폰틴(OPN), 비트로넥틴, 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor), 라미닌, 테나신, 피브리노겐, 트롬보스폰딘), 엘라스틴 및 프로테오글리칸으로 분류된다. 이들 ECM 단백질은 상응하는 인테그린에 결합하고 세포골격(cytoskeltal) 구성, 이동성, 증식, 분화 등을 조절하기 위한 세포 내 신호 전달 경로를 활성화한다. ECM 단백질-결합된 인테그린은 ECM 단백질의 유형에 따라 특정 신호를 전달함으로써 상기 신호 활성화 경로를 조절한다. 상기 RGD(아르기닌-글리신-아스파라긴산) 서열은 다수의 ECM 단백질의 세포 유착 영역에서 흔히 관찰되며 인테그린에의 결합에 의해 다양한 기능들을 나타내는 것으로 보인다. ECM 단백질의 RGD 서열은 약물에 대한 표적이 될 수 있을 것으로 기대되어 왔으며 다수의 소 분자 화합물 및 인공 펩타이드들이 제공되어왔다.
일부 유형의 인테그린, 예를 들어 α3β1 인테그린, α5β1 인테그린, α8β1 인테그린, ανβ1 인테그린, ανβ3 인테그린, ανβ5 인테그린, ανβ6 인테그린, ανβ8 인테그린이 상기 RGD 서열에 결합하는 것으로 공지되었다. α5β1 인테그린과 그의 특정 리간드 피브로넥틴 간의 상호작용은 인테그린 매개된 신호 전달의 기전에 대한 조사를 고무시켰다. 상기와 같은 조사는 α5β1 인테그린이 세포 유착 및 세포 이동성뿐만 아니라 세포 분화 및 세포 사멸(mortality)을 조절함을 보인다(S.M. Frisch et al., Curr. Opin. Cell Biol., 9, 701-706, 1997). 상기는 또한 α5β1 인테그린이 종양 세포 상에서 고도로 발현되며 암의 악성화(malignant alteration)와 관련이 있음을 보였다. 각각의 인테그린 매개된 신호는 결합하는 ECM 단백질에 따라 상이하다, 예를 들어 성장 인자에 의한 자극은 피브로넥틴-결합된 내피 세포의 성장을 활성화하나, 라미닌-1 결합된 내피 세포의 성장을 억제한다. 또한, 라미닌-10/11로부터 α3β1 인테그린으로 전달된 신호는 피브로넥틴으로부터 α5β1 인테그린으로 전달된 신호와 상이하며, 암 세포의 이동성을 현저하게 상승시키고(J. Gu et al., J. Biol. Chem., 276, 27090-27097, 2001) 혈액 기아(blood starvation)에 의한 세포사멸(apoptosis)을 현저하게 피한다(J. Gu et al., J. Biol. Chem., 277, 19922-19928, 2002). RGD 서열 결합 αν 인테그린의 고 발현이 파골 세포 및 신생혈관에서 관찰되었으며, RGD 서열 및 αν 인테그린의 억제가 골다공증 및 암의 치료 약물에 대한 표적으로서 생각되었다. α5β1 인테그린은 종양 세포 상에서 고도로 발현되고 암의 악성화와 관련 있음이 지적되었다. 이러한 발견들로부터, 항-α5β1 인테그린 항체(볼로시맵(Volocimab)), 항-α4 인테그린 항체(나탈리주맵(Natalizumab)), 및 항-ανβ3 인테그린 항체(비탁신(Vitaxin))가 인테그린과 ECM 단백질 간의 상호작용을 억제하는 길항작용적 항-인테그린 항체 약물로서 개발되었다.
이러는 동안, 일부 ECM 단백질, 예를 들어 콜라겐, 오스테오폰틴(OPN), 비트로넥틴, 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 인자, 라미닌, 테나신, 피브리노겐 및 트롬보스폰딘이 RGD 서열을 포함하는 것으로 공지되었다. 또한, 일부 바이러스 및 일부 세균은 세포에 유착하기 위해서 RGD 서열을 갖는 것으로 공지되었다. OPN은 뼈속에 풍부하게 함유된 칼슘에 결합하는 성질을 갖는 산성 당단백질이다. OPN은 세포 유착, 세포 이동, 종양 형성, 면역 반응 및 보체 매개된 세포 분해(cellular lysis)에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. OPN 녹아웃 마우스 및 항-OPN 중화 항체의 결과들은 OPN이 간염, 자가면역 질병(예를 들어 류마티스성 관절염), 및 암의 전이와 관련이 있음을 가리킨다. 따라서, ECM 단백질의 세포에의 결합의 억제제를 골다공증 또는 암의 치료에 사용할 수도 있음이 주목되었다. 따라서, 인테그린에 표적화된 상기 언급한 길항작용성 약물 이외에, 상기 인테그린의 결합 짝인 ECM 단백질에 표적화된 길항작용성 약물이 개발되었다.
3. 발명의 요약
RGD 서열 매개된 인테그린과의 상호작용을 억제하는 소 분자, OPN에 대한 항체, 및 인테그린에 대한 항체와 같은 약물들이 개발되어왔지만, 상기 RGD 서열을 특이적으로 인식하는 항체에 관한 보고는 없다. 상기 RGD 서열은 ECM 단백질 중의 보존(conserved) 서열들 중 하나이므로, 상기 RGD 서열을 특이적으로 인식하는 항체는 인간과 치료 모델 동물 모두에 효과를 가질 것으로 기대되며, 따라서 치료제의 개발에 매우 유용한 활성 성분으로서 고려될 수 있다. 따라서, 상기 RGD 서열을 특이적으로 인식하는 상기와 같은 항체에 대한 요구가 있어왔다. 앞서, 발명자들은 상기 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하고 하이브리도마 클론 33E10 및 35B6(각각 기탁센터(depository) 수탁 번호 FERM BP-10440 및 FERM BP-10441)에 의해 생산되는 마우스 단클론 항체를 단리하였다. 본 발명에서, 상기 하이브리도마 클론 표시(designation)는 상기 클론들에 의해 생산된 단클론 항체들의 표시와 호환적으로 사용된다. 이들 마우스 항-RGD 항체들은 모두 IgG1 아이소타입을 가졌다. 이들 단클론 항체는 오스테오폰틴과 같은 ECM 단백질의 RGD 서열에 결합함으로써 ECM과 세포 간의 RGD 서열-매개된 결합을 방해하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 이들 항-RGD 항체는 RGD 서열-관련된 질병, 예를 들어 암, 예를 들어 암 세포의 성장 또는 전이, 및 염증성 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 골관절염, 감염성 질병, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장 질병(궤양성 대장염 및 크론병), 자가면역 질병, 골다공증 등에 대해 치료 또는 진단 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
그러나, 이들 단클론 항체는 마우스 기원(origin)의 것이므로, 인간에서 이들의 면역원성에 기인한 가능한 부작용들은 인간에 대한 진단 또는 치료 용도로의 이들의 직접적인 적용을 방해했다. 상기 면역원성을 감소시키기 위해서, 본 발명자들은 인간화된 항체가 유래된 원래의 마우스 항-RGD 항체에 의해 나타난 생물 활성들에 상응하는 생물 활성을 갖는 인간화된 항체를 제조하였다.
이에 따라, 본 발명은 상기 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 상기 항체는 비-인간 기원으로부터 부분적으로 유래되고 인간 기원으로부터 부분적으로 유래된 항원-결합 영역을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 비-인간 공급원(공여체(donor)), 예를 들어 33E10 및 35B6 단클론 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이후부터 "CDR"이라 약기함), 및 인간 공급원(수용체(acceptor))으로부터 유래된 프레임워크 영역(framework region, 이후부터 "FR"이라 약기함)을 포함한다. 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 RGD 서열과 그의 리간드 간의 결합을 억제할 수도 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은: (i) 인간 H-쇄의 가변 영역(이후부터 "V-영역"이라 약기함)으로부터 유래된 하나 이상의 H-쇄 FR(이후부터 "FRH"라 약기함), 및 상기 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 비-인간 항체의 CDRH들 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 H-쇄 CDR(이후부터 "CDRH"라 약기함)을 포함하는 중쇄(heavy chain, 이후부터 "H-쇄"라 약기함); 또는 (ii) 인간 L-쇄의 V-영역로부터 유래된 하나 이상의 L-쇄 FR(이후부터 "FRL"이라 약기함), 및 상기 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 비-인간 항체의 CDRL들 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 L-쇄 CDR(이후부터 "CDRL"이라 약기함)을 포함하는 경쇄(light chain, 이후부터 "L-쇄"라 약기함); 또는 상기 (i) 및 (ii) 모두를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은: (i) 서열식별번호:92, 94 또는 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 H-쇄; 또는 (ii) 서열식별번호:98 또는 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 L-쇄; 또는 (iii) 상기 (i) 및 (ii) 모두를 포함한다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호:91, 92 또는 93의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는(encoded) 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열식별번호:97 또는 99의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 VH는 서열식별번호:91, 92 또는 93의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열식별번호:97 또는 99의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 상기 VH는 서열식별번호:94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열식별번호:100의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 상기 H-쇄는 서열식별번호:25 또는 27의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 L-쇄는 서열식별번호:29 또는 31의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 상기 H-쇄는 서열식별번호:25의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 L-쇄는 서열식별번호:31의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 상기 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 H-쇄 또는 L-쇄, 또는 이들 모두를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 예를 들어 발현 벡터를 추가로 제공한다. 상기와 같은 벡터에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 조절 요소(regulatory element)에 작동가능하게(operably) 결합될 수도 있다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 CDR이 유래된 비-인간 공여체 항체 고유의 신호 펩타이드, 또는 이종 기원의 신호 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 인간화된 H-쇄를 암호화하는 제 1 핵산 분자 및 본 발명의 인간화된 L-쇄를 암호화하는 제 2 핵산 분자를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공하며, 상기 제 1 및 제 2 핵산 분자는 각각 본 발명의 생물학적으로 기능성인(functional) 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 발현되는 방식으로 조절 요소에 작동가능하게 결합된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 발현되도록 하는 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하고; 생성된 인간화된 항체를 수거하는 것을 포함하는, 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명의 인간화된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 인간화된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편 중 하나 이상, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 상기 RGD-단백질과 관련된 질환 또는 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 상기 조성물들 중 어느 하나는 상기 질환 또는 질병을 부가적으로 또는 상승적으로(synergistically) 개선할 수 있는 또 다른 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 활성 화합물은 소염성 화합물, 화학요법(chemotherapeutic) 화합물 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 활성 화합물은 또한 소 분자 화합물 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어 인간 α4 인테그린 특이 항체 또는 인간 α9 인테그린 특이 항체를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 RGD-단백질과 관련이 있거나 또는 이를 수반하는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 질환 또는 질병의 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 예방학적 또는 치료학적 유효량의 본 발명의 인간화된 항체들 또는 그의 항원-결합 단편 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 상기와 같은 용도를 위해서, 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생물학적 효과를 상승시키는 치료 영역(therapeutic moiety)에 접합시킬 수도 있다. 상기와 같은 치료 영역의 예로는 또 다른 항체, 세포 증식 억제성(cytostatic) 또는 세포 파괴성(cytocidal)인 세포독소, 방사성 원소, 및/또는 다른 치료제, 예를 들어 소염제, 항생제 등이 있다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 환자에게서 RGD-단백질과 관련 있거나 이를 수반하는 질환 또는 질병을 진단하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 검사하고자 하는 환자에게 진단 유효량의 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여함을 포함한다. 상기와 같은 진단 용도를 위해서, 본 발명의 인간화된 항체를 검출 가능한 마커, 예를 들어 방사성 원소로 표지할 수도 있다.
3.1. 정의
본 발명에 사용된 바와 같이, "항체"란 용어는 목적하는 항원, 또는 RGD 서열과 같은 목적하는 서열에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체 분자를 지칭하며, 이는 전체로서의 항체분자를 포함하고, 그리고, 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 항체의 단편을 포함할 수도 있다.
본 발명에 사용된 "항원-결합 단편"이란 용어는 표적 폴리펩타이드, 단백질 또는 서열, 특히 RGD 서열에 면역특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 임의의 단편을 지칭하며, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합된 Fv, 및 표적 폴리펩타이드, 단백질 또는 서열에 특이적으로 결합하는 VL 및/또는 VH 또는 CDR을 함유하는 단편을 포함한다. 따라서, 인간화된 항체의 상기와 같은 항원-결합 단편은 부분 또는 완전한 길이의 인간 불변 영역을 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다. 상술한 항체 단편을 획득하기 위한 다양한 방법들이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 "면역특이적으로 인식한다"란 용어는 표적 폴리펩타이드, 단백질 또는 서열, 특히 인간 RGD 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 능력을 지칭한다. 상기와 같은 항체는 다른 폴리펩타이드 또는 단백질에 비-특이적으로 결합하지 않는다. 그러나, 상기 표적 폴리펩타이드 또는 단백질(예를 들어 RGD-단백질)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 다른 항원들과 교차 반응할 수도 있다. 예를 들어, 인간 RGD-단백질을 면역특이적으로 인식하는 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 쥐 RGD-단백질과 교차 반응할 수도 있다. 바람직하게는, RGD-단백질을 면역특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 다른 항원들과 교차 반응하지 않는다.
본 발명에 사용된 "인간 공급원으로부터 유래된" 또는 "비-인간 공급원으로부터 유래된"이란 용어는 각각 인간 항체 또는 비-인간 항체의 상응하는 부분으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 항체 부분을 지칭한다.
본 발명에 사용된 "수용체 서열"이란 용어는 대개 비-인간 항체인 공여체 항체로부터의 CDR에 대해 수용체로서 작용하는 인간 항체 VH 또는 VL로부터의 FR의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
4. 도면의 간단한 설명
본 발명을 설명하기 위한 목적으로, 도 1 내지 27는 본 발명의 바람직한 태양을 반영한다. 그러나, 본 발명이 도 1 내지 27에 나타낸 특정 태양에 한정되는 것은 아닌 것으로 이해된다.
