KR102129562B1 - 결장절제없이 염증성 장 질환을 치료하는 방법 및 조성물 - Google Patents

결장절제없이 염증성 장 질환을 치료하는 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

병이든 또는 손상된 조직, 이를 테면 염증성 장 질환, 가령, 궤양성 대장염을 치료하기 위한 방법 및 조성물은 손상된 조직으로 줄기 세포 이동을 촉진시키는 줄기 세포 또는 조직 이식편을 이용한 조직 재생을 포함한다. 상기 조직 이식편은 세포외 매트릭스 (ECM) 재료, 이를 테면 조직-특이적 세포외 매트릭스 (TS-ECM)일 수 있다. 상기 방법은 상기 이식편의 배치에 앞서, 손상된 또는 병이든 조직의 점막 절제를 또한 포함할 수 있다.

Description

결장절제없이 염증성 장 질환을 치료하는 방법 및 조성물{METHOD AND COMPOSITION FOR TREATING INFLAMMATORY BOWEL DISEASE WITHOUT COLECTOMY}
배경
염증성 장 질환 (IBD)은 2개의 별개 질환: 크론병 (CD)과 궤양성 대장염 (UC)으로 구성되는데, 833,000명의 미국인에게 발생된다.
CD는 소화관 (입에서 항문까지)을 따라 임의의 곳에서 나타나며, 소화관 벽의 전체 두께에 대개 영향을 주지만, UC는 결장과 직장에 국한되고, 이들 벽의 점막 (이너 라이닝)에만 영향을 준다
소염제의 사용을 포함한 약물 치료는 심각한 부작용을 가질 수 있고, UC의 증상 치료를 하지 못할 수 있으며, 모든 다른 약물 치료에 환자가 불응할 경우에 UC 치료를 위한 유일한 공지의 "치유" 방법은 결장의 완전한 제거 (결장절제술)는 이다. 결장절제술은 잘 확립된 수술이지만, 그러나, 배설물 제거를 용이하게 하기 위하여 회장루성형술이 대개 요구되는 큰 외과수술이다.
UC를 포함하는 IBD의 치료 및 치유를 위하여 제1선 치료(잠재적 유해한 부작용을 가진 약물치료)와 제2선 치료(결장절제술)의 대안이 필요하다.
침습성을 최소화시키는 외과적 절차를 지향하는 경향은 조직 재생에 유용한 인공 스캐폴드(scaffolds) 개발을 촉발시켰다. 정제된 콜라겐, 젤라틴, 자가(autologous) 지방, 히알루론산, 및 합성 재료들은 요실금, 역류성 질환, 후두 병리, 및 신생 심장근육세포의 치료를 위한 재생 의학에서 임상적으로 주사가능한 스캐폴드로 이용되어 왔었다. 그러나, 과도하게-정제된, 화학적으로 변형된 또는 합성 재료들은 숙주에 의해 부정적인 면역 반응이 유도될 수 있고, 매트릭스로 세포 이동이 제한될 수 있다.
자연 발생적 세포외 매트릭스 (ECM)-유도된 스캐폴드는 많은 생물활성 성질을 보유하며, 하부 요로 구조, 식도, 심장 조직, 및 근건(musculotendonous) 구조가 포함된 다양한 조직의 복구에 이용되어 왔었다. 그러나, 이들 스캐폴드중 많은 것들은 비-인간 조직으로부터 유도되었으며, 하부 내장 조직, 이를 테면 결장 조직의 치료 또는 재생에 이용될 수 있다고 설명된 것은 하나도 없으며, UC의 치료에 특이적인 것도 없다.
Figure 112019100345759-pct00002
발명의 요약
대상 발명은 결장절제술을 하지 않고 병이든 또는 손상된 점막 조직을 신규한 조직 이식편으로 대체시킴으로써 UC를 치료하는 신규한 조직 이식편과 방법에 관계한다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 (1) 결장의 병이든 또는 손상된 점막 라이닝에 임의선택적으로 점막절제술을 실행하고, 그리고 (2) 상기 결장의 점막 라이닝에 줄기 세포 또는 전구 세포를 씨딩하고(seeding), 또는 결장의 점막 라이닝의 질환 또는 손상 증후군 또는 이로 인한 고통을 받은 환자에서 병이든 또는 손상된 결장 조직으로 줄기 세포와 전구 세포가 이동되도록 자극하는 단계에 의해 손상된 또는 병이든 하부 내장 조직을 치료하는 것을 포함한다. 상기 결장의 점막 라이닝의 질환은 염증성 장 질환 (IBD)일 수 있고, 상기 방법을 이용하여 IBD를 치료, 개선 또는 치유할 수 있다.
따라서, 대상 발명은 예를 들면, 줄기 세포 또는 전구 세포(progenitor cells)를 직접적으로 손상된 또는 병이든 결장 조직으로 운반하여 줄기 세포 또는 전구 세포를 씨딩하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 상기 줄기 세포 또는 전구 세포는 결장의 내강(lumen)으로 주사 또는 주입에 의해 결장 조직으로 운반하기 위하여 유체 조성물, 이를 테면 용액, 현탁액, 또는 겔 안에 준비되며, 상기 줄기 세포 또는 전구 세포는 결장의 내강 벽에 접촉하고, 그리고 최소한 임시로 머무르게되어, 상기 장의 점막 라이닝의 재구성 조직 재건을 개시 또는 촉진시킨다. 따라서 본 발명의 방법은 손상된 또는 병이든 결장 조직을 새로운 건강한 결장 조직으로 대체시킬 수 있다.
대안으로, 줄기 세포 또는 전구 세포는 결장 내강 벽에 또는 내벽과 접촉되도록 세포외 매트릭스 (ECM) 조성물, 가령, 고형 (쉬트 또는 튜브) 또는 유체 (용액, 현탁액, 또는 겔) 형태의 ECM 이식편 또는 스캐폴드가 도입됨으로써, 손상된 또는 병이든 결장 조직 부위로 자극될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에 있어서, 줄기 세포 또는 전구 세포는 고형 또는 유체 ECM 조성물에 통합될 수 있고, 줄기 세포 또는 전구 세포가 포함된 ECM 조성물은 본 명세서에서 설명된 조성물에 적합한 운반 수단에 의해 결장의 점막 라이닝으로 운반될 수 있다. 예를 들면, 고형 ECM은 내시경을 통하여 결장 라이닝 상에 피하주입될 수 있거나, 또는 유체 ECM은 결장으로 주입, 주사, 또는 분무될 수 있다.
일단 손상된 결장 조직 부위로 씨딩되거나 또는 이동되면, 상기 줄기 세포 또는 전구 세포는 제자리에서 특화되고, 발달되어, 상기 결장의 점막 라이닝을 대체한다. 상기 방법은 다음의 하나 또는 그 이상의 추가 단계를 더 포함할 수 있다: (3) 회장루를 성형하고, 그리고 (4), 새로운 점막이 형성되고, 병이든 점막 라이닝을 대체하는 동안, 환자 정맥으로 공급하거나, 소화관을 우회함으로써 환자에게 종합 비경구 영양수액 (TPN)이 제공된다.
본 발명의 방법의 일부분으로 이용될 경우, 이식편의 피하주입(implantation), 이식(transplantation), 또는 투여에 앞서, 병이든 또는 손상된 조직을 제거하는 점막절제술 단계가 조직 절제(resection) 또는 제거(ablation)에 의해 실행될 수 있다.
절제 또는 제거 방법으로는 내시경 또는 외과적 점막 잘라냄 (excision), 내시경 레이져 요법, 광역학 요법, 아르곤 플라즈마 응고를 이용한 내시경 열응고, 고주파 제거, 동결절제, 또는 EDTA 또는 기타 제거 물질, 이를 테면 바람직하게는 가열된 염수의 이용이 포함된다. 이들 점막절제술 절차는 당업계에서 잘 정리되어 있다. 상기 언급된 기술 또는 절차중 하나 또는 그 이상을 절제 또는 제거 단계가 이용되는 대상 발명에서 이용할 수 있다.
대상 발명은 이를 테면 치료되는 조직과 동일한 조직으로부터 유도된 세포외 매트릭스 (ECM) 스캐폴드를 이용하여, 질환- 또는 외상-손상된 조직의 치료를 위한 방법 및 조성물을 더 포함한다. 치료되는 조직과 동일한 조직으로부터 유도된 ECM이 포함된 조직 이식편은 본 명세서에서 “조직-특이적 세포외 매트릭스” (TS-ECM)로 지칭된다.
