CN116731183B - 抗人cd13蛋白的兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体及其应用。所述抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示；重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明制备得到的抗CD13蛋白兔单克隆抗体具有高特异性，可以特异性识别合成和/或表达人CD13蛋白的血清、细胞或组织样本，适用于天然CD13蛋白或重组表达CD13蛋白的免疫学检测，具有高的准确性和良好的可靠性，特别是适用于免疫印迹、免疫组织化学检测和流式细胞术检测，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

Description

抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD13是一种Ⅱ型跨膜锌离子依赖型金属蛋白酶，也被称为氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN)，具有将氨基酸氨基端切除的活性，以两种形式存在，膜氨基肽酶N和可溶性氨基肽酶N。CD13最早被鉴定为髓性细胞的表面标志物，仅在髓系祖细胞和分化的髓系子代细胞表面表达，多见于前体细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，外周血和扁桃体淋巴细胞为阴性。近年来研究显示CD13也广泛分布于其它多种细胞，比如肾和肠的上皮细胞、活化的内皮细胞、中枢神经系统突触膜细胞等，具有重要的生物学功能，参与促血细胞分化发育、血管发生、细胞增殖、抗原的剪切和抗原呈递过程等生物事件，并可作为冠状病毒和其他人类病毒细胞表面受体等发挥作用，这些功能有助于调节生物活性肽反应(疼痛管理、加压素释放)，并影响免疫功能和主要生物事件(细胞增殖、分泌、侵袭、血管生成)，从而为多种疾病提供治疗选择。例如，CD13抑制剂在癌症治疗中具有广阔应用前景，已上市的乌苯美司(Ubenimex)在临床上被用于白血病和恶性实体肿瘤手术及放化疗后辅助治疗。此外，CD13是体外鉴别诊断中有用的免疫组化(IHC)标志物，多种肿瘤细胞已经检测出高表达CD13，如CD13在多种恶性实体瘤如黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌以及白血病中包括急性髓系白血病(AML)等中表达上调，对肿瘤细胞的侵袭、转移以及肿瘤新血管的形成和预后密切相关。CD13可用于AML免疫分型标志物，白血病免疫分型是对细胞形态学分型的重要补充，采用荧光标记的特定免疫分型标志物抗体联合免疫组织化学(IHC)或流式细胞分析(FCM)技术，可分析细胞的来源及分化阶段，判定白血病免疫表型。白血病免疫分型是诊断白血病的重要依据，具有准确性高、快速、特异性强等特点。另外，CD13在髓样肉瘤中的高表达使其在该肿瘤的诊断中也非常有价值。
鉴于CD13应用于科研和临床诊断与治疗的良好潜力，开发一种CD13蛋白水平检测方法、IHC病理及流式分析检测手段，具有非常重要的现实意义和临床使用价值。但现有的市售抗体多为兔多克隆抗体，产品质量不稳定，批次稳定差，且特异性较低，难以应用于免疫检测如IHC或FCM的分析需求，因此，开发特异性强、具备良好CD13蛋白结合能力且易于生产的单克隆抗体已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中抗人CD13蛋白抗体的特异性差、产品质量不稳定，难以用于免疫学检测等问题，本发明提供了抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体，并提供了该兔单克隆抗体在免疫检测人CD13蛋白中的应用。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括三个互补决定区，其中，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示。
进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。
进一步地，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成完整轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成完整重链；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体为全长抗体或具有免疫活性的抗体片段；所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体。
本发明第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包含如上所述的核酸分子。
本发明第四方面提供了如上所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体在免疫检测人CD13蛋白中的应用。
进一步地，免疫检测方法包括免疫印迹法、免疫组织化学法和流式细胞术中的至少一种。
进一步地，免疫检测样本包括表达CD13蛋白的组织样本、合成人CD13蛋白的细胞系样本、分泌人CD13蛋白的血清样本和重组表达的CD13蛋白中的至少一种。
本发明的优点及积极效果为：
本发明制备得到的抗CD13蛋白的兔单克隆抗体具有高特异性，可以特异性识别合成和/或表达人CD13蛋白的血清、细胞或组织样本，适用于天然CD13蛋白或重组表达的CD13蛋白的免疫学检测，具有高的准确性和良好的可靠性，特别是适用于免疫印迹、免疫组织化学检测和流式细胞术检测，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为预先携带重链恒定区和抗体轻链恒定区的pRB322载体图谱；
图2为本发明实施例2兔单克隆抗体1G3与不同细胞样本结合的免疫印迹检测图；
图3为本发明实施例3兔单克隆抗体1G3与人胎盘组织样本结合的免疫组织化学检测图；
图4为本发明实施例3兔单克隆抗体1G3与人扁桃体组织样本结合的免疫组织化学检测图；
图5为本发明实施例3兔单克隆抗体1G3与人肝组织样本结合的免疫组织化学检测图；
图6为本发明实施例3兔单克隆抗体1G3与人脑组织样本结合的免疫组织化学检测图；
图7为本发明实施例4兔单克隆抗体1G3与阳性细胞样本结合的流式细胞检测图；
