CN1441843A - 细胞外基质蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明描述用于防止炎症，更具体地用于在患有类风湿性关节炎的患者体内诱导T细胞对其耐受的蛋白。

Description

细胞外基质蛋白

本发明涉及分离编码新的细胞外基质蛋白质，即SCIM-1的多聚核苷酸。编码的蛋白质及其衍生物用于诊断、预防和治疗疾病状况。它们可用作调节剂，治疗自身免疫病，更具体为类风湿性关节炎。

免疫系统的基本功能是保护个体免受带有外来，即非自身抗原的病原体的入侵。为了安全有效地实现这个功能，必然需要机制来辨别外来抗原和源自个体身体的自身抗原。该自身-非自身辨别过程的失效，即对自身抗原免疫耐受的丧失，可能引起对自身抗原的免疫反应而导致自身免疫病，并伴随组织损伤和器官功能丧失。

自身免疫病是人类卫生保健的重要问题。一些自身免疫病可能是导向一种抗原或抗原复合物的免疫学过程的结果，而在其他自身免疫反应中可能涉及存在于多种器官中的许多种抗原。一些证据显示自身免疫病的病理学涉及免疫系统。首先，个体形成自身免疫病的机会与他们的遗传背景密切相关：编码主要组织相容性复合体(MHC)II类分子的基因表现出与疾病易感性有重大的遗传关联，而MHC II类分子将(自身)抗原呈递给识别MHC-肽复合物的应答T细胞。其次，免疫系统细胞，比如单核细胞/巨噬细胞和T细胞能渗透进入目标器官。其三，自身免疫病患者的T细胞应答于潜在相关的自身抗原而激增。其四，对自身免疫性动物模型的研究已明确证明免疫系统细胞，比如单核细胞/巨噬细胞和T细胞与疾病活动的诱导和表达有关。

像类风湿性关节炎(RA)这样的疾病能说明可能在任何自身免疫病的情况下发生的免疫病理学。RA自身是慢性多系统的疾病，普通临床显示为持续发炎的滑膜炎，并伴有滑膜细胞增殖、血管翳形成、软骨降解和骨侵蚀，并且最终关节变形导致功能丧失。

目前对免疫系统产生不合需要的并且有害的炎症反应的自身免疫紊乱，比如RA的治疗方法是不够的。治疗集中于减轻自身免疫病的症状而不是针对其原因。大多数用于自身免疫病治疗的药品，比如类固醇类和非甾类抗炎症化合物，是非特异性的而且具有显著的毒副作用。由于自身免疫病是慢性状况，需要延长用药，这就尤其存在问题。

抗原驱动、无毒性的免疫调节疗法为非特异的免疫抑制提供了非常诱人的另一种选择。抗原特异的疗法包括对患者用靶(自身)抗原或者由(自身)抗原衍生的合成的T细胞反应肽进行治疗。这些合成的肽应答于T细胞(自身)抗原决定簇，可用来诱导特异的T细胞对肽本身和(自身)抗原的耐受。有控制的使用靶(自身)抗原可对免疫系统进行非常有效的脱敏作用。免疫系统的脱敏或免疫耐受基于长期观察到的下述现象：人们发现被投喂或是已吸入抗原或抗原决定簇的动物当由全身路线引入上述抗原或抗原决定簇时较不易形成对其的全身免疫反应。

关于应用抗原进行免疫疗法，最近报导人类软骨(HC)gp-39蛋白可对关节炎治疗有效诱导全身性免疫耐受(Joosten等人，Arthritis Rheum.，43：645-655，2000)。在小鼠中一但鼻内给药，HC gp-39阻碍II型胶原蛋白诱导的关节炎的形成。治疗结果是疾病活性和关节毁坏都得到改善。

在寻找与自身免疫病比如类风湿性关节炎相关的蛋白质中，我们确定了新基因SCIM-1(滑膜/软骨炎症连锁信使1)。由SCIM-1mRNA编码的蛋白质没有前人报导。鉴定SCIM-1后，已确定在公开领域数据库中只有作为表达序列标签(ESTs)的该mRNA的片段存在。通过公开的ESTs不可能重建已鉴定的SCIM-1 cDNA。

已发现SCIM-1蛋白最好的同源物是具有EGF样结构域的fibulin-1，后者是含有9个EGF样结构域的细胞外蛋白。Fibulin-1能将血管壁的胞外基质和血小板上的整合蛋白-αIIbβ3通过与纤维蛋白原的反应桥连起来(Godyna等人，Blood，88：2569-2577，1996).通过其EGF样结构域fibulin-1与巢蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原、NOVH、聚集蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖结合(Tran等人，J.Biol.Chem.272：22600-22606，1997；Perbal等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：869-874，1999；Barth等人，Matrix Biol.，17：635-646，1998)。Fibulin-1的高表达似乎干涉到肿瘤形成和入侵(Qing等人，Oncogene，15：2159-2168，1997)。可以想象包含其EGF样结构域中RGD基元的SCIM-1也具有相似的功能。

根据Sarkissian和Lafyatis的报导(J.Immunol.162：1772-1779，1999)，SCIM-1和整合蛋白间推测的相互作用可能与RA相关，因为比如源自RA患者，成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)的增殖除需要促有丝分裂细胞因子，比如PDGF之外，还需要由结合整合蛋白的细胞外基质蛋白提供的信号。Wang等人(Arthritis Rheum.，40：1298-1307，1997)提出整合蛋白αv、α4和α5在IL-1β激发的RA-FLS关节软骨入侵中是必需的。

SCIM-1基因似乎在滑膜和软骨组织中的表达相对较高。根据部分cDNA序列，从人类软骨细胞中分离到了全长的cDNA。检测多种组织northern印迹表明SCIM-1在健康人类供体的初级软骨细胞中有表达，而在大脑和肺中也观察到了一些表达，尽管这些组织中SCIM-1的mRNA似乎长度不同。在其他人类组织比如心脏、胎盘、肝脏、骨骼肌、脾脏、肾脏和结肠，以及单核细胞、动脉内皮细胞和培养的滑膜成纤维细胞的细胞系中观察到只有低水平表达或不表达。

SCIM-1表达似乎确实与分化的软骨细胞表型正相关，因为只在初级软骨细胞中检测到了表达，而在经SV40转化的人类初级软骨细胞中没有。此外，资料表明SCIM-1基因在人类软骨细胞中的表达在RA相关的细胞因子TNFα和ILβ存在时得到提高。在软骨细胞中，SCIM-1基因的转录形成2.7kb编码有653个氨基酸的蛋白质的mRNA。根据多种组织northern印迹数据以及Incyte和公开领域数据库的序列，已发现SCIM-1转录物在关节、大脑和肺组织中经历不同的剪接过程。

根据预期的蛋白质基元，人们认为SCIM-1是细胞外基质蛋白质，或是定位于软骨细胞、滑膜细胞和其他可能种类细胞表面的蛋白质。

(自身)免疫病(比如RA)的主要问题是免疫系统对其发生有害反应的精确的靶点或抗原大多未知，暗示仅由抗原特异的方式调节疾病可能行不通。

然而，如果能在无需知道(自身)免疫反应中作为靶点的抗原的情况下运用抗原驱动的、无毒形式的免疫调节疗法，这将会具有重要的优势。这样的抗原驱动的疗法会涉及用预计在自身免疫过程中释放或产生的抗原来产生抗原特异调节细胞。该抗原能在炎症或是组织破坏时获得。如果在自身免疫病中，局部产生的自身抗原应该能活化或重新活化由这种抗原诱导的调节细胞。

为了有效地利用耐受诱导疗法来治疗T细胞介导的软骨破坏，极需要鉴定T细胞反应(多)肽，它能减少患者对激活负责炎症反应过程T细胞的自身抗原的敏感性。

本发明的目的是提供能诱导全身性免疫耐受的(多)肽，尤其是特异的T细胞耐受的(多)肽，该耐受优先针对于患有T细胞介导软骨破坏的患者中的有关的(responsible)软骨抗原。已经发现SCIM-1满足上述要求并能作为调节免疫系统的有效耐受原。