바람직한 TS-ECM은 동일한 유형의 조직 (가령, 결장 조직 치료를 위하여 결장으로부터 유도된 ECM) 뿐만 아니라, 치료될 종과 동일한 종으로부터 유도된다. 예를 들면, 인간의 UC 치료는 TS-ECM 스캐폴드 조성물로써 인간 결장 점막 조직을 이용할 것이다. 상기 조직 이식편은 동종이식편 또는 이종이식편일 수 있다. EMC과 세포 간에 자극 및 정보의 상호 교환 (“동적 상호관계(dynamic reciprocity)”로 당업계에서 공지되며 지칭됨)이 존재할 수 있어, ECM 이식편의 이용에 유익할 수 있다. TS-ECM 이식편을 이용함으로써 이러한 동적 상호관계가 용이하게 되거나 또는 개선될 수 있다.
따라서 대상 발명은 병이든 또는 손상된 대장 조직을 대체하기 위하여 대장 조직으로부터 유도된 조직 이식편 조성물을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 대장 조직으로부터 유도된 ECM은 결장 조직일 수 있으며, 바람직하게는 결장 점막을 포함하고, 그리고 치료될 대장 조직은 결장 조직일 수 있고, 또한 바람직하게는 결장 점막일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 조직 이식편 조성물은 상기 결장 점막 상에 위치되거나 또는 확보될 수 있는 고형 쉬트 또는 튜브로 형성된 ECM 스캐폴드일 수 있다. 고형 쉬트 또는 튜브 스캐폴드는 피하주입되거나 또는 이식될 수 있거나, 또는 당업계에서 인지하는 바와 같이, 봉합, 스페이플스, 스텐츠, 또는 클립이 포함되나 이에 국한되지 않는 기계적 또는 외과적 수단에 의해 환자의 원하는 위치에 고정, 지원 또는 부착될 수 있고, 또는 수용가능한 접착제, 이를 테면 생물접착제가 포함된 약제학적으로 수용가능한 또는 치료요법적으로 수용가능한 접착제에 의해 점막에 부착될 수 있다. ECM 조성물을 결장으로 운반하기 위한 한 가지 바람직한 과정은 내시경을 이용할 수 있는데, 이로써 침습성 외과적 절차를 유익하게 최소화시킬 수 있다.
대안으로, ECM은 유체, 이를 테면 겔, 용액, 또는 현탁액의 형태로 제공되도록 분말화되거나 또는 절단되거나(digested), 그리고 가용화되거나 또는 현탁될 수 있다. 유체 조성물은 겔, 용액 또는 현탁액을 주사, 주입, 분무 또는 이와 유사한 형태에 의해 치료 부위로 유익하게 투여될 수 있다. 예를 들면, 유체화된 ECM은 결장의 내강으로 주사, 주입 또는 분무에 의해 투여 또는 제공될 수 있는데, 가령, 관장 요법에 의해 유체 ECM는 결장의 점막 라이닝을 피복하거나 또는, 점막절제된(mucosectomized) 결장의 경우, 결장의 노출된 내강 벽을 피복한다. 이러한 투여는 원하는 데로 수용가능한 재성장 또는 생존가능한 또는 건강한 조직의 대체를 주시하는 치료의사에 의해 결정된 몇 일, 몇 주 또는 몇 달, 최대 1년 기간 동안 하루에 1회 또는 그 이상이 포함된 수차례 반복될 수 있다.
유체화된 ECM의 분무가능한 겔, 용액 또는 현탁액의 한 가지 바람직한 구체예는 분무에 의한 투여를 위하여 조성물을 연무질화시키는 것이다. 상기 연무화된 스프레이는 내시경 안에 또는 함께 제공되는 원하는 부위 또는 위치로 이렇게 유체화된 ECM을 운반하기 위하여 제작된 또는 변형된 캐뉼라 또는 다른 도관을 통하여 원료 저장기로부터 펌프될 수 있다.
유익하게는, 줄기 세포 또는 전구 세포는 ECM 배치 또는 투여 부위로 이동하는 것으로 알려져 있으며, 시간이 경과함에 따라 상기 조직은 이들 세포 또는 조직의 정상적인 성질 및 기능을 보유한 건강한 또는 비-증상 세포 및 조직으로 대체될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물의 대체 구체예에는 고형 ECM 튜브 또는 쉬트 스캐폴드 만을 포함하거나; 줄기 세포 또는 전구 세포가 피복된 또는 매립된 고형 ECM 스캐폴드를 포함하거나; 유체화된 ECM (가령, 겔) 만을 포함하거나; 또는 피복된, 매립된 줄기 세포 또는 전구 세포와 함께, 또는 피복된 매립된 줄기 세포 또는 전구 세포 없이 유체화된 ECM이 추가로 포함된 고형 ECM 스캐폴드를 포함하거나, 또는 고형 또는 유체 ECM과 혼합된 유체화된 ECM이 포함된 고형 ECM 스캐폴드를 포함한다.
ECM 조성물은 일부가 천연 조직으로부터 유도되고, 그리고 합성 또는 천연 폴리머와 혼합 또는 복합된 하이브리드일 수 있다는 것 또한 인지할 것이다. 합성 또는 천연 폴리머가 포함된 본 발명의 ECM 조성물에 생물분해가능한 폴리머가 이용되는 것이 바람직할 수 있지만, 반드시 요구되는 사항은 아니다.
본 발명의 또다른 구체예에 있어서, 가령, 고형 쉬트 또는 튜브 ECM 조성물은 3D 프린터 기술을 이용하여 형성될 수 있거나 또는 생산될 수 있다.
상기 조성물은 ECM에 특별히 바람직한 성질을 제공하는 첨가제를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 ECM 조성물은 하나 또는 그 이상의 약물 또는 생물제제(biologics), 이를 테면 항생제, 소염제, 면역억제제, 단클론 항체, 성장 인자, 또는 추가된 약물 또는 생물제제의 바람직한 활성을 제공하는 이와 유사한 것들을 포함할 수 있다. 이들 첨가제는 선호적인 조직 재건에 도움이 되는 국소 환경을 만들 수 있다. 조성물에 다른 첨가제로는 예를 들면 점성 강화 물질, 또는 겔 형성을 개시시킬 수 있는 물질이 포함될 수 있다. 더 높은 점성의 겔이 겔의 접착 성질을 개선시킬 수 있다는 것은 당업계에서 일반적으로 수용되는 사실이다. 따라서, 점성 강화 물질은 접착을 용이하게 하는 작용을 또한 할 수 있다. 접착 촉진제는 당업계에 잘 공지되어 있지만, 점성 강화 물질 또는 접착 강화 물질로써 혈액 성분들, 이를 테면 혈액 응고제 또는 혈액 응고 인자가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 일부로 기존의 절제 또는 제거 없이, 본 명세서에서 설명된 바와 같이, ECM 이식편 또는 스캐폴드를 이용하여 병이든 또는 손상된 결장 조직을 치료하는 방법이 또한 포함된다. 예를 들면, 상기 조직에 질환 또는 손상이 병소, 이를 테면 상기 조직의 노출된 또는 출혈 표면을 만드는 경우, 상기 ECM 스캐폴드 또는 이식편 조성물의 피하주입, 이식, 적용, 또는 투여에 앞서 조직의 절제가 생략될 수 있다. 따라서, 대상 방법의 한 구체예는 다음의 단계들을 포함한다:
a) 내장, 생식, 외피, 췌장, 신장, 순환, 및 호흡 조직에서 선택된 조직을 이용하여 ECM 스캐폴드, 이식편, 또는 조성물을 준비하는 단계, 그리고
b) 내장 조직에 영향을 주는 질환, 손상, 또는 상태로 고통을 받는 환자에서 하부 내장관 조직에 영향을 주는 질환 또는 상태로 고통을 받는 환자의 조직 상에 상기 ECM 이식편 또는 스캐폴드 조성물을 피하주입, 이식, 바르거나(applying) 또는 투여하는 단계, 이때 상기 내장 조직은 상기 ECM 조성물의 피하주입, 이식, 바름 또는 투여에 앞서 절제 또는 제거되지 않는다.