图8为本发明实施例4兔单克隆抗体1G3与阴性细胞样本结合的流式细胞检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
在本发明的上下文中，术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”和“兔单抗”等类似词语具有相同含义，可互换使用，均指特异性结合人(Human)CD13蛋白的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。其中，“抗体片段”是指全长抗体的一个或多个部分或片段，在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，CDR由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
术语“抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)”是抗体分子中可以与抗原结合的区域，其由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和一个恒定区片段)组成，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc'片段。F(ab')2片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备单链抗体(scFv)一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构，在临床诊断和治疗上应用广泛。
术语“可变片段(Fv)”位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整抗体。
术语“单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)“是指重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成的最小抗体片段，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以来自单一物种，例如兔，或者可以是嵌合的或人源化的抗体，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”抗体是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自人FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如人兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到人类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。
术语“单克隆抗体”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的结构、来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区(VL)和所述重链可变区(VH)均包括三个互补决定区(CDR)，依次用CDR1、CDR2和CDR3表示，其中，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明采用单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体技术平台进行开发，获得抗CD13蛋白的兔单克隆抗体的重链和轻链序列，将编码重链、轻链的核酸连接至表达载体中后，转化宿主细胞并培养，最后纯化得到抗CD13蛋白的兔单克隆抗体。与市售常见传统鼠单抗及兔多抗相比，为抗体序列已知的CD13重组单抗，更易批量化生产且批次稳定，产品质量高。而且，本发明得到的抗CD13蛋白的兔单克隆抗体具有高特异性，可以特异性识别合成和/或表达人CD13蛋白的血清、细胞或组织样本；具体而言，通过蛋白印迹法检测表达CD13蛋白的阳性细胞样本(人单核细胞白血病细胞系THP-1)和不表达CD13蛋白的阴性细胞样本(人T淋巴细胞瘤细胞系Jurkat)，发现仅在阳性细胞样本中检测出单一条带且条带清晰、无拖带，在阴性细胞中未检测到非特异性条带；通过免疫组织化学法检测多个表达CD13蛋白的组织，其能够检测出所有阳性组织样本且在阴性组织样本中无非特异性染色，检测灵敏度和特异度都高达100％；通过流式细胞术检测细胞表面表达的CD13蛋白，仅在表达CD13蛋白的阳性细胞样本(肝癌细胞系Hep G2)有特异性结合且荧光信号强度单一，荧光跃迁良好，阳性信号强，在阴性细胞样本Jurkat细胞上无非特异性结合；前述结果证实本发明的抗体对CD13蛋白有很好的特异性和高的亲和力，用于免疫检测时具有高的准确性和良好的可靠性，适用于天然表达的CD13蛋白或重组表达的CD13蛋白的免疫学检测，特别是免疫组化检测和流式细胞术检测，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。
可选地，所述轻链可变区(VL)和所述重链可变区(VH)均包括框架区(FR)，其中每一条链的4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区，对应地，本发明的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体的所述轻链可变区(VL)的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
可选地，所述抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体还包括轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)，CL和VL构成完整轻链，CH和VH构成完整重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa C reign获得CL。
可选地，包含所述轻链恒定区的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含所述重链恒定区的所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述轻链恒定区为κ型，所述重链恒定区为IgG型。
