CN117700562A

CN117700562A - 靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN117700562A
Application number: CN202311717339.9A
Authority: CN
Inventors: 陈露; 胡文娟; 吴海; 代海艳; 李倩倩; 李博
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2023-12-12
Filing date: 2023-12-12
Publication date: 2024-03-15

Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体及其应用。所述兔单克隆抗体的轻链互补决定区1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示；重链互补决定区1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体性能良好，能够特异性识别嘌呤霉素，且抗体识别和结合嘌呤霉素的亲和力高、抗干扰能力强，保证了多物种细胞或组织免疫检测的灵敏度、特异度、可靠性和准确性，大大降低了假阳性或假阴性结果的发生率，在临床诊断和科研检测中具有良好的市场化前景。

Description

靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

嘌呤霉素(Puromycin)是一种由白黑链霉菌发酵代谢产生的氨基核苷类抗生素，具有与tRNA分子末端类似的结构，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合并渗入到延伸的肽链中，最终导致蛋白合成提前终止并释放出C-末端含嘌呤霉素的不成熟多肽。在原核和真核细胞中，嘌呤霉素都是强效的蛋白质合成抑制剂，同时它导致多种分子量的小肽的积累，因此，通过检测嘌呤霉素掺入新合成蛋白质的量可用于直接监测蛋白质翻译活性，反映mRNA翻译的速率。

近年来，嘌呤霉素作为蛋白合成研究的基本工具被广泛使用，采用抗嘌呤霉素的单克隆抗体结合嘌呤霉素的免疫检测技术的开发使得在体外扩增和细胞测定中对蛋白翻译活性的定量化成为可能，如嘌呤霉素抗体可以分析总蛋白质的合成效率。此外，体内嘌呤化测定也成为了定位细胞中翻译核糖体的流行工具，可揭示翻译核糖体的亚细胞定位位点，如细胞核中嘌呤化肽在释放后积累，并不一定与活性翻译位点一致。以嘌呤霉素为基础的成像方法也被广泛应用，特别是在神经生物学领域，神经元突起的翻译对神经元功能至关重要。也有研究嘌呤霉素治疗结合邻位连接技术，来监测一些翻译位置的特定蛋白。因此，急需开发一种高灵敏度、高特异性的靶向嘌呤霉素的单克隆抗体产品，对于生物学技术方面的蛋白质翻译水平分析、嘌呤霉素检测与定位等方面的研究具有非常重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中缺乏难以用于免疫检测的性能良好的嘌呤霉素单克隆抗体等问题，本发明提供了靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体，并提供了该兔单克隆抗体在制备免疫检测嘌呤霉素试剂和/或试剂盒中的应用。

为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括三个互补决定区，其中：轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

更进一步地，所述轻链恒定区为κ型，所述重链恒定区为IgG型。

进一步地，所述兔单克隆抗体为全长抗体或具有免疫活性的抗体片段；所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)₂片段、Fv片段、(Fv)₂片段、scFv片段和sc(Fv)₂片段中的至少一种。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如上所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体。

本发明第三方面提供了一种重组载体或宿主细胞，所述重组载体或所述宿主细胞携带如上所述的核酸分子。

本发明第四方面提供了如上所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体或宿主细胞在制备免疫检测嘌呤霉素试剂和/或试剂盒中的应用。

进一步地，免疫检测方法为免疫印迹法、免疫沉淀法、酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫荧光法、免疫组织化学法和流式细胞法中的至少一种。

本发明第五方面提供了一种嘌呤霉素免疫检测试剂盒，包括如上所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体或所述兔单克隆抗体与可检测标记偶联的免疫偶联物。

进一步地，所述试剂盒为免疫印迹试剂盒、免疫沉淀试剂盒、酶免疫分析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、酶联免疫斑点试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫组织化学试剂盒和流式细胞试剂盒中的至少一种。

进一步地，所述可检测标记为生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素和检测抗体中的至少一种。

本发明的优点及积极效果为：

本发明制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体性能良好，能够特异性识别嘌呤霉素，且抗体识别和结合嘌呤霉素的亲和力高、抗干扰能力强，保证了多物种细胞或组织免疫检测的灵敏度、特异度、可靠性和准确性，大大降低了假阳性或假阴性结果的发生率，在临床诊断和科研检测中具有良好的市场化前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1构建靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体表达载体所用的哺乳动物载体pBR322的图谱，从左至右分别为预先携带轻链恒定区和重链恒定区的pRB322载体图；

