CN116836289B - 针对人mpo蛋白的兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体及其应用。所述针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体的轻链互补决定区1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3‑5所示；重链互补决定区1‑3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8‑10所示。本发明的兔单克隆抗体可以识别人细胞或组织表达的天然MPO蛋白，具有良好的特异性和亲和力，用于免疫检测尤其是免疫组织化学法检测时，背景染色干净，基本无非特异性染色，检测MPO蛋白的可靠性好、抗干扰能力强，而且具有分析灵敏度和特异度高等优点，能够有效避免假阳性和假阴性结果，适用于多种病理样本中MPO蛋白的高准确性和高精度检测。

Description

针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体及其应用。
背景技术
髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)又称过氧化物酶，是一种溶酶体血蛋白，属于血红素过氧化物酶超家族成员之一，主要来源于多形核中性粒细胞(PMN)、单核细胞和巨噬细胞，贮存在嗜氮颗粒中，是髓系细胞的特异性标志，可通过标记MPO蛋白精确定位和分选髓系细胞。
研究发现，MPO的主要功能是杀灭吞噬于细胞内的微生物，在受刺激的PMN中，MPO催化次卤酸的产生，主要是生理情况下的次氯酸，以及其他有毒中间体的产生，这些中间体大大提高了PMN杀微生物活性。然而，在特定条件下，MPO催化反应生成过量的氧化剂及其前体(如HOCl、NO2、3-氯化酪氨酸、酪氨酰基、硝基酪氨酸等)，超过局部抗氧化剂的防御反应时，就会导致氧化应激和氧化性组织损伤。因此，有研究表明MPO有促进冠心病形成的作用。MPO与过氧化氢相互作用，生成一系列具有广泛生物学效应的氧化剂，通过HOCl、NO2氧化途径或通过酪氨酸的硝化作用来氧化修饰低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白中的脂质、载脂蛋白等，导致脂质充填的泡沫细胞形成，胆固醇逆向转运功能受损，从而增大富含胆固醇酯的脂核，促进斑块形成和不稳定性增加。MPO还具有促炎性反应及激活细胞的特性，而这一特性不依赖它的催化活性；MPO与CD11b/CD18整联蛋白结合后黏附于外膜的中性粒细胞，从而激活细胞内信号级联放大，进而促使过氧化物的产生、脱粒和整联蛋白的表达，最终导致动脉粥样硬化(AS)斑块的形成，加速冠心病进展，并引起多种并发症如急性冠脉综合征(ACS)。MPO水平的升高与动脉粥样硬化(AS)和冠心病等不良心血管事件易感性相关，可以作为预测不良心血管事件的一个新兴标志物，临床用于AS和冠心病的辅助诊断和预后评估。
鉴于MPO蛋白的诊断和标记价值，目前临床上常采用基于抗体的免疫学方法如免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)检测细胞和组织中MPO表达水平和定位信息，因此开发特异性好、灵敏度高的抗MPO抗体具有重要意义。然而，目前市售的抗人MPO蛋白抗体的效价偏低、特异性不强，容易导致非特异性染色，进而影响检测结果的准确性，因此，较少有抗体能够满足免疫组织化学法的检测需求。开发特异性强、具备良好MPO蛋白结合能力的单克隆抗体已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中抗人MPO蛋白抗体的特异性差、难以用于免疫组织化学检测等问题，本发明提供了针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，并提供了该兔单克隆抗体在制备人MPO蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区，其中：轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5所示；重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
进一步地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区，4个所述框架区与3个所述互补决定区按顺序交错排列，构成可变区；所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ IDNO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。
进一步地，所述兔单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，所述兔单克隆抗体为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体。
进一步地，所述兔单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体包含如上所述的核酸分子。
本发明第四方面提供了如上所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体在制备人MPO蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