本发明中系统免疫耐受诱导的过程应理解为：抗原呈递细胞(APC)激活抗原特异淋巴细胞，而使淋巴细胞获得产生抗炎症细胞因子的状态。抗炎症细胞因子可以是例如IL-4、IL-10和/或TGF-β。由APC带来耐受的淋巴细胞能将其抗炎症状态施加于身体的其他部位，比如正在发炎的部位。

免疫系统保护个体免于外来抗原的侵害，并在暴露于外来抗原时通过活化特异细胞如T-和B-淋巴细胞并产生可溶的因子比如白细胞介素、抗体和补体因子来作出反应。引起免疫系统反应的抗原通过抗原呈递细胞(APCs)降解且抗原片段暴露于细胞表面，与II类主要组织相容性复合物(MHC)糖蛋白相联系。MHC糖蛋白-抗原-片段复合物呈递给T细胞，T细胞依靠其T细胞受体识别与它自身结合的MHC II类蛋白相结合的抗原片段。T细胞从而活化，也就是增殖和/或产生白细胞介素，受攻击时导致扩增导向抗原的活化的淋巴细胞。(Grey等人，Sci.Am.，261：38-46，1989)。

自身抗原也持续的得到处理和作为抗原片段由MHC糖蛋白呈现给T细胞(Jardetsky等人，Nature，353：326-329，1991)。自我识别从而是免疫系统固有的。在正常情况下免疫系统对自身抗原具有耐受性并且避免由这些自身抗原活化免疫反应。当丧失自身抗原耐受时，免疫系统对一或多种自身抗原活化，导致活化自身反应性的(autoreactive)T细胞，有时还产生自身抗体。该现象被称为自身免疫性。通常免疫反应具有破坏性，即破坏侵入的外来抗原，所以自身免疫反应便能造成身体自身组织的破坏。

因而可以清楚知道SCIM-1蛋白的片段会由APC表达，且因此SCIM-1蛋白的片段能激发免疫反应。具有相似功能的其他种类的蛋白或至少与人类SCIM-1蛋白结构非常接近的蛋白也可能表现同样的耐受原效应。因此，本发明也包括同源多肽及其部分。

根据本发明的蛋白包括含有SEQ ID NO：2的多肽以及具有70％相似性，优选90％相似性、更优选95％、98％和最优选99％相似性的多肽。并且这些多肽中仍然能具有耐受原效应的部分也包含在本发明中。这些部分本身可能就具备功能，例如在溶解状态中或者通过生物技术或化学合成与其他多肽相连得到的嵌合蛋白。

这里用到的术语相似性如NCBI-BLAST 2.0.10中所定义[Aug-26-1999](Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)。

SCIM-1蛋白或同源多肽的片段理解为蛋白的亚序列。这些亚序列能调节淋巴细胞的功能。它们优选具有如下免疫调节功能特征：i)这些多肽可以同疾病相关的MHC分子结合，后者优选HLA-DRB1^*0101、DRB1^*0401、DRB1^*0404、DRB1^*0408、DRB1^*0405、DQB^*0301、DQB^*0302；以及ii)多肽必须能在人体内激发T细胞反应，优选自身免疫病患者，更优选在RA患者中。该反应可以由例如体外T细胞增殖实验或检测T细胞细胞因子产量的实验来进行测量(例如ELISA或ELISPOT)(Coligan等人，Current Protocolsin Immunology.John Wiley & Sons Inc.，1998)。优选用SCIM-1(多)肽进行免疫接种之后，该多肽必须也能被含上述相关的人类MHC II类分子和人类CD4的转基因动物体中的T细胞识别。

只要亚序列包含有被相关MHC分子识别的抗原决定簇，则这些亚序列的长度并不重要。优选这些多肽氨基酸序列长度为9-55氨基酸残基。优选多肽含氨基酸9-35，特别是含9-25个氨基酸残基。更优选多肽有9-15个氨基酸残基。高度优选的多肽的氨基酸序列为13和14个残基。

可以通过在上述序列中删除、替换、插入、颠换或增加一到几个氨基酸或者通过整个序列上氨基酸的差异构成序列中可以发生的变异，尤其在小肽中。已描述了预计不会从本质上改变生物学和免疫学活性的氨基酸替换。在相关氨基酸间或是在演化中常见的氨基酸替换有：Ser/Ala，Ser/Gly，Asp/Gly，Asp/Asn，Ile/Val及其他(见Dayhof，M.D.，蛋白序列和结构图集，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.，1978，第5卷，第3期增刊)。根据该信息Lipman和Pearson开发了快速而灵敏的蛋白质比较(Science，227：1435-1441，1985)和测定同源多肽间功能相似性的方法。

这些多肽的多聚体，如根据本发明的多肽的二聚体或三聚体也在本发明的范围内。根据本发明的多聚体可以是由多条相同肽组成的同聚体，也可是由不同肽组成的异聚体。

本领域技术人员可清楚地了解可在该(多)肽任意一端或两端延长而该肽仍能发挥相同的免疫功能。延长的部分可以是与天然蛋白序列相似的氨基酸序列。但是(多)肽也可用非天然序列延长。很显然该(多)肽并不需要发挥其原有功能而这样可能没有活性但仍能执行其根据本发明的免疫功能。根据本发明的(多)肽可以与MHC分子连接，这样结合槽就由该肽占据。弹性连接分子，优选也由氨基酸序列组成，可以连接该肽。MHC分子不需要有稳定区并可以只由其可变区组成，能直接互相连接或通过弹性连接分子连接。这种复合物的优势在于它能以可溶的状态存在并可直接由T细胞识别。

因此，根据本发明，类似于MHC II类所限制的T细胞抗原决定簇的(多)肽、该抗原决定簇出现于包含多肽SEQ ID NO：2的抗原或其包含这些抗原决定簇的片段中，适用于在哺乳动物，特别是人类中治疗来诱导对上述抗原的系统免疫耐受，患者患有淋巴细胞或T细胞介导的软骨破坏，如关节炎，尤其是类风湿性关节炎。该疗法可选同其他药剂一起使用，如DMARDs(疾病调节抗风湿病药物，例如磺胺吡啶、抗疟疾药物(氯喹，羟基氯喹)可注射或口服的黄金(gold)、甲氨喋呤、D-青霉胺、咪唑硫嘌呤、环孢菌素A、霉酚酸盐)，NSAIDs(非甾类抗炎药物)，皮质类固醇或其他已知可以影响自身免疫病患者病情进展的药物。

根据本发明的多肽还可以用于调节淋巴细胞，这些细胞对同上述抗原即包含SEQ ID NO：2多肽的蛋白质或其部分处于相同组织中的其他抗原反应。通过诱导抗原特异性T细胞耐受，自身免疫紊乱可以通过系统免疫耐受治疗。更通常的情况下，要调节的细胞是造血细胞。通常要具有耐受原的功能，多肽就必须满足至少两个条件，即它必须具有免疫调节能力以及它必须在局部表达，通常作为一个大蛋白质的部分。

因此，本发明为患有炎症自身免疫疾病的患者提供了治疗方法，通过施用含有根据本发明的(多)肽的药物制剂实现。该(多)肽含有可被自身反应的T细胞识别并可激活该T细胞的T-细胞抗原决定簇。这些T细胞存在于例如炎症患者的血液中。这些患者可能患有像突眼性甲状腺肿、青年关节炎、初级肾小球肾炎、多关节炎、骨关节炎、Sjgren’s综合征、重症肌无力、类风湿性关节炎、Addison’s病、初级胆硬化、葡萄膜炎、全身红斑狼疮、肠炎疾病、多发性硬化或糖尿病这类的病征。因而根据本发明的多肽可用于药物制备以防治炎症疾病。施用SCIM-1可以诱导系统免疫耐受。更具体地，该多肽可用于药物制备，治疗患有炎症疾病，优选免疫细胞介导的软骨破坏的患者，诱导特异的免疫耐受。所说免疫细胞优选为T细胞。而最优选的疾病为关节炎，更优选类风湿性关节炎。

用根据本发明的多肽进行自身免疫病的治疗利用了系统免疫耐对不相关但是共定位的抗原所诱导的事实。调节细胞以抗原特异方式分泌如细胞因子这样的多效性蛋白质，它们可以降低免疫反应水平。