图2为本发明实施例2兔单克隆抗体与不同细胞样本结合的免疫印迹检测结果图，其中，从左至右分别为经嘌呤霉素处理过的293F和Raw264.7细胞；

图3本发明实施例2兔单克隆抗体与293F细胞结合的免疫沉淀检测结果图；

图4为本发明实施例2兔单克隆抗体与不同细胞结合的免疫荧光检测结果图，其中，从左至右分别为经嘌呤霉素处理前后的HeLa和Raw264.7细胞；

图5为本发明实施例2兔单克隆抗体与293T细胞结合的流式细胞检测结果图，其中，图a为阳性293T细胞直方图，图b为正常293T细胞直方图，图c为Rabbit Isotype IgG散点图，图d为阳性293T细胞散点图；

图6为本发明实施例2兔单克隆抗体与Raw264.7细胞结合的流式细胞检测结果图，其中，图a为阳性Raw264.7细胞直方图，图b为正常Raw264.7细胞直方图，图c为RabbitIsotype IgG散点图，图d为阳性Raw264.7细胞散点图；

图7为本发明实施例2兔单克隆抗体与C6细胞结合的流式细胞检测结果图，其中，图a为阳性C6细胞直方图，图b为正常C6细胞直方图，图c为Rabbit Isotype IgG散点图，图d为阳性C6细胞散点图；

图8为本发明实施例2兔单克隆抗体与嘌呤霉素处理前后的小鼠造模心脏结合的免疫组织化学检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。

在本发明的上下文中，术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”和“兔单抗”等类似词语具有相同含义，可互换使用，均指特异性结合嘌呤霉素(Puromycin)的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。

抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白(ImmunoglobμLin，Ig)分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。其中，“抗体片段”是指全长抗体的一个或多个部分或片段，在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)₂、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv、sc(Fv)₂。

典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

CDR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，CDR由Kabat编号系统来定义。

轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。

全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。

术语“抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)”是抗体分子中可以与抗原结合的区域，其由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和一个恒定区片段)组成，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)₂片段和一个pFc'片段。F(ab')₂片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备单链抗体(scFv)一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构，在临床诊断和治疗上应用广泛。

术语“可变片段(Fv)”位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整抗体。

术语“单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)“是指重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成的最小抗体片段，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。

本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以来自单一物种，例如兔，或者可以是嵌合的或人源化的抗体，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”抗体是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自人FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如人兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到人类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。

术语“单克隆抗体”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的结构、来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。

术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

本发明实施例提供了一种靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区(VL)和所述重链可变区(VH)均包括三个互补决定区(CDR)，依次用CDR1、CDR2和CDR3表示，其中，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本发明以血蓝蛋白(KLH)偶联嘌呤霉素(Puromycin)化合物为免疫原，对日本大耳白兔进行免疫，之后基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体并经测序确定重链和轻链序列。本发明所得抗体在采用免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫荧光法、流式细胞术分析经嘌呤霉素处理前后的细胞样本(如人胚胎肾细胞293F、人肾上皮细胞293T、人宫颈癌细胞HeLa、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7和大鼠胶质瘤细胞C6)时，仅在嘌呤霉素处理过的阳性细胞中检测出阳性信号，且阳性信号明显，抗体结合嘌呤霉素的实际定位与预期相符；进一步由免疫组织化学法检测阳性和阴性组织样本，在阳性组织样本中着色准确且在阴性和阳性组织样本均无非特异性染色，能够有效区分不同类型样本。结合前述多种免疫检测的结果，证明了本发明筛选得到的嘌呤霉素兔单克隆抗体性能良好，能够特异性识别嘌呤霉素，且抗体识别和结合嘌呤霉素的亲和力高、抗干扰能力强，保证了多物种细胞或组织免疫检测的灵敏度、特异度、可靠性和准确性，大大降低了假阳性或假阴性结果的发生率，在临床诊断和科研检测中具有良好的市场化前景。

可选地，所述轻链可变区(VL)和所述重链可变区(VH)均包括框架区(FR)，其中每一条链的4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。本发明兔单克隆抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

可选地，本发明的兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成完整轻链，CH和VH构成完整重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。

具体地，包含CL的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含CH的所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，对应地，CL为κ型，CH为IgG型。

