CN117025547B - 产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117025547B
CN117025547B CN202311286635.8A CN202311286635A CN117025547B CN 117025547 B CN117025547 B CN 117025547B CN 202311286635 A CN202311286635 A CN 202311286635A CN 117025547 B CN117025547 B CN 117025547B
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
hybridoma cell
antibody
protein
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311286635.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117025547A (zh
Inventor
张亚飞
李荣艳
于永娟
叶晟帆
陆夏萍
王健荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Original Assignee
Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd filed Critical Meijie Transformation Medical Research Suzhou Co ltd
Priority to CN202311286635.8A priority Critical patent/CN117025547B/zh
Publication of CN117025547A publication Critical patent/CN117025547A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117025547B publication Critical patent/CN117025547B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/10—Immunoblots, e.g. Western blot or Dot blot
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
    • G01N2474/20—Immunohistochemistry assay

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株的分类命名为鼠抗人B7H3单克隆抗体杂交瘤细胞系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45550，保藏日期为2023年04月25日。所述杂交瘤细胞产生的抗B7H3单克隆抗体与B7H3蛋白具有较高的亲和力。以抗B7H3单克隆抗体构建的B7H3检测试剂盒灵敏度高、特异性好，在包括酶联免疫吸附、蛋白免疫印迹、免疫组织化学、流式细胞术和免疫荧光等在内的多种检测中应用效果较好。

Description

产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明属于免疫化学技术领域，具体涉及产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
CD276（Cluster of Differentiation 276，簇分化抗原276）是人类CD276基因编码的I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，也称为B7-H3。在人类中，它由染色体15q24编码，由一个胞外区、一个跨膜区和一个短的胞内区组成，没有已知的信号基序。B7-H3存在两种亚型：2IgB7-H3由一对免疫球蛋白可变区（IgV）样和免疫球蛋白恒定区（IgC）样胞外结构域组成，4IgB7-H3包含两对相同的IgV样和IgC样胞外结构域，后者是人类细胞的主要亚型。
B7-H3靶点（CD276/B7RP-2），属于B7配体家族成员（PD-L1也属于此家族成员），B7家族的10个已知成员包括B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-H1（PD-L1）、B7-DC（PD-L2）、B7-H2（CD275）、B7-H3（CD276）、B7-H4（VTCN1）、B7-H5（VISTA）、B7-H6（NCR3LG1）和B7-H7（HHLA2）。B7家族成员在淋巴组织和非淋巴组织上表达，并且通常在许多人类癌症组织中高度表达。B7-H3 mRNA在多种正常组织（肝脏、小肠、胰腺、睾丸、心脏和结肠组织）表达，但不在人外周血白细胞中表达。然而，B7-H3蛋白表达在正常细胞、组织和失活的T淋巴细胞中保持低水平，但在活化（通过GM-CSF或LPS刺激）B细胞、T细胞、单核细胞或NK细胞以及多种肿瘤类型中发现B7-H3表达增加。其中，B7-H3鉴于其在各种癌症中的高表达以及与不良预后的相关性获得关注。尽管B7-H3首次被发现可通过IFN-γ的产生激活T细胞功能，但目前已更明确地表明其可通过抑制IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-13下调CD4+和CD8+T细胞应答。
B7-H3的转录本在正常组织和实体肿瘤中广泛存在，但其蛋白仅在肿瘤组织中高表达，正常组织中表达量极低。
大量研究已在多种恶性肿瘤中发现B7-H3表达失调，B7-H3表达失调与更具侵袭性的病程和较差的结局相关。在口腔鳞状细胞癌中，B7-H3过表达与更具侵袭性的肿瘤和更高的死亡率相关；阻断表达抑制了肿瘤生长。同样，B7-H3在前列腺癌中的表达增加与转移、复发、术后癌症进展和死亡密切相关。
B7-H3也被用作区分病理性和非病理性血管生成的内皮标志物。结肠癌肿瘤血管上B7-H3高表达与较差的TNM分期和不良预后相关。同样，B7-H3通常定位于细胞膜和细胞质，很少发现于细胞核。然而，在结肠癌中，B7-H3更常定位于细胞核，与癌症进展、转移和不良疾病结局相关。
B3-H7的功能颇受争议，且具有多面性，既可以起到免疫共刺激作用，也可以起到免疫共抑制作用。B3-H7可以影响肿瘤细胞的多重信号通路，具体有PI3K/AKT，NF-κB，Ras/Raf/MEK/MAPK，JAK2/STAT3信号途径，还可以调节葡萄糖代谢途径。
最近的研究表明，B7-H3在肿瘤的生长、侵袭、迁移及血管生成和转移中起着重要作用，由于其在免疫逃逸中的作用，B7-H3已成为新的免疫治疗靶点。主要免疫治疗手段有：单抗阻断、放射免疫疗法、ADC、ADCC、CD3衔接的双抗、TriKEs、CAR-T/NK细胞治疗等，临床上进展较快的是MacroGenics公司的依诺妥珠单抗及在此单抗基础上改造获得的B7-H3*CD3双抗（MGD009），B7-H3-ADC药物（MGC018）等，Daiichi Sankyo公司的B7-H3-ADC药物（DS-7300a）。联合治疗方面，B7-H3和PD-L1对T细胞产生抑制作用，改变T细胞的微环境以逃避抗肿瘤免疫应答。B7-H3 CAR-T/NK细胞已经被证明对多种癌症类型具有有效的体外抗肿瘤活性。而B7-H3和CTLA4也可能有协同作用，类似于B7-H3在PD-1通路中一样。
