CN102552910B

CN102552910B - 细胞外基质蛋白1及其调节剂在制备过敏性疾病诊断或治疗药物中的应用

Info

Publication number: CN102552910B
Application number: CN201010620105.9A
Authority: CN
Inventors: 孙兵; 李振虎; 张渊; 吴晓东
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for excellence and innovation of molecular cell science, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102552910A

Abstract

本发明涉及细胞外基质蛋白1(ECM1)及其调节剂在制备过敏性疾病诊断或治疗药物中的应用。本发明首次揭示ECM1可调节Th2细胞的迁移，与Th2细胞介导的过敏性疾病的发生或发展密切相关，从而ECM1可以作为药物靶点开发预防或治疗过敏性疾病的药物。

Description

细胞外基质蛋白1及其调节剂在制备过敏性疾病诊断或治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及细胞外基质蛋白1及其调节剂在制备过敏性疾病诊断或治疗药物中的应用。

背景技术

在过去的二十年中，像哮喘等过敏性疾病在西方国家发病率已超过人口的25％，而且呈稳定的上升趋势。而在中国的北京，上海和广州等发达的城市，过敏性疾病的发病率也逐年增加。这不仅影响人们的生活质量，特别是幼儿哮喘，直接影响了儿童身体的正常发育，还对国家经济的发展造成一定阻碍作用。

当机体幼稚Th细胞被抗原递呈细胞激活后，经过克隆增殖与细胞分化，形成不同的细胞亚型如Th1，Th2，Th17和Treg等。不同的细胞亚型介导不同的疾病，其中Th2细胞分泌大量的白介素4，5和13。Th2细胞功能为辅助B细胞增殖、分化，介导体液免疫应答，参与I型超敏反应等，在抗寄生虫以及过敏反应中起到重要的作用。Th2细胞能够介导过敏性哮喘、皮肤炎症反应、过敏性皮炎，寄生虫感染等。

作为Th2细胞介导的过敏性疾病的一种，过敏性哮喘是一种肺部的慢性炎症疾病，它的主要特征有血清中IgE水平升高，肺部嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润，黏液分泌过多，呼吸道非特异性反应增强。过敏性哮喘的发病机理可以简单地概括为：机体在呼吸道接触到某种过敏原而发生免疫反应产生针对该过敏原的特异性IgE类抗体，并且这些抗体通过受体结合于肥大细胞表面；当机体再次遇到相同过敏原时，该过敏原就能和特异性的IgE结合，从而使肥大细胞表面的IgE发生桥联，引起了肥大细胞的脱颗粒作用，释放白三烯，组胺等介质，招募炎症细胞浸润到肺组织，导致平滑肌收缩，血管扩张，气管阻塞，肺部炎症发生。从免疫学的层面上来讲，过敏性哮喘是一个典型的Th2反应。CD4阳性的辅助性T细胞通过其表面的受体TCR识别过敏原，并释放白细胞介素，趋化因子等细胞因子，表达一些共刺激因子，Th2细胞释放的Th2类型的细胞因子IL-4和共刺激因子CD40L能够传递给B细胞进行抗体重链转换的信号，从而使B细胞分泌IgE类抗体；它分泌的IL-4，IL-10可以调节肥大细胞的功能，同时IL-5又是嗜酸性粒细胞浸润和发挥功能必不可少的因素。

虽然目前国内外对Th2细胞介导的过敏性疾病的研究日益加深，但是有效的特异性治疗手段却相对甚少，其中很大一部分原因在于过敏原的多样性和复杂性。目前的治疗药物如糖皮质激素，β2受体激动剂，茶碱，白三烯受体拮抗剂等都具有一定的负作用和耐受性。因此，如何针对炎症发生的机制发展新的诊断和治疗手段，研发出新的抗过敏药物，有着非常重要的科学意义。

发明内容

本发明的目的在于提供细胞外基质蛋白1及其调节剂在制备Th2细胞介导的过敏性疾病诊断或治疗药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种细胞外基质蛋白1的抑制剂的用途，用于制备防治或改善Th2细胞介导的过敏性疾病的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物还用于：

抑制Th2细胞迁移出脾脏或淋巴结到达病灶部位；

降低Th2免疫应答；

下调血清中IgE水平；

减轻肺部的炎症侵润；

降低趋化因子受体S1P1和CCR4表达；或

降低转录因子klf2表达。

在另一优选例中，所述的细胞外基质蛋白1的抑制剂选自：

特异性干扰细胞外基质蛋白1基因或其上游基因表达的干扰分子(如小干扰RNA分子或反义核苷酸)；

特异性与细胞外基质蛋白1结合的抗体或配体。

在另一优选例中，所述的细胞外基质蛋白1基因的上游基因是gata3或stat6基因。

在另一优选例中，所述的细胞外基质蛋白1的抑制剂是干扰分子，其选自：

序列如SEQ ID NO：2所示的寡核苷酸，或包含SEQ ID NO：2所示的寡核苷酸序列的表达载体(干扰gata3基因的表达)；或

序列如SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸，或包含SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸序列的表达载体(干扰细胞外基质蛋白1基因的表达)。