도 1은 마우스 33E10 VH cDNA의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙한 VH의 N-말단 아미노산 잔기(E)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 카밧(Kabat) 등의 정의(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다.
도 2는 마우스 33E10 VL cDNA의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙한 VL의 N-말단 아미노산 잔기(D)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다.
도 3은 SpeI 및 HindIII 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는(flanked) 디자인된(designed) 33E10 VH 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙한 VH의 N-말단 아미노산 잔기(E)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 4는 NheI 및 EcoRI 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는 디자인된 33E10 VL 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙한 VL의 N-말단 아미노산 잔기(D)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 5는 키메릭(chimeric) 및 인간화된 33E10 항체들을 위한 발현벡터(집합적으로(collectively), "발현 벡터")들의 도식적 구조를 나타낸다. 상단의 SalI 부위로부터 시계방향으로, 상기 플라스미드는 항체 중쇄 유전자의 전사를 개시시키기 위한 인간 거대세포바이러스(CMV) 주요 즉각 조기 프로모터(major immediate early promoter) 및 인헨서(CMV 프로모터)로 출발하는 중쇄 전사 유닛을 함유한다. 상기 CMV 프로모터에 이어서, 개재(intervening) 인트론들과 함께 VH 엑손, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 엑손을 포함하는 인간 감마-1 중쇄 불변 영역을 함유하는 게놈 서열이 있고, 상기 CH3 엑손 다음에 폴리아데닐화 부위가 있다. 상기 중쇄 유전자 서열 뒤에, 경쇄 전사 유닛이 CMV 프로모터로 시작하고, 이어서 VL 엑손, 및 인간 카파(kappa) 쇄 불변 영역 엑손(CL)을 함유하는 게놈 서열(이에 선행하여 인트론 부분이 있다)이 있고, 상기 CL 엑손 다음에 폴리아데닐화 부위가 있다. 이어서 상기 경쇄 유전자 다음에 SV40 초기 프로모터(SV40 프로모터), 이 콜라이 잔틴(xanthine) 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(gpt), 및 상기 SV40 폴리아데닐화 부위(SV40 폴리(A) 부위)를 함유하는 분절이 있다. 마지막으로, 상기 플라스미드는 세균 기원 복제(pUC ori) 및 베타-락타마제 유전자(베타 락타마제)를 포함하는 플라스미드 pUC19의 일부를 함유한다. 관련 제한효소 부위의 위치는 본 도면에 나타낸다.
도 6은 33E10 VH, 인간화된 33E10(Hu33E10) VH 및 인간 수용체 U03400(진뱅크 수탁 번호)의 아미노산 서열들의 정렬을 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 상기 서열들 위의 숫자는 카밧 등(1991)에 따른 위치를 가리킨다. 카밧(Kabat) 등(Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991)에 의해 정의된 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 이중으로 밑줄을 그은 잔기들은 상기 CDR과의 접촉을 예상한 것이며 마우스 잔기들은 인간화된 형태에서도 상기 위치에 잔류되었다. U03400 중의 CDR 잔기는 도면에서 생략한다.
도 7은 33E10 VL, 인간화된 33E10(Hu33E10) VL 및 인간 수용체 X72452(진뱅크 수탁 번호)의 아미노산 서열들의 정렬을 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 상기 서열들 위의 숫자는 카밧 등(1991)에 따른 위치를 가리킨다. 카밧(Kabat) 등(1991)에 의해 정의된 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. X72452 중의 CDR 잔기는 도면에서 생략한다.
도 8은 Hu33E10 VH1 유전자의 구성에 사용된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 9는 Hu33E10 VL1 유전자의 구성에 사용된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
도 10은 Hu33E10 VH1 유전자의 구성에 사용된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 화살표는 각 올리고뉴클레오티드의 위치 및 배향(5'에서 3')을 나타낸다. 아미노산 잔기들을 단일 문자 코드로 나타낸다.
도 11은 Hu33E10 VL1 유전자의 구성에 사용된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 화살표는 각 올리고뉴클레오티드의 위치 및 배향(5'에서 3')을 나타낸다. 아미노산 잔기들을 단일 문자 코드로 나타낸다.
도 12는 SpeI 및 HindIII 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VH1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙한 VH의 N-말단 아미노산 잔기(E)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 13은 NheI 및 EcoRI 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VL1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙한 VL의 N-말단 아미노산 잔기(D)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 14는 NheI 및 EcoRI 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VL6 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 신호 펩티드-암호화 영역 내의 연접 공여체(splicing donor) 사이트를 제거하기 위한 침묵 돌연변이(silent mutation)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙한 VL의 N-말단 아미노산 잔기(D)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 15A 및 15B는 hOPN5-BSA에 대한 키메릭 및 인간화된 33E10 IgG1/κ 항체의 결합을 ELISA에 의해 분석한 것을 나타낸다. 정제된 Ch33E10, Hu33E10-VH1/VL6, Hu33E10-VH5/VL6 및 Hu33E10-VH7/VL6(도 15A), 및 Ch33E10과 Hu33E10-VH7.8/VL6(도 15B)는 hOPN5-BSA과의 결합에 대하여 100 ㎍/㎖에서 출발하여 계열 2-배 희석(serial 2-fold dilution)된 다양한 농도에서 시험하였다. 실험은 2회 중복수행하였다.
도 16은 SpeI 및 HindIII 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VH5 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 2개의 밑줄로 표시한 아미노산 잔기들은 VH1로부터 상이한 부분을 가리킨다.
도 17은 SpeI 및 HindIII 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VH7 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 2개의 밑줄로 표시한 아미노산 잔기들은 VH1로부터 상이한 부분을 가리킨다.
도 18은 SpeI 및 HindIII 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VH7.8 유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 2개의 밑줄로 표시한 아미노산 잔기들은 VH1로부터 상이한 부분을 가리킨다.
도 19는 33E10 VL, Hu33E10 VLv2 및 인간 수용체 M29467(진뱅크 수탁 번호)의 아미노산 서열들의 정렬을 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 상기 서열들 위의 숫자는 카밧 등(1991)에 따른 위치를 가리킨다. 카밧(Kabat) 등(1991)에 의해 정의된 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 2개의 밑줄로 표시한 잔기들은 CDR과 접촉할 것으로 예상되었고, 인간화된 형태 내의 상기 위치들에서 마우스의 잔기들은 잔류되었다. M29467 중의 CDR 잔기는 도면에서 생략한다.
도 20은 NheI 및 EcoRI 부위(밑줄)가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VLv2유전자의 뉴클레오티드 서열을 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 신호 펩타이드 서열은 이탤릭체로 나타낸다. 성숙한 VL의 N-말단 아미노산 잔기(D)는 2 개의 밑줄로 나타낸다. 카밧 등의 정의(1991)에 따른 CDR 서열은 밑줄로 나타낸다. 인트론 서열은 이탤릭체로 나타낸다.
도 21A 및 21B는 hOPN5-BSA에 대한 Ch33E10 및 Hu33E10-VH7/VLv2 IgG1/κ 항체의 결합을 ELISA에 의해 분석한 것을 나타낸다. 정제된 Ch33E10 및 Hu33E10-VH7/VLv2 항체는 hOPN5-BSA과의 결합에 대하여 200 ㎍/㎖(도 21A), 또는 100 ㎍/㎖(도 21B)에서 시작하여 계열 2-배 희석(serial 2-fold dilution)된 다양한 농도에서 시험하였다. 두 가지의 독립된 실험(도 21A 및 21B)을 각각 2회 중복수행한 결과를 나타낸다.
도 22는 PCR 증폭, 및 Hu33E10 중쇄 및 경쇄 cDNA의 서열화에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열을 나타낸다.
도 23은 NS0-Hu33E10-4 및 NS0-Hu33E10-6 내에서 발현된 VH7 및 감마-1 중쇄 불변영역의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열을, 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 종결 코돈은 부호"ㆍ"로 나타낸다.
도 24는 NS0-Hu33E10-5 내에서 발현된 VH7.8 및 감마-1 중쇄 불변영역의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열을, 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 종결 코돈은 부호"ㆍ"로 나타낸다.
도 25는 NS0-Hu33E10-4 및 NS0-Hu33E10-5 내에서 발현된 VL6 및 카파 경쇄 불변영역의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열을, 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 종결 코돈은 부호"ㆍ"로 나타낸다.
도 26은 NS0-Hu33E10-6 내에서 발현된 VLv2 및 카파 경쇄 불변영역의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열을, 추론된 아미노산 서열과 함께 나타낸다. 아미노산 잔기를 단일 문자 코드로 나타낸다. 종결 코돈은 부호"ㆍ"로 나타낸다.
도 27은 hOPN5-BSA에 대한 MDA-MB-435S의 유착을 억제하는 인간화된 항-OPN 항체를 나타낸다. MDA-MB-435S(4×104 세포/웰)는 다양한 농도의 항체들, 인간 IgG, Ch33E10, EJ3-1-1(Hu33E10-VH7.8/VL6), R3-1(Hu33E10-VH7/VL6), SP2-1(Hu33E10-VH7/VLv2), 및 m33E10의 존재 하에, hOPN5-BSA(2mg/ml)로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 유착되도록 하였다. 데이타는 3회 반복실험의 평균으로 나타낸다.
5. 발명의 상세한 설명
5.1. RGD 서열에 대한 항체의 제조
RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 항체를 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성시킬 수 있다.
본 발명에서 세포 유착성 "RGD" 서열을 포함하는 RGD-단백질 또는 펩타이드(이후부터 "RGD-펩타이드"라 약기함)는 (1) RGD-단백질을 발현하는 인간 ECM 또는 상기 ECM이 존재하는 모든 조직으로부터 유래하거나, (2) 세균, 효모, 동물 세포와 같은 세포 주 등에 형질감염시킴으로써 상기 RGD-단백질 또는 RGD-펩타이드를 암호화하는 DNA(바람직하게는 cDNA)의 발현에 의해 수득되는 재조합 단백질 또는 펩타이드, 또는 (3) 합성 단백질 또는 펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 항원으로서 사용되는 상기 RGD-펩타이드는 면역화에 의해 상기 RGD 서열에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 상기 RGD-펩타이드는 쥐 ECM 단백질의 세포 유착 서열인 RGD-펩타이드 아미노산 서열 CVDVPNGRGDSLAYGLR(서열식별번호: 71)을 포함한다. 상기 RGD-단백질 또는 RGD-펩타이드는 예를 들어 OPN, 비트로넥틴, 피브로넥틴, 폰 빌레브란트 인자, 콜라겐, 라미닌, 테나신, 피브리노겐, 트롬보스폰딘, 및 이들의 단편을 포함하는 RGD를 포함한다. 상기 아미노산의 인공 또는 천연 변이, 예를 들어 치환, 결실, 일시변이(modification) 및 추가를, 상기 단백질 또는 펩타이드가 RGD-서열을 포함하는 한 상기 단백질 또는 상기 펩타이드에 적용시킬 수 있다. 상기 변형 단백질 또는 펩타이드는 아미노산 서열을 포함할 수도 있으며, 여기에서 다수의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 10 개의 아미노산 및 보다 바람직하게는 1 내지 여러 개(예를 들어 1 내지 5 개)의 아미노산이 치환되거나, 결실되거나, 일시변이되거나, 추가되거나 삽입된다.
본 발명에서, 상기 RGD-펩타이드는 약 5 개 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 5 내지 50 개의 아미노산, 및 보다 바람직하게는 약 10 내지 20 개의 아미노산을 포함한다. 본 발명에서 항원으로서 상기 RGD-단백질 또는 RGD-펩타이드를 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 화학 합성 방법, 세포 배양 방법, 유전자 재조합 방법 및 그의 적합한 변경을 사용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 RGD-펩타이드는 ECM 단백질을 프로테아제로 적합하게 절단하여 수득할 수 있다. 상기 RGD-단백질 또는 RGD-펩타이드는 포유동물, 예를 들어 쥐, 래트, 토끼, 돼지, 소, 원숭이 및 인간으로부터 유래될 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 임의의 방법들을 항-RGD 항체의 제조에 사용될 수 있는 RGD-단백질 또는 RGD-펩타이드의 제조에 사용할 수 있다.
변형 폴리펩타이드의 제조 방법의 예로는 합성 올리고뉴클레오티드 부위-특이적(site-directed) 돌연변이 유발(간격이 있는 중복 방법(gapped duplex method)), 점 돌연변이 유발 방법(나이트라이트 또는 설파이트에 의한 처리에 의해 랜덤하게 점 돌연변이를 도입시킴을 수반한다), Bal31 효소 또는 다른 효소에 의해 결실 돌연변이체를 제조함을 포함하는 방법, 카세트 돌연변이 유발, 링커 스캐닝 방법, 오 결합(miss incorporation) 방법, 미스매치 프라이머 방법, DNA 분절 합성 방법 등이 있다.
상기 RGD-펩타이드를 다른 생물학적 거대분자, 예를 들어 타이로글로블린, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA), 오브알부민(OVA) 또는 소 글로불린, 바람직하게는 타이로글로블린과 결합시킬 수 있다. RGD-펩타이드를 생물학적 거대분자에 결합시키기 위한 방법은 커플링 시약, 예를 들어 활성 에스터 그룹 및 말레산 이미드(maleic imide) 그룹을 갖는 결합 시약을 사용하거나(상기 활성 에스터 그룹은 단백질 또는 펩타이드의 아미노 그룹에 결합하고 말레산 이미드 그룹은 단백질 또는 펩타이드의 티올 그룹에 결합한다; S. Yoshirake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399, 1979), 혼합된 무수물 방법을 사용하거나(B.F. Erlanger et al., J. Biol. Chem., 234, 1090-1094, 1954), 또는 활성 에스터 방법을 사용함(A.E. Karu et al., J. Agric. Food Chem., 42, 301-309, 1994)으로써 성취될 수 있다. 상기 RGD-펩타이드를 생물학적 거대분자에 결합시키기 위한 방법을 바람직하게는 커플링 시약을 사용함으로써 성취한다.
