CN116143921B - 针对人cd31的兔单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供针对人CD31的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明具体提供针对人CD31的高亲和力兔单克隆抗体，其轻重链的互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.5、SEID NO.6、SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。本发明还利用该兔单克隆抗体开发的免疫组化检测方法，具有特异性高的优势。

Description

针对人CD31的兔单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种针对人CD31的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
CD31粘附分子，也称为PECAM-1，在细胞间连接处的内皮细胞和T细胞亚群上大量表达，在血小板和大多数其它白细胞(如单核细胞和中性粒细胞)上表达较少。CD31自身通过Ig-like C2-type 1和Ig-like C2-type 2结构域形成反式同源二聚体，细胞间相互作用需要反式同源二聚化，也可与白细胞整合素αvβ3结合。CD31是白细胞通过血管内皮细胞的细胞间连接跨上皮迁移所必需的。在人血浆中发现了CD31，这种循环亚型的存在被认为调节白细胞的跨内皮迁移。
CD31是跨膜糖蛋白，分子量130～140kDa，属于免疫球蛋白超家族。CD31是CD38的配体，在血栓形成和血管生成中起作用。CD31在内皮细胞中强表达，在巨核细胞、血小板、浆细胞、淋巴细胞(尤其是边缘区B细胞，外周T细胞)和嗜中性粒细胞中表达较弱。CD31敏感性和特异性优于CD34、人凝血因子Ⅷ相关抗原。CD31在绝大多数类型的血管性肿瘤如血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管瘤和血管肉瘤中表达。大多数情况下，卡波西肉瘤和上皮样血管内皮瘤也表达CD31。CD31可表达于血液淋巴肿瘤如慢性淋巴性白血病、浆细胞瘤、组织细胞增生症和幼年黄色肉芽肿中。因此，CD31主要标记单核细胞、颗粒细胞、内皮细胞和某些T细胞，主要用于良恶性血管源性肿瘤的诊断和鉴别诊断，亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。
但是，目前针对人CD31蛋白的高灵敏度检测技术并未得到有效研究和开发。
发明内容
基于此，有必要提供针对人CD31的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。该兔单克隆抗体适用于免疫组化检测人CD31蛋白，特异性好。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种针对人CD31的兔单克隆抗体，轻链全长序列如SEQ ID NO.1所示，重链全长序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区的序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的序列如SEQ ID NO.4所示，轻链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.5、SEID NO.6、SEQ IDNO.7所示，重链互补决定区的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
本发明还可以提供编码上述针对人CD31的兔单克隆抗体的基因，或者包含该基因的表达载体或者宿主。
本发明还可以提供抗体偶联物，主要由上述针对人CD31的兔单克隆抗体与抗原和/或荧光标记分子反应制备而成。
本发明还可以提供针对人CD31的兔单克隆抗体在制备检测人CD31的试剂或者试剂盒中的应用。所述检测的方法为免疫检测，所述免疫检测为免疫组织化学法、免疫印迹法、免疫沉淀法中的一种。
本发明还在于提供一种用于制备针对人CD31的兔单克隆抗体的免疫原，所述免疫原为包含氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重组蛋白。
本发明还提供针对人CD31兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将编码针对人CD31的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染宿主；培养获得包含兔单克隆抗体的上清液；纯化，即得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明选取人CD31蛋白C末端的第630位至第738位氨基酸片段为抗原，大肠杆菌Rosetta表达的基因片段，蛋白表达在上清，最后得到纯度较高的人CD31重组蛋白。利用人CD31重组蛋白作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得抗CD31蛋白的兔单克隆抗体及重链、轻链序列。本发明制备得到的兔单克隆抗体具有高特异性，可以特异性识别含人CD31蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。
附图说明
图1为用SDS-PAGE胶检测CD31蛋白表达在上清图。
图2为用SDS-PAGE胶检测CD31蛋白GST标签纯化图。
图3为构建含兔单克隆抗体重链恒定区的表达载体示意图。
图4为构建含兔单克隆抗体轻链恒定区的表达载体示意图。
图5为用免疫印迹的方法检测兔单克隆抗体针对细胞样本中CD31的识别特异性。
图6为用免疫沉淀方法检测兔单克隆抗体针对细胞样本Jurkat中CD31的识别特异性。
图7为实施例4中采用免疫组化检测人组织样本中CD31的染色定位图。
图8为对比例1中针对CD31的兔单克隆抗体2采用免疫组化检测人组织样本中CD31的染色定位图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
试验例1
本试验例提供重组CD31蛋白的表达纯化方法，具体步骤为：
1.1、蛋白表达质粒构建