本发明的兔单克隆抗体可以为全长抗体或抗体片段，该抗体片段是指基本上保持与兔单克隆抗体的全长形式具有相同的生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗体片段包括如上所述的CDR区(SEQ ID NO.3-5、SEQ ID NO.8-10)，更优选地具有如上所述的可变区(SEQ ID NO.2或7)，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原嘌呤霉素，尤其是结合于相同表位。所述抗体片段包括但不限于：(i)Fab片段，由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区构成的单价片段；(ii)F(ab)₂片段，包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fv片段，由抗体的一个重链可变区和一个轻链可变区构成；(iv)(Fv)₂片段，由两个共价连接在一起的Fv片段构成；(v)scFv片段，由单一多肽链构成的Fv片段，一个重链可变区和一个轻链可变区通过接头连接形成；(vi)sc(Fv)₂片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接成。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常规技术获得。

本发明又一实施例提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体。

核酸分子可以是DNA(例如cDNA或基因组DNA或合成DNA)形式或RNA(例如mRNA或合成RNA)形式。DNA可以是单链或是双链，也可以是编码链或非编码链。核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。

本发明另一实施例提供了一种重组载体或宿主细胞，所述重组载体或所述宿主细胞携带如上所述的核酸分子。

构建所述重组载体的出发载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。载体可以是克隆载体或表达载体，克隆载体可以包含选择标记，以及与克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。

编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些实施方式中，编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子也可以分别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的载体和载体所含调控元件的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。

重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法或MgCl₂法处理，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，以及显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转化如上所述的表达载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出单克隆抗体，然后再进行分离以得到纯化的抗体。

在较佳的实施方式中，上述所述的重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为293F细胞。

本发明实施例还提供了如上所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体或宿主细胞在制备免疫检测嘌呤霉素试剂和/或试剂盒中的应用。

所述靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备免疫检测嘌呤霉素试剂和/或试剂盒中的应用优势与如上所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。

基于上述相同的发明构思，本发明实施例还提供了一种嘌呤霉素免疫检测试剂盒，包括如上所述的兔单克隆抗体或所述兔单克隆抗体与可检测标记偶联的免疫偶联物。

在免疫检测时，将待检样本与本发明的嘌呤霉素兔单克隆抗体接触，之后检测结合的嘌呤霉素兔单克隆抗体即可。在一些实施方案中，可以直接用可检测标记偶联嘌呤霉素兔单克隆抗体，之后通过观测可检测标记物产生可识别的信号变化来实现定性或定量检测嘌呤霉素。在另一些实施方案中，不标记嘌呤霉素兔单克隆抗体(一抗或捕获抗体)，通过标记偶联可结合该单克隆抗体的二抗(检测抗体)或其他分子，例如，如果嘌呤霉素兔单克隆抗体是兔IgG，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过检测偶联标记的二抗以产生可识别的信号变化。

用于检测目的的可检测标记包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶(如辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。

可选地，免疫检测方法包括但不限于：免疫印迹法(Western blot，WB)、免疫沉淀法(Immunoprecipitation，IP)、酶免疫分析法(Enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linkedImmunospot，ELISPOT)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)或流式细胞法(Flow Cytometry，FC)。因此，试剂盒可以是免疫印迹试剂盒、免疫沉淀试剂盒、酶免疫分析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、酶联免疫斑点试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫组织化学试剂盒或流式细胞试剂盒。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例1靶向嘌呤霉素(Puromycin)的兔单克隆抗体的制备

(1)免疫原制备：本发明的免疫原为血蓝蛋白(KLH)偶联嘌呤霉素化合物，由兰州大学提供，其制备流程包括：用磷酸盐(PBS)缓冲液分别配制5mg/mL的磺基琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SuLfo-SMCC)溶液、3mg/mL的血蓝蛋白(KLH)溶液和10mg/mL的嘌呤霉素(Puromycin，CAS编号为58-58-2)溶液备用。取适量体积的SuLfo-SMCC溶液加入到KLH溶液中，室温条件下置于旋转培养器中摇匀激活1h，用PBS缓冲液(pH 7.4)透析1h除去游离的SuLfo-SMCC，获得激活的KLH溶液。将需要偶联的Puromycin溶液分多次缓慢加入激活的KLH溶液中，放入旋转培养器中，低速室温孵育4h，获得交联在KLH蛋白上的嘌呤霉素化合物，作为免疫原。