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原-抗体高度特异性结合的特点来显示组织切片中抗原的分布和定位的原位检测技术。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助组织化学的方法进行观察，如将酶偶联到抗体上，酶会催化底物在抗原位置产生有色沉淀，从而将抗原抗体结合的部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位或定量的研究。为了提高免疫组织化学的检测效率和一致性，需要筛选出高特异性的单克隆抗体，且要求这些抗体在组化检测工作中的灵敏度、特异性和准确度等指标达到一定的标准，因此筛选出各项指标均较好的抗体对病理诊断具有重要的意义。
目前，市场上能够特异性并高灵敏度地检测B7H3的抗体的数量极少，尤其是能够应用于免疫组织化学检测的抗B7H3单克隆体。所以制备特异性强、灵敏度高、应用范围广的抗B7H3单克隆抗体，具有重要的现实意义和应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，所述杂交瘤细胞株产生的抗B7H3单克隆抗体与B7H3蛋白具有较高的亲和力，能够特异性地识别B7H3蛋白，在制备B7H3检测试剂盒中具有重要的应用前景。以抗B7H3单克隆抗体构建的B7H3检测试剂盒灵敏度高、特异性好，在包括酶联免疫吸附、蛋白免疫印迹、免疫组织化学、流式细胞术和免疫荧光等在内的多种检测中应用效果较好。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一株产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株的分类命名为鼠抗人B7H3单克隆抗体杂交瘤细胞系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45550，保藏日期为2023年04月25日。
第二方面，本发明提供一种抗B7H3单克隆抗体，所述抗B7H3单克隆抗体由第一方面所述的产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。
本发明中，所述抗B7H3单克隆抗体以B7H3蛋白为免疫原免疫动物制备获得。
优选地，所述抗B7H3单克隆抗体的亚型为IgG1型。
优选地，所述抗B7H3单克隆抗体的重链包括：
CDR1：GFTVSSYA，（SEQ ID No.3）；
CDR2：ITSGGTYT，（SEQ ID No.4）；
CDR3：PYGGWFAY，（SEQ ID No.5）。
优选地，所述抗B7H3单克隆抗体的轻链包括：
CDR1：TGAVTTSNY，（SEQ ID No.6）；
CDR2：GTN；
CDR3：ALWYSNHWV，（SEQ ID No.7）。
优选地，所述抗B7H3单克隆抗体的重链可变区包括SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，所述抗B7H3单克隆抗体的轻链可变区包括SEQ ID No.10所示的氨基酸序列。
优选地，所述抗B7H3单克隆抗体的重链全长包括SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；所述抗B7H3单克隆抗体的轻链全长包括SEQ ID No.11所示的氨基酸序列。
本发明中，以人B7H3重组蛋白作为免疫原免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，筛选能分泌高灵敏度和高特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明中所述抗B7H3单克隆抗体的抗原为人源B7H3蛋白，所述人源B7H3蛋白包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，所述人源B7H3蛋白的氨基酸序列见Uniprot GenBank ID：Q5ZPR3，相应的蛋白胞外区位于第Leu29-Thr461位氨基酸，并在蛋白的C末端，添加6个组氨酸组成的标签。
在本发明中，鼠抗人B7H3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ22-2分泌的单克隆抗体命名为单克隆抗体MJ22-2，在实际应用中，可根据需要采用已知的抗体改造方案对单克隆抗体MJ22-2进行结构和序列上的改造，以获得需要的性质，对单克隆抗体MJ22-2的改造包括：
（1）标记抗体
可对抗体进行标记以便于检测，标记方法可以是荧光标记、化学发光标记、放射性标记、酶联标记、生物素/亲和素标记、磁珠标记或纳米颗粒标记等。
（2）结构改造
可对抗体结构进行改造，构建成抗原亲和性类似但结构不同的分子，如Fab、F(ab’)2、Fab’、Fab’-SH、Fv片段、单链抗体（如scFv）、单域抗体、抗体偶联物、双功能抗体或多特异性抗体等。其中Fab’片段是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量氨基酸残基（包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸）的Fab，Fab’-SH是指在恒定区的半胱氨酸残基带有自由硫醇基的Fab’。
优选地，对纯化后的抗B7H3单克隆抗体进行修饰，所述修饰使用的修饰缀合物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述抗B7H3单克隆抗体应用于构建B7H3检测试剂盒，或者直接应用于检测，所述抗B7H3单克隆抗体可以修饰有缀合物或检测标记，例如荧光标记、酶标记、放射性标记、生物素标记或亲和素标记等。具体的缀合物或检测标记包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5等，连接方式包括化学键偶联、静电吸附或亲疏水性吸附等。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的抗B7H3单克隆抗体的制备方法，所述抗B7H3单克隆抗体的制备方法包括：
培养第一方面所述的产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，纯化，获得所述抗B7H3单克隆抗体。
本发明中，所述抗B7H3单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：
（1）应用真核表达平台，构建真核表达质粒，在293T细胞中瞬转表达，ELISA法证实蛋白能够表达，在293F细胞中扩大培养，瞬转表达，并纯化获得人源B7H3蛋白。
（2）用得到的真核表达的人源B7H3蛋白免疫小鼠，血清效价测定合格后，处理并获得免疫后的小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经过培养、亚克隆分选和筛选后，获得杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株能产生特异性识别B7H3蛋白的单克隆抗体。
（3）培养杂交瘤细胞株，收集培养基的上清，并进行亲和纯化，获得单克隆抗体，ELISA测定单克隆抗体的活性。
