CN116854818A - 一种特异性结合p16多肽的结合蛋白及p16多肽检测试剂盒 - Google Patents

一种特异性结合p16多肽的结合蛋白及p16多肽检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合P16多肽的结合蛋白及P16多肽检测试剂盒，涉及生物技术领域。本发明提供的结合蛋白可以特异性结合P16，具有较好的结合活性和亲和力，使用本发明的结合蛋白检测P16，可以提高检测的灵敏度和特异性。基于该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力，可以用于开发检测P16蛋白的检测产品，例如检测试剂和试剂盒。此外，该结合蛋白可以用于诊断以P16多肽作为标志物的疾病，如宫颈癌等。有利于疾病的早发现早干预治疗。本发明为P16多肽的检测以及为P16多肽为标志物的疾病的诊断提供了更多的蛋白选择。

Description

一种特异性结合P16多肽的结合蛋白及P16多肽检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种特异性结合P16多肽的结合蛋白及P16多肽检测试剂盒。
背景技术
P16蛋白是由P16基因编码产生的16KD的蛋白。P16蛋白的功能是：抑制CDK4的活性。而CDK4是一种细胞分裂周期关键酶。其与细胞周期素的复合体参于G1-S转换的调控，P16蛋白通过抑制CDK4的活性，最终阻止细胞进入S期。一旦发生P16基因缺失，突变等导致P16蛋白的功能缺失，则不能抑制CDK4，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生。
现已研究表明，P16蛋白的阳性部位为细胞质和细胞核，是HPV致癌基因的一个标记物，预示着早期癌症的发生，参与了HPV感染引起的宫颈病变发展。P16阳性预示着宫颈癌的发生，P16和HPV辅助检测可以减少和避免不必要的阴道镜检查。
临床上检测肿瘤细胞中蛋白表达的状况常用免疫组织化学(IHC)病理实验来检测，而IHC实验检测的准确性和灵敏度，由特异性结合蛋白的单克隆抗体的优劣决定。因此，研制一种结合特异性较高的针对P16多肽的单克隆抗体，对于检测P16蛋白的表达水平具有重要意义。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性结合P16多肽的结合蛋白及P16多肽检测试剂盒以解决上述技术问题。
本发明提供的结合蛋白可以特异性结合P16，具有较好的结合活性和亲和力，使用本发明的结合蛋白检测P16，可以提高检测的灵敏度和特异性，该结合蛋白可以用于诊断以P16作为标志物的疾病，例如肿瘤。
名词定义
术语“结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段，特别是抗体或抗体功能片段。“抗体功能片段”包括上述这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体、多特异性抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD等。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
本文中的术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，嵌合抗体，以及抗体片段，只要他们展示所需的生物学活性，如特异性结合HRP-II抗原或其片段。“抗体片段”包括全长抗体的部分，优选地其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv，互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如，scFv)，双价抗体或结构域抗体。
通常情况下，抗体的重链和轻链的可变区VH/VL可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种特异性结合P16多肽的结合蛋白，结合蛋白包括抗原结合结构域，抗原结合结构域具有如下所示的6个互补决定区：
CDR-VH1：DYTMN；
CDR-VH2：LINLYNDGTTYNQKFRG；
CDR-VH3：GIYLDY；
CDR-VL1：RASQSIGTSVH；
CDR-VL2：YASESIS；
CDR-VL3：QQSYKWPLT。
上述互补决定区的氨基酸序列是本发明首次发现并揭示，是一种新的序列，可赋予该结合蛋白特异性结合P16抗原的能力。基于该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力，可以用于开发检测P16蛋白的检测产品，例如检测试剂和试剂盒，使用本发明的结合蛋白检测P16多肽，可以提高检测的灵敏度和特异性。此外，该结合蛋白可以用于诊断以P16多肽作为标志物的疾病，如宫颈癌等。有利于疾病的早发现早干预治疗。本发明为P16多肽的检测以及为P16多肽为标志物的疾病的诊断提供了更多的蛋白选择。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述结合蛋白与AFP多肽以KD≤6.907×108L/mol的亲和力结合，结合蛋白为抗体或功能性片段。