使用包含人CD31 CDS序列的质粒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)为模板，以一对特异性引物扩增人CD31蛋白C末端的第630位至第738位目的片段，其中PCR反应体系如下：1μL模板，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，25μL2×Gloria Hi-FiPCRMasterMixwithGCBuffer(武汉爱博泰克生物科技有限公司)，22μL N.F H2O。
其中，人CD31蛋白第630位至第738位氨基酸片段序列如下：
AKQMPVEMSRPAVPLLNSNNEKMSDPNMEANSHYGHNDDVRNHAMKPINDNKEPLNSDVQYTEVQVSSAESHKDLGKKDTETVYSEVRKAVPDAVESRYSRTEGSLDGT(SEQ ID NO:11)。
引物对序列为：
CD31-Primer-F：
5'-GGTTCCGCGTGGATCCCCGGAAGCCAAGCAGATGCCAGTGG-3'(SEQ ID NO:12)；
CD31-Primer-R：
5'-TGGTGATGATGATGCGGCCGCTCAGTTCCATCAAGGGAGCCTTCCGTT-3'(SEQ ID NO:13)。
PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行30次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
将扩增的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式装载在表达载体上，所使用的原核表达载体为pGEX-4T-1(商业化载体)，经测序验证之后保存质粒，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
1.2、蛋白表达
将包含有CD31630-738aa序列的pGEX-4T-1质粒，转化至大肠杆菌Rosetta菌株，并在LB琼脂平板(含有100μg/mL氨苄青霉素)上于37℃温育过夜，以获得几个单菌落转化物。
将单菌落转化物接种于10mL聚丙烯管中的2mLLB培养液(含100μg/mL氨苄青霉素)中，于37℃下，以220rpm培养3～4小时，OD600nm约为0.4～0.6，接下来，将每种菌株的2mL培养物转移到在1L烧瓶中的400mLLB表达培养基中，于37℃下，以220rpm再培养3～4小时。当OD600nm达到约0.45～0.55时，加入0.8mMIPTG，37℃诱导3～4h，将诱导完成的菌液转移至干燥的500mL离心瓶中，用电子称平衡，质量不等则加纯水，水平转子4000rpm离心10min，弃上清，离心瓶正置，菌体-20℃冰柜保存。
取30mL的破菌液(50mM Tris-300mM NaCl)在离心瓶中悬浮菌体。将悬浮完成的菌液转移至50mL圆底离心管，放入冰盒中，用冰固定。选择变幅杆，放入破菌舱内，功率350W，破菌时间3s，间隔时间3s，倒计5min，之后置于冰水混合物中冷却5min，再重复上述步骤破菌5min。破菌完成后9000rpm离心10min得到上清液①和沉淀。
第二次破碎：量取30mL破菌液(2M尿素-PBS缓冲液)倒入沉淀中，吹匀沉淀，转移至50mL的圆底离心管中，功率350W，破菌时间3s，间隔时间3s，破碎0～5min(破碎时间按沉淀量及质地来决定，菌液置于冰块中)，9000rpm离心10min得到上清液②和包涵体，将得到的上清液①和上清液②用Loading Buffer分别做2倍稀释，包涵体做2倍稀释、10倍稀释；将得到的2倍稀释上清液①(简称“上1”)、2倍稀释上清液②(简称“上2”)、2倍稀释包涵体(简称“*2”)、10倍稀释包涵体(简称“*10”)样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图1所示。
由图1中的结果可以看出：CD31(630-738aa)-GST蛋白表达在上清液中。
1.3、蛋白获得
使用GST亲和层析树脂(汇研)通过亲和层析从上清液①中提取纯化CD31蛋白，纯化结果如图2所示。其中，从左至右，图2中泳道1和泳道2分别为0.4mg/mL和0.2mg/mL的BSA，泳道3为marker，泳道4为上清液①(简称“上1”)，泳道5为纯化过程中的流穿液(简称“FT”)，泳道6为收集的CD31蛋白2倍稀释液(简称“*2”)，泳道7为收集的CD31蛋白10倍稀释液(简称“*10”)。
从图2的SDS-PAGE胶图中可辨：得到了纯度为80％的重组CD31蛋白，包含CD31蛋白片段、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签及组氨酸蛋白标签。
试验例2
本试验例提供兔单克隆抗体的制备及纯化方法，具体包括如下步骤：
2.1、动物免疫：以重组人CD31蛋白(试验例1制备纯化获得)为免疫原，免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg免疫原，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射；首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人CD31蛋白的滴度，取血清按1:243K稀释后用ELISA测滴度，取OD450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
2.2、分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30～40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
2.3、B淋巴细胞分选：采用中国专利CN110016462B(专利名称：从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法)说明书中第[0030]～[0044]段的方法。
2.4、编码兔单克隆抗体基因的克隆
培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNATM MicroPrep试剂盒(购自ZYMO公司)提取RNA，并反转录成cDNA。
以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，挑选若干个克隆进行测序，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