바람직한 구체예에서, 이 방법은 IBD를 나타내는 손상된 또는 병이든 결장 조직 , 이를 테면 궤양성 대장염 또는 크론병; 가족성 대장폴립증; 히르슈스프룽(Hirschsprungs); 협착; 직장염; 결장 암; 또는 누공(fistula)의 치료, 더욱 바람직하게는, 결장 점막 조직에 질환 또는 손상의 치료를 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예는 기존의 절제 또는 제거 없이 본 명세서에서 설명된 바와 같이 조직-특이적 ECM (TS-ECM) 스캐폴드를 이용하여 병이든 또는 손상된 조직을 치료하는 방법이다. 따라서, 대상 방법의 한 구체예는 다음의 단계들을 포함한다:
a. 손상된 또는 병이든 조직 상에서 임의선택적으로 점막절제술을 실행하는 단계;
b. 내장, 생식(질을 제외한), 외피, 췌장, 신장, 순환, 및 호흡 조직에서 선택된 조직을 이용하여 TS-ECM 이식편 또는 스캐폴드 조성물을 준비하는 단계, 그리고
c. 동일한 내장, 생식 (질을 제외한), 외피, 췌장, 신장, 순환, 및 호흡 조직에 영향을 주는 질환 또는 상태로 고통을 받는 환자의 조직에 상기 TS-ECM 스캐폴드 또는 조성물을 피하주입, 이식, 또는 투여하는 단계.
본 발명의 ECM 또는 TS-ECM 이식편, 스캐폴드 또는 조성물은 생물접합성 다공성, 거대다공성, 또는 미세다공성 매트릭스일 수 있으며, 이때 줄기 세포 또는 ECM 겔, 용액 또는 현탁액은 분산될 수 있음을 인지할 것이다. 추가적으로, 본 발명의 ECM 또는 TS-ECM은 겔화될 수 있다.
이식편으로 이용되는 세포 성장 매트릭스 또는 스캐폴드에 유용한 튜브, 쉬트, 그리고 겔화된, 가용화된 ECM 조성물을 만드는 방법은 당업계에 설명되어 있다. ECM 겔 조성물은 환자에게 피하주입 또는 투여되기 앞서, 상기 조성물이 제자리에서 겔이 되는 겔화 전에 겔화 안된 형태로 몰딩될 수 있다. ECM 이식편을 만드는 이러한 방법들과 다른 방법들은 예를 들면, US 특허 8,361,503에서 기술되며, 이의 전문은 참고자료에 편입된다.
바람직한 구체예에서, 설명된 하나 또는 그 이상의 과정에 따라 ECM 겔 조성물이 준비된다. 예를 들면, 다음을 포함하는 방법에 의해 ECM 겔이 만들어질 수 있다:
i) ECM을 가루로 만들고(comminuting),
ii) 절단(digest) 용액을 만들기 위하여 산성 용액 안에서 산 프로테아제에 의한 절단에 의해 비-투석된 또는 비-가교-연계된 고유한 ECM을 가용화시키고;
iii) 상기 절단 용액의 pH를 7.2 내지 7.8로 조정함으로써 중화된 절단 용액을 만들고, 그리고
iv) 25 ℃ 이상의 온도에서 용액을 겔화시킨다.
또다른 구체예에서 ECM 이식편 또는 스캐폴드 조성물을 만드는 방법은 상기 스캐폴드를 초음파분쇄시키는 것을 더 포함한다. 추가 본 발명의 방법은 TS-ECM 스캐폴드를 환자의 조직에 부착시키는 것을 포함하며, 이때 상기 스캐폴드의 표면은 환자의 세포, 가령, 줄기 세포가 매립된 또는 피복된 겔화된 가용화된 ECM을 포함하며, 이때 상기 매립된 또는 피복된 세포는 상기 조직에 상기 스캐폴드를 피하주입, 이식, 또는 투여하기에 앞서, 환자의 세포가 상기 스캐폴드 안에서 성장하는데 충분한 시간이 허용된다.
본 발명의 방법을 실행함에 있어서, 스캐폴드 또는 이식편은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 준비되거나, 또는 ECM을 준비하는 다른 공지 방법에 의해 준비되며, 그 다음 병이든 또는 손상된 조직의 최소한 단편으로 피하주입되거나, 이식되거나, 또는 투여되고, 그리고 대체 세포들이 성장하고, 병이든 또는 손상된 세포를 대체하도록 충분한 시간 동안 병이든 또는 손상된 조직과 접촉이 유지되도록 한다. 충분한 기간은 하루에서 약 6개월이 될 수 있다.
유익하게는, ECM 이식편의 피하주입, 이식, 또는 투여는 상기 ECM 이식편의 피하주입, 이식 또는 투여 부위로 줄기 세포가 이동되도록 자극을 제공한다. 예를 들면, UC를 치료할 때, ECM 이식편은 결장의 최소한 단편-병이든 또는 손상된 결장 점막이 있었던(점막절제술을 받은 이후의 경우) 또는 병이든 또는 손상된 결장 점막이 있는(점막절제술이 실행되지 않는 경우)-과 접촉되도록 피하주입되거나, 이식되거나 또는 투여되고, 결장 점막 세포의 성장 및 대체가 허용되어, 병이든 또는 손상된 세포들이 건강한 세포들로 대체되는 기간 동안 점막과 접촉이 유지된다. 상기 ECM 이식편은 1-10 센티미터와 유사한 상대적으로 짧은 고형 세그먼트로 제공되며, 결장의 내벽에 동시에 또는 순차적으로 피하주입되거나, 이식되거나 또는 투여된다. 대안으로, 상기 ECM 이식편은 다수의 단면을 가진 또는 전체 결장에 대응하는 길이를 가지도록 준비될 수 있다.
도 1은 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 소장 점막하층 세포외 매트릭스 (SIS-ECM)로 처리된 개에서 떼낸 결장 절단면(아래 사진)의 결과를 보여준다; 현미경사진 (위쪽 사진 A-D)은 결장 단면의 말단 → 전단 경사를 따라 현미경 세포 검사를 나타내는데, 경사를 따라 점막 범위가 증가됨이 설명되며, 즉, 불완전한 점막 범위를 말단 문합 (A)에서 볼 수 있고, 전단 (B), (C), 및 (D) 쪽으로 갈 수록 점막 범위가 증가되는 것을 나타낸다.
대상 발명은 병이든 또는 손상된 점막 세포들과 조직을 결장절제술 없이 대체 또는 대체를 자극시킴으로써, 염증성 장 질환 (IBD), 예를 들면 궤양성 대장염 (UC) 또는 크론병 (CD), 또는 이와 유사한 것들의 치료에 관한 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 (1) 결장의 병이든 또는 손상된 점막 라이닝에 임의선택적으로 점막절제술을 실행하고, 그리고 (2) 상기 결장의 점막 라이닝에 줄기 세포 또는 전구 세포를 씨딩하고(seeding), 또는 결장의 점막 라이닝의 질환 또는 손상 증후군 또는 이로 인한 고통을 받은 환자에서 병이든 또는 손상된 결장 조직으로 줄기 세포와 전구 세포가 이동되도록 자극하는 단계에 의해 손상된 또는 병이든 하부 내장 조직을 치료하는 것을 포함한다. 상기 결장의 점막 라이닝의 질환은 염증성 장 질환 (IBD)일 수 있고, 상기 방법을 이용하여 IBD를 치료, 개선 또는 치유할 수 있다.
따라서, 대상 발명은 예를 들면, 줄기 세포 또는 전구 세포를 직접적으로 손상된 또는 병이든 결장 조직으로 운반하여 줄기 세포 또는 전구 세포를 씨딩하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 상기 줄기 세포 또는 전구 세포는 결장의 내강으로 주사 또는 주입에 의해 결장 조직으로 운반하기 위하여 유체 조성물, 이를 테면 용액, 현탁액, 또는 겔 안에 준비되며, 상기 줄기 세포 또는 전구 세포는 결장의 내강 멱에 접촉하고, 그리고 최소한 임시로 머무르게되어, 상기 장의 점막 라이닝의 재구성 조직 개건을 개시 또는 촉진시킨다. 따라서 본 발명의 방법은 손상된 또는 병이든 결장 조직을 새로운 건강한 결장 조직으로 대체시킬 수 있다.