在可选的实施方式中，结合蛋白与AFP蛋白具有KD≤4×109L/mol、3×109L/mol、2×109L/mol、1×109L/mol、9×109L/mol、8×109L/mol、7×109L/mol、6×109L/mol、5×109L/mol、4×109L/mol、3×109L/mol或2×109L/mol的亲和力。
在本发明应用较佳的实施方式中，结合蛋白为抗体或功能性片段。
在本发明应用较佳的实施方式中，结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H。
SEQ ID NO:1-8的序列如下表所示：
在本发明应用较佳的实施方式中，结合蛋白还包含恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，轻链恒定区选自kappa(κ)链和lambda(λ)链中的任意一者的恒定区；
在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；
在本发明应用较佳的实施方式中，恒定区来源于小鼠。
在本发明应用较佳的实施方式中，功能性片段选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和多特异性抗体中的任意一种。
上述抗体的功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。
上述抗体的功能片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
第二方面，本发明还提供了一种结合蛋白在制备肿瘤诊断或P16多肽检测产品中的应用。
在肿瘤诊断或P16多肽检测产品应用中，利用抗P16的抗体或其抗原结合片段与P16蛋白片段特异性结合从而实现P16的检测。
在一种可选的实施方式中，P16多肽检测产品选自试剂、试剂盒或芯片。
在本发明应用较佳的实施方式中，肿瘤选自上皮性肿瘤。
在本发明应用较佳的实施方式中，上皮性肿瘤选自宫颈鳞癌和扁桃体癌中的至少一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，结合蛋白标记有可被检测的标记物。
可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体；纳米颗粒包括不限于：有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
在本发明应用较佳的实施方式中，P16多肽检测是以结合蛋白标记组织细胞。
第三方面，本发明还提供了一种用于诊断肿瘤或P16多肽检测的试剂或试剂盒，其含有上述的结合蛋白。
在本发明应用较佳的实施方式中，肿瘤选自宫颈鳞癌、扁桃体癌中的至少一种。
第四方面，本发明还提供了一种载体，其含有编码上述结合蛋白的核酸。
考虑到密码子的简并性，可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，编码上述抗体的基因序列可以进行修改，获得编码相同抗体氨基酸序列的基因；也可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
载体为表达载体或克隆载体，优选为表达载体，可以指任何重组的多核苷酸构建体，该构建体可通过转化，转染或转导的方式将目的DNA片段直接或间接(如包装成病毒)导入宿主细胞内，进行目的基因表达。
第五方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述的载体。
宿主细胞选自哺乳动物细胞；
哺乳动物细胞选自293细胞、293T细胞、293FT细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠L细胞、LNCaP细胞、633细胞、Vero、BHK细胞、CV1细胞、Hela细胞、MDCK细胞、Hep-2细胞和Per6细胞中的任一种。其中的293系列细胞、Per6细胞和CHO细胞是用于生产制备抗体或重组蛋白的常用哺乳动物细胞，为本领域普通技术人员所熟知。
本发明还提供了一种生产前述实施方式的结合蛋白的方法，其包括：
培养前述实施方式的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中分离纯化得到结合蛋白。
所述生产方法可以是例如，用编码至少一部分结合蛋白的核酸载体转染宿主细胞，在合适的条件下培养该宿主细胞使其表达该结合蛋白。宿主细胞也可以用一个或多个表达载体转染，该表达载体可以单独或结合地包含编码至少一部分结合蛋白的DNA。利用常规的纯化蛋白质和肽的技术可从培养基或细胞裂解物中分离结合蛋白，所述技术包括硫酸铵沉淀，层析(如离子交换，凝胶过滤，亲合层析等)和/或电泳。
