CN117777295A

CN117777295A - 抗人cd44蛋白的兔单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN117777295A
Application number: CN202410047257.6A
Authority: CN
Inventors: 邹志豪; 刘政泽; 李志友; 吴海; 李博; 黄长青
Original assignee: Wuhan Abclonal Inc
Current assignee: Wuhan Abclonal Inc
Priority date: 2024-01-11
Filing date: 2024-01-11
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体及其应用。所述抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体的轻链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5‑7所示；重链CDR1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD44蛋白以及细胞或组织中天然表达的CD44蛋白，且抗体特异性高，亲和力良好，抗干扰能力强，保证了在免疫检测人CD44蛋白时具有高准确性和高可靠性，在临床诊断和科研检测中具有广阔的应用前景。

Description

抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体及其应用。

背景技术

CD44属于跨膜糖蛋白家族成员，也被称为归巢细胞粘附分子(HCAM)、吞噬糖蛋白-1(Pgp-1)、Hermes抗原、淋巴细胞归巢受体、ECM-III或HUTCH-1，是透明质酸的主要受体，也是细胞外基质的主要成分，广泛表达于多种内皮细胞、间充质干细胞、造血干细胞及中胚层来源的细胞和组织，且在记忆B细胞和记忆T细胞中高度表达。生理上，CD44蛋白的主要功能可归纳为：(1)作为淋巴细胞归巢受体，介导淋巴细胞与毛细血管后小静脉中的高柱状内皮细胞结合，使淋巴细胞穿过血管壁回到淋巴组织；(2)CD44蛋白的胞外结构域有两段高度保守的BX7B基序，可与细胞外基质中的透明质酸、层粘连蛋白等基质分子结合，调节细胞在细胞外基质中的粘附或移行；(3)参与淋巴细胞的激活过程。病理上，CD44蛋白在多种肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞中表达，表达水平高低与肿瘤侵袭能力直接相关，是公认的肿瘤干细胞标志物。研究表明，在增殖旺盛的细胞恶性肿瘤细胞，CD44的特异转录本表达增高，参与肿瘤的侵袭、分化和迁移等过程，因此，CD44可用于各种良恶性肿瘤早期诊断、转移潜能判断和治疗等方面研究。

免疫检测方法是利用抗原-抗体特异结合的特性来实现定量或定性检测的实验方法，已经成为多种临床疾病诊断的重要方法，为确定疾病的病因和病变部位提供了有效手段。目前，常见的免疫检测方法有免疫印迹法、免疫荧光法、免疫组织化学法、流式细胞法等，核心在于抗体与抗原之间的特异性结合，抗体性能的优劣直接决定着免疫检测结果的准确性和可靠性。鉴于CD44的诊断和标记价值，开发一种抗干扰能力强和检测灵敏度高的针对CD44蛋白特异性结合的单克隆抗体对于实现免疫检测CD44蛋白具有非常重要的现实意义和广阔的应用前景。

发明内容

针对现有技术中缺乏难以用于免疫检测的性能良好的抗人CD44蛋白的单克隆抗体等问题，本发明提供了抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体，并提供了该兔单克隆抗体在免疫检测人CD44蛋白中的应用。

为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括三个互补决定区，其中，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示。

进一步地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述兔单克隆抗体为全长抗体或具有免疫活性的抗体片段；所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)₂片段、Fv片段、(Fv)₂片段、scFv片段和sc(Fv)₂片段中的至少一种。

本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体。

进一步地，所述兔单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

更进一步地，所述兔单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包含如上所述的核酸分子。

本发明第四方面提供了如上所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体在制备免疫检测人CD44蛋白试剂和/或试剂盒中的应用。

进一步地，免疫检测方法包括免疫印迹法、酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫荧光法、免疫组织化学法或流式细胞法。