本发明不仅包括完整的抗体(全长抗体)，还包括具有免疫活性的抗体的片段(抗体片段)，该片段是指基本上保持与兔单克隆抗体的全长形式具有相同的生物学功能或活性的多肽。抗体片段包括但不限于：(i)Fab片段，由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区构成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fv片段，由抗体的一个重链可变区和一个轻链可变区构成；(iv)(Fv)2片段，由两个共价连接在一起的Fv片段构成；(v)scFv片段，由单一多肽链构成的Fv片段，一个重链可变区和一个轻链可变区通过接头连接形成；(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接成。这些抗体片段和衍生物是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的。
上述所述的抗体片段具有如上所述的CDR区(SEQ ID NO.3-5和8-10)，更优选地具有如上所述的可变区(SEQ ID NO.2和7)，保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原CD13蛋白，尤其是结合于相同表位。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体。
核酸分子可以是DNA(例如cDNA或基因组DNA或合成DNA)形式或RNA(例如mRNA或合成RNA)形式。DNA可以是单链或是双链，也可以是编码链或非编码链。核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。
核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当序列较长时，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链和轻链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
本发明另一实施例提供了一种重组载体，所述重组载体携带如上所述的核酸分子。
本发明的典型载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许插入到载体的核酸分子在细胞中表达)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。本发明的核酸分子或其片段可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
需要说明的是，编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以克隆至一个载体中，每段核苷酸序列连接到合适的启动子下游。如，编码重链与轻链的每段核苷酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些具体的实施方式中，编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子也可以别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转化如上所述的表达载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出单克隆抗体，然后再进行分离。
重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能转化DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔以及脂质体包装等。
在较佳的实施方式中，所述重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293细胞)。
本发明实施例还提供了如上所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体在免疫检测人CD13蛋白中的应用。
所述抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体、核酸分子、重组载体在制备人CD13蛋白免疫检测试剂和/或检测试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
本发明的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体可以单独使用，也可以与可检测标记物(为检测目的)结合或偶联。用于检测目的的可检测标记物包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶(如辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
在免疫检测时，将本发明的抗体作为抗原结合抗体(捕获抗体)，其特异性识别和结合待检样本中的CD13蛋白，之后通过与其连接的可检测标记物产生可识别的信号变化，或者通过偶联有可检测标记物的检测抗体特异性结合本发明的抗体以产生可识别的信号变化，从而实现定性或定量检测人CD13蛋白。本发明提供的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体能够用于建立特异性好、准确性高的免疫学检测方法。
在较佳的实施方式中，所述免疫检测方法为免疫印迹法(Western blot，WB)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)和流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)中的至少一种。本发明的免疫检测方法还可以是酶免疫分析法(Enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)或免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)。
可选地，免疫检测样本包括但不限于：表达CD13蛋白的组织样本、合成人CD13蛋白的细胞系样本、分泌人CD13蛋白的血清样本和重组表达的CD13蛋白，其中，血清、细胞或组织中CD13蛋白以天然状态存在。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体的制备
1、动物免疫