进一步地，免疫检测方法为免疫组织化学法，免疫检测病理组织切片样本包括扁桃体、结肠、结外NK/T细胞淋巴瘤、结肠浸润性腺癌、高级别尿路上皮癌、卵巢浆液性癌、肝、肝细胞癌、肺、肺鳞癌、肺腺癌、乳腺浸润性导管癌、胎盘和小细胞肺癌中的一种或多种。
本发明的优点及积极效果为：
本发明制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体可以识别人细胞或组织表达的天然MPO蛋白，具有良好的特异性和亲和力，用于免疫检测尤其是免疫组织化学法检测时，背景染色干净，基本无非特异性染色，检测MPO蛋白的可靠性好、抗干扰能力强，而且具有分析灵敏度和特异度高等优点，能够有效避免假阳性和假阴性结果，适用于多种病理样本中MPO蛋白的的高准确性和高精度检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1构建兔单克隆抗体表达载体所用的载体图谱，从左至右分别为预先携带重链恒定区和抗体轻链恒定区的pRB322载体图谱；
图2为本发明实施例1纯化所得的兔单克隆抗体1F9的凝胶电泳图；
图3为本发明实施例2病理芯片的样本分布图，图中灰色所示为阴性组织，其余为阳性组织；
图4为本发明实施例2利用兔单克隆抗体1F9通过免疫组织化学法检测人扁桃体样本中MPO蛋白的特异性定位和表达情况；
图5为本发明实施例2利用兔单克隆抗体1F9通过免疫组织化学法检测人结肠样本中MPO蛋白的特异性定位和表达情况；
图6为本发明实施例2利用兔单克隆抗体1F9通过免疫组织化学法检测人结肠癌样本中MPO蛋白的特异性定位和表达情况；
图7为本发明实施例2利用兔单克隆抗体1F9通过免疫组织化学法检测人脑(神经元)样本中MPO蛋白的特异性定位和表达情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
在本发明的上下文中，术语“兔单克隆抗体”、“单克隆抗体”、“抗体”等类似词语具有相同含义，可互换使用，均指特异性结合人(Human)髓过氧化物酶(MPO)蛋白的抗体。修饰词“兔”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于兔源免疫球蛋白序列。
抗体是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标抗原或表位。在本发明中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释并且包括不同的抗体结构，包括但不限于所谓全长抗体、抗体片段以及它们的遗传学或化学修饰，只要它们展示所期望的抗原结合活性。其中，“抗体片段”是指全长抗体的一个或多个部分或片段，在典型的例子中，抗体片段包括：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、(Fv)2、scFv、sc(Fv)2。
典型的抗体分子(全长抗体)由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。轻链可分为两种，分别为κ链和λ链；重链可分类为五种，分别为μ、δ、γ、α和ε链，并且分别将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constantregion，C)。重链可变区(VH)以及轻链可变区(VL)通常是抗体的最可变部分并含有抗原识别位点。VH与VL区域可进一步细分为高变区(hypervariable region，HVR)和框架区(framework region，FR)，高变区又称为互补决定区(CDR)，为环状结构，重链CDR与轻链CDR通过FR区紧密地靠在一起并相互配合，共同形成能与目标抗原或表位的三维结构互补的表面，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。FR区是VH与VL中较保守的部分，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连。每个VH与VL通常由三个CDR以及四个FR所组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
CDR可以根据Kabat定义、Chothia定义、Kabat定义和Chothia定义两者的累积、AbM定义、接触定义、IMGT独特编号定义和/或构象定义或本领域熟知的任何CDR确定方法来标识。如本发明使用的，CDR由Kabat编号系统来定义。
轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。不同型Ig(κ或λ)的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CH1、CH2、CH3和CH4。抗体重链与轻链恒定区的氨基酸序列是本领域众所周知的。
全长抗体是最为完整的抗体分子结构，具有典型的Y型分子结构，因此，在本发明的上下文中，“全长抗体”、“完整抗体”和“Y型抗体”具有相同含义，可互换使用。