根据本发明的多肽可通过重组DNA技术制备。

本发明提供编码根据本发明的蛋白或多肽的DNA序列。

本发明还包含完整的mRNA序列，其部分序列在SEQ ID NO：1中给出。完整编码的DNA序列在SEQ ID NO：1核苷酸59-2017中出示。此外，为适应密码子可变性，本发明还包括编码与这里公开的氨基酸序列相同的序列。除其等位基因和物种变异体之外，编码个别具有相同免疫功能的多肽的部分编码序列也是本发明的部分。有时，基因在特定组织中以剪接变异体表达，形成5’或3’端改变了的mRNA或是包含额外的外显子序列。这些预计序列以及由这些序列编码的蛋白质具有相同或相似功能，也是本发明的部分。

具体地，SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18代表特异的剪切变异体，与SEQ ID NO：1序列在其核苷酸1852下游部分序列不同。该剪切变异体的翻译产生SEQ ID NO：2蛋白质的截短形式，分别由SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21出示。后面这几种核酸的编码序列位置分别为59-1969、59-1912和59-1894，并且都含有SEQ ID NO：2中的前598个氨基酸。完全的蛋白质优选为成熟蛋白质。其信号序列很可能为19个氨基酸但长度可有微小的不同。

不应将这里提供的序列信息狭义的解释为要求包含错误鉴定的碱基。这里公开的特异序列可以很容易地用于分离完全的基因，而全基因接下来可以很容易地进行进一步的序列分析从而鉴定测序的错误。

因而，本发明还提供了分离的编码SCIM-1及其截短版本或其片段的多核苷酸。

根据本发明的DNA可从cDNA得到。组织优选为人源。优选，核糖核酸从胎儿大脑、胎儿肝脏、胎儿脾脏、胎盘或其他组织中分离得到。或者，编码序列可以为基因组DNA或由DNA合成技术制得。多聚核苷酸也可为RNA形式。如果多聚核苷酸为DNA，则可为单链或双链形式。而单链可能为编码链或是非编码链。

本发明进一步涉及有微小变异或多态位点(polymorphicsites)的多聚核苷酸。具有微小变异的多聚核苷酸编码的多肽保留与天然、成熟的蛋白质相同的生物功能或活性。多态位点可用于诊断目的。通过在优选的高严紧条件下杂交可以鉴定这些多聚核苷酸。根据本发明术语“严紧”指在65℃下采用1×SSC、0.1％SDS的洗涤条件；高度严紧的条件指SSC减量至0.3×SSC，更优选的为0.1×SSC。优选前两步洗涤相继进行两次，每次为15-30分钟。如果需要在高度严紧条件下洗涤，则再用0.1×SSC进行15分钟的洗涤。杂交可以在如下条件：pH7.5的0.5M磷酸盐缓冲液/7％SDS，65℃，过夜进行。

或者，上面提到编码具有相同免疫功能多肽的多聚核苷酸的片段也收录在本发明中。同时从这些蛋白质衍生的编码的蛋白质或多肽也是本发明的组成部分。

将编码根据本发明的蛋白质、多肽、所述多肽多聚体或嵌合多肽的核苷酸序列插入到表达载体上。适当的表达载体包含必需的复制和表达控制区。表达载体可以在宿主细胞中表达。合适的宿主细胞有例如细菌、酵母细胞和哺乳动物细胞。这些是本领域熟知的技术，参见Sambrook等人所著，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，1989。

根据本发明(更小的)(多)肽也可以通过众所周知的有机化学肽合成方法来制备，如在J.Amer.Chem.Soc.85：2149(1963)和Int.J.Peptide Protein Res.35：161-214(1990)中描述的固相肽合成法。

通过C-和/或N-末端修饰可以使(多)肽稳定，减少外肽酶催化的水解作用。修饰包括有：C-末端酰基化(例如：酰基化＝Ac-肽)、N-端引入氨基(例如：肽-NH₂)、酰基化和氨基引入的结合(例如：Ac-肽-NH₂)以及引入D-氨基酸替代L-氨基酸(Powell等人，J.Pharm.Sci.，81：731-735，1992)。

其他修饰集中于防止外肽酶的水解作用。这类修饰的例子有：引入D-氨基酸替代L-氨基酸，引入修饰了的氨基酸，肽内环化作用，引入修饰后的肽键，如减少的肽键ψ[CH₂NH]和peptoid(N-烷基化甘氨酸衍生物)(Adang等人，Recl.Tray.Chim.Pays-Bas，113：63-78，1994和Simon等人，Natl.Acad.Sci.USA，89：9367-9371，1992)。

根据本发明耐受原肽可通过包含以下步骤的方法得以鉴定：

a)将编码SCIM-1肽片段的DNA片段引入到合适的宿主细胞中；

b)在允许所引入DNA序列表达的条件下培育宿主细胞；

c)将表达产物与淋巴细胞接触，并

d)确定淋巴细胞的活性。

优选，如通过将表达产物施用于动物而使表达产物与淋巴细胞在体内接触。淋巴细胞的活性可以比如通过对抗炎细胞因子的检测来测量。

或者，在b步骤中宿主细胞的表达产物可以先分离，接下来接触抗原呈递细胞和T细胞，然后可以确定T细胞的活性。

很显然在上述描述的筛选方法中被检测的肽可以是化学合成的。

得到鉴定的肽可用于含肽与药学可接受载体混合物的药物组合物的配制。

根据本发明，患有T细胞介导关节软骨破坏的患者可以用包含本发明的一或多种肽及药学可接受的载体的治疗组合物来进行治疗。根据本发明该药物组合物的施用能诱导系统免疫耐受，特别是这些患者特异的自身活性的T细胞的耐受，该耐受针对于疾病发作时关节软骨种的自身抗原性蛋白质以及其他显示已知的能结合MHC II类的T细胞抗原决定簇的自身抗原，该抗原决定簇为根据本发明的一或多种肽的氨基酸序列所表征或模拟。诱导的耐受从而导致疾病发作的关节软骨中炎症反应的减轻。

根据本发明(多)肽和免疫抑制药物的非特异抑制效应相比较的优势在于它们对自身反应性的T细胞有特异的作用效应，因此使免疫系统其他组分保持完好。

通过施用高或者低剂量根据本发明的肽可以获得系统免疫耐受。肽的量除了取决于患者基本健康条件和饮食以外，还依赖于用药途径、用药时间、患者年龄。

一般而言，每公斤体重的肽剂量为0.01至10000μg，优选为0.05至500μg，更优选施用的肽量为0.1至100μg。

本领域技术人员熟知药学可接受的载体包括有：如无菌盐，乳糖，蔗糖，磷酸钙，白明胶，糊精，琼脂，果胶，花生油，橄榄油，芝麻油和水。如果需要包埋在脂质体中，其他载体可以是例如MHCII类分子。

另外根据本发明的药物组合物可以包含一或多种佐剂。合适的佐剂其中包括：氢氧化铝，磷酸铝，amphigen，生育酚，单磷脂酰甘油脂A(monophosphenyl lipid A)，胞壁酰二肽和皂角苷比如QuillA。优选地，用于根据本发明的耐受疗法的佐剂为如霍乱毒素B-亚基或carbomers的粘膜佐剂，它们可以和粘膜上皮结合。佐剂的量取决于佐剂自身的特性。

另外根据本发明的药物组合物可含一或多种稳定剂，比如例如包括山梨糖醇，甘露醇，淀粉，蔗糖糊精(sucrosedextrin)和葡萄糖的碳水化合物，例如清蛋白或酪蛋白之类的蛋白以及像碱性磷酸盐这样的缓冲液。

适当的用药途径有：比如肌内注射、皮下注射、静脉内注射或腹膜腔内注射、口服和如喷雾剂的鼻腔施用。

几种鼠模型表现出适于进行对(多)肽调节(自身)免疫反应的能力的测试，这些模型比如：在小鼠中由胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)，大鼠中的佐剂关节炎，小鼠的实验性(experimental)过敏脑脊髓炎和小鼠或转基因小鼠中的非肥大(non-obese)糖尿病(NOD)。在这些模型中抗原可由静脉内，腹膜腔内，口内或鼻腔内施用(Liblau等人所著的综述，Immunol.Today，18：599-603，1997)。为了利于这些模型的结果读出，增加置信区间就很重要。根据本发明已经发现在关节炎模型中的发病率和临床得分可以通过与将关节炎的最初引发物如CIA中的II型胶原蛋白和从细胞外基质蛋白质聚蛋白聚糖衍生的肽结合而得到提高。尽管也可能进行分别的施用，该肽可能优选与原始引发物同时施用。