第四方面，本发明提供第一方面所述的产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或第二方面所述的抗B7H3单克隆抗体在制备B7H3蛋白表达检测产品中的应用。
第五方面，本发明提供一种B7H3免疫组织化学检测试剂盒，所述B7H3免疫组织化学检测试剂盒包括第二方面所述的抗B7H3单克隆抗体。
优选地，所述B7H3免疫组织化学检测试剂盒还包括：免疫组织化学抗原修复缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色剂或苏木素复染液中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述B7H3免疫组织化学检测试剂盒中的抗B7H3单克隆抗体与B7H3蛋白具有高亲和力。
本发明中，在所述B7H3免疫组织化学检测试剂盒中抗B7H3单克隆抗体是指能够检测组织样本中B7H3表达状态的抗体，其能够与B7H3蛋白结合，在免疫组织化学实验中，抗B7H3单克隆抗体作为一抗进行B7H3表达状态的检测。
第六方面，本发明提供一种B7H3免疫印迹检测试剂盒，所述B7H3免疫印迹检测试剂盒包括第二方面所述的抗B7H3单克隆抗体。
优选地，所述B7H3免疫印迹检测试剂盒还包括：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE凝胶）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）、封闭液或酶标二抗中的任意一种或至少两种组合。
第七方面，本发明提供一种B7H3酶联免疫吸附检测试剂盒，所述B7H3酶联免疫吸附检测试剂盒包括第二方面所述的抗B7H3单克隆抗体。
优选地，所述B7H3酶联免疫吸附检测试剂盒还包括：封闭液、酶标二抗、显色液或终止液中的任意一种或至少两种组合。
第八方面，本发明提供一种B7H3免疫荧光检测试剂盒，所述B7H3免疫荧光检测试剂盒包括第二方面所述的抗B7H3单克隆抗体。
优选地，所述抗B7H3单克隆抗体修饰有荧光基团，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5中的任意一种。
第九方面，本发明提供一种B7H3流式细胞术检测试剂盒，所述B7H3流式细胞术检测试剂盒包括第二方面所述的抗B7H3单克隆抗体。
发明中，在所述B7H3流式细胞术检测试剂盒中抗B7H3单克隆抗体是指能够检测表达B7H3蛋白的细胞中B7H3表达状态的抗体，抗B7H3单克隆抗体能够与细胞膜上的B7H3蛋白结合，在流式细胞术中，抗B7H3单克隆抗体作为一抗进行表达B7H3蛋白的细胞的检测。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供的抗B7H3单克隆抗体能识别真核重组表达和原核重组表达的B7H3蛋白，具有检测B7H3蛋白的特性，具有广泛的用途。
（2）本发明提供的抗B7H3单克隆抗体为IgG1亚型抗体，能够在免疫组化检测中特异性地识别肿瘤组织和正常组织中的B7H3蛋白表达，且具有较高的亲和力。
（3）本发明提供的抗B7H3单克隆抗体在免疫印迹检测、酶联免疫吸附检测和免疫组织化学检测中具有极高的灵敏度和特异性。
附图说明
图1是实施例1中ELISA检测真核表达的人B7H3蛋白表达量与细胞活率的关系图。
图2为实施例1中纯化后的人B7H3重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图3为实施例5中纯化获得的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图。
图4为商品化抗体Rb mAb to B7H3检测正常胃（癌旁）组织B1994-1的结果（比例尺100 μm）。
图5为商品化抗体Rb mAb to B7H3检测平滑肌（正常膀胱）组织100-0015-B234的结果（比例尺100 μm）。
图6为单克隆抗体MJ22-2检测正常胃（癌旁）组织B1994-1的结果（比例尺100 μm）。
图7为单克隆抗体MJ22-2检测平滑肌（正常膀胱）组织100-0015-B234的结果（比例尺100 μm）。
图8为单克隆抗体MJ22-5检测正常胃（癌旁）组织B1994-1的结果（比例尺100 μm）。
图9为单克隆抗体MJ22-5检测平滑肌（正常膀胱）组织100-0015-B234的结果（比例尺100 μm）。
图10为B7-H3 (D9M2L) XP® Rabbit mAb检测肺癌-100-0015-B197的结果（比例尺100 μm）。
图11为B7-H3 (D9M2L) XP® Rabbit mAb检测子宫内膜癌-100-0015-B313的结果（比例尺100 μm）。
图12为B7-H3 (D9M2L) XP® Rabbit mAb检测肺癌-100-0015-B204的结果（比例尺100 μm）。
图13为单克隆抗体MJ22-2检测肺癌-100-0015-B197的结果（比例尺100 μm）。
图14为单克隆抗体MJ22-2检测子宫内膜癌-100-0015-B313的结果（比例尺100 μm）。
图15为单克隆抗体MJ22-2检测肺癌-100-0015-B204的结果（比例尺100 μm）。
图16为单克隆抗体MJ22-5检测肺癌-100-0015-B197的结果（比例尺100 μm）。
图17为单克隆抗体MJ22-5检测子宫内膜癌-100-0015-B313的结果（比例尺100 μm）。
图18为单克隆抗体MJ22-5检测肺癌-100-0015-B204的结果（比例尺100 μm）。
图19为实施例10中单克隆抗体MJ22-2及同期开发的单克隆抗体MJ22-10、MJ22-19与对照抗体Rb mAb to B7H3（Abcam，0.516 µg/mL）的免疫印迹检测结果图。
图20为实施例10中单克隆抗体同期开发的单克隆抗体MJ22-5、MJ22-16、MJ22-14与对照抗体Rb mAb to B7H3（Abcam，0.516 µg/mL）的免疫印迹检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种人B7H3重组蛋白，所述人B7H3重组蛋白的制备过程如下：
在人B7H3蛋白胞外区的C端添加6个组氨酸，在蛋白的N端添加适合于真核蛋白分泌的信号肽。利用同源重组的方法将目的基因与表达载体pcDNA3.4连接，构建表达克隆pcDNA3.4-B7H3。
所述人源B7H3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述人源B7H3蛋白的氨基酸序列见Uniprot GenBank ID：Q495A1，相应的蛋白胞外区位于第Met22-Pro141位氨基酸。
将构建完成的真核表达pcDNA3.4-B7H3质粒，在293T细胞中瞬转表达，48 h后收集细胞表达上清，通过ELISA进行验证，证实蛋白有表达。然后扩大培养，提取质粒，测序正确后，将质粒DNA瞬时转染HEK293F细胞，具体方法参见赛默飞世尔公司的Expi293™表达系统试剂盒（货号：A14635）操作指南。在HEK293F细胞中进行蛋白表达，分别在48小时、72小时、96小时、120小时、144小时进行取样计数，观察细胞状态，检测细胞活率，并用ELISA法进行目的蛋白的表达检测，检测结果如图1所示。并在144小时收获细胞培养物，10000 rpm离心20分钟，用0.45 μm一次性无菌滤器过滤液体，获得上清液用于纯化获得的人源B7H3蛋白。