其中，PCR反应体系如下：4μL cDNA，1μL正向引物(10mM)，1μL反向引物(10mM)，12.5μL 2×Gloria HiFi(武汉爱博泰克生物科技有限公司提供)，6.5μL N.F H2O。
其中，轻链可变区引物对为：
VL-Primer-F：
5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'(SEQ ID NO:14)；
VL-Primer-R：
5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'(SEQ ID NO:15)。
重链可变区引物对为：
VH-Primer-F：
5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'(SEQ ID NO:16)；
VH-Primer-R：
5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'(SEQ ID NO:17)。
PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
2.5、单克隆抗体制备和纯化
2.5.1、将步骤2.4中挑选出的若干个兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图3和图4。图3和图4中，pBR322origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，图3中Heavy chain constant为兔单克隆抗体重链恒定区的核苷酸序列，图4中Light chainconstant为兔单克隆抗体轻链恒定区的核苷酸序列。
2.5.2、将含兔单克隆抗体重链恒定区(图3)和轻链恒定区(图4)的哺乳动物细胞(如CHO、HEK293等)表达载体分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理。
2.5.3、将步骤2.4中扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将重链可变区基因和轻链可变区基因构建到相应的哺乳动物表达载体中；经测序验证之后，将含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染72～96小时获得培养上清中含有重组的识别人CD31的兔单克隆抗体。
使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人CD31蛋白的兔单克隆抗体，使用12％SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。
其中，挑选出的兔单克隆抗体的轻链基因序列为：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGACTGTTGCTGTTGTGGTTGCCTGGGGCGATTTGTGACCCCGTCCTCACTCAAACCCCCCCGTCTGTCTCAGCAGCGGTCGGCGGGACCGTTACGATAAGTTGTCAAGCATCCCAGACGATCTACAACAACGAATACTTGGCATGGTATCAGCAGAAACCTGGGCAGCCGCCGAAGCTGCTGATATATGACGCCAGTACACTCGCTAGTGGAGTCTCTTCCCGCTTTAAGGGTAGCGGGTCCGGTACCCAATTCACGCTGACAATCTCTGATGTTCAATGCGATGACGCTGCCACATATTACTGCCTGGGGGAGTTTACTTGTAGCACTATAGATTGTTTTTTGTTCGGAGGGGGCACAGAGGTTGTGGTTAAAGGTGATCCCGTCGCACCTACCGTCCTGATTTTTCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ ID NO:18)。
挑选出的兔单克隆抗体的轻链的可变区基因序列为：
GACCCCGTCCTCACTCAAACCCCCCCGTCTGTCTCAGCAGCGGTCGGCGGGACCGTTACGATAAGTTGTCAAGCATCCCAGACGATCTACAACAACGAATACTTGGCATGGTATCAGCAGAAACCTGGGCAGCCGCCGAAGCTGCTGATATATGACGCCAGTACACTCGCTAGTGGAGTCTCTTCCCGCTTTAAGGGTAGCGGGTCCGGTACCCAATTCACGCTGACAATCTCTGATGTTCAATGCGATGACGCTGCCACATATTACTGCCTGGGGGAGTTTACTTGTAGCACTATAGATTGTTTTTTGTTCGGAGGGGGCACAGAGGTTGTGGTTAAA(SEQ ID NO:19)。
挑选出的兔单克隆抗体的重链基因序列为：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTGGCAGTTTTGAAGGGAGTTCAGTGTCAGAGCCTGGAGGAGTCTGGCGGTCGGCTGGTTACGCCTGGTACCCCCCTGACACTCACCTGTACCGTCAGTGGAATTGATCTCAGTAGCTATGCTATGACATGGGTCAGGCAAGCGCCGGGTAAAGGTCTGGAGTGGATAGGAGCAGCAGGCAAGAGCGGCTTTTCTTATTACGCAACTTGGGCTAAGGGCAGGTTTACAATAAGCAAAAGCAGCACAACTATGGATCTGCGGATCATTAGTCCTACCACGGAGGACACCGCTACTTACTTTTGCGCCCGCCTGTCTGCAGCAATTGAACAGATAAACTTGTGGGGTCCGGGAACGTTGGTGACAGTGTCATCCGGCCAGCCCAAGGCTCCATCCGTGTTTCCGCTGGCCCCCTGTTGTGGCGACACTCCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA(SEQ ID NO:20)。
挑选出的兔单克隆抗体的重链可变区基因序列为：