SCIM-1或根据本发明的肽也都很适合用于诊断方法来检测参与慢性关节软骨炎的活化的自身反应性的T细胞的存在。

根据本发明该诊断方法包含以下步骤：

a)从个体血样中分离外周血液单核细胞(PBMC)；

b)在适合的条件下培育上述PBMC；

c)在自身抗原或其一或多种根据本发明的衍生肽存在时孵育上述PBMC培养物，并且

d)检测T细胞的反应，比如增殖反应，表明个体中存在活化的自身反应性的T细胞。

假如要通过测量自身反应性的T细胞的增殖反应来检测反应时，反射性同位素如3H-胸苷的整合便是增殖反应的量度。PBMC中存在的自身反应性的T细胞的反应也可由通过用细胞因子特异的ELISA测量细胞因子的释放，或是用⁵¹Cr(铬)释放测量细胞毒性来进行检测。另一种检测方法是通过FACS分析测量活化标记的表达量，例如Il-2R的。因而包含一或多种根据本发明的肽和合适的检测剂的诊断组合物也形成本发明的一部分。取决于检测的类型，检测试剂可以为放射性同位素、酶或是对细胞表面或活化标记特异的抗体。

同样含根据本发明的一或多种肽的测试试剂盒也在本发明的范围内。这些测试试剂盒适于用于根据本发明的诊断方法。

因此本发明提供了检测方法，检测与SCIM-1反应的自身攻击性的T细胞是否存在于患有T细胞介导的软骨破坏比如关节炎，尤其是类风湿性关节炎患者的体内。如果存在SCIM-1特异的T细胞，则用包含SCIM-1或是根据本发明的肽又或其组合物使这些T细胞的耐受能延迟或抑制关节炎的发展。

下面的实施例是对本发明的说明，决不能解释为对本发明范围有任何限定性。

图例

图1

人类软骨cDNA的RT-PCR，使用SCIM-1和GAPDH特异的寡核苷酸。图中出示了在健康软骨(膝盖，男性；交通事故；1泳道)和来源于4位RA患者的软骨(膝盖/髋部，3位女性和一位男性；2-5泳道)中对SCIM-1基因表达的检测。对相同的4个RA样品进行的GAPDH基因表达检测在7-10泳道中出示。6泳道为平行进行的100bp间隔阶梯的DNA片段长度标记(Gibco-BRL)(电泳中道的主条带对应长度为600bp)。

图2

SCIM-1探针(SEQ ID NO：1中核苷酸序列号560-1048)在特制关节Northern印迹(上方栏)上的杂交。所代表的人类细胞/组织：U937单核细胞+PMA-离子霉素(1泳道)，HAEC内皮细胞-/+TNFα(分别对应2-3泳道)，SCRO14.SF初级滑膜成纤维细胞+TNFα(4泳道)，PCG SV40.04转化的软骨细胞-/+TNFα(5-6泳道，分别对应)，和初级软骨细胞-/+TNFα(分别对应7-8泳道)。每泳道加入1-2μg多聚(A+)RNA。作为对照用³²P标记源于人类β-肌动蛋白基因的cDNA探针检测该印迹(下面的栏)。

图3

由4个不同SCIM-1 mRNA种类，即变异体A-D编码的不同的羧基末端。编码的C-末端已指出并且氨基酸用单字母代码表示。序列从氨基酸599开始有所不同。变异体A-D编码的氨基酸序列分别由SEQID NO：20-23表示，并且对应的核酸分别由SEQ ID NO：16-19表示。

图4

在转染的CHO细胞中检测SCIM-1变异体A/His6的表达。转染pNGV1(1泳道)或pNGV1.SCIM1.变异体A(His6)(2和3泳道)的CHO细胞培养物上清夜的样品在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离然后进行Western印迹。含有(His6)尾部的蛋白质可以通过抗(His6)-标签的单克隆抗体(Dianova GMBH)检测。4泳道(M)为蛋白质分子重量标记。

实施例

实施例1：SCIM-1基因的鉴定

在LifeSeq数据库(Incyte Pharmaceuticals)能得到的cDNA文库根据其基因内容分组，从而定义代表RA相关组织比如关节组织的专门组织类别。cDNA文库间的距离用平方欧氏几何距离测量法(squared Euclidian distance measurement)计算，而且结果利用未加权的平均连接方法(unweighted average linkage method)分组成树形(Fry 1993，Biological Data Analysis，牛津大学出版社，纽约)。两个所得组包含5个分别从非肿瘤的滑膜或软骨组织衍生来的cDNA文库。每个滑液cDNA文库中能得到4038到5627序列反应的数据，而每个软骨cDNA文库中能得到1554到7231的。检测这些序列数据来寻找其表达相对限于这些组的基因。两部分cDNA片段均由重叠的Incyte-est序列和SEQ ID NO：1的部分组成，经鉴定确定为阳性结果。由于它们的表达模式相似，因此假定它们衍生于同一基因。

实施例2：SCIM-1基因在RA软骨中的表达

SCIM-1基因在患病组织中的表达通过在cDNA上用SCIM-1特异的寡聚核苷酸(SEQ ID NO：3，5’TTGCCAATTACGCCTACGGT和SEQ IDNO：4，5’CCTGGTCATTGTCAAAGTCGG)进行RT-PCR得到检测，该cDNA源于4个RA患者和一个健康捐献者的软骨样品。关节炎软骨通过膝盖的关节替换手术得到。从软骨中酶解分离得到软骨细胞(Cornelissen等人，1993，J.Tiss.Cult.Meth.15：139-146)，并从中使用Trizol(Gibco-BRL)和RNAzol B(CamproScientific)分离RNA。以1μg总RNA使用SuperscriptTMII(Gibco-BRL)在20μl总体积下进行cDNA合成。在对SCIM-1和作为正对照的持家基因GAPDH的RT-PCR中，每反应使用0.5μl cDNA。PCR在Perkin Elmer 9600中进行：94℃5分钟1个循环，94℃ 30秒/55℃ 30秒/72℃1分钟35循环，72℃5分钟1循环，在25μl总体积中加入50ng/引物、200μM dNTPs、2.5u Taq聚合酶(Pharmacia，#27-0799)。对GAPDH特异的寡核苷酸为SEQ IDNO：5(5’CCCTTCATTGACCTCAACTACATGG)和SEQ ID NO：6(5’GGTCCACCACCCTGTTGCTGTAGCC)。在琼脂糖凝胶上分析PCR样品(图1)。1-5泳道清楚地给出了具有预期长度的来自于健康软骨(宏观地)和4个关节炎患者的SCIM-1 cDNA扩增产物的信号，同时GAPDH特异扩增信号与RA cDNA制备物具有相同的数量级(7-10泳道)。RT-PCR数据表明SCIM-1基因在患病组织，即在检测的4个RA患者中，所有4个遭受疾病的膝盖软骨中表达。SCIM-1基因确实有可能在至少相当大比例的RA患者的患病关节软骨中表达。因此，可以预计SCIM-1蛋白在RA患者患病的软骨中合成。