以重组人CD13蛋白(武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RP00188)为免疫原，免疫3只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对人CD13的滴度，取血清滴度高的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
2、分离脾脏中B淋巴细胞
分离脾细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基，放一个细胞筛网，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BioGems公司)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。
3、B淋巴细胞分选与培养
B淋巴细胞的分选和培养：参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。
4、编码兔单克隆抗体基因的克隆
培养后的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA鉴定出能够结合人CD13蛋白的阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后按Quick-RNATMMicroPrep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。其中，反转录体系如下：Oligo(dT)12-18primer(Life)1μL、dNTPs(10mM)1L、RNA 1μL；在PCR仪中进行65℃、5min后，向以上产物中加入5×FS Buffer(ABconal)4μL、DTT(100mM)μL、RNase OUT(40U/μL)1μL、ABScriptⅡRT(200U/μL)(ABconal)1μL，混匀后在42℃、1h，85℃、5min下进行反应，得到cDNA。以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来，PCR反应体系如下：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×GloriaHiFi(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20717)和6.5μL H2O；PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。
上述所述的正向引物和反向引物的核酸序列如下所示：
VL-F：5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'(SEQ ID NO.11)；
VL-R：5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'(SEQ ID NO.12)；
VH-F：5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'(SEQ ID NO.13)；
VH-R：5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'(SEQ ID NO.14)。
将扩增得到的cDNA进行测序，将获得的兔单克隆抗体的重链、轻链可变区基因纯化后，分别装载在表达载体pBR322上，所使用的表达载体pBR322预先携带轻链和重链恒定区，其表达图谱见图1，图中，pBR322Ori和f1Ori是E.coli中的复制起始位点，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV Promoter为转录启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Heavychain constant为重链恒定区的核酸序列(左图)，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(右图)。具体方法步骤如下：将含兔单克隆抗体CH和CL的哺乳动物细胞表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，将上述扩增后的PCR产物进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将上游具有信号肽编码基因的VL基因和VH基因构建到表达载体中，并经测序确定序列，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。
需要说明的是，本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，具体可参见专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”或“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”，轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”或“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。
将本实施例得到的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体命名为1G3，氨基酸序列见表1。
表1本发明的兔单克隆抗体1G3的氨基酸序列信息汇总
5、兔单克隆抗体1G3的生产和纯化
为了获得多株识别人CD13蛋白的兔单克隆抗体，将上述构建成功的含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染后培养72-96h，培养获得包含针对人CD13蛋白的兔单克隆抗体的上清液。使用protein A亲和凝胶树脂从培养上清液中纯化出识别人CD13蛋白的兔单克隆抗体1G3，亲和层析采用本领域的常规操作，在此不再赘述，纯化的抗体浓度为2mg/mL。
实施例2针对兔单克隆抗体1G3的免疫印迹分析
细胞培养：在48孔细胞培养板中，传代培养细胞，当汇合度处于70-80％时，吸出培养液上清，使用PBS溶液小心清洗细胞两次，备用。细胞包括阳性细胞样本(人单核细胞白血病细胞系THP-1)、阴性细胞样本(人T淋巴细胞瘤细胞系Jurkat)。