대안으로, 줄기 세포 또는 전구 세포는 결장 내강 벽에 또는 내벽과 접촉되도록 세포외 매트릭스 (ECM) 조성물, 가령, 고형 (쉬트 또는 튜브) 또는 유체 (용액, 현탁액, 또는 겔) 형태의 ECM 이식편 또는 스캐폴드가 도입됨으로써, 손상된 또는 병이든 결장 조직 부위로 자극될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에 있어서, 줄기 세포 또는 전구 세포는 고형 또는 유체 ECM 조성물에 통합될 수 있고, 줄기 세포 또는 전구 세포가 포함된 ECM 조성물은 본 명세서에서 설명된 조성물에 적합한 운반 수단에 의해 결장의 점막 라이닝으로 운반될 수 있다. 예를 들면, 고형 ECM은 결장 라이닝 상에 내시경을 통하여 피하주입될 수 있거나, 또는 유체 ECM은 결장으로 주입, 주사, 또는 분무될 수 있다.
계획적으로, ECM은 그 자리에서 신속하게 분해되고, 상기 부위로 대식세포의 이동이 포함된 염증 반응을 부추긴다. ECM의 한 가지 독특한 특징은 이들 대식세포의 표현형 M1 유형 (전-염증, 이를 테면 UC를 앓고 있는 환자에서 볼 수 있는)으로부터 M2 유형(전-조직 재구성, 이를 테면 잠재된 전-염증 상태 없는 인간에서 볼 수 있는)으로 전환을 부추기는 것이다. M1에서 M2로의 이러한 표현형 전환의 중요한 영향은 그렇지 않는 경우 염증 성향이 되는 조직을 건강한 상태로 유지되도록 허용하는 것이다.
이식편의 피하주입, 이식, 또는 투여에 앞서, 병이든 또는 손상된 조직, 가령, 결장 점막 조직을 제거하기 위하여 실행되는 임의선택적인 점막절제술 단계는 임의의 통상적으로 수용되는 방법, 이를 테면 조직 절제 또는 제거를 이용하여 실행될 수 있다. 공지의 절제 또는 제거 방법에는 내시경 또는 외과적 점막 절제, 내시경 레이져 요법, 광역학 요법, 아르곤 플라즈마 응고를 이용한 내시경 열응고, 냉동요법, 고주파 제거 또는 EDTA 또는 다른 제거 물질, 이를 테면 가열된 또는 “뜨거운” 염수 또는 기타 수성 용액을 이용한 제거가 포함된다
줄기 세포 또는 전구 세포를 점막절제된 조직에 씨딩시키는 것은 공지된 방법, 이를 테면 의학 문헌에서 설명된 바와 같이, 해당 부위에 줄기 세포를 주사함으로써 실행될 수 있다. 예를 들면, Lanzoni, G., Inflammatory bowel disease: Moving toward a stem cell-based therapy, World J Gastroenterol. 14(29): 4616- 4626 (August 7, 2008)을 참고하는데, 여기에는 IBD 치료에 조혈 및 간엽 줄기 세포의 이용이 요약되어 있지만, 기존의 점막절제술은 교시하거나 암시하지 못한다.
바람직하게는, 줄기 세포는 투여 부위에 ECM 스캐폴드 또는 이식편으로써 세포외 매트릭스 (ECM) 재료 또는 조성물을 가령, 피하주입, 이식, 또는 투여하여 배치 및/또는 확보함으로써 점막절제된 조직으로 도입될 수 있다. 점막절제된 부위로 ECM 조성물은 고형 쉬트 또는 튜브의 형태로 도입될 수 있거나, 또는 유체, 이를 테면 용액, 현탁액 또는 겔의 형태로 도입될 수 있다. 상기 고형 ECM 재료의 배치 또는 확보는 봉합, 클립, 스페이플스, 글루, 또는 공지된 다른 확보 수단에 의해 이루어질 수 있다.
대안으로, 통상적으로 이용되는 유체 투여 또는 전달 과정 이를 테면 주사, 주입 또는 흠뻑적심 (부위에 “액체 뿜어나놈(squirting)”) 또는 해당 부위에 유체의 분무에 의해 유체화된 ECM은 투여될 수 있다. 바람직한 분무 기술은 예를 들면 내시경을 통하여 전달되는 연무화된 ECM 유체를 이용하여 실행된다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, ECM을 지칭하는 용어 “조성물", “재료", “스캐폴드", 및 “이식편"은 호환되며, 특정 형상, 이를 테면 고형, 액체, 유체 또는 다른 형태이어야 한다는 것을 내포하는 것은 아니다. 예를 들면, “ECM 스캐폴드”는 고형 또는 유체일 수 있다.
바람직하게는, 유체화된 ECM 조성물은 겔로 형성되고, 이 겔은 점착성 성질을 가지며, 신체내 원하는 위치에 상기 유체가 자가-흡착되는데 충분한 점성을 보유한다. 바람직한 구체예에서, 상기 유체화된 ECM은 바르거나 투여될 때 상대적으로 비-점착성 액체 성질을 가진 수화겔이며, 유익하게 농후해지거나 또는 더욱 점착성이 커지게되거나, 또는 투여 부위에서 신체와 접촉되거나 또는 바를 때 또는 바른 후 바로 접착제 겔이 형성된다. 겔화는 상승된 온도, 이를 테면 투여 후 체온에 의해 개시될 수 있다. 상기 유체 ECM은 또한 별도의 점착성 물질, 이를 테면 수화겔 또는 다른 통상적으로 알려진 겔화 물질과 혼합되어, 충분한 점성이 제공될 수 있다. 대안으로, 2가지 유체가 투여될 수 있고, 이때 유체중 최소한 하나는 ECM 재료를 포함하며, 이때 다른 유체와 접촉될 때 또는 혼합될 때 두 유체는 겔화된다.
ECM 조성물은 조직의 충분한 맥관화가 존재할 때 줄기 세포를 그 부위로 이동되도록 하고, 혈관은 이들 세포가 해당 부위로 이동하기 위한 적합한 통로를 제공한다는 것은 확인된 사실이다. 추가적으로, ECM은 화학적 신호생성을 통하여 인접 또는 하위 조직과 소통하고, 그리고 인접 또는 하위 조직은 상기 ECM과 소통하는데, 이는 ECM이 이용되는 세포 및 조직 대체 또는 재생을 최적화시키는 "동적 상호관계"로 명명된 현상이다. 따라서, 상기 ECM 조성물은 배치, 투여, 또는 적용 부위에서 새로운 세포 및 조직 성장을 위한 고형, 액체 또는 겔 스캐폴드로써 기능을 할 수 있다.
추가 구체예에서, ECM-유도된 조성물은 조직 이식편일 수 있으며, 이로 인하여 상기 ECM 조성물은 이식 부위에서 조직의 새로운 성장을 촉진시키는 스캐폴드 기능을 한다. 상기 스캐폴드는 원하는 부위에 배치된 ECM 튜브 또는 쉬트일 수 있다. 상기 스캐폴드는 생물접합성 다공성, 거대다공성, 또는 미세다공성 매트릭스일 수 있으며, 이때 줄기 세포 또는 ECM 겔, 용액 또는 현탁액은 분산될 수 있다. 상기 ECM은 또한 상기 줄기 세포 또는 ECM 용액 또는 현탁액의 분한 후 후속적으로 겔화될 수 있다.
한 구체예에서, ECM은 당분야에서 통상적으로 이용되는 조직으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, ECM은 소장 점막하층 (SIS) 또는 뇨 방광 매트릭스 (UBM) 조직으로부터 유도되었다. 더욱 바람직한 구체예에서, 치료되는 조직과 동일한 조직 유형으로부터 유도된 ECM- “조직-특이적 세포외 매트릭스” 또는 “TS-ECM"으로 지칭됨-은 유익한 결과, 이를 테면 동적 상호관계를 통하여 발생될 수 있는 좀더 효과적인 또는 더욱 반응적인 재구성 조직 재건을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다.
따라서, 대상 발명은 TS-ECM 이식편을 이용하여, 질환- 또는 외상-손상된 하부 내장 관, 생식 (질을 제외한), 외피, 췌장, 신장, 순환, 또는 호흡 조직의 치료를 위한 방법 및 조성물을 더 포함한다. 한 구체예에서, TS-ECM은 치료될 종과 동일한 종으로부터 유도된다. 예를 들면, 인간의 UC 치료는 TS-ECM 스캐폴드 조성물로써 인간 결장 점막 조직을 이용할 것이다. 상기 조직 이식편은 상기에서 설명된 바와 같이 동종이식편, 또는 이종이식편일 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에서, 대상 발명은 병이든 또는 손상된 대장 조직을 대체하기 위하여 대장 조직으로부터 유도된 조직 이식편 조성물이 포함된 조성물 및 이용 방법을 포함한다. 상기 유도된 대장 조직 또는 치료될 대장 조직은 결장 조직일 수 있고, 바람직하게는 결장 점막일 수 있다.