进一步地，免疫检测样本包括血清、细胞或组织，其中，细胞包括人宫颈癌细胞、人表皮癌细胞和人乳腺癌细胞中的一种或多种，组织包括人扁桃体、人结肠、人卵巢、人结外NK/T细胞淋巴瘤、人结肠浸润性腺癌、人子宫内膜样癌、人肝细胞癌、人前列腺腺癌、人高级别尿路上皮癌、人卵巢浆液性癌、人肝胆管癌、人恶性胶质瘤、人乳腺、人宫颈、人肺、人脑(神经元)、人乳腺浸润性导管癌、人宫颈鳞状细胞癌、人肺鳞癌、人小细胞肺癌、人胎盘、人子宫内膜间质肉瘤和人肺腺癌的一种或多种。

本发明的优点及积极效果为：

本发明制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD44蛋白以及细胞或组织中天然表达的CD44蛋白，且抗体特异性高，亲和力良好，抗干扰能力强，保证了在免疫检测人CD44蛋白时具有高准确性和高可靠性，在临床诊断和科研检测中具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1利用原核表达系统表达得到破碎细胞后的上清和沉淀中CD44蛋白的凝胶电泳图；

图2为本发明实施例1纯化所得的CD44蛋白的凝胶电泳图；

图3构建抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体表达载体所用的哺乳动物载体pBR322的图谱，从左至右分别为预先携带轻链恒定区和重链恒定区的pRB322载体图谱；

图4为本发明实施例3兔单克隆抗体与HeLa细胞结合的免疫印迹检测结果图；

图5为本发明实施例4兔单克隆抗体与HeLa和A-341细胞结合的免疫荧光检测图；

图6为本发明实施例5兔单克隆抗体与人扁桃体和人肝组织结合的免疫组织化学检测图；

图7为本发明实施例6兔单克隆抗体与HeLa和MCF-7细胞结合的流式细胞检测图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。

在本发明的上下文中，术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”和“兔单抗”等类似词语具有相同含义，可互换使用，均指特异性结合人(Human)CD44蛋白的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。

抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。其中，“抗体片段”是指全长抗体的一个或多个部分或片段，在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)₂、F(ab’)₂、Fv、(Fv)₂、scFv、sc(Fv)₂。

典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

CDR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，CDR由Kabat编号系统来定义。

轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。

全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。

术语“抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)”是抗体分子中可以与抗原结合的区域，其由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和一个恒定区片段)组成，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)₂片段和一个pFc'片段。F(ab')₂片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备单链抗体(scFv)一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构，在临床诊断和治疗上应用广泛。

术语“可变片段(Fv)”位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整抗体。

术语“单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)“是指重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成的最小抗体片段，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。

本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以来自单一物种，例如兔，或者可以是嵌合的或人源化的抗体，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”抗体是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自人FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如人兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到人类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。

术语“单克隆抗体”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的结构、来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。

术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

本发明实施例提供了一种抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区(VL)和所述重链可变区(VH)均包括三个互补决定区(CDR)，依次用CDR1、CDR2和CDR3表示，其中，轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示；重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本发明以原核表达系统表达得到的人CD44蛋白N末端的第20位至第178位氨基酸片段为抗原，对新西兰大白兔进行免疫，之后基于单个B淋巴细胞筛选和培养的单克隆抗体开发技术，获得抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体，该抗体性能良好。具体而言，通过免疫印迹法检测高表达CD44蛋白的人宫颈癌细胞HeLa，在细胞裂解液中仅检测出单一条带、条带大小与预期相符；通过免疫荧光法检测高表达CD44蛋白的人宫颈癌细胞HeLa和人表皮癌细胞A-431，抗体结合CD44抗原定位准确，荧光信号清晰明亮；由免疫组织化学法检测表达和不表达CD44蛋白的阳性和阴性组织样本，能够准确区分所有阳性和阴性组织样本，在阳性组织样本中着色准确且在阴性和阳性组织样本无非特异性染色，检测灵敏度和特异度高；进一步通过流式细胞法检测细胞表面表达的CD44蛋白，在Hela细胞和人乳腺癌细胞MCF-7上有明显的荧光跃迁且信号强度单一。前述结果证明，本发明制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体可以特异性识别基因工程表达得到的重组CD44蛋白以及细胞或组织中天然表达的CD44蛋白，且抗体特异性高，亲和力良好，抗干扰能力强，保证了在免疫检测尤其是免疫印迹、免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞检测人CD44蛋白时具有高准确性和高可靠性，有利于避免假阳性或假阴性结果，因此适用于人CD44蛋白的免疫检测，在临床诊断和科研检测中具有广阔的应用前景。