实施例3：SCIM-1基因在关节相关细胞中的表达

为了测定SCIM-1基因表达的组织分布，使用SCIM-1cDNA片段为探针进行多种组织Northern印迹检测。通过使用Ready-To-Go珠(Pharmacia)和³²P-α-dCTP(Amersham)，对SCIM-1cDNA nt(560-1048)和(1983-2427)(编号对应SEQ ID NO：1)的片段随机引导标记产生探针。标记的探针在1ml的Sephadex G50介质柱上与游离核苷酸分离，杂交混合物(0.5M磷酸盐缓冲液pH7.0，7％SDS，1mMEDTA)中加入约3×10⁶cpm/ml的标记探针，并且在约65℃左右进行16小时的Northern印迹杂交。65℃下用0.5×SSC洗涤印迹，并将印迹在STORM840^TM磷光屏下曝光。与SEQ ID NO：1相关的nt560-1048探针与大脑中约2.4kb的mRNA和肺中约3.0kb的mRNA(分别为Clontech人类多种组织Northern印迹H2和H1，cat#7759-1和7760-1)杂交信号弱。除了在初级软骨细胞中有约2.6kb的明显信号外(图2，上方栏7-8泳道)，在其他关节相关的培养细胞中没有观测到信号。根据以作为持家基因对照(图2，下方栏)的β-肌动蛋白杂交信号的修正，SCIM-1 mRNA的信号似乎由TNFα(24小时，10ng/ml)提高了3-4倍。利用另一SCIM-1探针，即nt(1983-2427)，在Clontech多种组织Northern印迹H3(cat#7767-1)和H2中没有观测到信号。用探针nt(1983-2427)在初级软骨细胞RNA上杂交产生与用探针nt(560-1048)(未出示)相同的2.6kb mRNA的信号，并包括TNFα对SCIM-1基因表达3-4倍的上调。用来源于有或未用IL-1孵育的软骨细胞的探针与cDNA微阵列杂交结果表明SCIM-1的表达有依赖于IL-1的3倍上调效应。同样用探针nt(1983-2427)对可能代表去分化细胞的SV40转染的人类细胞进行Northern印迹，没有观察到信号存在。推断如下：i)SCIM-1基因表达显示有限的组织分布；ii)在大脑、肺和软骨细胞中检测到的不同长度的mRNA可能代表剪接变异体；而且iii)促炎症因子如TNF和IL-1增强SCIM-1的基因表达。

实施例4：SCIM-1全长cDNA的分离

在TNFα激活的初级人类软骨细胞1μg的总RNA产生的RACE-cDNA上用SCIM-1特异的寡核苷酸通过SMART-RACE(#K1811-1，Clontech)鉴定了人类SCIM-1的完整编码序列。软骨细胞从健康软骨(膝盖)中由酶法(胶原酶)分离得到，单层培养(Hamm’s/F12，10％FCS)生长约3周后用10ng/ml TNFα激活24小时。寡核苷酸是根据从Incyte数据库中鉴定的两个基因片段(实施例1)的序列而设计的。对第一个基因片段的引物为：5’RACE引物SEQ ID NO：7(5’GGGTCCATTGTACCCCGCGACGACG)和嵌套引物SEQ ID NO：8(5’CTCAAAGTCCCCATCATGGTCC)，3’RACE引物SEQ ID NO：9(5’CTCAGCCGCTGTCCGTCTTCCGG)和嵌套引物SEQ ID NO：10(5’GCTTCAACAACAACTGGCTGCG)。对第二个基因片段的引物为：5’RACE引物SEQ ID NO：11(5’GGATGGGCTTGGGGAGGGTCTAGCTC)和嵌套引物SEQ ID NO：12(5’GCAGCAGCACAAGCCCACTTTC)，3’RACE引物SEQ ID NO：13(5’GTGCCCAGGGAGGTGGTGTCACTG)和嵌套引物SEQID NO：14(5’GCACAGGAAGTATGAGGACTTTAGTG)。根据Clontech手册PT3269-1(1999年3月)进行SMART-RACE PCRs。对许多RACE cDNA克隆的测序产生SEQ ID NO：1的重叠群cDNA，表明如实施例1中所鉴定的两个基因片段对应于称为SCIM-1的同一基因。在nt59处发现翻译起始密码子，并且发现一个编码653个氨基酸的开放读码框。关于在软骨细胞中观察到长度为2.6kb的mRNA，认为已鉴定2589bp的SCIM-1 cDNA很可能包含该对应基因的完整编码区。

一旦可以得到完整的SCIM-1 cDNA，通过blastsearches(NCBI-BLAST 2.0.10，1999年8月26日；Altschul等人，Nucleic AcidsRes.，25：3389-3402，1997)用Incyte和公开领域数据库的核酸和蛋白质序列进行比较。已发现几个公开序列和专利申请WO99/58660中1100bp的cDNA序列和SCIM-1 cDNA的部分相同。由于不完全重叠，不能由这些公开cDNA片段重建完整的SCIM-1基因。根据我们完整的编码的SCIM-1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，做出了对SCIM-1功能蛋白结构域的预测。氨基酸1-19或1-21鉴定为信号序列，氨基酸263-265为结合整合蛋白的RGD基元，氨基酸551-598为结合钙的EGF样结构域，氨基酸614-635为推测的疏水区，以及氨基酸12-20、39-47、149-157和323-331为MHC II类DR4Dw4结合基元。

实施例5：SCIM-1剪接变异体和它们的组织分布

从涉及SCIM-1全长cDNA和所有包含与SCIM-1相同的序列的Incyte的和公开的cDNA的多重比对中发现cDNA群在核苷酸1852的下游(编号根据SEQ ID NO：1)是异质性的。该下游区编码直接跟随EGF样结构域的蛋白质C-末端。根据对来源于不同组织cDNA(分别对应SEQ ID NO：16-18；3’-末端的不同从核苷酸位置1853开始)的推论，鉴定出SCIM-1的四个不同的C-末端区，即变异体A-D(表格1；分别对应SEQ ID NO：19-21，C-末端的不同从氨基酸位置599开始)，这被认为是可变剪切事件造成的结果。对变异体A、B和C，SEQ ID NO：16-18很可能分别包含相应mRNA的3’末端，因为每一个都在推断的多聚-腺苷化信号AATAAA之后包含3’poly(A)尾部。变异体A和B中3’UTR区不同的长度与分别对软骨和大脑组织的Northern印迹中检测到的SCIM-1 mRNA长度是一致(见实施例3)。在不同数据库中发现编码每个变异体A-D的cDNA克隆数目有力地表明SCIM-1变异体A主要在关节组织(软骨/滑膜)中表达，某种程度上在肿瘤和其他组织中有一定程度的表达，而变异体B的表达似乎限定于中枢神经系统组织(主要为大脑)。通过对所有大脑cDNA(Clontech人类大脑Quick-clone cDNA，cat.7187-1/lot9070843)和初级软骨细胞(用TNF-α培养24小时，见实施例4)cDNA进行RT-PCR，其中采用对SCIM-1变异体B特异的寡核苷酸引物，结果确证了这种推测的组织限定表达。合成cDNA和PCR的条件如实施例2中所描述。对照PCR用对持家基因GAPDH(SEQ ID NO：5和6)特异的寡核苷酸进行。在大脑组织中可以看到预期长度的SCIM-1变异体B的mRNA的强扩增信号，而在软骨细胞中几乎观测不到表达。对GAPDH基因表达进行的对照PCR在两种组织中都产生相似的信号，说明PCR中相应cDNA的加入量相当。发现由一约2.4kbmRNA表示的变异体B的表达在初级软骨细胞(24小时/TNF-α)中几乎检测不到，这与实施例3和4中的数据相符。在初级软骨细胞(24小时/TNF-α)(图2，8泳道)中Northern印迹结果只检测到一条约2.6kb的SCIM-1变异体，推断其代表变异体A，因为在对软骨细胞cDNA的3’RACE扩增中只产生变异体A序列(见SEQ ID NO：1)。