由图1的ELISA结果可知，随着时间的延长，ELISA检测的阳性值逐渐升高，并在120小时达到一个峰值，144小时出现略微下降，细胞活率随着时间的延长不断降低，实验结果证实目的蛋白成功表达，所述人B7H3重组蛋白的理论分子量为47 kDa。
采用AKTA蛋白纯化仪，利用Ni柱（Ni sepharose High performance，GE，货号：17-5268-01）进行亲和纯化，对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，检验所获得的蛋白的大小及纯度。
SDS-PAGE凝胶电泳的结果如图2所示。图2中泳道1：蛋白分子量标准；泳道2：BSA，1µg；泳道3：还原状态下（R）B7H3蛋白，1 µg；泳道4：非还原状态下（N）B7H3蛋白，1 µg。所述人B7H3重组蛋白的C端带有6个组氨酸标签，所以纯化后的蛋白的分子量比理论分子量偏大，经ELISA确认表达获得的蛋白为人B7H3重组蛋白，纯度>95%，满足实验要求。
实施例2
本实施例提供一种人B7H3重组蛋白，所述人B7H3重组蛋白的制备过程如下：
通过同源重组的方法将人B7H3蛋白胞外区序列与表达载体pColdTMTF（品牌：Takara，Code No.3365）连接，构建表达克隆pCold TF-B7H3，形成完整的TF-B7H3融合蛋白，完整的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
构建原核表达质粒，测序正确后，转化BL21（DE3）株，并涂布氨苄青霉素平板，37℃倒置培养12小时。挑菌并摇菌培养，采用终浓度为0.1 mM的IPTG进行诱导，破碎菌体，进行SDS-PAGE电泳，确定蛋白是否表达以及分子量，经验证蛋白在菌体破碎后上清液中，呈可溶性表达，分子大小符合预期。
将菌株接种在含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200 rpm培养，待菌液OD值升高至0.5，利用0.1 mM的IPTG进行低温诱导表达，诱导表达的温度为16℃，时间为18小时，诱导表达结束后在10000 rpm离心收集菌体。利用超声破碎仪进行破菌处理，10000 rpm离心30分钟，用0.45 μm的滤器过滤破菌上清液，获得待纯化样品，利用Ni柱（Ni sepharoseHigh performance，GE，货号17-5268-01）进行亲和层析纯化获得用于制备B7H3抗体的人源抗原，并通过ELISA验证蛋白有活性。
实施例3
本实施例提供一种杂交瘤细胞株的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
（1）免疫小鼠
取6周龄的雌性Balb/c小鼠，从眼眶采血20 µL，离心获得血清作为阴性对照。将实施例1纯化得到的人B7H3重组蛋白在小鼠腹部皮下多点注射免疫；首次免疫剂量为每只小鼠120 µg，用生理盐水稀释至体积为200 µL，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后注射。隔14天皮下加强免疫一次，剂量为每只小鼠注射人B7H3重组蛋白60 µg，用生理盐水稀释至体积为200 µL，与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后注射。第3次加强免疫后7天眼眶取血，用ELISA检测血清抗体效价，对达到要求的小鼠进行冲击免疫，免疫剂量为每只小鼠注射人B7H3重组蛋白60 µg，3天后进行融合。
（2）融合
在融合的前一天，取一只未免疫的小鼠，采用腹腔灌洗方法获得腹腔细胞作为饲养层细胞，铺在96孔板的板底。
在融合的当天，取血清效价合格的免疫小鼠，脱颈处死，在75%乙醇浸泡5分钟消毒，放入无菌操作台摘取脾脏，除去脂肪和结缔组织，然后用DMEM（品牌：Hyclone，货号：SH30243.01B）基础培养基洗涤脾脏3遍，将其放在预先加入10 mL DMEM基础培养基的细胞培养皿中，用1 mL注射器吸入培养基吹打脾脏，吹出脾细胞，再进行充分研磨吹打，最后用40 µm网筛过滤除去粘性蛋白获得脾细胞，将脾细胞与SP2/0细胞按4:1的比例混合，1000rpm，室温离心5分钟，弃去上清，拍打离心管底部使细胞团均匀覆盖于离心管底部，然后将离心管放入37℃温水浴中，一边轻轻晃动离心管，一边逐滴加入1 mL聚乙二醇溶液（Sigma，P7181-5×5 mL），在90 s内加完。聚乙二醇溶液滴加完毕后，将15 mL预热的DMEM培养基倒入离心管中终止反应，37℃水浴内静置10分钟，然后1000 rpm离心5分钟，弃去上清。用含25% FBS的HAT选择培养基重悬细胞，并按100 μL/孔接种于96孔细胞培养板，在37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。融合3天后，对细胞进行半量换液，吸取培养液160 μL，补加1×HAT选择培养基160 μL，融合后第8天，检测细胞上清中的抗体。
（3）筛选
细胞融合后约8天，融合孔中出现明显细胞团，此时，取培养基上清，利用间接ELISA法筛选产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株，采用有限稀释法进行杂交瘤细胞株的亚克隆分选。
间接ELISA法的操作步骤如下：取TF-B7H3蛋白，稀释至4 μg/mL，每孔加入100 μL，包被96孔板，37℃静置1小时，然后用PBST洗涤4次，用5% BSA封闭。封闭结束后，再次用PBST洗涤4次，取100 µL培养基进行一抗孵育，用免疫后具有抗体效价的小鼠血清按1:5000稀释作为阳性对照，用未免疫的小鼠血清作为阴性对照，37℃孵育1小时，用PBST洗涤4次。然后每孔加辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG（H+L）F(ab’)2片段（品牌：Jackson，货号：115-036-003，稀释比例为1:5000），37℃孵育1小时，最后用TMB显色，终止显色后测定450 nm的OD值。OD450数值大于0.5的判定为可以进行亚克隆分选的阳性克隆。
（4）杂交瘤细胞株的构建
经过3次亚克隆和ELISA筛选，共得到27株针对人B7H3抗原、稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，克隆号为MJ22-2至MJ22-29。根据筛选结果挑选出灵敏度和特异性最强的一株，克隆号为MJ22-2的杂交瘤细胞。
实施例4
本实施例通过ELISA法对实施例3中所述的单克隆抗体MJ22-2的亚型进行鉴定。
（1）单克隆抗体亚型鉴定
用100 mM PBS（pH 7.4）稀释包被所用的羊抗鼠IgG（杭州索莱尔博奥生物技术有限公司，SL200101）至1 µg/mL，每孔加入100 µL，在4℃孵育10小时。倾空液体，用含0.05%Tween-20的PBST清洗5次。每孔加入300 µL封闭液（质量分数为5% BSA），37℃封闭1小时，倾空液体，用PBST清洗5次。每孔加入100 µL单克隆抗体MJ22-2，37℃孵育1小时。倾空液体，用PBST清洗5次。用封闭液按1:5000稀释HRP标记的山羊抗鼠（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）抗体，每孔加入100 µL，37℃孵育1小时。倾空液体，用PBST清洗5次。每孔加入100 µL底物溶液，室温显色10分钟，在450 nm波长下测OD值。结果如表1所示。