(2)动物免疫：以交联在KLH蛋白上的嘌呤霉素化合物免疫3只日本大耳白兔；每只大白兔免疫700μg，首次免疫前将抗原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取350μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫4次。5次免疫后采集兔子血清样本，取血清稀释后用酶联免疫吸附法(ELISA)测定其针对嘌呤霉素的滴度，并将最后一次免疫后血清纯化成抗体，采用免疫印迹法(WB)检测对内源样本的特异性，取血清滴度高且内源检测最好的兔子，用700μg免疫原皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物取脾脏。

(3)分离脾脏中B淋巴细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基(由RPMI 1640、100U Penicillin-Streptomycin(P.S)双抗、15％ FBS、100mMHEPES、0.05mM硫基乙醇(2-ME)配置)，放一个细胞筛，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自BD公司，货号555899)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，再加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。

(4)B淋巴细胞分选与培养：参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A，公开日：2019-07-16)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A，公开日：2020-08-11)”。

(5)编码兔单克隆抗体基因的克隆：培养后的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA鉴定出能够结合嘌呤霉素的阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后用Quick-RNA^TMMicroPrep试剂盒(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。以前述cDNA为模板，采用PCR方法将天然配对的兔单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码基因从阳性克隆中扩增出来，并经测序确定序列，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成；其中，PCR反应体系如下：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×GloriaHiFi(来源于武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20717)和6.5μL纯水；PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s进行40次循环，最后72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。所述的扩增VL和VH的引物对的核苷酸序列(5'-3')如下所示，F表示正向引物，R表示反向引物：

VL-F：5'-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3'(SEQ ID NO.11)；

VL-R：5'-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3'(SEQ ID NO.12)；

VH-F：5'-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3'(SEQ ID NO.13)；

VH-R：5'-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3'(SEQ ID NO.14)。

(6)兔单克隆抗体基因的生产和纯化：

为了获得多株识别嘌呤霉素的兔单克隆抗体，将挑选出的若干个兔单克隆抗体轻链可变区和重链可变区基因纯化后，分别装载在预先携带轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)编码基因的表达载体pBR322上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图1，图中，pBR322 origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。具体构建过程：将含兔单克隆抗体CH和CL的表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶进行常规线性化处理，将上述扩增后的PCR产物(上游具有信号肽编码基因)进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将VL基因和VH基因构建到表达载体中，经测序(测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成)验证。

本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“高亲和力Human IL-5兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN115819578A，公开日期：2023-03-21)”，轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC”，重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”。

将上述构建成功的含有相应兔单克隆抗体轻链和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染后培养72-96h，获得包含针对嘌呤霉素的兔单克隆抗体的上清液。使用protein A亲和凝胶树脂(购自天地人和，货号SA023100)从培养上清液中纯化出靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体。亲和层析实验步骤包括：将培养上清转移至无菌50mL离心管中，1000g、4℃(或常温)离心10min，收集上清液；将预处理后的Protein A Agarose悬浮液加入到离心后细胞上清液中，振荡孵育室温3-4h或4℃过夜。孵育完成后1000g离心10min，将Protein A Agarose悬浮液转移到吸附柱中，用掌上离心机常温离心1min，使固液分离，收集流穿液。加入十倍Protein A Agarose体积的洗涤缓冲液(磷酸缓冲液，pH 7.0)并重新悬浮颗粒，离心机离心，收集洗杂液，再重复洗杂两次。向吸附柱中加入洗脱缓冲液(柠檬酸盐缓冲液，pH 3.0)，离心获得抗体上清，将抗体上清装入透析袋(购自索莱宝，货号YA1070)中，透析过夜，收取抗体，抗体验证合格后分装，于-20℃低温保存备用。经检测纯化的抗体浓度为0.69mg/mL，纯度大于95％。

本实施例得到的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG型，其轻链和重链的氨基酸(AA)序列见表1。以下为描述方便，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。

表1本发明的兔单克隆抗体的序列信息汇总

实施例2兔单克隆抗体反应特异性和应用效果

1、针对兔单克隆抗体的免疫印迹分析(Western blot，WB)