可选地，所述轻链可变区(VL)和所述重链可变区(VH)均包括框架区(FR)，其中每一条链的4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。本发明兔单克隆抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

可选地，本发明的兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，CL和VL构成完整轻链，CH和VH构成完整重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgG Kappa Creign获得CL。

具体地，包含CL的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含CH的所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应地，CL为κ型，CH为IgG1型。

本发明的兔单克隆抗体可以为全长抗体或抗体片段，该抗体片段是指基本上保持与兔单克隆抗体的全长形式具有相同的生物学功能或活性的多肽，具体而言，抗体片段包括如上所述的CDR区(SEQ ID NO.5-10)，更优选地具有如上所述的可变区(SEQ ID NO.3-4)，由此保留有完整的抗原识别和结合部位，能够与全长抗体结合于相同的抗原CD44蛋白，尤其是结合于相同表位。所述抗体片段包括但不限于：(i)Fab片段，由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区构成的单价片段；(ii)F(ab)₂片段，包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fv片段，由抗体的一个重链可变区和一个轻链可变区构成；(iv)(Fv)₂片段，由两个共价连接在一起的Fv片段构成；(v)scFv片段，由单一多肽链构成的Fv片段，一个重链可变区和一个轻链可变区通过接头连接形成；(vi)sc(Fv)₂片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接成。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常规技术获得。

本发明又一实施例提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体。

核酸分子可以是DNA(例如cDNA或基因组DNA或合成DNA)形式或RNA(例如mRNA或合成RNA)形式。DNA可以是单链或是双链，也可以是编码链或非编码链。核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。

示例性地，本发明的兔单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。进一步地，轻链的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。本领域技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，不同于前述示例的核酸分子同样可以编码得到本发明的兔单克隆抗体，因此，前述示例的核酸分子不应作为对本发明保护范围的限定。

本发明另一实施例提供了一种重组载体，所述重组载体携带如上所述的核酸分子。

构建所述重组载体的出发载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。载体可以是克隆载体或表达载体，克隆载体可以包含选择标记，以及与克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。

编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些实施方式中，编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子也可以分别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的载体和载体所含调控元件的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。

重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法或MgCl₂法处理，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，以及显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转化如上所述的表达载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出单克隆抗体，然后再进行分离以得到纯化的抗体。

在较佳的实施方式中，上述所述的重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。

本发明实施例还提供了如上所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体在制备免疫检测人CD44蛋白试剂和/或试剂盒中的应用。

所述抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体、核酸分子、重组载体在制备免疫检测人CD44蛋白试剂和/或试剂盒中的应用优势与如上所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。

本发明的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体可用于常规免疫测定法，包括但不限于：免疫印迹法(Western blot，WB)、酶免疫分析法(Enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linkedImmunospot，ELISPOT)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、流式细胞法(Flow Cytometry，FCM)。可用于检测重组表达的人CD44蛋白或者来自人的天然CD44蛋白。检测样本包括血清、细胞或者组织，其中，细胞包括但不限于：人宫颈癌细胞HeLa、人表皮癌细胞A-431和人乳腺癌细胞MCF-7，组织包括但不限于：人扁桃体、人结肠、人卵巢、人结外NK/T细胞淋巴瘤、人结肠浸润性腺癌、人子宫内膜样癌、人肝细胞癌、人前列腺腺癌、人高级别尿路上皮癌、人卵巢浆液性癌、人肝胆管癌、人恶性胶质瘤、人乳腺、人宫颈、人肺、人脑(神经元)、人乳腺浸润性导管癌、人宫颈鳞状细胞癌、人肺鳞癌、人小细胞肺癌、人胎盘、人子宫内膜间质肉瘤和人肺腺癌。