表1
根据阳性对照及样品检测的OD值，确定抗体的亚型，N为阴性对照，P为阳性对照，结果如表1所示，由此可知，本次融合获得的27株杂交瘤单克隆抗体的亚型均为鼠源IgG1，表1列出MJ22-2的亚型测定数据，证实MJ22-2亚型为IgG1。
所述抗B7H3单克隆抗体的重链包括：CDR1：GFTVSSYA，（SEQ ID No.3）；CDR2：ITSGGTYT，（SEQ ID No.4）；CDR3：PYGGWFAY，（SEQ ID No.5）。
所述抗B7H3单克隆抗体的轻链包括：CDR1：TGAVTTSNY，（SEQ ID No.6）；CDR2：GTN；CDR3：ALWYSNHWV，（SEQ ID No.7）。
所述单克隆抗体MJ22-2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示，重链全长的氨基酸序列如SEQ ID No.9所示。
所述单克隆抗体MJ22-2的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示，轻链全长的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示。
实施例5
本实施例提供一种抗B7H3单克隆抗体，所述抗B7H3单克隆抗体由实施例3中的鼠抗人B7H3单克隆抗体杂交瘤细胞系MJ22-2产生。
（1）抗体培养液的制备
复苏克隆号为MJ22-2的杂交瘤细胞，用DMEM完全培养基（88% DMEM+12% FBS+1×青霉素链霉素）培养在15 cm的无菌培养皿中，37℃，5% CO2，静置培养48小时。待细胞密度达到5×106个/mL时，弃去培养基上清，并用无菌PBS（pH 7.4）溶液，清洗一遍，补加20 mL基础培养基（DMEM+1×青霉素链霉素），37℃，5% CO2，静置培养72小时，收集培养基上清，并10000 rpm离心10分钟，用0.45 μm的滤器过滤，进行下一步的纯化。
（2）抗B7H3单克隆抗体的纯化
用Hi Trap rProtein G FF（GE Healthcare，17061802）亲和层析填料及AKTA系统，参照说明书从培养基中纯化单克隆抗体。平衡液为20 mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲液，洗脱液为100 mM、pH 2.7的甘氨酸，中和液为1 M、pH 8.5的Tris-HCl。
纯化具体步骤为：首先取1 mL的纯化柱，用10 mL纯化水冲洗柱子，接着用10 mL平衡液冲洗柱子，进行样品上样，再用10 mL平衡液冲洗柱子，最后用10 mL洗脱液进行抗体的洗脱，并立即加入中和液，使其pH达到7.0，所有步骤的液体流速均为1 mL/min。
复苏克隆号为MJ22-5、MJ22-10和MJ22-19的杂交瘤细胞制备单克隆抗体MJ22-5、MJ22-10和MJ22-19，并采用相同的方法纯化单克隆抗体MJ22-5、MJ22-10和MJ22-19。
SDS-PAGE电泳鉴定纯度，并用紫外分光光度计测定浓度。SDS-PAGE检测结果见图3，图3中泳道1：蛋白分子量标准；泳道2：还原状态下（R）抗B7H3单克隆抗体MJ22-2，1 µg；泳道3：非还原状态下（N）抗B7H3单克隆抗体MJ22-2，1 µg；泳道4：非还原状态下（N）抗B7H3单克隆抗体MJ22-10，1 µg；泳道5：还原状态下（R）抗B7H3单克隆抗体MJ22-10，1 µg；泳道6：BSA，1 µg；泳道7：还原状态下（R）抗B7H3单克隆抗体MJ22-19，1 µg；泳道8：非还原状态下（N）抗B7H3单克隆抗体MJ22-19，1 µg。由图3可知，纯化后的单克隆抗体MJ22-2的条带大小正确，纯度>95%。
实施例6
本实施例对实施例3中所述的克隆号为MJ22-2的杂交瘤细胞株进行保藏，分类命名为鼠抗人B7H3单克隆抗体杂交瘤细胞系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101，保藏编号为CGMCCNo.45550，保藏日期为2023年04月25日。
实施例7
本实施例提供一种B7H3免疫组织化学检测试剂盒，所述B7H3免疫组织化学检测试剂盒包括实施例5所述的单克隆抗体MJ22-2、免疫组织化学抗原修复缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色剂和苏木素复染液。
实施例8
本实施例使用实施例7中所述的B7H3免疫组织化学检测试剂盒对样本进行检测。
（1）材料
本实施例中所用组织样本为正常胃（癌旁）组织、平滑肌（正常膀胱）组织样本，组织样本来源于迈杰转化医学研究（苏州）有限公司组织样本库，组织样本包括正常胃（癌旁）组织B1994-1、平滑肌（正常膀胱）组织100-0015-B234样本，组织样本是经福尔马林固定和石蜡包埋处理的人体组织样本，均经病理证实，并有患者知情同意书。其中正常胃（癌旁）组织B1994-1样本为经商业化抗体Rb mAb to B7H3（公司：Abcam，货号#Ab219648）验证为B7H3表达阳性的组织（间质细胞），作为阳性对照。平滑肌（正常膀胱）组织100-0015-B234样本为经商业化抗体Rb mAb to B7H3（公司：Abcam，货号#Ab219648）验证为B7H3表达阴性的组织，作为阴性对照。经文献验证和Rb mAb to B7H3抗体验证证实，正常胃组织（间质细胞）样本，为B7H3表达阳性组织。
（2）实验步骤
组织玻片经60℃烘箱烤片1 h之后，上机进行“复水”程序：二甲苯I 10分钟、二甲苯II 10分钟、无水乙醇I 5分钟、无水乙醇II 5分钟、95%乙醇5分钟、75%乙醇5分钟、ddH2OⅠ 2分钟、ddH2O Ⅱ 2分钟、ddH2O Ш 10分钟（仪器为全自动染封一体机，厂家察微，型号E7）。抗原修复采用Tris-EDTA修复液pH 9.0（厂家：迈新，货号：MVS-0099）高压修复，之后ddH2O中浸泡水洗重复3次后，在切片组织周围用疏水笔（厂家：中杉金桥，货号：ZLI-9305）画出封闭疏水圈。1×PBST（厂家：无锡傲锐东源生物科技，货号：ZLI-9062）中浸泡水洗3次后，进行灭活处理，切片平摊于湿盒（后续的抗体孵育都是如此操作），滴加过氧化物封闭液（厂家：Leica Bond，货号：DS9800），避光孵育10分钟。再次PBST水洗3次后一抗孵育，避光孵育30分钟，然后PBST水洗3次后孵育一抗后试剂（厂家：Leica Bond，货号：DS9800），避光孵育10分钟（一抗为兔抗可省略此步骤，直接跳到下一步加羊抗兔抗体）。PBST水洗3次后孵育羊抗兔抗体（厂家：Leica Bond，货号：DS9800），避光孵育10分钟。PBST水洗3次后DAB（厂家：中杉金桥，货号：ZLI-9019）显色，室温避光5分钟。水洗ddH2O中浸泡3次，上机（仪器同“复水”程序）进行“苏木素封片”程序：ddH2O Ⅰ 2分钟、苏木素10分钟、ddH2O Ⅱ 2分钟、分化液1s、ddH2O Ш 7分钟、75%乙醇2分钟、95%乙醇2分钟、无水乙醇Ⅰ 2分钟、无水乙醇II 2分钟、二甲苯I 5分钟、二甲苯II 5分钟、中性树胶封片，切片于通风橱（厂家：Supreme Air，型号：C0458）内挥发走二甲苯后扫描。
（3）检测结果
