TWI664190B - 人類化抗－ｔａｕ抗體 - Google Patents

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Abstract

本文提供特異性結合tau之經分離抗體或抗原結合片段，該抗體或片段包含具有本文所述之胺基酸序列之重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區。亦提供預防或治療個體之tau蛋白病變之方法，其包含向需要tau蛋白病變療法之人類投與一或多種如本文所述之抗體或片段，其中該等抗體或抗原結合片段係在可有效地預防或治療該tau蛋白病變之條件及量下投與。

Description

人類化抗-TAU抗體 相關申請案的交叉參考
本申請案根據35 U.S.C.§119(e)主張於2014年6月27日提出申請之美國第62/018,436號、於2014年11月17日提出申請之美國第62/080,903號及於2015年6月2日提出申請之美國第62/170,036號的優先權益，該等申請案全部內容之全文皆以引用方式併入本文中。
本發明係關於以下領域：結合至tau之人類化抗體及其抗原結合片段以及使用該等抗體治療tau蛋白病變之方法。具體而言，本發明係關於結合至tau之特異性表位且防止tau播散之人類化抗體及抗原結合片段。
Tau蛋白病變通常具有不可溶過度磷酸化tau蛋白在腦中之累積。超過20種不同神經退化病症之特徵在於某種程度之神經原纖維退化且可歸類為tau蛋白病變(Williams 2006)。原型tau蛋白病變(例如進行性核上性麻痺(PSP)及皮質基底核退化(CBD))之特徵在於tau內含物成為唯一或主要的中樞神經系統病灶。原型tau蛋白病變與在其他神經病理學特徵(如在阿茲海默氏病(Alzheimer's disease，AD)中發現之類澱粉β(Aβ)斑或在帕金森氏病(Parkinson's disease，PD)中發現之路易氏體(Lewy body))存在下發現tau聚集物的其他tau蛋白病變不同。在該等非原型tau蛋白病變中，更無法確定tau病狀是否代表原發性疾病驅動 力或其是否繼發於其他蛋白質錯誤摺疊及神經退化。
進行性核上性麻痺(PSP，亦稱為斯-裏-奧三氏症候群(Steele-Richardson-Olszewski syndrome))係進行性神經退化病症，其經估計之年發病率為5-7人/100,000人(Golbe 2014)。在US，疾病侵襲約20,000個個體。PSP頻率無明顯的地理、民族、性別或種族差異。PSP最初可呈現類似於其他腦病症(包括特發性帕金森氏病)之臨床症狀。出於此原因，有時會耽誤PSP之正確診斷，通常發生在臨床症狀最初發作後1至3年。症狀發作最經常出現在50歲至70歲之間，且儘管臨床病程可變，但自症狀發作時間之典型存活期為5至9年(Houghton,2007)。儘管臨床呈現存在異質性，但最常見且最初闡述之PSP症候群(現稱為理查森氏症候群(Richardson's Syndrome))存在導致跌倒之顯著的姿勢不穩及軸向剛度、導致視力範圍受損之核上性凝視麻痺、額葉-皮質下失智症及導致抽吸之吞嚥困難。疾病之病程為進行性及一律地致死性(Williams及Lees 2009)。
在病理學上，PSP之特徵在於tau蛋白之過度磷酸化不可溶聚集物在腦幹、小腦、基底神經節及大腦皮質之神經元及神經膠質中異常累積(Williams及Lees 2009)。在生命期間，PSP中tau聚集之程度及分佈與PSP症狀學密切相關(Schofield等人，2012)。闡述理查森氏症候群之國家神經病症研究院與進行性核上性麻痺學會(National Institute of Neurological Disorders and the Society for Progressive Supranuclear Palsy，NINDS-SPSP)研究準則可高度預測潛在PSP病狀(Litvan等人，1996)。各個腦區域中之神經元損失伴隨有由tau聚集物構成之神經原纖維纏結(NFT)。亦出現多發性神經遞質異常，包括影響特定多巴胺能、膽鹼、GABA能及去甲腎上腺素能系統之彼等。
當前尚無經批準用於PSP之治療(Stamelou等人，2010)。PSP之治療效力研究之消極結果排除推薦基於證據之標準療法(Boxer等人， 2014)。在任何有效的疾病改良或神經保護性療法不存在下，PSP代表迫切的尚未滿足之醫學需要。
阿茲海默氏病(AD)係常見的慢性進行性神經退化疾病，其中存在認知及行為功能之不可逆損失。該疾病可持續10年以上，自輕度症狀發展至極其嚴重的表現。認為AD折磨約10%之65歲以上之群體及超過30%之80歲以上之群體。阿茲海默氏病自身在病理學上呈現為細胞外類澱粉斑及細胞內神經原纖維纏結。神經原纖維纏結係由例如組裝成成對螺旋絲及直絲之微管結合蛋白tau構成。已表明，該等實體可在功能上相關，但類澱粉沈積促進病理性tau絲總成或反之亦然之機制尚不清楚。
tau蛋白病變之細胞內神經原纖維結構(神經原纖維纏結、營養不良性軸突及神經纖維網線)具有成對螺旋絲(PHF)。PHF之主要蛋白質亞單位係呈異常過度磷酸化形式之微管相關蛋白tau。具有神經原纖維變化之神經元發生退化，且此退化程度與受侵襲個體之失智症之程度直接相關。
已知具有含有微管相關蛋白tau之絲狀細胞內含物之其他tau蛋白病變包括匹克病(Pick’s disease，PiD)、統稱為與染色體17相關之伴有帕金森氏症(Parkinsonism)之額顳葉失智症(FTDP-17)之相關病症之群、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、拳擊手型失智症(DP)、傑茨曼-斯脫司勒-史茵克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease，GSSD)、路易氏體病、慢性創傷性腦病(CTE)及亨汀頓氏病(Huntington disease)。儘管該等疾病之病因、臨床症狀、病理性發現及絲狀細胞內含物之生物化學組成不同，但新出現的證據表明，參與正常細胞蛋白質聚集以形成各種絲狀內含物之機制係相當的。業內認為微管相關蛋白tau構象之最初變化用於起始絲總成之核或種子之產生，且為關鍵特徵之一。此過程可能 受正常蛋白質之翻譯後修飾、某些基因之突變或缺失及結合正常蛋白質且因此改變其構象之因子的影響。
作為本發明之一態樣，提供特異性結合tau之經分離抗體或抗原結合片段。抗體或片段包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，且VH及VL區中之每一者具有選自圖1及2中所示之胺基酸序列之序列。更具體而言，VL區可具有選自由SEQ ID NO：1、2、3及4組成之群之胺基酸序列[VK1、VK2、VK3及VK4]，且VH區可具有選自由SEQ ID NO：5、6、7及8組成之群之胺基酸序列[VH1、VH2、VH3及VH4]。在一些實施例中，VL區具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列[VK2]，且VH區具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列[VH1]。在一些實施例中，抗體包含Fc區，其可為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體，例如含有S241P鉸鏈穩定突變之人類IgG4。抗體可包含人類同型κ或其變體之輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體或片段係scFv或Fab。在一些實施例中，抗體或片段係人類化抗體或片段或嵌合抗體或片段。抗體或片段可係單株抗體。在一些實施例中，抗體或片段與HJ8.5競爭特異性結合至人類tau蛋白。在一些實施例中，抗體或片段以至少10-4M之平衡解離常數(Kd)結合人類tau蛋白。
作為本發明之另一態樣，提供具有複數個抗原結合區域之多特異性抗體或抗原結合片段。多特異性抗體或片段之至少一個抗原結合區域結合至人類tau蛋白。另一選擇為，提供具有兩個抗原結合區域之雙特異性抗體或抗原結合片段。雙特異性抗體或片段之抗原結合區域中之一者結合至人類tau蛋白。另一選擇為，提供其中抗體或抗原結合片段之一個臂與HJ8.5競爭特異性結合至人類tau蛋白之雙特異性抗體或抗原結合片段。另一選擇為，提供其中抗體或抗原結合片段之一個臂包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區之雙特異性抗體或抗原 結合片段，其中VH及VL區中之每一者具有選自圖1及2中所示之胺基酸序列之序列。
前述抗體或抗原結合片段中之任一者可進一步包含毒性有效負載，視情況藥物偶聯物或放射性核素。
作為本發明之另一態樣，提供經分離核酸分子，其編碼前述抗體或抗原結合片段中之任一者或圖1或2中所示之VH區或VL區。可提供包含此一核酸分子之載體(例如表現載體)。可提供包含此一載體之經分離宿主細胞。宿主細胞可係原核或真核細胞，例如哺乳動物細胞。
作為本發明之另一態樣，提供醫藥組合物。醫藥組合物包含前述抗體或抗原結合片段中之任一者或如本文所述之核酸分子及醫藥上可接受之載劑。
作為本發明之另一態樣，提供含有如圖1及2中所示輕鏈中之一者之序列的經分離胺基酸序列。另一選擇為或另外，提供含有如圖1及2中所示重鏈中之一者之序列的經分離胺基酸序列。
作為本發明之另一態樣，提供經分離人類化抗體或抗原結合片段，其特異性結合包含胺基酸序列DQGGYT(SEQ ID NO：9)之表位。抗體或抗原結合片段可含有來自供體抗體之VH及VL區之CDR。在一些實施例中，抗體包含Fc區，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體之Fc區。Fc區可為人類IgG4或其變體，此一人類IgG4含有S241P鉸鏈穩定突變。抗體可包含人類同型κ或其變體之輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體或片段係scFv或Fab。在一些實施例中，抗體或片段係人類化抗體或片段或嵌合抗體或片段。抗體或片段可係單株抗體。抗體或片段可係其中抗體或片段之一個臂特異性結合包含胺基酸序列DQGGYT(SEQ ID NO：9)之表位之雙特異性抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，提供免疫偶聯物，其包含連接至可檢測或治療部分之 前述抗體或片段中之一者。
作為另一態樣，提供經分離人類化抗體或抗原結合片段，其特異性結合包含胺基酸序列GYTMHQDQ(SEQ ID NO.10)之表位。抗體或片段可具有來自供體抗體之VH及VL區之CDR。在一些實施例中，抗體或片段包含Fc區，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體之Fc區。Fc區可為含有S241P鉸鏈穩定突變之人類IgG4及其變體。抗體可包含輕鏈恆定區。在一些實施例中，抗體或片段係scFv或Fab。亦提供雙特異性抗體或抗原結合片段，其中抗體之一個臂特異性結合包含胺基酸序列GYTMHQDQ(SEQ ID NO：10)之表位。在一些實施例中，免疫偶聯物包含連接至可檢測或治療部分之前述抗體或片段中之任一者。
作為本發明之另一態樣，提供預防或治療個體之tau蛋白病變之方法，其包含向需要tau蛋白病變療法之人類投與本文所述抗體或片段中之一或多者。抗體或抗原結合片段係在可有效地預防或治療tau蛋白病變之條件及量下投與。tau蛋白病變可係以下中之一或多者：阿茲海默氏病(AD)、進行性核上性麻痺(PSP)、皮質基底核退化(CBD)、匹克病(PiD)、統稱為與染色體17相關之伴有帕金森氏症之額顳葉失智症(FTDP-17)之相關病症之群、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、庫賈氏病(CJD)、拳擊手型失智症(DP)、傑茨曼-斯脫司勒-史茵克病(GSSD)、路易氏體病、慢性創傷性腦病(CTE)或亨汀頓氏病。
提供用於治療tau蛋白病變之方法，其包含向需要治療之個體投與抗-tau抗體或片段，其中抗體或抗原結合片段特異性結合tau且包含重鏈可變(VH)區及輕鏈可變(VL)區，其中VH及VL區中之每一者具有選自圖1及2中所示之胺基酸序列之序列，且抗體或片段係以約0.1mg/kg至約250mg/kg、另一選擇為約1mg/kg至約25mg/kg之劑量投與個體。在一些實施例中，抗體或片段具有包含選自由SEQ ID NO：1、 2、3及4組成之群之胺基酸序列之VL區[VK1、VK2、VK3及VK4]；另一選擇為或另外，抗體或片段具有包含選自由SEQ ID NO：5、6、7及8組成之群之胺基酸序列之VH區[VH1、VH2、VH3及VH4]。
圖1顯示鼠類HJ8.5抗體之可變區序列以及針對重鏈及輕鏈中之每一者之4條人類化變體序列(4條VH序列及4條VL/VK序列)。圖1顯示MuVL(SEQ ID NO：11)、VK1(SEQ ID NO：1)、VK2(SEQ ID NO：2)、VK3(SEQ ID NO：3)、VK4(SEQ ID NO：4)、MuVH(SEQ ID NO：12)、VH1(SEQ ID NO：5)、VH2(SEQ ID NO：6)、VH3(SEQ ID NO：7)、VH4(SEQ ID NO：8)的序列。
圖2A顯示重鏈VH1(SEQ ID NO：13)之人類化可變區及恆定區序列之序列。圖2B顯示重鏈VH2(SEQ ID NO：14)之人類化可變區序列及恆定區序列。圖2C顯示重鏈VH3(SEQ ID NO：15)之人類化可變區序列及恆定區序列。圖2D顯示重鏈VH4(SEQ ID NO：16)之人類化可變區序列及恆定區序列。可變重鏈移植至含有S241P鉸鏈穩定突變之人類IgG4之恆定重鏈。圖2E顯示輕鏈VL1(SEQ ID NO：17)之人類化可變區序列及恆定區序列。圖2F顯示輕鏈VL2(SEQ ID NO：18)之人類化可變區序列及恆定區序列。圖2G顯示輕鏈VL3(SEQ ID NO：19)之人類化可變區序列及恆定區序列。圖2H顯示輕鏈VL4(SEQ ID NO：20)之人類化可變區序列及恆定區序列。
圖3顯示經編碼VH及VK區之多核苷酸轉染之細胞的兩輪瞬時表現之表現數據。概述基於人類化重鏈及輕鏈可變區之不同組合之13個人類化抗tau抗體之結果，且觀察到不同的表現量。
圖4顯示以ELISA型格式評估本發明抗-tau抗體與原始鼠類HJ8.5(親代抗體)競爭結合至人類tau之能力之功效分析的數據。
圖5概述表面電漿子共振(SPR)分析之結果，該分析測定6個最佳 表現人類化構築體對人類tau之結合動力學。
圖6顯示在夾心式ELISA中四種人類化抗體變體與可溶性人類tau之結合。
圖7A至7H顯示人類化及對照抗體與來自野生型小鼠(陰性對照組織)、P301S小鼠(其表現具有P301S突變之人類tau且罹患年齡相關之tau病狀)及患有阿茲海默氏病或進行性核上性麻痺(PSP)之人類的組織之結合。圖7A.嵌合體(陽性對照)與小鼠及人類組織之結合；圖7B.非特異性人類IgG4(陰性對照)與小鼠及人類組織之結合。圖7C.VH1/VK2與小鼠及人類組織之結合。圖7D.VH1/VK3與小鼠及人類組織之結合。圖7E.VH2/VK2與小鼠及人類組織之結合。圖7F.VH2/VK3與小鼠及人類組織之結合。圖7G.VH3/VK2與小鼠及人類組織之結合。圖7H.VH3/VK3與小鼠及人類組織之結合。
圖8顯示鼠類抗體HJ8.5針對人類tau之胺基酸序列之表位定位。圖8顯示人類、恒河猴及小鼠tau序列(分別為SEQ ID NOs：21、22及23)。
圖9顯示HJ8.5及C2N-8E12之基於肽之詳細表位定位。該定位指示C2N-8E12之結合表位係25DQGGYT30(SEQ ID NO：9)且匹配鼠類親代HJ8.5之表位。圖9顯示肽PEP_2875800至PEP_2875830之序列(分別為SEQ ID NOs：24至54)。
圖10圖解說明不同的抗人類tau抗體與人類或恒河猴tau之結合結果。結果展示C2N-8E12及HJ8.5並不結合至恒河猴tau，而其的確顯示與人類tau之陽性結合。HJ8.7結合至人類及恒河猴tau二者。
圖11顯示人類化抗-tau抗體與患有多種tau蛋白病變之人類個體之CSF中之tau的結合。評估C2N-8E12與經診斷患有多種tau蛋白病變之個體之CSF樣品中之tau的結合。
存在充分實驗證據及生物原理以支持tau免疫療法策略作為抵抗神經退化之tau病狀之方式。首先，tau通常係高度可溶性、天然非摺疊細胞內蛋白質，因此細胞外抗體不可能影響tau之正常功能。第二，在人類及轉基因小鼠tau蛋白病變模型中，tau病狀之負荷與進行性神經元功能障礙、突觸損失及功能衰退相關。第三，在病理性條件下，tau變得錯誤摺疊且聚集至由病理性tau原纖維構成之神經元內神經原纖維纏結(NFT)中。在人類tau蛋白病變中，此病狀以疾病特異性模式自一個腦區域進展至另一個。實驗數據表明tau聚集物可自細胞擴散至細胞以誘導腦中之進一步tau聚集及tau病狀擴散。此數據表明在一個細胞中產生之聚集物釋放至細胞外空間中且可促進相鄰或所連接細胞中之聚集。最後，存在先前技術展示抗-tau抗體可預防或減緩攜載tau之突變人類形式之小鼠之腦中tau病狀的進展。
「人類化抗體」係已經修飾以在投與後降低非人類抗體誘發人類免疫反應之風險的抗體或其變體、衍生物、類似物或片段。如本文所使用，人類化抗體以免疫特異性方式結合至與非人類抗體(供體抗體)相同或相似之表位。在一些實施例中，人類化抗體包含實質上具有人類抗體之胺基酸序列的框架(FR)區及實質上具有非人類抗體之胺基酸序列的互補決定區(CDR)。術語「實質上」在CDR之背景下係指胺基酸序列與非人類抗體CDR之胺基酸序列至少80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的CDR。人類化抗體包含實質上所有的至少一個、且通常兩個可變結構域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或實質上所有的CDR區皆對應於非人類免疫球蛋白(即供體抗體)之彼等，且所有或實質上所有的框架區皆為人類免疫球蛋白共有序列之彼等。較佳地，人類化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)、通常人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。包含新穎框架區之人類化抗體提供於本發明中。
在一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及重鏈之至少可變結構域二者。抗體亦可包括重鏈之CH1區、鉸鏈區、CH2區、CH3區及CH4區。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅含有輕鏈之人類化可變結構域及/或人類化重鏈。
抗體可選自任一種類之免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，及任何同型(包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。人類化抗體可包含一個以上種類或同型之序列，且可使用業內熟知之技術選擇具體恆定結構域以優化期望效應功能。
抗體或其抗原結合片段選自由以下組成之群：二硫鍵連接之Fv、單株抗體、單鏈可變片段(scFv)、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙價抗體、人類化抗體、多特異性抗體、Fab(片段抗原結合)、雙特異性抗體、F(ab')2(雙重臂，其通常係藉由用胃蛋白酶裂解抗體製備之抗原結合片段)、Fab'(通常藉由溫和還原將F(ab’)2分裂成兩個抗原結合片段之結果)或Fv(抗原結合可變片段)。
術語「嵌合抗體」係指包含一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列及另一物種之恆定區序列的抗體，例如具有連接至人類恆定區之鼠類重鏈及輕鏈可變區之抗體。
「VH區」、「VL區」或「VK區」分別係指重鏈可變區(VH)、輕鏈λ可變區(VL)或輕鏈κ可變區(VK)。VH及VL區可進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。每一VH及VL由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端按下列順序佈置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG 1、IgG2、IgG 3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。
術語「框架」或「框架序列」係指可變區減去CDR後之保留序 列。由於可藉由不同系統確定CDR序列之準確界定，故框架序列之含義具有相應的不同解釋。六個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3及重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦在每一鏈上將輕鏈及重鏈上之框架區分成四個亞區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在未將具體亞區指定為FR1、FR2、FR3或FR4之情況下，以其他形式提及之框架區代表天然免疫球蛋白單鏈之可變區內的組合FR。FR代表四個亞區中之一者，且FRs代表構成框架區之四個亞區中之兩者或更多者。
先前已闡述(Jones等人、Verhoeyen等人、Riechmann等人)之許多人類化免疫球蛋白已包含與具體人類免疫球蛋白鏈之框架一致之框架、受體及三個來自非人類供體免疫球蛋白鏈之CDR。「人類化抗-tau」抗體係指自能夠結合tau之非人類(供體)抗體產生且該結合轉移至人類抗體(受體)之抗體。
術語「CDR」係指抗體可變序列內之互補決定區。對於可變區之每一者而言，在重鏈及輕鏈可變區之每一者中存在三個CDR，其命名為CDR1、CDR2及CDR3。所主張之本發明VH及VL/K區之CDR之胺基酸序列展示於圖1中。
如本文所使用，術語單鏈Fv(亦稱為單鏈抗體)係指經改造之抗體構築體，其係藉由分離結合抗體之結合結構域(重鏈及輕鏈二者)並供應允許保留結合功能之連接部分來製備。插入兩條鏈之間之連接體肽容許穩定可變結構域而不干擾正確摺疊及活性結合位點之產生。此連接體之長度可介於5個與30個胺基酸之間且通常係由「GGGGS」((Gly)4Ser)胺基酸序列(SEQ ID NO：55)重複組成。此實質上形成顯著縮短之抗體，其僅具有結合抗原所需之可變結構域。
雙價抗體、三價抗體及四價抗體及高次變體通常係藉由將上文 所提及連接體肽之長度自0個改變成若干個胺基酸來產生。變體係多價多特異性抗體，其中VH及VL結構域在多肽鏈上表現，但所用連鎖體太短以致不容許相同鏈上之兩個結構域之間配對，由此迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點(例如，參見Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2：1121-1123)。該等抗體結合部分為業內已知(Kontermann及Dubel編輯，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.第790頁(ISBN 3-540-41354-5)。另一選擇為，業內亦熟知可使用連接至可變結構域之自組裝單元來產生多價結合抗體變體。
雙特異性、三特異性或多特異性抗體係藉由組合一種抗體之重鏈及輕鏈與一或多種其他抗體之重鏈及輕鏈來產生。該等鏈可共價連接。例如，術語「雙特異性抗體」係指藉由以下技術產生之全長抗體：四源雜交瘤(quadroma)技術(參見Milstein及Cuello(1983)Nature 305(5934)：537-40)、兩種不同單株抗體之化學偶聯(參見Staerz等人，(1985)Nature 314(6012)：628-31)或在Fc區中引入突變之杵臼結構或類似方法(參見Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(14)：6444-6448)，從而產生多種不同的免疫球蛋白，其中僅一者係功能性雙特異性抗體。關於分子功能，雙特異性抗體在其兩個結合臂(一個HC/LC對)之一者上結合一種抗原(或表位)，且在其第二臂(不同HC/LC對)上結合不同抗原(或表位)。雙特異性抗體具有兩個不同的抗原結合臂(在特異性及CDR序列二者中)，且針對其結合之每一抗原為單價。
已使用業內已知之方法產生一系列能夠結合tau之鼠類抗體。參見Holtzman等人，WO2014/08404。另外，該等抗體已經篩選以鑑別出具有特定生物活性之抗體以可使其成為治療用途之適宜候選者。
在一態樣中，本發明提供複合人類化抗體。複合人類抗體TM技術係藉由以消除與潛在T細胞表位之結合的方式鑑別供體抗體及經改造抗體或抗原結合片段之可變區(V區)序列中之潛在T細胞表位來產生人類化抗體(參見EP2,388,871)。與使用單一人類輕鏈及重鏈V區框架或人類共有框架作為來自供體抗體(通常鼠類)之各別互補決定區(CDR)之輕鏈及重鏈「受體」的其他人類化技術不同，複合人類抗體TM包含源自多個不相關人類抗體之V區之多個序列區段(「複合物」)。
在確定認為對起始抗體之抗原結合至關重要之胺基酸後，選擇源自不相關人類V區之數據庫之序列區段。使用業內已知之電腦工具針對潛在CD4+ T細胞表位之存在過濾源自人類V區數據庫之所有所選序列區段。由於人類序列區段與起始抗體V區之所有部分的緊密擬合，故複合人類抗體TM保留優於標準人類化抗體之親和力及特異性。複合人類抗體TM缺失T細胞表位，且因此視為人類化及去免疫化二者。
在一實施例中，來自供體抗體之鼠類可變區替代人類受體IgG之人類可變區，產生嵌合抗體。
在另一實施例中，來自供體抗體之鼠類CDR序列替代人類受體IgG之CDR序列，產生人類化抗體。將其他變化納入人類化抗體中以移除認為對維持供體抗體之結合特徵至關重要之潛在T細胞表位及框架殘基。熟習此項技術者將得知可用於人類化抗體之其他方法，例如CDR移植。
在另一實施例中，能夠結合至人類tau之非人類抗體經人類化。