在免疫检测时，将待检样本与本发明的抗CD44抗体接触，并且检测结合的CD44抗体。在一些实施方案中，可以直接用可检测标记偶联抗CD44抗体，之后通过观测可检测标记物产生可识别的信号变化来实现定性或定量检测CD44蛋白。在另一些实施方案中，不标记抗CD44抗体(一抗或捕获抗体)，但可检测标记偶联可结合抗CD44抗体的二抗(检测抗体)或其他分子，例如，如果抗CD44抗体是兔IgG，那么二抗可以是抗兔IgG抗体，由此通过偶联有可检测标记的二抗特异性结合抗CD44抗体以产生可识别的信号变化。

用于检测目的的可检测标记包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶(如辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例1重组人CD44蛋白抗原制备

本实施例利用大肠杆菌Rosetta表达编码人CD44蛋白第20位(含)至第178位(含)氨基酸片段的基因序列，纯化得到纯度较高的重组人CD44蛋白作为免疫原，重组人CD44蛋白携带GST标签和His标签。其中，人CD44蛋白全长基因序列参见NM_000610.4，人CD44蛋白第20-178位氨基酸序列如下所示：

AQIDLNITCRFAGVFHVEKNGRYSISRTEAADLCKAFNSTLPTMAQMEKALSIGFETCRYGFIEGHVVIPRIHPNSICAANNTGVYILTSNTSQYDTYCFNASAPPEEDCTSVTDLPNAFDGPITITIVNRDGTRYVQKGEYRTNPEDIYPSNPTDDDV(见SEQ ID NO.15)。

重组人CD44蛋白的制备具体包括以下步骤：

1)蛋白表达质粒构建：使用包含人CD44 CDS序列的质粒(来源于武汉爱博泰克生物科技有限公司)为模板，以一对特异性引物(核苷酸序列见SEQ ID NO.16-17)扩增人CD44蛋白N末端的第20位至第178位目的片段。其中，PCR反应体系如下：1μL模板、1μL模板、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、25μL Gloria Nova HS 2X Master Mix(来源于武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20717)和22μL纯水(N.F H₂O)；PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行30次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。扩增人CD44蛋白第20-178位氨基酸(以下简称CD44(20-178aa))序列引物对的核酸序列(5'-3')如下：

CD44-F：ggttccgcgtggatccccggaagcgcagatcgatttgaatataac(见SEQ ID NO.16)；

CD44-R：tggtgatgatgatgcggccgctccacgtcatcatcagtagggttgc(见SEQ IDNO.17)。

将扩增的PCR产物纯化后，采取同源重组的方式装载在原核表达载体pGEX-4T-AB1上，插入位点为EcoRI和XhoI酶切位点，经测序验证之后保存质粒，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成。

2)蛋白表达：将包含有CD44蛋白20-178AA序列的pGEX-4T-AB1质粒转化至大肠杆菌Rosetta菌株中，并在LB琼脂平板(含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素)上于37℃温育过夜，以获得单菌落转化物。

将单菌落转化物接种于含有2mL LB培养液(含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL氯霉素)的10mL聚丙烯管中，于37℃下、以220rpm培养16h，至OD_600nm约为0.4-0.6；之后将每种菌株的2mL培养物转移到含有400mL LB表达培养基的1L烧瓶中，于37℃下、以220rpm再培养3-4h；当OD_600nm达到约0.45-0.55时，加入0.8mM IPTG，37℃诱导3-4h，将诱导完成的菌液转移至干燥的500mL离心瓶中，用电子称平衡，质量不等则加纯水，4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体-20℃冰柜保存。

第一次破碎菌体：取30mL破菌液(50mM Tris+300mM NaCl)悬浮菌体，将悬浮完成的菌液转移至50mL圆底离心管，放入冰盒中，用冰固定；选择变幅杆，放入破菌舱内，功率350W，破菌3s，间隔3s，倒计5min，之后置于冰水混合物中冷却5min，再重复上述步骤破菌5min；破菌完成后9000rpm离心10min得到上清液①和沉淀。