免疫组织化学的检测结果如图4-图5所示，其中，图4为商品化抗体Rb mAb toB7H3检测正常胃（癌旁）组织B1994-1的结果；图5为商品化抗体Rb mAb to B7H3检测平滑肌（正常膀胱）组织100-0015-B234的结果；图6为单克隆抗体MJ22-2检测正常胃（癌旁）组织B1994-1的结果；图7为单克隆抗体MJ22-2检测平滑肌（正常膀胱）组织100-0015-B234的结果；图8为单克隆抗体MJ22-5检测正常胃（癌旁）组织B1994-1的结果；图9为单克隆抗体MJ22-5检测平滑肌（正常膀胱）组织100-0015-B234的结果。经过专业病理工作人员对结果进行判读，此次免疫组化实验结果显示，商品化抗体Rb mAb to B7H3与本实施例5中的单克隆抗体MJ22-2、MJ22-5在检测胃癌旁阳性组织中B7H3表达时，呈现间质细胞阳性染色，这与人B7H3表达在间质细胞上的结果相匹配；三种抗体在B7H3表达呈阴性的平滑肌组织中，检测结果均为阴性。且实施例5中的单克隆抗体MJ22-2、MJ22-5在组织细胞上的染色无特异性染色背景。
因此，由实验结果可知，所述单克隆抗体MJ22-2能够特异性地检测人B7H3在胃癌旁组织中的表达。可以进一步地将所述单克隆抗体MJ22-2的性能进行优化和开发，以单独抗体或以试剂盒的形式应用于免疫组织化学实验，用于相关组织样本的检测。所述单克隆抗体MJ22-2能够特异性地检测正常人体组织中B7H3蛋白的表达，且特异性强。
实施例9
本实施例使用实施例7中所述的B7H3免疫组织化学检测试剂盒对样本进行检测。
（1）材料
本实施例中所用组织样本为子宫内膜癌、肺癌组织、胃癌旁组织、平滑肌组织样本，组织样本来源于迈杰转化医学研究（苏州）有限公司组织样本库，组织样本包括肺癌-100-0015-B197样本、子宫内膜癌-100-0015-B313样本、肺癌-100-0015-B204样本，组织样本是经福尔马林固定和石蜡包埋处理的人体组织样本，均经病理证实，并有患者知情同意书。肺癌-100-0015-B197样本为经商业化抗体D9M2L（公司：Cell Signaling Technology，商品名：B7-H3 (D9M2L) XP® Rabbit mAb，货号#14058BF）验证为B7H3表达阳性的组织（M++)，作为强阳性对照。子宫内膜癌-100-0015-B313样本为经商业化抗体D9M2L验证为B7H3表达阳性组织（M+），作为弱阳性对照。肺癌-100-0015-B204样本为经商业化抗体D9M2L验证为B7H3表达阴性的组织（M-），作为阴性对照。经文献验证和D9M2L抗体验证证实，肺癌和子宫内膜癌组织样本，均为B7H3表达阳性组织。
（2）实验步骤
样品经烤片后，在Leica BOND-III（出厂编号3212741）全自动免疫染色系统上完成，其中一抗的用量均为抗体的最适使用浓度（0.1 μg/mL），具体程序如表2所示。
表2
（3）检测结果
免疫组织化学的检测结果如图10为B7-H3 (D9M2L) XP® Rabbit mAb检测肺癌-100-0015-B197的结果；图11为B7-H3 (D9M2L) XP® Rabbit mAb检测子宫内膜癌-100-0015-B313的结果；图12为B7-H3 (D9M2L) XP® Rabbit mAb检测肺癌-100-0015-B204的结果；图13为单克隆抗体MJ22-2检测肺癌-100-0015-B197的结果；图14为单克隆抗体MJ22-2检测子宫内膜癌-100-0015-B313的结果；图15为单克隆抗体MJ22-2检测肺癌-100-0015-B204的结果；图16为单克隆抗体MJ22-5检测肺癌-100-0015-B197的结果；图17为单克隆抗体MJ22-5检测子宫内膜癌-100-0015-B313的结果；图18为单克隆抗体MJ22-5检测肺癌-100-0015-B204的结果；经过专业病理工作人员对结果进行判读，此次免疫组化实验结果显示，商品化抗体D9M2L与本实施例5中的单克隆抗体MJ22-2、MJ22-5在检测肺癌-100-0015-B197、子宫内膜癌-100-0015-B313阳性组织中B7H3表达时，呈现细胞膜阳性染色，这与人B7H3表达在细胞膜上的结果相匹配，且其染色强度由高到低依次为：MJ22-2、D9M2L、MJ22-5；两种抗体在B7H3表达呈阴性的肺癌-100-0015-B204组织中，检测结果均为阴性。且实施例5中的单克隆抗体MJ22-2、MJ22-5在组织细胞上的染色无特异性染色背景。
因此，由实验结果可知，所述单克隆抗体MJ22-2能够特异性地检测人B7H3在肺癌、子宫内膜癌等组织中的表达，且其灵敏度比商用化抗体D9M2L及MJ22-5高。可以进一步地将所述单克隆抗体MJ22-2的性能进行优化和开发，以单独抗体或以试剂盒的形式应用于免疫组织化学实验，用于相关组织样本的检测。
综上，所述单克隆抗体MJ22-2能够特异性地检测人体组织中B7H3蛋白的表达，且灵敏度高、特异性强。
实施例10
本实施例提供一种B7H3免疫印迹检测试剂盒，所述B7H3免疫印迹检测试剂盒包括实施例5中所述的单克隆抗体MJ22-2、SDS-PAGE凝胶、PVDF膜、封闭液和酶标二抗。
所述SDS-PAGE凝胶的浓度为12%，所述封闭液为含5%脱脂奶粉的PBST封闭液，所述酶标二抗为HRP-山羊抗小鼠IgG。
实施例11
本实施例使用实施例10中所述的B7H3免疫印迹检测试剂盒对样本进行检测。其中单克隆抗体MJ22-2、MJ22-5、MJ22-10、MJ22-14、MJ22-16、MJ22-19为克隆号为MJ22-2、MJ22-5、MJ22-10、MJ22-14、MJ22-16、MJ22-19的杂交瘤细胞产生。
（1）实验步骤
将真核细胞293T、LNCaP、Jurkat、Raji表达的人B7H3内源蛋白（预测条带大小：57kDa，观测条带大小：95-130 kDa）上样于12%的SDS-PAGE凝胶，并以相同上样量的真核商品化蛋白作为阳性对照；在100 V下电泳，电泳结束后，将凝胶在1×转移液中浸泡10 分钟；剪取PVDF膜用甲醇处理后，与凝胶一起在电压为100 V的条件下转膜90分钟；然后将PVDF膜置于含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中于37℃封闭1小时；纯化后的单克隆抗体MJ22-2、MJ22-5、MJ22-10、MJ22-14、MJ22-16、MJ22-19（0.6 µg/mL）及对照抗体Rb mAb to B7H3（Abcam，0.516 µg/mL，货号GR3268730-1）用1%脱脂奶粉稀释后与PVDF膜室温孵育60分钟；HRP-山羊抗小鼠IgG按1:5000稀释，室温孵育60分钟，用ChemiDoc™ MP成像系统（全能成像系统）曝光。
（2）实验结果
实验结果如图19所示，泳道1：蛋白分子量标准；泳道2、6、10、14：真核细胞293T提取的细胞全蛋白，上样量为20 µg；泳道3、7、11：真核细胞LNCaP提取的细胞全蛋白，上样量为20 µg；泳道4、8、12、15：真核细胞Jurkat提取的细胞全蛋白，上样量为20 µg；泳道5、9、13：真核细胞Raji提取的细胞全蛋白，上样量为20 µg。泳道2、3、4、5：实施例5中的单克隆抗体MJ22-2，泳道6、7、8、9：为其同期研发的单克隆抗体MJ22-10，泳道10、11、12、13：为其同期研发的单克隆抗体MJ22-19，一抗孵育的浓度为0.6 µg/mL，二抗为HRP-山羊抗小鼠IgG，稀释比例为1:5000；泳道14、15：对照抗体Rb mAb to B7H3，一抗孵育浓度为0.516 µg/mL，二抗为HRP-山羊抗兔IgG，稀释比例为1:5000。