在另一优选例中，所述的包含SEQ ID NO：1或2所示的寡核苷酸序列的表达载体在进入体内后能够形成特异性干扰细胞外基质蛋白1基因或其上游基因的表达的抑制剂。

在另一优选例中，所述的Th2细胞介导的过敏性疾病选自(但不限于)：过敏性哮喘，皮肤炎症反应，过敏性皮炎，寄生虫感染。

在本发明的另一方面，提供一种防治Th2细胞介导的过敏性疾病的干扰分子，选自：

序列如SEQ ID NO：2所示的寡核苷酸；或

序列如SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种防治Th2细胞介导的过敏性疾病的抑制剂，所述抑制剂为重组表达载体，其含有：

SEQ ID NO：2所示的寡核苷酸序列；或

SEQ ID NO：1所示的寡核苷酸序列；

所述的重组表达载体在进入体内后能够特异性干扰细胞外基质蛋白1基因或其上游基因的表达。

在本发明的另一方面，提供一种细胞外基质蛋白1的用途，用于筛选防治Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种筛选防治Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达细胞外基质蛋白1的体系；和

(2)检测所述体系中细胞外基质蛋白1的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低细胞外基质蛋白1的表达或活性，则表明该候选物质是防治Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达细胞外基质蛋白1的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中细胞外基质蛋白1的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达细胞外基质蛋白1的体系；

如果测试组中细胞外基质蛋白1的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是防治Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系中还表达GATA3或STAT6蛋白，所述方法还包括：检测所述体系中GATA3或STAT6蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)GATA3或STAT6蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是防治Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于防治Th2细胞介导的过敏性疾病有用的物质。

在本发明的另一方面，提供特异性识别细胞外基质蛋白1或与细胞外基质蛋白1结合的物质的用途，用于制备诊断Th2细胞介导的过敏性疾病的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的特异性识别细胞外基质蛋白1或与细胞外基质蛋白1结合的物质通过判断待测样品(如血清和痰液)中细胞外基质蛋白1的表达量来诊断Th2细胞介导的过敏性疾病。若细胞外基质蛋白1的表达量高于标准值，则诊断为Th2细胞介导的过敏性疾病。所述的标准值为正常人表达细胞外基质蛋白1的平均值。

在本发明的另一方面，提供一种防治Th2细胞介导的过敏性疾病的方法，所述方法包括：下调所述哺乳动物体内细胞外基质蛋白1或其上游蛋白的表达或活性。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、C57BL/6小鼠的幼稚CD4+辅助性T细胞，在外加Th1或Th2条件下培养分化，在1～5天时间里收细胞进行Real-time PCR(a)和Western blot(b)，检测ECM1的表达情况；对Th细胞的5种不同亚型分别进行real-time PCR(c)，Western blot(d)和上清ELISA(e)检测ECM1表达情况；对其它免疫细胞检测ECM1表达情况(f)。

图2、ECM1被经典的Th2信号通路所上调。

(a)STAT6分子敲除(KO)后，ECM1表达情况。

(b)通过逆转录病毒系统再转入持续性表达的STAT6(STAT6-CA)，ECM1表达情况。

( c)用RNAi技术下调GATA3，ECM1表达情况。

(d)CHIP实验验证GATA3是否能直接结合在ECM1的启动子上。

图3、ECM1基因敲除小鼠显示体内Th2免疫应答降低。

(a)过继转移了野生型(WT)以及ECM1基因敲除小鼠(KO)的骨髓细胞后的小鼠在诱导哮喘后肺泡灌洗液中的免疫细胞数目。

(b)ELISA方法检测过继转移了野生型(WT)以及ECM1基因敲除小鼠(KO)的骨髓细胞后的小鼠在诱导哮喘后血清中的OVA特异性IgE。以未诱导哮喘组(PBS)作为对照。

(c)肺组织切片显示过继转移了野生型(WT)以及ECM1基因敲除小鼠(KO)的骨髓细胞后的小鼠在诱导哮喘后肺部的炎症侵润情况。以未诱导哮喘组(PBS)作为对照。

(d)检测脾脏，纵膈淋巴结(LLN)中免疫细胞数量。

(e)淋巴结细胞如果经体外重刺激96小时后，其分泌的Th2细胞因子(IL-4，IL-5，IL-13)和IFN-γ情况。

图4、将Th1和Th2细胞经CFSE标记后静脉注射给RAG-1基因敲除小鼠(RAG-1-/-)，24小时后检测血液，肠系膜淋巴结(MLN)，腹股沟淋巴结(iLN)中的CFSE阳性细胞数目。

图5、ECM1的缺失导致趋化因子受体S1P1和CCR4表达降低。

(a)Realtime-PCR检测Th1和Th2细胞中各趋化因子受体的表达情况。

(b)Realtime-PCR检测与S1P1表达相关的转录因子klf2的表达情况。

(c)在敲除ECM1基因的细胞(KO mock)中过表达ECM1(KO ecm1)，S1P1和klf2的表达情况。

(d-g)体外迁移实验验证ECM1与趋化因子受体S1P1的迁移功能相关，其中d为配体S1P体外诱导细胞迁移的实验，敲除ECM1基因的细胞迁移明显降低；e和f为将体外不同染色的野生型与ECM1基因敲除的Th2细胞共培养，再用流式细胞方法将两者分开，发现共培养后，野生型细胞能恢复基因敲除细胞的迁移能力，g为共培养后野生型细胞能恢复基因敲除细胞的S1P1和Klf2分子的表达。

