KR20190054094A - 키메라 포식작용 수용체 분자 - Google Patents

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KR20190054094A
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cer
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다니엘 마크 코리
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세로 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 키메라 포식작용 수용체 분자, 식작용 포식작용 분자를 포함하도록 변형된 숙주 세포, 및 이러한 수용체 분자 및 변형된 세포의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

키메라 포식작용 수용체 분자
서열목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열목록은 인쇄물 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열목록이 포함된 텍스트 파일명은 200265_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 275 KB이고, 2017년 9월 26일에 생성되었으며, EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되었다.
배경 기술
식작용의 두 가지 주요 유형이 있으며, 이는 표적, 세포 유형 및 주위 환경에 의해 영향을 받는다. 항-미생물 식작용은 질병을 유발하는 미생물을 제거 및 분해하고, 사이토카인 및 케모카인 분비를 통해 전염증성 신호전달를 유도하며, 면역 세포를 집약시켜, 효과적인 염증 반응을 구축한다. 이러한 유형의 식작용은 종종 "염증성 식작용" (또는 "면역원성 식작용")으로 지칭된다. 그러나, 특정의 지속적 감염과 같은 일부 경우에는 미생물 흡수 후 항 염증 반응이 뒤따를 수 있다. 항 미생물 식작용은 일반적으로 골수 계통의 전문적 식세포, 예컨대 미성숙 수지상 세포 (DC) 및 대식세포 및 조직-상재 면역 세포에 의해 수행된다.
이와 달리, 손상된 자기 유래 아폽토시스 세포 또는 세포 파편 (예를 들어, 탐식작용)의 식작용은 통상적으로 비-염증성 (또한 "비-면역원성"으로 지칭됨) 과정이다. 수십억의 손상되어, 사멸 중인 바람직하지 않은 세포에 대해 매일 아폽토시스가 진행된다. 바람직하지 않은 세포는, 예를 들어 발달 중에 생성된 과량의 세포, 노화 세포, 감염 세포 (세포내 박테리아 또는 바이러스), 형질전환 또는 악성 세포 및 세포독성 제제에 의해 비가역적으로 손상된 세포를 포함한다. 식세포는 주위 조직에 손상을 주거나, 전염증성 면역 반응을 유도함이 없이, 아폽토시스 세포의 특이적이고, 신속한 제거를 수행한다. 아폽토시스 세포 제거를 위한 단계는 (1) 아폽토시스 세포의 위치로 식세포를 집약시키는 아폽토시스 세포로부터의 "발견" 신호의 송신 단계; (2) 아폽토시스 세포의 표면에 노출된 신호가 특이적 수용체를 통해 식세포와 결합하는 단계; (3) 아폽토시스 세포를 포식작용하기 위한 세포골격 재배열 단계; 및 (4) 포식된 아폽토시스 세포가 분해되고, 특이적 식작용 반응이 유도되는 단계 (예를 들어, 항 염증성 사이토카인의 분비)를 포함한다.
감염, 염증성 질병, 면역 질병, 및 다양한 암을 치료하는 신규의 조성물 및 방법에 대한 요구가 계속되고 있다. 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 다양한 암, 급성 및 만성 감염, 염증성, 면역성 및 선택된 신경계 질병의 치료에서 감염, 형질전환, 악성, 아폽토시스, 손상 또는 괴사 세포 또는 입자의 체내로부터의 제거를 증대시킴으로써, 이러한 요구를 충족시킨다.
키메라, 포식작용 수용체가 본 명세서에 기재된다. 특정 실시형태에서, 키메라 포식작용 수용체 (단수형태의 "CER" 및 복수형태의 "CER")는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 세포내 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 세포외 도메인과 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하며, 이를 연결한다. 세포외 도메인은 결합 도메인 및 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하며, 이를 연결하는 선택적 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 포식작용 수용체는 (a) 질병, 장애, 상태, 또는 감염과 연간된 전-포식작용 마커 또는 표적 항원을 표적화하는 세포외 도메인, (b) 막관통 도메인, 및 (c) 포식작용 신호전달 도메인을 갖는 키메라 단백질이다. 특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 적어도 하나의 항상성 포식작용 도메인 및 전염증성 포식작용 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 키메라 포식작용 수용체는 단일 사슬 키메라 단백질이다. 키메라 포식작용 수용체는 표적 세포/기관/조직/영역에 염증 반응을 유발하기 위해, 설계될 수 있다. 아폽토시스 세포 제거가 통상적으로 비-염증성 과정이나, 염증은, 예를 들어, 잔여 종양 세포에 대해 면역 반응을 유도하는 아폽토시스 종양 세포의 제거 상황과 같은 특정 상황에서 숙주에 유리할 수 있다.
일부 실시형태에서, CER의 세포외 도메인은 전-포식작용 마커에 특이적인 결합 도메인을 포함한다. 이러한 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 포스파티딜세린 (PtdSer) 결합 도메인을 포함한다. 본 명세서에 기재된 CER의 실시형태에서, PtdSer 결합 도메인은 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 1 (Tim1), T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 4 (Tim4), 또는 T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 3 (Tim3)의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, PtdSer 결합 도메인은 FA58C2, GAS6, 단백질 S, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 또는 프로트롬빈 PS로부터 유래하는 결합 도메인의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 세포외 도메인은 표적 항원에 결합한다. 이러한 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은, 예를 들어, FcGR1, FcGR2A, FcGR2B2, FcGR2C, FcGR3A, FcεR1, 및 FcαR1과 같은 Fc 수용체 (FcR)의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다. 세포외 도메인이 표적 항원과 결합하는 다른 실시형태에서, 세포외 도메인은 항체 또는 그의 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포외 도메인은 인트라바디 (intrabody), 펩티다비 (peptibody), 나노바디 (nanobody), 단일 도메인 항체, SMIP, 및 다중 특이적 항체로부터 선택되는 항체 또는 항원-결합 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 Fab 결합 도메인을 포함한다. 다른 이러한 실시형태에서, 세포외 도메인은 scFv을 포함한다.
CER의 세포외 도메인과 전-포식작용 마커 또는 표적화된 항원의 결합시, CER의 포식작용 신호전달 도메인은 포식작용 신호전달 활성을 자극한다. 따라서, 활성화시, CER에 포함된 포식작용 신호전달 도메인은 포식작용할 숙주 세포를 유도하는 효과기 기능성 신호를 도입시킨다. 특정 실시형태에서, CER의 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 항상성 포식작용 신호전달 도메인의 예는 MRC1, ItgB5, MERTK, Tyro3, 및 Axl 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 전염증성 포식작용 신호전달 도메인의 예는 Traf6, Syk, MyD88, Zap70, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, FcαR1, BAFF-R, NFAM1, DAP12, 및 CD79b 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 것을 포함하여, 항상성 및 전염증성 포식작용 신호전달 도메인으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
추가의 양상에서, 본 개시내용은 CER을 발현하도록 유전자 변형된 세포에 관한 것이다. 구체적 실시형태에서, CER은 자연 발생 단일 수용체 단백질에 의해 나타나지 않는 포식작용 표현형을 부여한다. 다른 실시형태에서, 본 기재내용에 따른 CER은 자연적으로 포식작용 활성을 나타내지 않는 세포에 포식작용 표현형을 부여한다. 특정 실시형태에서, 세포는 사멸, 사멸 중, 손상, 감염 또는 괴사 세포와 연관된 전-포식작용 마커를 표적화하는 CER을 발현하도록 유전자 변형된다. 다른 실시형태에서, 세포는 감염성 입자에 의해 유도된 감염성 미생물 또는 분자와 연관된 항체와 같은 마커를 표적화하는 CER을 발현하도록 유전자 변형된다. 이러한 실시형태에서, 유전자 변형된 세포는 감염성 입자에 의해 유도된 표적화된 감염성 미생물 또는 표적화된 분자와 연관된 마커의 CER과의 결합시, 표적화된 세포 또는 미생물의 제거 또는 분해를 촉진한다. 다른 특이적 실시형태에서, 세포는 정상적으로는 포식작용을 촉발하지 않는 항원 마커를 표적화하는 CER을 발현하도록 유전자 변형된다. 예를 들어, 이러한 실시형태에서, CER의 세포외 도메인은 항원 마커에 특이적인 Fab 결합 도메인 또는 scFv과 같은 항체 또는 항체의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 이러한 특정 실시형태에서, 항원 마커는 질병, 장애, 또는 다른 바람직하지 않은 상태와 연관된 이상 세포의 표면 단백질, 당단백질, 또는 당지질 특징일 수 있다. 이러한 실시형태에서, 유전자 변형된 세포는 CER에 의한 항원 마커의 결합시, 이상 세포의 제거 또는 분해를 촉진한다.
추가의 실시형태에서, CER-변형된 세포는 작은 GTPase를 공동 발현하도록 추가로 변형될 수 있다. 작은 GTPase는 CER 및 작은 GTPase를 인코딩하는 벡터를 사용하여, CER-변형된 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, 작은 GTPase는 CER을 도입시키기 위해 사용되는 벡터와 상이한 벡터를 사용하여, CER-변형된 세포이거나, 일 것인 세포에 도입될 수 있다.
추가의 양상에서, 본 개시내용은 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법의 실시형태는 하나 이상의 CER을 포함하는 약제학적 조성물 또는 본 기재내용에 따른 하나 이상의 CER을 발현하도록 유전자 변형된 세포의 집단의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 숙주 세포의 포식작용 표현형을 변이시키기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 이러한 방법은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 자연적으로 포식작용 표현형을 나타내지 않는 숙주 세포에 CER을 도입시키고, 이를 발현시킴으로써, 포식작용 표현형을 나타내는 세포의 집단을 생성하는 방법; 숙주 세포에 CER을 도입시켜, 이를 발현시킴으로써, 세포의 집단의 포식작용 표현형을 변이시키는 방법으로서, CER이 자연적으로는 숙주 세포에 의해 표적화되지 않는 전-포식작용 마커 또는 항원 마커에 특이적인 포식작용 표현형을 부여하는 방법; 및 숙주 세포에 CER을 도입시켜, 이를 발현시킴으로써, 세포의 집단의 포식작용 표현형을 증대시키는 방법으로서, CER이 숙주 세포에 의해 자연적으로 표적화되는 전-포식작용 마커 또는 항원 마커에 특이적이고, 숙주 세포에 의한 CER의 발현이 표적화된 전-포식작용 또는 항원 마커를 나타내는 세포, 미생물, 또는 입자의 숙주 세포에 의한 포식작용을 증대시키는 방법.
도 1a 내지 도 1d는 키메라 포식작용 수용체 (CER)의 예시적 도식을 도시한다. 도 1a는 포스파티딜세린에 특이적인 세포외 도메인을 가진 2개의 예시적 CER을 도시하며 (Tim4 및 scFv), 표는 단일 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 도 1b는 포스파티딜세린에 특이적인 결합 도메인을 가진 2개의 예시적 CER을 도시하며 (Tim4 및 scFv), 이는 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 보조 또는 2차 포식작용 신호전달 도메인의 CER로의 혼입은 보조 수용체에 대한 발현 리간드의 부재하에서도 포식작용 반응을 증대시킬 수 있다. 도 1c는 Fab 또는 FcR을 포함하는 세포외 도메인을 갖는 2개의 예시적 CER을 도시하며, 이는 단일 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 도 1d는 Fab 또는 FcR을 포함하는 것을 갖는 2개의 예시적 CER을 도시하며, 이는 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. "TMD" = 막관통 도메인.
도 2a 및 도 2b는 예시적 CER 벡터를 도시한다. 도 2a에 도시된 CER 벡터는 단일 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 도 2b에 도시된 CER 벡터는 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. "ECD" = 세포외 도메인.
도 3a 및 도 3b는 천연 림프구과 본 개시내용의 CER에 의해 변형된 림프구의 비교를 도시한다. 도 3a는 내인성 림프구를 도시한다. 도 3b는 본 개시내용의 CER에 의해 변형된 림프구를 도시한다.
도 4는 본 개시내용의 CER의 예시적 투여 방법을 도시한다.
도 5a 내지 도 5c는 예시적 처리 시간표를 도시한다. 도 5a는 CER에 의해 변형된 세포에 의한 요법의 처리 체계를 도시한다. 도 5b는 비-식작용 T 세포성 면역 요법과 조합하여 사용되는 CER-변형된 세포의 처리 체계를 도시한다. 도 5c는 단일클론 항체, 통상적인 화학요법, 또는 방사선 요법과 조합하여 사용되는 CER-변형된 세포의 처리 체계를 도시한다.
도 6a 내지 도 6f는 아폽토시스 표적 세포의 Tim4-MERTK 키메라 포식작용 수용체 (chimeric engulfment receptor: CER) 매개 시험관내 포식작용을 도시한다. 도 6a는 Tim4-MERTK CER의 예시적 도식을 도시한다. ECD = 세포외 도메인; TMD = 막관통 도메인; ESD = 포식작용 신호전달 도메인. 도 6b는 도 6a의 Tim4-MERTK CER을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pMSCV 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 쥣과동물 Ba/F3 B-세포의 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 플롯을 도시한다. 양성 Ba/F3 B-세포 형질도입체를 유동 세포계측을 사용하여, Ba/F3 B-세포의 세포막 상의 Tim4-MERTK CER의 존재를 나타내는 녹색 형광 단백질 마커 및 Tim4의 염색에 의해 분류하였다. 도 6c는 FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 인큐베이션 2시간 및 24시간 후, Tim4-MERTK 키메라 포식작용 수용체-발현 Ba/F3 B-세포에 의한 아폽토시스 1차 흉선 세포의 식작용의 막대 그래프를 도시한다. Tim4 및 GFP을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pMSCV로 형질도입된 BA/F3 B-세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 6d는 Tim4-MERTK CER 표면 발현의 양뿐만 아니라, 표적 세포 인큐베이션 기간과 아폽토시스 1차 흉선 세포의 식작용 사이의 상관관계를 예시하는 선 그래프를 도시한다. 도 6e는 Tim4-MERTK CER-발현 세포가 pHrodo 레드 염료-염색된 아폽토시스 1차 흉선 세포를 포식작용함을 보여주는 형광 현미경 검사로부터의 이미지를 도시한다. 황색 삼각형은 포식리소좀 내의 아폽토시스 1차 흉선 세포를 나타내며; 백색 사각형은 비 포식작용된 아폽토시스 1차 흉선 세포의 저 강도 염색을 나타낸다. 도 6f는 시험관내 식작용을 나타내는 것으로, pHrodo 레드 및 Tim4-MERTK CER 발현에 대해 이중 양성인 Ba/F3 세포의 FACS 및 히스토그램 플롯을 도시한다.
도 7a 및 도 7b는 아폽토시스 표적 세포의 Tim4-MERTK 키메라 포식작용 수용체 (CER)-매개 포식작용을 도시한다. 도 7a는 12시간 및 48시간의 인큐베이션 시간에 표적 아폽토시스 흉선 세포의 Tim4-MERTK CER-매개 제거의 저속 촬영 이미지를 도시한다. 95% 초과의 표적 세포가 4일 이내에 제거되었다. 아폽토시스 흉선 세포의 얇은 막이 Tim4를 발현하는 대조군 Ba/F3 세포의 존재하에 지속된다 (하부 패널) (백색 화살표는 흉선 세포를 가리킴). 도 7b는 대조군 (Tim4 발현 Ba/F3 세포) 및 Tim4-MERTK CER-발현 Ba/F3 세포 샘플에서 고출력 현미경 필드당 존재하는 흉선 세포의 수를 정량화하는 선 그래프를 도시한다. 도 7b는 Tim4-MERTK CER을 발현하는 림프구에 의한 아폽토시스 흉선 세포의 실재적인 완전한 제거를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8c는 Raji Burkitt 림프종 세포의 Tim4-MERTK 키메라 포식작용 수용체-매개 제거를 도시한다. 도 8a는 시험관내 식작용을 나타내는 것으로, pHrodo 레드 및 Tim4-MERTK CER 발현에 대해 이중 양성인 Ba/F3 세포의 FACS 플롯을 도시하며, 도 8b는 Tim4를 발현하는 대조군 Ba/F3 B-세포와 비교하여, Tim4-MERTK CER-발현 Ba/F3 B-세포에 의한 Raji Burkitt 림프종 세포의 식작용의 막대 그래프를 도시한다. 도 8c는 Raji Burkitt 림프종 세포의 Tim4-MERTK CER-매개 제거의 형광 현미경 사진을 도시한다.
도 9a 내지 도 9f는 아폽토시스 표적 세포의 FA58C2-MERTK 키메라 포식작용 수용체 (CER)-매개 시험관내 포식작용을 도시한다. 도 9a는 FA58C2-MERTK CER의 예시적 도식을 도시한다. 도 9b는 FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 인큐베이션 2시간 및 24시간 후, FA58C2-MERTK CER-발현 Ba/F3 B-세포에 의한 아폽토시스 1차 흉선 세포의 식작용의 막대 그래프를 도시한다. Tim4 및 GFP을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pMSCV로 형질도입된 BA/F3 B-세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 9c는 FA58C2-MERTK CER 표면 발현의 양뿐만 아니라, 표적 세포 인큐베이션의 기간과 아폽토시스 1차 흉선 세포의 식작용 사이의 상관관계를 예시하는 선 그래프를 도시한다. 도 9d는 FA58C3-MERTK CER-발현 세포가 pHrodo 레드 염료-염색된 아폽토시스 1차 흉선 세포를 포식작용함을 보여주는 형광 현미경 검사로부터의 이미지를 도시한다. 황색 삼각형은 포식리소좀 내의 아폽토시스 1차 흉선 세포를 나타낸다. 도 9e는 FACS 플롯을 도시하며, 도 9f는 시험관내 식작용을 나타내는 것으로, pHrodo 레드 및 FA58C2-MERTK CER 발현에 대해 이중 양성인 Ba/F3 세포의 히스토그램 플롯을 도시한다.
도 10a 내지 도 10e는 작은 GTPase Rac1에 의한 CER-매개 식작용의 증대를 도시한다. 도 10a는 P2A 서열에 의해 분리되어 있는 FA58C2-MERTK CER 및 Rac1 또는 Rab5 (상부 패널) 및 생성된 공동 발현 FA58C2-MERTK CER 및 GTPase (Rac1) (하부 패널)의 이중-시스트론 레트로바이러스 발현 카세트의 예시적 도식을 도시한다. 도 10b는 FA58C2-MERTK CER 또는 FA58C2-MERTK CER + Rac1을 발현하는 Ba/F3 B-세포에서 인큐베이션 24시간째에 FA58C2-MERTK CER 표면 발현의 양과 아폽토시스 1차 흉선 세포의 식작용 사이의 상관관계를 예시하는 선 그래프를 도시한다. 도 10c는 FA58C3-MERTK CER + Rac1-발현 세포가 pHrodo 레드 염료-염색된 아폽토시스 1차 흉선 세포를 포식작용함을 보여주는 형광 현미경 검사로부터의 이미지를 도시한다. 도 10d는 FACS 플롯을 도시하며, 도 10e는 시험관내 식작용을 나타내는 것으로, pHrodo 레드 및 FA58C2-MERTK CER + Rac1 발현에 대해 이중 양성인 Ba/F3 세포의 히스토그램 플롯을 도시한다.
도 11a 내지 도 11e는 표적 아폽토시스 세포의 FA58C2-Syk CER-매개 시험관내 포식작용을 도시한다. 도 11a는 FA58C2-Syk CER의 레트로바이러스 발현 카세트 및 P2A 서열에 의해 분리되어 있는 FA58C2-Syk CER 및 작은 GTPase Rac1 (상부 패널) 및 생성된 공동 발현 FA58C2-Syk CER 및 Rac1 (하부 패널)의 이중-시스트론 레트로바이러스 발현 카세트의 예시적 도식을 도시한다. 도 11b는 FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 인큐베이션 2시간 및 24시간 후 FA58C2-Syk CER- 또는 FA58C2-Syk CER + Rac1-발현 Ba/F3 B-세포에 의한 아폽토시스 1차 흉선 세포의 식작용의 막대 그래프를 도시한다. Tim4 및 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pMSCV로 형질도입된 BA/F3 B-세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 11c는 FA58C2-Syk CER 또는 FA58C2-Syk CER + Rac1을 발현하는 Ba/F3 B-세포에서 인큐베이션 24시간째에 FA58C2-Syk CER 표면 발현의 양과 아폽토시스 1차 흉선 세포의 식작용 사이의 상관관계를 예시하는 선 그래프를 도시한다. 작은 GTPase Rac1의 첨가는 식작용을 증대시킨다. 도 11d는 FA58C3-Syk CER + Rac1-발현 세포가 pHrodo 레드 염료-염색된 아폽토시스 1차 흉선 세포를 포식작용함을 보여주는 형광 현미경 검사로부터의 이미지를 도시한다. 황색 삼각형은 포식리소좀 내의 아폽토시스 1차 흉선 세포를 나타낸다. 도 11e는 시험관내 식작용을 나타내는 것으로, pHrodo 레드 및 FA58C2-Syk CER + Rac1 발현에 대해 이중 양성인 Ba/F3 세포의 FACS 플롯을 도시한다.
도 12a 내지 도 12d는 작은 GTPase Rab5의 공동 발현이 CER-매개 식작용을 증대시킴을 보여준다. 도 12a는 P2A 서열에 의해 분리되어 있는 FA58C2-Syk CER 및 작은 GTPase Rab5 (상부 패널) 및 생성된 공동 발현 FA58C2-Syk CER 및 Rab5 (하부 패널)의 이중-시스트론 레트로바이러스 발현 카세트의 예시적 도식을 도시한다. 도 12b는 FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 인큐베이션 2시간 후, FA58C2-Syk CER- 또는 FA58C2-Syk CER + Rab5-발현 Ba/F3 B-세포에 의한 아폽토시스 1차 흉선 세포의 식작용의 막대 그래프를 도시한다. Tim4 및 GFP을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pMSCV로 형질도입된 BA/F3 B-세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 12c는 FA58C3-Syk CER + Rab5-발현 세포가 pHrodo 레드 염료-염색된 아폽토시스 1차 흉선 세포를 포식작용함을 보여주는 형광 현미경 검사로부터의 이미지를 도시한다. 도 12d는 FA58C2-Syk CER 발현 세포의 시험관내 식작용 (9%) 및 Rab5의 첨가에 의한 증가된 식작용 (12.5%)을 나타내는 것으로, pHrodo 레드 및 FA58C2-Syk CER (좌측 플롯), FA58C2-Syk CER + Rab5 발현 (중간 플롯), 또는 Tim4 대조군에 대해 이중 양성인 Ba/F3 세포의 FACS 플롯을 도시한다.
도 13a 내지 도 13h는 표적 B-세포의 CD19-MERTK 키메라 포식작용 수용체 (CER)-매개 시험관내 포식작용을 도시한다. 도 13a는 CD19-MERTK CER (상부 패널) 및 생성된 공동 발현 CD19-MERTK CER (하부 패널)의 레트로바이러스 발현 카세트의 예시적 도식을 도시한다. 도 13b는 P2A 서열에 의해 분리되어 있는 CD19-MERTK CER 및 작은 GTPase Rac1 (상부 패널) 및 생성된 공동 발현 CD19-MERTK CER 및 Rac1 (하부 패널)의 이중-시스트론 레트로바이러스 발현 카세트의 레트로바이러스 발현 카세트의 예시적 도식을 도시한다. 도 13c는 FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 인큐베이션 2시간 및 24시간 후 CD19-MERTK CER- 또는 CD19-MERTK CER + Rac1-발현 Ba/F3 B-세포에 의한 Raji Burkitt 림프종 세포의 식작용의 막대 그래프를 도시한다. Tim4 및 GFP을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 pMSCV로 형질도입된 Ba/F3 B-세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 13d는 CD19-MERTK CER을 발현하는 Ba/F3 B-세포에서 인큐베이션 24시간째에 CD19-MERTK CER 표면 발현의 양과 Raji Burkitt 림프종 세포의 식작용 사이의 상관관계를 예시하는 선 그래프를 도시한다. 도 13e는 CD19-MERTK CER + Rac1-발현 세포가 pHrodo 레드 염료-염색된 Raji Burkitt 림프종 세포를 포식작용함을 보여주는 형광 현미경 검사로부터의 이미지를 도시한다. 황색 삼각형은 포식리소좀 내의 Raji Burkitt 림프종 세포를 나타낸다. 도 13f는 Raji Burkitt 림프종 표적 세포에 의한 인큐베이션 2시간째 또는 Raji Burkitt 림프종 표적 세포에 의한 인큐베이션 24시간째에 시험관내 식작용을 나타내는, pHrodo 레드 및 CD19-MERTK CER 발현에 대해 이중 양성인 Ba/F3 세포의 FACS 플롯을 도시한다 (도 13g). 도 13h는 pHrodo 레드 염료 염색된 Raji Burkitt 림프종 세포를 포식작용한 CD19-MERTK CER 발현 세포의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 포식작용 현상을 나타낸다.
도 14는 본 개시내용에 따른 CER의 예를 예시하는 표 1 및 표 2를 도시한다.
도 15는 본 개시내용에 따른 CER의 예를 예시하는 표 3을 도시한다.
도 16은 서열번호(SEQ ID NO:) 71의 아미노산 서열을 갖는 "CER01" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER01은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 MERTK 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER01 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 17a 내지 도 17d는 CER01로 형질도입된 Ba/F3 쥣과동물 세포의 FACS 정제를 도시한다. 바이오틴-표지된 세툭시맙 (항-EGFR 항체) 후, R-피고에리트린과 접합된 스트렙타비딘 (SA-PE)을 사용하여, FACS에 의해, 형질도입 48시간 후, 비 형질도입된 Ba/F3 세포 (도 17a) 및 CER01-T2A-EGFRt 포함 렌티바이러스로 형질도입된 Ba/F3 쥣과동물 B 세포 (도 17b)에서의 EGFR 발현을 검출하였다. CER+EGFRt+ 발현 세포 (도 17C)를 FACS에 의해 선택하고, 하류 분석을 위해 확장시켰다. 도 17d는 EGFRt 정제 후, 비 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포를 도시한다.
도 18a 및 도 18b는 CER01+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손-처리된 흉선 세포의 시험관내 포식작용을 도시한다. 도 18a는 덱사메타손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된, EGFRt+ 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포의 형광 현미경 이미지를 도시하고; 도 18b는 덱사메타손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된, CER01로 형질도입된 Ba/F3 세포의 형광 현미경 이미지를 도시한다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄). 도 18b의 일부의 고배율 이미지가 우측에 도시된다.
도 19a 및 도 19b는 CER01+ Ba/F3 효과기 세포 (도 19a) 및 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER01+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손-처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화 (도 19b)의 FACS 분석을 도시한다.
도 20a 및 도 20b는 CER01+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 20a는 덱사메탄손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER01+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 세포의 백분율 값 및 혼성체 포획 값의 표를 도시한다. 도 20b는 CER01+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 21은 CER01+ Ba/F3 세포에 의한 CT26 결장 암종 세포의 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 22a 및 도 22b-a 혼성체 포획 알고리즘을 사용하여, 식작용 분석의 형광 이미지 상의 CER01+ Ba/F3 세포 CELLTRACE 바이올렛 염색된 영역 내의 pHrodo 레드 염색된 표적 세포의 형광을 검출하였다. 도 22a는 CER01+ Ba/F3 세포로부터 CT26 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 히스토그램 플롯을 도시하며, 도 22b는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 혼성체 세포 개수를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 CT26 세포의 중첩 영역을 나타낸다.
도 23은 CER01+ Ba/F3 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포로부터 CT26 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 산포도를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 CT26 세포의 중첩 영역을 나타낸다.
도 24a 및 도 24b는 CT26 결장 암종 세포와 공동 배양된 CER01+ Ba/F3 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 빈도 (A) 및 식작용 지수 (B)를 도시한다.
도 25는 CER01+ Ba/F3 세포에 의한 A20 림프종 세포의 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 26a 및 도 26b-a 혼성체 포획 알고리즘을 사용하여, 식작용 분석의 형광 이미지 상의 CER01+ Ba/F3 세포 CELLTRACE 바이올렛 염색된 영역 내의 pHrodo 레드 염색된 표적 세포의 형광을 검출하였다. 도 26a는 CER01+ Ba/F3 세포로부터 A20 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 히스토그램 플롯을 도시하며, 도 26b는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 혼성체 세포 개수를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 A20 세포의 중첩 영역을 나타낸다.
도 27은 CER01+ Ba/F3 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포로부터 A20 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 산포도를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 A20 세포의 중첩 영역을 나타낸다.
도 28은 A20 세포와 공동 배양된 CER01+ Ba/F3 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 29는 CER01+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L T 세포 림프종 세포의 식작용의 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 30은 CER01+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 식작용 빈도의 그래프를 도시한다.
도 31a 및 도 31b는 CER01+ 인간 1차 B 세포의 형질도입 및 확장을 도시한다. 도 31a는 항-EGFR 항체 및 그 후 항-Tim4 Kat5-18 항체를 사용하여, CER01 (우측 히스토그램) 및 대조군 B 세포 (좌측 히스토그램)로 형질도입된 인간 1차 B 세포의 FACS 분석을 도시한다. 도 31b는 24시간, 48시간 및 72시간째에 확장된 정제된 CER01+ B 세포를 도시한다.
도 32a 및 도 32b는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 인간 1차 B 세포 (도 32b)와 비교하여, CER01+ 인간 1차 B 세포 (도 32a)에 의한 스타우로스포린 처리된 Jurkat 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 33은 FACS에 의해 분석된 바와 같은 CER01+ 인간 1차 B 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 pHrodo 레드 염색된 Jurkat 세포의 식작용을 도시한다. 살아 있는 CD19+, 알로피코시아닌 (allophycocyanin) (APC)-표지된 세포에 대해 게이팅 (gating)을 수행하고 (좌측 플롯), 이중 양성 염색된 현상 (APC 및 pHrodo 레드)의 빈도를 식작용 현상으로 규정하였다 (우측 플롯).
도 34는 CER01+ 인간 1차 B 세포와 공동 인큐베이션된 스타우로스포린 처리된 Jurkat 세포의 식작용 빈도의 그래프를 도시한다.
도 35는 CER01+ 인간 1차 B 세포에 의한 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 플루오로우라실 처리된 Jurkat 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 36은 서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 "CER08" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER08은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 Tyro3 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER08 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 37a 및 도 37b는 살아 있는 CER08+ 변형된 Ba/F3 세포 (도 37a) 및 덱사메타손 처리된 pHrodo 레드 염색된 흉선 세포와 CELLTRACE 바이올렛 염색된 CER08+ 마우스 Ba/F3 세포의 공동 배양시, 식작용 빈도를 나타내는 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합 (도 37b)의 FACS 플롯을 도시한다.
도 38은 EGFRt+ Ba/Fe 대조군 세포 (상부 사진)와 비교하여, CER08+ Ba/F3 세포 (하부 사진)에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다.
도 39a 및 도 39b는 CER08+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 39a는 덱사메탄손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER08+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 세포의 백분율 값 및 혼성체 포획 값의 표를 도시한다. 도 39b는 CER08+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 40은 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는 "CER09" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER09는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER09 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 41a 및 도 41b는 살아 있는 CER09+ 변형된 Ba/F3 세포 (도 41a) 및 덱사메타손 처리된 pHrodo 레드 염색된 흉선 세포와 CELLTRACE 바이올렛 염색된 CER09+ 마우스 Ba/F3 세포의 공동 배양시, 식작용 빈도를 나타내는 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합 (도 41b)의 FACS 플롯을 도시한다.
도 42a 및 도 42b는 EGFRt+ Ba/Fe 대조군 세포 (도 42a)와 비교하여, CER09+ Ba/F3 세포 (도 42b)에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다.
도 43a 및 도 43b는 CER09+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 43a는 덱사메탄손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER09+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 세포의 백분율 및 혼성체 포획 값의 표를 도시한다. 도 43b는 CER09+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 44a 및 도 44b는 CER09+ Ba/F3 세포 (도 44a) 및 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 CT26 결장 암종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 45는 CER09+ Ba/F3 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포로부터의 CT26 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 산포도를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 CT26 세포의 영역을 나타낸다.
도 46은 스타우로스포린 처리된 CT26 세포와 공동 인큐베이션된 CER09+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다.
도 47은 CER09+ Ba/F3 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 WR19L 림프종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 48은 CER09+ Ba/F3 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 A20 림프종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 49a 및 도 49b는 CER09+ 인간 1차 B 세포의 형질도입 및 확장을 도시한다. 도 49a는 항-EGFR 항체 및 그 후 항-Tim4 Kat5-18 항체를 사용하여, CER09 (우측 히스토그램) 및 대조군 B 세포 (좌측 히스토그램)로 형질도입된 인간 1차 B 세포의 FACS 분석을 도시한다. 도 49b는 24시간, 48시간 및 72시간째에 확장된 정제된 정제된 CER09+ B 세포를 도시한다.
도 50은 FACS에 의해 분석된 바와 같은 CER09+ 인간 1차 B 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 pHrodo 레드 염색된 Jurkat 세포의 식작용을 도시한다. 살아 있는 CD19+, 알로피코시아닌 (APC)-표지된 세포에 대해 게이팅을 수행하고 (좌측 플롯), 이중 양성 염색된 현상 (APC 및 pHrodo 레드)의 빈도를 식작용 현상으로 규정하였다 (우측 플롯).
도 51은 CER09+ 인간 1차 B 세포 또는 대조군 EGFRt+ 인간 1차 B 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 Jurkat 세포의 식작용 빈도의 그래프를 도시한다.
도 52는 CER09+ 인간 1차 B 세포 (좌측 사진) 또는 EGFRt+ 인간 1차 B 세포 (우측 사진)에 의한 스타우로스포린 처리된 Jurkat 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 53은 서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 "CER10" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER10은 Tim4 결합 도메인, Dap12 막관통 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 P2A 서열에 의해 CER10 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 54a 및 도 54b는 살아 있는 CER10+ Ba/F3 효과기 세포 (도 54a) 및 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER10+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손-처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화 (도 54b)의 FACS 분석을 도시한다.
도 55a 및 도 55b는 CER10+ Ba/F3 세포 (도 55b) 또는 대조군 EGFRt+ Ba/F3 세포 (도 55a)에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다.
도 56a 및 도 56b는 CER10+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 56a는 덱사메탄손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER10+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 세포의 백분율 값 및 혼성체 포획 값의 표를 도시한다. 도 56b는 CER10+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 57은 서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는 "CER11" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER11은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 Axl 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER11 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 58a 및 도 58b는 CER11+ Ba/F3 효과기 세포 (도 58a) 및 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER11+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손-처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화 (도 58b)의 FACS 분석을 도시한다.
도 59a 및 도 59b는 CER11+ Ba/F3 세포 (도 59b) 또는 대조군 EGFRt+ Ba/F3 세포 (도 59a)에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다.
도 60a 및 도 60b는 CER11+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 60a는 덱사메탄손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER11+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 세포의 백분율 값 및 혼성체 포획 값의 표를 도시한다. 도 60b는 CER11+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 61a 및 도 61b는 CER11+ Ba/F3 세포 (좌측 사진) 또는 대조군 EGFRt+ Ba/F3 세포 (우측 사진)에 의한 스타우로스포린 처리된 CT26 결장 암종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 62는 CER11+ Ba/F3 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포로부터의 CT26 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 산포도를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 CT26 세포의 영역을 나타낸다.
도 63은 CER11+ Ba/F3에 의한 WR19L 세포의 시험관내 식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 64a 및 도 64b는 CER11+ Ba/F3 효과기 세포 (도 64a) 및 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER11+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 WR19L 림프종 세포의 포식작용의 정량화 (도 64b)의 FACS 분석을 도시한다.
도 65a 및 도 65b는 CER11+ Ba/F3 세포 (좌측 사진) 또는 대조군 EGFRt+ Ba/F3 세포 (우측 사진)에 의한 스타우로스포린 처리된 A20 림프종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 66은 스타우로스포린 처리된 A20 세포와 공동 인큐베이션된 CER11+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다.
도 67은 CER11+ 인간 1차 B 세포 (좌측 사진) 또는 대조군 EGFRt+ 인간 1차 B 세포 (우측 사진)에 의한 옥살리플라틴 및 플루오로우라실 처리된 Jurkat 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 68은 CER11+ 인간 1차 B 세포에 의한 겜시타빈 (gemcitabine) 처리된 COLO320HSR 결장 암 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 69는 CER11+ 인간 1차 B 세포에 의한 파클리탁셀 (paclitaxel) 또는 파클리탁셀 처리된 A204 횡문근육종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 70은 CER11+ 인간 1차 B 세포에 의한 파클리탁셀 또는 파클리탁셀 + 겜시타빈 처리된 H1703 비 소세포 폐암 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 71은 서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 "CER12" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER12는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 FcεRIγ 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER12 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 72a 및 도 72b는 CER12+ Ba/F3 효과기 세포 (도 72a) 및 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER12+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 흉선 세포의 포식작용의 정량화 (도 72b)의 FACS 분석을 도시한다.
도 73a 및 도 73b는 CER12+ Ba/F3 세포 (도 73b) 또는 대조군 EGFRt+ Ba/F3 세포 (도 73a)에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다.
도 74a 및 도 74b는 CER12+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 74a는 덱사메탄손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER12+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 세포의 백분율 값 및 혼성체 포획 값의 표를 도시한다. 도 74b는 CER12+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 75는 CER12+ Ba/F3 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 WR19L 림프종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 76은 CER12+ Ba/F3 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 A20 림프종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 77은 스타우로스포린 처리된 A20 세포와 공동 인큐베이션된 CER12+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다.
도 78은 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 "CER13" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER13은 Tim4 결합 도메인, FcεRIγ 막관통 도메인, 및 FcεRIγ 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER13 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 79a 및 도 79b는 CER13+ Ba/F3 효과기 세포 (도 79a) 및 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER13+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 흉선 세포의 포식작용의 정량화 (도 79b)의 FACS 분석을 도시한다.
도 80은 CER13+ 인간 1차 B 세포에 의한 파클리탁셀 및 겜시타빈 처리된 Colo320 HSR 결장 암 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 81은 CER13+ 인간 1차 B 세포에 의한 파클리탁셀 처리된 A204 횡문근육종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 82는 CER13+ 인간 1차 B 세포에 의한 파클리탁셀 및 겜시타빈 처리된 Colo320 HSR 결장 암 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 83은 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 "CER15" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER15는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER15 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 84a 및 도 84b는 CER15+ Ba/F3 효과기 세포 (도 84a) 및 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER15+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 흉선 세포의 포식작용의 정량화 (도 84b)의 FACS 분석을 도시한다.
도 85a 및 도 85b는 CER15+ Ba/F3 세포 (도 85b) 또는 대조군 EGFRt+ Ba/F3 세포 (도 85a)에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다.
도 86a 및 도 86b는 CER15+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 86a는 덱사메탄손-처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER15+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 세포의 백분율 값 및 혼성체 포획 값의 표를 도시한다. 도 86b는 CER15+ 세포 또는 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 87은 CER15+ Ba/F3 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 CT26 결장 암종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 88은 CER15+ Ba/F3 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 WR19L 림프종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 89는 CER15+ Ba/F3 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 A20 림프종 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 90a 및 도 90b는 CER15+ 인간 1차 B 세포의 형질도입 및 확장을 도시한다. 도 90a는 항-EGFR 항체 및 그 후 항-Tim4 Kat5-18 항체를 사용하여, CER15 (우측 히스토그램) 및 대조군 B 세포 (좌측 히스토그램)로 형질도입된 인간 1차 B 세포의 FACS 분석을 도시한다. 도 49b는 24시간, 48시간 및 72시간째에 확장된 정제된 CER15+ B 세포를 도시한다.
도 91은 FACS에 의해 분석된 바와 같은 CER15+ 인간 1차 B 세포에 의한 스타우로스포린 처리된 pHrodo 레드 염색된 Jurkat 세포의 식작용을 도시한다. 살아 있는 CD19+, 알로피코시아닌 (APC)-표지된 세포에 대해 게이팅을 수행하고 (좌측 플롯), 이중 양성 염색된 현상 (APC 및 pHrodo 레드)의 빈도를 식작용 현상으로 규정하였다 (우측 플롯).
도 92는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 인간 1차 B 세포와 비교하여, 스타우로스포린 처리된 Jurkat 세포와 공동 배양된 CER15+ 인간 1차 B 세포에 의한 식작용 빈도 그래프를 도시한다.
도 93a 및 도 93b는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 인간 1차 B 세포 (도 93b)와 비교하여, CER15+ 인간 1차 B 세포 (도 93a)에 의한 스타우로스포린 처리된 Jurkat 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 94는 서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 "CER16" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER16은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 MyD88 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER16 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 95는 CER16+ 인간 1차 B 세포에 의한 옥살리플라틴 및 플루오로우라실로 처리된 Jurkat 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 96은 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 "CER25" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER25는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 NFAM1 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER25 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 97a 및 도 97b는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포 (도 97a)와 비교하여, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER25+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화의 FACS (도 97b)를 도시한다.
도 98은 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER25+ Ba/F3 세포의 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 99는 절두된 EGFR로 형질도입된 Ba/F3 세포와 비교하여, 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER25+ Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 100은 서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 "CER85" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER85는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 BAFFR 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER85 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 101a 및 도 101b는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포 (도 101b)와 비교하여, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER85+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화의 FACS (도 101a)를 도시한다.
도 102는 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER85+ Ba/F3 세포에 의한 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 103은 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포와 비교하여, 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER85+ Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 104는 서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 "CER86" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER86은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER86 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 105는 서열번호 130의 아미노산 서열을 갖는 "CER87" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER87은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, BAFFR 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER87 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 106a 및 도 106b는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포 (도 106b)와 비교하여, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER87+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화의 FACS (도 106a)를 도시한다.
도 107은 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER87+ Ba/F3 세포에 의한 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 108은 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포와 비교하여, 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER87+ Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 109는 서열번호 131의 아미노산 서열을 갖는 "CER88" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER88은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, DAP12 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER88 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 110은 서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 "CER89" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER89는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 CD79b 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER89 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 111은 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 "CER90" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER90은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 NFAM1 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER90 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 112는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 "CER91" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER91은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 바이러스 P2A 서열에 CER 서열의해 로부터 분리된 Rab5a을 인코딩하는 서열, 및 바이러스 T2A 서열에 의해 Rab5a 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 113a 및 도 113b는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포 (도 113b)와 비교하여, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER91+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화의 FACS (도 113a)를 도시한다.
도 114는 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER91+ Ba/F3 세포에 의한 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 115는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포와 비교하여, 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER91+ Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 116은 서열번호 133의 아미노산 서열을 갖는 "CER92" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER92는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER92 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 117a 및 도 117b는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포 (도 117b)와 비교하여, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER92+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화의 FACS (도 117a)를 도시한다.
도 118은 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER92+ Ba/F3 세포에 의한 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 119는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포와 비교하여, 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER92+ Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 120은 서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 "CER93" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER93은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 BAFFR 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER93 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 121a 및 도 121b는 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포 (도 121b)와 비교하여, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합을 측정함으로써, CER93+ Ba/F3 쥣과동물 B 세포에 의한 덱사메타손 처리된 흉선 세포의 포식작용의 정량화의 FACS (도 121a)를 도시한다.
도 122는 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER93+ Ba/F3 세포에 의한 시험관내 식작용의 형광 현미경 이미지를 도시한다. 포식작용 현상의 고 배율 사진이 우측에 제시되어 있다. 백색 화살표는 식작용 현상을 나타낸다.
도 123은 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포와 비교하여, 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER93+ Ba/F3 세포의 식작용 지수의 그래프를 도시한다.
도 124는 서열번호 134의 아미노산 서열을 갖는 "CER94" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER94는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER94 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 125는 서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 "CER97" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER97은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, Axl 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER97 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 126은 서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 "CER98" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER98은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, Axl 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 CD79b 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER98 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 127은 서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 "CER95" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER95는 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 CD79b 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER95 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 128은 서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 "CER96" 키메라 포식작용 수용체를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 벡터 맵을 도시한다. CER96은 Tim4 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 NFAM1 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 바이러스 T2A 서열에 의해 CER96 서열로부터 분리된 절두된 EGFR (서열번호 121)을 인코딩하는 서열을 포함한다.