实验结果如图20所示：泳道1：蛋白分子量标准；泳道2、6、10：真核细胞293T提取的细胞全蛋白，上样量为20 µg；泳道3、7、11、14：真核细胞LNCaP提取的细胞全蛋白，上样量为20 µg；泳道4、8、12：真核细胞Jurkat提取的细胞全蛋白，上样量为20 µg；泳道5、9、13、15：真核细胞Raji提取的细胞全蛋白，上样量为20 µg。泳道2、3、4、5：为实施例5中的单克隆抗体MJ22-2同期研发的单克隆抗体MJ22-5，泳道6、7、8、9：为其同期研发的单克隆抗体MJ22-16，泳道10、11、12、13：为其同期研发的单克隆抗体MJ22-14，一抗孵育的浓度为0.6 µg/mL，二抗为HRP-山羊抗小鼠IgG，稀释比例为1:5000；泳道14、15：对照抗体Rb mAb to B7H3，一抗孵育浓度为0.516 µg/mL，二抗为HRP-山羊抗兔IgG，稀释比例为1:5000。
由实验结果可知，所述单克隆抗体MJ22-2与对照抗体在免疫印迹实验中均能够检测不同表达来源的内源性B7H3蛋白，免疫印迹的条带大小正确、特异性好、无非特异性背景。符合文献和资料显示，B7H3阳性表达细胞包括：LNCaP、293T，B7H3阴性表达细胞包括：Raji、Jurkat。说明单克隆抗体MJ22-2及同期研发的其他单克隆抗体的特异性较好。
实施例12
本实施例提供一种B7H3酶联免疫吸附检测试剂盒，所述B7H3酶联免疫吸附检测试剂盒包括实施例5中所述的单克隆抗体MJ22-2、封闭液和酶标二抗；所述封闭液为5% BSA；所述酶标二抗为HRP-山羊抗小鼠IgG。
实施例13
本实施例利用酶联免疫吸附实验（ELISA法），通过对抗体进行梯度稀释，比较MJ22-2抗体与商业化抗体Rb mAb to B7H3（公司：Abcam，货号#Ab219648）、B7-H3（D9M2L）XP® Rabbit mAb（公司Cell Signaling Technology，货号14058BF）的效价。
实验步骤：取真核表达的人B7H3重组蛋白，用PBS稀释至0.5 µg/mL，每孔包被100µL，在37℃孵育1小时，用PBST洗涤后，用4% BSA在37℃封闭1小时，再进行一抗孵育，一抗为实施例5中纯化后的抗B7H3单克隆抗体MJ22-2和商业化抗体Rb mAb to B7H3（公司：Abcam，货号#Ab219648）、B7-H3（D9M2L）XP® Rabbit mAb（公司Cell Signaling Technology，货号14058BF），调整3种抗体的初始浓度为1 mg/mL，然后分别梯度稀释，稀释比例依次为1:500、1:1500、1:4500、1:13500、1:40500、1:121500、1:364500、1:1093500、1:3280500和1:9841500，抗体稀释液作为阴性对照（N），以抗体稀释浓度为0.3 μg/mL的相对应抗体作为阳性对照（P），37℃孵育1小时。最后每孔加入对应的1:5000稀释的辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗鼠IgG（H+L）F(ab')2片段（品牌：Jackson，货号：115-036-003）和辣根过氧化物酶HRP标记亲和纯化山羊抗兔IgG（H+L（品牌：Jackson，货号：111-035-003）100 µL，进行二抗孵育后洗涤，加入TMB显色液显色，终止显色后，测定450 nm的OD值。
结果如表3所示，表3中商业化抗体1为Rb mAb to B7H3，商业化抗体2为B7-H3（D9M2L）XP® Rabbit mAb，抗B7H3单克隆抗体MJ22-2能够特异性地识别真核B7H3蛋白。抗体B7-H3（D9M2L）XP® Rabbit mAb的效价为1:1093500稀释浓度，Rb mAb to B7H3效价为1:3280500，MJ22-2效价为1:9841500，并在相同稀释条件下，抗B7H3单克隆抗体MJ22-2抗体对B7H3蛋白的反应的阳性OD值更高，说明其效价高于商品化抗体。
表3
综上，本发明提供的抗B7H3单克隆抗体与B7H3蛋白具有较高的亲和力，能够特异性地识别真核表达的B7H3蛋白，在制备B7H3检测试剂盒中具有重要的应用前景。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.一株产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株的分类命名为鼠抗人B7H3单克隆抗体杂交瘤细胞系，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45550，保藏日期为2023年04月25日。
2.一种抗B7H3单克隆抗体，其特征在于，所述抗B7H3单克隆抗体由权利要求1所述的产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。
3.根据权利要求2所述的抗B7H3单克隆抗体，其特征在于，所述抗B7H3单克隆抗体的亚型为IgG1型；
所述抗B7H3单克隆抗体的重链包括：
CDR1：GFTVSSYA；CDR2：ITSGGTYT；CDR3：PYGGWFAY；
所述抗B7H3单克隆抗体的轻链包括：
CDR1：TGAVTTSNY；CDR2：GTN；CDR3：ALWYSNHWV。
4.根据权利要求2所述的抗B7H3单克隆抗体，其特征在于，对纯化后的抗B7H3单克隆抗体进行修饰，所述修饰使用的修饰缀合物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5中的任意一种或至少两种的组合。
5.权利要求2-4中任一项所述的抗B7H3单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗B7H3单克隆抗体的制备方法包括：
培养权利要求1所述的产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株，纯化，获得所述抗B7H3单克隆抗体。
6.权利要求1所述的产生抗B7H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株和/或权利要求2-4中任一项所述的抗B7H3单克隆抗体在制备B7H3蛋白表达检测产品中的应用。
7.一种B7H3免疫组织化学检测试剂盒，其特征在于，所述B7H3免疫组织化学检测试剂盒包括权利要求2-4中任一项所述的抗B7H3单克隆抗体；
所述B7H3免疫组织化学检测试剂盒还包括：免疫组织化学抗原修复缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色剂或苏木素复染液中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种B7H3免疫印迹检测试剂盒，其特征在于，所述B7H3免疫印迹检测试剂盒包括权利要求2-4中任一项所述的抗B7H3单克隆抗体；
所述B7H3免疫印迹检测试剂盒还包括：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶、聚偏二氟乙烯膜、封闭液或酶标二抗中的任意一种或至少两种组合。
9.一种B7H3酶联免疫吸附检测试剂盒，其特征在于，所述B7H3酶联免疫吸附检测试剂盒包括权利要求2~4中任一项所述的抗B7H3单克隆抗体；