实施例6：重组SCIM-1的表达

将SCIM-1(变异体A)cDNA克隆到克隆载体pCR2.1TOPO(Invitrogen)中并作为EcoR I片段亚克隆到真核表达载体pNGV1(EMBL登记号X99274)。随之，将cDNA置于SV40早期启动子和Kozak翻译起始序列之后。在翻译终止密码子上游插入编码His6标签的18个核苷酸。为了在真核细胞中产生重组SCIM-1(His6)蛋白，将CHO细胞(ATCC CCL61)在含有5％FCS(Harlan sera lab)的DMEM/Hamm’s F12中培养。用Transfectam(Promega)和含有5％FCS和0.8mg/ml新霉素的DMEM/Hamm’s F12选择性培养基培养(G418 sulfate Gibco BRL Life technology，用0.22μMMillipore SLGV025BS滤膜过滤除菌)将pNGV1-SCIM-1(His6)构建体转染到CHO-K1细胞中。为了检测重组蛋白，将细胞在无血清培养基(含有0.8mg/ml新霉素)上过夜培养并允许连续表达1天。无血清培养基上清用SDS-PAGE分析，然后进行Western印迹并用抗-His6单克隆抗体随后进行检测。印迹用以PBS/0.05％ Tween-20配制的5％脱脂牛奶封闭，并用鼠-抗(His6)-标签抗体显示结果(Dianova GMBH cat.no.Dia 900)。在室温用PBST每次5分钟地洗涤三次，将印迹与抗-鼠-IgG-HRP(Promega cat no3624512)孵育。在室温用PBST每次5分钟地洗涤三次，用HRP的生色底物，即PBS溶解的二氨基联苯胺四氢氯化物(tetrahydrochloride)，2.5mM CoCl₂和0.006％H₂O₂进行检测。

                        序列表<110>Akzo Nobel N.V.<120>细胞外基质蛋白<130><140><141><160>21<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2589<212>DNA<213>人类<400>1aagcagtggt aacaacgcag agtacgcggg ggtataaagc gagcgcgctg accccggcat  60gtccaggatg ttaccgttcc tgctgctgct ctggtttctg cccatcactg aggggtccca  120gcgggctgaa cccatgttca ctgcagtcac caactcagtt ctgcctcctg actatgacag  180taatcccacc cagctcaact atggtgtggc agttactgat gtggaccatg atggggactt  240tgagatcgtc gtggcggggt acaatggacc caacctggtt ctgaagtatg accgggccca  300gaagcggctg gtgaacatcg cggtcgatga gcgcagctca ccctactacg cgctgcggga  360ccggcagggg aacgccatcg gggtcacagc ctgcgacatc gacggggacg gccgggagga  420gatctacttc ctcaacacca ataatgcctt ctcgggggtg gccacgtaca ccgacaagtt  480gttcaagttc cgcaataacc ggtgggaaga catcctgagc gatgaggtca acgtggcccg  540tggtgtggcc agcctctttg ccggacgctc tgtggcctgt gtggacagaa agggctctgg  600acgctactct atctacattg ccaattacgc ctacggtaat gtgggccctg atgccctcat  660tgaaatggac cctgaggcca gtgacctctc ccggggcatt ctggcgctca gagatgtggc  720tgctgaggct ggggtcagca aatatacagg gggccgaggc gtcagcgtgg gccccatcct  780cagcagcagt gcctcggata tcttctgcga caatgagaat gggcctaact tccttttcca  840caaccggggc gatggcacct ttgtggacgc tgcggccagt gctggtgtgg acgaccccca  900ccagcatggg cgaggtgtcg ccctggctga cttcaaccgt gatggcaaag tggacatcgt  960ctatggcaac tggaatggcc cccaccgcct ctatctgcaa atgagcaccc atgggaaggt  1020ccgcttccgg gacatcgcct cacccaagtt ctccatgccc tcccctgtcc gcacggtcat  1080caccgccgac tttgacaatg accaggagct ggagatcttc ttcaacaaca ttgcctaccg  1140cagctcctca gccaaccgcc tcttccgcgt catccgtaga gagcacggag accccctcat  1200cgaggagctc aatcccggcg acgccttgga gcctgagggc cggggcacag ggggtgtggt  1260gaccgacttc gacggagacg ggatgctgga cctcatcttg tcccatggag agtccatggc  1320tcagccgctg tccgtcttcc ggggcaatca gggcttcaac aacaactggc tgcgagtggt  1380gccacgcacc cggtttgggg cctttgccag gggagctaag gtcgtgctct acaccaagaa  1440gagtggggcc cacctgagga tcatcgacgg gggctcaggc tacctgtgtg agatggagcc  1500cgtggcacac tttggcctgg ggaaggatga agccagcagt gtggaggtga cgtggccaga  1560tggcaagatg gtgagccgga acgtggccag cggggagatg aactcagtgc tggagatcct  1620ctacccccgg gatgaggaca cacttcagga cccagcccca ctggagtgtg gccaaggatt  1680ctcccagcag gaaaatggcc attgcatgga caccaatgaa tgcatccagt tcccattcgt  1740gtgccctcga gacaagcccg tatgtgtcaa cacctatgga agctacaggt gccggaccaa  1800caagaagtgc agtcggggct acgagcccaa cgaggatggc acagcctgcg tggggactct  1860cggccagtca ccgggccccc gccccaccac ccccaccgct gctgctgcca ctgccgctgc  1920tgctgccgct gctggagctg ccactgctgc accggtcctc gtagatggag atctcaatct  1980ggggtcggtg gttaaggaga gctgcgagcc cagctgctga gcaggggtgg gacatgaacc  2040agcggatgga gtccagcagg ggagtgggaa agtgggcttg tgctgctgcc tagacagtag  2100ggatgtaaag gcctgggagc tagaccctcc ccaagcccat ccatgcacat tacttagcta  2160acaattaggg agactcgtaa ggccaggccc tgtgctgggc acatagctgt gatcacagca  2220gacagggtcg ctgccctgat ggcgcttaca ttccagtggg tctaatgacc atatcttagg  2280acacagatgt gcccagggag gtggtgtcac tgcacaggaa gtatgaggac tttagtgtcc  2340tgagttcaaa tcctgattca ggaactcaca aagctatgtg accttacacc agtcacttaa  2400cttgttagcc atccattatc gcatctgcaa aatggggatt aagaatagaa tcttggggtt  2460agtgtggaga ttagattaaa tgtatgtaag acacttanca caaaacctgg cacatagtaa  2520aggctcaata aaaacaagtg cctctcactg ggctttgtca acacgtcaaa aaaaaaaaaa  2580aaaaaaaaa                                                          2589<210>2<211>653<212>PRT<213>人类<400>2Met Ser Arg Met Leu Pro Phe Leu Leu Leu Leu Trp Phe Leu Pro Ile1               5                  10                  15Thr Glu Gly Ser Gln Arg Ala Glu Pro Met Phe Thr Ala Val Thr Asn

         20                  25                  30Ser Val Leu Pro Pro Asp Tyr Asp Ser Asn Pro Thr Gln Leu Asn Tyr

     35                  40                  45Gly Val Ala Val Thr Asp Val Asp His Asp Gly Asp Phe Glu Ile Val

 50                  55                  60Val Ala Gly Tyr Asn Gly Pro Asn Leu Val Leu Lys Tyr Asp Arg Ala65                  70                  75                  80Gln Lys Arg Leu Val Asn Ile Ala Val Asp Glu Arg Ser Ser Pro Tyr

             85                  90                  95Tyr Ala Leu Arg Asp Arg Gln Gly Asn Ala Ile Gly Val Thr Ala Cys

        100                 105                 110Asp Ile Asp Gly Asp Gly Arg Glu Glu Ile Tyr Phe Leu Asn Thr Asn

    115                 120                 125Asn Ala Phe Ser Gly Val Ala Thr Tyr Thr Asp Lys Leu Phe Lys Phe

130                 135                 140Arg Asn Asn Arg Trp Glu Asp Ile Leu Ser Asp Glu Val Asn Val Ala145                 150                 155                 160Arg Gly Val Ala Ser Leu Phe Ala Gly Arg Ser Val Ala Cys Val Asp

            165                 170                 175Arg Lys Gly Ser Gly Arg Tyr Ser Ile Tyr Ile Ala Asn Tyr Ala Tyr

        180                 185                 190Gly Asn Val Gly Pro Asp Ala Leu Ile Glu Met Asp Pro Glu Ala Ser

    195                 200                 205Asp Leu Ser Arg Gly Ile Leu Ala Leu Arg Asp Val Ala Ala Glu Ala

210                 215                 220Gly Val Ser Lys Tyr Thr Gly Gly Arg Gly Val Ser Val Gly Pro Ile225                 230                 235                 240Leu Ser Ser Ser Ala Ser Asp Ile Phe Cys Asp Asn Glu Asn Gly Pro

            245                 250                 255Asr Phe Leu Phe His Asn Arg Gly Asp Gly Thr Phe Val Asp Ala Ala