取经过嘌呤霉素处理过的人胚胎肾细胞293F(293F+Puromycin)和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7(Raw264.7+Puromycin)等阳性细胞样本及未经过嘌呤霉素处理过的293F和Raw264.7等阴性细胞样本，用免疫印迹法检测本发明兔单克隆抗体的识别特异性。包括以下步骤：将前述细胞样本分别裂解，得到蛋白提取液，进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规方法在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上；将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体(一抗稀释比1：8000，一抗工作浓度为0.2μg/mL)，4℃孵育过夜；之后用TBST洗膜，加入羊抗兔二抗工作液(来自ABclonal，货号AS014，二抗稀释比1：10000)，室温孵育1h；再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液，显影，结果见图2。

嘌呤霉素是一类氨基核苷类抗生素，当检测样本与嘌呤霉素一起孵育时，嘌呤霉素会被掺入新合成的蛋白质中，并造成蛋白合成终止，因此，在仅存在嘌呤霉素的情况下，该抗体会检测到掺入嘌呤霉素的多种不同分子量的新合成蛋白，由于不同蛋白的表观分子量大小是有差异的，因此在免疫印迹中会呈现出多带或弥散带型，通过对比嘌呤霉素处理前后样本的检测趋势可以分析此兔单克隆抗体的特异性。由图2可以看出，筛选得到的嘌呤霉素兔单克隆抗体特异性好，可广泛特异性识别并结合C-末端含嘌呤霉素的新合成多肽或蛋白。

2、针对兔单克隆抗体的免疫沉淀分析(Immunoprecipitation，IP)

取293F+Puromycin细胞样本，用免疫沉淀法检测本发明兔单克隆抗体的识别特异性。包括以下步骤：收集嘌呤霉素处理过的293F细胞，离心，弃上清，收集沉淀，PBS清洗一次，加入IP实验专用细胞裂解液(来自ABclonal，货号RM00022)，充分裂解后应无明显沉淀，离心取上清备用；取30μL Protein A/G Plus MaqPoly Beads(购自碧云天生物，货号P2108)清洗去除磁珠保护液，加入1mL细胞裂解液(without inhibitors)(购自碧云天生物，货号P0013J)，混匀，放置在磁分离器上，收集磁珠，用移液器吸弃洗杂液，重复2次，加入1mL的3％ BSA，置于翻转混合仪4℃封闭1h备用；在细胞裂解液中加入3μg嘌呤霉素兔单克隆抗体，置于翻转混合仪4℃过夜，将上述完成抗体-抗原结合的复合物与备好的磁珠进行混合，置于4℃下反应2h，将上述磁珠-抗体-抗原复合物放在磁分离器上进行分离，收集上清液，进行后续WB检测，使用同型Rabbit IgG作为空白对照，检测结果见图3。其中，WB实验有三组样本，泳道Input表示未经IP的细胞裂解物，用于判断目标蛋白位置和富集相对程度；泳道Control IgG表示同型Rabbit IgG(Isotype Control IgG)进行IP的产物，作为蛋白与IgG结合的背景信号；泳道Puromycin Antibody表示采用靶向嘌呤霉素兔单克隆抗体进行IP的产物(实验组)。

由图3可以看出，嘌呤霉素(Puromycin)兔单克隆抗体可以从Puromycin处理过的293F细胞样本中特异性的富集出与嘌呤霉素结合的新合成蛋白，表明其特异性良好。

3、针对兔单克隆抗体的免疫荧光分析(Immunofluorescence，IF)

取人宫颈癌细胞(HeLa)+Puromycin和Raw264.7+Puromycin细胞样本及阴性细胞样本HeLa和Raw264.7，用免疫荧光法检测本发明兔单克隆抗体的识别特异性。包括以下步骤：用5％空白山羊血清将HeLa细胞样本完全覆盖，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min，去除封闭液，在样本上滴加TBS缓冲液配制的靶向嘌呤霉素兔单克隆抗体工作液(一抗稀释比1：200，一抗工作浓度为8μg/mL)，置于4℃孵育过夜，将样本置于常温，复温15min，去除一抗工作液；用缓冲液TBST洗涤，在样本上滴加羊抗兔二抗工作液(来自ABclonal，货号AS039，二抗稀释比1：10000)，样本需完全覆盖，避光、37℃孵育1h，去除二抗工作液；用TBST缓冲液洗涤，在样本上滴加DAPI工作液，孵育10min；去除DAPI工作液，加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像，结果见图4。其中，免疫荧光实验有两组样本，每组从左至右、从上至下依次为：嘌呤霉素兔单克隆抗体检测HeLa/Raw264.7+Puromycin细胞样本的成像图(红色)、嘌呤霉素兔单克隆抗体检测正常HeLa/Raw264.7细胞样本的成像图、上述处理组成像图与HeLa/Raw264.7+Puromycin细胞样本细胞核DAPI染色叠加显示图以及HeLa/Raw264.7细胞样本使用DAPI核染色(蓝色)。