CAGAGCCTGGAGGAGTCTGGCGGTCGGCTGGTTACGCCTGGTACCCCCCTGACACTCACCTGTACCGTCAGTGGAATTGATCTCAGTAGCTATGCTATGACATGGGTCAGGCAAGCGCCGGGTAAAGGTCTGGAGTGGATAGGAGCAGCAGGCAAGAGCGGCTTTTCTTATTACGCAACTTGGGCTAAGGGCAGGTTTACAATAAGCAAAAGCAGCACAACTATGGATCTGCGGATCATTAGTCCTACCACGGAGGACACCGCTACTTACTTTTGCGCCCGCCTGTCTGCAGCAATTGAACAGATAAACTTGTGGGGTCCGGGAACGTTGGTGACAGTGTCATCC(SEQ ID NO:21)。
其中，挑选出的兔单克隆抗体的序列如下：
轻链氨基酸序列：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGAICDPVLTQTPPSVSAAVGGTVTISCQASQTIYNNEYLAWYQQKPGQPPKLLIYDASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGEFTCSTIDCFLFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO:1)。
重链氨基酸序列：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMTWVRQAPGKGLEWIGAAGKSGFSYYATWAKGRFTISKSSTTMDLRIISPTTEDTATYFCARLSAAIEQINLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO:2)。
轻链可变区的氨基酸序列：
DPVLTQTPPSVSAAVGGTVTISCQASQTIYNNEYLAWYQQKPGQPPKLLIYDASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGEFTCSTIDCFLFGGGTEVVVK(SEQ ID NO:3)。
重链可变区的氨基酸序列：
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMTWVRQAPGKGLEWIGAAGKSGFSYYATWAKGRFTISKSSTTMDLRIISPTTEDTATYFCARLSAAIEQINLWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO:4)。
轻链互补决定区CDR1的氨基酸序列：
QTIYNNEYLAW(SEQ ID NO:5)。
轻链互补决定区CDR2的氨基酸序列：
LIYDASTLASGV(SEQ ID NO:6)。
轻链互补决定区CDR3的氨基酸序列：
LGEFTCSTIDCFLF(SEQ ID NO:7)。
重链互补决定区CDR1的氨基酸序列：
IDLSSYAMT(SEQ ID NO:8)。
重链互补决定区CDR2的氨基酸序列：
WIGAAGKSGFSYYATWAK(SEQ ID NO:9)。
重链互补决定区CDR3的氨基酸序列：
YFCARLSAAIEQINL(SEQ ID NO:10)。
上述兔单克隆抗体，轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG1型。
试验例3 特异性鉴定
取高表达CD31的细胞样本THP-1(中科院上海细胞库)、Jurkat(上海思路迪)，用免疫印迹的方法检测单克隆抗体的识别特异性，进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上。将膜置于含3％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入抗体CD31兔单克隆抗体(1:10000稀释，试验例2制备)，4℃孵育过夜。用TBST洗膜后，加入1:10000稀释的羊抗兔二抗(Jackson ImmunoResearch)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL显色液，显影，结果见图5。
CD31全长为738aa，理论分子量为83kd，蛋白表面有9个糖基化位点，影响蛋白的分子量大小，CST、Abcam检测内源样本中的CD31分子量均为130kd。由图5可以看出，筛选得到的CD31兔单克隆抗体特异性较好，检测到单一目的条带。
取高表达CD31的细胞样本Jurkat，用免疫沉淀的方法检测单克隆抗体的识别特异性。收集Jurakt细胞，离心，弃上清，收集沉淀，PBS清洗一次，加入IP实验专用细胞裂解液，充分裂解后应无明显沉淀，离心取上清备用；取30μL rProtein A/G Plus MaqPoly Beads(碧云天生物)清洗去除磁珠保护液，加入1ml Cell lysis buffer for IP(withoutinhibitors)(碧云天生物)，混匀，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃洗杂液，重复2次，加入1mL的3％BSA，置于翻转混合仪4℃封闭1h备用。在Jurkat细胞裂解液中加入3μgCD31兔单克隆抗体(试验例2制备)，置于翻转混合仪4℃过夜，将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备用好的磁珠(碧云天生物)进行混合，置于4℃下反应2h，将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离，收集上清液，进行后续WB检测；此实验时使用同型RabbitIgG作为空白对照。WB实验有三组样本，Input组：即未经IP的细胞裂解物，判断目标蛋白位置和富集相对程度；Isotype组：使用Isotye Control IP的产物，作为蛋白与IgG结合的背景信号；IP组：IP实验组，结果见图6。
由图6可以看出：CD31兔单克隆抗体可以从Jurkat样本中特异性的富集出CD31蛋白。
实施例4 免疫组化组织芯片染色和鉴定
(1)芯片选择：人CD31蛋白在人样本中广泛表达，可以选择人的肝、肺、结肠、食管、脑、胎盘、扁桃体和癌症样本结肠癌、乳腺癌、食管癌、肝癌、肺癌样本，用于免疫组化检测。
(2)IHC染色及分析
样本准备，烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液(无锡市江原实业技贸有限公司)1缸一起放入56℃的恒温箱中。