图6、野生型(WT mock)和ECM1基因敲除型小鼠(KO mock)Th2细胞分别过表达ECM1(KO ECM1)或者S1P1(KO S1P1)，klf2(KO klf2)后再过继转移给RAG1敲除小鼠，24小时后检测血液，脾脏，肠系膜淋巴结(MLN)和腹股沟淋巴结(iLN)中的细胞数。证明3者有相同的作用，都可以促进细胞迁移出淋巴结。

图7、Western blot验证ecm1基因设计的siRNA分子(SEQ ID NO：1)抑制ECM1表达的能力。其中，RNAi control为无关序列。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示细胞外基质蛋白1(ExtracellularMatrix Protein 1，ECM1)可调节Th2细胞的迁移，与Th2细胞介导的过敏性疾病的发生或发展密切相关。在Th2细胞介导的过敏性疾病动物模型的染色体中敲除ECM1基因后，ECM1缺陷动物发生的过敏性症状显著减轻，因此可知ECM1蛋白是一种在Th2细胞介导的过敏性疾病发病机制中发挥重要作用的因素，从而可以作为药物靶点开发预防或治疗过敏性疾病的药物。

ECM1及其用途

ECM1是最早利用双向电泳的方法发现于间质成骨细胞细胞系MN7，它是一个85KD的蛋白，并且在序列分析中发现ECM1存在糖基化修饰。在小鼠中克隆到ECM1基因以后，很快就在人类的基因组中找到了同源性很高的对应基因。并且，对于人类的ECM1基因的研究发现，ECM1对软骨成骨的形成，内皮细胞的增生和血管发生都起到重要的调节作用。在2002年皮肤病病人的体内发现了ECM1的突变体，正是由于ECM1的突变导致了常染色体隐性遗传的皮肤病：类脂质蛋白质沉积症(lipoid proteinosis)。另外随后发现在苔癣硬化症(lichen sclerosus)病人的体内能产生自发性的ECM1的抗体，从而导致ECM1功能的丧失和疾病的发生。至今为止绝大部分的研究都集中在人类皮肤病的研究中，并且认为ECM1在人类一些皮肤病中起到了主要的作用，并且作为一种疾病的检测指标，但是其对免疫细胞的功能以及在免疫性疾病中的作用却很少有报道。

任何适合的ECM1蛋白均包括在本发明中。所述的ECM1蛋白包括全长的ECM1蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的ECM1蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号：NP_0319252基本上相同。编码所述的ECM1蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号：NM 007899.2或该序列的简并的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的ECM1蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。ECM1蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。例如，所述的ECM1蛋白可以是来自于鼠(如小鼠)的，也可以是来自于人或其它哺乳动物的、氨基酸序列接近或基本相同的(如相同性大于70％，较佳的相同性大于80％；更佳的相同性大于85％；最佳的相同性大于90％)、且生物活性与小鼠ECM1蛋白的生物活性相同(如对于Th2细胞介导的过敏性疾病的发生或发展具有重要作用)的蛋白。

本发明人发现，ECM1选择性地被Th2细胞表达，并且在Th2细胞分化的晚期达到一个高峰。并可调节Th2细胞的迁移。接着，利用转基因和基因敲除技术得到了ECM1基因高表达和基因敲除小鼠。研究表明：在由Th2细胞介导的过敏性疾病如哮喘模型中，发现来自ECM1基因敲除小鼠的Th2细胞在体内的分布，发生了很大的改变。这些细胞在淋巴结和脾脏中大量堆积，而外周血中的比例却大大降低，说明ECM1对Th2细胞的迁移具有重要的调控功能。深入研究揭示ECM1能通过调控趋化因子受体S1P1和CXCR4的表达，从而影响了Th2细胞的迁移。ECM1和它的中和性抗体可开发成诊断和治疗Th2细胞介导的过敏性疾病药物。

通过上述的研究工作可知，ECM1是一个新的、对过敏性相关疾病有保护作用的药物靶点。针对ECM1的各种治疗手段可以作为治疗Th2细胞介导的过敏性疾病及相关疾病的新颖和有效的手段。

ECM1的抑制剂及其用途

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种ECM1的抑制剂的用途，用于制备抑制Th2细胞介导的过敏性疾病的组合物。所述的Th2细胞介导的过敏性疾病包括但不限于：过敏性哮喘，皮肤炎症反应，过敏性皮炎，寄生虫感染等。所述的ECM1的抑制剂还用于促进Th2细胞迁移到脾脏、淋巴结；降低Th2免疫应答；下调血清中IgE水平；减轻肺部的炎症侵润；降低趋化因子受体S1P1和CCR4表达；或降低转录因子klf2表达。