构建合适的含有目的编码和调控序列的载体可以使用本领域公知的标准连接和限制技术进行。将分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸按需要的形式切割、加尾和再连接。可以用任何方法向编码序列中引入突变以产生本发明的变体，这些突变可以包含缺失或插入或置换等。
一种检测P16的方法，其包括：将前述实施方式任一项的结合蛋白与待测样本混合。
在可选的实施方式中，上述方法是以非疾病的诊断为目的。
需要说明的是，本领域技术人员可以基于抗体/抗原结合形成免疫复合物的特点对待测样本中的P16多肽进行定性或定量检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的结合蛋白可以特异性结合P16，具有较好的结合活性和亲和力，使用本发明的结合蛋白检测P16，可以提高检测的灵敏度和特异性。
基于该结合蛋白具有较好的结合活性以及亲和力，可以用于开发检测P16蛋白的检测产品，例如检测试剂和试剂盒。此外，该结合蛋白可以用于诊断以P16多肽作为标志物的疾病，如宫颈癌等。有利于疾病的早发现早干预治疗。本发明为P16多肽的检测以及为P16多肽为标志物的疾病的诊断提供了更多的蛋白选择。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为扁桃体组织免疫组化实验结果；
图2为宫颈鳞癌组织免疫组化实验结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例进行特异性抗P16多肽的单克隆抗体的制备。
1.动物(小鼠)免疫
利用通用的方法，用免疫原免疫小鼠。免疫原为的人P16多肽，同时作为检测抗原对血清效价和杂交瘤进行测定和筛选，高纯度的抗原能使得到所需单抗的机会增加，同时减轻筛选量。免疫5只小鼠，每只小鼠免疫50ug P16抗原。用PBS配置抗原蛋白溶液。将适量的抗原蛋白、PBS、福氏佐剂放入注射器中，注射器出水口用塞子塞住，放在乳化仪上搅拌充分乳化，使抗原佐剂形成稳定油包水的溶液。在初免和二免后的7-10天进行第一次尾血血清效价检测，经过2到4次的加强免疫得到良好的效价。选择血清效价高的免疫小鼠腹腔终免后进行细胞融合。
2.杂交瘤细胞融合与筛选
在细胞融合前需要做好准备工作：(1)培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0至对数生长期；(2)在融合前一天处死一只阴性鼠，在无菌环境中用HAT培养基注入小鼠腹腔取小鼠腹腔滋养层细胞并铺板在96孔板，每孔100ul，这些细胞对杂交瘤细胞生长有促进作用。处死免疫小鼠，在无菌环境下取脾脏，用PEG化学融合脾B细胞和SP2/0骨髓瘤细胞，根据要铺板的个数，加入合适的HAT培养基，最后将融合细胞铺在滋养层细胞培养板上，每孔100ul。
7-10天后可在显微镜下观察存活的杂交瘤细胞生长情况，在铺板两周后，收集各孔上清，用ELISA方法用人P16-his蛋白抗原进行杂交瘤细胞筛选。
方法如下：用100ul 2ug/ml人P16多肽抗原的PBS溶液包被酶标板37℃两小时。PBST洗板3次后，加入150ul/孔的3％脱脂奶粉的PBS溶液至于4℃封闭过夜。再洗板三次，加入80ul/孔的杂交瘤上清，37℃孵育1小时，而后洗板三次。以100ul/孔加入1：8000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗，37℃孵育45分钟，洗板3次，拍干。添加100ul/孔的TMB显色液，室温显色5-10分钟，用2M硫酸溶液终止，测定450纳米处各孔的吸光值。挑选出阳性的杂交瘤细胞。
实施例2
挑选出实施例1ELISA阳性的融合孔进行免疫组化(IHC)实验。
实验步骤如下：
将扁桃体切片以及宫颈鳞癌组织置于60℃恒温箱中烘烤60分钟，将切片用二甲苯Ⅰ浸泡15分钟，更换二甲苯Ⅱ后浸泡15分钟，分别在无水乙醇①浸泡5分钟、无水乙醇②浸泡5分钟，95％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟；ddH2O浸泡5分钟，清洗3次；利用高压锅进行抗原修复(煮沸法)压力锅中加入足以淹没切片的10mmol/L枸橼酸盐缓冲液(ph6.0)，加热至沸腾，切片置耐热料切片架上,放入锅中，盖好锅盖，扣上压力阀，继续加热，设置保压4分钟，时间到后打开放气阀放气，压力归零后开锅盖将内锅取出放置室温冷却。待溶液冷却至室温后取出切片(约40min)；ddH2O浸泡5分钟，清洗2次，PBST浸泡5分钟，清洗2次；将切片放置在20ml3％H2O2-甲醇溶液中，避光，室温处理10分钟；PBST浸泡5分钟，清洗3次；每个组织群加入山羊血清封闭液一滴约25ul，湿盒中室温孵育45分钟；PBST浸泡5分钟，清洗3次。