유익하게는, IBD, 이를 테면 CD 또는 UC를 앓고 있는 환자의 결장 조직에 의해 나타나는 개방 또는 출혈 병소를 야기하는 조직 질환, 손상 또는 상태에서, 사전의 점막 절제 또는 제거 없이 TS-ECM의 피하주입, 이식 또는 투여를 포함하는 방법에 의해 영향을 받을 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, 상기 조직에 질환 또는 손상이 병소, 이를 테면 상기 조직의 노출된 또는 출혈 표면을 만들게 되는 경우, 상기 조직의 사전 절제는 생략될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 피하주입하는 또는 피하주입, 이식하는 또는 이식, 바르거나 또는 바름, 투여하는 또는 투여, 주입하는 또는 주입, 주사하는 또는 주사, 전달하는 또는 전달은 모두 치료 부위로 ECM을 제공하는 과정을 지칭하며, 해당 부위로 ECM을 전달하는데 이용되는 절차와 조성물의 성질에 따라 동일한 의미를 가진 것으로 당업자는 이해할 수 있을 것이다. 이들 용어는 호환될 수 있으며, 어떤 방식으로던 본 발명의 방법을 한정시키지 않는다.
따라서, 대상 방법의 한 구체예는 다음의 단계들을 포함한다:
하부 내장 관, 생식 (질을 제외한), 외피, 췌장, 신장, 순환, 및 호흡 조직으로부터 선택된 조직을 이용하여 TS-ECM 스캐폴드를 준비하는 단계, 그리고
동일한 하부 내장 관, 생식 (질을 제외한), 외피, 췌장, 신장, 하부 내장 관, 순환, 및 호흡 조직에 영향을 주는 질환 또는 상태로 고통을 받는 환자의 조직에 TS-ECM 스캐폴드를 피하주입, 이식, 또는 투여하는 단계.
임의선택적으로, 결장을 치료할 때, 상상기 방법은 다음의 하나 또는 그 이상의 추가 단계를 더 포함할 수 있다: (3) 회장루를 성형하고, 그리고 (4) 환자 정맥으로 환자에게 종합 비경구 영양수액 (TPN)을 제공하는 한편, 새로운 점막은 형성된다.
바람직한 구체예에서, 이 방법은 손상된 또는 병이든 결장 조직의 치료를 포함한다. 상기 방법은 크론병, 궤양성 대장염, 가족성 대장폴립증, 히르슈스프룽(Hirschsprungs), 협착, 직장염, 또는 누공(fistula)으로 인한 결장 조직의 손상 또는 질환을 치료하는데 이용될 수 있으며, 그리고 더욱 바람직하게는, 결장 점막 조직에 질환 또는 손상을 치료하는데 이용될 수 있다.
세포 성장 스캐폴드로 유용한 튜브, 쉬트, 그리고 겔화된, 가용화된 ECM 조성물을 만드는 방법은 당업계에 설명되어 있다. ECM 겔 조성물은 환자에게 피하주입 또는 투여되기 앞서, 상기 조성물이 제자리에서 겔이 되는 겔화 전에 겔화 안된 형태로 몰딩될 수 있다.
ECM 이식편을 만드는 이러한 방법들과 다른 방법들은 예를 들면, US 특허 8,361,503에서 기술되며, 이의 전문은 참고자료에 편입된다. 바람직한 구체예에서, 설명된 하나 또는 그 이상의 과정에 따라 ECM 겔 조성물이 준비된다. 예를 들면, 다음을 포함하는 방법에 의해 ECM 겔이 만들어질 수 있다:
i. ECM을 가루로 만들고,
ii. 절단 용액을 만들기 위하여 산성 용액 안에서 산 프로테아제에 의한 절단에 의해 비-투석된 또는 비-가교-연계된 고유한 ECM을 가용화시키고;
iii. 상기 절단 용액의 pH를 7.2 내지 7.8로 조정함으로써 중화된 절단 용액을 만들고, 그리고
iv. 25℃ 이상의 온도에서 용액을 겔화시킨다.
또다른 구체예에서 ECM 스캐폴드를 준비하는 방법에는 상기 스캐폴드를 초음파분쇄시키는 것을 더 포함한다.
추가 본 발명의 방법은 TS-ECM 스캐폴드를 환자의 조직에 부착시키는 것을 포함하며, 이때 상기 스캐폴드의 표면은 환자의 세포, 가령, 줄기 세포가 매립된 또는 피복된 겔화된 가용화된 ECM을 포함하며, 이때 상기 매립된 또는 피복된 세포는 상기 조직에 상기 스캐폴드를 피하주입, 이식, 또는 투여하기에 앞서, 환자의 세포가 상기 스캐폴드 안에서 성장하는데 충분한 시간이 허용된다.
본 발명의 방법을 실행함에 있어서, 스캐폴드 이식편은 본 명세서에서 설명된 바와 같이 준비되고, 그 다음 병이든 또는 손상된 조직의 최소한 단편으로 피하주입되거나, 이식되거나, 또는 투여되고, 그리고 대체 세포들이 성장하고, 병이든 또는 손상된 세포를 대체하도록 충분한 시간 동안 병이든 또는 손상된 조직과 접촉이 유지되도록 한다.
이러한 치료 방법에 대한 환자의 반응에 따라 충분한 치료 기간은 하루에서 몇주 또는 몇달이 될 수 있다. 성공적인 조직 재구성없이 1년의 치료는 이러한 치료의 지속을 위한 상한이 될 수 있다. 상기 ECM 재료는 체내에서 자연적으로 생분해되며, 제거 필요성은 없다.
UC를 치료하는 대상 방법을 실행하기 위하여, ECM 이식편은 결장의 최소한 단편과 접촉되도록 피하주입되거나, 이식되거나 또는 투여되고, 결장 점막 세포의 성장 및 대체가 허용되어, 병이든 또는 손상된 세포들이 염증을 나타내지 않는 또는 UC-질병든 세포의 현시를 나타내지 않는 건강한 점막 세포들로 대체되는 기간 동안 점막과 접촉이 유지된다.
상기 ECM 이식편은 길이가 1-10 센티미터와 유사한 상대적으로 짧은 튜브 또는 쉬트 세그먼트로 제공되며, 결장의 내벽에 피하주입되거나, 이식되거나 또는 투여된다. 대안으로, 상기 ECM 이식편은 결정의 전장에 대응하는 하나 또는 그 이상의 길이를 포함할 수 있다. 고형 튜브 또는 쉬트 ECM은 봉합, 클립, 스페이플스, 글루(glue), 또는 이와 유사한 것들에 의해 상기 조직에 확보될 수 있다. 대안으로, 상기 결장 조직은 치료될 부위로 액체 용액, 현탁액, 또는 겔 조성물의 분무에 의해 투여됨으로써 치료될 수 있다.
점막절제술 단계가 포함된 UC의 치료 방법에 있어서, UC는 점막 안에 국한되기 때문에 UC의 증상을 나타내는 조직은 제거된다. 상기 점막절제술 단계은 내시경을 통하여 실시할 수 있으며, 개방 또는 복강경 외과술의 필요성을 피할 수 있다. 상기 줄기 세포 자극 단계 (TS-ECM 이식편의 도입을 통하여)로 결장 내강안에 새로운 건강한 점막의 형성이 허용된다. 상기 점막절제술은 결장의 일부분 또는 짧은 세그먼트 또는 긴 길이의 결장에 실행될 수 있다.
결장의 세그먼트 또는 결장의 전장에서 실행을 하건 간에, 대상 발명은 복부 결장절제술의 필요성을 없애고, 직장 조직 끝동(cuff)을 제자리에 남겨두고, 증식성 (악성) 병리, 가령, UC 또는 가족성 폴립증으로부터 남아있는 직장내 악성 가능성을 제거하는 장점이 포함된 잇점을 제공할 수 있으며; 그리고 다음의 기능적 이점과 함께 전문의가 직장S자결장 세그먼트를 그 자리에 남겨두는 것을 허용한다:
- 하부 절개에 따른 괄약근 파괴 (실금) 또는 천골 신경 손상 (발기부전)의 위험 감소, 그리고
- 저장 기능의 개선으로, 물 흡수의 증가 및 개선된 저장 용량으로 인하여 좀더 정상적인 배변 습관이 허용되며;
- 결장절제술 또는 유사한 절차, 이를 테면 IPAA (전체 큰 창자절제술과 회장 문합)보다 상대적으로 간단하고 침습성이 적으며; 점막절제술은 풀 스루(pull-through)/회장루성형술와 동일한 시점에 또는 추후 임의의 시점에 아래로부터 실행될 수 있는 상당히 간단한 절차다. 상기 줄기 세포는 “주입될 수 있고(planted)”, 그리고 우회 회장루가 존재하는 동안 점막을 재생시킬 수 있다.