항원으로서, 상기 RGD-단백질 또는 RGD-펩타이드를 과발현하는 세포 자체를 또한 사용할 수 있다. 상기 RGD-단백질 또는 RGD-펩타이드를 과발현하는 세포를 당해 분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다.
상술한 바와 같이 제조된 적합한 항원을 사용하여, 상기 RGD 서열에 특이적인 항체를 당해 분야에 널리 공지된 다양한 방법들에 의해 제조할 수 있다. 상기 RGD 서열에 대한 다클론 항체를 당해 분야에 널리 공지된 다양한 과정에 의해 생성시킬 수 있다. 예를 들어 관심 항원을 다양한 숙주 동물, 예를 들어 비 제한적으로 토끼, 마우스, 래트 등에 투여하여 상기 항원에 특이적인 다클론 항체를 함유하는 항혈청의 생산을 유도할 수 있다. 다양한 항원보강제(adjuvant)를 사용하여, 숙주 종에 따라 면역 반응을 증가시킬 수 있으며, 상기 항원보강제에는 비 제한적으로 프로인트(완전 및 불완전) 항원보강제, 무기 젤, 예를 들어 수산화 알루미늄, 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 유화액, 키홀 림펫 헤모시아닌, 다이나이트로페놀, 및 인간에 잠재적으로 유용한 항원보강제, 예를 들어 BCG(Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum)이 있다. 상기와 같은 항원보강제들은 당해 분야에 또한 널리 공지되어 있다.
단클론 항체를 당해 분야에 공지된 광범위하게 다양한 기법들, 예를 들어 하이브리도마, 재조합체 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어 당해 분야에 공지되고 예를 들어 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)](이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 교시된 것들을 포함하여 하이브리도마 기법을 사용함으로써 단클론 항체를 생성시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. "단클론 항체"란 용어는 단일 클론으로부터 유래된 항체를 지칭하며, 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 포함하나, 이의 생성 방법에 제한되지 않는다.
하이브리도마 기술을 사용하는 특이 항체의 생성 및 선별 방법은 통상적이며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 비 제한적인 예에서, 마우스를 관심 항원 또는 상기와 같은 항원을 발현하는 세포로 면역시킬 수 있다. 일단 면역 반응이 탐지되면, 예를 들어 상기 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되면, 상기 마우스 비장을 수확하고 비장 세포를 단리한다. 이어서 상기 비장 세포를 널리 공지된 기법에 의해 임의의 적합한 골수종 세포(예를 들어 P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2/0-Ag14, P3X63-Ag8-653 등)에 융합시킨다. 하이브리도마를 선택하고 제한 희석(limiting dilution)에 의해 클로닝한다. 이어서 상기 하이브리도마 클론을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 상기 항원과 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 분석한다. 마우스를 양성 하이브리도마 클론으로 복강 내 접종하여 높은 수준의 항체를 일반적으로 함유하는 복수액을 생성시킬 수 있다.
특이적인 에피토프를 인식하는 항체 단편을 공지된 기법에 의해 생성시킬 수 있다. 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편을, 파파인(Fab 단편을 생성시키기 위해) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성시키기 위해)을 사용하여, 면역글로불린 분자의 단백질 분해 절단에 의해 생성시킬 수 있다. F(ab')2 단편은 완전한 L-쇄, 및 H-쇄의 V-영역, CH1 영역 및 힌지(hinge) 영역을 함유한다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 항체의 합성에 대한 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 특히 화학 합성에 의해 또는 바람직하게는 재조합 발현 기법에 의해 생성시킬 수 있다.
항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 당해 분야의 숙련가들에게 입수 가능한 임의의 정보로부터 획득할 수 있다(즉 진뱅크, 문헌으로부터, 또는 통상적인 클로닝 및 서열 분석에 의해). 특정 항체 또는 그의 에피토프-결합 단편을 암호화하는 핵산을 함유하는 클론을 입수할 수 없지만 상기 항체 분자 또는 그의 에피토프-결합 단편의 서열이 공지되어 있는 경우, 상기 면역글로불린을 암호화하는 핵산을 화학적으로 합성하거나, 또는 상기 서열의 5' 말단에 하이브리드화할 수 있는 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 또는 상기 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터 예를 들어 cDNA 클론을 동정하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하는 클로닝에 의해 적합한 공급원(예를 들어 항체 cDNA 라이브러리, 또는 상기 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예를 들어 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 상기로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+RNA)으로부터 수득할 수 있다. 이어서 PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산을 당해 분야에 널리 공지된 임의의 방법을 사용하여 복제 가능한 클로닝 벡터에 클로닝할 수 있다.
5.2. 재조합 항체의 제조
상기 항체의 뉴클레오티드 서열을 뉴클레오티드 서열의 조작에 대해 당해 분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어 재조합 DNA 기법, 부위 지향된 돌연변이 생성, PCR 등을 사용하여 조작할 수 있다(예를 들어 상기 문헌[Sambrook et al.]; 및 [Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY](이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 기법 참조). 항체에 돌연변이, 예를 들어 에피토프-결합 도메인 영역 또는 임의의 부분에서 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 도입시켜 생물 활성을 증가 또는 감소시킬 수도 있다.
항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 재조합 발현에 사용할 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생성을 위해 항체 분자, 항체의 H-쇄 및/또는 L-쇄 또는 그의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 선행 섹션들에 논의된 바와 같이 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 서열 및 적합한 전사 및 번역 조절 신호를 암호화하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 발현 벡터를 제작할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전자 재조합이 있다. 항체의 VH, VL, VH 및 VL 모두, 상기 VH 및/또는 VL의 항원-결합 단편, 또는 하나 이상의 CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 상기와 같은 발현 벡터에 클로닝할 수 있다. 상기와 같은 서열을 상기 원래 항체에 고유하거나 또는 이종일 수 있는 신호 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 융합시킬 수도 있다. 이어서 상기와 같이 제조된 발현 벡터를 상기 항체의 발현에 적합한 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함한다.
상기 숙주 세포를 본 발명의 2 개의 발현 벡터로 동시 형질감염시킬 수 있으며, 여기에서 제 1 벡터는 H-쇄 유래된 폴리펩타이드를 암호화하고 제 2 벡터는 L-쇄 유래된 폴리펩타이드를 암호화한다. 상기 두 벡터는 H-쇄 및 L-쇄 폴리펩타이드를 동등하게 발현할 수 있는 동일한 선택성 마커, 또는 상기 두 플라스미드 모두를 유지되게 하는 상이한 선택성 마커를 함유할 수 있다. 한편으로, H-쇄 및 L-쇄 폴리펩타이드를 모두 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터를 사용할 수도 있다. 상기 H-쇄 및 L-쇄에 대한 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 당해 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 항체를 또한 생성시킬 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인을 상기를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 파지 입자의 표면 상에 나타낸다. 특정 실시태양에서, 상기와 같은 파지를 레퍼토리 또는 조합적인 항체 라이브러리(예를 들어 인간 또는 쥐)로부터 발현된 항원 결합 도메인, 예를 들어 Fab 및 Fv 또는 다이설파이드-결합 안정화된 Fv를 표시하는데 사용할 수 있다. 관심 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지를 항원으로, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포착된 항원을 사용하여 선택하거나 동정할 수 있다. 상기 방법에 사용되는 파지는 전형적으로는 섬유상 파지, 예를 들어 fd 및 M13이다. 상기 항원 결합 도메인은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 어느 하나에 재조합적으로 융합된 단백질로서 발현된다. 본 발명의 면역글로불린 또는 그의 단편을 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkman et al., J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24:952-958, 1994; Persic et al., Gene, 187:9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology, 57:191-280, 1994]; PCT 출원 PCT/GB91/01134; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 제 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108 호에 개시된 것들을 포함하며, 이들 참고문헌은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
상기 참고문헌들에 개시된 바와 같이, 파지 선택 후, 상기 파지로부터의 항체 암호화 영역들을 단리하고 이를 사용하여 인간 항체를 포함한 전체 항체, 또는 임의의 다른 목적하는 단편들을 생성시키고, 임의의 목적하는 숙주, 예를 들어 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균에서, 예를 들어 하기 상세히 개시하는 바와 같이 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 당해 분야에 공지된 방법들, 예를 들어 PCT 공보 WO 92/22324; 문헌[Mullinax et al., BioTechniques, 12(6):864-869, 1992] 및 [Sawai et al., AJRI, 34:26-34, 1995]; 및 [Better et al., Science, 240:1041-1043, 1988](이들은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 것들을 사용하여 Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성시키는 기법을 또한 사용할 수 있다. 단일 쇄 Fv 및 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 기법들의 예로는 미국 특허 제 4,946,778 및 5,258,498 호; 문헌[Huston et al., Methods in Enzymology, 203:46-88, 1991; Shu et al., PNAS, 90:7995-7999, 1993] 및 [Skerra et al., Science, 240:1038-1040, 1988]에 개시된 것들이 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 상술한 임의의 방법들에 의해 생성되었으면, 이어서 이를 면역글로불린 분자의 정제에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 또는 단백질 G 정제 후 특이 항원에 대한 친화성에 의해, 및 크기 분류 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도(differential solubility)에 의해, 또는 단백질 정제에 대한 임의의 다른 표준 기법들에 의해 정제할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 본 발명에 개시되거나 또는 달리 당해 분야에 공지된 이종 폴리펩타이드 서열에 융합시켜 정제를 촉진할 수도 있다.
인간에서 항체의 생체 내 용도 및 시험관 내 검출 분석을 포함한 일부 용도를 위해, 키메릭, 인간화된, 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다. 키메릭 항체 및 인간화된 항체는 하기 섹션 5.3에 상세히 논의되어 있다.
다른 화합물 또는 이종 폴리펩타이드에 융합되거나 접합된 항체를 시험관 내 면역분석, 정제 방법(예를 들어 친화성 크로마토그래피)뿐만 아니라 생체 내 치료 또는 진단 용도에 사용할 수 있다. 예를 들어 PCT 공보 WO 93/21232; EP 439,095; 문헌[Naramura et al., Immunol. Lett., 39:91-99, 1994]; 미국 특허 제 5,474,981 호; [Gillies et al., PNAS, 89:1428-1432, 1992]; 및 [Fell et al., J. Immunol., 146:2446-2452, 1991](이들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 예를 들어, 항체를 공지된 방법 또는 상업적으로 입수할 수 있는 키트(예를 들어 비오틴 표지화, FITC 표지화, APC 표지화)를 사용하여 다양한 방식으로 표지할 수 있다. 또 다른 예로서, 항체를 생체 내에서 상기 항체의 생물학적 효과를 증대시키는 치료 영역에 접합시킬 수도 있다. 상기와 같은 치료 영역의 예로는 또 다른 항체, 세포 증식 억제 또는 세포 파괴성인 세포독소, 방사성 원소, 및/또는 다른 치료제들, 예를 들어 소염제, 항생제 등이 있다. 본 발명에서, 상기 인간화된 항-RGD 항체를 또 다른 항체에 접합시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 인간화된 항체를 생체 내 진단 용도를 위해서 검출 가능한 마커, 예를 들어 방사성 원소로 표지할 수도 있다.
5.3. 키메릭 및 인간화된 항체
키메릭 항체는 상기 항체의 상이한 부분들이 상이한 동물 종으로부터 유래된 분자, 예를 들어 쥐 단클론 항체로부터 유래된 V-영역 및 인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메릭 항체의 생성 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Morrison, Science, 229:1202, 1985; Oi et al., BioTechniques, 4:214 1986; Gillies et al., J. Immunol. Methods, 125:191-202, 1989]; 미국 특허 제 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397 호(이들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오.
인간화된 항체는 목적하는 항원과 결합하고 비-인간 종으로부터 유래된 하나 이상의 CDR 및 인간 면역글로불린 분자로부터 유래된 하나 이상의 FR을 함유하는 V-영역을 포함하는 분자이다. 비인간 항체를 인간화하는 전형적인 방법은 다양한 참고문헌들, 예를 들어 문헌[Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033] 및 미국 특허 제 5,585,089 및 5,693,762 호; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332:323, 1988] 및 [Tsurushita et al., Methods 36:69-83, 2005](이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있다. 예를 들어 상기 문헌[Tsurushita et al., 2005](이후부터 "츠루시타")은 상기 퀸(Queen) 등(1989)에 의해 최초로 개발된 항체-인간화 방법에 근거한 마우스 단클론 항체의 인간화에 대한 실용적이고 도움이 되는 프로토콜을 제공한다. 상기 츠루시타에 개시된 일반적인 프로토콜을 하기에 간단히 요약한다.
5.3.1. 인간화된 항체의 제조에 대한 일반적인 프로토콜
마우스 V 유전자의 클로닝 및 서열화
다양한 방법들을 표적 마우스 단클론 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA의 클로닝에 이용할 수 있다. 예를 들어, 스마트 레이스(SMART RACE) cDNA 증폭 키트(BD Biosciences, CA) 또는 진레이서 키트(GeneRacer Kit)(Invitrogen, CA)를 사용하는 5'RACE(cDNA 말단의 고속 증폭) 방법을 통상적으로 사용하였다. 5'RACE에 대한 유전자 특이적인 프라이머를 상기 프라이머가 상기 VH 및 VL의 바로 아래에 결합할 수 있도록 상기 표적 단클론 항체의 H-쇄 및 L-쇄의 아이소타입을 근거로 제조할 수 있다. 따라서, 5'RACE 프라이머를 마우스의 각 서브유형, 예를 들어 γ1, γ2a, γ2b, 또는 γ3에 특이적이도록 디자인할 수 있다. 한편으로, 모든 서브유형들에 공통인 프라이머를 상기 서브유형들 중 일치하거나 또는 고도로 일치하는 영역을 근거로 디자인할 수도 있다. 츠루시타에서, 하기 5'RACE 프라이머들을 예로서 개시한다:
(i) 5'-GCCAGTGGATAGACTGATGG-(서열식별번호: 82)(마우스 γ1, γ2a, γ2b 및 γ3 H-쇄의 클로닝을 위해서)
(ii) 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(서열식별번호: 83)(마우스 κ L-쇄의 클로닝을 위해서).