如本文所用，所述的ECM1基因或蛋白的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。

更具体地，所述的ECM1基因或蛋白的抑制剂是指任何可降低ECM1蛋白的活性、降低ECM1基因或蛋白的稳定性、下调ECM1蛋白的表达、减少ECM1蛋白有效作用时间、或抑制ECM1基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调ECM1有用的物质，从而可用于预防或治疗Th2细胞介导的过敏性疾病。例如，所述的拮抗剂是：特异性干扰ECM1基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与ECM1结合的抗体或配体。

此外，一类ECM1基因的上游基因或蛋白的抑制剂也包括在所述的ECM1基因或蛋白的抑制剂的范围内。所述的ECM1基因的上游基因例如GATA3基因。

作为本发明的一种实施方式，所述的ECM1的抑制剂是一种特异性与ECM1结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用ECM1蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达ECM1或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

作为本发明的一种实施方式，所述的ECM1的抑制剂是一种特异性与ECM1上游蛋白结合的抗体或配体。

作为本发明的一种实施方式，所述的ECM1的抑制剂是一种ECM1特异性的小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。作为本发明的一种实施方式，所述的ECM1的抑制剂是一种特异性干扰ECM1基因的上游基因(如可启动ECM1基因的表达的基因)表达的干扰分子。作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的小干扰RNA分子，所述的小干扰RNA分子可特异性的干扰ECM1基因上游的GATA3基因的表达，与其它的人类核酸序列没有显著的同源性；并且经验证，其具有良好的干扰GATA3基因的效果，从而下调ECM1基因的表达，例如靶序列为ttcggatgtaagtcgagg的小干扰分子。作为本发明的特别优选的方式，提供了另一种效果良好的小干扰RNA分子，其可特异性的干扰ECM1基因表达，与其它的人类核酸序列没有显著的同源性；并且经验证，其具有良好的干扰ECM1基因的效果，例如靶序列为ccttgtagagctgaccaag的小干扰分子。

小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了ECM1与Th2细胞介导的过敏性疾病的相关性以后，可以以各种途径方便地制备出针对ECM1或其上游基因的小干扰RNA，从而用于抑制Th2细胞介导的过敏性疾病。所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到体内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到体内。

此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。

所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

组合物

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的ECM1的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制Th2细胞介导的过敏性疾病。任何前述的ECM1的抑制剂均可用于组合物的制备。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。

在得知了所述ECM1基因或蛋白的抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将ECM1的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带ECM1的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的ECM1抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明所述的ECM1的抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的ECM1基因或蛋白的抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的ECM1的抑制剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

药物筛选

在得知了ECM1与Th2细胞介导的过敏性疾病的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制ECM1的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于预防或治疗Th2细胞介导的过敏性疾病真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选抑制Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达ECM1的体系；和检测所述体系中ECM1的表达或活性；若所述候选物质可抑制ECM1的表达或活性，则表明该候选物质是抑制Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质。所述的表达ECM1的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达ECM1的细胞；或可以是重组表达ECM1的细胞。所述的表达ECM1的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到ECM1的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达ECM1的体系。

在本发明的优选方式中，所述的体系中还表达GATA3蛋白，所述方法还包括：检测所述体系中GATA3蛋白的表达或活性；其中，若所述候选物质可降低GATA3蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是防治Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制Th2细胞介导的过敏性疾病真正有用的物质。

本发明对于ECM1蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法等。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抑制Th2细胞介导的过敏性疾病的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制ECM1的表达和活性，进而抑制Th2细胞介导的过敏性疾病有用的物质。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示ECM1与Th2细胞介导的过敏性疾病的发生或发展密切相关，从而可以作为药物靶点开发预防或治疗Th2细胞介导的过敏性疾病的药物。

(2)基于本发明人的新发现找到了可抑制ECM1的抑制剂，其可非常有效地抑制ECM1的表达，从而抑制Th2细胞介导的过敏性疾病的发生。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料和方法

动物：C57BL/6，DO11.10转基因小鼠，和STAT6-基因敲除小鼠均购自Jackson实验室(为对外专卖转基因和基因敲除小鼠的公司)，RAG-1-/-由Jackson实验室获得)，ECM1转基因和基因敲除小鼠自己构建。这些小鼠均饲养在中科院上海生化细胞所实验动物中心(SPF级)。

逆转录病毒系统的质粒：MSCV-IRES-GFP(获自UC Berkeley，Dr.XingxingZang惠赠)。

siRNA系统的质粒：pBS/U6购自addgene公司。

抗体：APC标记抗小鼠IFN-g(XMG1.2)从eBioscience购得。PE标记抗小鼠IL-4(BVD4-1D11)、PE标记抗小鼠CD8α(53-6.7)、FITC标记抗小鼠CD4(GK1.5)、APC标记抗小鼠CD25(PC61.5)、APC标记抗小鼠CD122(TM-b1)和PE标记抗小鼠CD132(TUGm2)从BD Pharmingen公司购买。抗Akt1/2/3(H136)，p-Akt1/2/3(Ser 473)，p-Stat6(Tyr 641-R)和Gata3(HG3-31)抗体从SantaCruz购买。抗p-Stat5(Tyr694)和总Stat5的抗体从Cell Signaling公司购买。PI(3)K和mTOR信号抑制剂：LY294002和Rapamycin从Sigma-Aldrich公司购买。