免疫印迹实验：将上述细胞分别裂解，得到蛋白提取液，进行6％聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后按常规操作在电转移系统中将凝胶上的蛋白带转移到PVDF膜上，将膜置于含3％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入纯化后的CD13兔单克隆抗体1G3(1:40000稀释，实施例1制备)，4℃孵育过夜；之后用TBST洗膜后，加入1:10000稀释的羊抗兔二抗(HRPGoat Anti-Rabbit IgG(H+L)，武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号AS014)，室温孵育1h；再次用TBST洗膜，加入ECL超敏显色液，显影，结果见图2。
CD13全长为967aa，理论分子量为109.54kDa，该蛋白有10个糖基化位点，糖基化是一种常见的蛋白翻译后修饰，其会降低蛋白在凝胶中的迁移速率，使得实际检测的蛋白分子量比理论分子量偏大，检测内源CD13蛋白(机体或细胞自身表达的天然蛋白)的分子量为160kDa。由图2可以看出，筛选得到的抗CD13蛋白的兔单克隆抗体1G3特异性良好，在阳性细胞样本THP-1中检测到单一条带，在阴性细胞样本Jurkat中未检测到非特异性条带，趋势正确，且实际检测分子量与CST公司检测大小以及文献报道(PMID：8102558)大小吻合，说明兔单克隆抗体1G3能够特异识别人CD13蛋白，且无非特异性结合，进而可以有效避免假阳性结果，检测准确性高。
实施例3针对兔单克隆抗体1G3的免疫组织化学分析
1、芯片选择
人CD13蛋白在人组织中广泛分布，选择病理芯片(购自购自百奥斯，货号TMA000-24-H)的阳性样本(21例)有人常规肝、肺、宫颈、结肠、乳腺、扁桃体和胎盘组织以及肝细胞癌、肺鳞癌、子宫内膜样癌、宫颈鳞状细胞癌、结肠浸润性腺癌、乳腺浸润性导管癌、结外NK/T细胞淋巴瘤、肝胆管癌、肺腺癌、卵巢浆液性癌、子宫内膜间质肉瘤、高级别尿路上皮癌、前列腺腺癌、小细胞肺癌样本；阴性样本(3例)有恶性胶质瘤、卵巢、脑(神经元)，均仅内皮细胞着色。
2、免疫组织化学法(IHC)染色及分析
样本准备和烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中，脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min；前述的脱蜡液1-3购自无锡市江原实业技贸有限公司；
抗原修复：0.01M Tris-EDTA修复液(pH9.0)高压热修复；
内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温孵育10min；
封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时；
一抗孵育：除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液-PBS工作液稀释的兔单克隆抗体1G3(一抗稀释比1：200)，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；
二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(剂瓶A，购自Dako，货号K5007)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的二抗工作液，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；
显色：在切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后，将切片浸入大量蒸馏水中终止显色，终止显色后，将切片入流水中清洗10min；
复染：将稍沥干的组织切片浸入Mayer’s苏木素复染1min，之后用流水清洗3min；
返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min；
脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54-58℃)下完全干燥；
封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出；
最后进行切片扫描。
免疫组化染色结果分为：阳性和阴性，其中阳性信号需在特定组织和细胞中有棕褐色着色且背景低，即理论上应该显示棕褐色的细胞或组织着色程度中等、理论不应该着色的细胞和组织没有着色，细胞核经苏木精复染呈现蓝色，可显示被特定免疫染色的细胞背景轮廓，用于判断靶蛋白的亚细胞定位。如人胎盘为蜕膜细胞细胞膜、细胞质中CD13蛋白中等表达(见图3)；人扁桃体为网状纤维和部分内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和粒细胞细胞膜、细胞质中CD13蛋白高表达，相应细胞的细胞膜、细胞质应当着色，鳞状上皮细胞及T、B淋巴细胞无表达，不着色(见图4)；人肝为胆管细胞细胞膜、细胞质中CD13蛋白高表达，相应细胞的细胞膜、细胞质应当着色，肝细胞无表达，不着色(见图5)；人脑仅内皮细胞细胞膜、细胞质中CD13蛋白中等表达，其他细胞无表达，不着色(见图6)。
统计切片扫描24例样本结果，兔单克隆抗体1G3定位在于细胞膜、细胞质中，呈现清晰的棕褐色染色且无非特异性染色，背景干净。其中阳性对照样本中，在21个阳性样本中均有特异性染色，灵敏度为21/21＝100％，阴性对照样本中，3例均为阴性，特异度为3/3＝100％。说明抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体1G3特异性识别人CD13蛋白，无非特异性染色，可满足病理样本的高准确性和高精度检测。
实施例4针对兔单克隆抗体1G3的流式细胞分析
选用CD13蛋白高表达的细胞样本肝癌细胞系Hep G2及阴性细胞样本Jurkat，用流式细胞术检测兔单克隆抗体1G3的识别特异性，包括如下步骤：
1)细胞培养：将培养好的Jurkat细胞收集于50mL离心管中并计数；400g离心5min，去上清。将培养好的Hep G2细胞培养基上清收集到50mL离心管中，用PBS清洗残余培养基，吸弃PBS，加入3mL TrypLETMExpress酶(1X)和无酚红gibco 12604021，消化5min左右，用培养基上清终止消化，收集于50mL离心管中并计数；500g离心4min，去上清。
将收集的细胞用1mL 0.5％ BSA/PBS溶液重悬，400g离心3min，重复2次，取5×106细胞/mL用0.5％ BSA/PBS溶液中重悬细胞至750μL。96孔板中每孔加50μL细胞悬液。