将处理好的组织切片加入迈新的P16抗体(CAT#:MAB-2673)进行对比，其余切片加入P16-8E2纯化抗体。4℃湿盒中孵育过夜；从4℃冰箱取出，室温孵育60分钟；PBST轻柔冲洗后浸泡5分钟，清洗3次；每个组织群加入HRP标记的长岛公司二抗25ul，室温，孵育45分钟；洗涤；配制好DAB显色液，避光反应10-15分钟后滴加到切片上，显色1-5分钟；用蒸馏水终止显色反应；每个组织群滴加苏木素染液50ul，染色5-10分钟，用蒸馏水冲洗干净；将切片放入1％盐酸-乙醇中脱色2-3秒后迅速取出放入蒸馏水中终止，再放入PBST(pH8.0)中反蓝5-10分钟；分别在75％乙醇中浸泡5分钟：85％乙醇中浸泡5分钟；95％乙醇中浸泡5分钟：无水乙醇中浸泡5分钟。用二甲苯浸泡10分钟，换二甲苯后再浸泡10分钟；滴加中性树胶封片，加盖玻片封片；显微镜拍片。
图1、图2为P16的免疫组化实验结果图，图1检测标本为扁桃体组织，图2检测标本为宫颈鳞癌组织。图1中A为实施例1制备的P16-8E2抗体，B为迈新公司的P16抗体。图2中A为实施例1制备的P16-8E2抗体，B为迈新公司的P16抗体。
由图1和图2的染色结果可知，P16-8E2抗体与迈新抗体的染色部位及染色强度无明显差异。证实本发明提供的P16具有制备试剂盒的应用前景。
实施例3
通过ELISA和IHC实验挑出结合为阳性的融合细胞，通过有限稀释法克隆，每孔阳性株铺48/96孔板，继续培养。并通过ELISA方法进行第二轮复筛，筛选出特异性识别P16多肽且能阻断P16结合的杂交瘤，通过有限稀释法亚克隆，获得一个单克隆细胞株8E2。将单克隆细胞株进行扩培，将收集到的约1×106个细胞注射进挑选好的老鼠(老鼠需提前一周在腹腔注射石蜡油)，再经过7-10天的等待，小鼠产生腹水，收集腹水进行抗体纯化。提纯后，获得特异性抗P16多肽的小鼠单克隆抗体。
实施例4
进行DNA克隆和测序，抗人P16单克隆抗体的可变区基因测序。
使用Trizol试剂提取小鼠单克隆细胞株中的总RNA。收集在9cm皿中培养的细胞到1.5ml离心管中，将上清吸干。加入1ml的Trizol试剂并将细胞吹打均匀使细胞裂解，将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。12000rpm 4℃离心10min。吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min。12000rpm 4℃离心10min，弃上清。加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。12000rpm 4℃离心3min，弃上清。室温干燥5-10min。加入30-50ulRNase-freeddH2O。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。
选用AMV第一链cDNA合成试剂盒把总RNA逆转录为cDNA。实验体系配置如下，6ul的总RNA+1ul Oligo dT+4ul RNase-free水(共11ul)。轻轻混匀后离心3-5s，反应混合物在65℃温浴5mi预变性后，冰浴30s，然后离心3-5s，接着冰浴2min。在冰浴状态下加入4ul的5x缓冲液+1ul的dNTP混合物+1ul的RNase抑制剂+1ul逆转录酶(总共20ul体系)，轻轻混匀后离心3-5s，在PCR仪上42℃50分钟，85℃5min，完成cDNA合成。随机引物适合于500bp以下的短链cDNA的合成，所转录的RNA模板无需poly(A)尾，可转录5`端区域。
轻链与重链的PCR扩增。对于扩增抗体轻链可变区序列，配置PCR反应体系：2x Taq酶缓冲液25ul+FP-VL 1ul+RP-VL 1ul+cDNA 2ul+ddH2O 21ul。对于扩增抗体重链可变区序列，配置PCR反应体系：2x Taq酶缓冲液25ul+FP-VH 1ul+RP-VH 1ul+cDNA 2ul+ddH2O21ul。重链和轻链可变区PCR扩增的温度循环如下(其中步骤2到4，重复35个循环)：
步骤1-预变性94℃，4min；
步骤2-变性94℃，30sec；
步骤3-退火55℃，45sec；
步骤4-延伸72℃，60sec；
步骤5-72℃，10min；
步骤6-保存4℃。
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，切出对应大小的DNA区段条带(VH的约为375bp，VL的约为325bp)，用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA提取。简述如下：从琼脂糖凝胶中割下含目标片段的胶块，称重；加入胶块重量3-6倍的buffer B2,50℃水浴5-10分钟溶胶；将溶胶液移入吸附柱中，8000g离心30秒；倒掉收集管中的液体；柱中加入500ulwash Solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中液体；再重复加wash solution一次，倒掉液体；孔吸附柱于9000g离心1分钟；将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40ul Elution Buffer,室温静置1分钟后，离心1分钟。获得制备的DNA溶液，纯化PCR产物经过测序获得抗体的可变区序列。