由于嘌呤霉素渗入细胞中后会产生与嘌呤霉素结合的新合成蛋白，不同蛋白定位有区别，所以在细胞质、细胞核与细胞膜均有可能显示阳性信号，因此可以通过对比处理前后样本的检测趋势来分析此兔单克隆抗体的特异性。从图中红色荧光分布情况可以看到，经Puromycin处理过的HeLa和Raw264.7细胞样本中抗原和抗体高度结合，主要定位于细胞膜、细胞质，阴性细胞样本的检测结果呈阴性，与理论相符，表明本申请制备的单克隆抗体对与嘌呤霉素结合的新合成蛋白具有良好的识别特异性。

4、针对兔单克隆抗体的流式细胞分析(Flow Cytometry，FC)

取293T+Puromycin、Raw264.7+Puromycin和C6+Puromycin细胞样本及阴性细胞样本(未经Puromycin处理)293T、Raw264.7和大鼠胶质瘤细胞(C6)，用流式细胞术检测本发明兔单克隆抗体的识别特异性。包括以下步骤：(1)紫外照射消毒超净工作台15-20min，并开风机5min，做无菌准备工作；(2)分别收集并洗涤293T、Raw264.7和C6细胞，测定细胞总数，检测确保细胞活力不低于90％；(3)用1×PBS溶液重悬细胞至约3×10⁶-5×10⁶细胞/mL，将细胞分配到96孔V型板里，每孔100μL，用1×PBS洗涤一遍；(4)用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀15min后，在离心机中用400g离心5min，弃掉上清，用FACS buffer洗涤2次；(5)用1×IntracellμLar Fixation buffer按每孔100μL添加到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，再次用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀30min；(6)在离心机中用400g离心5min，弃掉上清，用1×Permeablization buffer洗涤2次；(7)将用1×Permbuffer稀释好的嘌呤霉素兔单克隆抗体(按1：800稀释，工作浓度为2μg/mL)，按每孔100μL添加到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，再次用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀30min；(8)在离心机中用400g离心5min，弃上清，用1×Permeablization buffer洗涤2次；(9)将用1×Permeablization buffer按1：200稀释好的Fluorescein(FITC)AffiniPureF(ab')2Fragment Goat Anti-Rabbit IgG(购自jackson，货号Cat#111-096-046)荧光二抗，按每孔100μL添加到96孔V型板里，重悬每孔中的细胞，再次用铝箔纸包好，在微孔板震荡混匀仪上轻柔混匀30min；(10)用1×Permeablization buffer洗涤2次，按200μL每孔用FACS buffer重悬每孔细胞，避光保存；(11)使用流式细胞仪对细胞进行分析，按Beckmancytoflex流式分析仪使用说明书进行操作。采用rabbit IgG(Kappa)(来自于Abclonal，货号A22069)作为兔同型对照(Rabbit Isotype IgG)。Puromycin处理前后的293T、Raw264.7和C6细胞样本检测结果见图5-7，其中，图a为293T/Raw264.7/C6细胞+Puromycin的处理组直方图，图b为正常293T/Raw264.7/C6细胞直方图，作为阴性对照，图c为Rabbit IsotypeIgG散点图，作为同型对照，图d为293T/Raw264.7/C6细胞+Puromycin的处理组散点图；直方图中横坐标代表通道的荧光信号/散射光信号的相对强度，纵坐标代表其对应的细胞数，红色曲线表示不添加任何抗体的空白对照检测结果，蓝色曲线表示同型对照检测结果，橘黄色曲线表示嘌呤霉素兔单克隆抗体检测结果，散点图中横坐标/纵坐标均代表通道的荧光信号/散射光信号的相对强度值。