PCR-증폭된 V-영역 유전자 단편들을 예를 들어 제로 블런트(Zero Blunt) TOPO PCR 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 플라스미드 벡터에 직접 클로닝하고, 이들의 DNA 서열을 결정할 수 있다. 상기 획득된 서열들은 예를 들어 모델 241 단백질 서열화기(Hewlett-Packard, CA)를 사용하여, 상기의 암호화 아미노산 서열들을 N-말단 아미노산 서열화에 의해 결정된 표적 단클론 항체의 서열들과 비교함으로써 확인해야 한다. 전형적으로, 예를 들어 에드만 분해(Edman degradation)에 의한 상기 표적 항체의 N-말단에서의 15 내지 20 개 이상 아미노산 잔기의 결정이면 상기 클로닝된 DNA 서열의 진정성(authenticity)을 확인하기에 충분하다. 츠루시타는, 마우스에서 2 개의 가장 통상적인 N-말단 아미노산 중 하나인 글루타민이 N-말단 아미노산인 경우, 상기가 피로글루타민으로 전환되었을 지도 모르고 상기 N-말단에서 상기 서열화를 차단할 것임을 경고한다. 이 경우, 상기 N-말단의 차단을 풀어 상기 서열을 획득하는 것이 필요하다.
V-영역의 3차원 모델링
상기 VH 및 VL의 서열들을 근거로, 상기 CDR의 형태적 구조를 유지하는데 잠재적으로 중요한 상기 표적 항체의 프레임워크 잔기들을 우선, 예를 들어 문헌[R. Levy et al., 1989, Biochemistry 28:7168-7175] 및 [B. Zilber et al., 1990, Biochemistry 29:10032-10041]에 개시된 방법에 의해 동정한다. 전형적으로, 상기 VH 및 VL 각각을 14 개의 구조적으로 의미있는 분절들(이들은 β 가닥이고 상기 면역글로불린 상과(superfamily)의 도메인 구조를 포함하는 고리형 구조들이다)로 분할한다. 상기 표적 항체로부터의 상기 분절들 각각의 아미노산 서열을 PDB 데이터베이스(문헌[H.M. Berman et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:235-342] 참조)의 공지된 구조의 항체들의 상응하는 분절들과 정렬시킨다. 수 회의 서열 정렬에 의해, 상기 표적 분절 각각에 대해 최고의 서열 일치성을 갖는 상응하는 분절을 선택하고 상기 V-영역의 3차원 모델을 제작한다. 상기 구조를 최적화하기 위해서, 상기 모델에 수 회의 접합체 구배 에너지 최소화 주기(multiple cycles of conjugate gradient energy minimization)를 수행한다(예를 들어 문헌[Press et al., 1990, in "Numerical Recipes, Cambridge University Press, Cambridge]에 개시된 바와 같은 ENCAD; 문헌[Weiner et al., 1981, J. Comp. Chem. 2:287-303]에 의한 AMBER; 영국 암 연구소에 의해 운영되는 "BMM" 웹 사이트 또는 BioMolecularModelling 에서 입수할 수 있는 3D-JIG-SAW; 또는 Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva에 의해 운영되는 ExPASy Proteomics 서버 웹 사이트에서 입수할 수 있는 SWISS-MODEL을 사용하여).
인간 프레임워크의 선택
상기 V-영역의 구조를 모델링하는 것과 병행하여, 각각 마우스 VH 및 VL의 cDNA 클로닝으로부터 추론된 아미노산 서열들을 데이터베이스, 예를 들어 카밧 데이터베이스(문헌[Johnson et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:214-218] 참조), 진뱅크 등의 인간 V-영역 서열들과 비교한다. 상기 마우스 서열과 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 95% 이상 일치하는 전체 서열 일치성을 갖는 인간 FR들을 예를 들어 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 연산(Gusfield, 1997, in "Algorithms on Strings, Trees, and Sequences", Cambridge University Press, Cambridge), 또는 BLAST(Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268) 등을 사용하여 탐색할 수 있다. 상기 인간 서열들은 cDNA-기초한(based) 및 단백질-유래된 서열에 근거할 수 있으나; 생식세포계열(germline)의 사용이 cDNA-기초한, 단백질-유래된 서열에서 체세포 초 돌연변이와 관련된 잠재적인 면역원성의 제거에 유용할 수 있으므로 종종 바람직하다. 한편으로, 상기 문헌[Queen et al.(1989)]에 개시된 바와 같이, 일치하는 프레임워크 서열의 사용은 또한 cDNA-기초한 또는 단백질-유래된 서열로부터 획득된 프레임워크 안의 상기와 같은 초 돌연변이된 잔기를 확인하고 제거할 수 있다. 생식세포계열 VH 분절이 수용체 프레임워크로서 사용되는 경우에, 염색체 14 상에 암호화된 VH 분절들만이 기능성 VH를 생성하므로 염색체 15 및 16 보다는 염색체 14 상의 것들을 사용해야 한다.
인간화된 V-영역의 디자인
상기 문헌[Queen et al(1989)]에 따라, CDR의 약 4 내지 6 Å 이내의 프레임워크 아미노산 잔기들이 정확한 CDR 구조를 지탱하는 잠재적인 주요 프레임워크 잔기들인 것으로 생각되므로 이들을 확인할 필요가 있다. 상기와 같은 과정은 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 원자 좌표로부터의 원자 간 거리를 계산하는, 국립 과학 재단(NSF)이 지원하는 분자 가시화 프리웨어 웹 사이트(Molecular Visualization Freeware web site)에서 입수할 수 있는 RASMOL을 사용하거나, 또는 컴퓨터 모델의 수동(manual) 검사를 통해 성취될 수 있다. 주요 프레임워크 위치에서의 아미노산들이 마우스 공여체와 인간 수용체 서열들 간에 상이한 경우, 마우스 공여체의 것이 대개 인간 잔기를 대신한다. 그러나, 상기와 같은 잔기가 상기 CDR 구조를 지원하는 최소의 기여를 갖는 경우, 전형적으로는 상응하는 인간 잔기가 사용된다. 또한, 상기 선택된 인간 수용체가 "비전형적인" 아미노산을 함유하는 경우(이는 상기 V 영역 서열의 약 10 내지 20% 미만에서 발생한다), 이는 친화성 성숙(affinity maturation) 도중 체세포 초 돌연변이의 결과일 수 있으며 인간에서 잠재적인 면역원성을 피하기 위해 상기 공여체 잔기로 대체해야 한다.
또한, 다른 인자들, 예를 들어 잠재적인 N-결합된 글리코실화 신호의 잔기를 인간화된 V 영역의 디자인을 위해 조심스럽게 고려할 필요가 있다(상세한 내용은 츠루시타 참조).
인간화된 항체는 치료학적 용도를 위해 필요하거나 제거해야 하는 이펙터(effector) 기능에 따라, 인간 항체의 인간 κ 또는 λ L-쇄, 및/또는 γ1, γ2, γ3, γ4, μ, α1, α2, δ 또는 ε H-쇄, 또는 그의 변이체(variant)로부터의 인간 불변 영역 또는 그의 일부를 함유할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이를 함유하는 상기 불변 영역의 Fc 부분을, Fc 수용체에 대한 본 발명의 키메릭 또는 인간화된 항체의 결합을 감소시키고/시키거나 보체를 고정시키는 그의 능력을 감소시키기 위해서 상기 항체의 V-영역에 융합시킬 수도 있다(예를 들어 Winter et al., GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142, Morgan et al., WO 94/29351 참조). 항체 분자에 대한 상기와 같은 조작을 섹션 5.2에 개시된 바와 같은 재조합 DNA 기술에 의해 수행할 수 있다.
바람직하게는 상기 생성되는 키메릭 또는 인간화된 항체는 비-인간 공여체 항체와 동일한 특이성 및 상기 비-인간 공여체 항체의 친화성과 유사하거나 또는 이의 약 1/3 이상, 약 1/2 이상, 또는 약 2/3 이상의 친화성을 갖는다. 또 다른 태양에서, 상기 생성되는 키메릭 또는 인간화된 항체는 약 1 x 107 M-1 이상, 바람직하게는 약 1 x 108 M-1 이상, 및 가장 바람직하게는 약 1 x 109 M-1 이상의 친화성 상수를 갖는다.
상술한 일반적인 프로토콜 이외에, 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법들, 예를 들어 CDR-그래프트화(EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 제 5,225,539; 5,530,101 및 5,585,089 호), 표면장식(veneering) 또는 표면재처리(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814, 1994; Roguska et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91:969-973, 1994), 및 쇄 셔플링(미국 특허 제 5,565,332)(이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 사용하여 인간화할 수 있다.
5.3.2. 약제로서 인간화된 항체의 제조를 위한 추가적인 고려사항
약제로서 인간화된 항체를 제공하기 위해, 효율적이고 일관적인 생산 시스템을 제조해야 할 필요가 있다. 예를 들어 인간화된 항체에 적합한 발현 벡터는 H-쇄 및 L-쇄 서열을 삽입함으로써 제조되며, 상기 발현 벡터로 형질감염된 고 생산성 세포 주는 마스터 세포 은행(MCB)용 종자 세포(제조용 세포 은행(WCB)을 위한 안정하고 반 영구적인 공급원으로서 작용한다)로서 획득될 수 있다. 이어서 인간화된 항체를, 상기 WCB로부터의 상용 세포를 배양하고 배양 배지를 수거하여 제조할 수 있다.
적합한 조절 유전자들을 갖는 다양한 발현 벡터들을 상기와 같은 생산 세포 주의 제조를 위해 사용할 수 있다. 숙주 세포로서, 포유동물 단백질 발현에 통상적으로 사용되는 것들을 인간화된 항체의 발현에 사용할 수 있다. 상기와 같은 숙주 세포의 예로는 비 제한적으로 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, SP2/0-Ag14.19 세포, NSO 세포 등이 있다. 발현 벡터와 숙주 세포의 최상의 조합을 선택함으로써 인간화된 항체의 생산성을 최대화할 수 있다. 더욱 또한, 다양한 무 혈청 배양 배지 및 보충물로부터 적합한 배지를 선택하기 위해서 배양 배지의 조성을 조사해야 하며, 따라서 상기 숙주 세포에 의한 인간화된 항체의 발현을 최적화할 수 있다.
효율성 및 최종 수율에 근거하여, 상기 숙주 세포에 의해 생산된 인간화된 항체를 당해 분야에 널리 공지된 다양한 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 등을 사용하여 상기 배양 상등액으로부터 정제할 수 있다.
5.4. 약학 조성물 및 치료 용도
본 발명은 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는, 상술한 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 활성 성분으로서 본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 약학 조성물을, 비 제한적으로 암, 예를 들어 암세포의 성장 또는 전이, 및 염증성 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장 질병(궤양성 대장염 및 크론병), 자가면역 질병 등을 포함한, RGD 단백질과 관련된 질환 또는 질병의 예방제 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 약학 조성물을 또한 만성적인 기관 이식후 거부, 및 자가면역 질병, 예를 들어 전신 자가면역 질병, 홍반, 포도막염, 베체트병, 다발성근염, 증식성 사구체 신염, 유육종증 등의 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 인간화된 항체를 포함하는, 상술한 질환 또는 질병을 예방 또는 치료하기 위한 예방제 및/또는 치료제는 낮은 독성을 가지며 이를 인간에게 경구 또는 비 경구로, 적합한 용매중에서 혼합하여 액체 제제로서, 또는 적합한 투여 형태의 약학 조성물로서 직접 투여할 수 있다.
상술한 투여에 사용되는 약학 조성물은 상기 항체 또는 그의 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유한다. 상기와 같은 조성물을 경구 또는 비 경구 투여에 적합한 투여형으로 제공한다.
용량은 투여하고자 하는 환자의 연령 및 치수, 표적 질병, 상태, 투여 경로 등에 따라 다양할 수 있다. 상기 항체가 예를 들어 성인 환자의 류마티스성 관절염의 예방 및/또는 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 통상 하루에 대략 1 내지 5 회, 바람직하게는 하루에 대략 1 내지 3 회, 약 0.01 내지 약 20 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 및 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 약 5 ㎎/㎏ 체중의 단일 용량으로 정맥 내 투여하는 것이 유리하다. 다른 비 경구 투여 및 경구 투여에서, 상기 항체를 상기 제공된 용량에 상응하는 용량으로 투여할 수 있다. 상기 상태가 특히 심각한 경우, 상기 용량을 상기 상태에 따라 증가시킬 수도 있다.
다양한 전달 시스템들이 공지되어 있으며 이들, 예를 들어 리포솜 중의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 엔도시토시스를 사용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여할 수 있다(예를 들어 문헌[Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법은 비 제한적으로 피 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비 내(intranasal), 경막 외, 및 경구 경로를 포함한다. 상기 화합물을 임의의 통상적인 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 일시(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부 내층(예를 들어 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며, 다른 생물 활성제와 함께 투여할 수도 있다. 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 폐 투여를 또한 예를 들어 흡입기 또는 분무기의 사용, 및 분무제가 있는 제형에 의해 사용할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물을 치료가 필요한 부위에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이를 예를 들어 비 제한적으로 수술 중 국소 주입, 국소 적용(topical application)에 의해, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱(wound dressing)과 함께, 주사에 의해, 카테터의 사용에 의해, 좌약의 사용에 의해, 코 스프레이의 사용에 의해, 또는 임플란트(implant)의 사용에 의해 성취할 수 있고, 상기 임플란트는 멤브레인, 예를 들어 사이알라스틱(sialastic) 멤브레인, 또는 섬유를 포함하여, 다공성, 비 다공성, 또는 젤라틴성 물질의 것이다. 하나의 실시태양에서, 투여를 감염된 조직 부위(또는 이전의 부위)에 직접 주사에 의할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 소낭, 특히 리포솜 중에서 전달할 수 있다(문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp. 353-365(1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327] 참조; 일반적으로 동일문헌 참조).