术语“抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab)”是抗体分子中可以与抗原结合的区域，其由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链(可变区和一个恒定区片段)组成，通过对全长抗体进行蛋白酶切，可得到Fab、F(ab’)2、Fab’等片段。例如，在木瓜蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为两个Fab片段及一个Fc片段；在胃蛋白酶的作用下，IgG可以被降解为一个F(ab’)2片段和一个pFc'片段。F(ab')2片段进一步被还原，形成两个Fab’片段。由于Fab具备抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备单链抗体(scFv)一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构，在临床诊断和治疗上应用广泛。
术语“可变片段(Fv)”位于抗体Fab片段的N端，仅包含可变区，并且由一条轻链和一条重链的可变区组成，是一个VH和一个VL非共价结合的二聚体(VH-VL二聚体)，各可变区的3个CDR相互作用，在VH-VL二聚体表面形成抗原结合部位，具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整抗体。
术语“单链抗体(Single-chain variable fragment，scFv)“是指重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个柔性接头(linker，一般由10-25个氨基酸组成)连接而成的最小抗体片段，其保留了原始抗体对抗原的结合特异性，本发明中的接头只要不妨碍连接在其两端的抗体可变区的表达即可，没有特别限定。与全长抗体相比，scFv具有分子量小的特点，因此具有更高的穿透力和更低的免疫副反应。
本发明的抗体或抗体片段的全长序列可以来自单一物种，例如兔，或者可以是嵌合的或人源化的抗体，以降低机体排斥反应，同时保持所需的特异性、亲和性。术语“嵌合抗体”抗体是指抗体的一部分源自于特定的来源或物种，同时其余部分源自于不同的来源或物种。术语“人源化抗体”是非人源抗体如兔源抗体的CDR区和来自人FR区的嵌合抗体，在一些情况下，非人源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合，例如人兔嵌合抗体；在另一些情况下，非人源抗体的CDR区与源自人源抗体序列的FR区和恒定区结合，即将非人源抗体的CDR区嫁接到人类抗体框架(FR)序列上，这种框架序列来源于单个或多个其他人类抗体可变区框架序列。在本发明中，嵌合抗体或人源化抗体中的CDR区来源于兔源CDR区。
术语“单克隆抗体”是指同质抗体群，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原或表位。“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为限制抗体的结构、来源或制备方式。在一些实施例中，单克隆抗体通过杂交瘤法、噬菌体展示法、酵母展示法、重组DNA法、单细胞筛选或单细胞测序法制备得到。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(CDR)，轻链互补决定区1(LCDR1)、轻链互补决定区2(LCDR2)和轻链互补决定区3(LCDR3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；重链互补决定区1(HCDR1)、重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
本发明制备得到的具备上述CDR序列的兔单克隆抗体可以识别人细胞或组织表达的天然髓过氧化物酶(MPO蛋白)，具有良好的特异性和亲和力，经免疫组织化学法检测多个表达MPO蛋白的阳性组织样本和不表达MPO蛋白的阴性组织样本，其能够准确检测出所有阳性样本，阳性样本染色明显，背景干净，基本无非特异性染色，而且在所有阴性样本中无染色，证实该抗体在免疫检测MPO蛋白时具有高的准确性、良好的可靠性和优良的抗干扰能力，而且具有分析灵敏度和特异度高等优点，能够有效避免假阳性和假阴性结果，能够适用于多种病理样本中MPO蛋白的高准确性和高精度检测，特别是适用于组织切片免疫组织化学检测。
可选地，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区(FR)，4个FR与3个CDR按顺序交错排列，构成可变区。本发明的兔单克隆抗体的所述轻链可变区(VL)的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
可选地，本发明的兔单克隆抗体还包括轻链恒定区(CH)和重链恒定区(VH)，CL和VL构成完整轻链，CH和VH构成完整重链。抗体的恒定区通常通过公开查询即可获得，如：通过IMGT在线数据库(www.imgt.org)，搜寻兔源IgG gamma C reign获得CH，搜寻兔源IgGKappa C reign获得CL。
示例性地，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。对应地，包含CH的所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包含VH的所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