实验例1
本实验例对上述实施例3制得的抗体(P16-8E2纯化抗体)的亲和力和灵敏度进行检测。
1.将重组人P16多肽分别按照3mg/L、1.5mg/L、0.75mg/L、0.375mg/L包板。
2.调整抗体浓度至10-7mol/L水平(1*10-7至5*10-7mol/L均可)。然后倍比稀释1:2-1:256，加至不同抗原包被量的孔中。
3.加入二抗，TMB显色。测450nm吸光值,测得数据见表1。
4.根据抗原抗体结合S曲线，求出不同抗原浓度下，半数吸光值的抗体浓度。这样就有四个抗体浓度(mol/L)。
5.代入公式K＝(N-1)/(N*AB’-AB)计算亲和常数。AB'、AB为对应抗原浓度AG下(3mg/L、1.5ml/L、0.75mg/L、0.375mg/L)产生半数吸光值的抗体浓度。N＝AG/AG’(AG>AG’)。
6.当N＝2时，可以得到三个K值1.300、0.580、0.481。当N＝4时，可以得到两个K值0.712、0.511。当N＝8时可以得到一个K值0.599。求出6个K值得平均值，为6.907×108L/mol。
表1 450nm吸光值统计表
实验例2
免疫组化中和实验：取一定量的P16抗原蛋白与P16-8E2纯化抗体混合，37℃中和反应1小时。按免疫组化实验步骤，作为一抗滴加到宫颈鳞癌切片，4℃过夜，之后按同样的步骤免疫组化染色，拍片。
图2中C为中和实验结果。中和试验中抗原结合了P16-8E2抗体，抗体无法与癌组织中的抗原结合，使得组织几乎没有染色。可以看出本发明实施例提供的抗P16多肽单克隆抗体P16-8E2可以识别人细胞中的P16多肽并与之结合，在后续IHC染色实验中使得宫颈鳞癌组织中细胞胞质呈棕色。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种特异性结合P16多肽的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域具有如下所示的6个互补决定区：
CDR-VH1：DYTMN；
CDR-VH2：LINLYNDGTTYNQKFRG；
CDR-VH3：GIYLDY；
CDR-VL1：RASQSIGTSVH；
CDR-VL2：YASESIS；
CDR-VL3：QQSYKWPLT。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白为抗体或功能性片段。
3.根据权利要求1或2所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包括序列依次如SEQID NO:1-4所示的轻链骨架区FR1-L、FR2-L、FR3-L及FR4-L，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR1-H、FR2-H、FR3-H及FR4-H；
优选地，所述结合蛋白还包含恒定区；
优选地，所述恒定区包括重链恒定区和轻链恒定区；
优选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区；
优选地，所述轻链恒定区选自kappa(κ)链和lambda(λ)链中的任意一者的恒定区；
优选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；
优选地，所述恒定区来源于小鼠。
4.根据权利要求2所述的结合蛋白，其特征在于，所述功能性片段选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和多特异性抗体中的任意一种。
5.一种如权利要求1-4任一项所述的结合蛋白在制备肿瘤诊断或P16多肽检测产品中的应用；
优选地，所述肿瘤选自上皮性肿瘤；
优选地，所述上皮性肿瘤选自宫颈鳞癌和扁桃体癌中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述结合蛋白标记有可被检测的标记物。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述P16多肽检测是以所述结合蛋白标记组织细胞。
8.一种用于诊断肿瘤或P16多肽检测的试剂或试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1-4任一项所述的结合蛋白；
优选地，所述肿瘤选自宫颈鳞癌和扁桃体癌中的至少一种。
9.一种载体，其特征在于，其含有编码如权利要求1-4任一项所述的结合蛋白的核酸。
10.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求9所述的载体。
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