- 결장을 보존시키면 결장이 없을 때 평생 살면서 우려되는 점들(가령, 낭염, 내장 폐색, 탈수, 등등)이 방지된다;
- 단지 일시적으로 회장이 만들어지며(가령, 새로운 점막이 생존가능할 때까지); 그리고
- IBD를 치료하기 위하여 독립적으로 작업해야하는 다양한 체계(외과적, 약물, 내시경, 및 조직 공학)를 함께 합쳐놓는다.
다양한 방법 및 절차를 이용하여 줄기 세포를 결장으로 전달시킬 수 있는데, 가령 카테테르-기반의 전달계 또는 이와 유사한 것들을 통하여 관장을 경유하여 전달되는 브로스(broth)내 스캐폴드 상에 줄기 세포를 전달 시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다. 유익하게는, 회장루가 만들어지는 동일한 외과적 절차 동안 상기 ECM 재료가 적용될 수 있고, 내부 파우치는 치유되는 동안 점막의 증식 또는 재생을 허용할 수 있다.
실시예 1 - 결장 조직 대체용 고형 ECM의 외과적 배치
소장 점막하층 세포외 매트릭스 (SIS-ECM) 이식편은 4마리의 살아있는 개의 결장 조직 안으로 이식되었다. 길이가 대략 3-4 cm인 SIS-ECM 이식편들은 공지의 기술에 따라 준비되었다. 2-층, 4-층, 6-층, 및 8-층의 상이한 수를 가진 쉬트 또는 튜브 이식편이 준비되었고, 항문경유 주변 점막 절제 후 테스트되었다.
4마리의 건강한 암컷 잡종 성견 (체중은 대략 20 kg)은 주변 결장 점막 EMR을 받았다. 전신 마취 하에서 개에게 외과적 점막절제술이 실행되었다. 대안으로, 점막 조직 제거, 이를 테면 EMR은 가령, 치료 내시경 (EG-3430, Pentax Medical, Montvale, NJ) 및 시판되는 이용가능한 키트(EMR Kit, Olympus America, Center Valley, Pa)를 이용하여 실행되었다. 4-cm 주변 절제가 완성될 때까지 단편적 점막 절제가 순차적으로 실행되었다.
돼지 소장 점막하층 (SIS)으로부터 유도된 튜브형 ECM 이식편 또는 스캐폴드는 내시경을 통하여 외과적으로 4마리 개에게 배치되었다. SIS-ECM 생물제제 스캐폴드 재료는 전술한 바와 같이 준비되었고, 튜브형 형상을 가졌다. 간략하게, 출하 돼지(대략 110-130kg)의 사망 직후 돼지 SIS가 회수되었다. 지방 조직이 포함된 잔류 외부 결합 조직들이 정리되었고, 모든 잔존 폐기물은 수돗물로 반복 세척함으로써 제거되었다. 소장 조직으로부터 점막하층 층은 기계적으로 박층 분리되었다(delaminate). 그 다음 점막하층 층으로부터 세포가 제거되었고, 2시간 동안 0.1% (vol/vol) 과산화아세트산 (s), 4% (vol/vol) 에탄올, 및 96% (vol/vol) 탈이온수에 담궈 소독되었다.
그 다음 SIS-ECM 재료는 인산염-완충된 염수 용액 (pH Z 7.4)으로 15분 동안 2차례 세척되었고, 탈이온수로 15 분간 2차례 세척되었다. 갯과 결장의 해부학에 부합되게 튜브형 스캐폴드가 직조되었다. 간략하게 설명하자면, 몇개의 완전 회전(가령, 다층 튜브)을 위하여 탯줄 띠가 감겨있는 22-mm 다공 튜브/원통 주변을 SIS 수화 쉬트로 둘러쌈으로써 다층 튜브가 만들어졌다. . 그 다음 구조체를 플라스틱 파우치에 두고, 응축 트렙이 나란히 있는 진공 펌프(모델 D4B, Leybold, Export, PA)에 부착되었다.
물을 제거하고, 단단하게 결합된 다중층 구조체가 형성되도록 10 내지 12시간 동안 710 내지 740 mm Hg의 진공이 상기 구조체에 제공되었다. 각 ECM 장치가 원통으로부터 제거된 후, 최종적으로 에틸렌 옥시드로 살균되었다.
SIS-ECM 이식편의 내시경 배치를 위하여, 튜브형 스캐폴드는 염수 용액조에서 5분간 수화되었고, 그 다음 30-mm 이완불능(achalasia) 풍선 (Cook Endoscopy Achalasia balloon, Wilson-Cook Medical, Winston-Salem, NC)위에 배치되었다. SIS-ECM 장치는 2개의 4-0 실크 봉합에 의해 압박되었으며, 풍선이 팽창되었을 때 풀리게 되는 외과의사 매듭을 가진다. 0.035-인치 와이어(Jagwire, Boston Scientific, Natick, MA)는 내시경을 통하여 개의 결장 안에 배치되었다. 그 다음 상기 풍선은 내시경 유도하에 와이어 위를 통과하여 배치되고, SIS-ECM은 점막 절제 길이를 따라 연결된다.
6F 내시경 유도 카테테르 (Oasis stent introduction system, Wilson-Cook Medical)를 통하여 결장 벽과 장치의 반대 측에 2개의 별도 스트립상의 SIS-ECM 사이에 1 ml의 분해가능한, 리신-유도된 우레탄 (LDU) 외과용 접착제 (TissuGlu, Cohera Medical, Pittsburgh, Pa)가 주사되어 미끄러짐을 방지하였다. 그 다음 상기 풍선은 수동으로 완전하게 팽창되어 결장 벽 쪽으로 상기 스캐폴드를 확장시킨다. 풍선 팽창은 15분간 지속되고, 수축 및 제거 후 결장 안에 SIS-ECM 스캐폴드를 제자리에 남여두었다.
수술 후. 마취에서 개들이 회복되었고, 관상기관이 제거되었고, 회복실에서 흉골 위치(sternal position)에서 편하게 휴식을 취할 때 까지 감시받았다. 상기 개들은 하룻밤 동안 우리에 두었고, 수술 후 1일 차에 더 큰 우리로 되돌려 보냈다. 모든 개에게 세팔로틴/세팔렉신 (35 mg/kg)로 구성된 경구 예방 항생제가 7 내지 9일 동안 일일 2회 제공되었다.
정맥 아세프라마진(0.1 mg/kg) 및 부토오르파놀 (0.05 mg/kg)이 2일간 투여되었고, 이어서 그 다음 무통이 필요한 경우 매 12시간 마다 피하 또는 근육내 부프렌오르핀 (0.01 내지 0.02 mg/kg)이 제공되었다.
모든 개들에게 또한 매일 오메프라졸 20 mg이 제공되었다. 외과술 이후 36시간 시점에서 경구 섭취가 시작되었다. 상승된/융기 플랫포옴으로부터 개들에게 공급되었다. 매일 영양 요구량이 산출되었고, 이를 3번의 별개 공급으로 나누었다. 수술 후 1주일 동안 묽은/부드러운 음식이 공급되었고, 뒤이은 2-주 기간에 결쳐 고형 음식으로 점진적으로 변화되었다. 매주 개의 체중을 측정하였고, 대략 10-14 피트의 큰 우리에 가두어 거동이 자유롭도록 하였다.
내시경 검사는 수술 후 1개월 그리고, 12주차 안락사 시행 직전에 실행되어 결장 점막 외양 및 협착이 평가되었다.
안락사 직후, 상기 스캐폴드 배치 부위 및 상기 스캐폴드 배치 부위의 고유 결장 조직 전단 및 말단이 수거되었다. 잘라낸 세그먼트는 종축으로 분할하여, 노출된 점막 표면이 검사되었으며, 크기 측정을 위하여 사진촬영되었다. 협착 정도를 결정하기 위하여 재구성된 부위의 상위 모서리로부터 3m 전단에서 결장의 내강 둘레와 이식편의 중간에서 둘레가 측정되었다. 결과는 재구성된 부위와 전단 정상 조직 사이의 둘레 감소 비율(평균 +/- SD)으로 나타내었다.