        260                 265                 270Ala Ser Ala Gly Val Asp Asp Pro His Gln His Gly Arg Gly Val Ala

    275                 280                 285Leu Ala Asp Phe Asn Arg Asp Gly Lys Val Asp Ile Val Tyr Gly Asn

290                 295                 300Trp Asn Gly Pro His Arg Leu Tyr Leu Gln Met Ser Thr His Gly Lys305                 310                 315                 320Val Arg Phe Arg Asp Ile Ala Ser Pro Lys Phe Ser Met Pro Ser Pro

            325                 330                 335Val Arg Thr Val Ile Thr Ala Asp Phe Asp Asn Asp Gln Glu Leu Glu

        340                 345                 350Ile Phe Phe Asn Asn Ile Ala Tyr Arg Ser Ser Ser Ala Asn Arg Leu

    355                 360                 365Phe Arg Val Ile Arg Arg Glu His Gly Asp Pro Leu Ile Glu Glu Leu

370                 375                 380Asn Pro Gly Asp Ala Leu Glu Pro Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Val385                 390                 395                 400Val Thr Asp Phe Asp Gly Asp Gly Met Leu Asp Leu Ile Leu Ser His

            405                 410                 415Gly Glu Ser Met Ala Gln Pro Leu Ser Val Phe Arg Gly Asn Gln Gly

        420                 425                 430Phe Asn Asn Asn Trp Leu Arg Val Val Pro Arg Thr Arg Phe Gly Ala

    435                 440                 445Phe Ala Arg Gly Ala Lys Val Val Leu Tyr Thr Lys Lys Ser Gly Ala

450                 455                 460His Leu Arg Ile Ile Asp Gly Gly Ser Gly Tyr Leu Cys Glu Met Glu465                 470                 475                 480Pro Val Ala His Phe Gly Leu Gly Lys Asp Glu Ala Ser Ser Val Glu

            485                 490                 495Val Thr Trp Pro Asp Gly Lys Met Val Ser Arg Asn Val Ala Ser Gly

        500                 505                 510Glu Met Asn Ser Val Leu Glu Ile Leu Tyr Pro Arg Asp Glu Asp Thr

    515                 520                 525Leu Gln Asp Pro Ala Pro Leu Glu cys Gly Gln Gly Phe Ser Gln Gln

530                 535                 540Glu Asn Gly His Cys Met Asp Thr Asn Glu Cys Ile Gln Phe Pro Phe545                 550                 555                 560Val Cys Pro Arg Asp Lys Pro Val Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Tyr

            565                 570                 575Arg Cys Arg Thr Asn Lys Lys Cys Ser Arg Gly Tyr Glu Pro Asn Glu

        580                 585                 590Asp Gly Thr Ala Cys Val Gly Thr Leu Gly Gln Ser Pro Gly Pro Arg

    595                 600                 605Pro Thr Thr Pro Thr Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala

610                 615                 620Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Pro Val Leu Val Asp Gly Asp Leu Asn625                 630                 635                 640Leu Gly Ser Val Val Lys Glu Ser Cys Glu Pro Ser Cys

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    595                 600                 605Ser Ala Ala Ser Arg Ile Ser Glu Pro Leu Ser Arg Ala Ser Tyr Leu

610                 615                 620Ser Leu Gly Leu Gly Leu Cys Leu Gln Leu Tyr Ala Leu625                 630                 635<210>20<211>618<212>PRT<213>人类<400>20Met Ser Arg Met Leu Pro Phe Leu Leu Leu Leu Trp Phe Leu Pro Ile1               5                  10                  15Thr Glu Gly Ser Gln Arg Ala Glu Pro Met Phe Thr Ala Val Thr Asn

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 50                  55                  60Val Ala Gly Tyr Asn Gly Pro Asn Leu Val Leu Lys Tyr Asp Arg Ala65                  70                  75                  80Gln Lys Arg Leu Val Asn Ile Ala Val Asp Glu Arg Ser Ser Pro Tyr

             85                  90                  95Tyr Ala Leu Arg Asp Arg Gln Gly Asn Ala Ile Gly Val Thr Ala cys

        100                 105                 110Asp Ile Asp Gly Asp Gly Arg Glu Glu Ile Tyr Phe Leu Asn Thr Asn

    115                 120                 125Asn Ala Phe Ser Gly Val Ala Thr Tyr Thr Asp Lys Leu Phe Lys Phe

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        180                 185                 190Gly Asn Val Gly Pro Asp Ala Leu Ile Glu Met Asp Pro Glu Ala Ser

    195                 200                 205Asp Leu Ser Arg Gly Ile Leu Ala Leu Arg Asp Val Ala Ala Glu Ala

210                 215                 220Gly Val Ser Lys Tyr Thr Gly Gly Arg Gly Val Ser Val Gly Pro Ile225                 230                 235                 240Leu Ser Ser Ser Ala Ser Asp Ile Phe Cys Asp Asn Glu Asn Gly Pro

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        260                 265                 270Ala Ser Ala Gly Val Asp Asp Pro His Gln His Gly Arg Gly Val Ala

    275                 280                 285Leu Ala Asp Phe Asn Arg Asp Gly Lys Val Asp Ile Val Tyr Gly Asn

290                 295                 300rrp Asn Gly Pro His Arg Leu Tyr Leu Gln Met Ser Thr His Gly Lys305                 310                 315                 320Val Arg Phe Arg Asp Ile Ala Ser Pro Lys Phe Ser Met Pro Ser Pro

            325                 330                 335Val Arg Thr Val Ile Thr Ala Asp Phe Asp Asn Asp Gln Glu Leu Glu

        340                 345                 350Ile Phe Phe Asn Asn Ile Ala Tyr Arg Ser Ser Ser Ala Asn Arg Leu

    355                 360                 365Phe Arg Val Ile Arg Arg Glu His Gly Asp Pro Leu Ile Glu Glu Leu

370                 375                 380Asn Pro Gly Asp Ala Leu Glu Pro Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Val385                 390                 395                 400Val Thr Asp Phe Asp Gly Asp Gly Met Leu Asp Leu Ile Leu Ser His

            405                 410                 415Gly Glu Ser Met Ala Gln Pro Leu Ser Val Phe Arg Gly Asn Gln Gly

        420                 425                 430Phe Asn Asn Asn Trp Leu Arg Val Val Pro Arg Thr Arg Phe Gly Ala

    435                 440                 445Phe Ala Arg Gly Ala Lys Val Val Leu Tyr Thr Lys Lys Ser Gly Ala

450                 455                 460His Leu Arg Ile Ile Asp Gly Gly Ser Gly Tyr Leu Cys Glu Met Glu465                 470                 475                 480Pro Val Ala His Phe Gly Leu Gly Lys Asp Glu Ala Ser Ser Val Glu

            485                 490                 495Val Thr Trp Pro Asp Gly Lys Met Val Ser Arg Asn Val Ala Ser Gly

        500                 505                 510Glu Met Asn Ser Val Leu Glu Ile Leu Tyr Pro Arg Asp Glu Asp Thr

    515                 520                 525Leu Gln Asp Pro Ala Pro Leu Glu Cys Gly Gln Gly Phe Ser Gln Gln

530                 535                 540Glu Asn Gly His Cys Met Asp Thr Asn Glu Cys Ile Gln Phe Pro Phe545                 550                 555                 560Val Cys Pro Arg Asp Lys Pro Val Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Tyr

            565                 570                 575Arg Cys Arg Thr Asn Lys Lys Cys Ser Arg Gly Tyr Glu Pro Asn Glu

        580                 585                 590Asp Gly Thr Ala Cys Val Gly Trp Trp Ser Pro Val Leu Lys Ile Val

    595                 600                 605Thr Pro Gln Val Gly Lys Ser Leu Gly Pro

610                 615<210>21<211>612<212>PRT<213>人类<400>21Met Ser Arg Met Leu Pro Phe Leu Leu Leu Leu Trp Phe Leu Pro Ile1               5                  10                  15Thr Glu Gly Ser Gln Arg Ala Glu Pro Met Phe Thr Ala Val Thr Asn