第二次破碎菌体：量取30mL破菌液(2M尿素+PBS缓冲液)倒入沉淀中，吹匀沉淀，转移至50mL的圆底离心管中，功率350W，破菌3s，间隔3s，破碎0-5min(破碎时间按沉淀量及质地来决定，菌液置于冰块中)，9000rpm离心10min得到上清液②和包涵体，将得到的上清液①和上清液②用Loading Buffer分别做2倍稀释，包涵体做2倍稀释、10倍稀释；将得到的2倍稀释上清液①(简称“上1”)、2倍稀释上清液②(简称“上2”)、2倍稀释包涵体(简称“*2”)、10倍稀释包涵体(简称“*10”)样品，进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图1所示。

由图1中的结果可以看出：CD44(20-178aa)-GST-His蛋白主要表达在包涵体中。因此后续收集包涵体进行蛋白纯化。

3)蛋白纯化：使用His标签亲和层析树脂(购自汇研生物，货号HQ060311001L)，通过亲和层析从包涵体中提取纯化CD44蛋白，纯化所得CD44蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图如图2所示，其中，从左至右，泳道1和泳道2分别为0.4mg/mL和0.2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，泳道3为包涵体，泳道4为纯化过程中的流穿液(简称“FT”)，泳道5为收集的CD44蛋白2倍稀释液(简称“*2”)，泳道6为Marker(简称“MK”)，泳道7为复性成功的CD44蛋白液，图中箭头所示为CD44蛋白条带位置。

经分离提纯，得到了纯度大于80％的重组人CD44蛋白，包含CD44蛋白片段、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签及组氨酸蛋白标签，重组人CD44蛋白浓度为1.5mg/mL。

实施例2抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体的制备

1)动物免疫：以实施例1纯化所得重组人CD44蛋白免疫2只新西兰大白兔；每只大白兔免疫200μg，首次免疫前将抗原与等量的完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂(购自Sigma公司)混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，取血清按1：243000稀释后用ELISA方法测定其针对人CD44的滴度，取OD_450nm超过0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。

2)分离脾脏中B淋巴细胞：在安全柜中无菌操作取出一个培养皿，加入30-40mL的基础培养基，放一个细胞筛，将脾脏取出放于细胞筛中，将兔脾脏组织上多余的结缔组织、脂肪剪除，脾脏组织剪碎放入细胞筛网中研磨，取干净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨。膜内细胞会慢慢游离出来，经过细胞筛之后，悬浮在培养皿溶液中；用10mL基础培养基洗一洗细胞筛网，收集细胞筛网外基础培养基。室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自天根生化科技有限公司，货号RT122-02)，用移液器轻柔吹散细胞团后计时1min，进行红细胞裂解，加入基础培养基37mL，混匀，终止红细胞裂解，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入40mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬，完成第一次清洗，室温下以400g离心力离心5min，去上清，留细胞，加入20mL常温放置的基础培养基，用移液器轻柔吹散细胞团，使细胞重悬；将重悬细胞经细胞筛网再次过滤，去除结团细胞，之后对细胞进行计数。

3)B淋巴细胞分选与培养：参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。

4)编码兔单克隆抗体基因的克隆：培养后的B淋巴细胞上清用抗原包被的ELISA鉴定出能够结合人CD44蛋白的阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后按Quick-RNA^TMMicroPrep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。以前述cDNA为模板，采用PCR方法将天然配对的兔单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码基因从阳性克隆的cDNA中扩增出来；其中，PCR反应体系如下：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×Gloria HiFi(来源于武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20717)和6.5μL纯水；PCR扩增程序：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s进行40次循环，最后72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。所述的扩增VL和VH的引物对的核苷酸序列(5'-3')如下所示，F表示正向引物，R表示反向引物：