从图5-7可以看出，处理组阳性细胞样本293T+Puromycin、Raw264.7+Puromycin和C6+Puromycin样本相比与未经Puromycin处理的阴性细胞样本均有明显荧光信号跃迁，而正常细胞样本293T、Raw264.7、C6的检测结果呈阴性或极弱阳性，证实本发明制备的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体在流式细胞术检测中，对与嘌呤霉素结合的新合成蛋白具有良好的识别特异性和高的亲和力，且无非特异性识别。

5、针对兔单克隆抗体的免疫组织化学分析(Immunohistochemistry，IHC)

嘌呤霉素(Puromycin)在正常心脏组织中阳性较弱，接近阴性，选择Puromycin处理过的小鼠造模心脏样本作为阳性样本并以为未处理过的小鼠正常心脏样本作为阴性样本，用于免疫组化检测。包括以下步骤：(1)样本准备和烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中；(2)脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min；前述的脱蜡液1-3购自无锡市江原实业技贸有限公司；(3)抗原修复：0.01M柠檬酸钠修复液(pH 6.0)高压热修复；(4)内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温孵育10min；(5)封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时；(6)一抗孵育：除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液-PBS缓冲液稀释的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体(一抗稀释比1：400，工作浓度为4μg/mL)，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；(7)二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(Dako REALEnVision Detection System,Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse,HRP；Dako K5007)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的二抗工作液，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；(8)显色：在切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后，将切片浸入大量蒸馏水中终止显色，终止显色后，将切片入流水中清洗10min；(9)复染：将稍沥干的组织切片浸入Mayer’s苏木素复染1min，之后用流水清洗3min；(10)返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min；(11)脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后取出；置于恒温鼓风干燥箱中54-58℃下完全干燥；(12)封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出；(13)进行切片扫描。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性，其中阳性信号需在特定组织和细胞中的抗原表达部位有棕褐色着色且背景低，即理论上应该显示棕褐色的细胞或组织着色程度中等、理论不应该着色的细胞和组织没有着色才能视为阳性。在本实施例中，经嘌呤霉素处理的组织样本在细胞质、细胞核与细胞膜均有可能显示阳性信号。细胞核经苏木精复染呈现蓝色，可显示被特定免疫染色的细胞背景轮廓，用于判断亚细胞定位。图8示出了小鼠造模心脏样本经嘌呤霉素处理前后的染色结果，其中，左图为经嘌呤霉素处理后的染色结果，右图为经嘌呤霉素处理前的染色结果。染色结果显示，未经Puromycin处理过的正常小鼠心脏样本中阳性弱，接近阴性，而经Puromycin处理后，小鼠造模心脏样本检测呈阳性，阳性信号定位在细胞质与细胞核中，具体为棕褐色部分信号增强，对比正常样本趋势正确，表明靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。

结合上述多种免疫检测的结果，证明本发明筛选得到的Puromycin兔单克隆抗体能够特异性识别嘌呤霉素且非特异性结合，抗体识别和结合Puromycin的亲和力高、抗干扰能力强，能够有效避免假阳性或假阴性结果，提高免疫检测的灵敏度、准确性和可靠性。与市面已有的单抗检测结果如与Merck MABE343的比较，本发明Puromycin兔单克隆抗体在免疫组织化学法、免疫印迹法、免疫荧光法、免疫沉淀和流式细胞术分析检测中的检测物种更多样化，检测结果准确性更高，具有良好的市场化前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括三个互补决定区，其中：轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

2.根据权利要求1所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.根据权利要求1所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体，其特征在于，还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求3所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链恒定区为κ型，所述重链恒定区为IgG型。

5.根据权利要求1或2所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为全长抗体或具有免疫活性的抗体片段；所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)₂片段、Fv片段、(Fv)₂片段、scFv片段和sc(Fv)₂片段中的至少一种。

6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-5任一项所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体。

7.一种重组载体或宿主细胞，其特征在于，所述重组载体或所述宿主细胞包含如权利要求6所述的核酸分子。

8.如权利要求1-5任一项所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体在制备免疫检测嘌呤霉素试剂和/或试剂盒中的应用。

9.一种嘌呤霉素免疫检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-5任一项所述的靶向嘌呤霉素的兔单克隆抗体或所述兔单克隆抗体与可检测标记偶联的免疫偶联物。

10.根据权利要求9所述的嘌呤霉素免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为免疫印迹试剂盒、免疫沉淀试剂盒、酶免疫分析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、酶联免疫斑点试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫组织化学试剂盒和流式细胞试剂盒中的至少一种。