脱蜡至水：将石蜡切片(武汉赛维尔生物科技有限公司)连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，其中置于脱蜡液试剂缸时每缸放置5min，置于无水乙醇试剂缸中时每缸放置3min；用流水清洗切片3min。
抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH6.0)进行高压热修复(高压热修复是高火把修复液加热至沸腾后放入切片盖上锅盖，等高压锅开始喷气后调至中火，计时2分钟关火，等气压降下来后开盖，自然冷却至室温)。
内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温，孵育10min。
封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液。用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加封闭液-PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时。
一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液-PBS工作液1：25稀释的抗CD31兔单克隆抗体，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次。
二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(Dako REAL EnVisionDetection System,Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse,HRP；Dako)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次。
显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中即可终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min。
复染：将稍沥干的切片浸入Mayer’s苏木素中复染切片1min，复染完成后，用流水清洗3min。
返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min。
脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54～58℃)下完全干燥。
封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出。
切片扫描。
需要说明的是，免疫组化染色结果分为:阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。
使用试验例2制备的抗人CD31兔单克隆抗体在人胎盘、人肝、人肝癌、人肺癌，人结肠癌，人结肠，人乳腺癌，人食管，人食管癌，人脑，人扁桃体，人前列腺癌，人卵巢癌，人宫颈癌组织的血管内皮(样本来源武汉赛维尔生物科技有限公司)有特异性染色。
图7显示在人卵巢癌和人胎盘组织中的染色表现。结果显示，试验例2制备的抗人CD31兔单克隆抗体染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。结合免疫印迹和免疫沉淀的结果，说明抗人CD31兔单克隆抗体特异的识别人CD31蛋白，无非特异性染色，有效避免假阳性结果。
对比例1 免疫组化组织芯片染色和鉴定
另外，值得说明的是，试验例2实施过程中，还获得了其他针对CD31蛋白的兔单克隆抗体2(经测序比对，兔单克隆抗体2的重链可变区序列和轻链可变区序列与上述实施例2中挑选的抗人CD31兔单克隆抗体的序列不同)，发明人团队使用实施例4的样本和方法进行免疫组织染色进行应用，结果如图8所示。
图8显示兔单克隆抗体2在人胎盘中的染色表现，在细胞膜、细胞质、细胞核均有定位，抗体特异性差。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种针对人CD31的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO.5、SEID NO.6、SEQ ID NO.7所示，重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的针对人 CD31的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链可变区的序列如SEQ ID NO.3所示，所述兔单克隆抗体的重链可变区的序列如SEQID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的针对人 CD31的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链全长序列如SEQ ID NO.1所示；和/或
所述兔单克隆抗体的重链全长序列如SEQ ID NO.2所示。
4.编码权利要求1至3任一项所述的针对人 CD31的兔单克隆抗体的基因。
5.一种包含权利要求4所述基因的表达载体。
6.一种包含权利要求4所述基因的宿主。
7.一种抗体偶联物，其特征在于，由权利要求1至3任一项所述的针对人 CD31的兔单克隆抗体与荧光标记分子反应制备而成。
8.如权利要求1至3任一项所述的针对人 CD31的兔单克隆抗体在制备检测人CD31的试剂或者试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测的方法为免疫检测。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫检测为免疫组织化学法、免疫印迹法、免疫沉淀法中的至少一种。
11.一种权利要求1至3任一项所述的针对人 CD31兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将编码权利要求1至3任一项所述的针对人CD31的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染宿主；
培养获得包含兔单克隆抗体的上清液；
纯化，即得。
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