도 129는 절두된 EGFRt로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포와 비교하여, 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 인큐베이션된 다양한 CER+ Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다.
도 130은 절두된 EGFRt로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포와 비교하여, 스타우로스포린 처리된 CT26 결장 암종 세포와 공동 인큐베이션된 다양한 CER+ Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다.
도 131은 절두된 EGFRt로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포와 비교하여, 스타우로스포린 처리된 A20 림프종 세포와 공동 인큐베이션된 다양한 CER+ Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다.
도 132a 내지 도 132c는 림프종 마우스 모델에서 생체내에서 저 조사량 방사선과 CER0 (Tim4MerTk) 1 처리의 상승 효과를 도시한다. 도 132a는 조합 요법 용법의 예시적 시간표를 도시한다. 도 132b는 비 처리된 마우스, 방사선 + 대조군 T 세포가 제공된 마우스, 또는 방사선 + CER01 변형된 T 세포가 제공된 마우스에서 종양 크기의 측정을 도시한다.
도 133a 및 도 133b는 림프종 마우스 모델에서 생체내에서 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법과 CER01 (Tim4MerTk) 처리의 상승 효과를 도시한다. 도 133a는 조합 요법 용법의 예시적 시간표를 도시한다. 도 133b는 항-CD19 CAR 변형된 T 세포 및 pMSCV 빈 레트로바이러스 벡터 변형된 T 세포가 제공된 대조군 마우스 (좌측 사진)와 비교하여, CER 주입 4일 후, 항-CD19 CAR 변형된 T 세포 및 CER 변형된 B 세포 (n=3) 또는 T 세포 (n=2)가 제공된 마우스에서의 종양 크기의 루세리파제 (lucerifase) 이미지를 도시한다 (우측 이미지).
도 134는 방사선 요법, CER 면역요법 (예를 들어, 포스파티딜세린 발현 세포의 표적화) 후, TCR 또는 CAR 면역요법을 포함하는 예시적 삼중 조합 처리 시간표를 도시한다.
(a) 세포외 결합 도메인 및 선택적으로, 세포외 스페이서 도메인을 포함하는 세포외 도메인, (b)막관통 도메인, 및 (c) 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 단백질, 및 상기 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 본 명세서에 기재된다. 추가로, 이러한 키메라 단백질을 발현하도록 변형된 세포 및 이러한 변형된 세포가 필요한 대상체에 이를 전달하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 키메라 단백질은 본 명세서에서 "키메라 포식작용 수용체" 또는 "키메라 포식작용 수용체" (단수형태의 "CER" 및 복수형태의 "CER")로 지칭된다. 본 명세서에 기재된 키메라 포식작용 수용체는 상기 키메라 포식작용 수용체를 발현하도록 유전자 변형된 숙주 세포에 포식작용 표현형을 부여할 수 있다. 이러한 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CER의 발현은 천연 상태에서는 포식작용 표현형을 나타내지 않는 숙주 세포에 포식작용 표현형을 부여한다. 다른 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CER의 숙주 세포에 의한 발현은 천연 상태에서 숙주 세포에 의해 표적화되지 않는 전-포식작용 마커 또는 항원 마커에 특이적인 포식작용 표현형을 부여한다. 다른 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CER의 숙주 세포에 의한 발현은 천연 상태에서 숙주 세포에 의해 표적화되지 않는 전-포식작용 마커 또는 항원 마커에 특이적인 포식작용 표현형을 부여하며, 숙주 세포에 의한 CER의 발현은 표적화된 전-포식작용 또는 항원 마커를 나타내는 세포, 미생물, 또는 입자의 숙주 세포에 의한 포식작용을 증대시킨다.
특정 실시형태에서, CER은 아폽토시스, 사멸, 사멸 중, 손상, 감염 또는 괴사 세포와 연관된 포식작용 마커를 표적화한다. 다른 실시형태에서, CER은 감염성 미생물 또는 입자와 연관된 항체 결합 세포를 표적화한다. 다른 실시형태에서, CER은 질병, 장애, 또는 다른 바람직하지 않은 상태와 연관된 이상 세포 또는 미스폴딩 (misfolding)된 단백질에 의해 디스플레이 (display)되는 항원 마커를 표적화한다.
본 기재내용에 따른 하나 이상의 CER은 T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, B 세포, 림프성 전구체 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 및 골수성 세포와 같은 세포에 형질도입되어, 그 내부에서 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, CER이 특이적 표적 분자 (예를 들어, 포식작용 마커 또는 항원 마커)와 결합하도록 하는 조작 이외에, CER의 포식작용 신호전달 도메인은 요망되는 포식작용 활성을 제공하는 것으로 선택된다. 이러한 일 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달을 유도하는 것으로 선택된다. 또 다른 이러한 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달을 유도하는 것으로 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인은 둘 모두 항상성 포식작용 신호전달 도메인일 수 있거나, 둘 모두 전염증성 포식작용 신호전달 도메인일 수 있거나, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인일 수 있고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인일 수 있다 (또는 이와 반대일 수 있음).
본 기재내용에 따른 하나 이상의 CER을 발현하도록 유전자 변형된 숙주 세포는 CER의 세포외 도메인이 결합하는 표적 분자를 발현하는 표적 세포 또는 입자의 특이적 포식작용에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 표적 세포 또는 입자는 감염, 질병, 장애, 또는 다른 바람직하지 않은 상태와 연관된 종양 세포, 암 세포, 미생물 (예를 들어, 박테리아, 진균, 바이러스), 원충 기생충, 이상 세포, 또는 미스폴딩된 단백질일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 본 기재내용에 따른 하나 이상의 CER을 발현하도록 유전자 변형된 숙주 세포는 대상체에서, 1차 요법 또는 부가 또는 조합 요법으로서, 암, 감염성 질병 (바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물), 염증성 질병, 면역 질병 (예를 들어, 자가면역 질병), 또는 신경퇴행성 질병 (예를 들어, 알츠하이머병)을 치료하는 데 사용된다. 본 개시내용의 CER은 표적 분자 및 치료 적응증에 따라, 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인의 선택을 통해, 특이적 포식작용 표현형 (예를 들어, 항상성 (비-면역원성) 대 전염증성 (면역원성))을 부여하도록 설계될 수 있다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 전염증성 포식작용 도메인을 포함하는 CER은 암의 미세환경을 개선하고, 종양 퇴행을 증대시키는 데 유용할 수 있다.
정의
본 개시내용을 더욱 상세히 설명하기 전에, 본 명세서에 사용되는 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 그의 이해에 도움이 될 수 있다.
본 기재내용에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 지정되지 않는 한, 열거된 범위 내의 임의의 정수 값, 적절한 경우, 그 분율 (예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 하위단위, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징과 연관하여 본 명세서에 열거된 임의의 수치 범위는 달리 지정되지 않는 한, 열거된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 달리 지정되지 않는 한, 지정된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 단수형태 ("a" 및 "an")는 열거된 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 양자택일 (예를 들어, "또는")의 사용은 양자택일 중 하나, 둘 모두 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 바아 같이, 용어 "~를 포함하다", "~를 갖다" 및 "~를 포괄하다"는 동의어로 사용되며, 이들 용어 및 변용예는 비 제한적으로 해석되는 것으로 의도된다.
항체 기술 분야의 당업자가 이해하는 용어는 본 명세서에서 다르게 명시적으로 정의되지 않는 한, 각각 당해 기술 분야에서 획득된 의미를 갖는다. 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 다클론 항체 및 단일클론 항체를 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 무 손상 항체뿐만 아니라, 표적 분자에 결합할 수 있는 능력을 가지거나, 보유하는 무 손상 항체의 항원-결합 부분 (또는 항원-결합 도메인)을 지칭할 수 있다. 항체는 면역글로불린, 예를 들어 내부바디, 펩티바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, SMIP, 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 탠덤 디-scFV, 탠덤 트리-scFv, ADAPTIR)의 자연 발생되거나, 재조합에 의해 생성되거나, 유전자 조작되거나, 변형된 형태일 수 있다. 단일클론 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 비-인간, 키메라, 인간화, 또는 인간, 바람직하게는 인간화 또는 인간일 수 있다. 면역글로불린 구조 및 기능은, 예를 들어,문헌[Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)]에서 확인된다. 무 손상 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 도메인"은 무 손상 항체의 일부분을 지정하고, 무 손상 항체의 항원 결정 가변 영역 또는 상보성 결정 영역을 지칭하는 "항체 단편"을 포괄하는 것을 의미한다. 항체 단편의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 항체 단편으로부터 형성된 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv 항체, VH, 및 다중 특이적 항체를 포함한다. "Fab" (단편 항원 결합)은 항원에 결합하는 항체의 일부분이며, 사슬 간 이황화 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역 및 CH1을 포함한다. 항체는 IgG 및 그 하위 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 하위 클래스일 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로, 각각의 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 CDR을 포함하는 유사한 구조를 갖는다 (예를 들어, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분한 것일 수 있다. 추가로, 특정 항원과 결합하는 항체는 항원과 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여, 단리하여, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
"초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어인 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비 인접 서열을 지칭하는 것으로 당 업계에 인식되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 존재하고, 각각의 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 존재한다.
용어 "항원" 및 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 유발된 면역 반응은 항체 생성, 면역학적으로 작용하는 특정 세포의 활성화, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 단백질, 당단백질 및 당지질을 포함한 거대 분자는 항원으로서 작용할 수 있다. 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래할 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 바와 같이, 항원은 (i) 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열에 의해서만 또는 (ii) 전적으로 "유전자"에 의해 인코딩될 필요는 없다. 항원은 생성되거나, 합성될 수 있거나, 항원은 생물학적 샘플로부터 유래할 수 있다. 이러한 생물학적 샘플은, 이에 제한되는 것은 아니나, 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 에피토프"는 동족 면역 결합 분자, 예컨대 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, scFv), T 세포 수용체 (TCR), 키메라 포식작용 수용체, 또는 다른 결합 분자, 도메인 또는 단백질에 의해 특이적으로 결합되는 항원 내의 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹을 포함하고, 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정 3차원 구조 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체형태적 에피토프일 수 있다.
용어 "항 종양 효과"는 종양 용적의 저하, 종양 세포 수의 저하, 전이 수의 저하, 기대 수명의 증가, 또는 암성 상태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항 종양 효과"는 또한 혈액학적 악성 종양 또는 종양 형성의 예방에 의해, 나타날 수 있다.
"자가면역 질병"은 자가면역 반응으로부터 유발되는 장애를 지칭한다. 자가면역 질병은 자가 항원에 대해 부적절하게 과도하게 반응한 결과이다. 자가면역 반응은 자가 항체, 자가 반응성 T 세포, 또는 둘 모두를 생성하는 자가 반응성 B 세포를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "자가 항체"는 또한 대상체에 의해 생성된 자가 항원에 결합하는 대상체에 의해 생성된 항체이다.
"자가"는 추후에 재 도입될 동일한 대상체로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 대상체로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "결합 도메인," "결합 영역," 및 "결합 모이어티"는 표적 분자 (예를 들어, PtdSer, IgG 항체, IgE 항체, IgA 항체, CD138, CD38, CD33, CD123, CD79b, 메소텔린 (mesothelin), PSMA, BCMA, ROR1, MUC-16, L1CAM, CD22, CD19, EGFRviii, VEGFR-2, 또는 GD2)와 특이적으로 비 공유적으로 결합하거나, 연계되거나, 연합하거나, 이를 인식하거나, 이와 조합되는 능력을 보유하는 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질과 같은 분자를 지칭한다. 결합 도메인은 목적 대상인 생물학적 분자 또는 다른 표적의, 자연 발생되거나, 합성되거나, 반 합성되거나, 재조합적으로 생성된 임의의 결합 상대를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 도메인은 항원-결합 도메인, 예컨대 항체 또는 그의 기능성 결합 도메인 또는 항원-결합 부분이다. 예시적 결합 도메인은 생물학적 분자에 결합하는 특이적 능력에 대해 선택된 단일 사슬 항체 가변 영역 (예를 들어, 도메인 항체, sFv, scFv, Fab), 수용체 엑토도메인 (예를 들어, TNF-α), 리간드 (예를 들어, 사이토카인, 케모카인), 또는 합성 폴리펩타이드를 포함한다.
웨스턴 블롯, ELISA, 및 BIACORE® 분석과 같이, 특정 표적과 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 결합 도메인의 확인뿐만 아니라, 결합 도메인 친화도의 결정을 위한 다양한 분석이 공지되어 있다 (또한, 예를 들어, 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949]; 및 미국 특허 제 5,283,173호, 제 5,468,614호, 또는 균등물 참조). 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "특이적으로 결합하다"는 샘플 내의 임의의 다른 분자 또는 성분과는 유의하게 결합하거나, 연합하지 않으면서, 친화도 또는 Ka (즉, 1/M의 단위의 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)가 105 M-1 이상인 표적 분자와 그의 결합 도메인 또는 융합 단백질의 결합 또는 연합을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 이상 세포의 제어되지 않는 고속 성장을 특징으로 하는 질병으로 정의된다. 이상 세포는 고형 종양을 형성하거나, 혈액학적 악성 종양을 구성할 수 있다. 암세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 확산될 수 있다. 다양한 CER의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함한다.
"질병"은 대상체가 항상성을 유지할 수 없고, 질병이 개선되지 않으면, 그 후 대상체의 건강은 계속 악화되는 대상체의 건강 상태이다. 이와 달리, 대상체의 "장애"또는 "바람직하지 않은 상태"는 대상체가 항상성을 유지할 수 있지만, 대상체의 건강 상태가 장애 또는 바람직하지 않은 상태의 부재시보다 적절하지 않은 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하는 경우, 장애 또는 바람직하지 않은 상태가 반드시 대상체의 건강 상태를 더 저하시키는 것은 아니다.
"미생물" 또는 "미세 유기체"는 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 진균의 임의의 종을 지칭한다.
"입자"는 살아있는 세포 또는 유기체로부터 유래된 것으로, 직경이 적어도 100 nm 및 최대 6 μm 이하인 세포 또는 작은 객체의 단편을 지칭한다. 입자는 바이러스 입자, 작은 무기물 입자, 세포 파편 또는 합성 입자일 수 있다.
"인코딩"은 DNA, cDNA 및 mRNA 서열과 같은 특정 폴리뉴클레오타이드 서열이 규정된 뉴클레오타이드 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 서열을 갖거나, 규정된 아미노산 서열을 갖는, 생물학적 과정의 다른 중합체 및 거대 분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 고유한 특성 및 그로부터 유발되는 생물학적 특성을 지칭한다.
따라서, 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 단백질을 인코딩한다. 코딩 가닥 및 비 코딩 가닥 둘 모두는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 다른 생성물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴 버전이고, 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 모두를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "내인성" 또는 "천연"은 숙주 또는 숙주 세포에 정상적으로 존재하는 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포식작용 (engulfment)"은 100 nm 초과의 직경의 내인성 또는 외인성 세포 또는 입자가 본 개시내용의 식세포 또는 숙주 세포에 의해 내재화되는 수용체-매개 과정을 지칭한다. 포식작용은 통상적으로 다수의 단계로 구성된다: (1) 직접 또는 간접적으로 (가교 분자를 통함) 표적 세포 또는 입자 상의 전-포식작용 마커 또는 항원 마커와 포식작용 수용체의 결합을 통한 표적 세포 또는 입자의 고정; 및 (2) 전체 표적 세포 또는 입자, 또는 그의 일부분의 내재화 또는 포식작용. 특정 실시형태에서, 식세포 또는 숙주 세포의 세포 골격 정렬을 통해, 내재화가 이루어짐으로써, 내재화된 표적을 포함하는 막-결합 구획인 식포를 형성할 수 있다. 포식작용은 식포의 성숙 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 포식된 표적이 분해되는 경우 (예를 들어, "식작용"), 식포는 점차로 산성이 되고, 리소좀과 융합된다 (포식리소좀 형성). 대안적으로, 식포-리소좀 융합은 포식작용에서 관찰되지 않을 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 식포는 완전한 분해 전에 세포외 환경으로 그 내용물을 역류시키거나, 방출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 포식작용은 식작용을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 포식작용은 본 개시내용의 숙주 세포의 식세포에 의한 표적 세포 또는 입자의 고정을 포함하나, 내재화는 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 포식작용은 본 개시내용의 숙주 세포의 식세포에 의한 표적 세포 또는 입자의 고정 및 표적 세포 또는 입자의 일부의 내재화를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "식작용"은 표적 세포 또는 입자의 고정, 표적 세포 또는 입자의 포식작용, 및 내재화된 표적 세포 또는 입자의 분해가 이루어지는 세포 또는 큰 입자 (≥ 0.5 μm)의 포식작용 과정을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 식작용은 식포의 형성을 포함하고, 리소좀과 내재화된 표적 세포 또는 입자 및 식포 융합을 포함하여, 포식리소좀을 형성하며, 여기서, 내부의 내용물이 분해된다. 특정 실시형태에서, 식작용 동안, 본 개시내용의 식세포 또는 숙주 세포 상에 발현된 CER과 표적 세포 또는 입자에 의해 발현된 포식작용 마커의 결합 후, 식작용 시냅스가 형성되고; 액틴이 다량 존재하는 식작용 컵이 식작용 시냅스에 생성되고; 식작용 지류가 세포 골격 재정렬을 통해 표적 세포 또는 입자 주위로 확장되며; 결국, 표적 세포 또는 입자가 운동 단백질에 의해 생성되는 힘을 통해 식세포 또는 숙주 세포로 견인된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "식작용"은 구체적으로는 비 염증 방식의 아폽토시스 또는 괴사 세포의 식작용을 지칭하는 "탐식작용" 과정을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "전-포식작용 마커"는 이에 의해, 각각 비-아폽토시스, 비-괴사, 비-파이롭토시스, 종양, 또는 비 감염 세포와 구별되는 것으로, 아폽토시스, 괴사, 파이롭토시스 (pyroptosis), 또는 감염 세포가 그 표면 상에 표출시키는 모이어티 (예를 들어, 단백질, 지질, 또는 다당류)를 지칭한다. 전-포식작용 마커는 아폽토시스 또는 괴사 세포에서 표면 노출되는 세포내 모이어티, 아폽토시스 또는 괴사 세포에서 변이된 당화 또는 변이된 표면 전하를 갖는 모이어티 또는 아폽토시스, 괴사, 파이롭토시스, 또는 종양 세포와 결합하는 혈청 모이어티일 수 있다. 아폽토시스 세포의 전-포식작용 마커의 예는 포스파티딜세린 (PtdSer), ICAM-3, 산화된 저 밀도 지질단백질, 칼레티쿨린 (calreticulin), 아넥신 I(annexin I), 보체 C1q, 및 트롬보스폰딘 (thrombospondin)을 포함한다. 괴사, 종양, 및 파이롭토시스 세포는 또한 세포 표면 상에 PtdSer 전-포식작용 마커를 노출시킨다. 포식작용 수용체는 전-포식작용 마커와 결합하는 중간체로서 가용성 가교 분자를 사용하여, 직접 또는 간접적으로 표적 세포 (예를 들어, 손상, 감염, 아폽토시스, 괴사, 파이롭토시스, 또는 종양 세포) 상의 전-포식작용 마커를 검출 (또는 결합)할 수 있다.
"포식작용 신호전달 도메인"은 숙주 세포에 의해 발현되는 CER의 세포외 도메인에 의해 표적화된 표적 분자 (예를 들어, 전-포식작용 마커 또는 항원 마커)의 결합시, 구체적 실시형태에서, 숙주 세포의 세포 골격 재정렬 및 마커 또는 항원과 결합된 표적 세포, 미생물, 또는 입자의 내재화를 포함하는 포식작용을 유발하는 숙주 세포의 하나 이상의 신호전달 경로를 활성화시키는 세포내 효과기 도메인을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 표적 세포, 미생물, 또는 입자의 식작용을 유발하는 하나 이상의 신호전달 경로를 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 1차 포식작용은 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인일 수 있다. 포식작용 신호전달 도메인이 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 실시형태에서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인일 수 있다. 유사한ly, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, CER은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 둘 모두 항상성 포식작용 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, CER은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 둘 모두 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CER은 항상성 포식작용 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CER은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 항상성 포식작용 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다.
용어 "항상성 포식작용 신호전달 도메인"은 (i) 표적화된 세포, 미생물, 또는 입자의 포식작용을 자극하나, (ii) 통상적으로 염증성 또는 면역원성 반응을 자극하는 내인성 수용체 또는 신호전달 분자로부터 유래되지 않은 효과기 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 항-염증성 및/또는 면역억제성 사이토카인, 예컨대, 예를 들어, TGF-β 및 IL-10의 숙주 세포 분비를 자극한다. 특정 실시형태에서, 항상성 포식작용 신호전달의 자극은 국소 조직 환경의 염증을 약화시키거나, 감쇠시키거나, 소산시킨다. 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 또한 "비-염증성" 포식작용 신호전달 도메인 또는 "비-면역원성" 포식작용 신호전달 도메인으로 지칭될 수 있다.
"전염증성 포식작용 신호전달 도메인"은 (i) 표적화된 세포, 미생물, 또는 입자의 포식작용을 자극하고, (ii) 통상적으로 (a) 염증성 사이토카인, 예컨대, 예를 들어, TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, 및 IL-23의 숙주 세포 분비, (b) 염증성 케모카인, 예컨대, 예를 들어, CCL5 (RANTES), CXCL9, 및 CXCL10의 숙주 세포 분비, (c) 세포 표면 공자극성 마커, 예컨대, 예를 들어, CD80, CD86, HLA-DR, CD40, HVEM, 및 4-1BBL의 상향조절, 및 (d) 화학요법, 항체-기반 면역 요법, 또는 세포성 요법, 예컨대, 예를 들어, T 세포 표적화된 요법을 유도하거나, 가능하게 하거나, 보완하는 하나 이상의 신호전달계, 예컨대 NF-κB의 활성화 중 하나 이상을 자극하는 내인성 수용체 또는 신호전달 분자로부터 유래하는 효과기 도메인을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 전염증성 포식작용 신호전달의 자극은 국소 조직 환경에서의 염증을 촉진한다. 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 또한 "면역원성" 포식작용 신호전달 도메인 또는 "염증성" 포식작용 신호전달 도메인으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "효과기 도메인"은 적절한 신호를 수신하는 경우, 효과기 도메인을 발현하는 세포에서 생물학적 또는 생리학적 반응을 직접 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 융합 단백질 또는 수용체의 세포내 부분이다. 특정 실시형태에서, 효과기 도메인은 결합되는 경우, 또는 이것이 효과기 도메인으로부터 신호를 촉발하는 표적 분자에 직접 결합하는 경우, 신호를 수신하는 단백질 또는 단백질 복합체의 일부분이다. 예를 들어, CER과 표적 분자의 결합에 대한 반응으로, 효과기 도메인은 숙주 세포의 내부에 신호를 도입시켜, 효과기 기능, 예를 들어, 포식작용, 포식리소좀 성숙, 항-염증성 및/또는 면역억제성 사이토카인의 분비, 염증성 사이토카인 및/또는 케모카인의 분비를 유도할 수 있다. 효과기 도메인은 이것이 하나 이상의 신호전달 도메인 또는 모티프를 포함하는 경우, 세포성 반응을 직접적으로 촉진할 수 있다. 다른 실시형태에서, 효과기 도메인은, 세포성 반응을 직접적으로 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과 결합함으로써, 세포성 반응을 간접적으로 촉진할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종" 또는 "비-내인성" 또는 "외인성"은 숙주 세포 또는 대상체에 대해 천연의 것이 아니거나, 숙주 또는 숙주 세포에 대해 천연의 것인 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 분자, 또는 활성이나, 천연 분자와 돌연변이 분자 사이에 구조, 활성, 또는 둘 모두가 상이하도록 변이되거나, 돌연변이된 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 분자, 또는 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 이종, 비-내인성 또는 외인성 분자 (예를 들어, 수용체, 리간드)는 숙주 세포 또는 대상체에 대해 내인성이 아닐 수 있으나, 대신에, 이러한 분자를 인코딩하는 핵산이 접합, 형질전환, 형질감염, 전기천공 등에 의해 숙주 세포에 첨가될 수 있으며, 첨가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈에 혼입될 수 있거나, 염색체 외 유전 물질 (예를 들어, 플라스미드 또는 다른 자가 복제 벡터)로서 존재할 수 있다. 용어 "상동성" 또는 "상동체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에 존재하거나, 그로부터 유래하는 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 이종 또는 외인성 분자 또는 이러한 분자를 인코딩하는 유전자는 천연 숙주 또는 숙주 세포 또는 분자를 인코딩하는 유전자에 대해 각각 상동성일 수 있으나, 변이된 구조, 서열, 발현 수준, 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 비-내인성 분자는 동일한 종, 상이한 종 또는 이들의 조합으로부터 유래할 수 있다.
"연접 아미노산" 또는 "연접 아미노산 잔기"는 폴리펩타이드의 2개의 인접 모티프, 영역 또는 도메인 사이의 하나 이상의 (예를 들어, 약 2 내지 20개의) 아미노산 잔기를 지칭한다. 연접 아미노산은 키메라 단백질의 작제물 설계로부터 생성될 수 있다 (예를 들어, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 부위의 사용에 의해 생성되는 아미노산 잔기).
"핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하여, RNA 또는 DNA의 형태로 존재할 수 있다. 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있으며, 단일 가닥인 경우, 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티센스 가닥)일 수 있다. 코딩 분자는 당 업계에 공지된 코딩 서열과 동일한 코딩 서열을 가질 수 있거나, 유전자 코드의 가외성 또는 축퇴의 결과로서, 또는 스플라이싱 (splicing)에 의해, 동일한 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있는 상이한 코딩 서열을 가질 수 있다.
항원의 "과발현된" 또는 "과발현"이란 용어는 세포에서의 비정상적으로 높은 수준의 항원 발현을 지칭한다. 과발현된 항원 또는 항원의 과발현은 종종 혈액학적 악성 종양 및 대상체의 특정 조직 또는 기관 내에 고형 종양을 형성하는 세포와 같은 질병 상태와 연관된다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액학적 악성 종양은 당 업계에 공지된 표준 분석에 의해 규정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호 혼용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유결합적으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 포함해야 하며, 및 제한없이, 단백질 또는 펩타이드 서열을 포함할 수 있는 최대 수의 아미노산에 상응한다. 폴리펩타이드는 서로 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 또한 당 업계에서 통상적으로, 예를 들어, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로서 지칭되는 짧은 사슬, 및 당 업계에서 일반적으로, 다수의 유형이 존재하는 단백질로서 지칭되는 더 긴 사슬 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩타이드"는, 예를 들어, 특히, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "성숙 폴리펩타이드" 또는 "성숙 단백질"은 세포 막 또는 특정 세포 기관 (예를 들어, 소포체, 골지체 또는 엔도솜) 내부에 분비되거나, 위치화되고, N-말단 신호 펩타이드를 포함하지 않는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
또한 "신호 서열", "리더 서열", " 리더 펩타이드", "위치화 신호" 또는 "위치화 서열"로 지칭되는 "신호 펩타이드"는 분비 경로로 배정될 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩타이드 (일반적으로 15 내지 30개의 아미노산 길이)이다. 신호 펩타이드는 통상적으로 N-말단에 짧은 길이의 친수성의 양전하를 띤 아미노산, 중간 부분의 5 내지 15개의 잔기의 소수성 도메인 및 신호 펩티다제의 절단 부위를 갖는 C-말단 영역을 포함한다. 진핵생물에서, 신호 펩타이드는 소포체로의 새로 합성된 단백질의 이동을 촉발하고, 여기서, 이는 신호 펩티다제에 의해 절단되어, 성숙 단백질을 생성한 후, 적절한 목적지로 진행된다.
2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "동일성 퍼센트"는 2개 이상의 서열의 정렬을 최적화하기 위해, 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 2개 이상의 서열 사이의 서열의 비교 및 동일성 퍼센트의 결정은 그의 디폴트 매개변수 (default parameter)에서의 수학적 알고리즘, 예컨대 BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하여 달성할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990]; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST의 BLASTN 참조).
"보존적 치환"은 당 업계에서, 하나의 아미노산이 유사한 특성을 가진 또 다른 아미노산으로 치환된 것으로서 인식되어 있다. 예시적인 보존적 치환은 당 업계에 잘 인식되어 있다 (예를 들어, 1997년 3월 13일자로 공개된 WO 97/09433의 10 페이지; 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8] 참조).
용어 "키메라"는 내인성이 아니며, 자연 상태에서 정상적으로는 함께 결합되거나, 연결되어 존재하지 않는, 함께 결합되거나, 연결된 서열을 포함하는 임의의 핵산 분자 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 키메라 핵산 분자는 상이한 공급원으로부터 유래한 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래하지만, 자연 상태에 존재하는 것과 상이한 방식으로 정렬된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 폴리뉴클레오타이드 서열의 특이적 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기전 또는 도입된 합성 기전에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우, 이 서열은 핵심 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우, 이 서열은 또한 유전자 산물의 발현에 필요한 인핸서 서열 및 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 서열일 수 있다.
"항시적(constitutive)" 프로모터는 유전자 산물을 인코딩하거나, 특정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 경우, 세포의 대부분 또는 모든 생리적 조건하에서 유전자 산물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오타이드 서열이다.
"유도성" 프로모터는 유전자 산물을 인코딩하거나, 특정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 경우, 실질적으로, 프로모터에 해당하는 유도인자가 세포 내에 존재할 때에만, 유전자 산물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오타이드 서열이다.
"조직-특이적"프로모터는 유전자 산물을 인코딩하거나, 특정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결된 경우, 실질적으로, 세포가 프로모터에 해당하는 조직 유형의 세포인 때에만, 유전자 산물이 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오타이드 서열이다.
용어 "대상체", "환자" 및 "개체"는 본 명세서에서 상호 혼용되며, 면역 반응이 유도될 수 있는 살아 있는 유기체 (예를 들어, 포유류)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간, 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼, 기니아피그, 돼지 및 이들의 트렌스제닉 종 (transgenic species)을 포함한다.
용어 "T 세포"는 T 세포 계통의 세포를 지칭한다. "T 세포 계통의 세포"는 세포를 다른 림프성 세포 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포와 구별하는 T 세포 또는 그의 전구체 또는 전구세포의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특성은 T 세포에 특이적인 하나 이상의 단백질 (예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+), 또는 T 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능적 또는 면역학적 특징의 발현을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 계통의 세포는 T 세포 계통으로 결정된 전구세포 또는 전구체 세포; CD25+ 불활성화된 미성숙 T 세포; CD4 또는 CD8 계통 결정을 거친 세포; CD4+CD8+ 이중 양성인 흉선 세포 전구세포; 단일 양성 CD4+ 또는 CD8+; TCRαβ 또는 TCR γδ; 또는 기능성이거나, 활성화된 성숙 T 세포일 수 있다. 용어 "T 세포" 나이브 T 세포 (naive T cell) (CD45 RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-), 중앙 기억 T 세포 (CD45RO+, CD62L+, CD8+), 효과기 기억 T 세포 (CD45RA+, CD45RO-, CCR7-, CD62L-, CD27-), 점막-연관 불변 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 조직 상재 T 세포를 포괄한다.
용어 "B 세포"는 B 세포 계통의 세포를 지칭한다. "B 세포 계통의 세포"는 세포를 다른 림프성 세포 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포와 구별하는 B 세포 또는 그의 전구체 또는 전구세포의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특성은 B 세포에 특이적인 하나 이상의 단백질 (예를 들어, CD19+, CD72+, CD24+, CD20+), 또는 B 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능적 또는 면역학적 특징의 발현을 포함할 수 있다. 예를 들어, B 세포 계통의 세포는 B 세포 계통으로 결정된 전구세포 또는 전구체 세포 (예를 들어, 프리-프로-B 세포, 프로-B 세포, 및 프리-B 세포); 불활성화된 미성숙 B 세포 또는 기능성이거나, 활성화된 성숙 B 세포일 수 있다. 따라서, "B 세포"는 나이브 B 세포, 혈장 세포, 조절 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 림프형질세포양 세포, 형질아세포 세포, 및 기억 B 세포 (예를 들어, CD27+, IgD-)를 포괄한다.
본 개시내용의 키메라 단백질 또는 키메라 단백질을 발현하는 세포 (예를 들어, CER 또는 CER을 발현하는 세포)의 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 치료할 질병, 장애, 또는 바람직하지 않은 상태의 하나 이상의 증상의 개선을 야기하기에 충분한 단백질 또는 세포의 양을 지칭한다. 단독으로 투여되는, 개별 활성 구성요소 또는 단일 활성 구성요소를 발현하는 세포를 지칭하는 경우, 치료 유효량은 그 구성요소 또는 구성요소를 발현하는 세포의 효과를 지칭한다. 조합을 지칭하는 경우, 치료 유효량은 연속적으로 또는 동시에 투여되는지와 상관없이, 치료 효과를 야기하는 활성 구성요소를 발현하는 세포와 활성 구성요소 또는 조합된 부가적 활성 구성요소의 조합된 양을 지칭한다.
"치료하다" 또는 "치료" 또는 "개선"은 대상체의 질병, 장애, 또는 바람직하지 않은 상태의 의료적 관리를 지칭한다. 일반적으로, 본 개시내용의 CER을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 적절한 투여량 또는 처리 용법은 치료적 또는 예방적 이점을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 또는 예방적/억제적 이점은 개선된 임상 결과; 질병, 장애, 또는 바람직하지 않은 상태와 연관된 증상의 감소 또는 완화; 저하된 증상 발생률; 개선된 삶의 질; 더 긴 무질병 상태; 질병, 장애, 또는 바람직하지 않은 상태의 정도의 감소; 질병 상태의 안정화; 질병 진행의 지연; 호전; 생존; 연장된 생존; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전사 제어하에" 또는 "작동 가능하게 연결된"이라는 어구는 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시 및 폴리뉴클레오타이드의 발현을 제어하기 위해, 폴리뉴클레오타이드와 연관하여 정확한 위치 및 배향으로 존재함을 의미한다.
"벡터"는 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지일 수 있다. 이 용어는 또한 세포로의 핵산의 전달을 촉진하는 비 플라스미드 및 비 바이러스 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "발현 벡터"는 적절한 환경에 존재하는 경우, 벡터에 의해 운반되는 하나 이상의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현을 유도할 수 있는 벡터이다.
특정 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 감마레트로바이러스 벡터, 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다. "레트로바이러스"는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. "감마레트로바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 지칭한다. 감마레트로바이러스의 예는 마우스 줄기세포 바이러스, 쥣과동물 백혈병 바이러스, 고양이과 백혈병 바이러스, 고양이과 육종 바이러스, 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다. "렌티바이러스"는 분열 및 비 분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, HIV 1형 및 HIV 2형, 말과 감염성 빈혈 바이러스, 고양이과 면역결핍 바이러스 (FIV), 소과 면역 결핍 바이러스 (BIV), 및 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함하여, HIV (인간 면역결핍 바이러스)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 비-바이러스 벡터의 예는 지질 기반 DNA 벡터, 변형된 mRNA (modRNA), 자가 증폭 mRNA, 폐쇄 말단 선형 이중가닥 (CELiD) DNA, 및 전이인자-매개 유전자 전달 (PiggyBac, 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty))를 포함한다. 비-바이러스 전달 시스템이 사용되는 경우, 전달 비히클은 리포솜일 수 있다. 지질 제형은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 핵산을 숙주 세포에 도입시키는 데 사용될 수 있다. 핵산은 리포솜의 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 미셀에 포함되거나, 그와 복합체화된 리포솜 및 핵산 둘 모두와 결합된 연결 분자를 통해, 리포솜에 결합되거나, 달리는 지질과 결합될 수 있다.
추가의 정의가 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공된다.
키메라 포식작용 수용체 (CER)
키메라 포식작용 수용체 (CER)가 본 명세서에 기재된다. 특정 실시형태에서, CER은 키메라, 단일 사슬 단백질이며, 이는 막관통 도메인에 의해 연결된 세포외 도메인 및 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 세포외 결합 도메인 및 선택적으로, 세포외 스페이서 도메인을 포함한다. 숙주 세포에서 발현되는 경우, CER은 표적 세포, 미생물, 입자, 또는 다른 물질 상에 존재하거나, 이에 의해 발현되는 선택된 전-포식작용 마커 또는 항원 마커에 특이적인 변형된 숙주 세포에 포식작용 표현형을 부여한다 (숙주 세포는 포식작용 표현형으로 "교체"됨). 특정 실시형태에서, CER은 표적 세포, 미생물, 입자, 또는 다른 물질 상에 존재하거나, 이에 의해 발현되는 선택된 전-포식작용 마커 또는 항원 마커에 특이적인 변형된 숙주 세포에 식작용 표현형을 부여한다. 특정 CER 실시형태에서, 키메라 단백질은 아미노 말단에서 카복시 말단으로: 표적 분자에 특이적인 결합 도메인을 갖는 세포외 도메인 및 선택적 세포외 스페이서 도메인;막관통 도메인; 및 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (예를 들어, 도 1a 및 도 1b 참조).
본 명세서에 개시된 바와 같은 CER의 성분 부품은 요망되는 포식작용 표현형을 제공하는 것으로 선택 및 정렬될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 (i) 아폽토시스, 사멸, 사멸 중, 손상, 또는 괴사 세포와 연관된 전-포식작용 마커 또는 (ii) 감염, 질병, 장애, 또는 다른 바람직하지 않은 상태와 연관된 외래 (예를 들어, 미생물), 감염 또는 이상 세포에 의해 디스플레이되는 항원 마커에 특이적인 결합 도메인을 포함할 수 있다.
포식작용 신호전달 도메인은 표적화된 세포의 포식작용을 유도하는 하나 이상의 효과기 (또한 "신호전달"로 지칭됨) 도메인을 포함할 수 있다. 포식작용 신호전달 도메인에 의한 신호전달은 세포외 도메인과 표적화된 전-포식작용 또는 항원 마커의 결합에 의해 촉발된다. 특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 반응을 개시하는 것으로 선택된다. 대안적으로, 다른 실시형태에서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 반응을 개시하는 것으로 선택된다. 다른 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하며, 1차 및 2차 포식작용 신호전달 도메인은 둘 모두 항상성 신호전달 도메인이거나, 둘 모두 전염증성 신호전달 도메인이거나, 각각 하나씩이다 (임의의 순). 본 개시내용에 따른 CER은, 요망되는 치료 결과 (예를 들어, 항상성 또는 전염증성 포식작용 신호전달)를 보완하는 포식작용 신호전달을 제공하면서, 다양한 치료 상황 (예를 들어, 아폽토시스, 사멸, 사멸 중, 손상, 감염 또는 괴사 세포의 제거, 감염성 질병의 원인 미생물의 제거, 및 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태와 연관된 이상 세포의 제거)에 적용하기 위해, 조작될 수 있다.
도 3a 및 도 3b는 본 개시내용의 CER의 예에 의해 변형된 림프구와 천연 림프구의 기능성 비교를 제공한다. 도 3a는 내인성 림프구를 도시하며, 도면에 제시된 바와 같이, 천연 림프구는 포식작용 표현형을 나타내지 않는다. 그러나, 도 3b에 예시된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CER을 발현하도록 변형된 림프구는 표적화된 암 세포에 특이적인 포식작용 표현형을 나타내며, 이에 의해, 포식작용 (예를 들어, 식작용) 및 표적화된 암 세포의 제거가 야기된다. 더욱 추가로, 도 3b에 예시된 바와 같이, 특정 실시형태에서, CER은 포식작용 과정의 분극화를 유도하도록 조작될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 기재내용에 따른 CER에 포함된 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 또는 전염증성 포식작용 신호전달을 유도하는 것으로 선택될 수 있다.
본 개시내용의 융합 단백질의 성분 부위가 본 명세서에서 상세하게 추가로 기재된다.
세포외 도메인
본 명세서에 기재된 바와 같이, CER은 표적 분자에 특이적인 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 표적화된 전-포식작용 마커 또는 항원과 특이적으로 결합하는 세포외 결합 도메인을 포함한다. 결합 도메인에 의한 표적 분자의 결합은 표적 분자 (예를 들어, 수용체 또는 리간드)와 또 다른 분자 사이의 상호작용을 차단할 수 있으며, 예를 들어, 표적 분자 (예를 들어, 신호 형질도입)의 특정 기능을 간섭하거나, 감소시키거나, 제거할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 분자의 결합은 제거를 위해, 특정 생물학적 경로를 유도할 수 있거나, 표적 분자 또는 표적 분자를 발현하는 세포를 확인할 수 있다.
결합 도메인은 대상 표적 분자와 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩타이드 또는 펩타이드일 수 있다. 결합 도메인의 공급원은 인간, 설치류, 조류 또는 양을 포함하여, 다양한 종으로부터의 수용체 결합 도메인, 리간드 결합 도메인, 및 항체 또는 항원 결합 부분, 예컨대 항체 가변 영역 (항체의 형태, sFv, scFv, Fab, scFv-기반 그라바바디 (grababody), 또는 가용성 VH 도메인 또는 도메인 항체일 수 있음)을 포함한다. 결합 도메인의 추가의 공급원은 낙타과 (낙타, 단봉 낙타 또는 라마; 문헌[Ghahroudi et al., FEBS Lett. 414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 및 Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998]), 수염 상어 (문헌[Roux et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998]), 은상어 (문헌[Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002]), 또는 칠성장어 (문헌[Herrin et al., Proc. Nat′l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008 및 Alder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008])와 같은 다른 종으로부터의 항체의 가변 영역을 포함한다. 이러한 항체는 중쇄 가변 영역만을 사용하여, 항원 결합 영역을 형성할 수 있으며, 즉, 이러한 기능성 항체는 중쇄만의 동종이량체이다 ("중쇄 항체"로 지칭됨) (문헌[Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al., Nature Med. 12:580, 2006; and Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 283:3639, 2008]).
일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 전-포식작용 마커에 결합한다. 이러한 특정 실시형태에서, 세포외 도메인에 의해 표적화되는 전-포식작용 마커는 포스파티딜세린 (PtdSer), ICAM-3, 산화된 저 밀도 지질단백질, 칼레티쿨린, 아넥신 I, 보체 C1q, 또는 트롬보스폰딘이다. 추가의 실시형태에서, 전-포식작용 마커에 결합하는 세포외 도메인은 내인성 포식작용 수용체 또는 포식작용 수용체에 대한 가용성 가교 분자 (예를 들어, GAS6, 단백질 S, MFG-E8)로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 전체 세포외 부분 (막 횡단 분자의 경우), 전체 가교 분자, 또는 포식작용 수용체의 절두된 부분 또는 가교 분자가 사용되며, 단, 절두된 부분은 전-포식작용 마커에 대해 충분한 결합 활성을 보유한다 (즉, 기능성 변이체임). 추가의 실시형태에서, 세포외 도메인에 사용되는 포식작용 수용체 또는 가교 분자의 세포외 부분은 전체 세포외 부분 (막 횡단 분자의 경우), 전체 가교 분자, 또는 포식작용 수용체의 절두된 부분 또는 가교 분자의 변이체이며, 단, 이러한 변이체는 전-포식작용 마커에 대해 충분한 결합 활성을 보유한다 (즉, 기능성 변이체임).
일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 1 (Tim1), T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 4 (Tim4), T-세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 3 (Tim3), 스타빌린-2(stabilin-2), RAGE, 또는 Fc 수용체 (FcR) 세포외 도메인을 포함한다. 구체적 실시형태에서, FcR 세포외 도메인은 FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, 또는 FcαR1로부터의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 세포외 도메인은 Tim1, Tim4, Tim3, 스타빌린-2, 후기 당화 최종산물 (RAGE)의 수용체, 뇌-특이적 혈관형성 억제제 1 (BAI1), 유지방구-EGF 인자 8 단백질 (MFG-E8) (예를 들어, PtdSer에의 고 친화도 결합을 매개하는 FA58C2 도메인), 성장 저지 특이적 6 (GAS6), 단백질 S, 단백질 C, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 베타 2-당단백질 I, α5β3 인테그린 및 다른 인테그린, CR3 보체 수용체, CR4 보체 수용체, CD14, CD93, 아넥신 V, 포스파티딜세린 수용체 (PSr), 프로트롬빈, 또는 스캐빈저 수용체(scavenger receptor), 예컨대 스캐빈저 수용체 B (SRB) (예를 들어, SRB1 (CD36)), 스캐빈저 수용체 C (SRC) (예를 들어, LOX-1, SRCL), 스캐빈저 수용체 D (SRD) (예를 들어, CD68, 마크로시알린 (macrosialin)), 및 PSOX로부터의 PtdSer 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열 또는 서열번호 31의 아미노산 16 내지 292를 포함하는 FcγRI 결합 도메인, 서열번호 28의 아미노산 서열 또는 서열번호 28의 아미노산 21 내지 290을 포함하는 TIM1 결합 도메인, 서열번호 29의 아미노산 서열 또는 서열번호 29의 아미노산 25 내지 314를 포함하는 TIM4 결합 도메인, 서열번호 34의 아미노산 서열 또는 서열번호 34의 아미노산 22 내지 202를 포함하는 TIM3 결합 도메인, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 FA58C2 결합 도메인, 서열번호 32의 아미노산 서열 또는 서열번호 32의 아미노산 31 내지 94를 포함하는 GAS6 결합 도메인, 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 BAI1 결합 도메인, 또는 서열번호 33의 아미노산 서열 또는 서열번호 33의 아미노산 25 내지 87을 포함하는 단백질 S 결합 도메인과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 서열번호 4에 따른 FcγRI 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 1에 따른 TIM1 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 2에 따른 TIM4 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 7에 따른 TIM3 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 3에 따른 FA58C2 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 5에 따른 GAS6 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 135에 따른 BAI1 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 서열번호 6에 따른 단백질 S 결합 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다.
다른 실시형태에서, 세포외 도메인은 다음 중 적어도 하나로부터 유래한다: ICAM3에 결합하는 CD14; 산화된 LDL에 결합하는 스캐빈저 수용체 세포외 도메인; 변이된 당에 결합하는 렉틴; 트롬보스폰딘에 결합하는 CD36; 또는 칼레티쿨린에 결합하는 LRP1/CD91 또는 렉틴 모이어티.
다른 실시형태에서, 세포외 도메인은 대상 표적 분자에 특이적인 VH 및 VL 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는 키메라, 인간, 또는 인간화된 것이다. 추가의 실시형태에서, VH 및 VL 영역은 인간 또는 인간화된 것이다. 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 전-포식작용 마커에 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합 부분이다. 포스파티딜세린에 특이적인 항체는 당 업계에 공지되어 있다 (미국 특허 제 7,247,303호; 문헌[Khogeer et al., 2015, Lupus 24:186-90; Gerber et al., 2015, Am. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 5:493-503] 참조, 각 문헌은 그 전문이 참조로 포함됨). 특정 실시형태에서, 대상 표적 분자는 종양 항원, 예를 들어 CD138, CD38, CD33, CD123, CD72, CD79a, CD79b, 메소텔린, PSMA, BCMA, ROR1, MUC-16, L1CAM, CD22, CD19, CD20, CD23, CD24, CD37, CD30, CA125, CD56, c-Met, EGFR, GD-3, HPV E6, HPV E7, MUC-1, HER2, 엽산 수용체 α, CD97, CD171, CD179a, CD44v6, WT1, VEGF-α, VEGFR1, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-11Rα, PSA, FcRH5, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, TAG-72, CEA, 에프린 A2, 에프린 B2, 루이스 A 항원 (Lewis A antigen), 루이스 Y 항원, MAGE, MAGE-A1, RAGE-1, 엽산 수용체 β, EGFRviii, VEGFR-2, LGR5, SSX2, AKAP-4, FLT3, 푸코실 GM1, GM3, o-아세틸-GD2, 및 GD2이며, 예시적 VH 및 VL 영역은 각각 항-CD138, -CD38, -CD33, -CD123, -CD72, -CD79a -CD79b, -메소텔린, -PSMA, -BCMA, -ROR1, -MUC-16, -L1CAM, -CD22, -CD19, -CD20, -CD23, -CD24, -CD37, -CD30, -CA125, -CD56, -c-Met, -EGFR, -GD-3, -HPV E6, -HPV E7, -MUC-1, -HER2, -엽산 수용체 α, -CD97, -CD171, -CD179a, -CD44v6, -WT1, -VEGF-α, -VEGFR1, -IL-13Rα1, -IL-13Rα2, -IL-11Rα, -PSA, -FcRH5, -NKG2D 리간드, -NY-ESO-1, -TAG-72, -CEA, -에프린 A2, -에프린 B2, -루이스 A 항원, -루이스 Y 항원, -MAGE, -MAGE-A1,-RAGE-1, -엽산 수용체 β, -EGFRviii, -VEGFR-2, -LGR5, -SSX2, -AKAP-4, -FLT3, -푸코실 GM1, -GM3, -o-아세틸-GD2, 및 -GD2 특이적 단일클론 항체의 절편을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 세포외 도메인은 대상 표적에 특이적인 Fab를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 대상 표적은 CD138, CD38, CD33, CD123, CD72, CD79a, CD79b, 메소텔린, PSMA, BCMA, ROR1, MUC-16, L1CAM, CD22, CD19, CD20, CD23, CD24, CD37, CD30, CA125, CD56, c-Met, EGFR, GD-3, HPV E6, HPV E7, MUC-1, HER2, 엽산 수용체 α, CD97, CD171, CD179a, CD44v6, WT1, VEGF-α, VEGFR1, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-11Rα, PSA, FcRH5, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, TAG-72, CEA, 에프린 A2, 에프린 B2, 루이스 A 항원, 루이스 Y 항원, MAGE, MAGE-A1, RAGE-1, 엽산 수용체 β, EGFRviii, VEGFR-2, LGR5, SSX2, AKAP-4, FLT3, 푸코실 GM1, GM3, o-아세틸-GD2, 및 GD2를 포함하며, Fab 영역은 각각 항-CD138, -CD38, -CD33, -CD123, -CD72, -CD79a, -CD79b, -메소텔린,-PSMA, -BCMA,- ROR1, -MUC-16, -L1CAM, -CD22, -CD19, -CD20, -CD23, -CD24, -CD37, -CD30, -CA125, -CD56, -c-Met, -EGFR, -GD-3, -HPV E6, -HPV E7, -MUC-1, -HER2, -엽산 수용체 α, -CD97, -CD171, -CD179a, -CD44v6, -WT1, -VEGF-α, -VEGFR1, -IL-13Rα1, -IL-13Rα2, -IL-11Rα, -PSA, -FcRH5, -NKG2D 리간드, -NY-ESO-1, -TAG-72, -CEA, -에프린 A2, -에프린 B2, -루이스 A 항원, -루이스 Y 항원, --MAGE, MAGE-A1, -RAGE-1, -엽산 수용체 β, -EGFRviii, -VEGFR-2, -LGR5, -SSX2, AKAP-4, -FLT3, -푸코실 GM1, -GM3, -o-아세틸-GD2, 및 -GD2 특이적 단일클론 항체의 일부분을 포함한다.
본 개시내용의 CER의 세포외 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 표적 분자는 대상 세포 ("표적 세포") 상에 또는 그와 결합하여 존재할 수 있다. 예시적 표적 세포는 암 세포, 자가면역 질병 또는 장애 또는 염증성 질병 또는 장애와 연관된 세포, 및 감염성 미생물 (예를 들어, 박테리아, 바이러스, 또는 진균), 또는 감염 세포 (예를 들어, 바이러스-감염 세포)를 포함한다. 감염성 유기체, 예컨대 포유류 기생충의 세포가 또한 표적 세포로서 고려된다.
일부 실시형태에서, 세포외 도메인 선택적으로 세포외, 비-신호전달 스페이서 또는 링커 도메인을 포함한다. 이러한스페이서 또는 링커 도메인이 포함되는 경우, 이는 추가로 적절한 세포/세포 접촉, 결합, 및 활성화가 가능하도록, 숙주 세포 표면으로부터 떨어져 있는 결합 도메인을 위치시킬 수 있다. 세포외 스페이서 도메인은 일반적으로 세포외 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한다. 세포외 스페이서의 길이는 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프, 결합 도메인 크기 및 친화도를 기반으로 하여, 표적 분자 결합을 최적화하기 위해, 다양할 수 있다 (예를 들어, 문헌[Guest et al., J. Immunother. 28:203-11, 2005; PCT Publication No. WO　2014/031687]; PCT 공보 WO　2014/031687 참조). 특정 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD)이다. 면역글로불린 힌지 영역은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변이된 야생형 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 변이된 IgG4 힌지 영역은 PCT 공보 WO　2014/031687에 기재되어 있으며, 힌지 영역은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 특정 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 ESKYGPPCPPCP (서열번호 67)의 아미노산 서열을 갖는 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함한다. 본 명세서에 기재된 CER에 사용될 수 있는 힌지 영역의 다른 예는 1형 막 단백질의 세포외 영역, 예컨대 CD8a, CD4, CD28 및 CD7에 존재하는 힌지 영역을 포함하며, 이는 야생형 또는 그의 변이체일 수 있다. 추가의 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 면역글로불린 Fc 도메인의 전체 또는 일부분을 포함한다 (예를 들어, PCT 공보 WO2014/031687 참조, 스페이서는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨). 추가의 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 II형 C-렉틴의 스토크 영역(stalk region) (C-유형 렉틴 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 도메인)을 포함할 수 있다. II형 C-렉틴은 CD23, CD69, CD72, CD94, NKG2A, 및 NKG2D를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 MERTK로부터 유래할 수 있다.
포식작용 신호전달 도메인
CER의 포식작용 신호전달 도메인은 세포내 효과기 도메인 및 CER의 세포외 도메인과 표적 분자의 결합에 대한 반응으로 세포에 기능성 신호를 전송할 수 있다. 특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 하나 이상의 항상성 포식작용 신호전달 도메인, 하나 이상의 전염증성 신호전달 도메인, 또는 둘 모두항상성 신호전달 도메인 및 전염증성 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 내인성 포식작용 수용체의 세포내 신호전달 도메인이다. 포식작용 신호전달 도메인이 유래할 수 있는 내인성 포식작용 수용체의 예는 Mer 티로신 키나제 (MERTK), Tyro3 단백질 티로신 키나제, Axl 수용체 티로신 키나제, BAI1, 만노스 수용체 C-1형 (MRC1), 및 Fc 수용체 (FcR) (예를 들어, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, 또는 FcαR1)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 식작용 동안의 신호전달 경로와 연관된 내인성 키나제 또는 어댑터 단백질 (adaptor protein)의 세포내 신호전달 도메인이다. 식작용 신호전달 경로와 연관된 키나제의 예는 비장 연관 티로신 키나제 (SYK), T 세포 수용체 연관 단백질 키나제 70 (Zap70)의 제타 사슬, 및 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K)를 포함한다.
포식작용 신호전달 도메인은 충분한 신호전달 활성을 보유하는 포식작용 신호전달 분자의 임의의 일부분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 포식작용 신호전달 분자의 전장 또는 전장의 세포내 성분이 사용된다. 일부 실시형태에서, 포식작용 신호전달 분자의 절두된 일부분 또는 포식작용 신호전달 분자의 세포내 성분이 사용되며, 단, 절두된 일부분은 충분한 신호 형질도입 활성을 보유한다. 추가의 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 포식작용 신호전달 분자의 전체 또는 절두된 일부분의 변이체이며, 단, 변이체는 충분한 신호 형질도입 활성을 보유한다 (즉, 기능성 변이체임).
특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인, 예를 들어 MRC1 신호전달 도메인, ItgB5 신호전달 도메인, MERTK 신호전달 도메인, Tyro3 신호전달 도메인, Axl 신호전달 도메인, BAI1 신호전달 도메인, 또는 ELMO 신호전달 도메인을 포함한다. 더욱 특정한 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 신호전달 도메인, 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 ItgB5 신호전달 도메인, 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 신호전달 도메인, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 신호전달 도메인, 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 신호전달 도메인, 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 BAI1 신호전달 도메인, 또는 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 ELMO 신호전달 도메인과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함하는 항상성 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인을 포함하며, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 55에 따른 MRC1 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 137에 따른 ItgB5 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 138에 따른 MERTK 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 18에 따른 Tyro3 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 17에 따른 Axl 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 139에 따른 BAI1 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 서열번호 140에 따른 ELMO 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된다.
특정 실시형태에서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인에 의한 신호전달은 적어도 하나의 항-염증성 사이토카인 및 면역억제성 사이토카인의 발현을 야기한다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 항-염증성 사이토카인 및 면역억제성 사이토카인은 TGF-β, IL-10, 또는 둘 모두이다.
특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인, 예를 들어Traf6 신호전달 도메인, Syk 신호전달 도메인, MyD88 신호전달 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인 (예를 들어, 사멸 도메인을 포함하나, Toll/인터루킨-1 수용체 (TIR) 상동성 도메인이 부재함), Zap70 신호전달 도메인, PI3K 신호전달 도메인, FcR 신호전달 도메인 (FcγR1 신호전달 도메인, FcγR2A 신호전달 도메인, FcγR2C 신호전달 도메인, FcγR2B2 신호전달 도메인, FcγR3A 신호전달 도메인, FcγR2C 신호전달 도메인, FcγR3A 신호전달 도메인, FcεR1 신호전달 도메인, 및 FcαR1 신호전달 도메인을 포함함), B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFF-R) 신호전달 도메인, DAP12 (또한 TYRO 단백질 티로신 키나제 결합 단백질 (TYROBP)로 지칭됨) 신호전달 도메인, ITAM 모티프 1 (NFAM1)을 갖는 NFAT 활성화 단백질 신호전달 도메인, 또는 CD79b 신호전달 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 Traf6 신호전달 도메인, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 Syk 신호전달 도메인, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 Zap70 신호전달 도메인, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 신호전달 도메인, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR1 신호전달 도메인, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2A 신호전달 도메인, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2C 신호전달 도메인, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR3A 신호전달 도메인, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 BAFF-R 신호전달 도메인, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 신호전달 도메인, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 NFAM1 신호전달 도메인, 서열번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 NFAM1 신호전달 도메인, 또는 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 CD79b 신호전달 도메인과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함하는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다.
다른 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인을 포함하며, 전염증성 신호전달 도메인은 서열번호 27에 따른 Traf6 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 19에 따른 Syk 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 26에 따른 MyD88 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 99에 따른 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 20에 따른 Zap70을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 141에 따른 FcεRIγ 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 21에 따른 FcγR1 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 22에 따른 FcγR2A 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 23에 따른 FcγR2C 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 24에 따른 FcγR3A 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 126에 따른 BAFF-R 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 127에 따른 DAP12 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 129에 따른 NFAM1 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 서열번호 128에 따른 CD79b 신호전달 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 제공된다.
추가의 실시형태에서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인에 의한 신호전달은 적어도 하나의 염증성 사이토카인, 염증성 케모카인, 또는 공자극성 세포 표면 마커의 발현을 야기한다. 추가의 실시형태에서, 염증성 사이토카인은 TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, 또는 IL-23이고; 염증성 케모카인은 CCL5 (RANTES), CXCL9, 또는 CXCL10이고; 공자극성 세포 표면 마커는 CD80, CD86, HLA-DR, CD40, HVEM, 또는 4-1BBL이거나; 이들의 임의의 조합이다.
추가의 실시형태에서, CER의 포식작용 신호전달 도메인은 하나 초과의 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 포식작용 신호전달 도메인이 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 실시형태에서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인일 수 있다. 유사하게, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, CER은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 둘 모두 항상성 포식작용 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 특정 실시형태에서, CER은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 둘 모두 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인 2차 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CER은 항상성 포식작용 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CER은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 항상성 포식작용 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인이 둘 모두 항상성 포식작용 신호전달 도메인이거나, 둘 모두 전염증성 신호전달 도메인인 이들 실시형태에서, 1차 및 2차 포식작용 신호전달 도메인은 동일하거나, 상이할 수 있다. 구체적 실시형태에서, 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인으로서 사용되며, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 MRC1, ItgB5, MERTK, ELMO, BAI1, Tyro3, Axl, Traf6, Syk, MyD88, Zap70, PI3K, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, FcαR1, BAFF-R, DAP12, NFAM1, 및 CD79b를 포함하는 본 명세서에 기재된 특이적 신호전달 도메인 중 하나 이상으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인의 존재는 CER의 포식작용 활성, CER 변형된 숙주 세포의 지속성, CER 변형된 숙주 세포의 확장, 또는 이들의 조합을 증대시킨다. 특정 실시형태에서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인인 1차 포식작용 신호전달 도메인과 전염증성 신호전달 도메인인 2차 포식작용 신호전달 도메인의 포함은 CER의 포식작용 활성, CER 변형된 숙주 세포의 지속성, CER 변형된 숙주 세포의 확장, 또는 이들의 조합을 증대시킨다.
막관통 도메인
막관통 도메인은 세포외 도메인 및 포식작용 신호전달 도메인을 연결하고, 그 사이에 위치한다. 막관통 도메인은 숙주 세포 막을 가로지르는 소수성 알파 나선이다. 막관통 도메인은 존재한다면, 결합 도메인 또는 세포외 스페이서 도메인에 직접 융합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 완전한 막 단백질 (예를 들어, 수용체, 분화 (CD) 분자의 군집, 효소, 운반체, 세포 부착 분자 등)로부터 유래한다. 막관통 도메인은 CER에 포함된 세포외 도메인 또는 포식작용 신호전달 도메인과 자연적으로 결합될 수 있다 (예를 들어, CER은 Tim4 결합 도메인 및 Tim4 막관통 도메인을 포함함). 특정 실시형태에서, 막관통 도메인 및 세포외 도메인이 상이한 분자로부터 유래하거나, 막관통 도메인 및 포식작용 신호전달 도메인이 상이한 분자로부터 유래하거나, 막관통 도메인, 세포외 도메인, 및 포식작용 신호전달 도메인이 모두 상이한 분자로부터 유래한다.
특정 실시형태에서, 막관통 도메인은 Tim1 막관통 도메인, Tim4 막관통 도메인, FcR 막관통 도메인 (예를 들어, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, 또는 FcαR1 막관통 도메인), CD8a 막관통 도메인, MERTK 막관통 도메인, Axl 막관통 도메인, Tyro3 막관통 도메인, BAI1 막관통 도메인, CD4 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인MRC1 막관통 도메인, 또는 DAP12 막관통 도메인이다.
구체적 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 Tim1 막관통 도메인, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 Tim4 막관통 도메인, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FcγRI 막관통 도메인, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 막관통 도메인, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CD8a 막관통 도메인, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 막관통 도메인, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 막관통 도메인, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 막관통 도메인, 서열번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 BAI1 막관통 도메인, 서열번호 68의 아미노산 서열에 제시된 바와 같은 CD28 막관통 도메인, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CD4 막관통 도메인, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 막관통 도메인, 또는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 막관통 도메인과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 8에 따른 Tim1 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 9에 따른 Tim4 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 85에 따른 FcεRIγ 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 10에 따른 FcγRI 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 11에 따른 CD8a 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 12에 따른 MERTK 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 13에 따른 Axl 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 14에 따른 Tyro3 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 144에 따른 CD28 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 143에 따른 BAI1 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 15에 따른 CD4 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 145에 따른 DAP12 막관통 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 제공된다.
본 명세서에 기재된 CER의 또 다른 도메인에 대한 하나의 도메인의 직접 융합이 개재 연접 아미노산의 존재를 배제하지 않는 것으로 이해된다. 연접 아미노산은 천연 또는 비 천연 (예를 들어, 키메라 단백질의 작제물 설계로부터 생성됨)의 것일 수 있다.
CER의 예
본 명세서에 개시된 바와 같은 CER의 성분 부위는 숙주 세포에 요망되는 포식작용 표현형을 제공하기 위해, 다양한 조합으로 선택 및 정렬될 수 있다. CER-변형된 숙주 세포에 의해 표적화되는 분자를 발현하거나, 이를 특징으로 하는 세포, 미생물, 또는 입자의 포식작용의 유도 이외에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CER은 표적 세포 또는 입자, 질병 상태, 및 요망되는 치료 결과에 따라, 항상성 포식작용 반응 또는 전염증성 포식작용 반응을 개시하도록 설계될 수 있다.
일 양상에서, 본 개시내용은 단일 사슬 키메라 단백질을 포함하는 키메라 포식작용 수용체 (CER)로서, 단일 사슬 키메라 단백질은 포스파티딜세린 (PtdSer)에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 포식작용 신호전달 도메인; 및 세포외 도메인과 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 막관통 도메인을 포함하는 키메라 포식작용 수용체 (CER)를 제공한다.
특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 특정 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인이다. 특정 이러한 실시형태에서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 것 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 다른 실시형태에서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인은 둘 모두 항상성 포식작용 신호전달 도메인이거나, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인이거나, 두 경우 모두 (임의의 순)일 수 있다. 이러한 특정 실시형태에서, 1차 신호전달 도메인 및 2차 신호전달 도메인에 포함된 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 항상성 포식작용 신호전달 도메인 및 전염증성 포식작용 신호전달 도메인 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 실시형태는 TIM4 PtdSer 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, TIM4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER01"로 지칭됨) (예를 들어, 도 6a 참조). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 71의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 FA58C2 PtdSer 결합 도메인 및 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함하는 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER03"으로 지칭됨) (예를 들어, 도 9a 참조). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 75의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 75의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 FA58C2 PtdSer 결합 도메인 및 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함하는 세포외 도메인, CD28 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 SYK 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 "CER04"로 지칭됨) (예를 들어, 도 11a 참조). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 70의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 TIM4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, TIM4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 Tyro3 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER08"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 83의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 TIM4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, TIM4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER09"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 84의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 84의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 TIM4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, DAP12 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER10"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 86의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 86의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 TIM4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, TIM4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 Axl 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER11"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 87의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 87의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 TIM4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, TIM4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 FcεRIγ 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER12"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 90의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 TIM4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, FcεRIγ 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 FcεRIγ 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER13"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 91의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 사멸 도메인을 포함하지만, TIR 도메인이 부재하는 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER15"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 79의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 79의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER16"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 80의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 및 NFAM1 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER25"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 93의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 BAFF-R 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER85"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 95의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER86"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 96의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 CD79b 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER89"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 98의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 NFAM1 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER90"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 100의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 100의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 CD79b 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER95"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 101의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 NFAM1 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER96"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 102의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 BAFF-R 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER93"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 103의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, BAFF-R 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER87"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 130의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, DAP12 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER88"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 131의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 131의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER92"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 133의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 133의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER94"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 134의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 134의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 NFAM1 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER96"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 102의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 절두된 NFAM1 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "절두된 NFAM1을 갖는 CER96"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드는 신호 펩타이드 서열 (서열번호 116의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, BAFFR 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER87"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 130의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 130의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, Axl 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 DAP12 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER97"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 152의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함한다.
PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 또 다른 실시형태는 Tim4 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인, Axl 신호전달 도메인을 포함하는 1차 포식작용 신호전달 도메인, 및 CD79b 신호전달 도메인을 포함하는 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다 (또한 본 명세서에서 "CER98"로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 153의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 단일 사슬 키메라 단백질을 포함하는 CER을 제공하며, 단일 사슬 키메라 단백질은 전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인;전염증성 포식작용 신호전달 도메인; 및 세포외 도메인과 전염증성 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 이러한 CER은 특이적으로 분극화되어, 표적 분자 (예를 들어, 전-포식작용 마커 또는 표적 항원)와 결합시, 염증성 또는 면역원성 포식작용 표현형을 제공한다.
전염증성 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 CER의 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 단일 사슬 키메라 단백질을 포함하는 CER을 제공하며, 단일 사슬 키메라 단백질은 전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인; 및 세포외 도메인과 전염증성 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인은 둘 모두 항상성 포식작용 신호전달 도메인이거나, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인이거나, 두 경우 모두 (임의의 순)일 수 있다.
1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 CER의 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 단일 사슬 키메라 단백질을 포함하는 CER로서, 단일 사슬 키메라 단백질은 전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 scFv을 포함하는 세포외 도메인; 포식작용 신호전달 도메인; 및 세포외 도메인과 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 막관통 도메인을 포함하는 CER을 제공하며, 여기서, 막관통 도메인 및 포식작용 신호전달 도메인은 각각 상이한 분자로부터 유래한다.
전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 scFv을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 특정 실시형태에서, 세포외 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함한다.
전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 scFv을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 CER의 실시형태는 CD19에 특이적인 scFv 결합 도메인 (예를 들어, FMC63 scFv (서열번호 66)) 및 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함하는 세포외 도메인; MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인; 및 세포외 도메인과 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함하며; 세포외 스페이서 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한다 (또한 "CER40"으로 지칭됨) (예를 들어, 도 13a 참조). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 64의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 64의 아미노산 서열을 포함한다.
전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 scFv을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 또 다른 CER은 메소텔린에 특이적인 scFv (예를 들어, M912 scFv, 서열번호 106의 아미노산 23 내지 264, 서열번호 106의 아미노산 1 내지 22의 신호 펩타이드) 및 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 절두된 MyD88 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인; 및 세포외 도메인과 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 Tim4 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인을 포함하며; 세포외 스페이서 도메인은 scFv과 막관통 도메인 사이에 위치한다 (또한 본 명세서에서 "CER50"으로 지칭됨). 특정 실시형태에서, 이러한CER은 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 신호 펩타이드 서열 (서열번호 107의 아미노산 1 내지 22)이 부재하는 서열번호 107의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포의 표면에 발현된 CER과 그의 동족 표적 분자의 결합 후, 숙주 세포 표면 상에 CER의 부수적 군집화가 유발되어, 국소적 CER 농도가 증가된다. 표적 세포 또는 입자 표면 상의 다가 리간드의 존재에 의해, 군집화가 유도된다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포의 표면에 발현된 CER과 그의 동족 표적 분자의 결합 후, CER의 이량체화 또는 다량체화가 유발되어, 세포내 포식작용 신호전달 도메인이 집약됨으로써, 그 후, 세포내 키나제의 표적이 된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 CER이 숙주 세포의 표면 상에 발현되는 경우, 표적 분자 또는 입자를 고정, 내재화 및 가공 (분해)할 수 있다 (예를 들어, 표적에 대한 식세포작용). 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 CER은 표적 분자 또는 입자를 고정 및 내재화할 수 있다 (예를 들어, 표적에 대한 포식작용). 일부 실시형태에서, 식포 내의 표적 세포 또는 입자는 식포 성숙 전 또는 그 동안에 방출될 수 있다. 더욱이, 내재화는 CER의 세포외 도메인에 의해 결합되는 전체 세포 또는 입자의 내재화를 포함할 수 있거나, CER의 세포외 도메인에 의해 결합되는 세포 또는 입자의 조각 또는 그 일부분의 내재화를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 CER은 표적 분자 또는 입자를 내재화시키지 않고, 고정시킨다. CER을 발현하는 숙주 세포는 다수의 표적 세포 또는 입자에 포식되거나, 고정될 수 있다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 표적 세포 또는 입자의 내재화 및 분해의 부재하에서도, CER을 발현하는 숙주 세포에 의한 표적 세포 또는 입자의 고정은 표적 세포 또는 입자의 분해를 야기할 수 있거나, 특정 치료 상황이 요구될 수 있는 염증 상태 (예를 들어, 암)를 촉진한다.
본 기재내용에 따른 CER의 예는 표 1 내지 표 3, 도 6a, 도 9a, 도 10a, 도 11a, 도 12a, 도 13a, 도 13b, 서열목록 및 실시예에 예시된다.
숙주 세포 및 핵산
특정 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 CER 중 임의의 하나 이상을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 요망되는 CER을 인코딩하는 핵산 서열은 표준 기법을 사용하여 당 업계에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어, 요망되는 서열 또는 그의 일부를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 동일한 서열을 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 서열을 유도함으로써, 또는 동일한 서열을 포함하는 세포 또는 조직으로부터 서열 또는 그의 일부를 직접 단리함으로써, 획득하거나, 생성할 수 있다. 대안적으로, 대상 서열을 클로닝 이외에 합성적으로 생성할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 CER 조성을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 인간, 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼, 기니아피그 또는 돼지와 같은 임의의 동물로부터 유래할 수 있다. 특정 실시형태에서, CER을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 숙주 세포와 동일한 동물 종으로부터 유래한 것이다.
본 명세서에서 제공되는 CER 조성을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 CER의 아미노 말단에 분비 경로로의 전구체 단백질의 표적화를 위한 신호 펩타이드 (또한 리더 펩타이드 또는 신호 서열로 지칭됨)를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩타이드는 선택적으로, CER의 세포성 처리 및 세포막으로의 이동 동안 세포외 도메인의 N 말단으로부터 절단된다. 신호 펩타이드 서열이 절단되거나, 제거된 폴리펩타이드는 또한 이른바 성숙 폴리펩타이드라고 할 수 있다. 본 개시내용의 CER에 사용될 수 있는 신호 펩타이드의 예는, 예를 들어, GM-CSF (서열번호 65의 아미노산 서열), Tim4 (서열번호 72의 아미노산 서열)를 포함하는 내인성으로 분비된 단백질로부터 유래하는 신호 펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 CER의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 성숙 폴리펩타이드의 서열을 포함한다. 신호 펩타이드 서열을 포함하는 본 명세서에 개시된 서열의 경우, 신호 펩타이드 서열은 인코딩된 단백질을 세포외 막으로 운반할 수 있는 또 다른 신호 펩타이드로 대체될 수 있음이 당업자에 의해 이해된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 CER을 인코딩하는 핵산 분자는 표적 숙주 세포에서 효과적인 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
요망되는 CER을 인코딩하는 핵산 분자는 대상 숙주 세포 (예를 들어, T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 림프구 전구체 세포, 항원 제시 세포, 랑게르한스 세포, 또는 골수성 세포)에서의 도입을 위해, 적절한 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터, 비-바이러스 플라스미드 벡터, 및 비-바이러스 벡터, 예컨대 지질 기반 DNA 벡터, 변형된 mRNA (modRNA), 자가 증폭 mRNA, CELiD, 및 전이인자-매개 유전자 전달 (PiggyBac, 슬리핑 뷰티))에 삽입될 수 있다. 본 개시내용의 CER을 인코딩하는 핵산 분자는 임의의 적합한 벡터, 예컨대 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 또는 시퀀싱 벡터에 클로닝될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 막관통 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 및 포식작용 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 단일 폴리뉴클레오타이드로 함께 결합시킨 후, 벡터에 삽입한다. 다른 실시형태에서, 세포외 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 막관통 도메인을 인코딩하는 핵산 서열, 및 포식작용 신호전달 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 벡터에 개별적으로 삽입하여, 생성된 아미노산 서열이 기능성 CER을 생성하도록 할 수 있다. CER을 인코딩하는 벡터는 본 명세서에서 "CER 벡터"로 지칭된다.
특정 실시형태에서, 벡터는 하나의 CER을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 다른 실시형태에서, 벡터는 2개 이상의 CER을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 일 실시형태에서, 각각의 CER을 인코딩하는 2개 이상의 핵산 분자는 벡터의 다수의 상이한 클로닝 부위에 순차적으로 클로닝되어, 각각의 CER이 상이한 프로모터의 조절하에 발현될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 다수의 CER을 인코딩하는 단일 핵산 분자를 하나의 클로닝 부위에 클로닝하여, 단일 프로모터로부터 발현시키고, 각각의 CER이 IRES 또는 바이러스 2A 펩타이드 서열에 의해 서로 분리되도록 하여, 단일 오픈 리딩 프레임으로부터 다수의 유전자의 공동 발현을 가능하게 한다 (예를 들어, 다중 시스트론 벡터). 특정 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 T2A (서열번호 147), P2A (서열번호 104), E2A (서열번호 148), 또는 F2A (서열번호 149)이다.
일부 실시형태에서, 전이 유전자의 장기적인 혼입 및 딸 세포로의 증식을 가능하게 하는 벡터가 사용된다. 예는 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 우두 바이러스, 헤르페스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 수두 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 렌티바이러스로부터 유래한 벡터가 장기적인 유전자 전달을 달성하는 데 사용될 수 있으며, 간세포와 같은 비 증식성 세포를 형질도입시키는 능력 및 낮은 면역원성을 포함하는 벡터에 비해 이점을 갖는다.
특정 실시형태에서, CER 벡터는 공간 및 시간 제어가 최적화되도록 작제될 수 있다. 예를 들어, CER 벡터는 공간 및 시간 제어가 최적화되는 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CER 벡터는 종양 또는 감염 조직과 같은 기관 또는 병적 미세 환경으로의 CER의 특이적 유도를 가능하게 하는 조직 특이적 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. "인핸서"는 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 작용할 수 있는 추가적인 프로모터 요소이다. 다른 실시형태에서, CER 벡터는 항시적 프로모터를 포함한다. 다른 실시형태에서, CER 벡터는 유도성 프로모터를 포함한다.
추가의 실시형태에서, CER 벡터는 생체내에서 귀소 및 항종양 활성을 개선하기 위해, 귀소 수용체, 예컨대 CCR4 또는 CXCR4를 포함할 수 있다.
시간 제어가 요구되는 경우, CER 벡터는 형질도입된 세포의 유도성 고갈을 가능하게 하는 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 벡터는 유도성 자살 유전자를 포함할 수 있다. 자살 유전자는 아폽토시스 유전자 또는 화학적으로 유도 가능한 카스파제 9 (iCASP9), 화학적으로 유도 가능한 Fas 또는 HSV-TK (간사이클로비르 (ganciclovir)에 대한 감응성을 부여함)와 같은 제제 (예를 들어, 약제)에 대해 감응성을 부여하는 유전자일 수 있다. 추가의 실시형태에서, CER 벡터는 관련 항체의 주입시 형질도입된 세포의 고갈을 가능하게 하는 공지된 세포 표면 항원을 발현하도록 설계될 수 있다. 형질도입된 세포의 고갈에 사용될 수 있는 세포 표면 항원 및 그의 관련 항체의 예는 CD20 및 리툭시맙, RQR8 (CD34 및 CD20 에피토프 조합, CD34 선택 및 항 CD20 결실을 가능하게 함) 및 리툭시맙 및 EGFR 및 세툭시맙을 포함한다.
독시사이클린으로 전이 유전자 발현을 활성화시키는 테트라사이클린 (Tet)-On 벡터 시스템과 같은 유도성 벡터 시스템 (문헌[Heinz et al., Hum. Gene Ther. 2011, 22:166-76])이 또한 유도성 CER 발현에 사용될 수 있다. 유도성 CER 발현은 훅 (hook)을 통해 소포체의 막에 고정된 스트렙타비딘 및 CER 구조로 도입된 스트렙타비딘 결합 단백질을 기반으로 한 선택적 훅 (RUSH) 시스템을 사용한 점유를 통해 달성될 수 있으며, 여기서, 시스템에의 바이오틴의 첨가에 의해, 소포체로부터의 CER의 방출이 유발된다 (문헌[Agaugue et al., 2015, Mol. Ther. 23 (Suppl. 1) : S88]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합" 또는 "비-천연"은 적어도 하나의 유전자 변이를 포함하거나, 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 유기체, 미세유기체, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 지칭하며, 이러한 변이 또는 변형은 유전자 조작에 의해 도입된다. 유전자 변이는, 예를 들어, 단백질, 키메라 단백질 또는 효소를 인코딩하는 발현 가능한 핵산 분자의 도입, 또는 다른 핵산 분자의 첨가, 결실, 치환 또는 세포의 유전 물질의 다른 기능적 파괴를 포함한다. 추가적 변형은, 예를 들어, 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변이시키는 비-코딩 조절 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 대상체로부터 채취한 세포, 예컨대 T 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 CER을 인코딩하는 핵산을 도입시켜, 세포가 세포 표면에 위치하는 CER을 발현하는 비-천연 또는 재조합 세포 (예를 들어, 비-천연 또는 재조합 T 세포)로 유전자 변형될 수 있다.
핵신 바이러스를 인코딩하는 벡터는 본 명세서에서 "바이러스 벡터"로 지칭된다. 인간 유전자 요법 적용을 위해 확인된 것을 포함하여, 본 개시내용의 조성으로 사용하기에 적합한 다수의 이용 가능한 바이러스 벡터가 있다 (문헌[Pfeifer and Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001] 참조). 적합한 바이러스 벡터는 RNA 바이러스를 기반으로 한 벡터, 예컨대 레트로바이러스-유래 벡터, 예를 들어, Moloney 쥣과동물 백혈병 바이러스 (MLV)-유래 벡터를 포함하며, 복합 레트로바이러스-유래 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스-유래 벡터를 포함한다. HIV-1-유래 벡터가 이 범주에 속한다. 다른 예는 HIV-2, FIV, 말과 감염성 빈혈 바이러스, SIV, 및 메디-비스나 바이러스 (Maedi-Visna virus) (양의 렌티바이러스)로부터 유래한 렌티 바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터를 사용하여, 키메라 수용체 전이 유전자를 포함하는 바이러스 입자에 의한 포유류 숙주 세포의 형질도입을 위해, 세포를 패키징하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 8,119,772호; 문헌[Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009]에 선행하여 기재된 바 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물 및 발현 시스템은 또한 시판용으로 이용 가능하다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 표적에 특이적인 CER을 인코딩하는 비 내인성 핵산 서열을 도입하기 위해 사용된다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 형질도입 마커를 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터의 형질도입 마커는 당 업계에 공지되어 있으며, 약제 내성을 부여할 수 있는 선택 마커 또는 유동 세포계측과 같은 방법에 의해 검출 가능한 형광 마커 또는 세포 표면 단백질과 같은 검출 가능한 마커를 포함한다. 특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 형광 단백질 (예를 들어, 녹색, 황색)을 포함하는 형질도입을 위한 유전자 마커, 절두된 인간 EGFR (서열번호 121의 아미노산 서열을 인코딩함) 또는 인간 CD2의 세포외 도메인을 추가로 포함한다 (huEGFRt; 문헌[Wang et al., Blood 118:1255, 2011] 참조). 바이러스 벡터 게놈이 개별 전사체로서 숙주 세포에서 발현될 복수의 핵산 서열을 포함하는 경우, 바이러스 벡터는 또한 이중 시스트론 또는 다중 시스트론 발현을 가능하게 하는 2개 (또는 그 이상의) 전사체 사이에 추가의 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 사용되는 이러한 서열의 예는 내부 리보손 유입 부위 (IRES), 푸린 절단 부위, 바이러스 2A 펩타이드 (예를 들어, T2A, P2A, E2A, F2A), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
도 2a 및 도 2b는 예시적 CER 벡터를 제공한다. 도 2a에 도시된 CER 벡터는 단일 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다. 도 2b에 도시된 CER 벡터는 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인을 포함한다.
예를 들어 아데노바이러스-기반 벡터 및 아데노-연관 바이러스 (AAV)-기반 벡터를 포함하는 DNA 바이러스 벡터; 앰플리콘 벡터, 복제-결핍 HSV 및 약독화된 HSV를 포함하는 단순 포진 바이러스 (HSV)로부터 유래한 벡터를 포함하는 다른 바이러스 벡터가 또한 폴리뉴클레오타이드 전달에 사용될 수 있다 (문헌[Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998]).
최근 유전자 요법용으로 개발된 다른 바이러스 벡터가 또한 본 개시내용의 조성 및 방법으로 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 바쿨로바이러스 및 α-바이러스로부터 유래한 벡터 (문헌[Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab]), 또는 플라스미드 벡터 (예컨대, 슬리핑 뷰티 또는 다른 전이인자 벡터)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 또는 플라스미드 벡터는 형질도입을 위한 유전자 마커 (예를 들어 녹색 형광 단백질, huEGFRt (서열번호 121의 아미노산 서열을 인코딩함)를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 유전자 편집 방법은 숙주 세포 게놈을 본 개시내용의 CER을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하도록 변형시키는 데 사용된다. 유전자 편집, 또는 게놈 편집은 유전자 조작된 엔도뉴클레아제를 사용하여, DNA를 숙주 세포의 게놈으로 삽입하거나, 대체하거나, 그로부터 제거하는 유전자 조작 방법이다. 뉴클레아제는 게놈 내의 표적화된 좌위에 특이적 이중-가닥 파손을 생성한다. 숙주 세포의 내인성 DNA 수선 경로는 그 후, 예를 들어, 비-상동성 말단 결합 (NHEJ) 및 상동성 재조합에 의해 유도된 파손 (들)을 수선한다. 유전자 편집에 유용한 예시적 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자-유사 효과기 (TALE) 뉴클레아제, 일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) (CRISPR)/Cas 뉴클레아제 시스템 (예를 들어, CRISPR-Cas9), 메가뉴클레아제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 유전자 편집 엔도뉴클레아제를 사용하여, B 세포 및 T　세포를 포함하는 면역 세포에서 유전자 또는 유전자 발현을 파괴하거나, 녹아웃 (knock out)시키는 방법이 당 업계에 공지되어 있고, 예를 들어, PCT 공보 WO　2015/066262; WO　2013/074916; WO　2014/059173; 문헌[Cheong et al., Nat. Comm. 2016 7:10934; Chu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016 113:12514-12519]에 기재되어 있으며; 각 문헌으로부터의 방법은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
특정 실시형태에서, B 세포, 공통 림프구 전구체 세포를 포함하는 림프성 전구체 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포를 포함하는 항원 제시 세포, 골수성 전구체 세포, 또는 성숙 골수성 세포는 본 개시내용의 CER을 인코딩하는 비-내인성 핵산 분자를 포함하도록 변형된다.
일부 실시형태에서, B 세포는 하나 이상의 CER을 발현하도록 유전자 변형된다. B 세포는 염증 부위 (예를 들어, 림프절, 종양)로의 운반, 항원 내재화 및 제시 가능, T 세포 공자극 가능, 고도의 증식성 및 자가-재생 (일생동안 지속됨)을 포함하여, 숙주 세포로서 유리할 수 있는 특정 특성들을 보유한다. 특정 실시형태에서, CER 변형된 B 세포는 포식작용된 표적 세포 또는 포식작용된 표적 입자를 더 작은 펩타이드로 분해하고, MHC 분자를 통해, 이를 T 세포에 제시할 수 있다. CER 변형된 B 세포에 의한 항원 제시는 비-표적화된 항원으로의 항원 면역 반응 확산에 기여할 수 있다. B 세포는 B 세포 계통으로 결정된 전구세포 또는 전구체 세포 (예를 들어, 프리-프로-B 세포, 프로-B 세포, 및 프리-B 세포); 불활성화된 미성숙 B 세포 또는 기능성 또는 활성화된 성숙 B 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, B 세포는 나이브 B 세포, 혈장 세포, 조절 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 림프형질세포양 세포, 형질아세포 세포, 기억 B 세포, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 기억 B 세포는 나이브 B 세포에 부재하는 CD27의 발현에 의해, 나이브 B 세포와 구별될 수 있다. 특정 실시형태에서, B 세포는 인간, 마우스, 랫트, 또는 다른 포유류로부터 유래하는 1차 세포 또는 세포주일 수 있다. B 세포주는 당 업계에 잘 공지되어 있다. 포유류로부터 획득하는 경우, B 세포는 혈액, 골수, 비장, 림프절, 또는 다른 조직 또는 유체를 포함하여 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, B 세포를 종양 부위로부터 단리한다 (종양 침윤 B 세포). B 세포 조성물을 농축시키거나, 정제할 수 있다.
특정 실시형태에서, 숙주 B 세포의 내인성 유전자의 발현을 억제하거나, 녹다운 (knock down)시키거나, 녹아웃시킨다. B 세포에서 억제되거나, 녹다운되거나, 녹아웃될 수 있는 내인성 유전자의 예는 B 세포 수용체 (BCR) 유전자 (예를 들어, CD79b, IGH, IGκ, IGλ, 또는 이들의 임의의 조합), 면역 체크포인트 분자 (immune checkpoint molecule) (예를 들어, PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, HVEM, 아데노신, GAL9, VISTA, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, PVRL2, PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, A2aR, CD244/2B4, CD160, TIGIT, LAIR-1, PVRIG/CD112R, 또는 이들의 임의의 조합), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. BCR 유전자, 면역 체크포인트 분자 유전자, 또는 둘 모두의 발현을 유전자 수준, 전사 수준, 또는 번역 수준, 또는 이들의 조합에서 억제하거나, 녹다운시키거나, 녹아웃시킬 수 있다. BCR 유전자, 면역 체크포인트 분자 유전자, 또는 둘 모두의 억제, 녹다운 또는 녹아웃 방법은, 예를 들어, RNA 간섭 제제 (예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA, 등) 또는 조작된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 이들의 임의의 조합)에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 (예를 들어, BCR 유전자 또는 면역 체크포인트 분자 유전자)를, 예컨대 조작된 엔도뉴클레아제를 통해, 내인성 B 세포 유전자의 좌위로의 본 개시내용의 CER을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 의해 녹아웃시킨다.
일부 실시형태에서, 세포 표면에 본 개시내용의 CER을 발현할 수 있는 세포는 CD4+, CD8+, 나이브 (CD45 RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-), 중앙 기억 (CD45RO+, CD62L+, CD8+), 효과기 기억 (CD45RA+, CD45RO-, CCR7-, CD62L-, CD27-), 바이러스-특이적, 점막-연관 불변, γδ (gd), 조직 상재 T 세포, 및 자연 살해 T 세포를 포함하는 T 세포이다. 특정 실시형태에서, T 세포는 인간, 마우스, 랫트, 또는 다른 포유류로부터 유래하는 1차 세포 또는 세포주일 수 있다. 포유류로부터 획득하는 경우, T 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 다른 조직 또는 유체를 포함하여, 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포를 종양 부위로부터 단리한다 (종양 침윤 T 세포). T 세포 조성물을 농축하거나, 정제할 수 있다. T 세포주는 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 그 중 일부가 문헌[Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000]에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, TCRα 및 β 사슬의 내인성 발현이 부재하는 T 세포가 사용된다. 이러한 T 세포는 자연적으로 TCRα 및 β 사슬의 내인성 발현이 부재할 수 있거나, 발현이 차단되거나 (예를 들어, TCR α 및 β 사슬의 발현이 억제되도록 조작된, TCR α 및 β 사슬 또는 세포를 발현하지 않는 트렌스제닉 마우스로부터의 T 세포), TCRα 사슬, TCRβ 사슬, 또는 유전자 둘 모두가 녹아웃되도록 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 표면에 본 개시내용의 키메라 단백질을 발현할 수 있는 세포는 T 세포 또는 T 세포 계통의 세포뿐만 아니라, 세포 표면에 항-CD3을 발현하도록 변형된 전구세포, 줄기세포 또는 세포인 세포이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 CER을 발현하도록 형질감염된 숙주 T 세포는 기능성 T 세포, 예컨대바이러스-특이적 T 세포, 종양 항원 특이적 세포독성 T 세포, 나이브 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중앙 또는 효과기 기억 T 세포, 또는 CD4+ CD25+ 조절 T 세포이다.
특정 실시형태에서, 숙주 T 세포의 내인성 유전자의 발현을 억제하거나, 녹다운시키거나, 녹아웃시킨다. T 세포에서 억제되거나, 녹다운되거나, 녹아웃될 수 있는 내인성 유전자의 예는 TCR 유전자 (TRA, TRB, 또는 둘 모두), HLA 유전자 (HLA 클래스 I 유전자, HLA 클래스 II 유전자, 또는 둘 모두), 면역 체크포인트 분자 (PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, HVEM, 아데노신, GAL9, VISTA, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, PVRL2, PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, A2aR, CD244/2B4, CD160, TIGIT, LAIR-1, PVRIG/CD112R, 또는 이들의 임의의 조합), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. TCR 유전자, HLA 유전자, 면역 체크포인트 분자 유전자, 또는 이들의 임의의 조합의 발현을 유전자 수준, 전사 수준, 또는 번역 수준, 또는 이들의 조합에서 억제하거나, 녹다운시키거나, 녹아웃시킬 수 있다. TCR 유전자, HLA 유전자, 면역 체크포인트 분자 유전자, 또는 이들의 임의의 조합의 억제, 녹다운 또는 녹아웃 방법은, 예를 들어, RNA 간섭 제제 (예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA, 등) 또는 조작된 엔도뉴클레아제 (예를 들어, CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 이들의 임의의 조합)에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 (예를 들어, TCR 유전자, HLA 유전자 또는 면역 체크포인트 분자 유전자)를, 예컨대 조작된 엔도뉴클레아제를 통해, 내인성 T 세포 유전자의 좌위로의 본 개시내용의 CER을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 의해 녹아웃시킨다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포는 CER 중 하나의 유형을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포는 적어도 2개 이상의 상이한 CER을 발현할 수 있다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 CER을 발현하도록 변형된 숙주 세포의 집단은 B 세포의 집단, T 세포의 집단, 자연 살해 세포의 집단, 공통 림프구 전구체 세포를 포함하는 림프성 전구체 세포의 집단, 수지상 세포, 랑게르한스 세포를 포함하는 항원 제시 세포의 집단, 골수성 전구체 세포의 집단, 성숙 골수성 세포의 집단, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 CER을 발현하도록 변형된 숙주 세포의 집단은 B 세포의 집단, T 세포의 집단, 또는 둘 모두이다.
특정 실시형태에서, 숙주 세포의 집단 내의 각각의 숙주 세포는 동일한 CER 또는 CER의 세트를 발현한다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포의 집단은 숙주 세포의 2개 이상의 부분집합의 혼합물을 포함하며, 각각의 부분집합은 상이한 CER 또는 CER의 세트를 발현한다.
특정 실시형태에서, CER을 발현하도록 유전자 변형된 숙주 세포는 또한 하나 이상의 작은 GTPase를 공동 발현하도록 변형될 수 있다. Rho GTPase, 작은 (약 21 kDa) 신호전달 G 단백질의 계열 및 또한 Ras 상과 계열의 하위 계열은 다양한 세포 유형에서 액틴 세포골격 체계를 조절하며, 식작용 동안 위족 연장 및 식포 폐쇄를 촉발한다 (예를 들어, 문헌[Castellano et al., 2000, J. Cell Sci. 113:2955-2961] 참조). 포식작용은 고정된 세포 또는 입자 하에 F-액틴이 집약되고, 막이 연장되어, 세포 또는 입자 내재화가 유발될 수 있도록, F-액틴이 재 정렬될 것을 필요로 한다. RhoGTPase는 RhoA, Rac1, Rac2, RhoG, 및 CDC42를 포함한다. 다른 작은 GTPase, 예컨대 Rap1은 보체 매개 식작용의 조절에 관여한다. 작은 GTPase와 CER의 공동 발현은 숙주 세포에 의한 표적 세포 또는 입자 내재화 및/또는 식포 형성을 촉발할 수 있다. 일부 실시형태에서, GTPase를 인코딩하는 재조합 핵산 분자는 CER-포함 벡터 이외에 별개의 벡터에 인코딩된다. 다른 실시형태에서, GTPase를 인코딩하는 재조합 핵산 분자는 다중 시스트론 발현 작제물로서 동일한 CER-포함 벡터에 인코딩된다. CER 및 작은 GTPase (들)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 바이러스 2A 펩타이드 서열 (예를 들어, T2A (서열번호 147), P2A (서열번호 104), E2A (서열번호 148), F2A (서열번호 149))에 의해 서로 분리될 수 있음으로써, 단일 오픈 리딩 프레임으로부터의 다중 시스트론 발현을 가능하게 할 수 있다. CER과 공동 발현될 수 있는 GTPase의 예는 Rac1, Rac2, Rab5 (또한 Rab5a로 지칭됨), Rab7, Rap1, RhoA, RhoG, CDC42, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 구체적 실시형태에서, GTPase는 서열번호 76의 Rac1 아미노산 서열, 서열번호 77의 Rab5 아미노산 서열, 서열번호 122의 Rab7 아미노산 서열, 서열번호 123의 Rap1 아미노산 서열, 서열번호 124의 RhoA 아미노산 서열, 서열번호 125의 CDC42 아미노산 서열, 또는 이들의 임의의 조합과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열이거나, 이를 포함한다. 다중 시스트론 발현 작제물의 특정 실시형태에서, P2A 서열에 의해 분리된 Tim4-MyD88t CER 및 작은 GTPase Rab5a를 인코딩하는 발현 작제물은 서열번호 105 (CER91)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 실시형태에서, CER 성숙 폴리펩타이드 서열은 아미노산 1 내지 22의 신호 펩타이드가 부재하는 서열번호 105를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CER을 발현하는 숙주 세포, 예를 들어, B 세포 또는 T 세포의 제조시, 숙주 세포, 예를 들어, B 세포 또는 T 세포의 증식을 촉발하는 하나 이상의 성장 인자 사이토카인을 세포 배양액에 첨가할 수 있다. 사이토카인은 인간 또는 비-인간의 것일 수 있다. T 세포 증식을 촉발하는 데 사용될 수 있는 예시적 성장 인자 사이토카인은 IL-2, IL-15 등을 포함한다. B 세포 증식을 촉발하는 데 사용될 수 있는 예시적 성장 인자 사이토카인은 CD40L, IL-2, IL-4, IL-15, IL-21, BAFF 등을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 선택적 유전자 전달을 사용하여, CER 벡터를 특정 영역 또는 기관에 위치시킨다. 일부 실시형태에서, 선택적 유전자 전달을 사용하여, CER 벡터를 대상체의 간 또는 폐에 위치시킨다.
CER 벡터에 의한 숙주 세포의 유전자 변형 전에, 숙주 세포의 공급원 (예를 들어, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 등)을 대상체 (예를 들어, 전혈, 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직)로부터 얻어, 이로부터의 숙주 세포를 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 단리한다. 특정 숙주 세포 하위세트를 공지된 기법에 따라 수집하여, 항체에의 친화도 결합, 유동 세포계측 및/또는 면역자성 선택과 같은 공지된 기법에 의해 농축시키거나, 고갈시킬 수 있다. 농축 및/또는 고갈 단계 및 CER의 도입 후, 요망되는 변형된 숙주 세포의 시험관내 확장을 당업자에 자명한 공지된 기법 또는 그의 변형 예에 따라 수행할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 CER을 포함하는 T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 림프성 전구체 세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 골수성 전구체 세포, 및 성숙 골수성 세포를 포함하는 숙주 세포는 표적 세포에 대해 약 20 내지 약 1,500의 식작용 지수를 갖는다. "식작용 지수"는 배지 중 표적 세포 및 CER 변형된 숙주 세포의 현탁액의 일 세트 기간의 인큐베이션 동안 CER 변형된 숙주 세포당 포식된 표적 세포의 수를 계수함으로써, 결정되는 바와 같은 형질도입된 숙주 세포의 식작용 활성의 측정치이다. 식작용 지수는 [포식작용된 표적 세포의 총 수/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)] 또는 [포식작용된 입자의 총 수/계수된 CER 변형된 숙주 세포의 총 수] x [포식작용된 입자를 포함하는 CER 변형된 숙주 세포의 수 / 계수된 CER 세포의 총 수] x 100에 의해 계산할 수 있다. 특정 실시형태에서, CER 변형된 세포는 약 30 내지 약 1,500; 약 40 내지 약 1,500; 약 50 내지 약 1,500; 약 75 내지 약 1,500; 약 100 내지 약 1,500; 약 200 내지 약 1,500; 약 300 내지 약 1,500; 약 400 내지 약 1,500; 약 500 내지 약 1,500; 약 20 내지 약 1,400; 약 30 내지 약 1,400; 약 40 내지 약 1,400; 약 50 내지 약 1,400; 약 100 내지 약 1,400; 약 200 내지 약 1,400; 약 300 내지 약 1,400; 약 400 내지 약 1,400; 약 500 내지 약 1,400; 약 20 내지 약 1,300; 약 30 내지 약 1,300; 약 40 내지 약 1,300; 약 50 내지 약 1,300; 약 100 내지 약 1,300; 약 200 내지 약 1,300; 약 300 내지 약 1,300; 약 400 내지 약 1,300; 약 500 내지 약 1,300; 약 20 내지 약 1,200; 약 30 내지 약 1,200; 약 40 내지 약 1,200; 약 50 내지 약 1,200; 약 100 내지 약 1,200; 약 200 내지 약 1,200; 약 300 내지 약 1,200; 약 400 내지 약 1,200; 약 500 내지 약 1,200; 약 20 내지 약 1,100; 약 30 내지 약 1,100; 약 40 내지 약 1,100; 약 50 내지 약 1,100; 약 100 내지 약 1,100; 약 200 내지 약 1,100; 약 300 내지 약 1,100; 약 400 내지 약 1,100; 또는 약 500 내지 약 1,100; 약 20 내지 약 1,000; 약 30 내지 약 1,000; 약 40 내지 약 1,000; 약 50 내지 약 1,000; 약 100 내지 약 1,000; 약 200 내지 약 1,000; 약 300 내지 약 1,000; 약 400 내지 약 1,000; 또는 약 500 내지 약 1,000; 약 20 내지 약 750; 약 30 내지 약 750; 약 40 내지 약 750; 약 50 내지 약 750; 약 100 내지 약 750; 약 200 내지 약 750; 약 300 내지 약 750; 약 400 내지 약 750; 또는 약 500 내지 약 750; 약 20 내지 약 500; 약 30 내지 약 500; 약 40 내지 약 500; 약 50 내지 약 500; 약 100 내지 약 500; 약 200 내지 약 500; 또는 약 300 내지 약 500의 식작용 지수를 갖는다. 추가의 실시형태에서, 인큐베이션 시간은 약 2시간 내지 약 4시간, 약 2시간, 약 3시간, 또는 약 4시간이다. 추가의 실시형태에서, CER 변형된 세포는 절두된 EGFR 대조군으로 형질도입된 세포보다 통계적으로 유의하게 더 높은 식작용 지수를 나타낸다. 식작용 지수는 유동 세포계측 또는 형광 현미경 검사에 의한 정량화를 포함하여, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여, 실시예에 추가로 기재된 바와 같이 계산할 수 있다.
숙주 세포는 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼, 기니아피그 또는 돼지와 같은 동물로부터 유래할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 동물은 인간이다. 숙주 세포는 건강한 대상체 또는 항원의 발현과 연관된 질병을 가진 대상체로부터 얻을 수 있다.
CER 및 CER을 발현하도록 변형된 세포의 용도
본 개시내용은 숙주 세포의 포식작용 표현형을 변이시키는 방법을 제공한다. 일 양상에서, 본 개시내용은 포식작용 표현형을 나타내는 세포의 집단을 생성하는 방법으로서, 자연적으로 포식작용 표현형을 나타내지 않는 숙주 세포의 집단에 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 CER을 인코딩하는 핵산 분자 또는 적어도 하나의 CER을 포함하는 벡터를 도입시키는 단계; 및 숙주 세포의 집단에서 적어도 하나의 CER을 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 포식작용 표현형은 식작용이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 세포의 집단의 포식작용 표현형을 변이시키는 방법으로서, 숙주 세포의 집단에 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 CER을 인코딩하는 핵산 분자 또는 적어도 하나의 CER을 포함하는 벡터를 도입시키는 단계; 및 숙주 세포의 집단에서 적어도 하나의 CER을 발현시키는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 CER가 자연적으로는 숙주 세포에 의해 표적화되지 않는 전-포식작용 마커 또는 항원 마커 (표적 항원)에 특이적인 포식작용 표현형을 부여하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 포식작용 표현형은 식작용이다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 세포의 집단의 포식작용 표현형을 증대시키는 방법으로서, 숙주 세포의 집단에 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 CER을 인코딩하는 핵산 분자 또는 적어도 하나의 CER을 포함하는 벡터를 도입시키는 단계; 및 숙주 세포의 집단에서 적어도 하나의 CER을 발현시키는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 CER가 자연적으로는 숙주 세포에 의해 표적화되지 않는 전-포식작용 마커 또는 항원 마커 (표적 항원)에 특이적이고, 숙주 세포에 의한 적어도 하나의 CER의 발현이 표적화된 전-포식작용 또는 항원 마커를 나타내는 세포, 미생물, 또는 입자의 숙주 세포에 의한 포식작용을 증대시키는 방법을 제공한다.
CER, CER을 인코딩하는 핵산 분자, CER을 포함하는 벡터, 및 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 CER을 발현하는 숙주 세포는 또한 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태를 앓고 있는 대상체의 치료 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법의 예는 하나 이상의 CER, 하나 이상의 CER을 인코딩하는 핵산 분자, 하나 이상의 CER을 포함하는 벡터, 또는 본 기재내용에 따른 하나 이상의 CER을 발현하도록 유전자 변형된 숙주 세포의 집단을 포함하는 약제학적 조성물의 치료 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용에 기재된 바와 같은 CER을 발현하는 세포로 치료될 수 있는 질병은 암, 감염성 질병 (바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 감염), 염증성, 또는 면역 질병 (예를 들어, 자가면역 질병, 염증성 장 질병, 다수의 경화증), 퇴행성 질병 (예를 들어, 관절 및 연골), 및 신경퇴행성 질병 (예를 들어, 알츠하이머병)을 포함한다. 입양 면역 및 유전자 요법은 다양한 유형의 암 (문헌[Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007]) 및 감염성 질병 (문헌[Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med. 89:903, 2011])에 대해 유망한 치료법이다.
본 개시내용의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 대상체는 인간, 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 토끼, 기니아피그 또는 돼지와 같은 동물을 포함한다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있으며, 유아, 아동, 청소년, 성인, 및 노인 대상체를 포함하여, 임의의 적절한 연령일 수 있다.
고형 종양 및 백혈병을 포함하는 다양한 암이 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에 적용될 수 있다. 치료될 수 있는 예시적인 암의 유형은 유방, 전립선 및 결장의 선암; 모든 형태의 폐 기관지 암종; 골수성 백혈병; 흑색종; 간암; 신경아세포종; 유두종; 아푸도마 (apudoma); 분리종; 아가미종 (branchioma); 악성 카시노이드 증후군 (carcinoid syndrome); 카시노이드성 심장병; 및 암종 (예를 들어, 워커 (Walker), 기저 세포, 기저편평, 브라운-페어스 (Brown-Pearce), 췌관, 에를리히 종양 (Ehrlich tumor), 크렙스 2 (Krebs 2), 메르켈 세포 (Merkel cell), 점액성 비소세포 폐, 귀리 세포, 유두, 경성암, 기관지, 기관지원성, 편평상피 세포, 및 이행 세포)를 포함한다. 치료될 수 있는 암의 추가 유형은 조직구 장애; 악성 조직구증; 백혈병; 호지킨병; 면역증식성 소; 비-호지킨 림프종; 형질세포종; 다발성 골수종; 형질세포종; 세망내피증; 흑색종; 연골아세포종; 연골종; 연골육종; 섬유종; 섬유육종; 거대 세포 종양; 조직구종; 지방종; 지방육종; 중피종; 점액종; 점액육종; 골종; 골육종; 척색종; 두개인두종; 미분화세포종; 과오종; 중간엽종; 중신종; 근육육종; 에나멜아세포종 (ameloblastoma); 시멘트종; 치아종; 기형종; 흉선종; 영양막 종양을 포함한다. 추가로, 다음과 같은 암의 유형이 또한 치료에 적합한 것으로 고려된다: 선종; 담관종; 진주종; 원주종; 낭포선암; 낭선종; 과립막 세포 종양; 음양아세포종; 간암; 한관종; 도세포종; 고환 비배세포종; 유두종; 세르톨리 세포종 (sertoli cell tumor); 난포막세포종; 평활근종; 평활근육종; 근육아세포종; 근종; 근육육종; 횡문근종; 횡문근육종; 뇌실막세포종; 신경절세포종; 신경교종; 수모세포종; 신경초종; 신경섬유초종; 신경아세포종; 신경상피종; 신경섬유종; 신경종; 부신결정종; 비크롬친화성부신경절종을 포함한다. 치료될 수 있는 암의 유형은 또한 피각혈관종; 호산구 증가증 동반 혈관림프구 과다형성; 경화성 혈관종; 혈관종증; 사구종양; 혈관내피종; 혈관종; 혈관 주위 세포종; 혈관육종; 림프관종; 림프관근종; 림프관육종; 송과체종; 암육종; 연골육종; 엽상낭상육종; 섬유육종; 혈관육종; 평활근육종; 백육종; 지방육종; 림프관육종; 근육육종; 점액육종; 난소 암종; 횡문근육종; 육종; 신생물; 신섬유종증; 및 자궁경부 이형성을 포함한다.
CER 요법에 적합한 예시적 과증식성 장애는 B-세포 림프종 (예컨대, 다양한 형태의 호지킨병, 비-호지킨 림프종 (NHL) 또는 중추신경계 림프종)을 포함하는 B-세포 암, 백혈병 (예컨대, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병의 B 세포 아구화전환) 및 골수종 (예컨대, 다수의 골수종). 추가적 B 세포 암은 소 림프구 림프종, B-세포 림프아구 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 형질세포 골수종, 골의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막-연관 (MALT) 림프성 조직의 결절외 변연부 B-세포 림프종, 결절성 변연부 B-세포 림프종, 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 종격동 (흉선) 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 유출성 림프종, 버킷 림프종/백혈병 (Burkitt's lymphoma/leukemia), 불특정 악성 잠재성 B-세포 증식, 림프종양육아종증, 이식 후 림프증식성 장애를 포함한다.
염증성 및 자가면역 질병은 관절염, 류머티스 관절염, 청소년 류머티스 관절염, 골관절염, 다발연골염, 건선성 관절염, 건선, 피부염, 다발성 근염/피부 근육염, 봉입체 근염, 염증성 근염, 독성 표피 괴사, 전신 경피증 및 경화증, CREST 증후군, 염증성 장 질환, 크론 병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체신염, 알레르기성 질환, 습진, 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응 동반 질환, 죽상동맥경화증,자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 아급성피부홍반루푸스, 원판성 루푸스, 루푸스 척수염, 루프스성 뇌염, 청소년 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 신경섬유성 눈염, 류머티스 열, 시드남 무도병 (Sydenham's chorea), 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민증 연관 면역 반응, 결핵, 유육종증, 베게너 육아종증 (Wegener's granulomatosis) 및 척 슈트라우스 (Churg-Strauss) 병을 포함한 육아종증, 무과립구증, 혈관염 (과민성 혈관염/맥관염, ANCA 및 류머티스성 혈관염을 포함함), 재생 불량성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈 (Diamond Blackfan anemia), 자가면역 용혈성 빈혈 (AIHA)을 포함한 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 순수한 적혈구 무형성증 (PRCA), 인자 VIII 결핍, 혈우병 A, 자가면역 호중구 감소증, 범혈구 감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 누출 동반 질병, 중추신경계 (CNS) 염증성 장애, 알츠하이머병, 다 장기 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개 질병, 항-사구체 기저막 질병, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트 병 (Behcet disease), 캐슬만 증후군 (Castleman's syndrome), 굿파스쳐 증후군 (Goodpasture's syndrome), 램버트-이튼 근무력 증후군 (Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome), 레이노 증후군 (Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군 (Sjorgen's syndrome), 스티븐스-존슨 증후군 (Stevens-Johnson syndrome), 고형 장기 이식 거부, 이식편 대 숙주 병 (GVHD), 수포성 천포창, 천포창, 자가면역성 다발성 내분비병증, 혈청음성 척추관절염, 라이터 병 (Reiter's disease), 강직 인간 증후군, 거대 세포 동맥염, 면역 복합체 신염, IgA 신병증, IgM 다발성 신경병증 또는 IgM 매개 신경병증, 특발성 혈소판 감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판 감소성 자반병 (TTP), 헤노호스콘레인 자반병 (Henoch-Schonlein purpura), 자가면역성 혈소판 감소증, 자가면역성 고환염 및 난소염을 포함한 고환 및 난소의 자가면역 질병, 원발성 갑상선 기능 저하증; 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염 (Hashimoto's Thyroiditis)), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능 저하증, 애디슨 병 (Addison's disease), 그레이브 병 (Grave's disease), 자가면역 다선성 증후군 (또는 다선성 내피병증 증후군), 또한 인슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM)으로 일컬어지는 1형 당뇨병 및 시핸 증후군 (Sheehan's syndrome)을 포함하는 자가면역 내분비계 질병; 자가면역 간염, 림프성 간질성 폐렴 (HIV), 폐색성 세기관지염 (비 이식), 비 특이적 간질성 폐렴 (NSIP), 길랑-바레시 증후군 (Guillain-Barre Syndrome), 대형 혈관 혈관염 (다발근통 류머티스 및 거대 세포 (다카야수 (Takayasu's)) 동맥염을 포함함), 중형 혈관 혈관염 (가와사끼 병 (Kawasaki's disease) 및 결절성 다발 동맥염을 포함함), 결절성 다발 동맥염 (PAN) 강직성 척추염, 버거 병 (Berger's disease) (IgA 신병증), 급성 진행성 사구체신염, 원발성 담즙성 간경변, 비열대성 스프루 (Celiac sprue) (글루텐 장질환), 저온 글로블린 혈증, 간염과 관련된 저온 글로블린 혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 관상 동맥 질병, 가족력 지중해 열, 현미경적 다발성 맥관염, 코간 증후군 (Cogan's syndrome), 위스콧-알드리치 증후군 (Whiskott-Aldrich syndrome) 및 폐색성혈전혈관염을 포함한다. 특정 실시형태에서, 염증성 질병의 치료 상황에서, 항상성 (비-염증성) 포식작용 신호전달 도메인을 갖는 CER의 설계가 바람직할 수 있다.
감염성 질병은 감염성 제제 연관 질병을 포함하며, 임의의 다양한 박테리아 (예를 들어, 병원성 E. 콜라이 (E. coli), S. 티피무리움 (S. typhimurium), P. 아에루기노사 (P. aeruginosa), B. 안트라시스 (B. anthracis), C. 보툴리눔 (C. botulinum), C. 디피실레 (C. difficile), C. 페르프링엔스 (C. perfringens), H. 필로리 (H. pylori), V. 콜레라 (V. cholerae), 리스테리아 속 (Listeria spp.), 리케트시아 속 (Rickettsia spp.), 플라미디아 속 (Chlamydia spp.) 등), 마이코박테리아, 및 기생충 (임의의 공지된 원생동물의 기생충을 포함함)을 포함한다. 감염성 바이러스는 진핵생물성 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 분야바이러스, 헤르페스바이러스, 파포바바이러스, 파필로마바이러스 (예를 들어, HPV), 파리믹소바이러스, 피코르나바이러스, 라브도바이러스 (예를 들어, 라비에스), 오르토믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자), 폭스바이러스 (예를 들어, 우두증), 레오바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 (예를 들어, HIV), 플라비바이러스 (예를 들어, HCV, HBV) 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 CER을 포함하는 조성물은 대상체에서 지속적인 감염을 달성할 수 있는 미생물에 의한 감염의 치료에 사용된다.
신경퇴행성 질병은 루이소체 질병, 소아마비 후 증후군, 샤이-드레거 증후군 (Shy-Draeger syndrome), 올리브교 소뇌 위축증, 파킨슨병, 다발성 전신 위축증, 선조체흑질 변성, 유비퀴틴화 봉입 동반 전측두엽 변성 (FLTD-U), 타우병증 (이에 제한되는 것은 아니나, 알츠하이머병 및 핵상마비를 포함함), 프리온 질병 (또한 이에 제한되는 것은 아니나, 소과 해면모양뇌병, 스크래피 (scrapie), 크로이츠펠트-야곱 증후군 (Creutz-feldt-Jakob syndrome), 쿠루 (kuru), 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 병 (Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 만성 소모성 질병, 치명적인 가족력 불면증), 연수 마비, 운동 신경 질병 (근위축성 측삭 경화증 (루게릭병)을 포함함), 및 신경계 이종퇴행성 장애 (이에 제한되는 것은 아니나, 카나반병 (Canavan disease), 헌팅톤병, 신경 세로이드-지질혈증, 알렉산더병, 뚜렛 증후군 (Tourette's syndrome), 멩케 킨키 헤어 증후군 (Menkes kinky hair syndrome), 코케인 증후군 (Cockayne syndrome), 할레보덴-스파츠 증후군 (Halervorden-Spatz syndrome), 라포라병 (lafora disease), 레트 증후군 (Rett syndrome), 간렌즈핵변성, 레쉬-니한 증후군 (Lesch-Nyhan syndrome), 및 운베리치-런드보그 증후군 (Unverricht-Lundborg syndrome)을 포함함), 치매 (이에 제한되는 것은 아니나, 픽병 (Pick's disease), 및 척추소뇌실조증을 포함함), 암 (예를 들어, 체내의 다른 부위에 암을 유발하는 뇌 전이를 포함하여, CNS 및/또는 뇌의 암)을 포함한다. 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증 (루게릭병) 및 프리온 질병을 포함하는 많은 신경퇴행성 질병은 알츠하이머병에서의 아밀로이드-β 또는 타우; 파킨슨병 (PD), 루이소체 치매, 다수의 전신 위축증 또는 알츠하이머병에서의 α-시누클레인 (synuclein), 헌팅톤병에서의 헌팅틴 (huntingtin), 근위축성 측삭 경화증에서의 SOD1, 헌팅톤병 또는 근위축성 측삭 경화증에서의 폴리글루타민 (폴리Q) 반복 단백질; 근위축성 측삭 경화증 또는 FLTD-U에서의 TDP-43; 또는 프리온 질병에서의 프리온 단백질 (예를 들어, PrPSc)과 같이, 신경병적 특징인 단백질의 이상 축적을 공유한다. 따라서, 특정 실시형태에서, CER 요법은 이상 단백질 축적을 감소시키거나, 예방하여, 신경퇴행성 질병의 진행을 지연시키거나, 예방하기 위해, 질병 연관 단백질을 표적화하도록 설계될 수 있다.
본 개시내용의 CER은 대상체에 세포-결합 형태로 투여될 수 있다 (예를 들어, 표적 세포 집합 (성숙 T 세포 (예를 들어, CD8+ 또는 CD4+ T 세포) 또는 T 세포 계통의 다른 세포)의 유전자 요법). 따라서, 예를 들어, 본 개시내용의 CER은 하위세트를 포함하여, T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, B 세포, 림프성 전구체 세포, 항원 제시 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 골수성 전구체 세포, 성숙 골수성 세포, 또는 이들의 임의의 조합의 표면에 발현되는 대상체에 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 환자의 치료 방법은 CER 변형된 세포 (즉, 하나 이상의 CER을 발현하는 재조합 세포)의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, CER 변형된 세포는 T 세포 계통, 자연 살해 세포 계통, 자연 살해 T 세포 계통, B 세포 계통, 림프성 전구체 세포 계통, 수지상 세포 계통, 랑게르한스 세포 계통, 골수성 세포 계통, 또는 이들의 임의의 조합의 이종성, 동계, 동종이계, 또는 자가 세포이다.
CER 변형된 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 의료 분야의 당업자에 의해 결정된 바와 같이, 치료 (또는 예방)될 질병 또는 상태에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 투여량, 적절한 지속시간 및 빈도는 환자의 상태, 크기, 체중, 신체 표영역, 연령, 성별, 질병의 유형 및 중증도, 투여될 특정 요법, 활성 구성요소의 특정 형태, 투여 시간 및 방법, 및 병행 투여되는 다른 약제와 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 본 개시내용은 CER 변형된 세포 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 적합한 부형제는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합을 포함한다. 다른 적절한 주입 매질은 식염수, Normosol R (Abbott), Plasma-Lyte A (Baxter), 물 중의 5% 덱스트로스 또는 링거 유산염을 포함하는 임의의 등장성 매질 제형일 수 있다.
약제학적 조성물 중 세포의 치료 유효량은 적어도 하나의 세포 (예를 들어, 하나의 CER 변형된 B 세포)이거나, 더욱 통상적으로는 102개 초과의 세포, 예를 들어, 최대 106, 최대 107, 최대 108개의 세포, 최대 109개의 세포, 최대 1010개의 세포, 또는 최대 1011개 이상의 세포이다. 특정 실시형태에서, 세포는 약 106 내지 약 1010 세포/m2의 범위, 바람직하게는 약 107 내지 약 109 세포/m2의 범위로 투여된다. 세포의 수는 내부에 포함된 세포의 유형뿐만 아니라, 의도된 조성물의 종국적 용도에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 특정 항원에 특이적인 CER을 포함하도록 변형된 세포를 포함하는 조성물은 약 5% 내지 약 95% 이상의 이러한 세포를 포함하는 세포 집합을 포함할 것이다. 특정 실시형태에서, CER 변형된 세포를 포함하는 조성물은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 이러한 세포를 포함하는 세포 집합을 포함한다. 본 명세서에 제공되는 용도를 위해, 세포는 일반적으로 1 리터 이하, 500 mls 이하, 250 mls 이하, 또는 100 mls 이하의 용적이다. 요망되는 세포의 밀도가 통상적으로 104 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107 세포/ml 초과, 일반적으로 108 세포/ml 이상이기 때문이다. 세포는 다양한 시간 동안 단일 주입 또는 다회 주입으로 투여될 수 있다. 질병 또는 질병 활성의 경과가 존재하는 경우, CER 변형된 세포의 반복 주입은 수일, 수주, 수개원 또는 심지어 수년의 간격을 두고 이루어질 수 있다. 임상적으로 적절한 면역 세포의 수가 다회 주입으로 분배될 수 있으며, 이는 누적되어, 106, 107, 108, 109, 1010, 또는 1011개 이상의 세포이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 투여의 바람직한 투여량은 약 107 세포/m2, 약 5 x 107 세포/m2, 약 108 세포/m2, 약 5 x 108 세포/m2, 약 109 세포/m2, 약 5 x 109 세포/m2, 약 1010 세포/m2, 약 5 x 1010 세포/m2, 또는 약 1011 세포/m2이다. 특정 실시형태에서, CER 변형된 B 세포의 조성물 및 CER 변형된 T 세포의 조성물 둘 모두가 투여되며, 이는 동시에, 병행하여 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 정맥내, 복강내, 종양내, 골수내, 림프절내, 및/또는 뇌척수액 내로 투여된다. 일부 실시형태에서, 키메라 포식작용 수용체 조작된 조성물은 종양 부위로 전달된다.
일부 실시형태에서, CER 변형된 세포는 대상체에 하나 이상의 추가적 요법과 함께 또는 조합하여 투여된다. 이러한 실시형태에서, 하나 이상의 추가적 요법은 방사선 요법, 유전자 조작된 세포성 면역요법 (예를 들어, T 세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 키메라 항원 수용체 (CAR) 요법), 항체 요법, 면역 체크포인트 분자 억제제 요법, 또는 약제학적 요법, 예컨대 화학요법용, 치료용 펩타이드, 항생제, 항-바이러스 제제, 항-진균 제제, 항-염증성 제제, 또는 소 분자 요법 중 하나 이상일 수 있다. 이러한 실시형태에서, CER 변형된 세포는 하나 이상의 추가적 요법의 상황에서 유도되는 프로-아폽토시스 마커를 디스플레이하는 아폽토시스, 사멸, 사멸 중, 손상, 감염 또는 괴사 세포를 제거할 수 있다. CER 변형된 세포가 하나 이상의 추가적 요법과 조합하여 투여되는 특정 실시형태에서, 하나 이상의 추가적 요법은 CER 요법과의 조합의 부가적 또는 상승적 효과로 인해, 치료 수준 이하의 투여량에서 투여될 수 있다. 조합 요법은 추가적 요법 전 (예를 들어, 추가적 요법 1일 내지 30일 이상 전)에, 추가적 요법과 병행하여 (동일한 날), 또는 추가적 요법 후 (예를 들어, 추가적 요법 1일 내지 30일 이상 후)에 CER을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, CER 변형된 세포는 하나 이상의 추가적 요법의 투여 후 투여된다. 추가의 실시형태에서, CER 변형된 세포는 하나 이상의 추가적 요법의 투여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 후에 투여된다. 추가의 실시형태에서, CER 변형된 세포는 하나 이상의 추가적 요법의 투여 후 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내 또는 1주 이내에 투여된다. 하나 이상의 추가적 요법이 다회의 투여를 수반하는 경우, CER 변형된 세포는 하나 이상의 추가적 요법의 최초 투여 후, 하나 이상의 추가적 요법의 최종 투여 후, 또는 하나 이상의 추가적 요법의 다회 투여 사이에 투여될 수 있다.
3중 조합 요법 (방사선 + CER + CAR/또는 TCR) 용법의 예가 도 134에 도시되어 있다. 방사선 요법 후, 본 개시내용에 따른 종양 항원 특이적 CER 변형된 숙주 세포 (예를 들어, 종양 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함함)는 대상체에 투여되어, 항-종양 면역 반응을 촉진하고, 및 면역 활성화 세포를 종양 미세환경으로 집약시킨다. 특정 실시형태에서, CER을 국소 부위의 방사선 처리된 종양으로 운반하여, 종양 조직을 면역 침윤 및 파괴되도록 함으로써 (예를 들어, 염증성 사이토카인의 발현, 효과기 T 세포의 활성화, 수지상 세포의 활성화, 조절 T 세포의 억제를 통함), 후속 입양 T 세포 면역요법 (예를 들어, CAR 또는 TCR 면역요법)에 대해 종양 미세환경을 감응화한다. 특정 실시형태에서, CER 변형된 세포는 방사선 요법의 투여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 후 투여된다. 추가의 실시형태에서, CER 변형된 세포는 방사선 요법의 투여 후 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내 또는 1주 이내에 투여된다. 특정 실시형태에서, CAR 또는 TCR 면역요법은 CER 요법의 투여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30일 후 또는 CER 요법의 투여 후 4주 이내, 3주 이내, 2주 이내 또는 1주 이내에 투여된다. 특정 실시형태에서, 방사선 요법, CAR 또는 TCR 면역요법, 또는 둘 모두는 치료 수준 이하의 수준에서 투여된다.
CER 요법과 조합하여 사용될 수 있는 방사선 요법의 예는 외부 빔 방사선 요법 (예를 들어, 통상적인 외부 빔 방사선 요법, 주촉성 방사선, 3차원 입체조형 방사선 요법, 강도 조절 방사선 요법, 입체 조절 회전 요법, 입자 요법, 양성자 요법, 및 오거 (auger) 요법), 근접치료, 전신성 방사성 동위원소 요법, 수술중 방사선 요법 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
CER 요법과 조합하여 표적화될 수 있는 면역 체크포인트 분자의 예는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, HVEM, 아데노신, GAL9, VISTA, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, PVRL2, PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, A2aR, CD244/2B4, CD160, TIGIT, LAIR-1, PVRIG/CD112R, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 체크포인트 분자 억제제는 항체, 펩타이드, RNAi 제제, 또는 작은 분자이다. CTLA-4에 특이적인 항체는 이필리무맙 (ipilimumab) 또는 트레멜리무맙 (tremelimumab)일 수 있다. PD-1에 특이적인 항체는 피딜리주맙 (pidilizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 또는 펨브롤리주맙 (pembrolizumab)일 수 있다. PD-L1에 특이적인 항체는 두르발루맙 (durvalumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab), 또는 아벨루맙 (avelumab)일 수 있다.
예시적 화학요법은 알킬화제, 백금계 제제, 혈관형성 억제제 (예를 들어, VEGF 경로 억제제), 티로신 키나제 억제제 (예를 들어, EGF 경로 억제제), B-Raf 억제제, MEK 억제제, mTOR 억제제, 세포독성 제제, 염색질 기능 억제제, 국소이성질화 효소 억제제, 미세소관 억제 약제, DNA 손상제, 대사길항제 (예컨대, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 및 당-변형된 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용 제제 (예컨대, 삽입성 제제), 및 DNA 수선 억제제를 포함한다.
조합 요법에 사용하기 위해 고려되는 화학치료제의 예는 베무라페닙 (vemurafenib), 다브라페닙 (dabrafenib), 트라메티닙 (trametinib), 코비메티닙 (cobimetinib), 아나스트로졸 (anastrozole) (아리미덱스 (Arimidex)®), 비칼루타미드 (bicalutamide) (카소덱스 (Casodex)®), 블레오마이신 술페이트 (bleomycin sulfate) (블레녹산 (Blenoxane)®), 부술판 (busulfan) (밀레란 (Myleran)®), 부술판 주사 (부술펙스 (Busulfex)®), 카페시타빈 (capecitabine) (젤로다 (Xeloda)®), N4-펜톡시카보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카보플라틴 (carboplatin) (파라플라틴 (Paraplatin)®), 카무스틴 (carmustine) (BiCNU®), 클로람부실 (chlorambucil) (레우케란 (Leukeran)®), 시스플라틴 (cisplatin) (플라티놀 (Platinol)®), 클라드리빈 (cladribine) (레우스타틴 (Leustatin)®), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide) (시톡산 (Cytoxan)® 또는 네오사르 (Neosar)®), 시타라빈 (cytarabine), 시토신 아라비노시드 (cytosine arabinoside) (시토사르-U (Cytosar-U)®), 시타라빈 리포솜 주사 (데포시트 (DepoCyt)®), 다카바진 (dacarbazine) (DTIC-Dome®), 닥티노마이신 (dactinomycin) (악티노마이신 D (액티노마이신 D), 코스메간 (Cosmegan)), 다우노루비신 하이드로클로라이드 (daunorubicin hydrochloride) (세루비딘 (Cerubidine)®), 다우노루비신 시트레이트 (daunorubicin citrate) 리포솜 주사 (다우녹솜 (DaunoXome)®), 덱사메타손 (dexametasone), 도세탁셀 (docetaxel) (탁소테레 (Taxotere)®), 독소루비신 하이드로클로라이드 (doxorubicin hydrochloride) (아드리아마이신 (Adriamycin)®, 루벡스 (Rubex)®), 에토포시드 (etoposide) (베페시드 (Vepesid)®), 플루다라빈 포스페이트 (fludarabine phosphate) (플루다라 (Fludara)®), 5-플루오로우라실 (아드루실 (Adrucil)®, 에푸덱스 (Efudex)®), 플루타미드 (flutamide) (에울렉신 (Eulexin)®), 테자시티빈 (tezacitibine), 겜시타빈 (디플루오로데옥시시티딘), 하이드록시우레아 (hydroxyurea) (하이드레아 (Hydrea)®), 이다루비신 (Idarubicin) (이다마이신 (Idamycin)®), 이포스파미드 (ifosfamide) (IFEX®), 이리노데칸 (irinotecan) (캄프토사르 (Camptosar)®), L-아스파라기나제 (L-asparaginase) (ELSPAR®), 레우코보린 칼슘 (leucovorin calcium), 멜팔란 (melphalan) (알케란 (Alkeran)®), 6-머캅토푸린 (6-mercaptopurine) (푸리네톨 (Purinethol)®), 메토프렉세이트 (methotrexate) (폴렉스 (Folex)®), 미톡산트론 (mitoxantrone) (노반트론 (Novantrone)®), 밀로타르그 (mylotarg), 파클리탁셀 (탁솔 (Taxol)®), 포에틱스 (phoenix) (이트리움90 (Yttrium90)/MX-DTPA), 펜토스타틴 (pentostatin), 카무스틴 임플란트 (carmustine implant) 함유 폴리페프로산 20(polifeprosan 20) (글리아델 (Gliadel)®), 타목시펜 시트레이트 (tamoxifen citrate) (놀바덱스 (Nolvadex)®), 테니포시드 (teniposide) (부몬 (Vumon)®), 6-티오구아닌 (6-thioguanine), 티오테파 (thiotepa), 티라파자민 (tirapazamine) (티라존 (Tirazone)®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드 (topotecan hydrochloride) (하이캄프틴 (Hycamptin)®), 빈블라스틴 (vinblastine) (벨반 (Velban)®), 빈크리스틴 (vincristine) (온코빈 (Oncovin)®), 및 비노렐빈 (vinorelbine) (나벨빈 (Navelbine)®)을 포함한다.
예시적 알킬화제는 질소 머스타드 (nitrogen mustard), 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아스 (nitrosoureas) 및 트리아제네스 (triazenes): 우라실 머스타드 (아미노우라실 머스타드 (aminouracil Mustard)®, 클로레타미나실 (Chlorethaminacil)®, 데메틸도판 (Demethyldopan)®, 데스메틸도판 (Desmethyldopan)®, 하에만타민 (Haemanthamine)®, 노르도판 (Nordopan)®, 우라실 질소 머스타드®, 우라실로스트 (Uracillost)®, 우라실모스타자 (Uracilmostaza)®, 우라무스틴 (Uramustin)®, 우라무스틴 (Uramustine)®), 클로르메틴 (chlormethine) (무스타르겐 (Mustargen)®), 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide) (시톡산 (Cytoxan)®, 네오사르 (Neosar)®, 클라펜 (Clafen)®, 엔독산 (Endoxan)®, 프로시톡스 (Procytox)®, 레브이뮨 (Revimmune)™), 이포스파미드 (ifosfamide) (미톡사나 (Mitoxana)®), 멜팔란 (melphalan) (알케란 (Alkeran)®), 클로람부실 (Chlorambucil) (레우케란 (Leukeran)®), 피포브로만 (pipobroman) (아메델 (Amedel)®, 베르시테 (Vercyte)®), 트리에틸렌멜라민 (헤멜 (Hemel)®, 헥살렌 (hexalen)®, 헥사스트트 (hexastat)®), 트리에틸렌티오포스포라민, 테모졸로미드 (Temozolomide) (테모다르 (Temodar)®), 티오테파 (thiotepa) (티오플렉스 (Thioplex)®), 부술판 (부실벡스 (Busilvex)®, 밀레란 (Myleran)®), 카무스틴 (BiCNU®), 로무스틴 (lomustine) (CeeNU®), 스트렙토조신 (streptozocin) (자노사르 (Zanosar)®), 및 다카르바진 (Dacarbazine) (DTIC-Dome®)을 포함한다. 추가의 예시적 알킬화제는, 제한없이, 옥살리플라틴 (엘록사틴 (Eloxatin)®); 테모졸로미드 (Temozolomide) (테모다르 (Temodar)® 및 테모달 (Temodal)®); 닥티노마이신 (또한 악티노마이신-D (액티노마이신-D)로 일컬어짐, 코스메겐 (Cosmegen)®); 멜팔란 (Melphalan) (또한 L-PAM, L-사르콜리신 (L-sarcolysin), 및 페닐알라닌 머스타드로 일컬어짐, 알케란 (Alkeran)®); 알트레타민 (Altretamine) (또한 헥사메틸멜라민 (HMM)으로 일컬어짐, 헥살렌 (hexalen)®); 카무스틴 (Carmustine) (BiCNU®); 벤다무스틴 (Bendamustine) (트레안다 (Treanda)®); 부술판 (부술펙스 (Busulfex)® 및 밀레란 (Myleran)®); 카보플라틴 (Carboplatin) (파라플라틴 (Paraplatin)®); 로무스틴 (Lomustine) (또한 CCNU로 일컬어짐, CeeNU®); 시스플라틴 (또한 CDDP로 일컬어짐, 플라티놀 (Platinol)® 및 플라티놀®-AQ); 클로람부실 (Chlorambucil) (류케란 (Leukeran)®); 사이클로포스파미드 (시톡산 (Cytoxan)® 및 네오사르 (Neosar)®); 다카바진 (Dacarbazine) (또한 DTIC, DIC 및 이미다졸 카복사미드로 일컬어짐, DTIC-Dome®); 알트레타민 (Altretamine) (또한 헥사메틸멜라민 (HMM)으로 일컬어짐, 헥살렌 (hexalen)®); 이포스파미드 (Ifosfamide) (이펙스 (Ifex)®); 프레드누무스틴 (Prednumustine); 프로카바진 (Procarbazine) (마툴란 (Matulane)®); 메클로레타민 (Mechlorethamine) (또한 질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 하이드로클로라이드로 일컬어짐, 무스타르겐 (Mustargen)®); 스트렙토조신 (Streptozocin) (자노사르 (Zanosar)®); 티오테파 (Thiotepa) (또한 티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA로 일컬어짐, 티오플렉스 (Thioplex)®); 사이클로포스파미드 (엔독산®, 시톡산®, 네오사르®, 프록시톡스®, 레브이뮨®); 및 벤다무스틴 HCl (Bendamustine HCl) (트레안다 (Treanda)®)를 포함한다.
예시적 백금계 제제는 카보플라틴 (carboplatin), 시스플라틴 (cisplatin), 옥살리플라틴, 네다플라틴 (nedaplatin), 피코플라틴 (picoplatin), 사트라플라틴 (satraplatin), 페난트리플라틴 (phenanthriplatin), 및 트리플라틴 테트라니트레이트 (triplatin tetranitrate)를 포함한다.
예시적 혈관형성 억제제는 제한없이, A6 (안즈스트롬 파마세티칼스 (Angstrom Pharmaceuticals)), ABT-510 (아보트 래버러토리스 (Abbott Laboratories)), ABT-627 (아트라센탄 (Atrasentan)) (아보트 래버러토리스/진라이 (Xinlay)), ABT-869 (아보트 래버러토리스), 악티미드 (Actimid) (CC4047, 포말리도미드 (Pomalidomide)) (켈젠 코포레이션 (Celgene Corporation)), AdGVPEDF.11D (GenVec), ADH-1 (엑스헤린 (Exherin)) (아드헤렉스 테크놀로지스 (Adherex Technologies)), AEE788 (노바르티스 (Novartis)), AG-013736 (악시티닙 (Axitinib)) (파이저 (Pfizer)), AG3340 (프리노마스타트 (Prinomastat)) (아고우론 파마세티칼스 (Agouron Pharmaceuticals)), AGX1053 (AngioGenex), AGX51 (AngioGenex), ALN-VSP (ALN-VSP O2) (알닐람 파마세티칼스 (Alnylam Pharmaceuticals)), AMG 386 (암젠 (Amgen)), AMG706 (암젠), 아파티닙 (Apatinib) (YN968D1) (지안구수 헹루이 메디슨 (Jiangsu Hengrui Medicine)), AP23573 (리다포롤리무스 (Ridaforolimus)/MK8669) (아리아드 파마세티칼스 (Ariad Pharmaceuticals)), AQ4N (노바베아 (Novavea)), ARQ 197 (ArQule), ASA404 (노바티스 (Novartis)/안티소마 (Antisoma)), 아티프리모드 (Atiprimod) (칼리스토 파마세티칼스 (Callisto Pharmaceuticals)), ATN-161 (아테누온 (Attenuon)), AV-412 (아베오 파마세티칼스 (Aveo Pharmaceuticals)), AV-951 (아베오 파마세티칼스), 아바스틴 (Avastin) (베바시주맙 (Bevacizumab)) (게넨테크 (Genentech)), AZD2171 (세디라닙 (Cediranib)/레센틴 (Recentin)) (AstraZeneca), BAY 57-9352 (텔라티닙 (Telatinib)) (바이어 (Bayer)), BEZ235 (노바티스 (Novartis)), BIBF1120 (보에링거 인겔헤임 파마세티칼스 (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals)), BIBW 2992 (보에링거 인겔헤임 파마세티칼스), BMS-275291 (브리스톨-마이어스 스큅 (Bristol-Myers Squibb)), BMS-582664 (브리바닙 (Brivanib)) (브리스톨-마이어스 스큅), BMS-690514 (브리스톨-마이어스 스큅), 칼시트리올 (Calcitriol), CCI-779 (토리셀 (Torisel)) (Wyeth), CDP-791 (ImClone 시스템스), 세플라토닌 (Ceflatonin) (호모하링토닌 (Homoharringtonine)/HHT) (ChemGenex 테라퓨틱스), 켈레브렉스 (Celebrex) (켈레콕십 (Celecoxib)) (파이저), CEP-7055 (케팔론 (Cephalon)/사노피 (Sanofi)), CHIR-265 (키론 코포레이션 (Chiron Corporation), NGR-TNF, COL-3 (메타스타트 (Metastat)) (콜라게넥스 파라세우티칼스 (Collagenex Pharaceuticals)), 콤브레타스타틴 (Combretastatin) (옥시젠 (Oxigene)), CP-751,871(피기투무맙 (Figitumumab)) (파이저), CP-547,632 (파이저), CS-7017 (다이이치 산키오 파르마 (Daiichi Sankyo Pharma)), CT-322 (안지오셉트 (Angiocept)) (아드넥수스 (Adnexus)), 쿠르쿠민 (Curcumin), 달테파린 (Dalteparin) (프라그민 (Fragmin)) (파이저), 디술피람 (Disulfiram) (안타부세 (Antabuse)), E7820 (에이사이 리미티드 (Eisai Limited)), E7080 (에이사이 리미티드), EMD 121974(실렌지티드 (Cilengitide)) (EMD 파마세티칼스), ENMD-1198 (EntreMed), ENMD-2076 (EntreMed), 엔도스타르 (Endostar) (심세레 (Simcere)), 에르비툭스 (Erbitux) (ImClone/브리스톨-메이어스 스퀴브 (Bristol-Myers Squibb)), EZN-2208 (엔존 파마세티칼스 (Enzon Pharmaceuticals)), EZN-2968 (엔존 파마세티칼스), GC1008 (G효소), 게니스테인 (Genistein), GSK1363089(포레티닙 (Foretinib)) (GlaxoSmithKline), GW786034 (파조파닙 (Pazopanib)) (GlaxoSmithKline), GT-111 (바스큘러 바이오제닉스 (Vascular Biogenics) Ltd.), IMC-1121B (라무시루맙 (Ramucirumab)) (ImClone 시스템), IMC-18F1 (ImClone 시스템), IMC-3G3 (ImClone LLC), INCB007839 (인시테 코포레이션 (Incyte Corpo비율n)), INGN 241 (인트로젠 테라퓨틱스 (Introgen Therapeutics)), 이레사 (Iressa) (ZD1839/게피티닙 (Gefitinib)), LBH589 (파리닥스 (Faridak)/파노비노스트스트 (Panobinostst)) (노바르티스 (Novartis)), 루센티스 (Lucentis) (라니비주맙 (Ranibizumab)) (게넨테크 (Genentech)/노바르티스 (Novartis)), LY317615 (엔자스타우린 (Enzastaurin)) (엘리 릴리 앤드 컴퍼니 (Eli Lilly and Company)), 마쿠젠 (Macugen) (페가프타닙 (Pegaptanib)) (파이저), MEDI522 (아베그린 (Abegrin)) (메드이뮨 (Medimmune)), MLN518(탄두티닙 (Tandutinib)) (밀렌늄 (Millennium)), 네오바스타트 (Neovastat) (AE941/베네핀 (Benefin)) (아에테르나 젠타리스 (Aeterna Zentaris)), 넥사바르 (Nexavar) (바이어 (Bayer)/오닉스 (Onyx)), NM-3 (겐자임 코포레이션 (Genzyme Corporation)), 노스카핀 (Noscapine) (코우가르 바이오테크놀로지 (Cougar Biotechnology)), NPI-2358 (네레우스 파마세티칼스 (Nereus Pharmaceuticals)), OSI-930 (OSI), 팔로미드 529 (Palomid 529) (팔로마 파마세니칼스 (Paloma Pharmaceuticals), Inc.), 판젬 캡슐스 (Panzem Capsules) (2ME2) (EntreMed), 판젬 NCD (2ME2) (EntreMed), PF-02341066 (파이저), PF-04554878 (파이저), PI-88 (프로젠 인더스트리스 (Progen Industries)/메디젠 바바이오테크놀로지 (Medigen Biotechnology)), PKC412 (노바티스 (Novartis)), 폴리페논 E (polyphenon E) (그린 티 익스트렉트 (Green Tea Extract)) (폴리페노 E 인터네셔널 (polypheno E International), Inc), PPI-2458 (프라에시스 파마세티칼스 (Praecis Pharmaceuticals)), PTC299 (PTC 테라퓨틱스), PTK787 (바탈라닙 (Vatalanib)) (노바티스), PXD101 (벨리노스타트 (Belinostat)) (CuraGen 코포레이션), RAD001 (에베롤리무스 (Everolimus)) (노바티스), RAF265 (노바티스), 로제라페닙 (Regorafenib) (BAY73-4506) (바이어), 레블리미드 (Revlimid) (켈젠), 레타안 (Retaane) (알콘 리서치 (Alcon Research)), SN38 (리포소멀 (Liposomal)) (네오팜 (Neopharm)), SNS-032 (BMS-387032) (수네시스 (Sunesis)), SOM230(파시레오티드 (Pasireotide)) (노바티스), 스쿠알라민 (Squalamine) (게네라 (Genaera)), 수라민 (Suramin), 수텐트 (Sutent) (파이저), 타세바 (Tarceva) (게넨테크 (Genentech)), TB-403 (트롬보게닉스 (Thrombogenics)), 템포스타틴 (Tempostatin) (콜라드 바이오파마세티칼스 (Collard Biopharmaceuticals)), 테트라티오몰리브데이트 (Tetrathiomolybdate) (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)), TG100801 (TargeGen), 탈리도미드 (Thalidomide) (켈젠 코포레이션), 틴자파린 소듐 (Tinzaparin Sodium), TKI258 (노바티스), TRC093 (트라콘 파마세티칼스 (Tracon Pharmaceuticals) Inc.), VEGF Trap (아플리버셉트 (Aflibercept)) (레제네론 파마세티칼스 (Regeneron Pharmaceuticals)), VEGF Trap-Eye (레제네론 파마세티칼스), 베글린 (Veglin) (VasGene 테라퓨틱스), 보테조밉 (Bortezomib) (밀레늄 (Millennium)), XL184 (엑셀릭시스 (Exelixis)), XL647 (엑셀릭시스), XL784 (엑셀릭시스), XL820 (엑셀릭시스), XL999 (엑셀릭시스), ZD6474 (AstraZeneca), 보리노스타트 (Vorinostat) (메르크 (Merck)), 및 ZSTK474를 포함한다.
예시적 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 베바시주맙 (Bevacizumab) (아바스틴 (Avastin)®), 악시티닙 (axitinib) (Inlyta®); 브리바닙 알라니네이트 (Brivanib alaninate) (BMS-582664, (S)―((R)-1-(4-(4-플루오로-2-메틸-1H-인돌-5-일옥시)-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일옥시)프로판-2-일)2-아미노프로파노에이트); 소라페닙 (Sorafenib) (넥사바르 (Nexavar)®); 파조파닙 (Pazopanib) (보트리엔트 (Votrient)®); 수니티닙 말레이트 (Sunitinib malate) (수텐트 (Sutent)®); 세디라닙 (Cediranib) (AZD2171, CAS 288383-20-1); 바르가테프 (Vargatef) (BIBF1120, CAS 928326-83-4); 포레티닙 (Foretinib) (GSK1363089); 텔라티닙 (Telatinib) (BAY57-9352, CAS 332012-40-5); 아파티닙 (Apatinib) (YN968D1, CAS 811803-05-1); 이마티닙 (Imatinib) (글레벡 (Gleevec)®); 포나티닙 (Ponatinib) (AP24534, CAS 943319-70-8); 티보자닙 (Tivozanib) (AV951, CAS 475108-18-0); 레고라페닙 (Regorafenib) (BAY73-4506, CAS 755037-03-7); 바탈라닙 디하이드로클로라이드 (Vatalanib dihydrochloride) (PTK787, CAS 212141-51-0); 브리바닙 (Brivanib) (BMS-540215, CAS 649735-46-6); 반데타닙 (Vandetanib) (카프렐사 (Caprelsa)® 또는 AZD6474); 모테사닙 디포스페이트 (Motesanib diphosphate) (AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인돌-6-일)-2-[(4-피리디닐메틸)아미노]-3-피리딘카복사미드, PCT 공보 WO 02/066470에 기재되어 있음); 도비티닙 디락트산 (Dovitinib dilactic acid) (TKI258, CAS 852433-84-2); 린파닙 (Linfanib) (ABT869, CAS 796967-16-3); 카보잔티닙 (Cabozantinib) (XL184, CAS 849217-68-1); 레스타우르티닙 (Lestaurtinib) (CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1,1-디메틸에틸)-2-옥사졸릴]메틸]티오]-2-티아졸릴]-4-피페리딘카복사미드 (BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올 (BMS690514); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸사이클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민 (XL647, CAS 781613-23-8); 4-메틸-3-[[1-메틸-6-(3-피리디닐)-1H-피라졸[3,4-d]피리미딘-4-일]아미노]-N-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-벤즈아미드 (BHG712, CAS 940310-85-0); 및 아플리베르셉트 (에일레아®)를 포함한다.
예시적 EGF 경로 억제제는, 제한없이 티르포스틴 46, EKB-569, 에로티닙 (erlotinib) (타르세바®), 게피티닙 (이레사®), 에르비툭스, 니모투주맙, 라파티닙 (Lapatinib) (티케르브®), 세툭시맙 (항-EGFR mAb), 188Re-표지 니모투주맙 (항-EGFR mAb), 및 WO 97/02266, EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0 520 722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, 미국 특허 제 5,747,498호, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 및 WO 96/33980에 일반적이고, 구체적으로 개시되어 있는 화합물을 포함한다. 예시적 EGFR 항체, 이에 제한되는 것은 아니나, 세툭시맙 (에르비툭스®); 마니투무맙 (벡티빅스®); 마투주맙 (EMD-72000); 트라스투주맙 (헤르셉틴®); 니모투주맙 (hR3); 잘루투무맙; TheraCIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1); 및 ch806 (mAb-806, CAS 946414-09-1)을 포함한다. 예시적 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 에로티닙 하이드로클로라이드 (타세바®), 게피티닙 (이레사®); N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3"S")-테트라하이드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4(디메틸아미노)-2-부텐아미드, 토복 (Tovok)®); 반데타닙 (Vandetanib) (카프렐사®); 라파티닙 (티커브 (Tykerb)®); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올 (BMS690514); 카네르티닙 디하이드로클로라이드 (CI-1033); 6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민 (AEE788, CAS 497839-62-0); 무브리티닙 (TAK165); 펠리티닙 (EKB569); 아파티닙 (BIBW2992); 네라티닙 (HKI-272); N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-1H-인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]-카르밤산, (3S)-3-모르폴리닐메틸 에스테르 (BMS599626); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸사이클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민 (XL647, CAS 781613-23-8); 및 4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀 (PKI166, CAS 187724-61-4)을 포함한다.
예시적 mTOR 억제제는, 제한없이, 라파마이신 (Rapamune®), 및 그의 유사체 및 유도체; SDZ-RAD; 템시롤리무스 (Temsirolimus) (Torisel®; 또한 CCI-779로 일컬어짐); 리다포롤리무스 (Ridaforolimus) (공식적으로는 데페롤리무스 (deferolimus)로 일컬어짐, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디하이드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리사이클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시사이클로헥실 디메틸포스피네이트, 또한 AP23573 및 MK8669로 일컬어지며, PCT 공보 WO 03/064383에 기재되어 있음); 에베롤리무스 (Afinitor® 또는 RAD001); 라파마이신 (AY22989, 시롤리무스 (Sirolimus)®); 시마피모드 (Simapimod) (CAS 164301-51-3); (5-{2,4-Bis[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-하이드록시에톡시)사이클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온 (PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N2-[1,4-디옥소-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸L-세린-, 내부 염 (SF1126, CAS 936487-67-1)을 포함한다.
예시적 포스포이노시티드 3-키나제 (PI3K) 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[[4-(메틸술포닐)피페라진-1-일]메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린 (또한 GDC 0941로 일컬어지며, PCT 공보 WO 09/036082 및 WO 09/055730에 기재되어 있음); 2-메틸-2-[4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디하이드로이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐]프로피오니트릴 (또한 BEZ 235 또는 NVP-BEZ 235로 일컬어지며, PCT 공보 WO 06/122806에 기재되어 있음); 4-(트리플루오로메틸)-5-(2,6-디모르폴리노피리미딘-4-일)피리딘-2-아민 (또한 BKM120 또는 NVP-BKM120로 일컬어지며, PCT 공보 WO2007/084786에 기재되어 있음); 토바세르팁 (Tozasertib) (VX680 또는 MK-0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-피리디닐)-6-퀴놀리닐]메틸렌]-2,4-티아졸리디네디온 (GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(아세틸옥시)-1-[(디-2-프로페닐아미노)메틸렌]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-옥타하이드로-11-하이드록시-4-(메톡시메틸)-4a,6a-디메틸-사이클로펜타[5,6]나프토[1,2-c]피란-2,7,10(1H)-트리온 (PX866, CAS 502632-66-8); 및 8-페닐-2-(모르폴린-4-일)-크로멘-4-온 (LY294002, CAS 154447-36-6)을 포함한다. 예시적 단백질 키나제 B (PKB) 또는 AKT 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐-1,2,4-트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온 (MK-2206, CAS 1032349-93-1); 페리포신 (Perifosine) (KRX0401); 4-도데실-N-1,3,4-티아디아졸-2-일 -벤젠술폰아미드 (PHT-427, CAS 1191951-57-1); 4-[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-7-[(3S)-3-피페리디닐메톡시]-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-4-일]-2-메틸-3-부틴-2-올 (GSK690693, CAS 937174-76-0); 8-(1-하이드록시에틸)-2-메톡시-3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6H-디벤조[b,d]피란-6-온 (팔로미드 529, P529, 또는 SG-00529); 트리시르빈 (Tricirbine) (6-아미노-4-메틸-8-(β-D-리보푸라노실)-4H,8H-피롤로[4,3,2-de]피리미도[4,5-c]피리다진); (αS)-α-[[[5-(3-메틸-1H-인다졸-5-일)-3-피리디닐]옥시]메틸]-벤젠에탄아민 (A674563, CAS 552325-73-2); 4-[(4-클로로페닐)메틸]-1-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딘아민 (CCT128930, CAS 885499-61-6); 4-(4-클로로페닐)-4-[4-(1H 피라졸-4-일)페닐]-피페리딘 (AT7867, CAS 857531-00-1); 및 아르켁신 (Archexin) (RX-0201, CAS 663232-27-7)을 포함한다.
도 5a 내지 도 5c, 도 93, 및 도 94는 CER 변형된 세포를 사용하는 용법의 실시형태를 예시한다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 백혈구성분채집술 후, 대상체에 주입하기 위한 제조시 세포를 생체외에서 가공하고, 활성화시키고, 유전자 변형시키고, 확장시킬 수 있다. 도 5b는 통상적인 T 세포 기반 요법과 조합하여 사용되는 CER-변형된 세포의 예시적 처리 도식을 도시한다. 조작된 T 세포의 초기 주입은 항 종양 효과를 나타내는 종양 세포 아폽토시스를 유도한다. CER 변형된 세포를 그 후 주입한다. CER 변형된 세포는 전-포식작용 (예를 들어, PtdSer)을 디스플레이하는 종양 세포를 제거하며, 이는 또한 T 세포 억제 종양 미세환경을 우회하면서, 종양 퇴행을 촉진한다. 종양 미세환경의 변이는 그 후 T 세포 요법에 대해 종양을 재 감응화시킴으로써, T 세포의 2차 주입을 가능하게 한다. 처리 방법의 또 다른 실시형태가 도 5c에 도시되어 있다. 도 5c에 도시되어 있는 처리 도식은 단일클론 항체 요법과 조합하여, CER 변형된 세포를 사용한다. 종양-특이적 항체, 예컨대 EGFR을 표적화하는 세툭시맙 또는 CD20을 표적화하는 리툭시맙의 주입은 세포 사멸을 촉발할 수 있거나, CER 변형된 세포와 결합하는 모이어티의 표적화를 유도할 수 있다. 후속하여, 항체 결합 세포에 결합하여, 이를 제거하는 CER 변형된 세포를 대상체에 제공한다. 이러한 실시형태에서, CER 세포외 도메인은 FcR 결합 도메인, PtdSer 결합 도메인, 또는 다른 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 시나리오에서, CER 변형된 세포는 작은 분자 억제제, 예컨대 BTK 억제제, MEK 억제제, 아데노신 경로 억제제 A2AR 길항제, IDO1 억제제, IMiDs, 예컨대 레날리도미드 (Lenalidomide), PI3Kδ 억제제, BRAF 억제제, 또는 BCR-ABL 억제제와 조합될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 고갈 단계를 포함한다. 대상체로부터 CER을 제거하기 위한 고갈 단계는 대상체에 대한 독성을 완화하기 위해, 치료 효과에 충분한 기간의 시간 후에 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태에서, CER 벡터는 유도성 자살 유전자, 예컨대 iCASP9, 유도성 Fas, 또는 HSV-TK를 포함한다. 유사하게, CER 벡터는 연관된 단일클론 항체 (mAb), 예를 들어, CD20의 경우 리툭시맙 또는 EGFR의 경우 세툭시맙의 주입을 통해 형질도입된 세포의 고갈을 촉진하는 공지된 세포 표면 항원, 예컨대 CD20 또는 절두된 EGFR (서열번호 121)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 성숙 림프구의 표면에 존재하는 CD52를 표적화하는 알렘투주맙 (Alemtuzumab)이 또한 형질도입된 B 세포, T 세포, 또는 자연 살해 세포를 고갈시키기 위해 사용될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본 개시내용의 CER을 발현하는 세포는 본 명세서에서 확인되는 적응증 또는 상태와 관련하여 사용되는 방법을 포함하여, 진단 방법 또는 촬영 방법에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1
CER 작제물의 생성 CER을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산 분자의 발현은 CER 단백질 또는 그의 일부분을 인코딩하는 핵산 분자를 프로모터에 작동 가능하게 연결시키고, 복제 및 혼입 진핵생물에 적합한 발현 벡터에 작제물을 혼입시킴으로써 달성된다. 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열 및 요망되는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 포함한다.
CER 단백질 또는 그의 일부의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 바이러스 벡터를 통해 형질감염되거나 감염될 세포 집합으로부터의 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하는 선택적 마커 유전자, 예컨대 항생제 내성 유전자 또는 리포터 유전자를 포함한다. 선택적 마커는 별도의 DNA 조각에 보유되어, 공동 형질감염 절차에 사용된다. 선택적 마커 또는 리포터 유전자는 숙주 세포에서 발현이 가능하도록 하는 적절한 조절 서열에 측접되어 있다. 발현 벡터는 레트로바이러스 벡터를 통해 숙주 세포 내로 전달된다. 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, RT-PCR 및 ELISA를 포함하는 다양한 분석을 수행한다.
CER 성능의 평가 CER을 확인하고, 특성화하기 위해, 후보 CER의 레트로바이러스-매개 형질도입을 사용하여 식작용 세포 포식작용을 재구성하는 시험관내 시스템을 확립하였다. 기능 활성의 획득에 대해 평가하기 위해, 정상적으로는 세포를 포식작용하는 능력이 부재하는 쥣과동물 및 인간 림프구 세포주를 CER로 형질도입시킨다. CER이 성공적으로 발현된 경우, 이종 세포에서 포식작용이 유발된다. 그의 포식작용 활성 외에도, CER을 (1) 염증성 사이토카인 및 케모카인을 방출하도록 세포를 분극화하고; (2) 하류 증식 경로를 활성화시키고; (3) 표적 세포를 비 요법 유도성 내성 패턴을 갖도록 하는 그의 능력에 대해 평가한다. 후보 CER을 평가하기 위해, 다차원 유동 세포계측, 사이토카인/케모카인 어레이, 및 기능성 분석 (아래)을 사용한다.
실시예 2
시험관내 식작용 마우스 프로-B 세포주 Ba/F3 또는 인간 Jurkat T 세포는 시험관내에서 아폽토시스 또는 종양 세포를 식작용하는 고유의 식작용 능력이 부재하며, 선두 CER 후보를 확인하기 위한 초기 스크리닝 세포주로 사용된다. CER 레트로바이러스 형질도입 후, Ba/F3 또는 Jurkat T 세포를 정제하고, 표지하여, 면역 표현형으로 특성화한다. FACS 또는 발광 현미경 검사로 측정된 포식작용 및 다양한 공동 배양 조건하에서의 규정된 표적 세포에 의한 시험관내 공동 배양 실험을 사용하여, 식작용 활성을 측정한다. 세포외 PtdSer 표적화 도메인을 갖는 Ba/F3 또는 Jurkat T 세포-형질도입된 CER 세포를 pHrodo-표지된 아폽토시스 세포와 공동 배양한다. 이러한 분석은 시토졸 리소좀에 유입된 아폽토시스 세포의 식작용을 평가할 수 있도록 한다. 다른 경우, Fc 수용체 세포외 도메인을 갖는 Ba/F3 또는 Jurkat T 세포-형질도입된 CER 세포를 항체, 예컨대종양 특이적 항체와 사전 인큐베이션된 표적 세포와 공동 인큐베이션시켜, 항체-코팅된 종양 세포에 대해 식세포작용을 하는 이러한 세포의 능력을 측정한다. 마지막으로, 항체 결합 모이어티, 예컨대단일-사슬 가변 단편을 통해 종양 항원에 결합하는 Ba/F3 또는 Jurkat T 세포-형질도입된 CER을 종양 세포와 공동 배양하고, 식작용을 정량화한다. 일부 경우, '프로-식작용' 분자 상태를 유도하기 위해, 표적 세포를 공동 배양 실험 전에, 통상적인 화학요법, 방사선, 또는 작은 분자 요법으로 전처리한다. 90분 공동 배양 실험 후, 표지된 Ba/F3 Jurkat 형질전환체에서 세포 추적인자 (Cell Tracker)-양성 세포의 백분율로서 식작용 활성을 정량화한다.
조절된 배지로부터의 사이토카인/케모카인 어레이 분석
병행하여, 조절된 배지를 Ba/F3 또는 Jurkat T 세포 형질전환체 공동 배양 실험으로부터 수집하고, 염증성 사이토카인/케모카인 분석의 방출에 대해 분석한다. Ba/F3 Jurkat 형질도입 전 및 후의 사이토카인/케모카인 변화 및 상대적 비교를 정량화하여, 기능성 획득에 대해 평가한다. (i) 미성숙 단핵구 및 골수-유래 억제 세포의 집약에 관여하는 면역억제성 사이토카인, 예컨대 IL-10 및 TGF-β, 단핵구 화학적 유인 물질의 하향 조절, 및 (ii) 염증성 사이토카인 TNF 알파, IL12p70, IFNα, 및 IFNγ의 상향 조절 둘 모두에 의해 염증성 상태로 세포를 분극시키는 CER 후보를 확인한다.
다차원 유동 세포계측 병행하여, 다차원 세포 유동계측을 사용하여, Ba/F3 및 Jurkat 형질전환체를 분석하여, 활성화 및 억제 수용체 프로파일에 대해 특성화한다. 활성화 프로파일은 CD137, CD69, HLA-DR, CD107a, CD123, CD11c, TNF, IFNγ, IL-2, 그랜자임, 퍼포린, CD25, CD40L, CD80, 및 CD86을 포함할 수 있으며, 억제 프로파일은 PD-1, Tim-3, Lag-3, ICOS, 및 CD172a를 포함할 수 있다. 배양액 내의 구경꾼 세포를 요법 유도된 내성 패턴에 대해 면역 표현형으로 평가한다.
증식 분석 CER 카세트로 형질도입된 1차 인간 T 세포를 외인성 사이토카인 또는 피더 세포 (feeder cell)의 존재 또는 부재하에 항시적 또는 비-항시적 성장 패턴에 대해 분석한다.
하류 전염증성 신호전달 경로 하류 전염증 반응을 추가로 시험하기 위해, 포스포-CYTOF를 수행하여, IkBtot, pSTAT1, p38, 및 JNK와 같은 후보 CER에 의해 활성화된 하류 신호전달 경로를 측정한다.
실시예 3
생체내 분석 생체내에서 CER 변형된 세포를 시험하기 위해, 동물 모델 및 생체외 실험을 사용한다. 인간 1차 종양 세포 또는 이종이식 표본을 Nod/SCDγ 마우스에 이식한다. 혈액 및 조직 표본으로부터 액적 PCR (ddPCR) 장치에 의해 CER 카세트에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변형된 CER 세포의 확장 및 지속성을 정량화할 수 있다. 생체외에서 CER 세포의 기능성 능력을 분석하기 위해, 종양 조직 및 비장 세포를 처리하고, CER-변형된 세포의 입양 전달 후, 생체내 식작용의 입증 및 표현형에 대해 FACS 및 조직 염색에 의해 분석한다. 종양 성장을 생체내에서 모니터링하고, 정량화한다.
실시예 4
Tim4-MerTk 키메라 포식작용 수용체 (CER) "CER01"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열을 인코딩함) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열을 인코딩함) (서열번호 57의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함께 가짐)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 티로신 키나제 MERTK의 세포내 키나제 도메인 (서열번호 58을 인코딩함)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER01" (서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MERTK CER)을 생성시켰다 (도 6A). MERTK 수용체 티로신 키나제는 포식작용의 신호를 도입시키며, Tim4가 최근 포스파티딜세린 결합 수용체로서 기재된 바 있다 (문헌[Miyanishi et al., Nature, 2007, 450:435-9; Nishi et al., 2014, Mol. Cell Biol. 34:1512-20]). Tim-4-MERTK 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 pMSCV (쥣과동물 줄기세포 바이러스) 레트로바이러스 벡터에 삽입하였다. 초기 계대배양 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 형질도입 마커로서 황색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 pMSCV Tim4-MERTK 레트로바이러스로 형질도입시켰다. 양성 Ba/F3 세포 형질도입체를 유동 세포계측 (FACS)을 사용하여, GFP 발현에 의해 분류하고, 배양하여 확장시키고, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
1차 흉선 세포를 10 μM 덱사메타손과 함께 24시간 동안 인큐베이션하여, 세포 사멸을 유도하였다. 흉선 세포를 그 후 PBS 중 1 μM의 pHrodo 레드 염료로 실온에서 15분 동안 표지하고, 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지로 2회 세척하고, 식작용 분석을 위한 표적 세포로서 사용하였다. 50 μl의 pHrodo 레드-표지된 흉선 세포 (106/ mL)를 50 μl의 Tim4-MERTK 키메라 포식작용 수용체를 발현하는 분류 Ba/F3 세포 (105/mL) (10:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율)와 함께 인큐베이션하였다. pHrodo 레드 염료로 표적 세포를 표지함으로써, 산성 리소좀 환경에서 증가된 빛 방출로 인해, 리소좀에 포식작용되어, 운반되는 세포를 시각화할 수 있다 (문헌[Miksa et al., 2009, Immunol. Methods 342:71-7]). 공동 배양 실험을 수행하고, 인큐베이션 2시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 Ba/F3 GFP+ 세포를 식작용에 대해 연속적으로 정량화하였다. Tim4 및 GFP (비-포식작용 수용체)를 발현하는 pMSCV 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
정상적인 상태에서, Ba/F3 쥣과동물 B-세포주는 표적 세포를 포식작용하는 능력이 부재하므로, 이를 포식작용에 대한 분석 시스템을 정립하기 위해, 선택하였다. 아폽토시스 흉선 세포의 Tim4-MERTK CER-매개 포식작용을 첫 번째로 조사하였다 (도 6a 내지 도 6f). 쥣과동물 Ba/F3 B-세포주에서 Tim4-MERTK CER의 발현은 포스파티딜세린 양성 (PtdSer+) 흉선 세포의 식작용 흡수를 강력하게 증대시켰다 (도 6c 내지 도 6f). 형광 현미경 검사 및 FACS에 의한 관찰 결과, 식작용의 양은 표적 세포와의 인큐베이션 시간뿐만 아니라, Tim4-MERTK CER 발현의 양과 상관관계가 있는 것으로 관찰된다 (도 6c 및 도 6d). 공동 인큐베이션 2시간 후, 대조군에서의 0%와 비교하여, 21.6%의 Tim4-MERTK CER 형질도입된 Ba/F3 세포가 표적 아폽토시스 흉선 세포를 포식작용하였다 (도 6C). Tim4-MERTK CER을 발현하는 식작용 Ba/F3 세포의 수가 24시간 인큐베이션 시간에는 57.5%, 및 72시간 인큐베이션 시간에는 75%로 증가하였다 (도 6c 및 도 6d). 추가로, 최대량의 Tim4-MERTK CER을 발현한 Ba/F3 세포가 최대량의 식작용을 나타내었고, 이는 상위 발현 4분위수 내에 80%에 달하며 (도 6D), Tim4-MERTK CER의 농도 의존적 효과를 시사한다.
그 후, Tim4-MERTK CER이 포식리소좀으로의 포식된 표적 세포의 전달을 촉진하는 능력을 조사하였다. 가수분해 효소를 포함하는 리소좀은 감소된 pH의 내부 환경에서 포식된 세포를 분해한다 (문헌[Arandjelovic et al., 2015, Nat. Immunol. 16:907-17]). 이러한 환경에서, pHrodo 레드-표지된 표적 흉선 세포는 형광 강도를 증가시킨다. 형광 현미경 검사에 의한 관찰 결과, 대부분의 Tim4-MERTK CER-발현 Ba/F3 세포의 내부에 수개의 pHrodo 레드-양성 세포가 존재하는 것으로 관찰된다 (도 6e). 이러한 관찰 결과에 완전히 일치하는 것으로, Tim4-MERTK CER-발현 Ba/F3 세포의 포식리소좀으로의 표적 세포의 유입은 그 제거와 연관되었다. 4일째에, 97%의 표적 세포가 식작용 흡수 및 리소좀 분해를 통해 제거되었다 (도 7a 및 도 7b). 이러한 결과는 Tim4-MERTK CER의 첨가가 PtdSer + 세포의 제거를 강력하게 증대시킴을 시사한다.
CER-발현 세포가 종양 세포를 제거하는 능력을 조사하기 위해, Raji 인간 Burkitt B-세포 림프종 세포주의 Tim4-MERTK CER-매개 포식작용을 시험하였다 (도 8a 및 도 8b). 연구결과는 항-IgM-활성화된 B-세포에서 B-세포 수용체 (BCR)가 PtdSer을 막 마이크로도메인으로 혼입시키고, 이상 신호전달 활성의 환경에서, 예를 들어, 항시적으로 활성인 Raji 림프종 세포에 존재함을 시사한다 (문헌[Dillon et al., 2000, J. Immunol. 164:1322-32). 쥣과동물 Ba/F3 B-세포주에서 Tim4-MERTK CER의 발현은 Raji 세포의 식작용 흡수를 증대시켰으며 (도 8a 내지 도 8c), 이는 Tim4-MERTK CER-매개 항-종양 효과를 나타낸다.
실시예 5
FA58C2-MERTK CER "CER03"의 작제
대식세포 옵소닌 MFGE8로부터의 포스파티딜세린 결합 모티프 FA58C2 (서열번호 30의 아미노산 서열)를 변형된 IgG4 세포외 스페이서 도메인 (서열번호 67의 아미노산 서열) 및 공자극 분자 CD28의 막관통 도메인 (서열번호 68의 아미노산 서열), 및 MERTK의 세포질 키나제 도메인 (서열번호 43의 아미노산 서열)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER03" (FA58C2-MERTK CER) (서열번호 59의 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 75의 아미노산 서열)을 생성시켰다 (도 9A). 작제물은 GM-CSF 유래 신호 펩타이드 (서열번호 65의 아미노산 서열을 인코딩함)를 가졌다. MERTK 수용체 티로신 키나제은 포식작용의 신호를 도입시키며, MFP-E8의 2차 FA58C 반복 (C2) (본 명세서에서 FA58C2로 지칭됨)의 C-말단 도메인이 포스파티딜세린 결합에 관여하는 것으로 나타났다 (문헌[Hanayama et al., 2002, Nature, 417:182-7; Nishi et al., supra]). FA58C2-MERTK CER 뉴클레오타이드 서열을 그 후 pMSCV (쥣과동물 줄기세포 바이러스) 레트로바이러스 벡터에 삽입하였다. 초기 계대배양 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 황색 형광 단백질 (GFP)을 발현하는 pMSCV FA58C2-MERTK CER 레트로바이러스로 형질도입시켰다. 양성 Ba/F3 형질도입체를 유동 세포계측 (FACS)을 사용하여, GFP 발현에 의해 분류하고, 배양하여 확장시키고, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
1차 흉선 세포를 10 μM 덱사메타손과 함께 24시간 동안 인큐베이션하여, 세포 사멸을 유도하였다. 흉선 세포를 그 후 PBS 중 1 μM의 pHrodo 레드 염료로 실온에서 15분 동안 표지하고, 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지로 2회 세척하고, 식작용 분석의 표적 세포로 사용하였다. 50 μl의 pHrodo 레드-표지된 흉선 세포 (106/mL)를 50 μl의 FA58C2-MERTK 분류 Ba/F3 B-세포 (105/mL) (10:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율)와 함께 인큐베이션하였다. pHrodo 레드로 표적 세포를 표지함으로써, 산성 리소좀 환경에서 그의 증가된 빛 방출로 인해, 리소좀에 포식작용되어, 운반되는 세포를 시각화할 수 있다 (문헌[Miksa et al., supra]). 공동 배양 실험을 수행하고, 2시간, 24시간, 48시간 및 72시간째에 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 Ba/F3 GFP+ 세포를 식작용에 대해 연속적으로 정량화하였다. Tim4 및 GFP (비-포식작용 수용체)를 발현하는 pMSCV 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
아폽토시스 흉선 세포의 FA58C2-MERTK CER-매개 포식작용을 첫 번째로 조사하였다 (도 9b 내지 도 9f). 쥣과동물 Ba/F3 B-세포에서 FA58C2-MERTK CER의 발현은 포스파티딜세린 양성 (PtdSer+) 흉선 세포의 식작용 흡수를 강력하게 증대시켰다 (도 9b 내지 도 9f). 형광 현미경 검사 및 FACS에 의한 관찰 결과, 식작용의 양은 표적 세포와의 인큐베이션 시간뿐만 아니라, FA58C2-MERTK CER 발현의 양과 상관관계가 있는 것으로 관찰된다 (도 9B-9C). 공동 인큐베이션 2시간 후, 대조군에서의 0%와 비교하여, 11%의 FA58C2-MERTK CER 형질도입된 Ba/F3 세포가 포식작용하였다 (도 9B). FA58C2-MERTK CER을 발현하는 식작용 Ba/F3 세포의 수는 24시간 인큐베이션 시간째에 48%로 증가하였다 (도 9b 내지 도 9f). 추가로, 최대량의 FA58C2-MERTK CER을 발현한 Ba/F3 세포가 최대량의 식작용을 나타내었고 (도 9C), 이는 FA58C2-MERTK CER의 농도 의존적 효과를 시사한다.
FA58C2-MerTk 포식작용에 대한 작은 GTPase의 효과
CER-발현 Ba/F3 세포에 의한 포식작용에 대한 작은 GTPase Rac1 및/또는 Rab5a의 첨가의 효과를 시험하였다. Rho 및 Rab 계열 GTPase는 대식세포 및 미성숙 수지상 세포에 의한 아폽토시스 세포의 포식작용을 조절한다. 세포를 포식작용하는 식작용 컵을 형성하기 위해, 대식세포에 의해 발현되는 인테그린 수용체는 Rho 계열의 GTPase의 Rac1을 활성화시켜, 액틴 중합을 유도한다 (문헌[Albert et al., 2000, Nat. Cell Biol. 2:899-905]). Rab 계열의 GTPase의 구성원인 Rab5는 식포와 엔도솜의 융합을 조절하며, 리소좀 생합성에서 역할을 할 수 있다 (문헌[Duclos et al., 2000, J. Cell Sci. 113:3531-41]). Rac1 (서열번호 60), Rab5 (서열번호 61), 또는 둘 모두 (서열번호 62)를 인코딩하는 cDNA 서열을 이중-시스트론 또는 삼중-시스트론 레트로바이러스 발현 카세트 (pMSCV FA58C2-MERTK-P2A-Rac1, pMSCV FA58C2-MERTK-P2A-Rab5a, 또는 pMSCV FA58C2-MERTK-P2A-Rac1-T2A-Rab5a)를 사용하여, FA58C2-MERTK를 공동 발현시켰다 (도 10a). 도 10b 내지 도 10e에서 명백한 바와 같이, Rac1의 첨가는 표적 아폽토시스 흉선 세포의 FA58C2-MERTK CER-매개 포식작용을 증가시켰다 (도 10e 대 도 9f에 도시된 바와 같이, 56% 대 48%). 추가로, 포식리소좀으로의 포식된 흉선 세포의 전달을 관찰하였다. 형광 현미경 검사에 의한 관찰 결과, 대부분의 FA58C2-MERTK CER/Rac1-발현 Ba/F3 B-세포 내부에 존재하는 수개의 pHrodo 레드-양성 세포이 관찰된다 (도 10c).
실시예 6
FA58C2-Syk CER "CER04"의 작제
GM-CSF 유래 신호 펩타이드에 융합된 대식세포 옵소닌 MFGE8로부터의 포스파티딜세린 결합 모티프 FA58C2를 변형된 IgG4 세포외 스페이서 도메인, 공자극 분자 CD28의 막관통 도메인, 및 Syk 키나제 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER04" (FA58C2-Syk CER) (서열번호 63의 폴리뉴클레오타이드 서열, 서열번호 70의 아미노산 서열, 도 11a)를 생성시켰다. 군집되어 있는 Syk 티로신 키나제 도메인은 COS 세포에서 식작용을 촉발한다 (문헌[Greenberg et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1103-7]). FA58C2-Syk CER 뉴클레오타이드 서열을 그 후 pMSCV (쥣과동물 줄기세포 바이러스) 레트로바이러스 벡터에 삽입하였다. 초기 계대배양 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 GFP 형광 단백질을 발현하는 pMSCV FA58C2-Syk 레트로바이러스로 형질도입시켰다. 양성 Ba/F3 형질도입체를 유동 세포계측 (FACS)을 사용하여, GFP 발현에 의해 분류하고, 배양하여 확장시키고, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 4에 기재된 바와 같이, 1차 흉선 세포를 아폽토시스에 도입하고, pHrodo 레드 염료로 표지하였다. 공동 배양 실험을 수행하고, Ba/F3 GFP + 세포를 식작용에 대해 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 연속적으로 정량화하였다. Tim4 및 GFP (비-포식작용 수용체)를 발현하는 pMSCV 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
아폽토시스 흉선 세포의 FA58C2-Syk CER-매개 포식작용을 조사하였다 (도 11a 내지 도 11e). 쥣과동물 Ba/F3 B-세포주에서 FA58C2-Syk CER의 발현은 포스파티딜세린 양성 (PtdSer+) 흉선 세포의 식작용 흡수를 강력하게 증대시켰다 (도 11B-11E). 형광 현미경 검사 및 FACS에 의한 관찰 결과, 식작용의 양은 표적 세포 인큐베이션 시간뿐만 아니라, FA58C2-Syk CER 발현의 양과 상관관계가 있는 것으로 관찰된다. 공동 인큐베이션 2시간 후, 대조군에서의 0%와 비교하여, 9.5%의 FA58C2-Syk CER-형질도입된 Ba/F3 세포 표적 아폽토시스 흉선 세포를 포식작용하였다 (도 11b). FA58C2-Syk CER을 발현하는 식작용 Ba/F3 세포의 수는 인큐베이션 24시간째에 48%로 증가하였다 (도 11b, 도 11c, 및 도 11e). 추가로, 최대량의 FA58C2-Syk CER을 발현한 Ba/F3 세포가 최대량의 식작용을 나타내었으며 (도 11c), FA58C2-Syk CER의 농도 의존적 효과를 시사한다.
FA58C2-Syk 포식작용에 대한 작은 GTPase Rab5의 효과
Ba/F3 세포에 의한 포식작용에 대한 작은 GTPase Rac1 및/또는 Rab5a의 첨가의 효과를 조사하였다. Rac1 (서열번호 60) 및/또는 Rab5 (서열번호 61), 또는 둘 모두 (서열번호 62)를 인코딩하는 cDNA 서열을 이중-시스트론 또는 삼중-시스트론 레트로바이러스 발현 카세트 (pMSCV FA58C2-Syk-P2A-Rac1, pMSCV FA58C2-Syk-P2A-Rab5a, 및 pMSCV FA58C2-Syk-P2A-Rac1-T2A-Rab5a 작제물)를 사용하여, FA58C2-Syk CER과 공동 발현시켰다 (도 11a, 도 12a). 도 11b 및 도 11c에서 명백한 바와 같이, Rac1의 첨가는 FA58C2-Syk CER-매개 포식작용 또는 표적 아폽토시스 흉선 세포를 증가시켰다. 추가로, Rab5의 첨가가 또한 식작용을 증가시켰다 (도 12b 내지 도 12d).
실시예 7
CD19-MERTK CER "CER40"의 작제
FMC63 마우스 IgG2a 마우스 단일클론 항체로부터 유래하고, GM-CSF 유래 신호 펩타이드 (서열번호 65의 아미노산 서열을 인코딩함)에 융합된 항-CD19 단일 사슬 단편 가변 (scFv) (서열번호 66의 아미노산 서열을 인코딩함)을 변형된 IgG4 세포외 스페이서 도메인 (서열번호 67의 아미노산 서열을 인코딩함), 공자극 분자 CD28의 막관통 도메인 (서열번호 68의 아미노산 서열을 인코딩함), 및 MERTK의 세포내 키나제 도메인 (서열번호 43의 아미노산 서열)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER40" (CD19-MERTK CER) (서열번호 64의 아미노산 서열을 가짐) (도 13a)을 생성시켰다 (문헌[Kochenderfer et al., 2009, J. Immunother. 32:689-702]). 포식작용을 증대시키기 위해, CD19-MERTK CER 및 Rac1을 포함하는 이중-시스트론 레트로바이러스 발현 작제물을 작제하였다 (도 13b). CD19-MERTK CER 뉴클레오타이드 서열을 그 후 pMSCV (쥣과동물 줄기세포 바이러스) 레트로바이러스 벡터에 삽입하였다. 초기 계대배양 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 pMSCV CD19-MERTK CER 레트로바이러스 발현 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형질도입시켰다. 양성 Ba/F3 형질도입체를 유동 세포계측 (FACS)을 사용하여, GFP 발현에 의해 분류하고, 배양하여 확장시키고, 시험관내 연구에 사용하였다.
인간 림프종 세포주에 대한 식작용 활성
실시예 4에 기재된 바와 같이, CD19+인 Raji 인간 Burkitt B-세포 림프종 세포를 1 μM의 pHrodo 레드 염료로 표지하고, 식작용 분석의 표적 세포로 사용하였다. 실시예 4에 기재된 바와 같이, 공동 배양 실험을 수행하고, Ba/F3 GFP + 세포를 식작용에 대해 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 연속적으로 정량화하였다. Tim4 및 GFP (비-포식작용 수용체)를 발현하는 pMSCV 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포 및 비-형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
Raji Burkitt B-세포 림프종 세포의 CD19-MERTK CER-매개 포식작용을 첫 번째로 조사하였다 (도 13C-13F). 쥣과동물 Ba/F3 B-세포에서 CD19-MERTK CER의 발현은 주 Raji 림프종 세포의 식작용 흡수를 강력하게 증대시켰다 (도 13c 내지 도 13g). 형광 현미경 검사 및 FACS에 의한 관찰 결과, 식작용의 양은 표적 세포 인큐베이션 시간뿐만 아니라, CD19-MERTK CER 발현의 양과 상관관계가 있는 것으로 나타난다. 공동 인큐베이션 24시간 후, 대조군에서의 0%와 비교하여, 17%의 CD19-MERTK-P2A-Rac1 CER 형질도입된 Ba/F3 세포 Raji Burkitt B-세포 림프종 세포를 포식작용하였다 (도 13c, 도 13g). 최대량의 CD19-MERTK CER을 발현한 Ba/F3 세포가 최대량의 식작용을 나타내었고 (도 13d), 이는 CD19-MERTK CER의 농도 의존적 효과를 시사한다.
포식리소좀으로의 포식된 Raji 세포의 전달을 촉진하는 CD19-MERTK CER의 능력을 조사하였다. 형광 현미경 검사에 의해, pHrodo 레드-양성인 전체 Raji 세포가 CD19-MERTK CER + Rac1-발현 Ba/F3 세포 내부에 존재하는 것으로 나타났다 (도 13e). 도 13h는 CD19-MERTK CER 발현 Ba/F3 세포에 의한 Raji 세포의 포식작용을 도시한다 (백색 화살표는 식작용을 나타냄). 이러한 결과에 의해, CD19-특이적 방식으로 표적을 제거하는 CD19-MerTk CER-발현의 능력이 입증된다.
실시예 8
TIM4-MERTK CER "CER01"의 작제
실시예 4에 기재된 바와 같이, 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 CER01을 인코딩하는 Tim-4-MERTK 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 및 10 ng/mL 쥣과동물 IL-3 (Peprotech 카탈로그 # 213-13)이 보충된 RMPI 1640 배지 중 12 웰 플레이트에서 0.5 x 106 세포/ml의 밀도로 배양하였다. Ba/F3 세포를 형질도입시키기 위해, Tim4-MERTK (CER01) 및 형질도입 마커로서 절두된 EGFR (또한 tEGFR 또는 EGFRt로 지칭됨)을 발현하는 100 μl의 pLenti 렌티바이러스 벡터 (도 16 참조) 및 5 μl TRANSDUX™ 형질도입 시약을 0.5 ml 완전 세포 성장 배지 중에서 희석하고, Ba/F3 세포에 첨가하였다. Ba/F3 세포를 그 후 사전 가온된 원심분리기에서 32℃에서 1시간 동안 270 x g rpm으로 원심분리하였다. Ba/F3 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. Ba/F3 세포를 또 다른 48시간 동안 완전 세포 성장 배지에서 확장시켰다. 양성 Ba/F3 세포 형질도입체를 표지된 Tim4 특이적 항체 (Kat5-18, Abcam 카탈로그 # 176486) 또는 표지된 EGFR-특이적 항체 (세틱수맙 (Cetixumab))로 염색함으로써, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) (Sony Sorter SH800)를 사용하여, 분류하였다 (도 17a 및 도 17b 참조). 분류 후, Tim4-MERTK-T2A-절두된 EGFR 포함 렌티바이러스를 포함하는 것으로, 정제되고, 형질도입된 Ba/F3 세포 (도 17c 참조)를 식작용 분석에 사용하기 전에 48시간 동안 방치하였다. 양성 염색의 세포 백분율이 각각의 히스토그램에 표시되어 있다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
식작용 분석 1일 전에, 1차 흉선 세포를 C3H 마우스 (Charles River Laboratories International, Inc.)로부터 단리하였다. 흉선 세포를 6 웰 플레이트에서 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 완전 RPMI 1640 성장 배지 중에서 배양하였다. 아폽토시스 및 세포 표면 상의 포스파티딜세린 발현을 유도하기 위해, 흉선 세포를 1 μM 덱사메탄손으로 24시간 동안 처리하였다. 비 처리된 흉선 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 흉선 세포를 6 웰 플레이트로부터 수집하고, 멸균 1X PBS로 1회 세척한 후, PBS 중 1 ng/μl pH 감응성 pHrodo™ Red 염료 (ThermoFisher Scientific, 카탈로그 #P36600) 실온에서 15분 동안 염색하였다. 세포를 그 후 성장 배지로 보충하고, 1회 초과하게 세척하여, 임의의 과량의 pHrodo 레드를 제거하였다. pHrodo 레드 염색된 흉선 세포를 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에서 RMPI 1640 완전 배지 중에 250,000 세포/웰로 플레이팅하였다.
상기에 기재된 바와 같이, 제조된 Ba/F3 CER01+ tEGFR+ 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, PBS 중 1μM CELLTRACE™ 바이올렛 염료 (ThermoFisher Scientific, 카탈로그 #C34557)로 37℃에서 10분 동안 염색하였다. 염색된 형질도입된 Ba/F3 세포에 성장 배지를 보충하고, 1X PBS로 1회 세척하여, 과량의 CELLTRACE™ 바이올렛을 제거하고, 동일한 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에 대략 25,000 세포/웰로 RPMI 1640 완전 배지 중에 플레이팅하였다.
표적 흉선 세포를 염색된 Ba/F3 CER01+ tEGFR+ 세포로 10:1 (표적 세포:효과기 세포)의 비율로 3시간 동안 또는 밤새 (약 14시간) 37℃에서 공동 배양하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리하고, 배지를 pH 9의 2% 소 태아 혈청이 보충된 PBS로 교체하였다. 96 웰 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 KEYENCE BZ-X710 형광 현미경을 사용하여, 관찰하였다. 2회 반복 실험용 96-웰 공동 배양 플레이트를 또한 유동 세포계측에 의한 분석을 위해, 병행하여, 설치하였다. 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD) 염료를 세포 생존 염료로 사용하고, pHrodo 레드로 표적 흉선 세포를 염색하고, CELLTRACE 바이올렛으로 효과기 세포를 염색하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 형광 현미경 검사는 절두된 EGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포 (도 18a 참조)와 비교하여, CER01+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰되었다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 18b 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 18b의 하단 우측에 제시되어 있다.
FACS에 의해 측정된 바와 같은 Ba/F3 효과기 세포의 양이 도 19a에 도시되어 있다. FACS에 의해 측정된 바와 같이, 식작용을 pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 19b 참조).
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 20a 및 도 20b 참조).
쥣과동물 세포주에 대한 식작용 활성
식작용 분석 1일 전에, CT26 쥣과동물 결장 암종 세포를 6 웰 플레이트에서 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 완전 RPMI 1640 성장 배지 중에서 배양하고, 1 mM 스타우로스포린 (STS)으로 12시간 동안 처리하여, 아폽토시스를 유도하였다. 비 처리된 CT26 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
식작용 분석 당일, CT26 세포를 수집하고, 1X PBS로 2회 세척하고, 과량의 스타우로스포린을 제거한 후, PBS 중 1 ng/μl pHrodo 레드로 실온에서 15분 동안 염색하였다. CT26 세포에 성장 배지를 보충하고, 1회 세척하여, 과량의 pHrodo 레드를 제거하고, 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에 250,000 세포/웰로 RPMI 1640 완전 배지 중에 플레이팅하였다.
상기에 기재된 바와 같이, 제조된 Ba/F3 CER01+ EGFR+ 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, PBS 중 1μM CELLTRACE™ 바이올렛 염료 (ThermoFisher Scientific, 카탈로그 #C34557)로 37℃에서 10분 동안 염색하였다. 염색된 형질도입된 Ba/F3 세포에 성장 배지를 보충하고, 1X PBS로 1회 세척하여, 과량의 CELLTRACE™ 바이올렛을 제거하고, 동일한 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에 대략 50,000 세포/웰로 RPMI 1640 완전 배지 중에 플레이팅하였다.
표적 CT26 세포를 염색된 CER01+ tEGFR+ 세포로 5:1 (표적 세포:효과기 세포)의 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리하고, 배지를 pH 9의 2% 소 태아 혈청이 보충된 PBS로 교체하였다. 96 웰 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 KEYENCE BZ-X710 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는 형광 현미경 사진이 도 21에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). pHrodo 레드로 표지된 CT26 세포는 포식작용된 경우, 리소좀의 저 pH 구획 내에서 형광 표지되었다 (분홍색으로 윤곽 표시됨).
CELLTRACE 바이올렛 염색 영역 내의 pHrodo 레드의 형광을 검출하는 혼성체 포획 알고리즘을 형광 이미지에 적용하여, 포식작용된 표적 세포의 영역/CER+ B 세포의 영역을 정량화하였다. 도 22는 CER01+ EGFR+ (도 22a) 또는 EGFR+ 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포 (도 22b) 내의 CT26 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 히스토그램 플롯을 도시한다. 도 23은 CER01+ EGFR+ 또는 EGFR+ 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포 내의 CT26 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 산포도를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 CT26 세포의 공동 위치화 영역을 나타낸다. CER01+ EGFR+ 또는 EGFR+ 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포의 식작용 빈도가 도 24a에 도시되어 있다. EGFRt 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER01+ Ba/F3 세포의 식작용 지수가 도 24b에 도시되어 있다.
상기에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER01+ EGFR+ 세포를 형질도입시키고, 정제하고, 확장시켜, CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. CT26 세포에 의한 식작용 분석을 위해, 상기에 기재된 바와 같이, A20 쥣과동물 B 세포 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하고, 염색된 CER01+ tEGFR+ 세포와 5:1 (표적 세포:효과기 세포)의 비율로 공동 배양하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. CT26 세포에 의한 분석에서 상기에 기재된 혼성체 포획 알고리즘을 사용하여, 식작용 현상을 형광 현미경 검사 (KEYENCE BZ-X710 형광 현미경, 20X 대물렌즈 배율)에 의해 정량화하였다.
시험관내 식작용을 보여주는, 표적 A20 세포의 형광 현미경 이미지가 도 25에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). 도 26은 CER01+ EGFR+ (도 26A) 또는 EGFR+ 대조군 (도 26B)으로 형질도입된 Ba/F3 세포 내의 A20 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 히스토그램 플롯을 도시한다. 도 27은 CER01+ EGFR+ 또는 EGFR+ 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포 내의 A20 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 산포도를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 A20 세포의 공동 위치화 영역을 나타낸다. EGFRt 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER01+ Ba/F3 세포의 식작용 지수가 도 28에 도시되어 있다.
CT26 세포의 분석에서 상기에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER01+ EGFR+ 세포를 또한 스타우로스포린 처리된 WR19L 쥣과동물 T 세포 림프종 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율 및 3시간의 공동 인큐베이션 시간을 사용하여, 공동 배양하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 상기에 기재된 바와 같이, CER01+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 식작용을 형광 현미경 검사에 의해 정량화하였다. 시험관내 식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지가 도 29에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). 도 30은 CER01+ EGFR+ (+ 또는-스타우로스포린 (STS)) 또는 EGFR+ 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포 식작용 빈도를 도시한다.
인간 세포주에 대한 인간 CER01+ B 세포의 식작용 활성
형질도입된 인간 B 세포를 표지된 항-EGFR 항체 (세툭시맙)에 의한 FACS로 분류한 후, Kat5-18 항체 (Tim4 특이적) (Abcam 카탈로그 # 176486)로 염색하는 것을 제외하고, Ba/F3 세포에 대해 상기에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-MERTK (CER01) 렌티바이러스로 형질도입시켰다 (도 31a 참조, 우측 FACS 그래프의 %는 Tim4 결합 도메인 (CER01)을 발현하는 세포의 %를 나타냄). 정제된 CER01+ B 세포를 확장시키고, 24시간, 48시간, 및 72시간째의 이미지를 도 31b에 도시하였다.
식작용 분석을 시작하기 1일 전에, Jurkat 인간 B 림프구를 6 웰 플레이트에서 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 완전 RPMI 1640 성장 배지 중에서 배양하고, 1mM 스타우로스포린으로 3시간 동안 처리하여, 아폽토시스를 유도하였다. Jurkat 세포를 1X PBS로 2회 세척하여, 과량의 스타우로스포린을 제거한 후, PBS 중 pHrodo 레드 (1 ng/μl)로 실온에서 15분 동안 염색하였다. Jurkat 세포에 성장 배지를 보충하고, 1회 세척하여, 과량의 pHrodo 레드를 제거하고, 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에 대략 250,000 세포/웰로 RPMI 1640 완전 배지 중에 플레이팅하였다.
형질도입된 인간 1차 B 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, PBS 중 1 μM CELLTRACE 바이올렛으로 37℃에서 10분 동안 염색하였다. 인간 1차 B 세포에 성장 배지를 보충하고, 1X PBS로 1회 세척하여, 과량의 CELLTRACE 바이올렛을 제거하고, 96 웰 플레이트에 대략 50,000 세포/웰로 RPMI 1640 완전 배지 플레이팅하였다. 인간 1차 B 세포 및 Jurkat 세포를 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 인큐베이션 후, 공동 배양 플레이트를 그 후 원심분리하고, 배지를 pH 9의 2% 소 태아 혈청이 보충된 PBS로 교체하였다. 식작용 현상을 형광 현미경 검사 (KEYENCE BZ-X710 형광 현미경, 20X 대물렌즈 배율)에 의해 정량화하였다. 시험관내 식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지가 CER01+ B 세포의 경우 도 32a에, EGFR+ 대조군의 경우 도 32b에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
2회 반복 실험용 96-웰 공동 배양 플레이트를 또한 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율을 사용하여, 유동 세포계측에 의한 분석을 위해, 병행하여 설정하였다 (대략 300,000 세포/웰 pHrodo 레드 표지된 스타우로스포린 처리된 Jurkat 세포와 대략 30,000 세포/웰 CER01+ 형질도입된 인간 1차 B 세포의 공동 배양). 공동 배양 플레이트를 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 인간 1차 B 세포를 염색시키기 위해, 알로피코시아닌 (APC) 표지된 CD19 항체의 1:50 희석액을 포함하는 FACS 완충액 (PBS + 2% 소 태아 혈청)으로 배지를 교체하였다. 인간 1차 B 세포를 APC 표지된 CD19 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 1회 세척하고, 세포 배양 플레이트를 세포 생존의 마커로 사용되는 DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌)를 포함하는 FACS 완충액으로 보충하였다. FACS 분석 동안, 살아 있는 CD19-APC 양성 세포에 대해 게이팅을 수행하고 (도 33 좌측 FACS 플롯 참조), CD19 양성-pHrodo 레드 양성 현상 (이중 양성 현상)의 빈도에 대해 평가하고, 이를 식작용 현상으로 규정하였다 (도 33 우측 FACS 플롯 참조). 도 34는 CER01+ EGFR+ 또는 EGFR+ 대조군으로 형질도입된 B 세포에 의한 Jurkat 세포 식작용의 빈도를 도시한다.
화학요법-처리된 인간 세포주에 대한 인간 CER01 + B 세포의 식작용 활성
상기에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-MERTK (CER01) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 식작용 분석을 시작하기 1일 전에, Jurkat 인간 B 림프구 세포를 6 웰 플레이트에서 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 완전 RPMI 1640 성장 배지 중에서 배양하고, 옥살리플라틴 (5 μM) 및 플루오로우라실 (5-FU) (10 μM)로 처리하였다. 다음 날, 표적 Jurkat 세포를 수집하고, 1X PBX로 2회 세척하고, pHrodo 레드 (PBS 중 1 ng/mL)로 실온에서 15분 동안 염색하였다. Jurkat 세포에 성장 배지를 보충하고, 1회 세척하여, 과량의 pHrodo 레드를 제거하고, 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에 대략 200,000 세포/웰로 RPMI 1640 완전 배지 중에 플레이팅하였다. 형질도입된 인간 1차 B 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, 그 후 CELLTRACE 바이올렛 (PBS 중 1 mM)으로 37℃에서 10분 동안 염색하였다. 인간 1차 B 세포에 성장 배지를 보충하고, 1X PBS로 1회 세척하여, 과량의 CELLTRACE 바이올렛을 제거하고, 96 웰 플레이트에 대략 50,000개의 세포로 RPMI 완전 배지 중에 플레이팅하였다. 인간 1차 B 세포 및 Jurkat 세포를 4:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 Keyence BZ-X710 현미경을 사용하여 촬영하였다. 도 35는 CER01+ 인간 1차 B 세포에 의한 화학요법 처리된 Jurkat 세포의 포식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지를 도시한다 (우측 이미지는 확대된 식작용 현상을 보여주며; 백색 화살표는 식작용을 나타냄).
실시예 9
TIM4-TYRO3 CER "CER08"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열) (서열번호 57의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함께 가짐)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 Tyro3 (서열번호 45)의 세포내 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER08" (서열번호 83의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-Tyro3 CER)을 생성시켰다. Tyro3 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-Tyro3 (CER08) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 36 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-Tyro3 (CER08) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER08+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER08+ tEGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER08+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 37a에 도시되어 있다. 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 37b 참조).
형광 현미경 검사에 의해 tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER08+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 38 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 38의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 39a 및 도 39b 참조).
실시예 10
TIM4-DAP12 CER "CER09"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열) (서열번호 57의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함께 가짐)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 DAP12의 세포내 신호전달 도메인 (서열번호 82)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER09" (서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-DAP12 CER)를 생성시켰다. DAP12은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-DAP12 (CER09) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 40 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-DAP12 (CER09) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER09+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER09+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER09+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER09+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 41a에 도시되어 있다. 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 41b 참조).
형광 현미경 검사에 의해 tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER09+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 42a 및 도 42b 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 42b의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 43a 및 도 43b 참조).
쥣과동물 세포주에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER09+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CT26 쥣과동물 결장 암종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, 공동 배양d with Ba/F3 CER09+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER09+ Ba/F3 세포에 의한 CT26 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는 CER09+ Ba/F3 세포 및 EGFRt+ 대조군 세포에 의한 형광 현미경 이미지가 도 44a 및 도 44b에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). pHrodo 레드로 표지된 CT26 세포는 포식작용된 경우, 리소좀의 저 pH 구획 내에서 형광 표지된다 (분홍색으로 윤곽 표시됨).
CELLTRACE 바이올렛 염색 영역 내의 pHrodo 레드의 형광을 검출하는 혼성체 포획 알고리즘을 형광 이미지에 적용하여, 포식작용된 표적 세포의 영역/CER+ B 세포의 영역을 정량화하였다. 도 45는 CER09+ tEGFR+ 또는 tEGFR+ 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포 내의 CT26 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 산포도를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 CT26 세포의 공동 위치화 영역을 나타낸다. EGFRt 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER09+ Ba/F3 세포의 식작용 지수가 도 46에 도시되어 있다.
실시예 8에 기재된 바와 같이, WR19L 쥣과동물 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CELLTRACE 바이올렛 표지된 Ba/F3 CER09+ EGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER09+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 식작용을 형광 현미경 검사에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. CER09+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 시험관내 식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지가 도 47에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
실시예 8에 기재된 바와 같이, A20 쥣과동물 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CELLTRACE 바이올렛 표지된 Ba/F3 CER09+ EGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER09+ Ba/F3 세포에 의한 A20 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는, CER09+ Ba/F3 세포에 의한 형광 현미경 이미지가 도 48에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
인간 세포주에 대한 인간 CER09+ B 세포의 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-DAP12 (CER09) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입된 인간 B 세포를 표지된 항-EGFR 항체 (세툭시맙)에 의해, FACS로 분류하고, 그 후 Kat5-18 항체 (Tim4 특이적) (Abcam 카탈로그 # 176486)로 염색하였다 (도 49a 참조, 우측 FACS 그래프의 %는 Tim4 결합 도메인 (CER09)을 발현하는 세포의 %를 나타냄). 정제된 CER09+ B 세포를 확장시키고, 24시간, 48시간, 및 72시간째의 이미지를 도 49b에 도시하였다.
식작용 분석에서, 실시예 8에 기재된 바와 같이, Jurkat 인간 T 림프구를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CER09+ 1차 B 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율 및 3시간의 공동 인큐베이션 시간을 사용하여, 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER09+ 인간 B 세포에 의한 Jurkat 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 살아 있는 CD19 양성 인간 1차 B 세포의 빈도 및 CD19 양성-pHrodo 레드 양성 현상의 빈도 (이중 양성 현상)가 도 50에 도시되어 있다 (각각 좌측 및 우측 플롯). 도 51은 CER09+ tEGFR+ 또는 EGFR+ 대조군으로 형질도입된 B 세포의 식작용 빈도를 도시한다.
시험관내 식작용을 보여주는, CER09+ 인간 1차 B 세포에 의한 Jurkat 세포의 형광 현미경 이미지가 도 52에 도시되어 있고 (좌측 사진), tEGFR+ 인간 1차 B 세포 대조군에 의한 Jurkat 세포의 식작용이 도 52에 도시되어 있다 (우측 사진) (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
실시예 11
TIM4-DAP12-DAP12 CER "CER10"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 DAP12 막관통 (서열번호 81) 및 세포내 신호전달 (서열번호 82)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER10" (서열번호 86의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-DAP12-DAP12 CER)을 생성시켰다. DAP12 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-DAP12-DAP12 (CER10) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 P2A 서열 (서열번호 104)에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 53 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-DAP12-DAP12 (CER10) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER10+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER10+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER10+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER10+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 54a에 도시되어 있다. 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 54b 참조).
형광 현미경 검사에 의해 tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER10+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 55a 및 도 55b 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 55b의 하단 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 56a 및 도 56b 참조).
실시예 12
TIM4-Axl CER "CER11"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 Axl 세포내 신호전달 (서열번호 44)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER11" (서열번호 87의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-Axl CER)을 생성시켰다. Axl 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-Axl (CER11) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 49 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-Axl (CER11) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER11+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER11+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER11+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER11+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 58a에 도시되어 있다. 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 58b 참조).
형광 현미경 검사에 의해, tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER11+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 59a 및 도 59b 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 59b의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 60a 및 도 60b 참조).
쥣과동물 세포주에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER11+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CT26 쥣과동물 결장 암종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, Ba/F3 CER11+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER11+ Ba/F3 세포에 의한 CT26 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는, CER11+ Ba/F3 세포 및 EGFRt+ 대조군 Ba/F3 세포에 의한 형광 현미경 이미지가 도 61a 및 도 61b에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). pHrodo 레드로 표지된 CT26 세포는 포식작용된 경우, 리소좀의 저 pH 구획 내에서 형광 표지된다 (분홍색으로 윤곽 표시됨).
CELLTRACE 바이올렛 염색 영역 내의 pHrodo 레드의 형광을 검출하는 혼성체 포획 알고리즘을 형광 이미지에 적용하여, 포식작용된 표적 세포의 영역/CER+ B 세포의 영역을 정량화하였다. 도 62는 CER11+ tEGFR+ 또는 tEGFR+ 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포 내의 CT26 표적 세포 영역을 추출한 혼성체 세포 개수의 산포도를 도시한다. 영역 비율은 Ba/F3 세포 내의 CT26 세포의 공동 위치화 영역을 나타낸다.
실시예 8에 기재된 바와 같이, WR19L 쥣과동물 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CELLTRACE 바이올렛 표지된 Ba/F3 CER11+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER11+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는, CER11+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 형광 현미경 이미지가 도 63에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER11+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 64a에 도시되어 있다. 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 64b 참조).
실시예 8에 기재된 바와 같이, A20 쥣과동물 세포 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CELLTRACE 바이올렛 표지된 Ba/F3 CER11+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER11+ Ba/F3 세포에 의한 A20 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. EGFRt 형질도입된 Ba/F3 대조군 (도 65B)와 비교하여, CER11+ Ba/F3 세포에 의한 A20 세포의 시험관내 식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지가 도 65a에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). EGFRt+ 대조군 세포와 비교하여, CER11+ Ba/F3 세포의 식작용 지수를 계산하였고, 이는 도 66에 도시되어 있다.
화학요법-처리된 인간 세포주에 대한 인간 CER11 + B 세포의 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-Axl (CER11) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 식작용 분석을 시작하기 1일 전에, Jurkat 인간 B 림프구 세포를 6 웰 플레이트에서 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 완전 RPMI 1640 성장 배지 중에서 배양하고, 옥살리플라틴 (5 μM) 및 플루오로우라실 (5-FU) (10 μM)로 처리하였다. 다음 날, 표적 Jurkat 세포를 수집하고, 1X PBX로 2회 세척하고, pHrodo 레드 (PBS 중 1 ng/mL)로 실온에서 15분 동안 염색하였다. Jurkat 세포에 성장 배지를 보충하고, 1회 세척하여, 과량의 pHrodo 레드를 제거하고, 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에 대략 200,000 세포/웰로 RPMI 1640 완전 배지 중에 플레이팅하였다. 형질도입된 인간 1차 B 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, 그 후 CELLTRACE 바이올렛 (PBS 중 1 mM)으로 37℃에서 10분 동안 염색하였다. 인간 1차 B 세포에 성장 배지를 보충하고, 1X PBS로 1회 세척하여, 과량의 CELLTRACE 바이올렛을 제거하고, 96 웰 플레이트에 대략 50,000개의 세포로 RPMI 완전 배지 중에 플레이팅하였다. 인간 1차 B 세포 및 Jurkat 세포를 4:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 Keyence BZ-X710 현미경을 사용하여 촬영하였다. 도 67은 CER11+ 인간 1차 B 세포에 의한 화학요법 처리된 Jurkat 세포의 포식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지를 도시한다 (우측 이미지는 확대된 식작용 현상을 보여주며; 백색 화살표는 식작용을 나타냄).
실시예 8에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-Axl (CER11) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 식작용 분석을 시작하기 1일 전에, Colo320 HSR 결장 암 세포를 포스파티딜세린 유도 화학요법 겜시타빈 (10 μM)과 함께 무혈청 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 처리 후, 부유 및 부착 표적 세포를 수집하고, 원심분리하고, PBS 중 pHrodo 레드 (1 ng/μL)와 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 그 후 비-부착 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 인간 CER11+ 발현 B 세포 및 Colo320HSR 세포를 4:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 Keyence BZ-X710 현미경을 사용하여 촬영하였다 (도 68 참조; 백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
실시예 8에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-Axl (CER11) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 식작용 분석을 시작하기 1일 전에, A204 횡문근육종 세포를 포스파티딜세린 유도 화학요법 파클리탁셀, 및 H1703 비-소세포 폐암 (NSCLC) 선암 암 세포를 포스파티딜세린 유도 화학요법 파클리탁셀 (30μM) + 겜시타빈 (10 μM)과 함께 무혈청 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 처리 후, 부유 및 부착 표적 세포를 수집하고, 원심분리하고, PBS 중 pHrodo 레드 (1 ng/μL)와 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 그 후 비-부착 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 인간 CER11+ 발현 B 세포 및 A204 또는 H1703 세포를 4:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 Keyence BZ-X710 현미경을 사용하여 촬영하였다 (A204 세포의 경우, 도 69 및 H1703 세포의 경우, 도 70 참조; 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
실시예 13
TIM4-FcεR1γ CER "CER12"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 FcεR1γ 세포내 신호전달 (서열번호 88)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER12" (서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-FcεR1γ CER)를 생성시켰다. FcεR1γ 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-FcεR1γ (CER12) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 71 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-FcεR1γ (CER12) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER12+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER12+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER12+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER12+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 72a에 도시되어 있다. 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 72b 참조).
형광 현미경 검사에 의해, tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER12+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 73a 및 도 73b 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 73b의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 74a 및 도 74b 참조).
쥣과동물 세포주에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, WR19L 쥣과동물 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CELLTRACE 바이올렛 표지된 Ba/F3 CER12+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER12+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. CER12+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 시험관내 식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지가 도 75에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
실시예 8에 기재된 바와 같이, A20 쥣과동물 B 세포 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CELLTRACE 바이올렛 표지된 Ba/F3 CER12+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER12+ Ba/F3 세포에 의한 A20 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는, CER12+ Ba/F3 세포에 의한 A20 세포의 형광 현미경 이미지가 도 76에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, CER12+ Ba/F3 세포의 식작용 지수를 계산하였고, 이는 도 77에 도시되어 있다.
실시예 14
TIM4-FcεR1γ-FcεR1γ CER "CER13"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 FcεR1γ 막관통 도메인 (서열번호 89의 아미노산 서열) 및 세포내 신호전달 (서열번호 88)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER13" (서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-FcεR1γ-FcεR1γ CER)을 생성시켰다. FcεR1γ 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-FcεR1γ- FcεR1γ (CER13) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 78 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-FcεR1γ-FcεR1γ (CER13) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER13+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER13+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER13+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER13+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 64a에 도시되어 있다. 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 64b 참조).
화학요법-처리된 인간 세포주에 대한 인간 CER13 + B 세포의 식작용 활성
실시예 11에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-FcεR1γ-FcεR1γ (CER13) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 식작용 분석을 시작하기 1일 전에, Colo320 HSR 결장 암 세포를 포스파티딜세린 유도 화학요법 겜시타빈 (10 μM) 및 파클리탁셀 (30 μM)과 함께 무혈청 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 처리 후, 부유 및 부착 표적 세포를 수집하고, 원심분리하고, PBS 중 pHrodo 레드 (1 ng/μL)로 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 그 후 비-부착 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 인간 CER13+ 발현 B 세포 및 Colo320HSR 세포를 4:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 Keyence BZ-X710 현미경을 사용하여 촬영하였다 (도 80, 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
실시예 11에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-FcεR1γ-FcεR1γ (CER13) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 식작용 분석을 시작하기 1일 전에, A204 횡문근육종 세포를 포스파티딜세린 유도 파클리탁셀 (30 μM) 화학요법과 함께 인큐베이션하고, H1703 비 소세포 폐암 (NSCLC) 선암 암 세포를 포스파티딜세린 유도 파클리탁셀 (30 μM) + 겜시타빈 (10 μM) 화학요법과 함께 무혈청 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 처리 후, 부유 및 부착 표적 세포를 수집하고, 원심분리하고, PBS 중 pHrodo 레드 (1 ng/μL)로 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 그 후 비-부착 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 인간 CER13+ 발현 B 세포 및 A204 또는 H1703 세포를 4:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 Keyence BZ-X710 현미경을 사용하여 촬영하였다 (A204 세포의 경우, 도 81 및 H1703 세포의 경우, 도 82 참조; 화살표는 식작용 현상을 나타낸다).
실시예 15
TIM4-MyD88t CER "CER15"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 사멸 도메인을 포함하나, TIR 도메인이 부재하는 절두된 MyD88 (MyD88t) (서열번호 78)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER15" (서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MyD88t CER)를 생성시켰다. 절두된 MyD88은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MyD88t (CER15) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 83 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MyD88t (CER15) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER15+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER15+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER15+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER15+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 84a에 도시되어 있다. 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 84b 참조).
형광 현미경 검사에 의해, tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER15+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 85a 및 도 85b 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 85b의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 86a 및 도 86b 참조).
쥣과동물 세포주에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER15+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CT26 쥣과동물 결장 암종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, Ba/F3 CER15+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER15+ Ba/F3 세포에 의한 CT26 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는, CER15+ Ba/F3 세포에 의한 CT26 세포의 형광 현미경 이미지가 도 87에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄). pHrodo 레드로 표지된 CT26 세포는 포식작용된 경우, 리소좀의 저 pH 구획 내에서 형광 표지된다 (분홍색으로 윤곽 표시됨).
실시예 8에 기재된 바와 같이, WR19L 쥣과동물 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CELLTRACE 바이올렛 표지된 Ba/F3 CER15+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER15+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는, CER15+ Ba/F3 세포에 의한 WR19L 세포의 형광 현미경 이미지가 도 88에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
실시예 8에 기재된 바와 같이, A20 쥣과동물 림프종 세포를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CELLTRACE 바이올렛 표지된 Ba/F3 CER15+ tEGFR+ 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 3시간 동안 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER15+ Ba/F3 세포에 의한 A20 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 시험관내 식작용을 보여주는, CER15+ Ba/F3 세포에 의한 A20 세포의 형광 현미경 이미지가 도 89에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
인간 세포주에 대한 인간 CER15 + B 세포의 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-MyD88t (CER15) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 형질도입된 인간 B 세포를 표지된 항-EGFR 항체 (세툭시맙)에 의해, FACS로 분류하고, 그 후 Kat5-18 항체 (Tim4 특이적) (Abcam 카탈로그 # 176486)로 염색하였다 (도 90a 참조, 우측 FACS 그래프의 %는 Tim4 결합 도메인 (CER15)을 발현하는 세포의 %를 나타냄). 정제된 CER15+ B 세포를 확장시키고, 24시간, 48시간, 및 72시간째의 이미지를 도 90b에 도시하였다.
식작용 분석에서 실시예 8에 기재된 바와 같이, Jurkat 인간 T 림프구를 스타우로스포린으로 처리하고, pHrodo 레드로 표지하고, CER15+ 1차 B 세포와 5:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율 및 3시간의 공동 인큐베이션 시간을 사용하여, 공동 배양하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, CER15+ 인간 B 세포에 의한 Jurkat 세포의 식작용을 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 정량화하였다. 살아 있는 CD19 양성 인간 1차 B 세포의 빈도 및 CD19 양성-pHrodo 레드 양성 현상의 빈도 (이중 양성 현상)이 도 91에 도시되어 있다 (각각 좌측 및 우측 플롯). 도 92는 CER15+ tEGFR+ 또는 EGFR+ 대조군으로 형질도입된 1차 인간 B 세포에 의한 Jurkat 세포의 식작용 빈도를 도시한다.
CER15+ 인간 1차 B 세포에 의한 Jurkat 세포의 시험관내 식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지가 도 93a에 도시되어 있고, tEGFR+ 인간 1차 B 세포 대조군에 의한 Jurkat 세포의 식작용은 도 93b에 도시되어 있다 (백색 화살표는 식작용 현상을 나타냄).
실시예 16
TIM4-MyD88 CER "CER16"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 사멸 도메인 및 TIR 도메인을 포함하는 MyD88 신호전달 도메인 (서열번호 53)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER16" (서열번호 80의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MyD88 CER)을 생성시켰다. MyD88은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MyD88 (CER16) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 94 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MyD88 (CER16) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
화학요법-처리된 인간 세포주에 대한 인간 CER16 + B 세포의 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 인간 1차 B 세포를 형질도입 마커로서 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti Tim4-MyD88 (CER16) 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 식작용 분석을 시작하기 1일 전에, Jurkat 인간 B 림프구 세포를 6 웰 플레이트에서 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 완전 RPMI 1640 성장 배지 중에서 배양하고, 옥살리플라틴 (5 μM) 및 플루오로우라실 (5-FU) (10 μM)로 처리하였다. 다음 날, 표적 Jurkat 세포를 수집하고, 1X PBX로 2회 세척하고, pHrodo 레드 (PBS 중 1 ng/mL)로 실온에서 15분 동안 염색하였다. Jurkat 세포에 성장 배지를 보충하고, 1회 세척하여, 과량의 pHrodo 레드를 제거하고, 평평한 바닥의 96 웰 플레이트에 대략 200,000 세포/웰로 RPMI 1640 완전 배지 중에 플레이팅하였다. 형질도입된 인간 1차 B 세포를 1X PBS로 1회 세척하고, 그 후 CELLTRACE 바이올렛 (PBS 중 1 mM)으로 37℃에서 10분 동안 염색하였다. 인간 1차 B 세포에 성장 배지를 보충하고, 1X PBS로 1회 세척하여, 과량의 CELLTRACE 바이올렛을 제거하고, 96 웰 플레이트에 대략 50,000개의 세포로 RPMI 완전 배지 중에 플레이팅하였다. 인간 1차 B 세포 및 Jurkat 세포를 4:1의 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 37℃에서 3시간 동안 공동 배양하였다. 플레이트를 그 후 20X 대물렌즈 배율의 Keyence BZ-X710 현미경을 사용하여 촬영하였다. 도 95는 CER16+ 인간 1차 B 세포에 의한 화학요법 처리된 Jurkat 세포의 포식작용을 보여주는 형광 현미경 이미지를 도시한다 (백색 화살표는 식작용을 나타냄).
실시예 17
TIM4-NFAM1 CER "CER25"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 NFAM1 신호전달 도메인 (서열번호 92)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER25" (서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-NFAM1 CER)를 생성시켰다. NFAM1 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-NFAM1 (CER25) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 96 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-NFAM1 (CER25) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER25+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER25+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER25+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER25+ 형질도입된 Ba/F3 세포가 도 97에 도시되어 있다. 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER25+ Ba/F3 세포에 의한 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 97b 참조). 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된, 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포의 이중 양성 염색 세포의 빈도가 도 97a에 도시되어 있다.
형광 현미경 검사에 의해, tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER25+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 98 참조 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 98의 우측에 제시되어 있음).
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 99 참조).
실시예 18
TIM4-MyD88t-BAFFR CER "CER85"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 절두된 MyD88 (서열번호 78)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 BAFF-R 신호전달 도메인 (서열번호 94)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER85" (서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MyD88t-BAFFR CER)를 생성시켰다. MyD88t 또는 BAFF-R 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MyD88t-BAFF4 (CER85) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 100 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MyD88t-BAFFR (CER85) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER85+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER85+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER85+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER85+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 101에 도시되어 있다. 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER+85 Ba/F3 세포에 의한 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 101a 참조). 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된, 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포의 이중 양성 염색 세포의 빈도가 도 101b에 도시되어 있다.
형광 현미경 검사에 의해 tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER85+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 102 참조, 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 102의 우측에 제시되어 있음).
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 103 참조).
실시예 19
TIM4-MyD88t-DAP12 CER "CER86"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 절두된 MyD88 (서열번호 78)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 DAP12 신호전달 도메인 (서열번호 82)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER86" (서열번호 96의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MyD88t-DAP12 CER)을 생성시켰다. MyD88t 또는 DAP12 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MyD88t-DAP (CER86) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 104 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MyD88t-DAP12 (CER86) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 20
TIM4-BAFFR-MYD88 CER "CER87"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 BAFF-R 신호전달 도메인 (서열번호 94)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인 (서열번호 78)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER87" (서열번호 130의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-BAFFR-MyD88 CER)을 생성시켰다. BAFF-R 또는 절두된 MyD88 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-BAFFR-MyD88 (CER87) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 105 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-BAFFR-MyD88 (CER87) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER87+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER87+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER87+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER87+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 106에 도시되어 있다. 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER87+ Ba/Fe 세포에 의한 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 106b 참조). 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된, 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포의 이중 양성 염색 세포의 빈도가 도 106a에 도시되어 있다.
형광 현미경 검사에 의해, tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER87+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 107 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 107의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 108 참조).
실시예 21
TIM4-DAP12-MYD88 CER "CER88"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 DAP12 신호전달 도메인 (서열번호 82)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인 (서열번호 78)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER88" (서열번호 131의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-DAP12-tMyD88 CER)을 생성시켰다. DAP12 또는 절두된 MyD88 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-DAP12-MyD88 (CER88) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 109 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-DAP12-MyD88 (CER88) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 22
TIM4-MYD88t-CD79b CER "CER89"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 절두된 MyD88 신호전달 도메인 (서열번호 78)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 CD79b 신호전달 도메인 (서열번호 97)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER89" (서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MyD88t-CD79b CER)를 생성시켰다. MyD88t 또는 CD79b 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MyD88t-CD79b (CER89) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 110 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MyD88t-CD79b (CER89) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 23
TIM4-MYD88t-NFAM1 CER "CER90"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 절두된 MyD88 신호전달 도메인 (서열번호 78)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 NFAM1 신호전달 도메인 (서열번호 92)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER90" (서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MyD88t-NFAM1 CER)을 생성시켰다. MyD88t 또는 NFAM1 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MyD88t-NFAM1 (CER90) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 111 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MyD88t-NFAM1 (CER90) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 24
TIM4-MYD88t-P2A-RAB5A CER "CER91"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을절두된 MyD88 신호전달 도메인 (서열번호 78)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER15"를 생성시켰다. MyD88t 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MyD88t (CER15) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 각각 P2A 서열 및 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 Rab5a 및 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 112 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MyD88t-Rab5a (CER91, 서열번호 105) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER91+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER91+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER91+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER91+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 113에 도시되어 있다. 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER91+ Ba/F3 세포에 의한 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 113a 참조). 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된, 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포의 이중 양성 염색 세포의 빈도가 도 113b에 도시되어 있다.
형광 현미경 검사에 의해, tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER91+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 114 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 114의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 115 참조).
실시예 25
TIM4-MERTK-MYD88 CER "CER92"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 MERTK 신호전달 도메인 (서열번호 69)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인 (서열번호 78)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER92" (서열번호 133의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MERTK-tMyD88 CER)를 생성시켰다. MERTK 또는 절두된 MyD88 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MERTK-tMyD88t (CER92) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 116 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MERTK-tMyD88 (CER92) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER92+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER92+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER92+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER92+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 117에 도시되어 있다. CER92+ Ba/F3 세포에 의한 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 117a 참조). 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된, 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포의 이중 양성 염색 세포의 빈도가 도 117b에 도시되어 있다.
형광 현미경 검사에 의해, tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER92+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 118 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 118의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 119 참조).
실시예 26
TIM4-MERTK-BAFFR CER "CER93"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 MERTK 신호전달 도메인 (서열번호 43의 아미노산 서열)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 BAFF-R (서열번호 94의 아미노산 서열)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER93" (서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MERTK-BAFFR CER)을 생성시켰다. MERTK 또는 BAFF-R 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MERTK-BAFFR (CER93) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 120 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MERTK-BAFFR (CER93) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
1차 아폽토시스 흉선 세포에 대한 식작용 활성
실시예 8에 기재된 바와 같이, 1차 C3H 마우스 흉선 세포를 단리하고, 덱사메타손으로 처리하고, pHrodo 레드로 염색하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER93+ tEGFR+ 세포를 CELLTRACE™ 바이올렛 염료로 표지하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, Ba/F3 CER93+ tEGFR+ 세포 및 1차 흉선 세포에 의한 공동 배양 실험을 10:1 표적 세포 대 효과기 세포 비율로 수행하고, Ba/F3 CER92+ EGFR+ 세포를 형광 현미경 검사 및 FACS에 의해 표적 흉선 세포의 식작용에 대해 정량화하였다. 절두된 EGFR을 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입된 Ba/F3 세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
FACS에 의해 정량화된 바와 같이, 살아 있는 CER93+ 형질도입된 Ba/F3 세포의 양이 도 121에 도시되어 있다. 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된 CER93+ Ba/F3 세포에 의한 식작용 빈도를 FACS에 의해 검출되는 바와 같이, pHrodo 레드 및 CELLTRACE 바이올렛에 대해 이중 양성 염색된 세포 집합으로서 정량화하였다 (도 121a 참조). 덱사메타손 처리된 흉선 세포와 공동 배양된, 절두된 EGFR로 형질도입된 대조군 Ba/F3 세포의 이중 양성 염색 세포의 빈도가 도 121b에 도시되어 있다.
형광 현미경 검사에 의해, tEGFR 형질도입된 Ba/F3 대조군 세포와 비교하여, CER93+ Ba/F3 세포가 덱사메타손-처리된 흉선 세포를 포식작용한 것으로 관찰된다 (백색 화살표는 포식작용 현상을 나타냄) (도 122 참조). 포식작용 현상의 고 배율 사진이 도 122의 우측에 제시되어 있다.
EGFRt 형질도입된 Ba/F3대조군 세포와 비교하여, [포식작용된 표적 세포의 총 수의 평균/계수된 CER 변형된 세포의 총 수 (예를 들어, 식작용 빈도)] x [CER+ Ba/F3 세포당 표적 세포 염색의 평균 영역 x 100 (예를 들어, 혼성체 포획)]에 의해 식작용 지수를 계산하였다 (도 123 참조).
실시예 27
TIM4-MERTK-DAP12 CER "CER94"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 MERTK 신호전달 도메인 (서열번호 43의 아미노산 서열)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 DAP12 신호전달 도메인 (서열번호 82의 아미노산 서열)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER94" (서열번호 134의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MERTK-DAP12 CER)를 생성시켰다. MERTK 또는 DAP12 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MERTK-DAP12 (CER94) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 124 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MERTK-DAP12 (CER94) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 28
TIM4-AXL-DAP12 CER "CER97"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 Axl 신호전달 도메인 (서열번호 44)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 DAP12 신호전달 도메인 (서열번호 82)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER97" (서열번호 152의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-AXL-DAP12 CER)을 생성시켰다. AXL 또는 DAP12 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-AXL-DAP12 (CER97) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 125 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-AXL-DAP12 (CER97) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 29
TIM4-AXL-CD79b CER "CER98"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 Axl 신호전달 도메인 (서열번호 44의 아미노산 서열)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 CD79b 신호전달 도메인 (서열번호 97의 아미노산 서열)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER98" (서열번호 153의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-AXL-CD79b CER)을 생성시켰다. Axl 또는 CD79b 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-AXL-CD79B (CER98) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 126 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-AXL-CD79b (CER98) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 30
TIM4-MERTK-CD79b CER "CER95"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 MERTK 신호전달 도메인 (서열번호 43의 아미노산 서열)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 CD79b 신호전달 도메인 (서열번호 97의 아미노산 서열)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER95" (서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MERTK-CD79b CER)를 생성시켰다. MERTK 또는 CD79b 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MERTK-CD79b (CER95) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 127 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MERTK-CD79b (CER95) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 31
TIM4-MERTK-NFAM1 CER "CER96"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 72의 아미노산 서열) 및 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열)을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4 (서열번호 73의 아미노산 서열)의 세포외 도메인을 MERTK 신호전달 도메인 (서열번호 43)을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 NFAM1 신호전달 도메인 (서열번호 99)을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER96" (서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 Tim4-MERTK-NFAM1 CER)을 생성시켰다. MERTK 또는 NFAM1 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키고, Tim4는 포스파티딜세린 결합 수용체이다. Tim4-MERTK-NFAM1 (CER96) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다 (도 128 참조). 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 Tim4-MERTK-NFAM1 (CER96) 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
신호 펩타이드 및 막관통 도메인을 포함하는 포스파티딜세린 결합 단백질 Tim4의 세포외 도메인을 MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 1차 신호전달 도메인 및 절두된 NFAM1 신호전달 도메인을 포함하는 2차 신호전달 도메인에 융합시켜, 서열번호 116의 아미노산 서열을 갖는 키메라 포식작용 수용체 CER96t를 생성시킴으로써, CER96의 변이체를 작제하였다.
실시예 32
M912scFv-IgG4-Tim4-MyD88t CER "CER50"의 작제
신호 펩타이드 (서열번호 85의 아미노산 서열)을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 메소텔린 특이적 인간 단일클론 항체 M912 (문헌[Feng et al., 2009, Mol. Cancer Ther. 8:1113-1118]) (서열번호 106의 아미노산 서열)로부터 유래된 scFv를 변형된 IgG4 힌지 영역 세포외 스페이서 도메인 (서열번호 67), Tim4 막관통 도메인 (서열번호 74의 아미노산 서열) 및 절두된 MyD88 신호전달 도메인 (서열번호 69)에 융합시켜, 키메라 포식작용 수용체 "CER50" (서열번호 107의 아미노산 서열을 갖는 M912scFv-IgG4-Tim4-MyD88t CER)을 생성시켰다. MyD88t 신호전달 도메인은 포식작용의 신호를 도입시키며, M912scFv은 세포 표면에 결합된 메소텔린에 결합한다. M912scFv-IgG4-Tim4-MyD88t CER (CER50) 키메라 포식작용 수용체 뉴클레오타이드 서열을 그 후 형질도입 마커로서 T2A 서열에 의해 분리되어 있는 절두된 EGFR과 함께 pLenti 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, 쥣과동물 Ba/F3 B-세포를 M912scFv-IgG4-Tim4-MyD88t 및 EGFRt를 발현하는 pLenti 벡터로 형질도입시키고, FACS에 의해 분류하여, 시험관내 연구에 사용하였다.
실시예 33
시험관내 식작용 데이터의 편집
선행 기재된 바와 같이 수행된 다양한 세포 유형의 CER+ 변형된 Ba/F3 세포에 대한 식작용 데이터를 편집하였다. 도 129는 덱사메타손 처리된 1차 흉선 세포와 공동 배양된 CER01, CER08, CER09, CER10, CER11, CER12, CER15, 또는 EGFRt 대조군에 의해 변형된 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 130은 스타우로스포린 처리된 CT26 결장 암종 세포와 공동 배양된 CER01, CER09, CER11, CER12, CER15, 또는 EGFRt 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다. 도 131은 스타우로스포린 처리된 A20 림프종 세포와 공동 배양된 CER01, CER09, CER11, CER12, CER15, 또는 EGFRt 대조군으로 형질도입된 Ba/F3 세포의 식작용 지수를 도시한다.
실시예 34
림프종의 마우스 모델에서의 CER01의 식작용 활성
서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 CER01을 인코딩하는 Tim4-MERTK CER 뉴클레오타이드 서열 (또한, 도 6a 참조)을 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 함께 pMSCV 레트로바이러스 벡터에 삽입하였다.
림프종 마우스 모델에서 방사선 요법 및 CER 면역요법의 조합 요법 용법의 시간표가 도 132a에 도시되어 있다.
0.5 x 106 38c13 마우스 B-세포 림프종 세포를 NOD scid 감마 (NSG) 면역결핍 마우스에 이식시켰다. 이식한지 4일 후, 마우스의 종양 부위에 5 Gy의 국소 방사선 처리를 제공한 후, 6 x 106 CER01+ 형질도입된 쥣과동물 T 세포 (C3H/HeN-MTV-음성 마우스로부터 유래함)의 정맥내 주입을 제공하였다. 종양 크기를 정밀 캘리퍼스를 사용하여 2차원으로 측정하고, 루시퍼라제 촬영을 CER01+ 형질도입된 T 세포의 주입 후 4일째에 수행하였다. pMSCV 빈 레트로바이러스 벡터 형질도입된 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 도 132b의 그래프에 도시된 바와 같이, 포스파티딜세린을 표적화하는 CER 변형된 T 세포는 저 조사량의 방사선 요법과 상승 효과를 나타내었다. 도 132C에 도시된 사진에서, 종양 성장을 포스파티딜세린을 표적화하는 CER 변형된 T 세포 　및 저 조사량 방사선의 조합 요법이 제공된 마우스에서 저하하였다.
림프종 마우스 모델에서 키메라 항원 수용체 (CAR) 면역요법 및 CER 면역요법에 대한 대체 조합 요법 용법의 시간표가 도 133a에 도시되어 있다. 0.5 x 106 38c13 림프종 세포를 NSG 면역결핍 마우스에 이식시켰다. 이식한지 4일 후, 마우스에 5 x 106 쥣과동물 CD19-표적화된 CAR-T 세포 (항-CD19 1D3 scFv, CD3-ζ 세포질 도메인 및 CD28 세포질 도메인을 갖는 "1D3 19z28" CAR)의 주입을 제공하였다. CAR 변형된 T 세포의 주입 3일 후, 6 x 106 CER01+ 형질도입된 T 세포를 마우스에 주입하였다. 종양 크기를 정밀 캘리퍼스를 사용하여 2차원으로 측정하고, 루시퍼라제 촬영을 CER01+ 형질도입된 T 세포 또는 CER01+ 형질도입된 B 세포의 주입 후 4일째에 수행하였다 (도 133b의 하부에 도시된 사진 참조). pMSCV 빈 레트로바이러스 벡터 형질도입된 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 도 133b에 도시된 바와 같이, PtdSer+을 표적화하는 CER+ T 세포 또는 CER+ B 세포는 저 투여량의 CAR 변형된 T 세포 요법과 상승 효과를 나타내었다.
상기에 기재된 다양한 실시형태는 조결합되어, 추가적인 실시형태를 제공할 수 있다. 본 명세서에서 언급되고/되거나, 2016년 9월 27일자로 출원된 미국 특허 출원 제 62/400,578호 및 2017년 1월 11일자로 출원된 미국 특허 출원 제 62/445,235호를 포함한 출원의 데이터 시트에 열거된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비 특허 공보는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 추가의 실시형태를 제공하기 위해, 다양한 특허, 출원 및 공보물의 개념을 채용할 필요가 있는 경우, 실시형태들의 양상이 변형될 수 있다.
전술한 상세한 설명에 비추어, 본 실시형태에 대해 이러한 변경 및 다른 변경이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용되는 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 실시형태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 청구범위에 청구된 균등물의 전 범위에 따라, 가능한 모든 실시형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> CERO THERAPEUTICS, INC. <120> CHIMERIC ENGULFMENT RECEPTOR MOLECULES <130> IPA190290-US <140> PCT/US2017/053553 <141> 2017-09-26 <150> US 62/400,578 <151> 2016-09-27 <150> US 62/445,235 <151> 2017-01-11 <160> 153 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 870 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Tim1 binding domain <400> 1 atgcaccccc aggttgttat actttcattg atcctgcatt tggccgactc cgtggcgggt 60 tccgtaaaag ttggagggga agctggacca agcgtcacct tgccttgcca ctactctgga 120 gccgtgacga gtatgtgctg gaatcgagga tcctgtagtc ttttcacatg ccaaaatggc 180 atagtttgga ccaatgggac gcacgtcacc taccgaaaag acactagata caaactcctg 240 ggtgacctca gcaggagaga tgtgtctctg actattgaaa acactgctgt ttctgactct 300 ggagtctact gttgccgggt cgagcaccga ggatggttca atgacatgaa gatcacggtc 360 agcttggaaa tcgtcccgcc caaggtaacc actacaccaa tagttactac ggttcccacg 420 gtaaccacgg ttcgaaccag caccacagta cccacaacta cgaccgttcc aaccactaca 480 gtccccacaa ccatgagtat ccctacgaca actacggtcc tgacaaccat gaccgtcagc 540 actaccacga gtgtgcctac gactactagc ataccgacga ctacttcagt tccagtcacc 600 accacggtga gtacattcgt gcctccaatg ccattgccga ggcaaaacca cgaacccgtg 660 gcgacatctc cgtctagtcc gcaaccagca gagacccatc ccaccacgct tcagggggca 720 atcaggagag aacctacaag ttcacccctc tacagctata caaccgatgg aaacgacaca 780 gttacagaaa gtagtgacgg tttgtggaat aacaaccaaa cacaattgtt cctggagcac 840 agtctgttga cagccaacac tacaaaggga 870 <210> 2 <211> 942 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Tim4 binding domain <400> 2 atgagtaaag agccgcttat cctgtggctt atgatagagt tttggtggtt gtatttgacc 60 ccggtcacga gcgaaacggt agtgactgaa gtattgggtc atcgggtaac cttgccttgc 120 ttgtatagct cctggtctca taatagtaat agcatgtgct ggggcaagga ccaatgcccc 180 tatagcggat gcaaggaggc gctcattcgc acagacggaa tgcgggtgac atcaaggaag 240 agtgctaagt accggcttca gggcacaatc ccacgcggcg acgtgtcact gactatcctt 300 aatccatccg agagcgactc tggtgtctat tgttgcagga tcgaggttcc gggatggttc 360 aatgatgtaa agatcaatgt aagactcaat ctgcaacggg catctacaac cacgcatcgg 420 acagccacta ctaccacaag gagaacaact actacgtcac ccacgactac tcgacagatg 480 accactacac ctgcggccct gccaactacg gttgtaacta ctccggatct gacaaccggg 540 acaccgttgc aaatgacaac cattgcagta tttaccacgg caaacacgtg tctctctctg 600 accccatcta ctcttccgga ggaggccacc gggctcctta caccggagcc gtctaaggaa 660 ggcccaatct tgaccgcaga gagtgagacc gtacttccga gcgattcatg gtccagtgtc 720 gagagcacat ccgctgacac cgtccttctt acgtccaaag aaagtaaagt ttgggacctc 780 ccgtccacga gccacgtttc tatgtggaag acctcagata gcgttagctc cccacagcca 840 ggagcaagcg acaccgcagt accggagcaa aacaagacga ctaagactgg ccagatggat 900 ggtatcccaa tgtcaatgaa aaatgagatg cccatatcac aa 942 <210> 3 <211> 483 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> FA58C2 binding domain <400> 3 ctcaacgggt gtgctaatcc ccttggcctg aagaataaca gcatacctga caagcaaata 60 acagcgtcaa gttcttataa aacttggggg ctgcatctgt tctcctggaa ccccagttac 120 gctagactcg acaaacaagg caattttaac gcatgggtgg caggctctta cgggaacgat 180 cagtggctgc aagtagactt gggaagtagt aaggaggtga ctgggatcat tacccagggg 240 gcacgaaatt tcggttccgt tcagttcgtt gcatcttata aggtagcgta ttcaaatgac 300 tccgcgaatt ggaccgaata tcaggacccg cgaaccggat caagcaagat ttttccgggg 360 aattgggaca accactctca caaaaaaaat ttgtttgaaa cacctatact ggcgcggtac 420 gttagaatcc tcccagttgc ctggcacaac cggatagcgc ttagactgga attgttgggg 480 tgc 483 <210> 4 <211> 876 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> FcgammaRI binding domain <400> 4 atgtggttcc tgactacgtt gttgctgtgg gtccctgtag acggccaagt agacacaacg 60 aaagcagtga tcacgctcca accgccttgg gtgtctgtgt tccaagaaga aacagttaca 120 ctgcactgtg aggtcctcca cctgcctggt tcttcatcta ctcaatggtt tctcaacgga 180 acagcaacac aaacaagtac cccttcctac agaattacga gtgcatctgt taacgattca 240 ggagagtata ggtgccagcg agggctttca ggccggtccg accccattca actcgaaatt 300 caccgcggtt ggcttctgct gcaagtatcc tctcgggtct tcacggaagg tgaaccactt 360 gccttgcgct gtcacgcatg gaaagataag ctcgtctaca acgttttgta ttatcggaat 420 ggaaaggcat ttaagttttt tcattggaac tcaaacctta cgatcctcaa aaccaatatc 480 agtcataacg gtacgtacca ctgctcaggc atgggcaagc atcgctatac gtccgcaggg 540 attagcgtga cagttaagga gctcttcccc gcgcctgtgc tgaatgcgag cgtaacttca 600 ccccttctgg agggcaactt ggtgaccctc tcttgtgaga cgaaacttct ccttcagagg 660 ccgggcctgc aactctattt cagcttttat atgggttcta aaactcttcg aggcagaaac 720 acgagcagcg aatatcagat actgactgcc cggcgggaag acagtggcct ttattggtgc 780 gaggctgcaa cagaagatgg caatgtcctt aaaaggtctc ccgaattgga gctccaagtg 840 cttggcttgc aactccctac acccgtatgg ttccac 876 <210> 5 <211> 282 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> GAS6 binding domain <400> 5 atggctccct ctttgtcacc aggacctgcg gctcttaggc gagccccgca gctgctgctt 60 ctcctgctcg ctgcagaatg cgctctcgct gcactcttgc ccgcgaggga ggcgactcag 120 ttcttgcgcc cccggcagag acgagcattc caagtctttg aggaagcgaa acaaggtcat 180 ctcgagcgag aatgcgtgga ggagctgtgt tctagggagg aagcacgcga agtctttgag 240 aatgacccgg aaacggacta cttttacccc cggtatcttg at 282 <210> 6 <211> 261 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Protein S binding domain <400> 6 atgcgcgtgt tggggggtcg ctgtggtgcg ctccttgctt gtctcctttt ggttcttccc 60 gtctccgagg ctaatttcct gtcaaaacaa caggctagtc aagtcttggt gcgcaagagg 120 agagctaaca 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DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Tyro3 transmembrane domain <400> 14 gtacccgtcg ttttgggggt cctgaccgcg ctcgttactg cggcagcact cgcactgata 60 ctt 63 <210> 15 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD4 transmembrane domain <400> 15 atggctctga tcgtactggg cggagtggca ggattgctgc tctttattgg actgggcatt 60 ttcttc 66 <210> 16 <211> 1428 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> MERTK signaling domain <400> 16 gcgctgcggc gaagggtaca ggagacgaaa ttcgggggag cctttagtga agaagacagc 60 cagttggtgg taaattacag agcgaaaaaa tctttctgcc gacgcgctat tgagcttact 120 cttcaaagcc tcggtgtaag tgaggagttg cagaataaat tggaggacgt agtcatcgac 180 cgcaaccttc tggtcctcgg aaaagtcctc ggagaaggtg aattcggctc agtaatggaa 240 ggcaatctca aacaagaaga cggaacttct cagaaggtag cagtaaaaac catgaaactc 300 gacaacttca gccagcggga aatcgaagaa ttcctgtccg aagccgcctg tatgaaagac 360 ttcaatcacc caaacgtgat aagacttctc ggcgtatgta tagagttgtc ttcccagggc 420 atccccaaac caatggtgat actcccattt atgaagtacg gggacttgca cacattcctg 480 ttgtattcca gacttaatac aggacccaag tatatacatt tgcagaccct gctcaaattt 540 atgatggaca tcgcgcaggg gatggagtat ctcagcaaca ggaatttttt gcatcgcgac 600 cttgctgcca ggaactgtat gttgagggac gacatgacgg tgtgtgtagc cgacttcggt 660 cttagcaaga agatctattc tggagactat tacaggcaag gcagaatagc taagatgccg 720 gtcaagtgga tcgctattga gagcctcgca gaccgggtct atacttcaaa gtcagacgtt 780 tgggcttttg gggtaaccat gtgggagatc actacgaggg ggatgacgcc ctatcccggg 840 gtccaaaatc acgagatgta tgattatctc ttgcatggcc accggctgaa acagcctgag 900 gactgtctgg acgagctcta cgatattatg tattcttgtt ggtccgcgga ccccctcgat 960 agaccaacct tttctgttct tcgactgcag ctcgaaaagc tttccgaatc tttgcctgat 1020 gcacaggaca aagaaagcat catttatata aatacacagc tcctggaatc ttgcgaagga 1080 attgctaatg gacctagtct gactggattg gacatgaata ttgacccgga cagcataatt 1140 gcatcttgca cacctggtgc agcggtatca gtcgtgacgg ccgaggtcca tgaaaacaat 1200 ctgcgggagg agcggtacat tttgaacggc ggaaacgaag agtgggagga cgtcagctca 1260 accccctttg cagccgtgac gccagagaaa gacggggtac ttcctgagga ccgccttacc 1320 aagaacgggg tatcctggtc tcaccacagc accctcccac ttgggagtcc atctcccgac 1380 gagcttctct tcgtagatga ttcacttgaa gattcagagg tgctcatg 1428 <210> 17 <211> 1266 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Axl signaling domain <400> 17 caccggagaa aaaaagagac ccgctacgga gaggtctttg agcctacggt cgagagaggt 60 gagcttgttg tccggtacag agtgaggaag agctattcac ggaggactac tgaagccacc 120 ctgaattcac tcggcatcag cgaagagctg aaagagaaac ttcgggacgt aatggtcgat 180 cggcacaagg tagccctcgg gaagacgttg ggagagggcg aatttggggc cgtcatggag 240 ggtcagttga accaagatga ctcaatactt aaagtagcag tcaaaacgat gaaaatcgca 300 atttgtactc gctcagagct cgaagacttt ctctctgagg cggtatgcat gaaggaattc 360 gaccacccaa atgtaatgcg attgatcggt gtctgcttcc aaggttccga aagagagtca 420 tttcctgcac ccgttgtcat tttgccattt atgaagcatg gggacctcca ctcatttctc 480 ctctattcta gattgggtga ccaaccggtt tacctcccga cccaaatgct cgttaagttc 540 atggccgaca ttgcttccgg gatggagtac ctgagtacca agcggtttat acatcgggat 600 ctcgcagcac gaaactgcat gttgaatgag aacatgtctg tctgtgtggc tgactttgga 660 ctctccaaaa aaatttacaa cggtgattat taccgccagg 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atttaccctc ggccgaatgc ttggaaaggg tgagtttggg 240 tcagttcgcg aggcgcagct taaacaggaa gacggtagtt ttgttaaagt cgcagtaaaa 300 atgttgaagg cggacataat cgcatccagc gatattgagg aatttcttcg cgaagcggca 360 tgtatgaaag agttcgacca cccgcacgtt gccaagctcg tgggcgtgtc tcttcgaagc 420 cgagctaagg gtagactccc tatcccaatg gtaatacttc cttttatgaa acatggggac 480 ttgcacgctt ttctgctcgc ttccaggata ggagaaaatc cgtttaattt gccgctccaa 540 acgcttatca ggtttatggt tgatattgcg tgtgggatgg aatacttgag ttcacgcaat 600 ttcatccatc gagacctggc cgcgcgaaat tgtatgctcg cagaggatat gaccgtatgt 660 gtagctgatt tcggcttgtc acgcaagata tatagcggcg attattatag acagggttgt 720 gcctctaagc tccctgtaaa gtggttggca ttggaatcac tggcggataa cctctatact 780 gtccagtcag atgtgtgggc atttggtgtc actatgtggg agattatgac acggggtcag 840 acaccctacg caggaatcga gaacgcggag atatataact acctgatagg tggcaaccga 900 ctgaaacaac ctccggaatg catggaggac gtgtatgacc tcatgtacca gtgttggagt 960 gccgatccga aacaaagacc tagtttcact tgcctgagaa tggagttgga gaatattttg 1020 ggtcagttgt ccgtactgag cgccagccaa gatccgttgt atataaatat agagcgggcg 1080 gaggagccca cggccggcgg gtccctggaa cttcctggac gagaccaacc gtactcaggg 1140 gccggagatg gaagtggaat gggggctgtt gggggcacac cgtccgactg ccgatacata 1200 ctcactccgg gcggtctcgc agaacaaccg ggtcaagcag aacatcaacc agaaagtcca 1260 ctcaatgaga cacagcgact gttgttgttg caacagggct tgctgcctca ctcatcctgt 1320 <210> 19 <211> 783 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Syk signaling domain <400> 19 acattggaag acaaagaact ggggtctggg aacttcggga cagtcaaaaa ggggtactac 60 cagatgaaaa aagttgtcaa aactgtggcg gtaaaaatct tgaaaaatga agctaatgac 120 cctgcactca aggatgagct tctggcagaa gctaacgtga tgcagcagct tgataatcct 180 tatattgttc gcatgatagg tatatgtgag gcggaaagct ggatgctcgt aatggaaatg 240 gcagaactgg gaccattgaa taaatatctg caacaaaata gacatgtgaa ggataaaaac 300 atcatagagc tcgtacacca agtctctatg gggatgaagt acttggagga gagcaacttc 360 gtgcataggg acttggccgc ccgaaacgta ctgctcgtaa ctcaacatta cgcgaaaatc 420 tcagacttcg gtttgtctaa agcactccgg gcagacgaga actactacaa agcccaaact 480 cacggcaagt ggccagtcaa gtggtacgcg ccggaatgca taaactatta caagtttagt 540 tctaagtctg atgtgtggag cttcggggtt ctgatgtggg aagcctttag ttatggacag 600 aagccctacc gggggatgaa aggaagcgag gtaacagcta tgctggaaaa aggggagcgg 660 atgggctgtc cagcggggtg tcctcgagaa atgtatgatc tcatgaacct gtgttggacc 720 tacgatgtcg agaatcgccc gggctttgct gcggtggaac ttagactgag gaattattac 780 tac 783 <210> 20 <211> 789 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Zap70 signaling domain <400> 20 ctcattgccg acatcgaact tggttgcggc aacttcggat ctgtgagaca aggcgtctac 60 cggatgagaa agaagcagat tgacgttgca atcaaagtcc tgaagcaggg cacggaaaag 120 gcggacaccg aggagatgat gcgcgaggct cagattatgc accagctcga caatccgtac 180 atcgttagac ttatcggagt ttgccaggca gaagcgttga tgctcgtgat ggagatggca 240 ggcggtggtc ctctgcataa atttttggta ggcaagcgag aagagatccc cgtcagcaat 300 gtagcagaat tgttgcatca agtgagcatg gggatgaagt accttgagga aaaaaatttc 360 gtacatcgcg acctcgctgc gagaaatgtg cttttggtaa atcgccatta cgctaaaatt 420 agtgactttg gactcagtaa ggcattgggt gctgacgact catattacac ggcaagaagc 480 gcaggtaagt ggcctctgaa gtggtatgct cccgagtgca tcaacttccg caagttttct 540 tccaggtctg acgtttggag ctacggtgtc acgatgtggg aagccctgag ctatggtcag 600 aaaccttaca agaaaatgaa gggacctgaa gtcatggcct ttatagagca gggaaagaga 660 atggagtgtc ccccagaatg cccacccgag ctctatgcac tgatgagtga ctgctggatt 720 tacaaatggg aggatcggcc tgactttctt acggttgagc aaaggatgag ggcgtgctat 780 tattctctg 789 <210> 21 <211> 183 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> FcgammaRI signaling domain <400> 21 agaaaggaac tcaagcgcaa gaagaagtgg gacctggaga tttctctcga ctccggtcac 60 gaaaagaagg tcatcagtag cttgcaagag gaccgacact tggaagaaga acttaaatgc 120 caggaacaga aagaggagca gctccaggag ggagtccacc ggaaagaacc acagggagca 180 act 183 <210> 22 <211> 231 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> FcgammaR2A signaling domain <400> 22 tgtcgaaaga agcggatttc agccaatagt acagacccag tgaaagccgc tcaatttgag 60 ccacccggtc gacagatgat cgcaattagg aaacgccaac tggaggaaac gaataatgat 120 tacgaaacgg cagatggggg ctacatgacg ctcaatccta gagctccgac cgacgacgac 180 aagaatatat atctgactct ccctcccaac gaccacgtaa acagtaataa c 231 <210> 23 <211> 231 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> FcgammaR2C signaling domain <400> 23 tgcagaaaga agcggataag tgcaaatagt actgatcccg ttaaagcagc acaatttgag 60 ccgccaggac ggcaaatgat tgcaatcaga aaacgacaac ccgaggaaac caataatgac 120 tacgagaccg ctgacggagg gtatatgacg ttgaatcccc gcgcaccaac ggatgacgat 180 aagaacattt atcttacgct gccccctaac gatcatgtga atagcaataa c 231 <210> 24 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> FcgammaR3A signaling domain <400> 24 aaaacaaata tccggtcctc tacgagggac tggaaagatc ataaattcaa gtggagaaaa 60 gatcctcagg ataaa 75 <210> 25 <211> 168 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> ItgB5 signaling domain <400> 25 aagttgcttg taacaataca cgaccgccgg gagttcgcta agttccaatc agaaaggtct 60 agagcgcggt atgaaatggc atctaacccc ttgtaccgga aacctatctc tacgcacacg 120 gtggatttcg catttaataa gttcaataag agttacaacg gctcagtc 168 <210> 26 <211> 888 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> MyD88 signaling domain <400> 26 atggccgcgg gtggacccgg 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ccctccca 888 <210> 27 <211> 1566 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Traf6 signaling domain <400> 27 atgtcactcc ttaactgcga aaacagttgt gggagttcac aatccgaaag tgattgttgc 60 gtggcgatgg cgtcttcatg ctctgcggtt accaaggatg actctgtggg aggcaccgca 120 tctaccggaa atctgagctc ttcttttatg gaggaaattc agggctacga cgttgagttt 180 gatcctcctc tcgaatctaa gtatgagtgc cccatatgtc tcatggcgtt gagagaagca 240 gtgcagactc cgtgcggaca tcgcttctgc aaggcgtgta ttataaagag tatacgcgat 300 gcgggtcaca aatgtccagt ggacaacgag atactgcttg aaaatcaact tttccccgac 360 aattttgcaa agagagagat actgtctttg atggttaagt gtccaaacga gggctgcttg 420 cacaaaatgg aactccgaca ccttgaagac caccaggcac actgcgagtt cgccctcatg 480 gattgcccac aatgccagcg cccgttccaa aagtttcaca taaacatcca catactgaag 540 gactgtccta ggagacaagt aagctgtgac aattgcgcag cgtcaatggc gttcgaggac 600 aaggagatac acgatcaaaa ctgtcctctg gcgaatgtga tctgcgaata ttgcaatacg 660 atcttgatcc gcgaacagat gcctaatcat tacgacctcg attgtccgac cgcgccaatt 720 ccttgtactt tttctacctt cggatgtcat gagaaaatgc aacgaaatca cctggctcgc 780 catcttcagg agaatactca gagccacatg cgcatgttgg ctcaagccgt acatagcctt 840 agcgtaatac cggactcagg ttatatatcc gaagtacgga attttcaaga aaccatacat 900 caacttgaag gaaggttggt acgacaggat catcagatac gcgaattgac ggccaagatg 960 gaaacccaga gcatgtatgt cagtgagctt aagcgcacta tccgaaccct ggaggataaa 1020 gttgccgaaa tcgaagctca acaatgcaac gggatataca tttggaaaat aggtaacttc 1080 ggaatgcacc tgaagtgtca agaagaagaa aaacctgtcg ttattcattc ccccggcttt 1140 tatacaggga agcctgggta taagctttgc atgaggctcc acctccaatt gccgacggcg 1200 caaaggtgcg caaattacat ttctctgttt gtccatacta tgcagggtga gtacgatagt 1260 cacttgccgt ggcccttcca gggtaccata cgattgacca tcctggatca gagcgaggcc 1320 cccgtgcgac agaatcatga agaaataatg gatgctaagc cggaactgct cgctttccag 1380 agacctacaa ttccgcgaaa tcctaagggt tttggctatg ttacgttcat gcatctggaa 1440 gcactcagac aaagaacatt cattaaagat gacaccttgc ttgtgcggtg tgaggtgtca 1500 accaggttcg acatgggatc tctcagacgg gaggggttcc aaccgcgctc tacagacgct 1560 ggagtg 1566 <210> 28 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> 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<213> Homo sapiens <220> <223> Protein S binding domain <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(24) <400> 33 Met Arg Val Leu Gly Gly Arg Cys Gly Ala Leu Leu Ala Cys Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Pro Val Ser Glu Ala Asn Phe Leu Ser Lys Gln Gln Ala 20 25 30 Ser Gln Val Leu Val Arg Lys Arg Arg Ala Asn Ser Leu Leu Glu Glu 35 40 45 Thr Lys Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Leu Cys Asn 50 55 60 Lys Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn Asp Pro Glu Thr Asp Tyr 65 70 75 80 Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu Val 85 <210> 34 <211> 202 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Tim3 binding domain <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(21) <400> 34 Met Phe Ser His Leu Pro Phe Asp Cys Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Arg Ser Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln 20 25 30 Asn Ala Tyr Leu Pro Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Pro Val Cys Trp Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly 50 55 60 Asn Val Val Leu Arg Thr Asp Glu Arg Asp Val Asn Tyr Trp Thr Ser 65 70 75 80 Arg 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sapiens <220> <223> FcgammaRI transmembrane domain <400> 37 Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu Val Asn Thr Val 1 5 10 15 Leu Trp Val Thr Ile 20 <210> 38 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD8a transmembrane domain <400> 38 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> MERTK transmembrane domain <400> 39 Phe Gly Cys Phe Cys Gly Phe Ile Leu Ile Gly Leu Ile Leu Tyr Ile 1 5 10 15 Ser Leu Ala Ile Arg 20 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Axl transmembrane domain <400> 40 Tyr Val Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val Leu Ile Leu 1 5 10 15 Ala Leu Phe Leu Val 20 <210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Tyro3 transmembrane domain <400> 41 Val Pro Val Val Leu Gly Val Leu Thr Ala Leu Val Thr Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ile Leu 20 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD4 transmembrane domain <400> 42 Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile 1 5 10 15 Gly Leu Gly Ile Phe Phe 20 <210> 43 <211> 476 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> MERTK signaling domain <400> 43 Ala Leu Arg Arg Arg Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Gly Ala Phe Ser 1 5 10 15 Glu Glu Asp Ser Gln Leu Val Val Asn Tyr Arg Ala Lys Lys Ser Phe 20 25 30 Cys Arg Arg Ala Ile Glu Leu Thr Leu Gln Ser Leu Gly Val Ser Glu 35 40 45 Glu Leu Gln Asn Lys Leu Glu Asp Val Val Ile Asp Arg Asn Leu Leu 50 55 60 Val Leu Gly Lys Val Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ser Val Met Glu 65 70 75 80 Gly Asn Leu Lys Gln Glu Asp Gly Thr Ser Gln Lys Val Ala Val Lys 85 90 95 Thr Met Lys Leu Asp Asn Phe Ser Gln Arg Glu Ile Glu Glu Phe Leu 100 105 110 Ser Glu Ala Ala Cys Met Lys Asp Phe Asn His Pro Asn Val Ile Arg 115 120 125 Leu Leu Gly Val Cys Ile Glu Leu Ser Ser Gln Gly Ile Pro Lys Pro 130 135 140 Met Val Ile Leu Pro Phe Met Lys Tyr Gly Asp Leu His Thr Phe Leu 145 150 155 160 Leu Tyr Ser Arg Leu Asn Thr Gly Pro Lys 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85 90 95 Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser 100 105 110 Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu 115 120 125 Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro 130 135 140 Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu 145 150 155 160 Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met 165 170 175 Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser 180 185 190 Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu 195 200 205 Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys 210 215 220 Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro 225 230 235 240 Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser 245 250 255 Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr 260 265 270 Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp 275 280 285 Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp 290 295 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ttctctaggc gccggaattc gccaccatgt ctaaaggtct tcttctgctg tggctggtta 60 ctgaactgtg gtggttgtat ctcactcctg cagcaagtga ggataccatc attggtttct 120 tggggcagcc cgtcaccctc ccttgtcact accttagctg gagccagagc agaaatagta 180 tgtgttgggg taagggctcc tgtcctaata gcaaatgtaa tgcagagctc ttgcgaacag 240 acgggacacg gatcatcagt agaaagtcta ctaagtatac cttgcttggg aaggtacaat 300 ttggggaagt gtccctcact attagtaata caaatagagg tgacagcgga gtctattgct 360 gtagaataga agtaccaggt tggtttaacg atgtcaaaaa aaatgtacgg ctcgaattga 420 ggagggctac cactaccaag aaaccaacta caaccacccg ccccactaca accccttacg 480 tcaccacaac aacccctgaa ctgctgccca caactgtgat gaccaccagt gttcttccca 540 ctaccactcc tccccagacc ctggctacta ccgctttctc aacagccgta actacttgtc 600 cctcaactac ccctgggtca ttcagtcagg aaactacaaa ggggtccgct ttcactactg 660 agtcagaaac cctccctgct tctaatcact ctcaacgcag catgatgaca atatcaactg 720 acatcgctgt tctgagacca actggaagca atcccggtat cttgccctcc acatctcagc 780 tgacaacaca aaaaactacc ctgaccacat cagaatccct tcagaagaca actaagtccc 840 accaaatcaa ttcccgacag 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tttagctgct 600 cgaaactgca tgttgcgaga tgacatgact gtctgtgttg cggacttcgg cctctctaag 660 aagatttaca gtggcgatta ttaccgccaa ggccgcattg ctaagatgcc tgttaaatgg 720 atcgccatag aaagtcttgc agaccgagtc tacacaagta aaagtgatgt gtgggcattt 780 ggcgtgacca tgtgggaaat agctacgcgg ggaatgactc cctatcctgg ggtccagaac 840 catgagatgt atgactatct tctccatggc cacaggttga agcagcccga agactgcctg 900 gatgaactgt atgaaataat gtactcttgc tggagaaccg atcccttaga ccgccccacc 960 ttttcagtat tgaggctgca gctagaaaaa ctcttagaaa gtttgcctga cgttcggaac 1020 caagcagacg ttatttacgt caatacacag ttgctggaga gctctgaggg cctggcccag 1080 ggctccaccc ttgctccact ggacttgaac atcgaccctg actctataat tgcctcctgc 1140 actccccgcg ctgccatcag tgtggtcaca gcagaagttc atgacagcaa acctcatgaa 1200 ggacggtaca tcctgaatgg gggcagtgag gaatgggaag atctgacttc tgccccctct 1260 gctgcagtca cagctgaaaa gaacagtgtt ttaccggggg agagacttgt taggaatggg 1320 gtctcctggt cccattcgag catgctgccc ttgggaagct cattgcccga tgaacttttg 1380 tttgctgacg actcctcaga aggctcagaa gtcctgatg 1419 <210> 139 <211> 1191 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> BAI1 signaling domain <400> 139 cgtagagagg tccaggacgc tgtgaaatgc cgtgtggttg accggcagga ggagggcaac 60 ggggactcag ggggctcctt ccagaacggc cacgcccagc tcatgaccga cttcgagaag 120 gacgtggatc tggcctgtag atcagtgctg aacaaggaca tcgcggcctg ccgcactgcc 180 accatcacgg gcacactgaa gcggccgtct ctgcccgagg aggagaagct gaagctggcc 240 catgccaagg ggccgcccac caatttcaac agcctgccgg ccaacgtgtc caagctgcac 300 ctgcacggct caccccgcta tcccggcggg cccctgcccg acttccccaa ccactcactg 360 accctcaaga gggacaaggc gcccaagtcc tccttcgtcg gtgacgggga catcttcaag 420 aagctggact cggagctgag ccgggcccag gagaaggctc tggacacgag ctacgtgatc 480 ctgcccacgg ccacggccac gctgcggccc aagcccaagg aggagcccaa gtacagcatc 540 cacattgacc agatgccgca gacccgcctc atccacctca gcacggcccc cgaggccagc 600 ctccccgccc gcagcccgcc ctcccgccag ccccccagcg gcgggccccc cgaggcaccc 660 cctgcccagc ccccaccgcc tccgccccca ccgccaccac ctccccagca gcccctgccc 720 ccaccgccca atctggagcc ggcacccccc agcctggggg atcccgggga gcctgccgcc 780 catccgggac ccagcacggg gcccagcacc aagaacgaga atgtcgccac cttgtctgtg 840 agctccctgg agcggcggaa gtcgcggtat gcagaactgg actttgagaa gatcatgcac 900 acccggaagc ggcaccaaga catgttccag gacctgaacc ggaagctgca gcacgcagcg 960 gagaaggaca aggaggtgct ggggccggac agcaagccgg aaaagcagca gacgcccaac 1020 aagaggccct gggagagcct ccggaaagcc cacgggacgc ccacgtgggt gaagaaggag 1080 ctggagccgc tgcagccgtc gccgctggag cttcgcagcg tggagtggga gaggtcgggc 1140 gccacgatcc cgctggtggg ccaggacatc atcgacctcc agaccgaggt c 1191 <210> 140 <211> 1191 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> ELMO <400> 140 cgtagagagg tccaggacgc tgtgaaatgc cgtgtggttg accggcagga ggagggcaac 60 ggggactcag ggggctcctt ccagaacggc cacgcccagc tcatgaccga cttcgagaag 120 gacgtggatc tggcctgtag atcagtgctg aacaaggaca tcgcggcctg ccgcactgcc 180 accatcacgg gcacactgaa gcggccgtct ctgcccgagg aggagaagct gaagctggcc 240 catgccaagg ggccgcccac caatttcaac agcctgccgg ccaacgtgtc caagctgcac 300 ctgcacggct caccccgcta tcccggcggg cccctgcccg acttccccaa ccactcactg 360 accctcaaga gggacaaggc gcccaagtcc tccttcgtcg gtgacgggga catcttcaag 420 aagctggact cggagctgag ccgggcccag gagaaggctc tggacacgag ctacgtgatc 480 ctgcccacgg ccacggccac gctgcggccc aagcccaagg aggagcccaa gtacagcatc 540 cacattgacc agatgccgca gacccgcctc atccacctca gcacggcccc cgaggccagc 600 ctccccgccc gcagcccgcc ctcccgccag ccccccagcg gcgggccccc cgaggcaccc 660 cctgcccagc ccccaccgcc tccgccccca ccgccaccac ctccccagca gcccctgccc 720 ccaccgccca atctggagcc ggcacccccc agcctggggg atcccgggga gcctgccgcc 780 catccgggac ccagcacggg gcccagcacc aagaacgaga atgtcgccac cttgtctgtg 840 agctccctgg agcggcggaa gtcgcggtat gcagaactgg actttgagaa gatcatgcac 900 acccggaagc ggcaccaaga catgttccag gacctgaacc ggaagctgca gcacgcagcg 960 gagaaggaca aggaggtgct ggggccggac agcaagccgg aaaagcagca gacgcccaac 1020 aagaggccct gggagagcct ccggaaagcc cacgggacgc ccacgtgggt gaagaaggag 1080 ctggagccgc tgcagccgtc gccgctggag cttcgcagcg tggagtggga gaggtcgggc 1140 gccacgatcc cgctggtggg ccaggacatc atcgacctcc agaccgaggt c 1191 <210> 141 <211> 126 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Fc(epsilon) RI(gamma) signaling domain <400> 141 cgactgaaga tccaagtgcg aaaggcagct ataaccagct atgagaaatc agatggtgtt 60 tacacgggcc tgagcaccag gaaccaggag acttacgaga ctctgaagca tgagaaacca 120 ccacag 126 <210> 142 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> BAI1 transmembrane domain <400> 142 Val Thr Leu Ile Val Gly Cys Gly Val Ser Ser Leu Thr Leu Leu Met 1 5 10 15 Leu Val Ile Ile Tyr 20 <210> 143 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> BAI1 transmembrane domain <400> 143 gtgacgctca tcgtgggctg tggcgtgtcc tctctcaccc tgctcatgct ggtcatcatc 60 tac 63 <210> 144 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 transmembrane domain <400> 144 ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60 gcctttatta ttttctgggt g 81 <210> 145 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> DAP12 transmembrane domain <400> 145 ggcgtgctgg cagggatcgt gatgggagac ctggtgctga cagtgctcat tgccctggcc 60 gtg 63 <210> 146 <400> 146 000 <210> 147 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A self-cleaving peptide <400> 147 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 148 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A self-cleaving peptide <400> 148 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 149 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A self-cleaving peptide <400> 149 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 150 <400> 150 000 <210> 151 <400> 151 000 <210> 152 <211> 774 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CER97 chimeric engulfment receptor <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(22) <400> 152 Met Ser Lys Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Val Thr Glu Leu Trp Trp -20 -15 -10 Leu Tyr Leu Thr Pro Ala Ala Ser Glu Asp Thr Ile Ile Gly Phe Leu -5 1 5 10 Gly Gln Pro Val Thr Leu Pro Cys His Tyr Leu Ser Trp Ser Gln Ser 15 20 25 Arg Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys Gly Ser Cys Pro Asn Ser Lys Cys 30 35 40 Asn Ala Glu Leu Leu Arg Thr Asp Gly Thr Arg Ile Ile Ser Arg Lys 45 50 55 Ser Thr Lys Tyr Thr Leu Leu Gly Lys Val Gln Phe Gly Glu Val Ser 60 65 70 Leu Thr Ile Ser Asn Thr Asn Arg Gly Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys 75 80 85 90 Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Lys Asn Val Arg 95 100 105 Leu Glu Leu Arg Arg Ala Thr Thr Thr Lys Lys Pro Thr Thr Thr Thr 110 115 120 Arg Pro Thr Thr Thr Pro Tyr Val Thr Thr Thr Thr Pro Glu Leu Leu 125 130 135 Pro Thr Thr Val Met Thr Thr Ser Val Leu Pro Thr Thr Thr Pro Pro 140 145 150 Gln Thr Leu Ala Thr Thr Ala Phe Ser Thr Ala Val Thr Thr Cys Pro 155 160 165 170 Ser Thr Thr Pro Gly Ser Phe Ser Gln Glu Thr Thr Lys Gly Ser Ala 175 180 185 Phe Thr Thr Glu Ser Glu Thr Leu Pro Ala Ser Asn His Ser Gln Arg 190 195 200 Ser Met Met Thr Ile Ser Thr Asp Ile Ala Val Leu Arg Pro Thr Gly 205 210 215 Ser Asn Pro Gly Ile Leu Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Thr Gln Lys 220 225 230 Thr Thr Leu Thr Thr Ser Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Lys Ser His 235 240 245 250 Gln Ile Asn Ser Arg Gln Thr Ile Leu Ile Ile Ala Cys Cys Val Gly 255 260 265 Phe Val Leu Met Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Leu His Arg Arg Lys 270 275 280 Lys Glu Thr Arg Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly 285 290 295 Glu Leu Val Val Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr 300 305 310 Thr Glu Ala Thr Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu 315 320 325 330 Lys Leu Arg Asp Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys 335 340 345 Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn 350 355 360 Gln Asp Asp Ser Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala 365 370 375 Ile Cys Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys 380 385 390 Met Lys Glu Phe Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys 395 400 405 410 Phe Gln Gly Ser Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu 415 420 425 Pro Phe Met Lys His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg 430 435 440 Leu Gly Asp Gln Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe 445 450 455 Met Ala Asp Ile Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe 460 465 470 Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met 475 480 485 490 Ser Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly 495 500 505 Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile 510 515 520 Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val 525 530 535 Trp Ser Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr 540 545 550 Pro Tyr Pro Gly Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln 555 560 565 570 Gly Asn Arg Leu Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala 575 580 585 Leu Met Ser Arg Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe 590 595 600 Thr Glu Leu Arg Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro 605 610 615 Ala Gln Glu Pro Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly 620 625 630 Gly Tyr Pro Glu Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr 635 640 645 650 Gln Pro Asp Pro Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val 655 660 665 His Pro Ala Gly Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro 670 675 680 Ala Gln Pro Ala Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp 685 690 695 Gly Ala Tyr Phe Leu Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala 700 705 710 Glu Ala Ala Thr Arg Lys Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr 715 720 725 730 Gln Glu Leu Gln Gly Gln Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr 735 740 745 Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys 750 <210> 153 <211> 767 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CER98 chimeric engulfment receptor <220> <221> SIGNAL <222> (1)...(22) <400> 153 Met Ser Lys Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Val Thr Glu Leu Trp Trp -20 -15 -10 Leu Tyr Leu Thr Pro Ala Ala Ser Glu Asp Thr Ile Ile Gly Phe Leu -5 1 5 10 Gly Gln Pro Val Thr Leu Pro Cys His Tyr Leu Ser Trp Ser Gln Ser 15 20 25 Arg Asn Ser Met Cys Trp Gly Lys Gly Ser Cys Pro Asn Ser Lys Cys 30 35 40 Asn Ala Glu Leu Leu Arg Thr Asp Gly Thr Arg Ile Ile Ser Arg Lys 45 50 55 Ser Thr Lys Tyr Thr Leu Leu Gly Lys Val Gln Phe Gly Glu Val Ser 60 65 70 Leu Thr Ile Ser Asn Thr Asn Arg Gly Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys 75 80 85 90 Arg Ile Glu Val Pro Gly Trp Phe Asn Asp Val Lys Lys Asn Val Arg 95 100 105 Leu Glu Leu Arg Arg Ala Thr Thr Thr Lys Lys Pro Thr Thr Thr Thr 110 115 120 Arg Pro Thr Thr Thr Pro Tyr Val Thr Thr Thr Thr Pro Glu Leu Leu 125 130 135 Pro Thr Thr Val Met Thr Thr Ser Val Leu Pro Thr Thr Thr Pro Pro 140 145 150 Gln Thr Leu Ala Thr Thr Ala Phe Ser Thr Ala Val Thr Thr Cys Pro 155 160 165 170 Ser Thr Thr Pro Gly Ser Phe Ser Gln Glu Thr Thr Lys Gly Ser Ala 175 180 185 Phe Thr Thr Glu Ser Glu Thr Leu Pro Ala Ser Asn His Ser Gln Arg 190 195 200 Ser Met Met Thr Ile Ser Thr Asp Ile Ala Val Leu Arg Pro Thr Gly 205 210 215 Ser Asn Pro Gly Ile Leu Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Thr Gln Lys 220 225 230 Thr Thr Leu Thr Thr Ser Glu Ser Leu Gln Lys Thr Thr Lys Ser His 235 240 245 250 Gln Ile Asn Ser Arg Gln Thr Ile Leu Ile Ile Ala Cys Cys Val Gly 255 260 265 Phe Val Leu Met Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Leu His Arg Arg Lys 270 275 280 Lys Glu Thr Arg Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg Gly 285 290 295 Glu Leu Val Val Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Thr 300 305 310 Thr Glu Ala Thr Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys Glu 315 320 325 330 Lys Leu Arg Asp Val Met Val Asp Arg His Lys Val Ala Leu Gly Lys 335 340 345 Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Met Glu Gly Gln Leu Asn 350 355 360 Gln Asp Asp Ser Ile Leu Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys Ile Ala 365 370 375 Ile Cys Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu Ser Glu Ala Val Cys 380 385 390 Met Lys Glu Phe Asp His Pro Asn Val Met Arg Leu Ile Gly Val Cys 395 400 405 410 Phe Gln Gly Ser Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala Pro Val Val Ile Leu 415 420 425 Pro Phe Met Lys His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg 430 435 440 Leu Gly Asp Gln Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln Met Leu Val Lys Phe 445 450 455 Met Ala Asp Ile Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu Ser Thr Lys Arg Phe 460 465 470 Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asn Glu Asn Met 475 480 485 490 Ser Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Asn Gly 495 500 505 Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys Trp Ile 510 515 520 Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys Ser Asp Val 525 530 535 Trp Ser Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala Thr Arg Gly Gln Thr 540 545 550 Pro Tyr Pro Gly Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr Asp Tyr Leu Arg Gln 555 560 565 570 Gly Asn Arg Leu Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu Asp Gly Leu Tyr Ala 575 580 585 Leu Met Ser Arg Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln Asp Arg Pro Ser Phe 590 595 600 Thr Glu Leu Arg Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys Ala Leu Pro Pro 605 610 615 Ala Gln Glu Pro Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn Met Asp Glu Gly Gly 620 625 630 Gly Tyr Pro Glu Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr 635 640 645 650 Gln Pro Asp Pro Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu Thr Ala Ala Glu Val 655 660 665 His Pro Ala Gly Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser Thr Thr Pro Ser Pro 670 675 680 Ala Gln Pro Ala Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala Pro Gly Gln Glu Asp 685 690 695 Gly Ala Asp Ser Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp His Thr Tyr Glu Gly 700 705 710 Leu Asp Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp Ile Val Thr Leu Arg 715 720 725 730 Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His Pro Gly Gln Glu 735 740 745

Claims (151)

  1. 단일 사슬 키메라 단백질(single chain chimeric protein)을 포함하는 키메라 포식작용 수용체 (CER)로서, 상기 단일 사슬 키메라 단백질은
    포스파티딜세린 (PtdSer)에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
    포식작용 신호전달 도메인; 및
    세포외 도메인과 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 막관통 도메인
    을 포함하는 키메라 포식작용 수용체 (CER).
  2. 제1항에 있어서, 결합 도메인은 PtdSer에 특이적인 scFv, 또는 Tim1, Tim4, Tim3, 스타빌린-2(stabilin-2), 후기 당화 최종산물 (RAGE)의 수용체, 뇌-특이적 혈관형성 억제제 1 (BAI1), 유지방구-EGF 인자 8 단백질 (MFG-E8), 성장 저지 특이적 6 (GAS6), 단백질 S, 단백질 C, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 베타 2-당단백질 I, α5β3 인테그린 및 다른 인테그린, CR3 보체 수용체, CR4 보체 수용체, CD14, CD93, 아넥신 V (annexin V), 포스파티딜세린 수용체 (PSr), 프로트롬빈, 또는 스캐빈저 수용체 (scavenger receptor)로부터의 PtdSer 결합 도메인을 포함하는, CER.
  3. 제2항에 있어서, 결합 도메인은 서열번호(SEQ ID NO:) 28의 아미노산 서열을 포함하는 TIM1 도메인, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 TIM4 도메인, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 Tim3 도메인, 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 FA58C2 도메인, 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 GAS6 도메인, 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 S 결합 도메인, 또는 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 BAI1 도메인을 포함하는, CER.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함하는, CER.
  5. 제4항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역(immunoglobulin hinge region), 1형 막 단백질의 세포외 영역, II형 C-렉틴의 스토크 영역 (stalk region), 면역글로불린 불변 도메인, 또는 이들의 단편을 포함하는, CER.
  6. 제5항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 또는 IgD 힌지 영역을 포함하는, CER.
  7. 제6항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함하는, CER.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은 Tim1, Tim4, Tim3, FcR, CD8a, CD28, MERTK, Axl, Tyro3, BAI1, CD4, DAP12, 또는 MRC1막관통 도메인을 포함하는, CER.
  9. 제8항에 있어서, 막관통 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 Tim1 막관통 도메인, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 Tim4 막관통 도메인, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FcγRI 막관통 도메인, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CD8a 막관통 도메인, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 막관통 도메인, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 막관통 도메인, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 막관통 도메인, 서열번호 68의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 142의 BAI1 막관통 도메인, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CD4 막관통 도메인, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 막관통 도메인, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 막관통 도메인, 또는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  10. 제8항에 있어서, FcR 막관통 도메인은 FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, 또는 FcαR1 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  12. 제11항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 ItgB5, MERTK, Tyro3, Axl, BAI1, ELMO, 또는 MRC1 신호전달 도메인인, CER.
  13. 제11항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 PI3K, Traf6, Syk, MyD88, Zap70, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, FcαR1, BAFF-R, DAP12, NFAM1, 또는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  14. 제12항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 신호전달 도메인, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 신호전달 도메인, 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 ItgB5 신호전달 도메인, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 신호전달 도메인, 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 BAI1 신호전달 도메인, 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 ELMO 신호전달 도메인, 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 신호전달 도메인인, CER.
  15. 제13항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 Traf6 신호전달 도메인, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 Syk 신호전달 도메인, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 절두된(truncated) MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 Zap70 신호전달 도메인, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR1 신호전달 도메인, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2A 신호전달 도메인, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2C 신호전달 도메인, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR3A 신호전달 도메인, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 신호전달 도메인, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 BAFF-R 신호전달 도메인, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 신호전달 도메인, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 NFAM1 신호전달 도메인, 또는 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  16. 제11항, 제12항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인에 의한 신호전달은 적어도 하나의 항-염증성 또는 면역억제성 사이토카인의 발현을 야기하는, CER.
  17. 제16항에 있어서, 항-염증성 또는 면역억제성 사이토카인은 TGF-β, IL-10, 또는 둘 모두인, CER.
  18. 제11항, 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인에 의한 신호전달은 적어도 하나의 염증성 사이토카인, 염증성 케모카인, 또는 공자극성 세포 표면 마커의 발현을 야기하는, CER.
  19. 제18항에 있어서, 염증성 사이토카인은 TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, 또는 IL-23이고; 염증성 케모카인은 CCL5 (RANTES), CXCL9, 또는 CXCL10이고; 공자극성 세포 표면 마커는 CD80, CD86, HLA-DR, CD40, HVEM, 또는 4-1BBL이거나; 이들의 임의의 조합인, CER.
  20. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 포식작용 신호전달 도메인은 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는, CER.
  21. 제20항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인이고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  22. 제20항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인이고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  23. 제20항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인이고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  24. 제20항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인이고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  25. 제21 또는 22항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인은 동일하거나 상이한, CER.
  26. 제21항, 제23항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 ItgB5, MERTK, Tyro3, Axl, BAI1, ELMO, 또는 MRC1 신호전달 도메인인, CER.
  27. 제26항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 신호전달 도메인, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 신호전달 도메인, 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 ItgB5 신호전달 도메인, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 신호전달 도메인, 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 BAI1 신호전달 도메인, 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 ELMO 신호전달 도메인, 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 신호전달 도메인인, CER.
  28. 제22항, 제23항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 PI3K, Traf6, Syk, MyD88, Zap70, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, FcαR1, BAFF-R, DAP12, NFAM1, 또는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  29. 제28항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 Traf6 신호전달 도메인, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 Syk 신호전달 도메인, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 Zap70 신호전달 도메인, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR1 신호전달 도메인, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2A 신호전달 도메인, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2C 신호전달 도메인, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR3A 신호전달 도메인, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 신호전달 도메인, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 BAFF-R 신호전달 도메인, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 신호전달 도메인, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 NFAM1 신호전달 도메인, 또는 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  30. 제1항에 있어서,
    결합 도메인은 Tim4 PtdSer 결합 도메인 및 FA58C2 PtdSer 결합 도메인으로부터 선택되고,
    막관통 도메인은 Tim4 막관통 도메인 및 CD28 막관통 도메인으로부터 선택되고,
    포식작용 신호전달 도메인은 MERTK 신호전달 도메인 및 SYK 신호전달 도메인으로부터 선택되고,
    세포외 도메인 선택적으로은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 포함하는, CER.
  31. 제30항에 있어서, Tim4 PtdSer 결합 도메인, Tim4 막관통 도메인, 및 MERTK 신호전달 도메인을 포함하는, CER.
  32. 제30항에 있어서, FA58C2 PtdSer 결합 도메인, 세포외 스페이서 도메인을 포함하고, 세포외 스페이서 도메인은 IgG4 힌지 영역, CD28 막관통 도메인, 및 MERTK 신호전달 도메인을 포함하는, CER.
  33. 제30항에 있어서, FA58C2 PtdSer 결합 도메인, 세포외 스페이서 도메인을 포함하고, 세포외 스페이서 도메인은 IgG4 힌지 영역, CD28 막관통 도메인, 및 SYK 신호전달 도메인을 포함하는, CER.
  34. 제30항 또는 제31항에 있어서, Tim4 PtdSer 결합 도메인은 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는, CER.
  35. 제30항 또는 제31항에 있어서, Tim4 막관통 도메인은 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는, CER.
  36. 제30항, 제31항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, MERTK 신호전달 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는, CER.
  37. 제31항에 있어서, 서열번호 71의 아미노산 서열 또는 서열번호 71의 아미노산 23 내지 776을 포함하는, CER.
  38. 제30항, 제32항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, FA58C2 PtdSer 결합 도메인은 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는, CER.
  39. 제30항, 제32항 및 제33항 중 어느 한 항에 있어서, CD28 막관통 도메인은 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는, CER.
  40. 제32 또는 33항에 있어서, IgG4 힌지 영역은 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는, CER.
  41. 제30항 또는 제33항에 있어서, SYK 신호전달 도메인은 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는, CER.
  42. 제32항에 있어서, 서열번호 75의 아미노산 서열 또는 서열번호 75의 아미노산 23 내지 699를 포함하는, CER.
  43. 제33항에 있어서, 서열번호 70의 아미노산 서열 또는 서열번호 70의 아미노산 23 내지 484를 포함하는, CER.
  44. 단일 사슬 키메라 단백질을 포함하는 키메라 포식작용 수용체 (CER)로서, 상기 단일 사슬 키메라 단백질은
    전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
    전염증성 포식작용 신호전달 도메인; 및
    세포외 도메인과 전염증성 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 막관통 도메인
    을 포함하는 CER.
  45. 제44항에 있어서, 전-포식작용 마커는 포스파티딜세린 (PtdSer), ICAM-3, 산화된 저 밀도 지질단백질, 칼레티쿨린 (calreticulin), 아넥신 I, 보체 C1q, 및 트롬보스폰딘 (thrombospondin)으로부터 선택되는, CER.
  46. 제45항에 있어서, PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하고, PtdSer에 특이적인 scFv, 또는 Tim1, Tim4, Tim3, 스타빌린-2, 후기 당화 최종산물 (RAGE)의 수용체, 뇌-특이적 혈관형성 억제제 1 (BAI1), 유지방구-EGF 인자 8 단백질 (MFG-E8), 성장 저지 특이적 6 (GAS6), 단백질 S, 단백질 C, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 베타 2-당단백질 I, α5β3 인테그린 및 다른 인테그린, CR3 보체 수용체, CR4 보체 수용체, CD14, CD93, 아넥신 V, 포스파티딜세린 수용체 (PSr), 프로트롬빈, 또는 스캐빈저 수용체로부터의 PtdSer 결합 도메인인, CER.
  47. 제44항에 있어서, 결합 도메인은 종양 항원에 특이적인 scFv인, CER.
  48. 제47항에 있어서, 종양 항원은 CD138, CD38, CD33, CD123, CD72, CD79a, CD79b, 메소텔린 (mesothelin), PSMA, BCMA, ROR1, MUC-16, L1CAM, CD22, CD19, CD20, CD23, CD24, CD37, CD30, CA125, CD56, c-Met, EGFR, GD-3, HPV E6, HPV E7, MUC-1, HER2, 엽산 수용체 α, CD97, CD171, CD179a, CD44v6, WT1, VEGF-α, VEGFR1, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-11Rα, PSA, FcRH5, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, TAG-72, CEA, 에프린 A2 (ephrin A2), 에프린 B2, 루이스 A 항원 (Lewis A antigen), 루이스 Y 항원, MAGE, MAGE-A1, RAGE-1, 엽산 수용체 β, EGFRviii, VEGFR-2, LGR5, SSX2, AKAP-4, FLT3, 푸코실 GM1, GM3, o-아세틸-GD2, 또는 GD2인, CER.
  49. 제44항에 있어서, 결합 도메인은 숙주에서 지속적인 감염을 달성할 수 있는 미생물의 항원에 특이적인 scFv인, CER.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함하는, CER.
  51. 제50항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역, 1형 막 단백질의 세포외 영역, II형 C-렉틴의 스토크 영역, 면역글로불린 불변 도메인, 또는 이들의 단편을 포함하는, CER.
  52. 제51항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 또는 IgD 힌지 영역을 포함하는, CER.
  53. 제52항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는변형된 IgG4 힌지 영역을 포함하는, CER.
  54. 제44항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은 Tim1, Tim4, Tim3, FcR, CD8a, CD28, MERTK, Axl, Tyro3, BAI1, CD4, MRC1, 또는 DAP12 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  55. 제54항에 있어서, 막관통 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 Tim1 막관통 도메인, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 Tim4 막관통 도메인, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FcγRI 막관통 도메인, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CD8a 막관통 도메인, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 막관통 도메인, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 막관통 도메인, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 막관통 도메인, 서열번호 68의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 142의 BAI1 막관통 도메인, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CD4 막관통 도메인, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 막관통 도메인, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 막관통 도메인, 또는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  56. 제54항에 있어서, FcR 막관통 도메인은 FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, 또는 FcαR1 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  57. 제44항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 PI3K, Traf6, Syk, MyD88, Zap70, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, FcαR1, BAFF-R, DAP12, NFAM1, 또는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  58. 제57항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 Traf6 신호전달 도메인, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 Syk 신호전달 도메인, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 Zap70 신호전달 도메인, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR1 신호전달 도메인, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2A 신호전달 도메인, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2C 신호전달 도메인, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR3A 신호전달 도메인, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 신호전달 도메인, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 BAFF-R 신호전달 도메인, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 신호전달 도메인, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 NFAM1 신호전달 도메인, 또는 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  59. 제44항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인에 의한 신호전달은 적어도 하나의 염증성 사이토카인, 염증성 케모카인, 또는 공자극성 세포 표면 마커의 발현을 야기하는, CER.
  60. 제59항에 있어서, 염증성 사이토카인은 TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, 또는 IL-23이고; 염증성 케모카인은 CCL5 (RANTES), CXCL9, 또는 CXCL10이고; 공자극성 세포 표면 마커는 CD80, CD86, HLA-DR, CD40, HVEM, 또는 4-1BBL이거나; 이들의 임의의 조합인, CER.
  61. 단일 사슬 키메라 단백질을 포함하는 키메라 포식작용 수용체 (CER)로서, 상기 단일 사슬 키메라 단백질은
    전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
    1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인; 및
    세포외 도메인과 1차 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고, 이를 연결하는 막관통 도메인
    을 포함하는, CER.
  62. 제61항에 있어서, 전-포식작용 마커는 포스파티딜세린 (PtdSer), ICAM-3, 산화된 저 밀도 지질단백질, 칼레티쿨린, 아넥신 I, 보체 C1q, 및 트롬보스폰딘으로부터 선택되는, CER.
  63. 제62항에 있어서, PtdSer에 결합하는 결합 도메인을 포함하고, PtdSer에 특이적인 scFv, 또는 Tim1, Tim4, Tim3, 스타빌린-2, 후기 당화 최종산물 (RAGE)의 수용체, 뇌-특이적 혈관형성 억제제 1 (BAI1), 유지방구-EGF 인자 8 단백질 (MFG-E8), 성장 저지 특이적 6 (GAS6), 단백질 S, 단백질 C, 인자 II, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 베타 2-당단백질 I, α5β3 인테그린 및 다른 인테그린, CR3 보체 수용체, CR4 보체 수용체, CD14, CD93, 아넥신 V, 포스파티딜세린 수용체 (PSr), 프로트롬빈, 또는 스캐빈저 수용체로부터의 PtdSer 결합 도메인인, CER.
  64. 제61항에 있어서, 결합 도메인은 종양 항원에 특이적인 scFv인, CER.
  65. 제64항에 있어서, 종양 항원은 CD138, CD38, CD33, CD123, CD72, Cd79a, CD79b, 메소텔린, PSMA, BCMA, ROR1, MUC-16, L1CAM, CD22, CD19, CD20, CD23, CD24, CD37, CD30, CA125, CD56, c-Met, EGFR, GD-3, HPV E6, HPV E7, MUC-1, HER2, 엽산 수용체 α, CD97, CD171, CD179a, CD44v6, WT1, VEGF-α, VEGFR1, IL-13Rα2, IL-13Rα1, IL-11Rα, PSA, FcRH5, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, TAG-72, CEA, 에프린 A2, 에프린 B2, 루이스 A 항원, 루이스 Y 항원, MAGE, MAGE-A1, RAGE-1, 엽산 수용체 β, EGFRviii, VEGFR-2, LGR5, SSX2, AKAP-4, FLT3, 푸코실 GM1, GM3, o-아세틸-GD2, 또는 GD2인, CER.
  66. 제61항에 있어서, 결합 도메인은 미생물 항원에 특이적인 scFv인, CER.
  67. 제61항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함하는, CER.
  68. 제67항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역, 1형 막 단백질의 세포외 영역, II형 C-렉틴의 스토크 영역, 면역글로불린 불변 도메인, 또는 이들의 단편을 포함하는, CER.
  69. 제68항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 또는 IgD 힌지 영역을 포함하는, CER.
  70. 제69항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함하는, CER.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은 Tim1, Tim4, Tim3, FcR, CD8a, CD28, MERTK, Axl, Tyro3, BAI1, CD4, MRC1, 또는 DAP12 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  72. 제71항에 있어서, 막관통 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 Tim1 막관통 도메인, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 Tim4 막관통 도메인, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FcγRI 막관통 도메인, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CD8a 막관통 도메인, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 막관통 도메인, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 막관통 도메인, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 막관통 도메인, 서열번호 68의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 142의 BAI1 막관통 도메인, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CD4 막관통 도메인, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 막관통 도메인, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 막관통 도메인, 또는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  73. 제71항에 있어서, FcR 막관통 도메인은 FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, 또는 FcαR1 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  74. 제61항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인이고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  75. 제61항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인이고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  76. 제61항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인이고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  77. 제61항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인은 전염증성 포식작용 신호전달 도메인이고, 2차 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  78. 제74항 또는 제75항에 있어서, 1차 포식작용 신호전달 도메인 및 2차 포식작용 신호전달 도메인은 동일하거나 상이한, CER.
  79. 제74항, 제76항, 제77항 및 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 ItgB5, MERTK, Tyro3, Axl, BAI1, ELMO, 또는 MRC1 신호전달 도메인인, CER.
  80. 제79항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 신호전달 도메인, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 신호전달 도메인, 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 ItgB5 신호전달 도메인, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 신호전달 도메인, 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 BAI1 신호전달 도메인, 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 ELMO 신호전달 도메인, 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 신호전달 도메인인, CER.
  81. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 PI3K, Traf6, Syk, MyD88, Zap70, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, FcαR1, BAFF-R, DAP12, NFAM1, 또는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  82. 제81항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 Traf6 신호전달 도메인, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 Syk 신호전달 도메인, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 Zap70 신호전달 도메인, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR1 신호전달 도메인, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2A 신호전달 도메인, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2C 신호전달 도메인, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR3A 신호전달 도메인, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 신호전달 도메인, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 BAFF-R 신호전달 도메인, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 신호전달 도메인, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 NFAM1 신호전달 도메인, 또는 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  83. 단일 사슬 키메라 단백질을 포함하는 키메라 포식작용 수용체 (CER)로서, 단일 사슬 키메라 단백질은
    전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 scFv을 포함하는 세포외 도메인;
    포식작용 신호전달 도메인; 및
    세포외 도메인과 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이를 연결하는 막관통 도메인
    을 포함하며,
    막관통 도메인 및 포식작용 신호전달 도메인은 각각 상이한 분자로부터 유래하는 CER.
  84. 제83항에 있어서, scFv는 포스파티딜세린 (PtdSer), ICAM-3, 산화된 저 밀도 지질단백질, 칼레티쿨린, 아넥신 I, 보체 C1q, 및 트롬보스폰딘으로부터 선택되는 전-포식작용 마커에 결합하는, CER.
  85. 제83항에 있어서, scFv은 종양 항원에 결합하는, CER.
  86. 제85항에 있어서, 종양 항원은 CD138, CD38, CD33, CD123, CD72, CD79a, CD79b, 메소텔린, PSMA, BCMA, ROR1, MUC-16, L1CAM, CD22, CD19, CD20, CD23, CD24, CD37, CD30, CA125, CD56, c-Met, EGFR, GD-3, HPV E6, HPV E7, MUC-1, HER2, 엽산 수용체 α, CD97, CD171, CD179a, CD44v6, WT1, VEGF-α, VEGFR1, IL-13Rα2, IL-11Rα, PSA, FcRH5, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, TAG-72, CEA, 에프린 A2, 에프린 B2, 루이스 A 항원, 루이스 Y 항원, MAGE, MAGE-A1, RAGE-1, 엽산 수용체 β, EGFRviii, VEGFR-2, LGR5, SSX2, AKAP-4, FLT3, 푸코실 GM1, o-아세틸 GD2, 또는 GD2인, CER.
  87. 제83항에 있어서, 결합 도메인은 미생물 항원에 특이적인 scFv인, CER.
  88. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는 세포외 스페이서 도메인을 추가로 포함하는, CER.
  89. 제88항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역, 1형 막 단백질의 세포외 영역, II형 C-렉틴의 스토크 영역, 면역글로불린 불변 도메인, 또는 이들의 단편을 포함하는, CER.
  90. 제89항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 또는 IgD 힌지 영역을 포함하는, CER.
  91. 제90항에 있어서, 세포외 스페이서 도메인은 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함하는, CER.
  92. 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은 Tim1, Tim4, Tim3, FcR, CD8a, CD28, MERTK, Axl, Tyro3, BAI1, CD4, MRC1, 또는 DAP12막관통 도메인을 포함하는, CER.
  93. 제92항에 있어서, 막관통 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 Tim1 막관통 도메인, 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 Tim4 막관통 도메인, 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 FcγRI 막관통 도메인, 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 CD8a 막관통 도메인, 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 막관통 도메인, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 막관통 도메인, 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 막관통 도메인, 서열번호 68의 CD28 막관통 도메인, 서열번호 142의 BAI1 막관통 도메인, 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 CD4 막관통 도메인, 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 막관통 도메인, 서열번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 막관통 도메인, 또는 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  94. 제92항에 있어서, FcR 막관통 도메인은 FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, 또는 FcαR1 막관통 도메인을 포함하는, CER.
  95. 제83항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 포식작용 신호전달 도메인은 항상성 포식작용 신호전달 도메인 또는 전염증성 포식작용 신호전달 도메인인, CER.
  96. 제95항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 ItgB5, MERTK, Tyro3, Axl, BAI1, ELMO, 또는 MRC1 신호전달 도메인인, CER.
  97. 제95항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 PI3K, Traf6, Syk, MyD88, Zap70, FcγR1, FcγR2A, FcγR2B2, FcγR2C, FcγR3A, FcεR1, FcαR1, BAFF-R, DAP12, NFAM1, 또는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  98. 제96항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 MERTK 신호전달 도메인, 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 Tyro3 신호전달 도메인, 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 ItgB5 신호전달 도메인, 서열번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 MRC1 신호전달 도메인, 서열번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 BAI1 신호전달 도메인, 서열번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 ELMO 신호전달 도메인, 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 Axl 신호전달 도메인인, CER.
  99. 제97항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 Traf6 신호전달 도메인, 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 Syk 신호전달 도메인, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 MyD88 신호전달 도메인, 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 Zap70 신호전달 도메인, 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR1 신호전달 도메인, 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2A 신호전달 도메인, 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR2C 신호전달 도메인, 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 FcγR3A 신호전달 도메인, 서열번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 FcεRIγ 신호전달 도메인, 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 BAFF-R 신호전달 도메인, 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 DAP12 신호전달 도메인, 서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 NFAM1 신호전달 도메인, 또는 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 CD79b 신호전달 도메인인, CER.
  100. 제95항, 제96항 및 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 항상성 포식작용 신호전달 도메인에 의한 신호전달은 항-염증성 또는 면역억제성 사이토카인 중의 적어도 하나의 발현을 야기하는, CER.
  101. 제100항에 있어서, 항-염증성 또는 면역억제성 사이토카인은 TGF-β, IL-10, 또는 둘 모두인, CER.
  102. 제95항, 제97항 및 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 전염증성 포식작용 신호전달 도메인에 의한 신호전달은 염증성 사이토카인, 염증성 케모카인, 또는 공자극성 세포 표면 마커 중의 적어도 하나의 발현을 야기하는, CER.
  103. 제102항에 있어서, 염증성 사이토카인은 TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, 또는 IL-23이고; 염증성 케모카인은 CCL5 (RANTES), CXCL9, 또는 CXCL10이고; 공자극성 세포 표면 마커는 CD80, CD86, HLA-DR, CD40, HVEM, 또는 4-1BBL이거나; 이들의 임의의 조합인, CER.
  104. 제83항에 있어서,
    CD19에 특이적인 scFv을 포함하는 결합 도메인 및 IgG4 힌지 영역을 포함하는 세포외 스페이서 도메인을 포함하는 세포외 도메인;
    MERTK 신호전달 도메인을 포함하는 포식작용 신호전달 도메인;
    세포외 도메인과 포식작용 신호전달 도메인 사이에 위치하고 이를 연결하는 CD28 막관통 도메인을 포함하는 막관통 도메인
    을 포함하고;
    세포외 스페이서 도메인은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치하는, CER.
  105. 제104항에 있어서, 서열번호 64의 아미노산 서열 또는 서열번호 64의 아미노산 23 내지 783을 포함하는, CER.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 따른 CER을 인코딩하는 핵산 분자.
  107. 제106항에 있어서, 적어도 하나의 작은 GTPase를 인코딩하는 서열를 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  108. 제107항에 있어서, 작은 GTPase는 Rac1, Rab5, Rab7, Rap1, RhoA, 또는 CDC42인, 핵산 분자.
  109. 제108항에 있어서, 작은 GTPase는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 Rac1, 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 Rab5, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 Rab7, 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 Rap1A, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 RhoA, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDC42, 또는 이들의 임의의 조합인, 핵산 분자.
  110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, IRES 서열, 푸린 절단 부위 서열, 또는 바이러스 2A 펩타이드 서열은 CER을 인코딩하는 서열과 작은 GTPase를 인코딩하는 서열 사이에 배치되는, 핵산 분자.
  111. 제106항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입 마커를 인코딩하는 서열, 자살 유전자 또는 둘 모두를 인코딩하는 서열을 추가로 포함하는, 핵산 분자.
  112. 제111항에 있어서, 형질도입 마커는 서열번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 EGFR 단백질인, 핵산 분자.
  113. 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  114. 제113항에 있어서, 벡터는 다중 시스트론 벡터(multicistronic vector)인, 벡터.
  115. 제113 또는 114항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터, 변형된 mRNA 벡터, 또는 전이인자-매개 유전자 전달 벡터인, 벡터.
  116. 제115항에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  117. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 따른 CER, 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 또는 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  118. 제117항에 있어서, 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 따른 적어도 2개의 상이한 CER을 포함하는, 숙주 세포.
  119. 제117 또는 118항에 있어서, 작은 GTPase를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함하는, 숙주 세포.
  120. 제119항에 있어서, CER 및 작은 GTPase는 동일한 벡터에 인코딩되는, 숙주 세포.
  121. 제119항에 있어서, CER 및 작은 GTPase는 별개의 벡터에 인코딩되는, 숙주 세포.
  122. 제119항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 작은 GTPase는 Rac1, Rab5, Rab7, Rap1, RhoA, 또는 CDC42인, 숙주 세포.
  123. 제122항에 있어서, 작은 GTPase는 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 Rac1, 서열번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 Rab5, 서열번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 Rab7, 서열번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 Rap1A, 서열번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 RhoA, 서열번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDC42, 또는 이들의 임의의 조합인, 숙주 세포.
  124. 제117항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 CD4+, CD8+, 나이브 (naive) (CD45 RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-), 중앙 기억 (CD45RO+, CD62L+, CD8+), 효과기 기억 (CD45RA+, CD45RO-, CCR7-, CD62L-, CD27-), 바이러스-특이적, 점막-연관 불변, γδ (gd), 자연 살해, 및 조직 상재 T 세포를 포함하는 T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 공통 림프구 전구체 세포를 포함하는 림프성 전구체 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포를 포함하는 항원 제시 세포, 골수성 전구체 세포, 또는 성숙 골수성 세포인, 숙주 세포.
  125. 제124항에 있어서, B 세포는 나이브 B 세포, 혈장 세포, 조절 B 세포, 변연부(marginal zone) B 세포, 여포성 B 세포, 림프형질세포양 세포, 형질아세포 세포, 또는 기억 B 세포인, 숙주 세포.
  126. 제117항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 인간 세포인, 숙주 세포.
  127. 제117항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, CER의 세포외 도메인이 전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 경우, 숙주 세포는 포식작용 활성을 나타내는, 숙주 세포.
  128. 제127항에 있어서, CER의 세포외 도메인이 전-포식작용 마커 또는 표적 항원에 결합하는 경우, 숙주 세포는 식작용 활성을 나타내는, 숙주 세포.
  129. 제117항 내지 제128항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 집단(population).
  130. 제129항에 있어서, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 림프성 전구체 세포, 항원 제시 세포(antigen presenting cell), 랑게르한스 세포, 골수성 전구체 세포, 성숙 골수성 세포, 또는 이들의 임의의 조합의 집단을 포함하는, 숙주 세포의 집단.
  131. 제129항 또는 제130항에 있어서, 숙주 세포의 집단은 농축 단계를 거치는, 숙주 세포의 집단.
  132. 제117항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 또는 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 또는 숙주 세포의 집단은 표적 세포에 대해 적어도 20의 식작용 지수를 나타내는, 숙주 세포, 또는 숙주 세포의 집단.
  133. 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제117항 내지 제128항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 또는 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 집단, 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  134. 암을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 따른 CER을 발현하도록 유전자 변형된 세포; 제117항 내지 제128항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 집단 또는 제133항의 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  135. 종양 항원의 과발현과 연관된 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 따른 CER을 발현하도록 유전자 변형된 세포; 제117항 내지 제128항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 집단 또는 제133항의 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  136. 자가면역 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 따른 CER을 발현하도록 유전자 변형된 세포; 제117항 내지 제128항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 집단 또는 제133항의 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  137. 대상체에서 감염성 질병을 치료하거나, 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 따른 CER을 발현하도록 유전자 변형된 세포; 제117항 내지 제128항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포, 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포의 집단 또는 제133항의 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  138. 제134항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형된 세포는 CD4+, CD8+, 나이브 (CD45 RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-), 중앙 기억 (CD45RO+, CD62L+, CD8+), 효과기 기억 (CD45RA+, CD45RO-, CCR7-, CD62L-, CD27-), 바이러스-특이적, 점막-연관 불변, γδ (gd), 자연 살해, 및 조직 상재(tissue resident) T 세포를 포함하는 T 세포, 자연 살해 세포, B 세포, 공통 림프구 전구체 세포를 포함하는 림프성 전구체 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포를 포함하는 항원 제시 세포, 골수성 전구체 세포, 또는 성숙 골수성 세포인, 방법.
  139. 제138항에 있어서, B 세포는 나이브 B 세포, 혈장 세포, 조절 B 세포, 변연부 B 세포, 여포성 B 세포, 림프형질세포양 세포, 형질아세포 세포, 또는 기억 B 세포인, 방법.
  140. 제138 또는 139항에 있어서, 유전자 변형된 세포는 자가 세포(autologous cell)인, 방법.
  141. 제138항 또는 제139항에 있어서, 유전자 변형된 세포는 동종이계 세포인, 방법.
  142. 암을 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  143. 종양 항원의 과발현과 연관된 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  144. 자가면역 질병, 장애 또는 바람직하지 않은 상태를 가진 대상체를 치료하는 방법으로서, 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  145. 대상체에서 감염성 질병을 치료하는 방법으로서, 제113항 내지 제116항 중 어느 한 항에 따른 벡터의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  146. 제142항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 작은 GTPase를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 2차 벡터를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  147. 제146항에 있어서, 작은 GTPase는 Rac1, Rab5, Rab7, Rap1, RhoA, 또는 CDC42인, 방법.
  148. 제134항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 변형된 세포, 숙주 세포의 집단, 약제학적 조성물, 또는 벡터는 대상체에 2차 치료제와 조합하여 투여되는, 방법.
  149. 제148항에 있어서, 2차 치료제는 항체, 방사선 요법, 화학치료제, 세포성 면역요법, 항생제, 항-진균 제제, 또는 항-바이러스 제제인, 방법.
  150. 제148항 또는 제149항에 있어서, CER은 2차 치료제의 투여 후 투여되는, 방법.
  151. 제148항 또는 제149항에 있어서, 2차 치료제는 치료 수준 이하의 투여량에서 투여되는, 방법.
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