         20                  25                  30Ser Val Leu Pro Pro Asp Tyr Asp Ser Asn Pro Thr Gln Leu Asn Tyr

     35                  40                  45Gly Val Ala Val Thr Asp Val Asp His Asp Gly Asp Phe Glu Ile Val

 50                  55                  60Val Ala Gly Tyr Asn Gly Pro Asn Leu Val Leu Lys Tyr Asp Arg Ala65                  70                  75                  80Gln Lys Arg Leu Val Asn Ile Ala Val Asp Glu Arg Ser Ser Pro Tyr

             85                  90                  95Tyr Ala Leu Arg Asp Arg Gln Gly Asn Ala Ile Gly Val Thr Ala Cys

        100                 105                 110Asp Ile Asp Gly Asp Gly Arg Glu Glu Ile Tyr Phe Leu Asn Thr Asn

    115                 120                 125Asn Ala Phe Ser Gly Val Ala Thr Tyr Thr Asp Lys Leu Phe Lys Phe

130                 135                 140Arg Asn Asn Arg Trp Glu Asp Ile Leu Ser Asp Glu Val Asn Val Ala145                 150                 155                 160Arg Gly Val Ala Ser Leu Phe Ala Gly Arg Ser Val Ala Cys Val Asp

            165                 170                 175Arg Lys Gly Ser Gly Arg Tyr Ser Ile Tyr Ile Ala Asn Tyr Ala Tyr

        180                 185                 190Gly Asn Val Gly Pro Asp Ala Leu Ile Glu Met Asp Pro Glu Ala Ser

    195                 200                 205Asp Leu Ser Arg Gly Ile Leu Ala Leu Arg Asp Val Ala Ala Glu Ala

210                 215                 220Gly Val Ser Lys Tyr Thr Gly Gly Arg Gly Val Ser Val Gly Pro Ile225                 230                 235                 240Leu Ser Ser Ser Ala Ser Asp Ile Phe Cys Asp Asn Glu Asn Gly Pro

            245                 250                 255Asn Phe Leu Phe His Asn Arg Gly Asp Gly Thr Phe Val Asp Ala Ala

        260                 265                 270Ala Ser Ala Gly Val Asp Asp Pro His Gln His Gly Arg Gly Val Ala

    275                 280                 285Leu Ala Asp Phe Asn Arg Asp Gly Lys Val Asp Ile Val Tyr Gly Asn

290                 295                 300Trp Asn Gly Pro His Arg Leu Tyr Leu Gln Met Ser Thr His Gly Lys305                 310                 315                 320Val Arg Phe Arg Asp Ile Ala Ser Pro Lys Phe Ser Met Pro Ser Pro

            325                 330                 335Val Arg Thr Val Ile Thr Ala Asp Phe Asp Asn Asp Gln Glu Leu Glu

        340                 345                 350Ile Phe Phe Asn Asn Ile Ala Tyr Arg Ser Ser Ser Ala Asn Arg Leu

    355                 360                 365Phe Arg Val Ile Arg Arg Glu His Gly Asp Pro Leu Ile Glu Glu Leu

370                 375                 380Asn Pro Gly Asp Ala Leu Glu Pro Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Val385                 390                 395                 400Val Thr Asp Phe Asp Gly Asp Gly Met Leu Asp Leu Ile Leu Ser His

            405                 410                 415Gly Glu Ser Met Ala Gln Pro Leu Ser Val Phe Arg Gly Asn Gln Gly

        420                 425                 430Phe Asn Asn Asr Trp Leu Arg Val Val Pro Arg Thr Arg Phe Gly Ala

    435                 440                 445Phe Ala Arg Gly Ala Lys Val Val Leu Tyr Thr Lys Lys Ser Gly Ala

450                 455                 460His Leu Arg Ile Ile Asp Gly Gly Ser Gly Tyr Leu Cys Glu Met Glu465                 470                 475                 480Pro Val Ala His Phe Gly Leu Gly Lys Asp Glu Ala Ser Ser Val Glu

            485                 490                 495Val Thr Trp Pro Asp Gly Lys Met Val Ser Arg Asn Val Ala Ser Gly

        500                 505                 510Glu Met Asn Ser Val Leu Glu Ile Leu Tyr Pro Arg Asp Glu Asp Thr

    515                 520                 525Leu Gln Asp Pro Ala Pro Leu Glu Cys Gly Gln Gly Phe Ser Gln Gln

530                 535                 540Glu Asn Gly His Cys Met Asp Thr Asn Glu Cys Ile Gln Phe Pro Phe545                 550                 555                 560Val Cys Pro Arg Asp Lys Pro Val Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Tyr

            565                 570                 575Arg Cys Arg Thr Asn Lys Lys Cys Ser Arg Gly Tyr Glu Pro Asn Glu

        580                 585                 590Asp Gly Thr Ala Cys Val Glu Arg Thr Leu Leu Leu Gly Leu Cys Asn

    595                 600                 605Leu Leu Gly Lys

610

Claims (21)

1.编码含SEQ ID NO：2中氨基酸编号从1延伸到598的氨基酸序列的多肽的多核苷酸。

2.根据权利要求1的多核苷酸，其编码SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1中从核苷酸59延伸到1852的序列。

4.根据权利要求1-3的多核苷酸，其包含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18或从 SEQ IDNO：1的核苷酸59延伸到2017的序列，SEQ ID NO：16中核苷酸59到1969的序列，SEQ ID NO：17中核苷酸59到1912的序列或SEQID NO：18中核苷酸59-1894的序列。

5.包含根据权利要求1-4的DNA的重组表达载体。

6.由根据权利要求1-4的多核苷酸、根据权利要求5的表达载体或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或者SEQID NO：21的免疫调节片段所编码的多肽。

7.包含根据权利要求6的多肽和药学可接受的载体的药物组合物。

8.根据权利要求6的多肽的治疗用途。

9.根据权利要求6的多肽在生产抗炎症药物制剂中的用途。

10.根据权利要求6的多肽在生产用于在患有自身免疫病更具体为类风湿性关节炎的患者中诱导对自身抗原免疫耐受的药物制剂中的用途。

11.用根据权利要求1-4的DNA或根据权利要求5的表达载体转染的细胞。

12.根据权利要求11的细胞，其为表达根据权利要求6的多肽的稳定转染的细胞。

13.根据权利要求1-4的DNA或根据权利要求5的表达载体，根据权利要求11或12的细胞或者根据权利要求6的多肽，在鉴定耐受原性(多)肽的筛选分析中的用途。

14.鉴定耐受原性肽的方法，该方法包括以下步骤

a)将根据权利要求1-4的多核苷酸的片段引入到合适的宿主细胞中；

b)在允许所引入的序列表达的条件下培养宿主细胞；

c)使表达产物与淋巴细胞接触；并且

d)确定淋巴细胞的活性。

15.鉴定耐受原性肽的方法，该方法包括以下步骤

a)将根据权利要求1-4的多核苷酸的片段引入到合适的宿主细胞中；

b)在允许所引入的DNA序列表达的条件下培养宿主细胞；

c)分离表达产物；

d)使表达产物与抗原呈递细胞和T细胞接触；并且

e)确定T细胞的活性。

16.鉴定耐受原性肽的方法，该方法包括以下步骤

a)化学合成SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的片段；

b)使该肽片段与抗原呈递细胞和T细胞接触；并且

c)确定T细胞的活性。

17.配制药物组合物的方法，该方法包含权利要求14-16的方法和将上述肽与药学可接受的载体混合。

18.权利要求14-16的方法所鉴定的肽在制备适于作为耐受原性剂的药物中的用途。

19.包含一或多种根据权利要求6的多肽和检测剂的诊断组合物。

20.用于检测活化的自身反应性的T细胞的诊断方法，该方法包含以下步骤：

a)从个体血液样品中分离外周血液单核细胞(PBMC)；

b)在适合条件下培养上述PBMC；

c)在SCIM-1、其片段和/或根据权利要求6的一或多种肽存在下孵育上述PBMC培养物，并且

d)检测T细胞反应，表明个体中活化的自身反应性的T细胞的存在。

21.检测活化的自身反应性的T细胞的测试试剂盒，该测试试剂盒包含SCIM-1或根据权利要求6的一或多种肽。

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