VL-F：tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac(SEQ ID NO.18)；

VL-R：cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag(SEQ ID NO.19)；

VH-F：tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg(SEQ ID NO.20)；

VH-R：gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg(SEQ ID NO.21)。

5)兔单克隆抗体基因的生产和纯化：将上述挑选出的若干个兔单克隆抗体的轻链可变区和重链可变区基因纯化后，分别装载在预先携带轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)编码基因的表达载体pBR322上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322见图3，图中，pBR322origin和f1 origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区的核酸序列(右图)。构建过程如下：将含兔单克隆抗体CH和CL的哺乳动物细胞表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶进行常规线性化处理，将上述扩增后的PCR产物(上游具有信号肽编码基因)进行纯化后，采取同源重组的方式，分别将VL基因和VH基因构建到构建到相应的哺乳动物表达载体中，经测序(测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成)验证之后，将上述构建成功的含有相应兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体一起转染至293F细胞中；转染后培养72-96h，培养获得包含针对人CD44蛋白的兔单克隆抗体的上清液。使用proteinA亲和凝胶树脂从培养上清液中纯化出识别人CD44蛋白的兔单克隆抗体，亲和层析采用本领域的常规操作，在此不再赘述，纯化的抗体浓度为1.5mg/mL，纯度大于95％。

本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”，轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”，编码基因为“ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGACTGTTGCTCCTGTGGTTGCCTGGTGCAACTTTC”；重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”，编码基因为“ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTGGCGGTGCTTAAGGGAGTACAGTGC”。

本实施例得到的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体轻链恒定区为κ链，重链恒定区为IgG1型，其轻链和重链的氨基酸(AA)和编码基因的核苷酸(DNA)序列见表1。以下为描述方便，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示。

表1本发明的兔单克隆抗体的序列信息汇总

实施例3针对兔单克隆抗体的免疫印迹分析(Western blot，WB)

取高表达CD44蛋白的人宫颈癌细胞HeLa样本，用WB法检测本发明的兔单克隆抗体的识别特异性，包括以下步骤：将前述细胞样本裂解，得到蛋白提取液，进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规方法在电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上；将膜置于含3％脱脂奶粉的TBST封闭液中室温孵育1h，加入抗CD44蛋白的兔单克隆抗体(一抗稀释比1：10000，一抗工作浓度为0.1μg/mL)，4℃孵育过夜；之后用TBST洗膜，加入羊抗兔二抗工作液(购自Jackson ImmunoResearch，货号111-035-045，二抗稀释比1：10000)，室温孵育1h；再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液，显影，结果见图4。

CD44全长为742aa，理论分子量为82kd。由图4可以看出，筛选得到的CD44兔单克隆抗体特异性较好，在HeLa细胞裂解液中检测到单一目的条带，且实际检测分子量与预期大小吻合，说明兔单克隆抗体能够特异识别人CD44蛋白，且无非特异性结合，抗体特异性较高，与CD44蛋白结合的亲和力良好，进而可以有效避免检假阳性结果，检测准确性高。

实施例4针对兔单克隆抗体的免疫荧光分析(Immunofluorescence，IF)

取高表达CD44蛋白的人宫颈癌细胞HeLa和人表皮癌细胞A-431样本，用IF法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，包括以下步骤：用5％空白山羊血清将HeLa细胞样本完全覆盖，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min，去除封闭液，在样本上滴加TBS缓冲液配制的抗CD44蛋白的兔单克隆抗体工作液(一抗稀释比1：200，一抗工作浓度为0.5μg/mL)，置于4℃孵育过夜，将样本置于常温，复温15min，去除一抗工作液，用缓冲液TBST洗涤，在样本上滴加羊抗兔二抗工作液(Alexa594AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，购自Jackson，货号111-585-003，二抗稀释比1：400)，样本需完全覆盖，避光、37℃孵育1h，去除二抗工作液，用TBST缓冲液洗涤，在样本上滴加DAPI工作液，孵育10min；去除DAPI工作液，加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像，结果见图5，其中，左上图和右上图分别为使用抗CD44蛋白兔单克隆抗体对HeLa细胞和A-431细胞进行共聚焦成像(红色)，左下图分别为HeLa细胞和A-431细胞使用DAPI核染色(蓝色)并将红蓝二色Merge来展示CD44蛋白的定位信息。