细胞纯化和体外分化

细胞的诱导：幼稚CD4⁺(CD4⁺CD44^lowCD62L^hi)T细胞，CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞，CD19⁺B细胞和逆转录病毒感染的阳性细胞(GFP+)均由FACSAria(BD Biosciences)流式分选获得。阳性细胞纯度通常高于95％。骨髓源树突状细胞(BM-DC)的培养采用最初来源于Inaba等的方法，经过修改。具体地说，从小鼠股骨和胫腓骨中，冲出骨髓细胞，裂解红细胞。细胞以每孔1.5×10⁶-2×10⁶细胞/1ml培养于24孔板中，培养基含有20ng/ml rGM-CSF。每隔一天非粘附细胞被小心移去，加入含有rGM-CSF的新鲜培养基。经过6天培养，收集贴壁细胞，重新铺在24孔板或60mm培养皿内，24小时后进行转染或刺激。在T细胞体外分化系统中，T细胞培养于加有10％胎牛血清(GIBCO)，谷氨酸钠(2mM)，β-ME(50mM)，青霉素(50units/ml)，链霉素(50mg/ml)，丙酮酸钠(1mM)和Hepes(100mM)的RPMI 1640培养液中。T细胞经由5μg/ml包板anti-CD3和2μg/ml可溶anti-CD28刺激，在如下诱导环境中朝着不同的方向进行分化：

Th0-----10μg/ml anti-IFN-γ，10μg/ml anti-IL-12/23和10μg/ml anti-IL-4；

Th1-----10ng/ml IL-12和10μg/ml anti-IL-4；

Th2-----10ng/ml IL-4，10μg/ml anti-IFN-γ和10μg/ml anti-IL-12/23；

Th17-----1ng/ml TGF-β1，20ng/ml IL-6，10ng/ml IL-1α，10ng/ml IL-23，10μg/ml anti-IFN-γ和10μg/ml anti-IL-4；

iTreg-----10ng/ml hTGF-β1；

在Th0，Th1，Th2和iTreg培养体系里还加入了50U/ml IL-2。

逆转录病毒系统

用于制备逆转录病毒的载体，包括MSCV，MSCV-IRES-GFP，MSCV-IRES-hCD4，pCMV/Eco-Envelope和pKF3-RSV/Gag-Pol均获自UCBerkeley，Dr.Xingxing Zang。ECM1(GenBank登录号AAI45382.1)和STAT6-CA(GenBank登录号AAA79006.1)的全长cDNA被插入到MSCV-IRES-GFP载体的NotI和SalI酶切位点中。

过表达S1P1的逆转录病毒载体的构建：用引物ACGCGTCGACATGGTGTCCACTAGCATCC(SEQ ID NO：11)和CCCATCGATTTAGGAAGAAGAATTGACGTT(SEQ ID NO：12)从幼稚Th细胞中PCR获得S1P1基因，插入到MSCV-IRES-GFP载体的SalI和ClaI的酶切位点中。

过表达klf2的逆转录病毒载体的构建：用引物GAAGATCTACACACAGTCCCTGCCATGG(SEQ ID NO：13)和CCATCGATCTGTTTGCAAGGGGACCGTG(SEQ ID NO：14)从幼稚Th细胞中PCR获得klf2基因。插入到MSCV-IRES-GFP载体的BglII和ClaI的酶切位点中。

为了构建逆转录病毒介导的RNAi载体，本发明人合成针对小鼠GATA3基因序列的互补寡核苷酸序列(序列是ttcggatgtaagtcgagg，SEQ ID NO：2)，然后将之克隆到pBS/U6载体的ApaI和EcoRI酶切位点中。接着，分别从pEGFPc1(Clontech)的BglII和XhoI酶切位点中切下EGFP编码片段和从pBS/U6的BamHI和EcoRI酶切位点中切下在U6启动子下表达GATA3 siRNA的元件，最后将这两部分克隆进MSCV的相应位点中(即BglII和XhoI，BamHI和EcoRI)以获得MSCV-EGFP-GATA3 siRNA载体。

用Lipofectamine(Invitrogen)将逆转录病毒载体转染进293T细胞(ATCC)。24小时后，将培养液由DMEM换为RPMI1640。48小时之后，收获病毒上清，在加入polybrene(6μg/ml)后用于感染已经用anti-CD3和anti-CD28预激活了30个小时的CD4⁺T细胞。病毒感染时，培养板于室温在1800rpm条件下离心90分钟。然后，将培养板放入32℃的培养箱中12个小时。最后，去除掉病毒上清并更换新鲜的细胞分化培养液。

Real-time PCR

细胞用TRIZOL(Invitrogen)裂解后抽提总RNA。用反转录试剂盒(购自Takara)得到cDNA。所有基因的转录产物的数量在ABI PRISM 7900HT序列检测仪上(PEApplied Biosystems)用以SYBR Green Master Mix(ABI)为基础的定量PCR的方法进行测定，每个样本都检测3个复孔，实验数据用SDS 2.2.2软件进行分析。用于real-time PCR analysis的引物序列如下：

ECM1 GCCAGCTCTGTGGAAGTGGA SEQ ID NO：3

CCGGAATCTGTTTATGCTTGC SEQ ID NO：4

S1P1 ATCATGGGCTGGAACTGCAT SEQ ID NO：5

GAGCACGGTGGAGCAGCTAG SEQ ID NO：6

CCR4 GATCACGTGGTCAGTGGCTG SEQ ID NO：7

CTGAACAAGAGGCCTGGGAG SEQ ID NO：8

klf2 GCCTTATCATTGCAACTGGGA SEQ ID NO：9

TCAGAGCGCGCGAACTTC SEQ ID NO：10

流式细胞检测

为了检测细胞表面分子的表达水平，T细胞首先用针对Fc受体(24G2)的抗体(购自eBioscience公司)进行孵育以降低非特异性抗体吸附，然后再用相应的荧光素标记的单克隆抗体进行染色。

为了检测细胞内的IFN-γ和IL-4的分泌，T细胞用PMA(50ng/ml)和Ionomycin(1mM)重刺激6个小时，并在最后4个小时里往培液中加入Brefeldin A(10μg/ml，Sigma-Aldrich)以阻断细胞因子分泌到胞外。然后，收获细胞，并经洗涤，固定，破膜(CALTAG FIX AND PERM)后，加入合适的荧光素标记的anti-IFN-γ和anti-IL-4抗体进行染色。合适的荧光素标记的表型相配的无关抗体作为阴性对照。细胞经由FACSCalibur流式细胞仪进行分析(BDBiosciences)。

ELISA实验

为了检测细胞培养上清里的细胞因子浓度，IL-2，4，5，10，13和IFN-γELISA Duoset kits从R&D Systems购得并按照生产商相关方法手册进行操作。

骨髓重建

用MACS磁珠分离野生型小鼠和ECM1基因敲除小鼠的CD4+细胞，通过尾静脉注射打入照光过((950rad))的C57小鼠体内。6-14周后检测重建效果。

动物免疫

将10μg OVA(Sigma)和1mg Alum混合在200μl PBS里，并在第1天和第14天分别对野生型C57BL/6和Dec2转基因小鼠进行免疫。到第21天，处死小鼠并取纵隔淋巴结细胞用OVA(100μg/ml)在体外重刺激培养4天。然后，收获上清以检测相关细胞因子的分泌。

免疫沉淀和Western印迹

细胞收集后置于冰上，用PBS洗涤一次后，加入含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 7.4)，137mM NaCl，10％(v/v)甘油，1％(v/v)NP-40，1mM焦磷酸，2mM Na₃VO₄，10mM NaF)(600μl/孔)裂解细胞。冰上裂解5-10分钟后，14,000rpm离心20分钟，收集上清于EP管中。取40μl上清与6×SDS样品缓冲液混合，作为全细胞裂解液(Whole cell lysates，WCL)备用。剩余上清中加入25％(w/v)BSA终浓度至0.2％，Protein A/G树脂(30μl)及相应的抗体。4℃孵育3小时后，3000rpm正反离心30秒收集树脂，用RIPA缓冲液洗3次后，将残液抽吸干净，之后加入20μl 1×SDS样品缓冲液，煮沸5分钟进行免疫印迹法印迹检测。

在SDS-PAGE胶中每孔上样10-20μl样品。电泳后转膜将蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后用TTBS洗膜一次，用5％(w/v)脱脂奶粉封闭膜1小时，用TTBS洗膜一次，将稀释后的一抗与膜室温杂交2小时或4℃过夜。用TTBS洗涤三次后将稀释后的二抗与膜室温杂交1小时，用TTBS洗涤后加入底物显色，暗室曝光。

ECM1的蛋白水平检测

1×10⁶T细胞收获后，用新鲜加入了各种抑制剂(1mM Na orthovanadate，1mMPMSF，10μg/ml Aprotinin，Leupeptin，胃酶抑素)的20μl裂解液(50mM HEPES[pH7.0]，1％NP-40，5mM EDTA，450mM NaCl，10mM Na pyrophosphate和50mM NaF)在室温下超声处理后，加入1％β巯基乙醇，100℃中放置5分钟。在SDS-PAGE胶中，每孔上样10μl样品。电泳后转膜将蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后用TTBS洗膜一次，用5％脱脂奶粉封闭膜1小时，用TTBS洗膜一次，将稀释后的一抗与膜室温杂交2小时或4℃过夜。用TTBS洗涤三次后将稀释后的二抗与膜室温杂交1小时，用TTBS洗涤后加入底物显色，暗室曝光。

小鼠过敏性哮喘模型的建立以及得病指标的检测

将10μg OVA(Sigma)和1mg Alum混合在200μl PBS里，并在第1天和第14天分别对野生型和ECM1基因敲除小鼠进行腹腔免疫。到第21天，用重悬于PBS的1％(w/v)的OVA喷雾重新刺激小鼠，共连续喷雾5天，每天30分钟。而后在最后一次喷雾24小时后，处死动物，外周血血清用于抗体IgG1，IgG2a和IgE的检测。一半的肺组织用于制作病理切片，另一半用PBS盥洗肺部得到盥洗液(BAL)。分离肺部纵隔淋巴结细胞，用100μg/ml OVA重新刺激，96小时后收集细胞上清，ELISA检测细胞因子浓度。另外分离的淋巴结和脾脏在计数后CD4和CD8染色，从而得到CD4⁺和CD8⁺细胞的数目。

³H增殖实验

纯化的CD4⁺T细胞在96孔板中用预包被anti-CD3抗体进行刺激，每孔种入2×10⁵的细胞，用200μl培养液培养72小时。当需要共刺激因子刺激细胞时，加入可溶性的anti-CD28抗体终浓度为1μg/ml。在细胞培养的最后12小时每孔加入1μCi的[³H]胸腺嘧啶，通过检测[³H]胸腺嘧啶的掺入而反应细胞的增殖状况。每个标本各三个复孔。培养结束后用细胞收集仪收集细胞并用闪烁计数仪检测[³H]胸腺嘧啶的掺入量。

细胞迁移实验

含重组趋化因子S1P(Sigma)500μl培养液加入24孔板(Corning Coster，Cambridge，MA)。Transwell culture inserts(Corning Coster)(5.0-um pore size)置于每个孔上。80ul T细胞悬液(5.0×10⁵个细胞/孔)加入上室中。在37℃，5％(v/v)CO₂孵育3小时，收集迁移至下室的细胞，光镜下计数。

实施例

实施例1、ECM1特异性高表达于II型辅助性T细胞(Th2)

本发明人分离C57BL/6小鼠的幼稚CD4+辅助性T细胞，在外加Th1或Th2条件下培养分化，在1～5天时间里收细胞进行Real-time PCR(图1a)和Western blot(图1b)检测ECM1的表达情况，发现ECM1特异性高表达于Th2细胞，并于第4，5天达到高峰。

本发明人又对Th细胞的5种不同亚型分别进行检测，也发现ECM1只特异性高表达于II型辅助性T细胞(Th2)(real-time PCR(图1c)，Western blot(图1d)和上清ELISA(图1e))。

其它免疫细胞的检测发现ECM1只少量表达于树突状细胞，在B细胞和CD8+T细胞中几乎没有表达(图1f)。

实施例2、ECM1被经典的Th2信号通路所上调

Th2细胞中，当把STAT6分子敲除(KO)后，ECM1表达也消失(图2a)。

如果通过逆转录病毒系统再转入持续性表达的STAT6(STAT6-CA)能回复ECM1(图2b)。

当本发明人用RNAi技术下调GATA3，ECM1表达也随之下调(图2c)。

为证明GATA3是否能直接结合在ECM1的启动子上，进行了CHIP实验。结果证明GATA3能直接结合在ECM1 5’端的4个GATA-box序列-1381～-1327、-940～-935、-708～-703、-42～-37(序列位点基于ECM1，GenBank登录号AAI45382.1的起始密码子上游)上，特别是-1381～-1327序列结合得最明显(图2d)。

实施例3、ECM1基因敲除小鼠显示体内Th2免疫应答降低

本发明人将C57BL/6小鼠经Co60照光摧毁造血系统，再过继转移野生型的和ECM1基因敲除型的小鼠骨髓细胞进行重构(骨髓细胞从野生型和ECM1基因敲除小鼠中分离出来，并且用CD4磁珠分离去掉CD4阳性的细胞的干扰，再用RPMI1640 500μl重悬1×10⁷骨髓细胞。受体老鼠用C57BL/6在致死吸收剂量8Gy(800rad)照光后24小时，将准备好的骨髓细胞从尾静脉注入体内。六周之后，取外周血白细胞验证骨髓细胞重构效果)。2个月后，小鼠免疫OVA和氢氧化铝佐剂。2个月后，再次用OVA喷雾激发哮喘。对肺泡灌洗液中的免疫细胞进行计数，用ELISA方法检测血清中的OVA特异性IgE，发现与对照小鼠相比，过继转移ECM1基因敲除小鼠骨髓细胞的小鼠肺泡灌洗液中的免疫细胞明显减少(图3a)，血清中的OVA特异性IgE也大大降低(图3b)。

肺组织切片显示肺部的炎症侵润明显减轻(图3c)，直接证明了降低ECM1的表达或活性能够改善或治疗过敏性哮喘。

进一步对脾脏、淋巴结的检测发现CD4⁺T细胞堆积明显(图3d)。

淋巴结细胞如果经体外重刺激96小时后，其分泌的Th2细胞因子并没有太大区别(图3e)。

这些结果提示，ECM1对Th细胞的细胞因子分泌没有太大影响，但影响它的迁移(促进细胞迁移出淋巴组织)。

实施例4、过继转移实验发现ECM1能控制Th2细胞的迁移

前述实施例3获得了来源于野生型(WT)和ECM1基因敲除型小鼠(KO)的Th1和Th2细胞。本发明人将Th1和Th2细胞经CFSE标记(将2.5×10⁷细胞重悬于含5um CFSE的40ml培液中，37℃孵育10分钟，加10％血清终止)后静脉注射给RAG-1基因敲除小鼠(RAG-1-/-)，24小时后检测血液，肠系膜淋巴结，腹股沟淋巴结中的CFSE阳性细胞，结果显示过继转移的CFSE阳性细胞大量堆积在脾脏，淋巴结等淋巴器官，而在血液中的数量反而减少(图4)。