편평한 위치에서 코르크판에 잘라낸 조직을 핀으로 고정시키고, 10% 중성 완충된 포르말린에 담궜다. 검체는 정상 조직과 재구성된 조직을 모두 포함하는 종축으로 정리되었고, 절단되었고, 헤마토실린-에오신과 Masson의 삼색 착색에 의해 착색되었다. 검사된 지역은 고유 조직, 재구성된 지역과 고유 조직 사이에 전단 및 말단 경계면, 그리고 재구성된 지역의 중앙 영역을 포함하였다. 데이터 분포 검사에 기초하여, 데이터는 정상적으로 분포된 것으로 보인다. 따라서, 결과를 비교하기 위하여 이용된 통계적 접근법은 지표 t 테스트이다 (n = 4).
테스트된 가설은 SIS-ECM를 이용하여 EMR 결함을 치료하면, 치료하지 않은 경우와 비교하여 둘레의 감소가 덜할 것이라는 것이다. 개별 테스트 동물의 데이타는 다중 통계학적 분석(가령, 둘레 감소 및 체중)을 거쳤다. 개에게서 내강 둘레의 감소 비교는 주요 통계학적 분석으로 채택되었지만, 다중 테스트와 관련되지는 않았다. 모든 다른 통계학적 테스트는 반복 측정을 위하여 무보정된 이들의 P값에 부차적인 것으로 간주되며, 이는 오직 설명으로 받아들여야 한다.
결과 및 결론
치료가 없을 때, 흉터생성 및 협착 형성 결과가 예상된다. 그러나, ECM 치료에 의해 절제된 조직의 점막이 육안으로 그리고 현미경관찰에 의해 정상인 것으로 보이는 피면(coverage)이 결과되었다. 결과는 튜브 장치에서 ECM 층의 수에 따라 약간씩 변화되었다-ECM 층의 수가 많을 수록 일반적으로 점막 피면이 증가되었다. ECM 스캐폴드로 치료를 받은 어떠한 개에게서도 협착 징후는 없었다.
개 모델에서 현행 연구는 내시경을 통하여 주변 EMR 다음에 배치된 SIS-ECM 스캐폴드가 협착 형성없이 결장 점막 재구성을 촉진시켰다는 것을 보여주었다(도 1). 재구성된 조직은 조밀한, 조직화된 콜라겐 점막하층과 정상적인 외양의 외 근육층을 가진 완전하게 상피화된 내강으로 구성되었다.
따라서, 개 모델에서 결장 점막 라이닝 조직의 재생에 대하여 SIS-ECM 이식편을 이용한 연구에서 ECM은 IBD, 이를 테면 UC 또는 CD의 치료에 이용될 수 있음이 설명된다.
따라서, 설명된 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 상이한 구체예들이 제공될 수 있음이 명백하다. 전술한 명세서는 제한을 위한 것이 아니라 설명을 위한 것으로 해석되어야 한다.
실시예 2 - 결장 조직의 대체용으로 겔 ECM의 적용
본 발명에 따라, 염증성 장 질환 (IBD) 치료를 위하여 ECM 겔 조성물의 실행가능성이 생체내 렛에서 테스트될 수 있다. 렛(rats)은 인간 IBD, 이를 테면 궤양성 대장염 (UC)의 모델로 확립될 수 있는데, 몇일 동안 임의로 공급되는 음용수에 덱스트란 설페이트 나트륨(DSS) 을 투여함으로써 렛 결장 조직에 UC가 유도될 수 있다.
임의로 공급되는 음용수에 7일간 2% DSS를 투여하고, 이어서 염수 플러쉬에 의해 렛에게서 급성 UC가 유도될 수 있다. 임의로 공급되는 음용수에 한번 또는 그 이상의 연속 7일간 2% DSS를 투여하고, 이어서 일반 물을 공급하면 렛에게서 만성 UC가 유도될 수 있다.
소장 점막하층 (SIS)으로부터 유도된 겔 세포외 매트릭스 (ECM)을 이용하여 관장을 통하여 결장으로 도입시켜 UC 치료를 실행할 수 있다. 겔 SIS-ECM은 최소한 1주일, 바람직하게는 최대 약 1개월 동안 일일 한번 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. SIS-ECM의 바람직한 투약 섭생은 30일 동안 일일 일회가 된다.
ECM으로부터 겔을 준비하는 방법
소장 세그먼트로부터 SIS를 준비하는 방법은 미국 특허 4,902,508, 미국 특허 5,275,826, 및 미국 특허 5,514,533에서 상세하게 설명되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 우선 내장의 세그먼트는 외층(특히 장막(tunica serosa)과 근육층(tunica muscularis)) 그리고 내층(점막층의 내강 부분)을 모두 제거하기 위하여 종축으로 닦아내는 움직임을 이용한 마찰을 받게 된다. 전형적으로, SIS는 염수로 헹궈내고, 하기에서 설명된 바와 같이, 사용할 때까지 임의선택적으로 수화된 또는 탈수화된 상태로 보관된다.
현재 유체화된 조성물은 상기 점막하층의 조직을 가용화시키고, 실질적으로 균질한 용액으로 만들기 위한 충분한 시간 동안 상기 점막하층을 프로테아제, 이를 테면 트립신 또는 펩신으로 가루로 만들거나 및/또는 분해시킴으로써 내장 점막하층의 용액 또는 현탁액으로 준비된다. 상기 내장 점막하층 출발 재료들은 ??거나, 절단하거나, 갈거나, 전단시키거나 그리고 이와 유사한 작업에 의해 분쇄된다. 냉동 또는 냉동-건조된 상태의 점막하층의 연마가 바람직하지만, 점막하층 조각들의 현탁액을 고속(고전단) 블렌더에 넣고, 필요에 따라 원심분리 또는 과량의 물을 따라냄으로써 물을 제거하여도 양호한 결과를 얻을 수 있다. 분쇄된 내장 점막하층은 건조되어 점막하층 분말이 형성된다. 그 다음, 물 또는 완충된 염수 그리고 임의선택적으로 다른 약제학적으로 수용가능한 부형제와 복합되어 수화됨으로써, 25?C에서 약 2 내지 300,000cps의 점성을 보유한 유체로된 조직 이식편 조성물이 형성될 수 있다. 더 높은 점성의 이식편 조성물은 겔 또는 페이스트 농도(consistency)를 보유할 수 있다. 본 조성물은 당업계에 공지된 멸균 기술, 이를 테면 이온화 방사선에 노출됨으로써 살균될 수 있다.
본 발명의 유체화된 점막하층은 조직, 예를 들면, 외상 또는 질환-유도된 조직 결함을 보정하기 위하여 복구 또는 확대가 필요한 연조직의 주사가능한 이형이식편으로서의 용도를 또한 발견한다.
SIS 현탁액
상기와 같이 준비된 SIS 견본은 조직 가위, 단일 날의 레어져 칼, 또는 다른 적절한 절단 도구를 이용하여 임의적으로 작은 조각으로 다지거나 또는 토막낸다. 상기 견본들은 편평한 스테인레스 강 용기 안에 넣고, 이들 견본을 가루로 만들기 위하여 용기 안으로 액화 질소를 용기에 도입시켜 냉동시킨다.
그 다음 냉동된 SIS 견본은 분쇄되어 SIS 거친 분말이 형성된다. 이러한 과정은 예를 들면, 냉동 견본 상단에 위치된 실린더형 동 주괴(brass ingot)가 있는 수동 아버 프레스(arbor press)로 실행될 수 있다. 주괴는 견본과 프레스 아버 사이에 접촉면 역할을 한다. 액화 질소는 SIS 견본이 냉동 상태가 유지될 수 있도록 주기적으로 견본에 투여될 수 있다.
SIS 견본을 분쇄시키는 다른 방법들을 이용하여 본 발명에 이용가능한 SIS 분말을 만들 수 있다. 예를 들면, SIS 견본은 동결-건조될 수 있고, 그 다음 수동 아버 프레스 또는 다른 분쇄 수단을 이용하여 분쇄될 수 있다. 대안으로, SIS는 고전단 블렌드로 처리되어, 탈수 및 건조에 의해 SIS 분말이 생성된다.