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 조절된 방출 시스템 중에서 전달할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 펌프를 사용할 수 있다(상기 문헌[Langer; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 실시태양에서, 중합체성 물질을 사용할 수 있다(문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida(1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiely, New York(1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61(1983)] 참조; 또한 문헌[Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105] 참조). 더욱 또 다른 실시태양에서, 조절된 방출 시스템을 상기 조성물의 표적 부근에 놓을 수 있으며, 따라서 단지 전신 용량의 일부분만이 필요하다(예를 들어 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138(1984)] 참조). 다른 조절된 방출 시스템들이 랭거(Langer)의 평론에 논의되어 있다(Science 249:1527-1533(1990)).
경구투여용 조성물의 예는 고체 또는 액체 투여형, 구체적으로 정제(당의정 및 필름 코팅된 정제 포함), 환제(pills), 과립, 분말 제제, 캡슐(연질 캡슐 포함), 시럽, 유화액, 현탁액 등을 포함한다. 상기와 같은 조성물은 공지된 방법들에 의해 제조되며 약학 제제 분야에 통상적으로 사용되는 비히클, 희석제 또는 부형제를 함유한다. 상기 정제용 비히클 또는 부형제의 예는 락토오스, 전분, 슈크로스, 마그네슘 스테아레이트 등이다.
주사용 제제는 정맥 내, 피하, 피 내 및 근육 내 주사, 점적제 등에 대한 투여형들을 포함할 수 있다. 이들 주사용 제제는 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다. 상기 주사용 제제를, 예를 들어 상술한 항체 또는 그의 염을 주사용으로 통상 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 용해, 현탁 또는 유화시켜 제조할 수 있다. 주사용 수성 매질로서, 예를 들어 생리 식염수, 글루코스 및 다른 보조제를 함유하는 등장성 용액 등이 있으며, 이들을 적합한 용해제(solubilizing agent), 예를 들어 알콜(예를 들어 에탄올), 폴리알콜(예를 들어 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들어 폴리솔베이트 80, HCO-50(수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌(50 몰) 부가물)] 등과 함께 사용할 수 있다. 상기 유성 매질로서, 예를 들어 참깨기름, 대두유 등이 사용되며, 이들을 용해제, 예를 들어 벤질 벤조에이트, 벤질 알콜 등과 함께 사용할 수 있다. 상기와 같이 제조된 주사액을 바람직하게는 적합한 앰풀(ampoule)에 충전한다. 직장 투여에 사용되는 좌약은 상기 항체 또는 그의 염을 좌약용으로 통상적인 베이스와 함께 블렌딩하여 제조할 수 있다.
유리하게는, 상술한 경구 또는 비경구용 약학 조성물을 상기 활성 성분의 용량을 맞추는데 적합한 단위 용량의 투여형으로 제조한다. 상기와 같은 단위 용량의 투여형은 예를 들어 정제, 환제, 캡슐, 주사액(앰풀), 좌약 등을 포함한다. 상기 함유된 항체의 양은 일반적으로 단위 용량의 투여형 당 약 5 내지 500 ㎎이며; 특히 주사액의 형태에서, 상기 항체를 약 5 내지 100 ㎎으로 함유하고 다른 투여형의 경우 약 10 내지 250 ㎎으로 함유하는 것이 바람직하다.
상술한 각각의 조성물은 제형이 상술한 항체와 임의의 불리한 상호작용을 일으키지 않는 한 다른 활성 성분들을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 세포 및/또는 조직 리모델링을 위한 억제제 및/또는 촉진제(활성 성분으로서 RGD 서열-결합 기능성 분자(예를 들어 인테그린 등)을 포함한다); 및 세포 및/또는 조직 리모델링을 억제 및/또는 촉진하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 RGD 단백질 발현 세포 및/또는 조직(예를 들어 종양 세포, 호중구, 평활근 등)을 상기 RGD 단백질 결합 기능성 분자와 접촉시킴을 포함한다. 상기와 같은 치료제 중의 활성 성분의 용량, 투여 방법, 약학 제제 등을 본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 상기 약제의 설명을 참고로 적합하게 결정할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 RGD 단백질과 관련되거나 이를 수반하는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 인간화된 항체들 중 하나 이상을 상기 예방 또는 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함한다.
5.5. 진단 용도
본 발명의 인간화된 항체를 포함하는 약학 조성물을 암(예를 들어 암세포의 성장 또는 전이) 및 염증성 질병(예를 들어 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 암전이, 동맥 경화증, 다발성 경화증, 육아종 등)의 진단제로서, 또는 만성적인 기관 이식후 거부, 자가면역 질병, 예를 들어 전신 자가면역 질병, 홍반, 포도막염, 베체트병, 다발성근염, 증식성 사구체 신염, 유육종증 등의 진단제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 인간화된 항체는 상기 RGD 서열을 특이적으로 인식할 수 있고, 따라서 이를 특히 샌드위치 면역분석, 경쟁 분석, 면역측정(immunometry), 신장측정(nephrometry) 등의 정량화, 면역염색 등을 위해 시험 유체 중의 RGD 단백질을 정량화하는데 사용할 수 있다. 이러한 면역학적 방법을 본 발명의 분석 방법에 적용함에 있어서, 임의의 특정한 조건, 과정 등을 열거할 필요는 없다. 당해 분야에 통상적인 기술적 고려사항을 통상적인 조건 및 과정에 부가함으로써 분석 시스템을 구성하는 것으로 충분하다. 이러한 일반적인 기술 수단의 세부사항에 대해서, 평론, 텍스트 등을 참고로 할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 RGD 단백질을 본 발명의 항체를 사용함으로써 고 감도로 정량화할 수 있다. 본 발명의 인간화된 항체는 상기 RGD 단백질의 생체 내 정량화 방법을 적용함으로써 상기 RGD 단백질과 관련된 다양한 질병을 진단하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 상기 RGD 단백질의 발현 수준의 증가 또는 감소를 검출하는 경우, 현재 상기 RGD 단백질과 관련된 질병, 예를 들어 암 또는 염증성 질병을 앓고 있을 가능성이 매우 크거나 장래에 상기 질병을 앓을 가능성이 매우 큰 사람을 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 환자에게서 상기 RGD 단백질과 관련되거나 이를 수반하는 질환 또는 질병의 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본 발명의 인간화된 항체들 중 하나 이상 또는 둘 모두를 상기 진단이 필요한 환자에게 투여함을 포함한다. 상기와 같은 생체 내 진단에 필요한 투여량은 치료용으로 필요한 경우보다 적을 수 있으며 이는 통상적인 과정에 따라 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 인간화된 항체를 또한 시험 샘플(예를 들어 체액, 조직 등과 같은 시험 유체)에 존재하는 RGD 단백질을 특별히 검출하는데 사용할 수 있다. 상기 인간화된 항체를 또한 상기 RGD 단백질의 정제를 위한 항체 컬럼의 제조, 정제 시 각 분획 중에 함유된 RGD 단백질의 검출, 또는 시험하고자 하는 세포에서의 RGD 단백질의 반응 분석에 사용할 수 있다.
본 명세서의 서열 목록 내의 서열식별번호는 다음 서열들을 가리킨다:
[서열 식별번호: 1]
마우스의 33E10과 인간의 33E10에 공통된 CDRH1의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 2]
마우스의 33E10과 인간의 33E10에 공통된 CDRH2의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 3]
마우스의 33E10과 인간의 33E10에 공통된 CDRH3의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 4]
마우스의 33E10과 인간의 33E10에 공통된 CDRL1의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 5]
마우스의 33E10과 인간의 33E10에 공통된 CDRL2의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 6]
마우스의 33E10과 인간의 33E10에 공통된 CDRL3의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 7]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, SpeI 및 HindIII 부위가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VH5 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 8]
신호 펩티드를 포함하는 Hu33E10 VH5 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 9]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, SpeI 및 HindIII 부위가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VH7 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 10]
신호 펩티드를 포함하는 Hu33E10 VH7 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 11]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, SpeI 및 HindIII 부위가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VH7.8 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 12]
신호 펩티드를 포함하는 Hu33E10 VH7.8 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 13]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, NheI 및 EcoRI 부위가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VL6 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 14]
신호 펩티드를 포함하는 Hu33E10 VL6 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 15]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, NheI 및 EcoRI 부위가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VLv2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 16]
신호 펩티드를 포함하는 Hu33E10 VLv2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 17]
Hu33E10 중쇄 및 경쇄 cDNA의 PCR 증폭 및 서열화에 사용되는 올리고뉴클레오티드[CMV2]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 18]
Hu33E10 중쇄 및 경쇄 cDNA의 PCR 증폭 및 서열화에 사용되는 올리고뉴클레오티드[JNT026]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 19]
Hu33E10 중쇄 및 경쇄 cDNA의 PCR 증폭 및 서열화에 사용되는 올리고뉴클레오티드[JNT080]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 20]
Hu33E10 중쇄 및 경쇄 cDNA의 PCR 증폭 및 서열화에 사용되는 올리고뉴클레오티드[JNT082]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 21]
Hu33E10 중쇄 및 경쇄 cDNA의 PCR 증폭 및 서열화에 사용되는 올리고뉴클레오티드[JNT084]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 22]
Hu33E10 중쇄 및 경쇄 cDNA의 PCR 증폭 및 서열화에 사용되는 올리고뉴클레오티드[JNT097]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 23]
Hu33E10 중쇄 및 경쇄 cDNA의 PCR 증폭 및 서열화에 사용되는 올리고뉴클레오티드[JNT098]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 24]
NS0-Hu33E10-4 및 NS0-Hu33E10-6 내에서 발현된 VH7 및 감마-1 중쇄 불변 영역을 암호화하는 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 25]
NS0-Hu33E10-4 및 NS0-Hu33E10-6 내에서 발현된 VH7 및 감마-1 중쇄 불변 영역을 암호화하는 영역의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 26]
NS0-Hu33E10-5 내에서 발현된 VH7.8 및 감마-1 중쇄 불변 영역을 암호화하는 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 27]
NS0-Hu33E10-5 내에서 발현된 VH7.8 및 감마-1 중쇄 불변 영역을 암호화하는 영역의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 28]
NS0-Hu33E10-4 및 NS0-Hu33E10-5 내에서 발현된 VL6 및 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 29]
NS0-Hu33E10-4 및 NS0-Hu33E10-5 내에서 발현된 VL6 및 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 영역의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 30]
NS0-Hu33E10-6 내에서 발현된 VLv2 및 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 31]
NS0-Hu33E10-6 내에서 발현된 VLv2 및 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 영역의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 32]
33E10 VL의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 33]
Hu33E10 VLv2의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 34]
마우스 33E10 VH cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 35]
마우스 33E10 VH cDNA의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 36]
마우스 33E10 VL cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 37]
마우스 33E10 VL cDNA의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 38]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, SpeI 및 HindIII 부위가 측면에 위치하고 있는 디자인된 33E10 VH 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 39]
신호 펩티드를 포함하는 디자인된 33E10 VH 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 40]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, NheI 및 EcoRI 부위가 측면에 위치하고 있는 디자인된 33E10 VL 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 41]
신호 펩티드를 포함하는 디자인된 33E10 VL 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 42]
33E10 VH의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 43]
인간화된 33E10(Hu33E10) VH1의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 44]
33E10 VL의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 45]
인간화된 33E10(Hu33E10) VL1의 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 46]
Hu33E10 VH1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ220]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 47]
Hu33E10 VH1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ206]을 나타낸다.
[서열 식별번호: 48]
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Hu33E10 VL1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ196]을 나타낸다.
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Hu33E10 VL1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ197]을 나타낸다.
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Hu33E10 VL1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ202]를 나타낸다.
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Hu33E10 VL1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ203]을 나타낸다.
[서열 식별번호: 74]
Hu33E10 VL1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ204]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 75]
Hu33E10 VL1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ205]를 나타낸다.
[서열 식별번호: 76]
Hu33E10 VL1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ101]을 나타낸다.
[서열 식별번호: 77]
Hu33E10 VL1 유전자의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 [JNJ117]을 나타낸다.
[서열 식별번호: 78]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, SpeI 및 HindIII 부위가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VH1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 79]
신호 펩티드를 포함하는 Hu33E10 VH1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 80]
신호 펩티드와 인트론 서열을 암호화하는 서열을 포함하며, NheI 및 EcoRI 부위가 측면에 위치하고 있는 Hu33E10 VL1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 81]
신호 펩티드를 포함하는 Hu33E10 VL1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 82]
5'RACE 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 83]
5'RACE 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 84]
진레이서 5' 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 85]
33E10 VH 3' 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 86]
33E10 VL 3' 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 87]
33E10 VH 5' 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 88]
33E10 VH 3' 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 89]
33E10 VL 5' 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 90]
33E10 VL 3' 프라이머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 91]
Hu33E10 VH5 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 92]
Hu33E10 VH5 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 93]
Hu33E10 VH7 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 94]
Hu33E10 VH7 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 95]
Hu33E10 VH7.8 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 96]
Hu33E10 VH7.8 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 97]
Hu33E10 VL6 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 98]
Hu33E10 VL6 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 99]
Hu33E10 VLv2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
[서열 식별번호: 100]
Hu33E10 VLv2 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타낸다.