所述B7H3酶联免疫吸附检测试剂盒还包括：封闭液、酶标二抗、显色液或终止液中的任意一种或至少两种组合。
10.一种B7H3免疫荧光检测试剂盒，其特征在于，所述B7H3免疫荧光检测试剂盒包括权利要求2-4中任一项所述的抗B7H3单克隆抗体；
所述抗B7H3单克隆抗体修饰有荧光基团，所述荧光基团为异硫氰酸荧光素、Cy3或Cy5中的任意一种。
11.一种B7H3流式细胞术检测试剂盒，其特征在于，所述B7H3流式细胞术检测试剂盒包括权利要求2-4中任一项所述的抗B7H3单克隆抗体。
CN202311286635.8A 2023-10-08 2023-10-08 产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Active CN117025547B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311286635.8A CN117025547B (zh) 2023-10-08 2023-10-08 产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311286635.8A CN117025547B (zh) 2023-10-08 2023-10-08 产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117025547A CN117025547A (zh) 2023-11-10
CN117025547B true CN117025547B (zh) 2023-12-12

Family

ID=88645151

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311286635.8A Active CN117025547B (zh) 2023-10-08 2023-10-08 产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117025547B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109963591A (zh) * 2017-08-04 2019-07-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途
CN114480298A (zh) * 2022-04-14 2022-05-13 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一株分泌抗tigit单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
TW202307432A (zh) * 2021-06-16 2023-02-16 日商積水醫療股份有限公司 SARS-CoV-2之免疫測定方法及免疫測定套組、以及單株抗體或其之抗體片段
CN115768795A (zh) * 2020-05-08 2023-03-07 依勒克拉疗法公司 SIRPα及SIRPβ1抗体及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109963591A (zh) * 2017-08-04 2019-07-02 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途
CN115768795A (zh) * 2020-05-08 2023-03-07 依勒克拉疗法公司 SIRPα及SIRPβ1抗体及其用途
TW202307432A (zh) * 2021-06-16 2023-02-16 日商積水醫療股份有限公司 SARS-CoV-2之免疫測定方法及免疫測定套組、以及單株抗體或其之抗體片段
CN114480298A (zh) * 2022-04-14 2022-05-13 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 一株分泌抗tigit单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN117025547A (zh) 2023-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW201831516A (zh) 抗gpc3抗體
CN107022030B (zh) 检测甲胎蛋白的单克隆抗体及试剂盒和应用
CN114480298B (zh) 一株分泌抗tigit单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN110684740B (zh) 一种抗人泛素羧基末端水解酶-1(uch-l1)的单克隆抗体及其应用
CN116143921B (zh) 针对人cd31的兔单克隆抗体及其制备方法和应用
CN114058595B (zh) 一株分泌抗lag3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114075552B (zh) 分泌抗fgl1单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114605543B (zh) 一种抗hla-g异构体分子hla-g5及hla-g6的单克隆抗体及其用途
CN112500484B (zh) 一种抗trop2抗体及其应用
CN116925218B (zh) 小热休克蛋白hspb1的抗体、抗体组合物、杂交瘤细胞株及其应用
US11906520B2 (en) Composition and methods for detecting cancer
CN110511277B (zh) 一种抗hsp90单克隆抗体及其应用
CN117025547B (zh) 产生抗b7h3单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN114685664B (zh) 抗人b淋巴细胞表面抗原cd20的单域抗体及其应用
JP5857334B2 (ja) 上皮性卵巣癌マーカー検出用抗体及び上皮性卵巣癌判定方法
CN111434686B (zh) 一种抗人pbx1单克隆抗体，其制备方法及其在复发性流产临床诊断中的用途
CN109593135B (zh) 抗人pd-l1单克隆抗体及其应用
JP7181523B2 (ja) 糖鎖をエピトープとして特異的に認識する新規抗体及びその用途
CN114213542B (zh) Cps-i抗体及其用途
CN114853889B (zh) 针对人gpr48的单克隆抗体及其应用
CN116925219B (zh) 小热休克蛋白hspb1的抗体、杂交瘤细胞株及其应用
CN118005787A (zh) 一种抗人pd-1单克隆抗体及其制备方法和应用
Mao et al. A monoclonal antibody against human UL16-binding protein 3
US20230159652A1 (en) Transferrin receptor 1 targeting for carcinogenesis prevention
CN109354626B (zh) 抗MyoD1蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant