CN115724970B - 一种特异性结合e-cad多肽的结合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性结合E‑CAD多肽的结合蛋白及其应用，涉及生物技术领域。该结合蛋白包括CDR‑VH1、CDR‑VH2、CDR‑VH3、CDR‑VL1、CDR‑VL2、CDR‑VL3共6个互补决定区。具有上述6个互补决定区的结合蛋白具有较好的活性，可以与E‑CAD抗原保持较高的结合特异性和亲和力。意味着采用该结合蛋白可以用于检测E‑CAD，有助于提高检测的灵敏度和特异性。该结合蛋白可以用于诊断以E‑CAD作为标志物的疾病，本发明为E‑CAD的检测以及为E‑CAD作为标志物的疾病的诊断提供更多的蛋白选择。

Description

一种特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白及其应用。

背景技术

E-CAD(E-cadherin,钙黏蛋白E):又名上皮细胞钙粘素和CD324，是一种钙依赖性的细胞粘附分子。它包括胞外结构域的5个重复钙粘蛋白、一个跨膜结构域和一个胞内结构域，该胞内结构域可结合p120-联蛋白和β-联蛋白。成人组织的CDH1在上皮组织中表达，在上皮组织中可不断地再生，它在细胞表面的半衰期是5个小时。

E-CAD蛋白，阳性部位为细胞膜，与上皮细胞的胞浆膜相关的120kD细胞粘附蛋白，其功能是肿瘤抑制蛋白。E-CAD蛋白，连同连环蛋自，对于上皮细胞内的致密细胞粘附有钙依赖性调节蛋白作用。已有研究表明，在肿瘤中E-钙粘蛋白的异常会导致该蛋白的细胞质膜定位的丧失，并且与粘附特性的丧失和侵入和转移可能性增加相关。

临床上检测肿瘤细胞中蛋白表达的状况常用免疫组织化学(IHC)病理实验来检测，而IHC实验检测的准确性和灵敏度，由特异性结合蛋白的单克隆抗体的优劣决定。因此，研制一种结合特异性较高的针对E-CAD蛋白的单克隆抗体对于IHC实验检测E-CAD表达水平具有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白及其应用以解决上述技术问题。

名词定义

术语“结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。

本文中的术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，嵌合抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性，如特异性结合HRP-II抗原或其片段。“抗体片段”包括全长抗体的部分，优选地其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv，互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。

通常情况下，抗体的重链和轻链的可变区VH/VL可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，结合蛋白包括抗原结合结构域，抗原结合结构域具有如下所示的6个互补决定区：

CDR-VH1：AYTMH；

CDR-VH2：GINPNTGYTTYNQKFKG；

CDR-VH3：SAGNYSVNWYFDV；

CDR-VL1：TANSSVSSSYLH；

CDR-VL2：STSNLAS；

CDR-VL3：HQYHRSPLT。

发明人发现：具有上述6个互补决定区的结合蛋白具有较好的活性，可以与E-CAD抗原保持较高的结合特异性和亲和力。意味着采用该结合蛋白可以用于检测E-CAD，有助于提高检测的灵敏度和特异性。该结合蛋白可以用于诊断以E-CAD作为标志物的疾病，本发明为E-CAD的检测以及为E-CAD作为标志物的疾病的诊断提供更多的蛋白选择。

在本发明应用较佳的实施方式中，结合蛋白与E-CAD多肽以K_D≤8.4078×10⁹的亲和力结合。

例如K_D≤8×10¹⁰L/mol的亲和力结合，例如K_D≤9×10¹⁰L/mol，K_D≤7×10¹⁰L/mol，K_D≤6×10¹⁰L/mol，K_D≤5×10¹⁰L/mol，K_D≤4×10¹⁰L/mol，K_D≤3×10¹⁰L/mol，K_D≤2×10¹⁰L/mol或K_D≤1×10¹⁰L/mol的亲和力结合。

在一种可选的实施方式中，结合蛋白为抗体或功能性片段。

在本发明应用较佳的实施方式中，结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

SEQ ID NO:1-8的序列如下表所示：

在一种可选的实施方式中，结合蛋白还包含恒定区；

在一种可选的实施方式中，恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

上述抗体的功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。

上述抗体的功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。

在一种可选的实施方式中，恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

在一种可选的实施方式中，恒定区的种属来源为乳牛、斗鸡或火鸡。

在其他实施方式中，上述恒定区的种属来源为骆驼。

在一种可选的实施方式中，恒定区来源于小鼠。

在本发明应用较佳的实施方式中，结合蛋白选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv和双特异抗体中的任意一种。

本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，该细胞株的名称为10F6。

本发明还提供了一种结合蛋白在制备用于诊断肿瘤或E-CAD免疫检测的试剂或试剂盒中的应用。

在本发明应用较佳的实施方式中，肿瘤选自上皮性肿瘤；E-CAD免疫检测是以结合蛋白标记组织细胞。

在本发明应用较佳的实施方式中，上皮性肿瘤包括不限于乳头状瘤、胃肠癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、腺癌、腺瘤或鳞癌。

胃肠癌选自食道癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、小肠癌、结肠直肠癌和肛门癌，任选地，其中结肠直肠癌选自结肠癌和直肠癌。

在一种可选的实施方式中，腺癌包括不限于肺腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、涎腺癌或胰腺癌。

在一种可选的实施方式中，腺瘤包括不限于囊腺瘤、纤维腺瘤、多形性腺瘤或息肉状腺瘤。

在一种可选的实施方式中，乳腺癌包括不限于乳腺导管癌、乳腺上皮癌或乳腺小叶癌。乳腺癌，优选II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选2级)。

卵巢癌，浆液性和粘液性癌(优选地Ic期至IIIb期)、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤。

子宫癌，优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地I期至IIIc期)。

膀胱癌，优选地包括移行细胞癌(优选地II期至IV期)。

肺癌，优选地包括小细胞肺癌(优选地I期至IIIb期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞肺癌。

鳞癌为口腔鳞癌、咽鳞癌、喉癌、食道鳞癌(例如食管鳞癌)、唇的鳞状细胞癌、子宫鳞癌、阴道鳞癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。

口腔鳞癌例如包括不限于舌鳞癌。

在其他实施方式中，上述鳞癌也可以是支气管、膀胱、肾盂等部位通过鳞状上皮化生而形成的鳞状细胞癌。

在一种可选的实施方式中，组织细胞为卵巢、子宫内膜、宫颈、肺、甲状腺和乳腺上皮、支气管、膀胱、肾盂中的至少一种。

本发明还提供了一种用于诊断肿瘤或E-CAD免疫检测的试剂或试剂盒，其含有上述的结合蛋白。

在一种可选的实施方式中，上皮性肿瘤选自乳头状瘤、胃肠癌、卵巢癌、子宫内膜样肿瘤、宫颈癌、肺癌、腺癌、腺瘤或鳞癌。

胃肠癌选自食道癌、胆囊癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、小肠癌、结肠直肠癌和肛门癌，任选地，其中结肠直肠癌选自结肠癌和直肠癌。

在一种可选的实施方式中，腺癌包括不限于肺腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、涎腺癌或胰腺癌。

在一种可选的实施方式中，腺瘤包括不限于囊腺瘤、纤维腺瘤、多形性腺瘤或息肉状腺瘤。

在一种可选的实施方式中，乳腺癌包括不限于乳腺导管癌、乳腺上皮癌或乳腺小叶癌。乳腺癌，优选II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选2级)。

卵巢癌，浆液性和粘液性癌(优选地Ic期至IIIb期)、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤。

子宫癌，优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地I期至IIIc期)。

膀胱癌，优选地包括移行细胞癌(优选地II期至IV期)。

肺癌，优选地包括小细胞肺癌(优选地I期至IIIb期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞肺癌。

鳞癌为口腔鳞癌、咽鳞癌、喉癌、食道鳞癌(例如食管鳞癌)、唇的鳞状细胞癌、子宫鳞癌、阴道鳞癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。

口腔鳞癌例如包括不限于舌鳞癌。

在其他实施方式中，上述鳞癌也可以是支气管、膀胱、肾盂等部位通过鳞状上皮化生而形成的鳞状细胞癌。

在一种可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒还包括标记有可被检测的标记物。

可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。

在可选的实施方式中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。

在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu和¹⁸F_。

在可选的实施方式中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。

在可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体。纳米颗粒包括不限于：有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒

在可选的实施方式中，胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。

在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。

本发明还提供了一种载体，其含有编码上述的结合蛋白的核酸。

本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的载体。

还提供一种生产前述实施方式任一项所述的结合蛋白的方法，其包括：

培养前述实施方式的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到结合蛋白。

所述生产方法可以是例如，用编码至少一部分结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。

构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。

在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

一种检测E-CAD的方法，其包括：将前述实施方式任一项的结合蛋白与待测样本混合。

在可选的实施方式中，上述方法是以非疾病的诊断为目的。

需要说明的是，本领域技术人员可以基于抗体/抗原结合形成免疫复合物的特点对待测样本中的E-CAD蛋白进行定性或定量检测。

本发明具有以下有益效果：

发明人发现具有特定的6个互补决定区的结合蛋白具有较好的活性，可以与E-CAD抗原保持较高的结合特异性和亲和力。意味着采用该结合蛋白可以用于检测E-CAD，有助于提高检测的灵敏度和特异性。该结合蛋白可以用于诊断以E-CAD作为标志物的疾病，本发明为E-CAD的检测以及为E-CAD作为标志物的疾病的诊断提供更多的蛋白选择。

本发明提供的特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白可以用于制备肿瘤诊断试剂或试剂盒，诊断标志物为E-CAD(E-cadherin,钙黏蛋白E)，从而检测相关肿瘤组织中E-CAD的表达水平。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为针对乳腺癌样本的免疫组化实验结果图；

图2为针对肺腺癌组织的免疫组化实验结果图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例进行特异性抗E-CAD的单克隆抗体的制备。

1.动物(小鼠)免疫。

利用通用的方法，用免疫原免疫小鼠。免疫原为由吉尔生物合成的人E-CAD多肽，同时作为检测抗原对血清效价和杂交瘤进行测定和筛选，高纯度的抗原能使得到所需单抗的机会增加，同时减轻筛选量。免疫5只小鼠，每只小鼠免疫50ug E-CAD抗原。用PBS配置抗原蛋白溶液。将适量的抗原蛋白、PBS、福氏佐剂放入注射器中，注射器出水口用塞子塞住，放在乳化仪上搅拌充分乳化，使抗原佐剂形成稳定油包水的溶液。在初免和二免后的7-10天进行第一次尾血血清效价检测，经过2到4次的加强免疫得到良好的效价。选择血清效价高的免疫小鼠腹腔终免后进行细胞融合。

2.杂交瘤细胞融合与筛选。

在细胞融合前需要做好准备工作：1.培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0至对数生长期；2.在融合前一天处死一只阴性鼠，在无菌环境中用HAT培养基注入小鼠腹腔取小鼠腹腔滋养层细胞并铺板在96孔板，每孔100ul，这些细胞对杂交瘤细胞生长有促进作用。处死免疫小鼠，在无菌环境下取脾脏，用PEG化学融合脾B细胞和SP2/0骨髓瘤细胞，根据要铺板的个数，加入合适的HAT培养基，最后将融合细胞铺在滋养层细胞培养板上，每孔100ul。

7-10天后可在显微镜下观察存活的杂交瘤细胞生长情况，在铺板两周后，收集各孔上清，用ELISA方法用人E-CAD-his蛋白抗原进行杂交瘤细胞筛选。方法如下：用100ul2ug/ml人E-CAD多肽抗原的PBS溶液包被酶标板37℃两小时。PBST洗板3次后，加入150ul/孔的3％脱脂奶粉的PBS溶液至于4℃封闭过夜。再洗板三次，加入80ul/孔的杂交瘤上清，37℃孵育1小时，而后洗板三次。以100ul/孔加入1：8000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗，37℃孵育45分钟，洗板3次，拍干。添加100ul/孔的TMB显色液，室温显色5-10分钟，用2M硫酸溶液终止，测定450纳米处各孔的吸光值。挑选出阳性的杂交瘤细胞。

将ELISA阳性的融合孔，挑选出来接着做免疫组化(IHC)，挑选出阳性孔做后续实验。实验步骤如下：

(1)切片处理：将肺腺癌切片置于60℃恒温箱中烘烤60分钟，将切片用二甲苯Ⅰ浸泡15分钟，更换二甲苯Ⅱ后浸泡15分钟，分别在无水乙醇①浸泡5分钟、无水乙醇②浸泡5分钟，95％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟；ddH₂O浸泡5分钟，清洗3次；利用高压锅进行抗原修复(煮沸法)压力锅中加入足以淹没切片的10mmol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，加热至沸腾，切片置耐热料切片架上，放入锅中，盖好锅盖，扣上压力阀，继续加热，设置保压4分钟，时间到后打开放气阀放气，压力归零后开锅盖将内锅取出放置室温冷却。待溶液冷却至室温后取出切片(约40min)；ddH₂O浸泡5分钟，清洗2次，PBST浸泡5分钟，清洗2次；将切片放置在20ml3％H₂O₂-甲醇溶液中，避光，室温处理10分钟；PBST浸泡5分钟，清洗3次；每个组织群加入山羊血清封闭液一滴约25ul，湿盒中室温孵育45分钟；PBST浸泡5分钟，清洗3次。

(2)组织切片与抗体混合孵育：

将处理好的组织切片加入罗氏的E-CAD抗体进行对比，其余切片加入上述阳性的杂交瘤细胞分泌的E-CAD-10F6抗体。4℃湿盒中孵育过夜；从4℃冰箱取出，室温孵育60分钟；PBST轻柔冲洗后浸泡5分钟，清洗3次；每个组织群加入HRP标记的长岛公司二抗(CAT#:)25ul，室温，孵育45分钟；洗涤；配制好DAB显色液，避光反应10-15分钟后滴加到切片上，显色1-5分钟；用蒸馏水终止显色反应；每个组织群滴加苏木素染液50ul，染色5-10分钟，用蒸馏水冲洗干净；将切片放入1％盐酸-乙醇中脱色2-3秒后迅速取出放入蒸馏水中终止，再放入PBST(pH8.0)中反蓝5-10分钟；分别在75％乙醇中浸泡5分钟：85％乙醇中浸泡5分钟；95％乙醇中浸泡5分钟：无水乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡10分钟，换二甲苯后再浸泡10分钟；滴加中性树胶封片，加盖玻片封片；显微镜拍片。如图1所示。

图1、图2为E-CAD的免疫组化实验，图1检测标本为乳腺癌，图2检测标本肺腺癌组织。图1中A为本实施例生产的E-CAD-10F6抗体，B为罗氏公司的E-CAD抗体。图2中A为本实施例生产的E-CAD-10F6抗体，B为罗氏公司的E-CAD抗体。由图1和图2的染色结果可知，E-CAD-10F6抗体与罗氏抗体的染色部位及染色强度无明显差异。证实本发明提供的E-CAD具有制备试剂盒的应用前景。

通过ELISA和IHC实验挑出结合为阳性的融合细胞，通过有限稀释法克隆，每孔阳性株铺48/96孔板，继续培养。并通过ELISA方法进行第二轮复筛，筛选出特异性识别E-CAD多肽且能阻断E-CAD结合的杂交瘤，通过有限稀释法亚克隆，获得一个单克隆细胞株10F6。将单克隆细胞株进行扩培，将收集到的约1×10⁶个细胞注射进挑选好的老鼠(老鼠需提前一周在腹腔注射石蜡油)，再经过7-10天的等待，小鼠产生腹水，收集腹水进行抗体纯化。提纯后，获得特异性抗E-CAD多肽的小鼠单克隆抗体。

实施例2

进行DNA克隆和测序，抗人E-CAD单克隆抗体的可变区基因测序。

使用Trizol试剂提取小鼠单克隆细胞株中的总RNA。收集在9cm皿中培养的细胞到1.5ml离心管中，将上清吸干。加入1ml的Trizol试剂并将细胞吹打均匀使细胞裂解，将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12000rpm 4℃离心10min。吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。12000rpm 4℃离心10min，弃上清。加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。12000rpm 4℃离心3min，弃上清。室温干燥5-10min。加入30-50ulRNase-freeddH₂O。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。

选用AMV第一链cDNA合成试剂盒把总RNA逆转录为cDNA。实验体系配置如下，6ul的总RNA+1ul Oligo dT+4ul RNase-free水(共11ul)。轻轻混匀后离心3-5s，反应混合物在65℃温浴5mi预变性后，冰浴30s，然后离心3-5s，接着冰浴2min。在冰浴状态下加入4ul的5x缓冲液+1ul的dNTP混合物+1ul的RNase抑制剂+1ul逆转录酶(总共20ul体系)，轻轻混匀后离心3-5s，在PCR仪上42℃50分钟，85℃5min，完成cDNA合成。随机引物适合于500bp以下的短链cDNA的合成，所转录的RNA模板无需poly(A)尾，可转录5`端区域。

轻链与重链的PCR扩增。对于扩增抗体轻链可变区序列，配置PCR反应体系：2x Taq酶缓冲液25ul+FP-VL 1ul+RP-VL 1ul+cDNA 2ul+ddH₂O 21ul。对于扩增抗体重链可变区序列，配置PCR反应体系：2x Taq酶缓冲液25ul+FP-VH 1ul+RP-VH 1ul+cDNA 2ul+ddH₂O21ul。重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复35个循环)：

步骤1-预变性94℃，4min；

步骤2-变性94℃，30sec；

步骤3-退火55℃，45sec；

步骤4-延伸72℃，60sec；

步骤5-72℃，10min；

步骤6-保存4℃。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH的约为375bp，VL的约为325bp)，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA提取。简述如下：从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重；加入胶块重量3-6倍的buffer B2,50℃水浴5-10分钟溶胶；将溶胶液移入吸附柱中，8000g离心30秒；倒掉收集管中的液体；柱中加入500ulwash Solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中液体；再重复加wash solution一次，倒掉液体；孔吸附柱于9000g离心1分钟；将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40ul Elution Buffer,室温静置1分钟后，离心1分钟。获得制备的DNA溶液，纯化PCR产物经过测序获得抗体的可变区序列。

实验例1

本实验例对上述实施例1制得的抗体的亲和力和灵敏度进行检测。

1.将实施例1中的重组抗原分别按照3mg/L、1.5mg/L、0.75mg/L、0.375mg/L包板。

2.调整抗体浓度至10^-7mol/L水平(1*10^-7至5*10^-7mol/L均可)。然后倍比稀释1:2-1:256，加至不同抗原包被量的孔中。

3.加入二抗，TMB显色。测450nm吸光值,测得数据见表1。

4.根据抗原抗体结合S曲线，求出不同抗原浓度下，半数吸光值的抗体浓度。这样就有四个抗体浓度(mol/L)。

5.代入公式K＝(N-1)/(N*AB’-AB)计算亲和常数。AB'、AB为对应抗原浓度AG下(3mg/L、1.5ml/L、0.75mg/L、0.375mg/L)产生半数吸光值的抗体浓度。N＝AG/AG’(AG>AG’)。

6.当N＝2时，可以得到三个K值1.767、13.089、12.225。当N＝4时，可以得到两个K值4.174、12.5。当N＝8时可以得到一个K值6.292。求出6个K值得平均值，为8.4078×10⁹L/mol。

表1不同处理下的吸光值统计表。

实验例2

本实验例进行免疫组化中和实验：取一定量的E-CAD抗原蛋白与E-CAD-10F6纯化抗体混合，37℃中和反应1小时。按免疫组化实验步骤，作为一抗滴加到肺腺癌切片，4℃过夜，之后按实施例1中同样的步骤免疫组化染色，拍片。

图2中C为中和实验结果。中和试验中抗原蛋白反应结合了E-CAD-10F6抗体，抗体无法与癌组织中的抗原结合，使得组织几乎没有染色。可以看出本发明实施例提供的抗E-CAD多肽单克隆抗体E-CAD-10F6可以识别人细胞中的E-CAD多肽并与之结合，在后续IHC染色实验中使得肺腺癌组织中细胞胞质呈棕色，并与罗氏公司的E-CAD抗体无明显差异。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (22)

1.一种特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有如下所示的6个互补决定区：

CDR-VH1：AYTMH；

CDR-VH2：GINPNTGYTTYNQKFKG；

CDR-VH3：SAGNYSVNWYFDV；

CDR-VL1：TANSSVSSSYLH；

CDR-VL2：STSNLAS；

CDR-VL3：HQYHRSPLT；

所述结合蛋白为抗体或其功能性片段；所述结合蛋白为抗体的功能性片段时，所述结合蛋白选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白与E-CAD多肽以K_D≤8.4078×10^-9的亲和力结合。

3.根据权利要求2所述的特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。

4.根据权利要求3所述的特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含恒定区。

5.根据权利要求4所述的特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区。

6.根据权利要求4所述的特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。

7.根据权利要求4所述的特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区的种属来源为乳牛、斗鸡或火鸡。

8.根据权利要求4所述的特异性结合E-CAD多肽的结合蛋白，其特征在于，所述恒定区来源于小鼠。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的结合蛋白在制备用于诊断肿瘤或E-CAD免疫检测的试剂或试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自上皮性肿瘤；所述E-CAD免疫检测是以所述结合蛋白标记组织细胞。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述上皮性肿瘤选自乳头状瘤、胃肠癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、腺癌、腺瘤或鳞癌。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述腺癌选自肺腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、涎腺癌或胰腺癌。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌选自乳腺上皮癌。

14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为乳腺导管癌或乳腺小叶癌。

15.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述腺瘤选自囊腺瘤、纤维腺瘤、多形性腺瘤或息肉状腺瘤。

16.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述鳞癌为口腔鳞癌、咽鳞癌、喉癌、食道鳞癌、唇的鳞状细胞癌、子宫鳞癌、阴道鳞癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。

17.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述组织细胞为卵巢、子宫内膜、宫颈、肺、甲状腺和乳腺上皮、支气管、膀胱、肾盂中的至少一种。

18.一种用于诊断肿瘤或E-CAD免疫检测的试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-8任一项所述的结合蛋白。

19.根据权利要求18所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述肿瘤选自上皮性肿瘤。

20.根据权利要求19所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述上皮性肿瘤选自乳头状瘤、胃肠癌、卵巢癌、子宫内膜样肿瘤、宫颈癌、肺癌、腺癌、腺瘤或鳞癌。

21.一种载体，其特征在于，其含有编码如权利要求1-8任一项所述的结合蛋白的核酸。

22.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求21所述的载体。