6. 실시예
하기 실시예들은 RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 단클론 항체의 제조, 상기 단클론 항체의 V-영역들의 서열화, 상기 항체의 에피토프 지도작성 및 기타 특성화, 및 상기와 같은 항체의 키메릭화 및 인간화뿐만 아니라 생성되는 키메릭 및 인간화된 항체의 특성화를 예시한다. 이들 실시예를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다.
6.1. 마우스 33 E10 가변 영역 유전자의 클로닝 및 서열화
마우스 33E10 하이브리도마 세포를 37 ℃에서 7.5% CO2 배양기 중의 10% 소 태아 혈청(FBS; HyClone, Logan, UT)을 함유하는 TIL 배지 I(Immuno-Biological Laboratories, Gunma, Japan)에서 증식시켰다. 전체 RNA를 공급자의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 대략 3 x 106 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. 올리고 dT-프라임드 cDNA(oligo dT-primed cDNA)를 공급자의 프로토콜에 따라 진레이서 키트(Invitrogen)를 사용하여 합성하였다. 33E10 중쇄 및 경쇄에 대한 가변 영역 cDNA를, 마우스 감마-1 및 카파 쇄 불변 영역에 각각 어닐링된 3' 프라이머, 및 상기 진레이서 키트에 제공된 진레이서 5' 프라이머(5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3')(서열식별번호: 84)를 사용하여 퓨전(Phusion) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA)와의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 중쇄 가변영역(VH)의 PCR 증폭을 위한 3' 프라이머는 서열 5'-GCCAGTGGATAGACAGATGG-3'(서열식별번호: 85)을 갖는다. 경쇄 가변영역(VL)의 PCR 증폭을 위한 3' 프라이머는 서열 5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3'(서열식별번호: 86)을 갖는다. 상기 증폭된 VH 및 VL cDNA를 서열 결정을 위해 pCR4Blunt-TOPO 벡터(Invitrogen)에 클로닝시켰다. 상기 가변 영역들의 DNA 서열화를 토코레(Tocore; Menlo Park, CA)에서 수행하였다. 여러 중쇄 및 경쇄 클론들을 서열화하고 전형적인 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역들에 일치하는(homologous) 독특한 서열들을 확인하였다. 상기 컨센서스 cDNA(consensus cDNA) 서열들을, 33E10 VH 및 VL의 추론된 아미노산 서열과 함께 각각 도 1 및 2에 나타낸다.
6.2. 키메릭 33 E10 IgG1 /κ 항체의 제작
33E10 VH를 암호화하는 유전자를, 주형으로서 33E10 VH cDNA, 5' 프라이머로서 5'-GGGACTAGTACCACCATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATT-3'(SpeI 부위는 밑줄로 나타낸다)(서열식별번호: 87), 및 3' 프라이머로서 5'-GGGAAGCTTGAAGTTAGGACTCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3'(HindIII 부위는 밑줄로 나타낸다)(서열식별번호: 88)을 사용하여 PCR에 의해 연접 공여체 신호 및 적합한 측면 인접 제한 효소부위(flanking restriction enzyme site)들을 포함하는 엑손으로서 생성시켰다(도 3). 마찬가지로, 33E10 VL을 암호화하는 유전자를, 주형으로서 33E10 VL cDNA, 5' 프라이머로서 5'-GGGGCTAGCACCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3'(NheI 부위는 밑줄로 나타낸다)(서열식별번호: 89), 및 3' 프라이머로서 5'-GGGGAATTCTTTGGATTCTACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3'(EcoRI 부위는 밑줄로 나타낸다)(서열식별번호: 90)을 사용하여 PCR에 의해 연접 공여체 신호 및 적합한 측면 인접 제한 효소부위들을 포함하는 엑손으로서 생성시켰다(도 4). 상기 33E10 VH 및 VL 엑손의 연접 공여체 신호는 각각 마우스 생식세포계열 JH3 및 Jκ1 서열로부터 유래하였다(카밧 등, Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). PCR-증폭된 단편들을 퀴아퀵 젤 추출 키트(QIAquick Gel Extraction Kit; Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 젤-정제하고, SpeI 및 HindIII(VH의 경우) 또는 NheI 및 EcoRI(VL의 경우)으로 절단하고, 키메릭 33E10 IgG1/κ 항체의 생산을 위해 인간 감마-1 및 카파 불변 영역을 수반하는 포유동물 발현 벡터에 클로닝하였다. 상기 생성되는 발현 벡터 pCh33E10의 도식적 구조를 도 5에 나타낸다.
6.3. 인간화된 33 E10 VH 및 VL 유전자의 생성
상기 33E10 가변 영역의 인간화를 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:10029-10033, 1989]에 개략된 바와 같이 수행하였다. 먼저, 상기 33E10 가변 영역의 3차원 분자 모델을 컴퓨터 프로그램의 도움으로 제작하였다. 이어서 인간 가변 영역 서열에 대한 상동성 연구를 근거로, U03400(진뱅크 수탁 번호)의 인간 VH 아미노산 서열(33E10 VH와 높은 상동성을 갖는다)을 수용체로서 선택하여 인간화된 33E10 VH에 대한 프레임워크를 제공하였다. 마찬가지로, X72452(진뱅크 수탁 번호)의 인간 VL 아미노산 서열을 33E10 VL의 인간화를 위한 수용체로서 선택하였다.
상기 3차원 모델이 상기 상보성 결정 영역(CDR)과의 의미있는 접촉을 제시한 프레임워크 위치에서, 상기 마우스 33E10 가변 영역으로부터의 아미노산 잔기를 상기 인간 프레임워크 잔기들을 위하여 치환하였다. 이를 30 및 48 번 위치에서 수행하여 인간화된 33E10 (Hu33E10) VH1를 생성시켰다(도 6). 경쇄의 경우, 인간화된 33E10(Hu33E10) VL1을 생성시키기 위한 대체가 필요하지 않았다(도 7). 33E10, 디자인된 Hu33E10 및 인간 수용체 아미노산 서열의 정렬을 도 6에서 VH에 대해, 도 7에서 VL에 대해 나타낸다.
Hu33E10 VH1 및 VL1 각각을 암호화하는 유전자를, 포유동물 발현 벡터 내로의 후속 클로닝을 위해 신호 펩타이드, 연접 공여체 신호 및 적합한 제한 효소 부위를 포함하는 엑손으로서 디자인하였다. 상기 Hu33E10 VH1 및 VL1 엑손의 연접 공여체 신호는 각각 인간 생식세포계열 JH3 및 Jκ1 서열로부터 유래하였다(카밧 등, 1991). 마우스 33E10 VL1 유전자의 신호 펩타이드 서열은 SIG-Pred 신호 펩타이드 예측 소프트웨어(http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.html)에 의해 정확한 절단에 차선인 것으로 나타났다. 따라서, 상기 마우스 단클론 항체 35B6(Gene Techno Science)의 VL 유전자의 신호 펩타이드(상기 SIG-Pred 소프트웨어에 의해 효율적이고 정확하게 절단되는 것으로 예측되었다)를 상기 Hu33E10 VL1 엑손에 사용하였다. 상기 Hu33E10 VH1 엑손 중의 신호 펩타이드 서열은 상응하는 마우스 33E10 VH 서열로부터 유래하였다. 상기 SIG-Pred 소프트웨어는 상기 Hu33E10 VH1 유전자의 신호 펩타이드가 효율적이고 정확하게 절단됨을 나타냈다.
상기 Hu33E10 VH1 및 VL1 유전자를 문헌[He et al., J. Immunol. 160:1029-1035, 1998]에 의해 개략된 바와 같이 퓨전 DNA 폴리머라제를 사용하여 여러 개의 중복 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 연장 및 PCR 증폭에 의해 제작하였다. Hu33E10 VH1 및 VL1 유전자의 제작을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드들을 각각 도 8 및 도 9에 나타낸다. 상기 Hu33E10 VH1 및 VL1 유전자 중의 상기 올리고뉴클레오티드들의 위치를 각각 도 10 및 11에 나타낸다. PCR-증폭된 단편들을 퀴아퀵 젤 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 젤-정제하고 서열 결정을 위해 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 클로닝하였다. SpeI 및 HindIII(VH의 경우) 또는 NheI 및 EcoRI(VL의 경우)으로 절단한 후에, Hu33E10 VH1 및 VL1 유전자를 인간 IgG1/κ 형태로 생산하기 위해 포유동물 발현 벡터 중의 상응하는 부위 내로 서브클로닝하였다. 상기 생성되는 발현 벡터 pHu33E10-1의 도식적 구조를 도 5에 나타낸다. 상기 수득된 Hu33E10 VH1 및 VL1 유전자의 뉴클레오티드 서열을 상기 추론된 아미노산 서열들과 함께 각각 도 12 및 도 13에 나타낸다.
6.4. 키메릭 및 인간화된 33 E10 항체의 발현
각각의 키메릭 및 인간화된 33E10 IgG1/κ 항체를 안정적으로 생산하는 세포 주를 얻기 위해, 발현 벡터 pCh33E10 및 pHu33E10-1 각각을 마우스 골수종 세포 주 NS0의 크로모좀 내로 도입하였다(Euorpean Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire, UK). NS0 세포들은 7.5% CO2 배양기(incubator) 중에서 37 ℃에서 10% FBS를 함유하는 DME 배지에서 배양되었다. NS0 세로 내로의 안정한 형질감염은 베빙턴(Bebbington) 등의 문헌(Bio/Technology 10: 169-175, 1992)에 기재된 바에 따른 전기천공법(electroporation)에 의해 수행되었다. 형질감염 이전에, 각 발현 벡터는 FspI를 이용하여 선형화되었다. 대략 107 세포들이 선형화된 플라스미드 10㎍으로 형질감염되었고, 10% FBS를 함유하는 DME 배지에 현탁되었으며, 여러개의 96-웰 플레이트에 접종되었다. 24~48시간 후, 선택 배지[10% FBS를 함유하는 DME 배지, HT 배지 보충물(Sigma, St.Louis, MO), 0.25mg/ml 잔틴(xanthine) 및 1㎍/ml 마이코페놀산(mycophemolic acid)]가 적용되었다. 선택 개시로부터 대략 10일 후, 항체 생성에 관하여 배양 상등액이 분석되었다.
배양 상등액 내의 pCh33E10 및 pHu33E10-1으로부터 발현된 재조합 항체(각각 Ch33E10 및 Hu33E10-VH1/VL1)의 발현 수준을 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 전형적인 실험에서, ELISA 플레이트를 PBS 중의 1/2,000-희석된 염소 항-인간 IgG Fcγ-쇄-특이적 다클론 항체(SouthernBiotech, Birmingham, AL) 100 ㎕/웰로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 세척 완충액(0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS)으로 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액(2% 탈지유 및 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS) 300 ㎕/웰로 차단시켰다. 세척 완충액으로 세척 후에, ELISA 완충액(1% 탈지유 및 0.025% 트윈 20을 함유하는 PBS)으로 적합하게 희석한 샘플 100 ㎕/웰을 상기 ELISA 플레이트에 적용시켰다. 인간 골수종 혈청(SouthernBiotech)으로부터 정제된 인간 IgG1/κ 항체 또는 정제된 Ch33E10을 표준으로서 사용하였다. 상기 ELISA 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양하고 세척 완충액으로 세척한 후에, 결합된 항체를 1/2,000-희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 카파 쇄 다클론 항체(SouthernBiotech) 100 ㎕/웰을 사용하여 검출하였다. 실온에서 1 시간 동안 배양하고 세척 완충액으로 세척한 후에, ABTS 기질 100 ㎕/웰을 첨가하여 발색을 수행하고, 2% 옥살산 100 ㎕/웰로 발색을 정지시켰다. 흡광도를 405 ㎚에서 판독하였다.
고도의 Ch33E10을 생산하는 NS0 안정 형질감염체 중 하나(NS0-Ch33E10 2C11; L4-2C11이라고도 함)가 하이브리도마 SFM(Invitrogen)을 이용하여 무 혈청 배지(serum free media) 내에서의 성장에 적용되었고, 롤러 보틀 내에서 약 106/ml의 농도까지 증량되었으며, 초여과된 콩 가수분해물(Ultrafiltrated Soy hydrolyzate)(Irvine Scientivid Cat# 96857) 6 mg/ml를 첨가하였고, 세포 생존률이 50% 미만이 될 때까지 추가로 성장시켰다. 원심분리 및 여과 후, 배양 상등액을 단백질 A-세파로스 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ)에 부었다. 컬럼은 0.1 M 글리신-염산(pH 3.0)으로 용리하기 전에 PBS로 세척되었다. 1 M Tris-염산(pH 8)으로 중화시킨 후, 용리된 항체의 완충액은 투석에 의해 PBS로 교환되었다. 280 nm에서의 흡광도를 측정하여, 항체의 농도를 측정하였다(1 mg/ml = 1.4 OD).