通过免疫荧光检测，可以看到本发明的兔单克隆抗体可特异结合细胞膜及细胞间质中的CD44蛋白，与其理论定位相符合，进一步证明了本申请制备的兔单克隆抗体对人CD44蛋白具有良好的识别特异性。

实施例5针对兔单克隆抗体的免疫组织化学分析(Immunohistochemistry，IHC)

1、芯片选择

人CD44蛋白在人组织样本中广泛表达，本实施例的病理组织芯片(购自百奥斯，货号TMA000-24–H)包括人扁桃体、人结肠、人卵巢、人肝、人结外NK/T细胞淋巴瘤、人结肠浸润性腺癌、人子宫内膜样癌、人肝细胞癌、人前列腺腺癌、人高级别尿路上皮癌、人卵巢浆液性癌、人肝胆管癌、人恶性胶质瘤、人乳腺、人宫颈、人肺、人脑(神经元)、人乳腺浸润性导管癌、人宫颈鳞状细胞癌、人肺鳞癌、人小细胞肺癌、人胎盘、人子宫内膜间质肉瘤、人肺腺癌组织样本。除人肝细胞为阴性样本，其余均为阳性样本。

2、免疫组织化学法(IHC)染色及分析

样本准备和烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中；

脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min；前述的脱蜡液1-3购自无锡市江原实业技贸有限公司；

抗原修复：0.01M Tris-EDTA修复液(pH9.0)高压热修复；

内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温孵育10min；

封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时；

一抗孵育：除封闭液，在组织切片上滴加用抗体稀释液-PBS缓冲液稀释的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体(一抗稀释比1：2500)，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；

二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(Dako REAL EnVisionDetection System,Peroxidase/DAB,Rabbit/Mouse,HRP；Dako)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的二抗工作液，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；

显色：在切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后，将切片浸入大量蒸馏水中终止显色，终止显色后，将切片入流水中清洗10min；

复染：将稍沥干的组织切片浸入Mayer’s苏木素复染1min，之后用流水清洗3min；

返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min；

脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后取出；置于恒温鼓风干燥箱中54-58℃下完全干燥；

封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出；

最后进行切片扫描。免疫组化染色结果分为：阳性和阴性，其中阳性信号需在特定组织和细胞中有棕褐色着色且背景低，即理论上应该显示棕褐色的细胞或组织着色程度中等、理论不应该着色的细胞和组织没有着色才能视为阳性。细胞核经苏木精复染呈现蓝色，可显示被特定免疫染色的细胞背景轮廓，用于判断靶蛋白的亚细胞定位。结果显示，人扁桃体、人结肠、人卵巢、人结外NK/T细胞淋巴瘤、人结肠浸润性腺癌、人子宫内膜样癌、人肝细胞癌、人前列腺腺癌、人高级别尿路上皮癌、人卵巢浆液性癌、人肝胆管癌、人恶性胶质瘤、人乳腺、人宫颈、人肺、人脑(神经元)、人乳腺浸润性导管癌、人宫颈鳞状细胞癌、人肺鳞癌、人小细胞肺癌、人胎盘、人子宫内膜间质肉瘤和人肺腺癌样本的细胞间质中CD44蛋白有表达。部分结果展示见图6，其中，左图为人扁桃体样本染色结果，右图为人肝样本染色结果。需要说明的是，人肝组织中，仅枯否细胞阳性，其他细胞阴性，该样本免疫组化结果符合理论着色，判定为阴性样本。

免疫组织化学染色结果显示抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体在细胞质和细胞间质定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。统计切片扫描结果，阳性样本中，在23个阳性样本中均有特异性染色，灵敏度为23/23＝100％，阴性样本中，1例为阴性，特异度为1/1＝100％，可见本发明的兔单克隆抗体能够特异性识别人CD44蛋白，无非特异性染色，检测多病理样本具有高准确性和良好的可靠性等优点。