实施例5、ECM1的缺失导致趋化因子受体S1P1和CCR4表达降低

本发明人利用Microarray方法检测ECM1缺失(KO)后导致的Th1细胞和Th2细胞内基因的一系列变化，再用realtime-PCR确认，发现趋化因子受体S1P1和CCR4表达降低(图5a)。

与S1P1表达相关的转录因子klf2也明显降低(图5b)。

如果在敲除基因的细胞中再次过表达ECM1(通过逆转录病毒实现ECM1过表达)，能够回复S1P1和klf2的表达(图5c)。

配体S1P体外诱导细胞迁移的实验证明，敲除ECM1基因的细胞迁移明显降低(图5d)。

将野生型的Th2细胞与ECM1基因敲除的Th2细胞共孵育后再分开分别做迁移实验(图5e)，前者能够恢复后者的迁移能力(图5f)以及S1P1和klf2的表达(图5g)。

实施例6、ECM1回复实验也证明能回复体内的Th2细胞迁移

野生型和ECM1基因敲除型小鼠Th2细胞分别过表达ECM1或者S1P1，klf2。步骤是：将过表达ECM1或者S1P1，klf2的逆转录病毒上清，在加入polybrane(6后用于感染已经用anti-CD3 and anti-CD28预激活了30个小时的CD4⁺T细胞。病毒感染时，培养板于室温在1800rpm条件下离心100分钟。然后，将培养板放入32℃的培养箱中12个小时。最后，将病毒上清更换为新鲜的细胞培养液。在如下诱导环境中朝着不同的方向进行分化7天：10ng/ml IL-4，10

anti-IFN-γ和10

anti-IL-12/23。

过表达的Th2细胞再过继转移(1×10⁷细胞悬浮于500ul培液中尾静脉注射小鼠)给RAG1敲除小鼠，24小时后检测血液和淋巴结中的细胞数，发现体内的Th2细胞迁移得到了回复(图6)。

实施例7、抑制剂的制备及功能验证

(1)小干扰分子

针对ecm1基因的核酸序列，设计了19bp的siRNA分子(该序列包含在MSCV-IRES-GFP质粒中)，靶序列如下：

CCTTGTAGAGCTGACCAAG(SEQ ID NO：1)。

给予Th2细胞上述设计的siRNA分子(通过制备发夹结构的载体，转入细胞，构建方法同GATA3 SiRNA的设计：将CCTTGTAGAGCTGACCAAG克隆到pBS/U6载体ApaI和EcoRI酶切位点中。接着，分别从pEGFPc1(Clontech)的BglII和XhoI酶切位点中切下EGFP编码片段和从pBS/U6 BamHI和EcoRI的酶切位点中切下在U6启动子下表达ECM1 siRNA的元件，最后将这两部分克隆进MSCV的相应位点(即BglII和XhoI，BamHI和EcoRI)中以获得MSCV-EGFP-ECM1 siRNA载体。

检测细胞内ECM1表达水平，结果发现蛋白表达被抑制到本底水平，见图7。

(2)抗体

将全长ECM1蛋白常规方法免疫兔子，获得ECM1蛋白的多克隆抗体。

体外实验发现，该抗体结合ECM1的特异性良好，用其检测ECM1 SiRNA的效果发现抑制ECM1活性显著，如图7所示。

实施例8、药物筛选

取正常小鼠的Th2细胞，该细胞可内源性表达ECM1蛋白。将该种细胞作为用于筛选防治哺乳动物Th2介导的过敏性疾病的药物的细胞模型。

测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；

对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。

在处理后适当时间，采用Real-time PCR和Western blot方法测定所述细胞的ECM1的表达。如果与对照组相比，测试组中的ECM1蛋白的表达显著下降30％以上，则说明该候选物质是潜在的防治哺乳动物Th2介导的过敏性疾病的物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种细胞外基质蛋白1的抑制剂的用途，用于制备防治过敏性哮喘的组合物；所述的细胞外基质蛋白1的抑制剂是干扰分子，其选自：

序列如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸，或包含SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸序列的表达载体；或

序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸，或包含SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸序列的表达载体。

2.一种防治过敏性哮喘的干扰分子，选自：

序列如SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸；或

序列如SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸。

3.一种防治过敏性哮喘的抑制剂，所述抑制剂为重组表达载体，其含有：

SEQ ID NO:2所示的寡核苷酸序列；或

SEQ ID NO:1所示的寡核苷酸序列；

4.一种筛选防治过敏性哮喘的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达细胞外基质蛋白1的体系；和

(2)检测所述体系中细胞外基质蛋白1的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低细胞外基质蛋白1的表达或活性，则表明该候选物质是防治过敏性哮喘的潜在物质；

所述的体系是体外细胞体系。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的体系中还表达GATA3或STAT6蛋白，所述方法还包括：检测所述体系中GATA3或STAT6蛋白的表达或活性；

其中，若所述候选物质可降低GATA3或STAT6蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是防治过敏性哮喘的潜在物质。