Ch33E10을 발현시키는 NS0 안정 형질감염체가 용이하게 얻어지는 반면, pHu33E10-1로 안정하게 형질감염된 모든 NS0 형질감염체는 Hu33E10-VH1/VL1을 잘 생산하지 못하는 것으로 판명되었다. 중쇄 및 경쇄 mRNA의 분석에 의하면, VL1 유전자의 신호 펩타이드-암호화 영역 내에 우연히 형성된 연접 공여체 사이트에 기인하여, VL 암호화 영역이 결여된 mRNA 이상 경쇄의 존재가 밝혀졌다. 이러한 문제를 해결하기 위해, overlap-extension PCR법을 이용한 사이트-지정 유도돌연변이에 의해 신호 펩타이드-암호화 영역 내에서의 연접 공여체 사이트를 제거하였다(Higuchi, R., in PCR Technology; Principles and Applications for DNA Amplification. Erlich, H. A., ed.pp.61-70, Stockton Press, New York, 1989). 얻어진 변형체 Hu33E10 VL 유전자, VL6의 서열은 도 14에 나타낸다. VL 영역 아미노산 서열은 VL1 및 VL6 유전자들 사이에서 서로 동일하다. pHu33E10-2를 제조하기 위해 발현벡터 pHu33E10-1 내에서 VL1 유전자 대신에 VL6로 치환하였다. pHu33E10-2로 안정하게 형질감염되고 재조합 항체(Hu33E10-VH1/VL6)를 고도로 생산하는 NS0 세포들이 전술한 방법에 의해 얻어졌다. pHu33E10-2로 안정하게 형질감염된 NS0 세포들 내에서 이상경쇄 mRNA는 발견되지 않았다. 고도의 Hu33E10-VH1/VL6을 생산하는 NS0 안정 형질감염체 중 하나(NS0-Hu33E10-2 #22)가 하이브리도마 SFM에 적용 및 증량되었고, 배양 상등액이 Hu33E10-VH1/VL6의 정제를 위해 전술한 바에 따라 사용되었다.
6.5. Hu33E10 - VH1 / VL6 의 특성화
Ch33E10 및 Hu33E10-VH1/VL6 IgG1/κ항체의 hOPN5-BSA에 대한 결합을 ELISA로 조사하였다. 항원으로서, 소 혈청 알부민에 접합된 합성 올리고펩타이드(Cys-Val-Asp-Thr-Tyr-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Val-Val-Tyr-Gly-Leu-Arg-Ser: Gene Techno Science 제공)(hOPN5-BSA)를 사용하였다. 전형적인 실험에서, ELISA 플레이트를 0.2 M Na2CO3 완충액(pH 9.4) 중의 hOPN5-BSA 1 ㎍/㎖의 100 ㎕/웰로 4 ℃에서 밤새 코팅하고, 세척 완충액으로 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 300 ㎕/웰로 차단시켰다. 세척 완충액으로 세척 후에, ELISA 완충액으로 적합하게 희석한 샘플 100 ㎕/웰을 상기 ELISA 플레이트에 적용하였다. 상기 ELISA 플레이트를 4 ℃에서 밤새 배양하고 세척 완충액으로 세척한 후에, 결합된 항체를 1/2,000-희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 γ 쇄 다클론 항체(SouthernBiotech) 100 ㎕/웰을 사용하여 검출하였다. 실온에서 1 시간 동안 배양하고 세척 완충액으로 세척한 후에, ABTS 기질 100 ㎕/웰을 첨가하여 발색을 수행하고 2% 옥살산 100 ㎕/웰로 정지시켰다. 흡광도를 405 ㎚ 에서 판독하였다.
도 15A에 나타낸 바와 같이,hOPN5-BSA에 대한 Hu33E10-VH1/VL6의 결합은 Ch33E10에 비해 약 100배 약했다.
6.6. Hu33E10 VH5 , VH7 및 VH7 .8의 생성 및 특성화
인간화된 VH1 및 VL6 유전자 중 어느 것이 Hu33E10-VH1/VL6의 항원-결합 친화성의 손실에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 두개의 재조합 IgG1/κ항체, 마우스의 VH와 인간화된 VL6로 구성된 것(MoHu33E10), 및 인간화된 VH1과 마우스의 VL로 구성된 것(HuMo33E10)을 제조하였다. MoHu33E10 및 HuMo33E10 항체들의 분석을 통해, Hu33E10-VH1/VL6의 친화성의 손실은 주로 VH1유전자로 인한 것이고, VL1 유전자는 일부 기인하는 것으로 확인되었다(데이타를 나타낸다).
VH1 유전자의 1차 변이 분석에 의하면, 73 내지 77 위치의 아미노산들이 항원-결합 친화성을 유지하는 데 중요한 것으로 추정된다(데이타는 나타내지 않는다). overlap-extension PCR법(Higuchi, 1989)을 이용한 사이트-지정 유도돌연변이에 의해 구성된 VH1 유전자의 세가지 변형체(VH5, VH7, 및 VH7.8)들이 추가의 분석을 위해 선택되었다. VH1과의 대비에서, VH5에서는 77 위치의 Ile가 Ser 대신에(도 6 및 16), VH7에서는 76 위치의 Ser 및 77 위치의 Ile가 각각 Asn 및 Ser 대신에(도 6 및 17), 그리고, VH7.8에서는 74위치의 Ser, 76 위치의 Ser 및 77 위치의 Ile가 각각 Ala, Asn 및 Ser 대신에(도 6 및 18) 사용되었다.
SpeI 및 HindIII로 절단된 VH5, VH7, 및 VH7.8 유전자 각각은 pHu33E10-2의 VH1대신에 사용되어, 발현 벡터들 pHu33E10-3, pHu33E10-4, 및 pHu33E10-5을 각각 구성하였다. 각 pHu33E10-3, pHu33E10-4, 및 pHu33E10-5로 안정하게 형질감염된 NS0 세포들이 섹션 4에 기재된 바에 따라 제조되었다. Hu33E10-VH5/VL6을 생산하는 NS0-Hu33E10-3 #65, Hu33E10-VH7/VL6을 생산하는 NS0-Hu33E10-4 5D3(R3-1 5D3라고도 함), 및 Hu33E10-VH7.8/VL6을 생산하는 NS0-Hu33E10-5 1E5(EJ3-3 1E5라고도 함)가 성장을 위해 하이브리도마 SFM에 적용되었고, 롤러 보틀 내에서 증량되었다. Hu33E10-VH5/VL6, Hu33E10-VH7/VL6 및 Hu33E10-VH7.8/VL6 항체들은 섹션 4에 기재된 바에 따라 단백질 A 컬럼을 이용하여 상응하는 배지 보충물로부터 정제되었다.
hOPN5-BSA에 대한 Hu33E10-VH5/VL6, Hu33E10-VH7/VL6 및 Hu33E10-VH7.8/VL6 항체들의 결합은 섹션 5에 기재된 바에 따라 ELISA에 의해 Ch33E10의 경우와 비교되었다. hOPN5-BSA에 대한 Hu33E10-VH5/VL6의 친화성은 Hu33E10-VH1/VL6과 비교해볼 때 약간 향상되었으나, Ch33E10의 경우 보다는 여전히 훨씬 약했다(도 15A). hOPN5-BSA에 대한 Hu33E10-VH7/VL6의 결합 친화성은 Ch33E10의 경우보다 3 내지 4배 약했다(도 15A). Hu33E10-VH7.8/VL6의 친화성은 본 실험에서 Ch33E10의 경우보다 대략 3배 낮았다(도 15B). 반복된 실험들에서, hOPN5-BSA결합에 있어서 Hu33E10-VH7/VL6 및 Hu33E10-VH7.8/VL6은 서로 유사하게 행동하였다.
6.7. Hu33E10 VLv2 의 생성 및 특성화
VL1 유전자가 친화성의 손실에 일부 영향을 미치는 것으로 추정됨에도 불구하고, VL1 유전자의 1차 변이 분석은 Hu33E10-VH1/VL6의 결합 친화성의 손실에 기여하는 어떠한 특정 프레임 워크 아미노산 잔기의 동정에 실패하였다(데이타는 나타내지 않음). VL1 유전자를 추가로 특성화하는 대신, 상이한 인간 프레임워크에 기반을 둔 새로운 인간화된 33E10 VL(VLv2)가 계획되었다(도 19). VLv2를 위해, M29467(Gene Bank 수탁번호)의 인간 아미노산 서열을 수용체로서 선택하였다. CDR과 의미있는 상호작용이 예상되는 위치인 22 및 37 위치에서, 마우스의 33E10 VL의 아미노산 잔기들은 인간화된 형태에서 잔류되었다. Nhe I 및 EcoRI 부위가 측면에 위치하고 있는 33E10 VLv2 유전자(도 20)는 Gen Scirpt USA Inc.(Piscataway, NJ)에서 합성되었다. VL6 및 VLv2 유전자들은 같은 신호 펩티드 서열 및 연접 공여 신호를 공유한다(도 14 및 20).
NheI 및EcoRI로 절단된 Hu33E10 VLv2 유전자를 pHu33E10-4의 VL1 대신에 사용하여, 새로운 발현 벡터 pHu33E10-6를 구성하였다. Hu33E10-VH7/VLv2 IgG1/κ를 생산하기 위해 pHu33E10-6로 안정하게 형질감염된 NS0 세포들이 섹션 4에 기재된 바에 따라 제조되었다. 형질감염체들 중 하나, NS0-Hu33E10-6 I-15(SP2-1 I-15라고도 함)가 하이브리도마 SFM에 적용 및 증량되었고, 섹션 4에 기재된 방법을 이용하여 Hu33E10-VH7/VLv2 항체가 배양 상등액으로부터 정제되었다.
hOPN5-BSA에 대한 Hu33E10-VH7/VLv2의 결합은 섹션 5에 기재된 바에 따라 ELISA에 의해 분석되었다. 두번의 독립된 실험의 결과들은 도 21에 나타내었다. Hu33E10-VH7/VLv2의 결합 친화성은 양 실험에서 Ch33E10의 2배 이내였다.
6.8. NS0 안정 형질감염체의 특성화
PCR Mycoplasma Detection Set(Takara Bio USA, Madison,WI)를 이용한 시험에서, NS0-Ch33E10 2C11, NS0-Hu33E10-4 5D3, NS0-Hu33E10-5 1E5 및 NS0-Hu33E10-6 I-15는 미코플라스마(mycoplasma)의 존재에 대해 모두 음성을 나타내었다.
NS0-Hu33E10-4 5D3, NS0-Hu33E10-5 1E5 및 NS0-Hu33E10-6 I-15에서 생성된 Hu33E10-VH7/VL6, Hu33E10-VH7.8/VL6 및 Hu33E10-VH7/VLv2 IgG1/κ 항체들 각각의 중쇄 및 경쇄의 확실성은 cDNA 서열분석으로부터 확인되었다. 상기 세포들로부터 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 총 RNA가 추출되었고, RT-PCR을 위한 SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)을 이용하여 공급자의 프로토콜에 따라 올리고 dT-프라임드(primed) cDNA가 합성되었다. 감마-1 중쇄의 암호화 영역은 CMV2 및 JNT098을 프라이머 및 Phusion DNA 폴리머라아제로서 이용하여 증폭되었다(도 22). PCR 단편들은 겔-정제되었고, 프라이머로서 CMV2, JNT082, JNT097 및 JNT098을 이용하여 서열화를 행하였다(도 22). 유사하게, 카파 경쇄의 암호화 영역이 CMV2 및 JNT026을 이용하여 증폭되었고(도 22), 겔-정제된 DNA 단편들은 프라이머로서 CMV2, JNT026, JNT080 및 JNT084를 이용하여 서열화를 행하였다(도 22). 중쇄 및 경쇄 암호화 영역의 얻어진 서열은 NS0-Hu33E10-4 5D3, NS0-Hu33E10-5 1E5 및 NS0-Hu33E10-6 I-15 안정 형질감염체의 각 발현벡터 내의 상응하는 서열들과 완벽히 대응되었다. Hu33E10-VH7 및 VH7.8로 이루어진 감마-1 중쇄의 전체 암호화 영역의 서열을 도 23 및 24에 각각 나타내었다. Hu33E10-VL6 및 VLv2로 이루어진 카파 경쇄의 전체 암호화 영역의 서열은 도 25 및 26에 나타내었다.
추가로, NS0-Ch33E10 2C11에서 생성된 Ch33E10 IgG1/κ 항체들의 VH 및 VL 영역들의 확실성은 cDNA 서열화를 통해 확인되었다. 총 RNA 및 cDNA 합성물의 추출은 전술한 바에 따라 수행되었다. VH 암호화 영역은 CMV2 및 JNT082을 프라이머 및 Phusion 폴리머라아제로서 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 단편들은 겔-정제되었고, 프라이머로서 CMV2 및 JNT082를 이용하여 서열화를 행하였다. 유사하게, VL 암호화 영역이 CMV2 및 JNT026을 이용하여 증폭되었고, 겔-정제된 DNA 단편들은 프라이머로서 CMV2 및 JNT026을 이용하여 서열화를 행하였다. VH 및 VL 영역들의 얻어진 뉴클레오티드 서열들은 pCh33E10 발현 벡터 내의 상응하는 서열들과 완벽하게 대응되었다(각각 도 3 및 4).
6.9 결론
hOPN5-BSA에 대한 Hu33E10-VH7/VLv2 IgG1/κ의 친화성은 Ch33E10 IgG1/κ의 경우의 3배 이내로 측정되었다.
6.10. 세포유착 억제 분석
도 27은 인간화된 항-OPN 항체들이 MDA-MB-435S의 hOPN-BSA에 대한 유착을 억제하는 것을 나타낸다. MDA-MB-435S 인간 유방암 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC)로부터 얻어졌고, 10%의 소태아혈청이 함유된 DMEM 보충물 내에서 배양되었다. 96-웰 플레이트를 hOPN5-BSA(2㎍/㎖)로 37℃에서 1시간 동안 코팅하고, 이후 실온에서 1시간 동안 0.5%BSA로 처리하였다. 인간 면역글로블린 G1 카파, Ch33E10, Hu33E10-VH7.8/VL6(EJ3-1-1), Hu33E10-VH7/VL6(E3-1), Hu33E10-VH7/VLv2(SP-2), 및 마우스 33E10 항체들을 0.25%BSA, DMEN에 용해시키고, 100㎍/㎖에서 시작하여 계열 2-배 희석(serial 2-fold dilution)된 다양한 농도에서 20분 동안 37℃로 처리되었다. 2×104 MDA-MB-435S 세포들이 각 웰에 첨가되었다. 37℃에서의 1시간 동안의 배양 후에, 배지를 제거하고 따뜻한(37℃까지 가온) PBS로 부드럽게 두번 세척하였다. 유착세포들은 고정되었고, 20% 메탄올에 용해시킨 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색되었으며, 20% 아세트산으로 분해되었다. 흡광도는 590nm에서 측정되었다. 억제율은 항체를 가하지 않은 흡광도로써 표준화되었다.