2)一抗孵育：将兔单克隆抗体1G3分配到96孔板里，兔单克隆抗体1G3工作浓度为2.5μg/mL，振荡，室温反应20min；采用rabbit IgG1(Kappa)作为兔同型对照(Rabbitisotype control，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色)，同型对照抗体的工作浓度为2.5μg/mL。
3)二抗孵育：加入100μL按照1：600稀释的荧光二抗GαR 2o Ab(购自Jackson，货号111-606-046)重悬避光振荡，室温反应20min。
4)以400g的速度离心5min，去上清；加入200μL 0.5％ BSA/PBS重悬，400g离心5min，上清，重复两遍，最后用150μL 0.5％ BSA/PBS重悬细胞，上机分析。按Beckmancytoflex流式分析仪使用与维护SOP-105-AND-CA-008操作进行分析。
流式细胞术检测结果分为：阳性和阴性。阳性必须在细胞上有特定的信号跃迁才能视为阳性，阴性在细胞上无信号跃迁才能视为阴性。如图7-8所示，横坐标代表通道的荧光信号值，纵坐标代表其对应的细胞数，红色曲线为空白对照检测结果，蓝色曲线为同型对照检测结果，橘黄色曲线为CD13抗体检测结果。使用兔单克隆抗体1G3，仅在阳性样本HepG2细胞有2个数量级的特异性信号跃迁，跃迁信号明显；在阴性样本Jurkat细胞系无信号跃迁，趋势正确，证实抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体1G3对于流式细胞术检测有很好的特异性和高的亲和力，无非特异性识别，能有效避免假阳性结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括三个互补决定区，其中，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求1所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。
4.根据权利要求3所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成完整轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成完整重链；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求1或2所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为全长抗体或具有免疫活性的抗体片段；所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
6.一种核酸分子，其特征在于，用于编码如权利要求1-5任一项所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体。
7.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求6所述的核酸分子。
8.如权利要求1-5任一项所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体在制备免疫检测人CD13蛋白试剂和/或试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体在制备免疫检测人CD13蛋白试剂和/或试剂盒中的应用，其特征在于，免疫检测方法包括免疫印迹法、免疫组织化学法和流式细胞术中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的抗人CD13蛋白的兔单克隆抗体在制备免疫检测人CD13蛋白试剂和/或试剂盒中的应用，其特征在于，免疫检测样本包括表达CD13蛋白的组织样本、合成人CD13蛋白的细胞系样本、分泌人CD13蛋白的血清样本和重组表达的CD13蛋白中的至少一种。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102175885B1 (ko) * 2019-05-07 2020-11-06 한국생명공학연구원 재조합 돼지 유래 아미노펩티다아제 N(pAPN) 단백질 및 이를 이용한 항-pAPN 항체 제조 방법
CN113512538A (zh) * 2021-04-21 2021-10-19 扬州大学 抗猪源氨肽酶n蛋白单克隆抗体及其应用
WO2023037015A1 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 Universiteit Gent Aminopeptidase n-specific monoclonal antibodies and uses thereof

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017214555A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-14 The Regents Of The University Of Michigan Modulation of aminopeptidase n/cd13 and rheumatoid arthritis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102175885B1 (ko) * 2019-05-07 2020-11-06 한국생명공학연구원 재조합 돼지 유래 아미노펩티다아제 N(pAPN) 단백질 및 이를 이용한 항-pAPN 항체 제조 방법
CN113512538A (zh) * 2021-04-21 2021-10-19 扬州大学 抗猪源氨肽酶n蛋白单克隆抗体及其应用
WO2023037015A1 (en) * 2021-09-13 2023-03-16 Universiteit Gent Aminopeptidase n-specific monoclonal antibodies and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
抗人CD13单克隆抗体的研制;施思;ＣＮＫＩ学位论文库;全文 *
抗猪氨基肽酶单克隆抗体的制备及阻断氨基肽酶受体功能的分析;焦文超;ＣＮＫＩ学位论文库;全文 *

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