本發明抗體可展現與供體抗體相比改變的結合親和力及/或改變的免疫原性。在一些實施例中，嵌合或人類化抗體具有與供體抗體實質上相同之對tau表位之結合親和力。
在另一實施例中，基於如本文所述之人類化抗體(例如人類化抗- tau抗體)之單鏈可變片段可以單體形式結合。
在另一實施例中，使用抗體片段、藉由使用雙價抗體、三價抗體、四價抗體及其他可製備之高次變體可達成多價結合。
在另一實施例中，人類化抗-tau抗體之重鏈及輕鏈可與其他抗體之重鏈及輕鏈組合形成雙特異性抗體或其他額外多特異性抗體。
另外，本發明之人類化抗體(例如人類化抗-tau抗體)亦可呈抗體片段(例如Fab)、Fab’單體、F(ab)’2二聚體或完整免疫球蛋白分子形式。
在一實施例中，本發明提供由胺基酸序列DQGGYT(SEQ ID NO：9)組成之經分離肽。此肽係本文所述抗體(如C2N-8E12或HJ8.5)之核心表位。在本發明之一態樣中，該肽包括X(0-8)DQGGYTX(0-8)(SEQ ID NO：56)，其中X係任一胺基酸。儘管說明性實例顯示15聚體(參見圖11)，但熟習此項技術者將認識到本發明包括不同長度之肽。因此，本發明抗體或片段可特異性結合含有胺基酸序列DQGGYT(SEQ ID NO：9)之表位。該表位可為線性或構象表位且可長約6至22個胺基酸。
在其他實施例中，本發明方法係關於使用抗體或抗原結合片段治療tau蛋白病變，其中該抗體或片段係以一定劑量投與患有tau蛋白病變之個體。
抗體或抗原結合片段之適宜劑量可以mg藥物/kg個體體重來表示。抗體或抗原結合片段之適宜劑量包括至少約0.1mg/kg，另一選擇為約0.2mg/kg，另一選擇為約0.25mg/kg，另一選擇為約0.3mg/kg，另一選擇為約0.5mg/kg，另一選擇為約0.75mg/kg，另一選擇為約1mg/kg，另一選擇為約1.25mg/kg，另一選擇為約1.5mg/kg，另一選擇為約2mg/kg，另一選擇為約5mg/kg，另一選擇為約7.5mg/kg，另一選擇為約10mg/kg，另一選擇為約12.5mg/kg，另一選擇為約15 mg/kg，另一選擇為約20mg/kg，另一選擇為約25mg/kg，另一選擇為約30mg/kg，另一選擇為約50mg/kg，另一選擇為約100mg/kg。抗體或抗原結合片段之適宜劑量可為至多約250mg/kg，另一選擇為至多約200mg/kg，另一選擇為至多約175mg/kg，另一選擇為至多約150mg/kg，另一選擇為至多約125mg/kg，另一選擇為至多約100mg/kg，另一選擇為至多約75mg/kg，另一選擇為至多約50mg/kg，另一選擇為至多約25mg/kg，另一選擇為至多約20mg/kg，另一選擇為至多約15mg/kg。前述最小值及最大值中之任一者可一起定義範圍(例如，約0.1mg/kg至約250mg/kg)，只要該範圍之最小值小於該範圍之最大值即可。
抗體或抗原結合片段之適宜劑量可以mg投與個體之藥物來表示。人類化抗體或抗原結合片段之適宜劑量包括至少約2.5mg，另一選擇為至少約5mg，另一選擇為至少約10mg，另一選擇為至少約15mg，另一選擇為至少約20mg，另一選擇為至少約25mg，另一選擇為至少約30mg，另一選擇為至少約40mg，另一選擇為至少約50mg，另一選擇為至少約60mg，另一選擇為至少約70mg，另一選擇為至少約80mg，另一選擇為至少約90mg，另一選擇為至少約100mg，另一選擇為至少約125mg，另一選擇為至少約150mg，另一選擇為至少約175mg，另一選擇為至少約200mg，另一選擇為至少約250mg，另一選擇為至少約100mg，另一選擇為至少約125mg，另一選擇為至少約300mg。抗體或抗原結合片段之適宜劑量可為至多約2500mg，另一選擇為至多約2000mg，另一選擇為至多約1500mg，另一選擇為至多約1000mg，另一選擇為至多約750mg，另一選擇為至多約500mg，另一選擇為至多約400mg，另一選擇為至多約300mg，另一選擇為至多約275mg，另一選擇為至多約250mg，另一選擇為至多約200mg，另一選擇為至多約150mg。前述最小值及最大值 中之任一者可一起定義範圍(例如，約5mg至約2500mg)，只要該範圍之最小值小於該範圍之最大值即可。
C2N-8E12係人類化重組IgG4抗-人類tau抗體。C2N-8E12之IgG4骨架含有最小化半抗體之形成之S241P鉸鏈穩定突變。C2N-8E12結合至人類tau之胺基酸25-30(DQGGYT)(SEQ ID NO：9)，該序列存在於所有人類tau剪接變體以及tau之胺基端片段中。在來自tau蛋白病變之人類腦組織中，該抗體結合至單體tau及聚集tau。C2N-8E12高度穩定且具有極少聚集或降解。C2N-8E12之一般物理性質列示於表1中。
儘管已參照隨附實例闡述本發明，但應理解修改及變化形式涵蓋於本發明之精神及範疇內。此處之附屬物係本發明之說明性實例且其全文皆以引用方式併入本文中。
實例1
此實例闡述人類化鼠類抗-tau抗體HJ8.5之努力及結果。該等努力產生四個人類化輕鏈可變區(VL或VK)及四個人類化重鏈可變區(VH)。
人類化通常係指降低與使用非人類單株抗體相關之潛在免疫原性用於慢性治療之技術。兩種通常用於降低免疫原性之方法係CDR移植及去免疫化。使用由Antitope研發之方法對鼠類抗體HJ8.5實施去免疫化。
CDR移植係蛋白質改造方法。簡言之，其依賴於對抗體之基本架構之理解及其在物種間之保守性二者。鼠類及人類抗體共享常用/保 守架構。抗體結構分成恆定區及可變區。可變區可進一步分成所謂的框架區及CDR區。可觀察到可變區係由四個個框架(Fwk)及三個CDR構成。框架及CDR之佈置在輕鏈及重鏈可變結構域中相同。
在CDR移植中，用人類恆定區替代非人類恆定區，從而產生所謂的嵌合抗體。另外，使鼠類CDR區轉移至人類框架區中；所得可變結構域係人類框架及鼠類CDR之混合物。作為最後步驟，轉移多個認為在維持親和力方面起重要作用之鼠類框架殘基(未顯示)。
去免疫化：認為來自Antitope之複合人類抗體TM技術係與鑑別認為在結合中起作用之CDR及框架中之關鍵胺基酸二者結合使用之去免疫化技術。所得全人類化抗體保留起始單株抗體之結合親和力及特異性且亦不含CD4+ T細胞表位，此避免在人類中不期望之免疫原性。
複合人類抗體TM係藉由組合來自包含100,000條不相關全人類抗體可變區序列之Antitope數據庫的人類抗體序列之多個區段來產生。使用HJ8.5抗體之可變區序列之最初建模來鑑別對抗體結合至關重要之胺基酸，然後使用該等胺基酸來限制人類序列區段之選擇。然後使用兩種專有電腦技術(iTopeTM及TCEDTM)來分析個別序列區段及毗鄰區段之間之接合用於選擇不含CD4+ T細胞表位之全人類可變區序列。合成用於複合人類抗體之編碼可變區之DNA，將其選殖至具有人類恆定區之表現載體中且轉染至哺乳動物細胞中用於產生人類化抗體。
HJ8.5之人類化：使用Swiss PDB產生HJ8.5鼠類抗-Tau412抗體V區之結構模型並分析，以鑑別V區中可能為抗體之結合性質所必需之重要的「限制性」胺基酸。根據分析，多個限制性框架殘基鑑別為用於納入全人類化V區中之候選者。選擇人類可變區序列之區段以納入該等殘基中之一或多者。
選擇可用於產生全人類化HJ8.5抗體之初步人類序列區段集合， 且使用iTopeTM技術(用於電腦分析肽與人類II類MHC對偶基因之結合(Perry等人，2008))並使用已知抗體序列相關之T細胞表位之TCEDTM(T細胞表位數據庫)(Bryson等人，2010)來分析。丟棄鑑別為人類II類MHC之重要的非人類種系結合劑或針對TCEDTM評分為顯著命中之序列區段。亦分析序列區段之組合以確保區段之間之接合不含潛在的T細胞表位。然後組合所選區段來產生用於合成之重鏈及輕鏈V區序列。對於HJ8.5，設計且構築四條VH鏈及四條Vκ鏈。
圖1顯示鼠類HJ8.5抗體之可變區序列以及針對重鏈及輕鏈中之每一者之4條人類化變體序列(4條VH序列及4條VL/VK序列)。彼等四條VH鏈及四條Vκ鏈之胺基酸序列展示於圖1中。如由Kabat等人定義之CDR序列以紅色突出顯示(加下劃線)。自原始小鼠序列之框架變化以藍色及粗體突出顯示。
表B-1概述在重鏈及輕鏈可變結構域之每一變體中引入之框架變化之數量。
圖2顯示針對重鏈及輕鏈中之每一者之人類化可變區及恆定區序列之序列(4條VH序列及4條VL/VK序列)。可變重鏈移植至含有S241P 鉸鏈穩定突變之人類IgG4之恆定重鏈。可變輕鏈移植至人類κ輕鏈之恆定輕鏈。此表亦列示理論等電點(PI)及分子量(Mw)。
圖3顯示經編碼VH及VK區之多核苷酸轉染之細胞之2輪瞬時表現之表現數據。概述13個人類化抗tau抗體之結果。觀察到重鏈及輕鏈之不同組合產生顯著不同的表現量。在第1輪中，VH及VL區之所有變體彼此組合(僅顯示所測試16者中13者之結果)。在第2輪中，測試在第1輪中所觀察到之6個最佳表現組合。表現係以μg所量測抗體/mL培養基顯示。較高表現量有利，此乃因其表明抗體正確地摺疊，如所預期進行分泌，無毒性且通常較穩定。
圖4顯示功效分析之數據。為進一步表徵人類化抗-tau抗體變體，該功效分析以ELISA型格式評估抗體與原始鼠類HJ8.5(親代抗體)競爭結合至人類tau之能力。該分析格式涉及用人類tau包覆ELISA板且然後容許測試抗體以及生物素化HJ8.5競爭結合至tau。該分析使得能夠量測每一人類化抗體變體之相對IC50值。將IC50值正規化至嵌合HJ8.5之IC50值以確保在各板之間進行比較。此數據展示人類化過程尚未顯著改變人類化抗體與人類tau之結合。
實例2
此研究闡述使用Biacore T200來量測及比較基於HJ8.5之六個全人類化(上文實例1中所述之VH1/VK2、VH1/VK3、VH2/VK2、VH2/VK3、VH3/VK2及VH3/VK3)單株抗體及一個嵌合單株抗體與重組人類Tau-412蛋白之間之相互作用的結合特徵。此研究之目的係使用Biacore T200表面電漿子共振儀器進行Tau-412與該七個mAb之間之相互作用的高解析度動力學表徵。
將抗體儲存在4℃下。根據製造商之說明書將Tau-412儲存在-20℃下。重構後，立即將Tau-412溶液儲存在冰上且在24小時內使用。將重構Tau-412之等份在重構30分鐘內冷凍且儲存在-20℃下。
在Biacore T200評估軟體V1.1(Uppsala,Sweden)上運行Biacore儀器。除非說明，否則所有材料皆來自Biacore：Biacore預防性維持套組2 BR-1006-51
系列S CM5感測器晶片 BR-1006-68
胺偶合套組 BR-1000-50
10mM乙酸鹽，pH 4.5 BR-1003-51
HBS-EP運行緩衝液\ BR-1006-69
10mM甘胺酸-HCl，pH 1.5 BR-1003-54
10mM甘胺酸-HCl，pH 2.0 BR-1003-55
蛋白質A(Sigma) P6031
4M MgCl2六水合物(Sigma) M9272-500G
所有實驗皆係使用Biacore「wizard」軟體來研發。使用以下Biacore方法：固定；動力學/親和力；以及解吸附及消毒。
在運行任何樣品之前及在研究期間，實施系統檢查(Biacore預防性維持套組2)。所測試之所有系統(試劑幫浦、折射計、注射、雜訊、混合及緩衝液選擇器)皆合格，此指示該儀器係根據製造商設定之準則來運行。
在插入CM5/蛋白質A晶片後，引發系統且然後使用BIA正規化溶液(Biacore預防性維持套組2)正規化。在25℃下運行所有樣品，且在5℃下培育樣品架。將晶片添加至系統中且使用HBS-EP作為運行緩衝液。
將mAb以原樣儲存且稀釋至100nM用於所有固定(捕獲)運行。使用Milli-Q水自乾燥粉末重構抗原Tau-412至1mg/mL之最終濃度；實施進一步稀釋用於動力學運行。由試劑製造商提供用於濃度計算之Tau-412之質量及分子量(100μg/瓶及42.9kDa)。不向此溶液中添加載體蛋白。僅在需要時重構抗原之瓶且以其粉末形式儲存在-20℃下直至使用。重構後，立即將抗原溶液保持在冰上且在24小時內使用。
選擇使用蛋白質A之捕獲分析用於此研究。蛋白質A表面之性能優於亦經測試之抗-人類蛋白質A/G、蛋白質G及蛋白質L表面。經由使用標準胺偶合化學固定來製備蛋白質A晶片。在CM5系列S感測器晶片(Biacore)上，在10mM乙酸鹽緩衝液(pH 4.5)中，以5μg/mL之蛋白質濃度實施固定，達到500RU之目標反應量。
蛋白質A晶片「All」之最終反應量及指定Fc顯示於表G-1中。
對於動力學實驗，需要限制經固定/捕獲之配體之量以避免晶片表面上之質量轉移效應。對於動力學實驗，表面應理想地具有50-100RU之最大分析物結合量(Rmax)。因此，使用等式1計算欲固定配體之量：
使用分析物Tau-412之42.9kDa之平均MW(由試劑製造商提供)、配體之150kDa(針對抗體之估計值)(mAb)、100RU之Rmax及化學計量(Sm)1，設定300RU之目標用於捕獲所有試驗抗體。在該研究內獲得之捕獲量自約280-400RU變化。對於第二及第三運行，調節所注射抗體之量以接近期望300RU捕獲量。
非特異性結合可歸因於與配體(非特異性且難以檢測)、捕獲蛋白或感測器晶片表面相互作用之分析物或分析物污染物。藉由分析以相 對較高之濃度(40nM)300秒注射Tau-412後空白Fc1表面之反應，對羧基-葡聚糖表面或蛋白質A捕獲表面未觀察到NSB。在Tau-412濃度>100nM下，對羧基-葡聚糖晶片表面觀察到顯著NSB；然而，此範圍內之濃度並非後續動力學分析所需。
實施再生探測且嵌合及VH1/VK2抗體在蛋白質A表面上再生之最佳條件如下。三次240秒注射10mM甘胺酸-HCl(pH 1.7)，然後一次300秒注射4M MgCl2，其皆以40μL/min進行。在最後一次再生注射後引入600秒等待步驟以容許表面在起始下一結合循環之前穩定。
不與最初測試一樣實施緩衝液探測，指示所選緩衝液「HBS-EP」產生適用於動力學分析之可再生系統。
藉由在動力學運行起始、中間及結束時重複控制注射2.5nM Tau-412來分析表面之性能。在整個動力學運行中觀察到穩定結合，此突出顯示了該系統用於動力學分析之適宜性。
當締合速率含有與分析物傳送到晶片表面及自晶片表面傳送之速率相關之重要組份時，出現質量傳送限制。當發現質量轉移顯著時，所得動力學分析可能不準確。減小經固定配體之密度或增加流速可減少質量傳送限制。根據使用低密度表面及類似Mw抗原之先前經驗，選擇40μL/min之流速用於此研究。
使用相關反應控制實驗來評價配體-分析物相互作用以檢查與1：1結合模型之偏差。經不同時間段(接觸時間)將分析物注射在表面上且分析解離速率以確定其是否隨接觸時間而變化。若觀察到此一關係，則其指示在表面上產生穩定複合物之最初結合事件後發生第二相互作用事件。
根據使用捕獲分析格式之先前經驗，1.5之表觀結合化學計量以及可在信任所得動力學數據之情況下擬合1：1模型，不實施相關反應控制，此乃因無額外證據支持更複雜的動力學相互作用。
使用1：1結合模型來擬合所得動力學數據(等式2)。由於所捕獲抗體量之變化，將參數Rmax設定為局部，此與用於每一抗體動力學分析之整體分析相反。
抗體表徵：對蛋白質A捕獲表面實施之表徵及對照實驗表明此係適於測定Tau-412相互作用之動力學值之系統。藉由將飽和濃度之Tau-412(1000nM)注射在試驗蛋白質A表面上之277RU之經捕獲VH1/VK2上來評價結合化學計量。1000nM Tau-412之兩次依序注射似乎引起在122RU下之飽和結合。此使得結合化學計量為150%，其高於對一個抗體分子與一個Tau-412分子之結合所預期之結合化學計量。此之原因可包括在晶片表面上抗體與兩個Tau-412分子之結合或Tau-412寡聚化。
在40μL/min之流速下獲得動力學數據以最小化任何潛在質量轉移效應。將空白(無抗原)及2.5nM濃度之分析物之兩個重複程式化至動力學運行中以檢查表面及分析物二者在動力學循環中之穩定性。對於最初動力學運行，運行Tau-412自40nM至0.156nM之2倍稀釋物。對於動力學分析及在後續運行時，選擇20nM至0.625nM之分析物範圍。此範圍涵蓋高於及低於所報告KD二者之多個分析物濃度。
持續500秒監測締合期以容許一些高濃度分析物達到穩態。為在動力學循環之解離期期間觀察到足夠的信號減少(>10%)，持續1200秒量測解離。如部分5中所論述，容許Fc在每一再生步驟後穩定600秒。自Fc2、Fc3及Fc4之信號減去參考通道Fc1之信號。
如在Biacore T200上使用蛋白質A捕獲系統量測之Tau-412與7種mAb之相互作用之動力學參數顯示於表F-2中。為校正每一結合循環之間抗體之捕獲量，在1：1結合模型中使用局部Rmax參數。在三次獨立 運行中使用Tau-412及抗體之新鮮製劑實施動力學分析。運行1及運行2+3使用不同瓶之抗原Tau-412；因此與平均反應相關之所報告誤差可能代表分析物製劑之變化及分析設置及運行之差異。自運行1至運行2+3，調節所注射抗體之量以嘗試接近目標300RU捕獲量。對於運行1，以一式三份運行嵌合抗體且所有三個數據集合之分析顯示於表F-2中。源自該三個數據集合之KD之CV%為4.3%，此指示該等結果在分析可變性內。
Chi2值顯示締合及解離數據與所提出1：1結合模型擬合之程度-值越小，擬合越好。用於速率常數之相關SE值代表與將數據擬合至所述模型相關之不確定性，且並不代表真實動力學值之總體不確定性。平均反應數據代表2個或3個獨立分析之平均動力學值及相關SD。
使用表F-2之平均KD值，可基於親和力將抗體分級如下：VH3/VK2>VH3/VK3>嵌合>VH2/VK3>VH1/VK3>VH1/VK2>VH2/VK2。與平均動力學參數相關之CV%介於10%-20%範圍內，且因此所有抗體可能具有極類似之親和力且差異僅歸因於分析變化。一般而言，抗體之間之結合差異可歸因於分析變化，且認為人類化抗體與嵌合抗體相比KD值不存在顯著差異。
顯示用於抗體與Tau-412之間之相互作用之Biacore T200上使用蛋白質A捕獲分析測定之動力學值的比較。嵌合抗體似乎展示與人類化抗體相比時顯著不同的結合曲線，但親和力類似。顯示所測試抗體與Tau-412相互作用之相對動力學值的kd對ka圖，如在Biacore T200上使用蛋白質A捕獲分析所測定。虛對角線代表等親和力線。應注意軸線展示不同的數據範圍，目的係改良圖上人類化抗體之清晰度。
圖5概述表面電漿子共振(SPR)分析之結果，該分析測定6種最佳表現人類化構築體對人類tau之結合動力學。將測試抗體與不同濃度之人類tau一起固定在SPR晶片上，然後容許流經晶片。基於所量測結合事件計算每一變體之締合及解離速率以及親和力。亦測試嵌合變體。
實例3
圖6顯示在夾心式ELISA中四種人類化抗體變體與可溶性人類tau之結合。依賴於被動吸附之分析方法可產生人工結合結果。為克服此可能性，採用基於溶液之方法來量測人類化抗體變體之結合活性。在 此分析格式中，藉由識別與HJ8.5不同之表位之單株抗-人類tau抗體捕獲抗原(人類tau)。人類化抗-tau抗體與所捕獲人類tau之後續結合取決於抗原濃度，而IgG4同型對照根本不顯示結合。此分析展示人類化抗-tau抗體與人類tau之結合具有特異性且該等抗體結合至可溶性人類tau。
實例4
圖7(A-H)顯示人類化及對照抗體與來自野生型小鼠(陰性對照組織)、P301S小鼠(其表現具有P301S突變之人類tau且罹患年齡相關之tau病狀)及患有阿茲海默氏病或進行性核上性麻痺(PSP)之人類的組織之結合。此研究之目的係確認與HJ8.5之嵌合形式相比人類化抗體保留與組織中之聚集tau結合之能力。各圖顯示用不同的人類化HJ8.5抗體變體對人類及小鼠腦染色之代表性影像。測試4月齡及9月齡之P301S小鼠，且兩個時間點皆顯示tau之病理性聚集物，其中9月齡小鼠具有多於4月齡小鼠之tau病狀。對於人類染色，檢查來自一個PSP個體之腦組織的樣品及來自一個AD個體之腦組織的樣品。圖7A圖解說明用嵌合HJ8.5對小鼠及人類AD組織染色。圖7B圖解說明用陰性對照抗體(非特異性人類IgG4)染色。圖7C-7H圖解說明用六種人類化抗體染色。鼠類HJ8.5抗體之所有人類化變體皆結合至在P301S小鼠腦中發現之tau聚集物以及在經診斷患有AD或PSP之個體之腦組織中發現的tau聚集物。
實例5
圖8顯示在人類tau中HJ8.5之表位。使用酵母展示定位該表位。對於此方法，使用酵母表現涵蓋人類tau之序列之多個肽。藉由免疫螢光量測培養物中HJ8.5抗體與酵母之結合。觀察到與酵母之結合、表現包括前34個胺基酸之tau變體，但若酵母僅表現tau之前32個胺基酸則無結合。此表明表位在前34個胺基酸內。另外，HJ8.5在肽包括 胺基酸27-135時結合，但在肽跨越胺基酸30-135時不結合。此表明表位包括大於胺基酸27之胺基酸。基於此數據，表位含於人類tau之27-34序列(GYTMHQDQ)(SEQ ID NO：10)內。圖8亦顯示恒河猴及小鼠tau序列且以紅色突出顯示與人類tau之胺基酸變化。
圖9更詳細顯示HJ8.5及C2N-8E12之基於肽之表位定位。產生跨越人類tau之完整序列(IN4R，412個胺基酸)之線性15聚體之肽文庫。另外，亦產生該等肽之其中胺基酸10及11變成丙胺酸之雙丙胺酸形式。對於雙丙胺酸文庫，位置10或11處之任何天然丙胺酸突變成甘胺酸。將所有肽點至肽陣列上，且然後用HJ8.5或C2N-8E12探測並量測結合。使用該等肽陣列可靠地定位兩種抗體之tau結合表位。C2N-8E12之結合表位係25DQGGYT30(SEQ ID NO：9)且匹配鼠類親代HJ8.5之表位。當表位中之胺基酸D、Q、Y或T經丙胺酸替代時，HJ8.5及C2N-8E12與tau肽之結合嚴重受損，此表明該等胺基酸在抗體結合中起重要作用。然而，當表位中之中心兩個甘胺酸經丙胺酸替代時，抗體與tau肽之結合並未嚴重受損(PEP 2875811)。此可能並不指示該等胺基酸對結合不重要，而是歸因於丙胺酸與甘胺酸胺基酸之間取代之保守性。使用該等更詳細方法定位之表位稍不同於使用酵母展示定位之表位(圖8)。此差異歸因於結合分析之差異，其中在酵母展示系統上使用較大肽。認為15聚體肽陣列方法優於酵母展示方法。
實例6
圖10圖解說明不同的抗人類tau抗體與人類或恒河猴tau之結合結果。測試鼠類抗人類tau抗體HJ8.5及HJ8.7及人類化變體VH1/VK2(亦稱為C2N-8E12)。圖8顯示在所主張結合表位序列GYTM(H/L)QDQ(SEQ ID NO：57)中，人類與恒河猴tau之間在位置32處之單一胺基酸差異。圖8顯示在所主張結合表位序列DQ(G/E)GYT(SEQ ID NO：58)中，人類與恒河猴tau之間在位置27處之單一胺基酸差異。為確定兩 種tau之間該等胺基酸差異是否影響抗體HJ8.5/C2N-8E12結合之能力，實施以下實驗。藉由用不同濃度之人類或恒河猴tau包覆96孔ELISA板來量測C2N-8E12、HJ8.5(C2N-8E12之鼠類前體)及HJ8.7(結合至tau之表位之鼠類抗-人類tau抗體，其中人類及恒河猴胺基酸序列為100%保守)與人類及恒河猴tau之結合。結果展示C2N-8E12及HJ8.5不與恒河猴tau結合，而其的確顯示與人類tau之陽性結合。如所預期，HJ8.7結合至人類及恒河猴tau二者。
實例7
圖11顯示人類化抗-tau抗體與患有多種tau蛋白病變之人類個體之CSF中之tau的結合。評估C2N-8E12與經診斷患有多種tau蛋白病變之個體以及年齡匹配及年輕正常對照個體之CSF樣品中之tau的結合。使用夾心ELISA來展示C2N-8E12與患有AD、CBD、FTD或PSP之個體以及年齡匹配及年輕人/成年人對照之人類CSF中之tau的結合。使用C2N-8E12作為包覆抗體以捕獲CSF樣品中之tau。使用生物素化鼠類單株tau抗體HJ8.7作為檢測抗體。經對照人類IgG4包覆之孔用作實驗之陰性對照。觀察到來自經C2N-8E12包覆之孔與經IgG4包覆之對照孔之信號之較大差異，此展示C2N-8E12與人類CSF樣品中之tau之特異性結合。藉由納入標準曲線(重組tau)，可獲得該等CSF樣品中關於tau濃度之定量資訊。
實例8
此研究係欲在高達十(10)個中心進行之隨機化、雙盲、安慰劑對照、單一升序劑量(SAD)1期研究。其經設計以評估單一劑量投與C2N-8E12之安全性、耐受性、免疫原性及PK，且確立用於將來重複投藥研究之MTD。
此研究之主要目標係確定在患有PSP之個體中單一劑量之C2N-8E12之安全性耐受性、免疫原性及最大耐受劑量(MTD)。安全性評價 將包括物理及神經病症檢查、臨床安全性實驗室研究、免疫原性、不良事件、生命體徵及合併用藥審查。
次要目標係確定：單一劑量全身性藥物動力學，包括單一輸注後之最大血漿濃度；單一輸注後之曲線下面積(AUC)；輸注後達成最大濃度之時間；C2N-8E12之末端半衰期；C2N-8E12於腦脊液(CSF)中之分配；及經由量測血液及CSF中之可溶性tau含量的生物靶接合以及評價C2N-8E12-tau複合物之存在。
此研究意欲使32個患有PSP之個體入選(24個於治療臂中且8個於安慰劑臂中)。個體將入選8組4患者中，其中將每一組中之一個患者隨機化至安慰劑且3個隨機化至當前估計之MTD。若出現DLT則可使其他個體入選。然而，在劑量遞增過程期間不可省略劑量。
如統計學設計部分所述使用劑量遞增之連續再評價方法(CRM)。使用邏輯模型來鑑別因劑量所致之DLT之可能性。
將C2N-8E12以於單次使用瓶中之冷凍液體形式以20mg/mL之標稱濃度運輸至臨床現場。每一瓶含有300mg C2N-8E12且必須冷凍儲存在-70℃至-80℃下。
患者將經歷篩選以評價是否符合納入及排除準則。篩選亦將包括評價血液及CSF以及MRI。在投藥當天(第0天)，經由IV線投與單一劑量之C2N-8E12，且在臨床設備下嚴密監測個體達劑量投與後24小時。此包括用於安全性及PK評價之血液樣品。在隨後3天期間以及在輸注後一週及兩週時，進行其他臨床檢查及血液取樣。在輸注後4天時實施另一安全性MRI及CSF取樣。每28天對個體進行隨訪，自投藥日起持續不少於兩個月(例如第56天)。此後，繼續每月量測直至早期發生以下事件中之任一者：(i)在血液中無法再檢測到C2N-8E12；(ii)贊助商確定研究完成；(iii)個體決定提前中斷研究之參與。
1期研究之目標包括確立如藉由安全性評估評價之MTD，該等安 全性評估包括臨床實驗室測試、物理及神經病症檢查以及不良事件之發生，以確定用於評估後續2期/MAD研究所建議之劑量範圍。隨機指派個體及納入安慰劑臂避免偏倚且增加已知及未知風險因子二者在治療組之間均勻分佈之可能性。
數據安全性監測委員會(DSMC)將在持續基礎上審查安全性數據。安全性監測委員會將最少包含兩個獨立醫師、一個生物統計學家、一個PSP資深醫師及一個來自贊助商之非表決成員。在任一個別研究中使個體經受SAE，將審查個體之所有可獲得之安全性數據以確定該事件是否符合DLT之定義及是否已確立MTD。若尚未確立MTD且患者入選繼續，則DSMC將向贊助商提供建議是否需要任何其他活動或方案修正來確保後續所入選患者之安全性。贊助商將對研究之任何修正或初步終止作出最終決定。
劑量限制性毒性定義為：(i)根據風濕病學常見毒性準則v2之任何3級或更高AE，其中存在C2N-8E12導致該事件之合理可能性；(ii)在認為在臨床上顯著之神經系統及精神病學病症之NCI常見不良事件術語準則v4.0.(CTCAE)系統器官類別中的任何2級AE，且其中存在C2N-8E12導致該事件之合理可能性；或(iii)在C2N-8E12輸注期間或完成輸注後24小時內發生之任何輸注相關之毒性(例如過敏反應/超敏反應)，其無法藉由降低輸注速率及/或支持性護理迅速解決。
劑量遞增：藉由以下規則管控個體至劑量隊列之指派：(1)在每一組4患者內，將1個患者分派至安慰劑臂；(2)需要至少3個患者在遞增至較高劑量值之前之劑量值下的完全毒性資訊；(3)自一個隊列遞增至下一隊列之最大增量為1個劑量值；且(4)應在MTD劑量值下向至少12個個體(3組)投藥。
在每一4患者隊列中，依序向患者投藥，且連續個體投藥之間之最小間隔為至少兩天，以提供安全性保證之另一量度。
將第一隊列分派至d 1 。在獲得每一隊列之完全毒性資訊後對統計學模型進行升級。根據規則，獲得最新隊列之所有個體之完全資訊之前可使一個額外隊列入選。在使下一隊列入選及隨機化之前容許不超過3個患者之不完全毒性數據。
將每一後續隊列指派至根據上述定義估計為MTD之劑量。在緩慢增長之事件中，該模型可隨每一患者入選及投藥至當前估計之MTD之每一後續患者而升級。
研究群體：此研究將使患有進行性核上性麻痺(PSP)之50歲至85歲之男性及女性個體入選。
納入準則：關於研究中之納入，每一個體必須願意且能夠提供書面知情同意書。在開始治療方案之前，確認每一個體能夠提供關於治療方案之知情同意書。邀請個體參與研究，且在簽署書面知情同意書後進行篩選程序。若個體無法滿足納入準則或符合任一排除準則，則個體將無法入選篩選評價或治療方案中。
每一個體必須符合以下準則以入選此研究：男性或女性；年齡介於50歲與85歲之間；符合根據NNIPPS及AL-108-231臨床試驗修改之NINDS-SPSP可能或大概準則，其包括：(d)核上性凝視麻痺或眼跳速度減小，(ii)步態不穩定或在症狀之前3年內跌倒；篩選時腦MRI與PSP一致(<4次微出血且無大型中風或重度白質疾病)；在PSP等級量表上之評分介於20與50之間；能夠提供基線參與之書面知情同意書，或若無法提供書面知情同意書則可提供對參與之同意且具有經授權可提供知情同意書之醫藥代表；具有每週至少5小時看到患者，可伴隨患者訪視且同意參與研究之研究伴侶；容許其他同步非生物療法但劑量必須在入選前至少30天內穩定；能夠以最少幫助行走5步(一個臂穩定或使用手杖/助行器)；在篩選前至少2個月針對帕金森氏症穩定用藥；包括左旋多巴(levodopa)、多巴胺(dopamine)激動劑、雷沙 吉蘭(rasagaline)、COMT抑制劑、金剛烷胺(amantadine)、美金剛(memantine)或膽鹼酯酶抑制劑；同意在4-18個月內多達3次腰椎穿刺術，若個體將參與1期/SAD研究及2期/MAD研究二者則多達6次腰椎穿刺術；簽署且註明自個體獲得之書面知情同意書之日期；同意使用方案指定之避孕方法(參見下文)。
符合以下準則中之任一者之個體將自研究排除：較佳符合除PSP外之神經病症類型之準則之進行性神經病症的標誌，包括：(a)符合可能的阿茲海默氏病之準則或(b)符合路易氏體型帕金森氏失智症、多系統萎縮症(MSA)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)之研究準則；在篩選5年內之任何惡性病(除非轉移性皮膚基底細胞癌外)；基於研究者之專業判斷，在篩選時臨床上顯著之腎或肝功能障礙；基於研究者之專業判斷，在研究進入前三個月內臨床上顯著之心血管事件；基於研究者之專業判斷，在篩選期間臨床上顯著之異常血液學或化學實驗室測試結果；已出於任何原因在最後90天內接受任何先前單株抗體療法或在先前30天或5個半衰期內(以較長者為準)接受任何其他研究性藥劑。先前投與C2N-8E12並不適用於此排除準則，且因此並不取消個體參與2期/MAD研究之資格；當前處於任何其他生物或免疫調節療法；疾病持續時間自症狀發作起超過5年；在篩選MRI掃描時中腦體積>8,600mm3；處於專業護理或失智症護理設備下之個體；在檢查時具有運動神經元疾病之明確證據，與ALS病狀(此已闡述於具有CBS呈現之C90RF72載體中)一致；基於研究者之專業判斷，可解釋認知缺陷之任何其他顯著不相關之神經或精神病學病症(例如活動性癲癇發作、中風、血管型失智症)之診斷；基於臨床判斷及GDS之結果，在基線評估時未經治療之嚴重抑鬱症；其他嚴重精神病學疾病史；任何先前自殺企圖史；如藉由MMSE評價之研究者認為將排除結果量測之集合的重度認知受損(<17)；無法參與評估方案；通 常來自在篩選時採集之血液樣品且將具有安全性風險或干擾研究數據之適當解釋之顯著異常的值；當前或最近(在篩選前四週內)臨床上顯著之細菌、真菌或分枝桿菌感染史；在篩選時無法耐受MRI掃描或MRI之任何其他禁忌；在篩選時對腰椎穿刺術之任何禁忌或無法耐受腰椎穿刺術，包括使用抗凝藥劑，例如華法林(warfarin)。將容許每日投與81mg阿司匹林(aspirin)或類似抗凝劑，只要劑量在篩選前30天內穩定即可；研究者認為無法或不可能符合投藥方案或研究評估之個體；在篩選之3個月內參與另一研究性臨床試驗；在篩選之30天內使用另一研究性藥物進行治療；超過450ms之任何預存QTcF持續時間；個體為贊助商之雇員或家庭成員或研究機構職工或其家庭成員。
個體必須同意在開始基線訪視時在整個研究中且直至最後治療時段之研究藥物之最後一個劑量後56天使用(及/或使其伴侶使用)可接受之避孕方法。可接受之避孕方法列示於下文中。
研究藥物：1期/SAD研究將使用來自DP批號1018775之C2N-8E12-當前以擴大存取IND 119404使用之研究細胞庫(RCB)材料。其係在25mM乙酸鹽緩衝液(pH 5.5)中調配，且其係在20mg/mL之濃度下提供。安慰劑：安慰劑係以與C2N-8E12相同之方式調配單不含活性研究藥物。
劑量原理：使用食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)對工業「估計臨床試驗中治療劑在健康成年志願者中之安全起始劑量」之指導計算最大建議起始劑量(MRSD)。根據指導，對於IV投與之分子量>100,000道爾頓之研究性治療蛋白質，應藉由在物種間正規化而非經由體表面積放大來估計MRSD。基於在小鼠毒物學研究中對250mg/kg觀察之無觀察效應量(NOEL)，10之標準安全係數將劑量限於25mg/kg。
1期/SAD研究之起始劑量將為IV投藥之2.5mg/kg。基於4週小鼠 毒物學研究此起始劑量比最大容許的起始劑量低10倍，且比在涉及C2N-8E12之擴大存取及恩慈用途人類治療方案中投與之當前最大劑量(15mg/kg)小6倍(參見Investigator's Brochure)。
基於來自單一患者試驗之初步血漿PK，可估計在2.5mg/kg劑量之C2N-8E12後之多個時間下CSF中由C2N-8E12結合之tau%。對於此計算，假設人類化抗體之CSF濃度係血漿濃度之0.1%，且CSF中tau之濃度係500pg/mL。基於該等假設，2.5mg/kg之劑量將使得第一個月內C2N-8E12之CSF濃度比CSF中tau之莫耳濃度高3至40倍。基於C2N-8E12之KD，2.5mg/kg劑量將使CSF中由抗體結合之tau為3%-26%。已對來自迄今為止投與人類之最高劑量(15mg/kg)之PK數據實施類似建模，且估計在28天時段內之平均tau結合為約50%(最大為72%結合，最小為40%)。亦將可能在腦中存在豐富的細胞外tau，其不經由CSF區室存取但抗體將能夠與其結合。由此，劑量遞增將進行至25mg/kg以評價可能引起腦中之顯著靶接合之劑量之安全性。
除非經研究者批準，否則在治療時段期間，不應使研究個體接受：任何其他生物或免疫調節療法；任何其他研究性藥劑；華法林；任何抗凝劑(除81mg每日阿司匹林外)，對於在CSF取樣前暫時停止治療將提供醫療危害之病況。
書面知情同意書：在提供書面知情同意書後，每一個體將經歷篩選評價以再次確認可滿足納入準則，且在此方案下不存在接受治療之禁忌。特定而言，將在篩選時利用臨床及神經檢查評價每一個體以確認診斷。利用PSP分級量表及抑鬱量表與面談進行簡單認知篩選且獲得完全醫療及藥物/藥劑史。若個體滿足所有納入準則且缺乏排除準則，則將實施進一步研究。篩選訪視在基線/第0天訪視前28天至7天進行。