实施例6针对兔单克隆抗体的流式细胞分析(Flow Cytometry，FCM)

取培养的高表达CD44蛋白的Hela细胞和人乳腺癌细胞MCF-7细胞样本，于500g离心4min，弃上清。用13mL PBS清洗一次，弃掉上清，加3ml TrypLETM Express酶(1×)消化细胞2min，显微镜下观察细胞消化状态，加入培养基终止消化，吹打收集细胞至离心管，400g离心5min，弃上清。将收集的细胞用1mL含0.5％BSA的PBS溶液重悬，400g离心3min，重复2次，取5×10⁶细胞数用0.5％BSA的PBS溶液重悬细胞至750μL。96孔板中每孔加50μL细胞悬液。

一抗孵育：每孔加入抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体工作液50μL(一抗工作浓度为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL)，振荡，室温反应20min；采用rabbit IgG(Kappa)(来自于Abclonal，货号AC042)作为兔同型对照(Rabbit isotype control，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色)，同型对照抗体的工作浓度为10μg/mL。

二抗孵育：400g离心5min，弃掉上清，加入100μL按照1：600稀释的荧光二抗GαR 2°Ab(Alexa647conjugated goat anti-rabbit pAb，购自Jackson，货号111-606-046)重悬避光振荡，室温反应20min。

信号检测：400g离心5min，弃掉上清，加入200μL含0.5％BSA的PBS溶液重悬，400g离心5min，去上清，重复两遍。用200μL含0.5％BSA的PBS溶液重悬细胞，上流式细胞仪检测荧光信号。按Beckman cytoflex流式分析仪使用与维护SOP-105-AND-CA-008操作进行分析。

流式细胞术检测结果分为：阳性和阴性。阳性必须在细胞上有特定的信号跃迁才能视为阳性，阴性在细胞上无信号跃迁才能视为阴性。如图7所示，横坐标代表通道的荧光信号/散射光信号的相对强度，纵坐标代表其对应的细胞数，红色曲线为不添加任何抗体的空白对照检测结果，蓝色曲线为同型对照检测结果，橘黄色曲线为CD44抗体检测结果。使用本发明的兔单克隆抗体与Hela细胞和MCF-7细胞结合之后荧光跃迁信号明显，能增加0.9-1.5的数量级，且随CD44兔单抗浓度增加而增强，证实抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体对于流式细胞术检测有很好的特异性和高的亲和力，且无非特异性识别。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括三个互补决定区，其中：

轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7所示；

重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示。

2.根据权利要求1所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；

所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1或2所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为全长抗体或具有免疫活性的抗体片段；

所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)₂片段、Fv片段、(Fv)₂片段、scFv片段和sc(Fv)₂片段中的至少一种。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-4任一项所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

7.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

8.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求5-7任一项所述的核酸分子。

9.如权利要求1-4任一项所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体在制备免疫检测人CD44蛋白试剂和/或试剂盒中的应用。

10.根据权利要求9所述的抗人CD44蛋白的兔单克隆抗体在制备免疫检测人CD44蛋白试剂和/或试剂盒中的应用，其特征在于，免疫检测方法包括免疫印迹法、酶免疫分析法、酶联免疫吸附法、酶联免疫斑点法、免疫荧光法、免疫组织化学法或流式细胞法；

免疫检测样本包括血清、细胞或组织，其中，细胞包括人宫颈癌细胞、人表皮癌细胞和人乳腺癌细胞中的一种或多种，组织包括人扁桃体、人结肠、人卵巢、人结外NK/T细胞淋巴瘤、人结肠浸润性腺癌、人子宫内膜样癌、人肝细胞癌、人前列腺腺癌、人高级别尿路上皮癌、人卵巢浆液性癌、人肝胆管癌、人恶性胶质瘤、人乳腺、人宫颈、人肺、人脑(神经元)、人乳腺浸润性导管癌、人宫颈鳞状细胞癌、人肺鳞癌、人小细胞肺癌、人胎盘、人子宫内膜间质肉瘤和人肺腺癌的一种或多种。