사전-냉동된 절구공이를 이용하여 SIS 분말의 추가 분쇄를 이용하여 좀더 일관되고, 미세하게 분쇄된 산물이 만들어질 수 있다. 다시, 최종 분쇄 동안 고형 냉동 입자를 유지하기 위하여 필요에 따라 액화 질소가 이용된다. 상기 분말은 예를 들면, 완충된 염수를 이용하여 용이하게 수화될 수 있고, 원하는 점성으로 본 발명의 유체화된 조직 이식편 재료를 만들 수 있다.
SIS 용액
SIS 분말은 와이어 메쉬를 통하여 체로 걸러 임의의 편리한 용기에 담는다. 그 다음 상기 분말은 단백질 절단되어 실질적으로 균질한 용액이 형성된다. 한 구체예에서, 상기 분말은 실온에서 48시간에 걸쳐 HCl에 의해 pH가 2.5로 조정된 0.1M의 아세트산 안에 1 mg/ml의 펩신 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)으로 절단된다. 반응 매질은 수산화나트륨으로 중화되어, 펩신 활성을 비활성화시킨다. 그 다음 가용화된 점막하층은 용액의 염 침전에 의해 농축되고, 분말 형태의 프로테아제 가용화된 내장 점막하층을 형성시키기 위하여 추가 정제 및/또는 냉동 건조를 위하여 분리될 수 있다.
본 발명에 따른 유체화된 점막하층 조성물의 점성은 점막하층 성분의 농도 및 수화도를 조절함으로써 조정될 수 있다. 상기 점성은 25?C에서 약 2 내지 약 300,000 cps의 범위로 조정될 수 있다. 낮은 점성 점막하층 조성물은 관절내 적용 또는 신체 강 안에 적용할 때 더 적합하다. 더 높은 점성 제형, 예를 들면, 겔은 SIS 절단 용액의 pH를 약 6.0 내지 약 7.0으로 조정함으로써 SIS 절단 용액으로부터 만들어질 수 있다. 점막하층 현탁액 또는 점막하층 소화 용액인 본 조성물의 겔 형태는 주사기 또는 카테테르를 이용하여 피하 또는 근육내 적용에 일반적으로 바람직하다.
SIS 겔은 4℃에서 적절한 양으로 0.1 N NaOH (절단 용액의 1/10 용적)와 10X PBS pH 7.4 (절단 용액의 1/9 용적)을 혼합함으로써 겔이 형성되는 것으로 또한 설명되었다. 상기 용액은 원하는 용적으로 그리고 저온 (4℃) 1X PBS pH 7.4를 이용하여 농축되며, 겔화가 일어나도록 37℃ 배양기에 위치시켰다.
ECM은 용액 안에서 40분 후 매트릭스를 형성할 수 있다. ECM-유도된 겔은 20?C이하의 온도에서 액체이지만, 온도를 37℃로 상승시키면 다시 겔로 된다.
ECM으로부터 겔을 준비할 때, 모든 용액은 얼음 위에 유지시켜야 하고, 다음의 변수들은 미국 특허 8,361,503(이의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입됨)에 따라 결정되어야 한다:
Cf = 최종 겔의 농도, mg/ml
Cs = ECM 절단 용액의 농도, mg/ml
Vf = 실험에 요구되는 최종 겔 용액의 용적
Vd = ECM 절단 용액으로부터 요구되는 용적, ml
V10X = 필요한 10X PBS 용적, ml
V1X = 필요한 1X PBS 용적, ml
VNaOH = 필요한 0.1 N NaOH의 용적, ml
우선, 요구되는 ECM 겔의 최종 농도 (Cf) 및 용적 (Vf)을 결정한다. 그 다음 Cf (mg/ml)* Vf (ml)를 곱하여 필요한 ECM 양을 산출한다. 이 값으로 상기 ECM 절단 용액으로부터 필요한 용적 (Vd)이 제시될 수 있으며, 이때 Vd =[Cf (mg/ml)* Vf (ml)]/Cs임.
상기 산출된 용적 Vd를 9로 나눔으로써 (V10X= Vd /9) 필요한 10X PBS의 용적이 산출된다. 상기 산출된 용적 Vd를 10으로 나눔으로써 (VNaOH = Vd /10), 필요한 0.1 N NaOH의 용적이 산출된다. 상기 용액을 적절한 농도/용적으로 만드는데 요구되는 1X PBS의 양은 다음과 같이 산출된다: V1X=Vf - Vd -V10X-VNaOH. ECM 절단(Vd)없이, 모든 시약 (V1X + Vd + V10X + VNaOH)을 적절한 용기 (보통 15 또는 50 ml의 원심분리 튜브)에 추가한다. 용액은 얼음위에 얹고, 내내 얼음 위에서 유지시킨다.
상기 ECM 절단 용액 (Vd)의 적절한 용적을 상기에서 준비된 PBS/NaOH 혼합물에 추가하고, 1 ml 마이크로피펫으로 잘 혼합하고, 이때 용액 안에 기포가 만들어지지 않도록 주위한다. 상기 ECM 절단 용액의 점성에 따라, 이동하는 동안 약간의 유의적인 용적 손실이 있을 수 있다. 총 용적을 주시하고, 최종 용적이 획득될 때까지 적절한 양을 추가한다. 사전-겔 용액의 pH를 측정하고, 이때 pH는 대략 7.4이어야 한다.
사전-겔 용액을 몰드 또는 적절한 웰에 추가한다. 상기 몰드 또는 웰을 37℃ 배양기 안에 최소 40분간 둔다. CO2 조절 하는 배양기의 사용은 피한다. 수분 증발이 우려되는 경우, 상기 몰드는 배양기에 넣기 전에 플라스틱 지퍼-락 주머니 안에 넣는다. 겔화 후, 몰드로부터 겔을 빼내고, 1X PBS에 둔다. 겔이 조직 배양 플레이트에서 만들어진 경우, 1X PBS를 겔의 상단에 위치시켜, 사용할 때까지 겔이 수화된 상태로 유지되도록 한다.
시료 산출: 10 mg/ml 원액으로부터 최종 농도 6 mg/ml인 6ml의 겔을 만든다.
SIS-ECM 투여 절차
SIS-ECM 용액 또는 현탁액은 UC-유도된 렛의 결장 안으로 관장에 의해 투여될 수 있다. 상기 이식편의 투여 후 숙주 동물의 거부, 감염 또는 비정상적인 생리학적 반응이 예상되지 않는다. 상기 용액 또는 현탁액은 내시경을 통하여 또는 복강경을 통하여 결장으로 또한 투여될 수 있다. 본 발명의 예상치 못한 결과는 적절한 조직 재건의 자극일 수 있고, 결장 점막의 확대는 SIS 용액 또는 현탁액 재료에 의해 실현될 수 있는 것으로 간주된다..
본 발명의 유체화된 조성물은 조직 대체 및 복구를 야기할 수 있고, 나아가 UC를 포함하는 IBD의 치료 또는 치료를 야기할 수 있다. 상기 유체화된 점막하층 조성물은 천연 결장 점막 조직의 재생을 유도하기 위하여 본 발명에서 이용된다. 유체화된 ECM 조성물의 유효량이 결함 조직의 국조로 주사됨으로써, 침습성이 큰 외과적 기술의 필요 없이 생체지향적 특징(biotropic properties)이 실현될 수 있다.
본 발명은 특정 바람직한 구체예를 참고로 상세하게 설명되지만, 설명된 그리고 다음의 청구범위에서 한정된 바와 같이 본 발명의 범위 및 사상내에서 변화 및 수정이 있을 수 있다.

Claims (32)

  1. 인간의 궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD)로부터 선택되는 염증성 장 질환 (IBD)을 치료, 개선 또는 치유용 조성물로서 용액, 현탁액, 또는 겔 형태의 세포외 매트릭스 (ECM)를 구성으로 하는 조성물에 있어서,
    이때 상기 ECM은 염증성 장 질환 (IBD)으로 인한 손상된 조직의 재구성적 조직 재건을 실행함으로써, 상기 손상된 조직을 치료 또는 개선시키고,
    이때 상기 ECM은 이식편(graft) 또는 스캐폴드(scaffold) 기능을 하며,
    이때 상기 ECM은 소장 및 대장에서 선택된 조직으로 부터 유래되며,
    이때 상기 조성물은 줄기 세포를 포함하지 않음을 특징으로 하는, 조성물.
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  4. 청구항 1에 있어서, 이때 상기 조성물은 내시경, 또는 관장에 의해 제공되는, 조성물.
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