藥物動力學評價：將在下表3所述之多個時間點下收集樣品進行 PK分析。
(*)若出現早期終止，則將在早期終止訪視時獲得最終血液樣品用於最終PK評價；(#)在輸注完成之15分鐘內；(@)第28天後，將每28天採集PK樣品直至早期出現任一以下事件：(i)研究終止；(ii)不存在任何可檢測到之血液C2N-8E12含量。
不良事件評價：將實施以下安全性評價以監測AE：生命體徵(血壓、脈搏/心臟速率、體溫、呼吸速率、SPO2)；完全神經檢查，包括認知評價(精神狀況測試)；實驗室測試：(1)血液學板：使用微分的完全血液計數(CBC)、血球比容及血紅素(Hb)、血小板計數；(2)化學板：血清電解質、葡萄糖、尿酸、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐、總蛋白質、白蛋白、膽紅素(總計、直接及間接)、鹼性磷酸酶、乳酸去氫酶(LDH)、肝酶(AST、ALT及GGT)、鐵、膽固醇板、CPK、澱粉酶及脂酶；(3)凝集板：凝血酶原時間(PT)、INR及部分凝血活素時間(PTT)；尿樣分析，包括量測Hb、WBC及蛋白質含量；ECG-連續監測或12種主要ECG；MRI腦成像，包括流體衰減反轉恢復(FLAIR)；CSF取樣與量測細胞計數(WBC及RBC)、總蛋白質及葡萄糖。
測定人類血漿及CSF中之C2N-8E12：已研發出夾心ELISA分析用於量測血漿及CSF中C2N-8E12之濃度。Charles River實驗室已驗證了該等分析用於多種不同基質中(參見表4)。
測定人類血漿中之抗-C2N-8E12抗體：收集血液樣品用於評價在最初投藥之前及投與藥物後第14天及第28天之抗藥物抗體(ADA)顯影。在終止時進行最終量測。已研發出基於ECL之夾心ELISA分析用於量測血漿中針對C2N-8E12之抗體(ADA)之存在。Charles River實驗室已驗證此分析用於檢測人類血漿中之ADA反應(參見表5)。
臨床及功能評價包括哥倫比亞自殺嚴重程度等級量表(Colombia-Suicide Severity Rating Scale)：作為安全性參數，將哥倫比亞自殺嚴重程度等級量表(C-SSRS)用於自殺意念(Posner等人，2011)。老年抑鬱量表(Geriatric Depression Scale)：與C-SSRS類似，在研究期間將使用老年抑鬱量表(GDS)來評價總體情緒。老年抑鬱量表(GDS)係用於鑑別老年人抑鬱症之30項自我報告評價(Yesavage等人，1983)。PSP等級量表：在研究之納入篩選以及基線及結束時將使用PSP等級量表(PSPRS)以評價量表隨時間之變化(Golbe及Ohman-Strickland，2007)。臨床總體印象：將使用臨床總體印象變化率(CGIc)及臨床總體印象嚴重程度(CGIs)量表來評價症狀之嚴重程度。Schwab及England每日生活活動：將使用Schwab及England每日生活活動 (SEADL)量表作為評價個體實施每日活動能力之手段(Schwab及England，1969)。臨床失智症分級盒數額顳葉失智症：臨床失智症分級盒數額顳葉失智症(CDR-SB-FTLD)係CDR-SB認知評價測試之形式，其包括評價行為、舉動、人格及語言(Knopman等人，2008)。細微精神狀態檢查：細微精神狀態檢查(MMSE)係量測認知受損之可靠的30點問卷(Folstein、Folstein及McHugh，1975)。
腦脊液：CSF係藉由腰椎穿刺術自L3-4間隙抽出。若CSF取樣不成功，則可根據本地方案及本地臨床機構職工之決定使用CT/螢光透視引導之腰椎穿刺術。將在每一腰椎穿刺術/CSF收集後，在當地於合適的臨床機構分析CSF安全性實驗室。該等量度包括：細胞計數(WBC及RBC)、總蛋白質及葡萄糖。其他CSF量度(例如C2N-8E12濃度、靶接合及其他探究性生物標記物)將由合適的指定實驗室來分析。
成像：個體亦將接受基線MRI掃描與結構性FLAIR、彌散加權及敏感加權成像。根據事件之時間表實施投藥後成像分析。
探究性藥物基因組分析：在基線處收集血液樣品用於DNA提取。所有個體將經歷延長的MAPT單倍型序列分析以確定H1(A-D)及H2攜帶狀況。自樣品提取DNA且將DNA運輸至用於此研究之指定藥物基因組核心。
個體將入選此研究直至早期出現以下事件中之任一者：(i)其完成其參與及整個事件時間表；(ii)其或研究者決定終止其參與；或(iii)合適個體經受研究者認為排除進一步參與此研究且排除後續2期/MAD研究之合格性的任何DLT或任何SAE。另外，根據研究者之決定，可確定在研究期間不再符合任何納入準則或符合一或多個排除準則之個體對於繼續參與該研究或對於後續參與2期/MAD研究不合格。
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之敘述：合成 肽
<400> 55
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<211> 22
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之敘述：合成 肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(8)
<223> 任何胺基酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(22)
<223> 任何胺基酸或不存在
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<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之敘述：合成 肽
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<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> His或Leu
<400> 57
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之敘述：合成 肽
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<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Gly或Glu
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Claims (10)

  1. 一種經分離之單株抗tau抗體，其包含：含有SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈，及含有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體為人類化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體為含有S241P鉸鏈穩定突變之人類化IgG4抗體。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體結合包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的表位。
  5. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含人類同型κ之輕鏈恆定區。
  6. 一種經分離之單株抗tau抗體，其包含含有SEQ ID NO：18之胺基酸序列的輕鏈；及含有SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈。
  7. 如請求項6之抗體，其中該抗體結合包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的表位。
  8. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  9. 一種核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的抗體輕鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的抗體重鏈。
  10. 如請求項9之核酸分子，其編碼包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的輕鏈及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈。
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