7. 기탁
마우스 항-RGD 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마들(본 발명에서 33E10 및 35B6으로서 표시함)은 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약에 따라 일본 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1 초메 1-1 츄오 제6 (우편 번호: 305-8566)에 위치한 산업기술종합연구소(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), 특허생물기탁센터에, 각각 부여받은 수탁 번호 FERM BP-10440 및 FERM BP-10441로 2005년 10월 27일자로 기탁되었으며, 이들은 모두 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
8. 산업상 이용가능성
본 발명의 인간화된 단클론 항체는 RGD 단백질의 작용을 억제하여 암, 예를 들어 암세포의 성장 또는 전이, 및 염증성 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염, 골 관절염, 간염, 기관지 천식, 섬유증, 당뇨병, 암전이, 동맥경화증, 다발성 경화증, 육아종, 염증성 장 질병(궤양성 대장염 및 크론병), 자가면역 질병 등에 대해 치료 효과를 나타낸다. 본 발명의 항-RGD 항체 및 항-인테그린 항체를 모두 포함하는 약학 조성물은 암 및 염증성 질병에 대해 보다 개선된 치료 효과를 발휘한다.
비록 본 명세서에 일부 특정 실시예들이 묘사 및 설명되었으나, 도시하거나 설명한 특정 실시예들에 대한 다양한 변형 및/또는 동등한 실행이 본 발명의 범위로부터 벗어남 없이 대체될 수 있는 것으로 당업자에게 인지될 것이다. 본 명세서는, 본 명세서 내에서 논의된 특정 실시예들의 어떠한 적용 또는 변형도 모두 포괄하고자 한다. 따라서, 본 발명은 특허청구범위 및 이와 동등한 것으로만 한정되는 것은 아니다.
독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-10440 20051027 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-10441 20051027
SEQUENCE LISTING <110> Gene Techno Science Co., Ltd. <120> HUMANIZED ANTIBODIES SPECIFIC FOR AMINO ACID SEQUENCE RGD OF AN EXTRACELLULAR MATRIX PROTEIN AND THE USES THEREOF <130> PCT10-0044 <150> US 61/272,438 <151> 2009-09-24 <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Ile 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ala Tyr 1 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Gln Gly Ser Phe Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 434 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 actagtacca ccatgaagtt gtggctgaac tggattttcc ttgtaacact tttaaatggt 60 ttccagtgtg aagtgcagct 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gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 ccgggtaaat ga 1392 <210> 25 <211> 463 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Phe Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Ser 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musculus <400> 32 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 33 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala 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gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggtgagtcc 420 taacttcaag ctt 433 <210> 39 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Phe Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 115 120 125 Val Thr Val Ser Ala 130 <210> 40 <211> 428 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 40 gctagcacca ccatgaagtt gcctgttagg ctgttggtgc tgatgttctg gattcctgct 60 tccagcagtg atgttttgat gacccaaact ccactctccc tgcctgtcag tcttggagat 120 caagcctcca tctcttgcag atctagtcag agcattgtac atagtaatgg aaacacctat 180 ttagaatggt acctgcagaa accaggccag tctccaaagc tcctgatcta cagagtttcc 240 aaccgatttt ctggggtccc agacaggttc agtggcagtg gatcagggac agatttcaca 300 ctcaagatca gcagagtgga ggctgaggat ctgggagttt attactgctt tcaaggttca 360 tttgttccgt ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa tcaaacgtaa gtagaatcca 420 aagaattc 428 <210> 41 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 42 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ala <210> 43 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 45 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gggactagta ccaccatgaa g 21 <210> 47 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gggactagta ccaccatgaa gttgtggctg aactggattt tccttgtaac actt 54 <210> 48 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 cagctgcact tcacactgga aaccatttaa aagtgttaca aggaaaatcc a 51 <210> 49 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 ttccagtgtg aagtgcagct ggtggagtct ggaggaggct tggtacagcc t 51 <210> 50 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 agctgcacag gagagtctca gagaaccccc aggctgtacc aagcctcctc c 51 <210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ctgagactct cctgtgcagc ttctggattc accttcactg attactacat g 51 <210> 52 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 tcccttccct ggagcctggc ggacccagat catgtagtaa tcagtgaagg t 51 <210> 53 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 cgccaggctc cagggaaggg acttgagtgg ttgggtttta ttagaaacaa a 51 <210> 54 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 tgcactgtac tctgttgtgt aaccattagc tttgtttcta ataaaaccca a 51 <210> 55 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 tacacaacag agtacagtgc atctgtgaag ggtcggttca ccatctccag a 51 <210> 56 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ttgaagatag agtgagttct tggcattatc tctggagatg gtgaaccgac c 51 <210> 57 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 aagaactcac tctatcttca aatgaactcc ctgagagctg aggacacggc c 51 <210> 58 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 ccagtaagcg ccccttgcac agtaatacac ggccgtgtcc tcagctctca g 51 <210> 59 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 tgtgcaaggg gcgcttactg gggccaaggg actatggtca ctgtctcttc a 51 <210> 60 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 gggaagcttg gaaagcccat cttacctgaa gagacagtga ccatagt 47 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 gggaagcttg gaaagcccat c 21 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gggctagcac caccatgagg 20 <210> 63 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 gggctagcac caccatgagg acccctgctc agtttcttgg aatcttgttg ctc 53 <210> 64 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 cacaatatca catttgatac ctggaaacca gagcaacaag attccaagaa a 51 <210> 65 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 ggtatcaaat gtgatattgt gatgacccaa tctccactct ccctgcctgt c 51 <210> 66 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 gcaagagatg gaggctggct ctccaggagt gacaggcagg gagagtggag a 51 <210> 67 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 gagccagcct ccatctcttg cagatctagt cagagcattg tacatagtaa t 51 <210> 68 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 ctgcaggtac cattctaaat aggtgtttcc attactatgt acaatgctct g 51 <210> 69 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 tatttagaat ggtacctgca gaaaccaggc cagtctccac agctcctgat c 51 <210> 70 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 gaccccagaa aatcggttgg aaactctgta gatcaggagc tgtggagact g 51 <210> 71 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 tccaaccgat tttctggggt cccagacagg ttcagtggca gtggatcagg g 51 <210> 72 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 cactctgctg atcttgagtg tgaaatctgt ccctgatcca ctgccactga a 51 <210> 73 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 acactcaaga tcagcagagt ggaggctgag gatgtcggag tttattactg c 51 <210> 74 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 gaacgtccac ggaacaaatg aaccttgaaa gcagtaataa actccgacat c 51 <210> 75 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 tcatttgttc cgtggacgtt cggtcaaggc accaaagtgg aaatcaaacg tgagtag 57 <210> 76 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ggggaattct ttaaattcta ctcacgtttg atttcca 37 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 ggggaattct ttaaattcta 20 <210> 78 <211> 434 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 actagtacca ccatgaagtt gtggctgaac tggattttcc ttgtaacact tttaaatggt 60 ttccagtgtg aagtgcagct ggtggagtct ggaggaggct tggtacagcc tgggggttct 120 ctgagactct cctgtgcagc ttctggattc accttcactg attactacat gatctgggtc 180 cgccaggctc cagggaaggg acttgagtgg ttgggtttta ttagaaacaa agctaatggt 240 tacacaacag agtacagtgc atctgtgaag ggtcggttca ccatctccag agataatgcc 300 aagaactcac tctatcttca aatgaattcc ctgagagctg aggacacggc cgtgtattac 360 tgtgcaaggg gcgcttactg gggccaaggg actatggtca ctgtctcttc aggtaagatg 420 ggctttccaa gctt 434 <210> 79 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp Ile Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 1 5 10 15 Phe Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu 65 70 75 80 Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 80 <211> 431 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 gctagcacca ccatgaggac ccctgctcag tttcttggaa tcttgttgct ctggtttcca 60 ggtatcaaat gtgatattgt gatgacccaa tctccactct ccctgcctgt cactcctgga 120 gagccagcct ccatctcttg cagatctagt cagagcattg tacatagtaa tggaaacacc 180 tatttagaat ggtacctgca gaaaccaggc cagtctccac agctcctgat ctacagagtt 240 tccaaccgat tttctggggt cccagacagg ttcagtggca gtggatcagg gacagatttc 300 acactcaaga tcagcagagt ggaggctgag gatgtcggag tttattactg ctttcaaggt 360 tcatttgttc cgtggacgtt cggtcaaggc accaaagtgg aaatcaaacg tgagtagaat 420 ttaaagaatt c 431 <210> 81 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Met Arg Thr Pro Ala Gln Phe Leu Gly Ile Leu Leu Leu Trp Phe Pro 1 5 10 15 Gly Ile Lys Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Phe Gln Gly Ser Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu Ile Lys 130 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' RACE primer <400> 82 gccagtggat agactgatgg 20 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' RACE primer <400> 83 gatggataca gttggtgcag c 21 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GeneRacer 5' primer <400> 84 cgactggagc acgaggacac tga 23 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33E10 VH3' primer <400> 85 gccagtggat agacagatgg 20 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33E10 VL 3' primer <400> 86 gatggataca gttggtgcag c 21 <210> 87 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33E10 VH 5' primer <400> 87 gggactagta ccaccatgaa gttgtggctg aactggatt 39 <210> 88 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33E10 VH 3' primer <400> 88 gggaagcttg aagttaggac tcacctgcag agacagtgac cagagtccc 49 <210> 89 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33E10 VL 5' primer <400> 89 ggggctagca ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttg 39 <210> 90 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33E10 VL 3' primer <400> 90 ggggaattct ttggattcta cttacgtttg atttccagct tggtgcctcc 50 <210> 91 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcag cttctggatt caccttcact gattactaca tgatctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gacttgagtg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataatgc caagaacatc 240 ctctatcttc aaatgaattc cctgagagct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaagg 300 ggcgcttact ggggccaagg gactatggtc actgtctctt ca 342 <210> 92 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 93 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcag cttctggatt caccttcact gattactaca tgatctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gacttgagtg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataatgc caagagcatc 240 ctctatcttc aaatgaattc cctgagagct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaagg 300 ggcgcttact ggggccaagg gactatggtc actgtctctt ca 342 <210> 94 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 95 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 gaagtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60 tcctgtgcag cttctggatt caccttcact gattactaca tgatctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gacttgagtg gttgggtttt attagaaaca aagctaatgg ttacacaaca 180 gagtacagtg catctgtgaa gggtcggttc accatctcca gagataattc caagagcatc 240 ctctatcttc aaatgaattc cctgagagct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcaagg 300 ggcgcttact ggggccaagg gactatggtc actgtctctt ca 342 <210> 96 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 97 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 gatattgtga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca ctcctggaga gccagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccacag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgtcggagtt tattactgct ttcaaggttc atttgttccg 300 tggacgttcg gtcaaggcac caaagtggaa atcaaa 336 <210> 98 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 99 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 gatatcgtga tgacccaatc tccagactcc ctggctgtca gtcttggaga gagggccacc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gcctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaccatc 240 agcagcctgc aggctgagga tgtggcagtt tattactgct ttcaaggttc atttgttccg 300 tggacgttcg gtcaaggcac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 100 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Phe Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (23)

  1. (i) 서열식별번호:92, 94 또는 96의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는 H-쇄; 또는
    (ii) 서열식별번호:98 또는 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 L-쇄; 또는
    (iii) 상기 (i) 및 (ii) 모두
    를 포함하는, RGD 서열을 면역특이적으로 인식하는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 VH가 서열식별번호:91, 93 또는 95의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL이 서열식별번호:97 또는 99의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 VH가 서열식별번호:94의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL이 서열식별번호:100의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 H-쇄가 서열식별번호:25 또는 27의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 L-쇄가 서열식별번호:29 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 H-쇄가 서열식별번호:25의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 L-쇄가 서열식별번호:31의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 서열식별번호: 92, 94 또는 96의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 91, 93 또는 95의 뉴클레오티드 서열을 가지는 단리된 핵산 분자.
  8. 서열식별번호: 98 또는 100의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 97 또는 99의 뉴클레오티드 서열을 가지는 단리된 핵산 분자.
  10. 서열식별번호: 25 또는 27의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 24 또는 26의 뉴클레오티드 서열을 가지는 단리된 핵산 분자.
  12. 서열식별번호: 29 또는 31의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 28 또는 30의 뉴클레오티드 서열을 가지는 단리된 핵산 분자.
  14. 제 6 항 또는 제 8 항의 핵산 분자, 또는 이들 모두를 포함하는 벡터로서, 상기 핵산 분자가 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게(operably) 결합된 벡터.
  15. 제 10 항 또는 제 12 항의 핵산 분자, 또는 이들 모두를 포함하는 벡터로서, 상기 핵산 분자가 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게(operably) 결합된 벡터.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  17. 제 16 항의 숙주 세포를 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 발현되도록 하는 조건 하에서 배양하고 상기 발현된 인간화된 항체를 수거함을 포함하는, 상기 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 세포 유착 억제를 위한 조성물.
  19. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 세포 외 기질 단백질의 세포에 대한 결합 방지를 위한 조성물.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    RGD 단백질과 관련된 질환 또는 질병의 치료 또는 진단에 사용되는 조성물.
  21. 필요로 하는 대상에게 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, RGD 단백질 관련된 질환 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법.
  22. 시험 샘플 내의 RGD 단백질에 대한 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 분석하는 것을 포함하는, 시험 샘플 내의 RGD 단백질을 검출하는 방법.
  23. 진찰 대상에게 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 생체 내에서 RGD 단백질 관련된 질환 또는 질병을 진단하는 방법.
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