可选地，本发明的兔单克隆抗体可以为全长抗体或抗体片段，所述抗体片段包括但不限于：(i)Fab片段，由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区构成的单价片段；(ii)F(ab)2片段，包含由铰链区二硫桥相连的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fv片段，由抗体的一个重链可变区和一个轻链可变区构成；(iv)(Fv)2片段，由两个共价连接在一起的Fv片段构成；(v)scFv片段，由单一多肽链构成的Fv片段，一个重链可变区和一个轻链可变区通过接头连接形成；(vi)sc(Fv)2片段，是将两个重链可变区和两个轻链可变区通过接头等连接而成。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常规技术获得。
本发明的抗体片段具有氨基酸序列如SEQ ID NO.3-5和SEQ ID NO.8-10所示的CDR区，更优选地具有氨基酸序列如SEQ ID NO.2和7所示的可变区，能够保留完整的抗原识别和结合部位，进而与全长抗体结合于相同的抗原，尤其是结合于相同表位。
本发明又一实施例提供了一种核酸分子，所述核酸分子用于编码如上所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体。
核酸分子可以是DNA形式(例如cDNA或基因组DNA或合成DNA)或RNA形式(例如mRNA或合成RNA)。DNA可以是单链的或是双链的，也可以是编码链或是非编码链。核酸分子的序列依据抗体的氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。
示例性地，本发明的兔单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。本领域技术人员可以理解，由于遗传密码的简并性，不同于前述示例的核酸分子同样可以编码得到兔单克隆抗体，因此，述示例的核酸分子不应作为对本发明保护范围的限定。
核酸分子全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当序列较长时，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链和轻链的编码序列和表达标签(如6×His)融合在一起，形成融合蛋白。
本发明另一实施例提供了一种重组载体，所述重组载体包含如上所述的核酸分子。
构建所述重组载体的出发载体为本领域常规的各种载体，只要其能够容载所述核酸分子即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。载体可以是克隆载体(即用于将核酸分子转移到宿主中，并在宿主细胞中大量繁殖)或表达载体(即包含必要的遗传元件从而允许插入到载体的核酸分子在宿主细胞中表达)。因此，克隆载体可以包含选择标记，以及与所述克隆载体所指定的细胞类型相匹配的复制起点，而表达载体则包含在指定宿主细胞中表达的调控元件(如启动子、增强子)。本发明的核酸分子可以插入到合适的载体中以形成携带本发明核酸分子的克隆载体或表达载体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子可以克隆至一个载体中，每段核酸序列连接到合适的启动子下游；如，编码重链与轻链的每段核酸序列可操作地连接到不同的启动子，或者，编码重链与轻链的核酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表达。在另一些实施方式中，编码如本发明抗体的重链与轻链的核酸分子也可以别构建到两个载体上，其可以被导入至相同或不同的宿主细胞中。当重链与轻链在不同的宿主细胞中表达时，每一条链都可以从表达其的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合并在合适的条件下孵育以形成抗体。前述的表达载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，也可用显微注射、电穿孔或脂质体包装等方法。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，以及显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞，真菌细胞如酵母、果蝇S2或Sf9的昆虫细胞、CHO、COS7、293系列细胞等。在获得转化如上所述的表达载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出单克隆抗体，然后再进行分离以得到纯化的抗体。
在较佳的实施方式中，上述所述的重组载体为哺乳动物表达载体pBR322，宿主细胞为人肾上皮细胞(293F细胞)。
本发明实施例还提供了如上所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体在制备人MPO蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
所述针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体、核酸分子、重组载体在制备人MPO蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用优势与如上所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
本发明的抗体可以单独使用，也可以与可检测标记物(为检测目的)结合或偶联。用于检测目的的可检测标记物包括但不限于：生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶(如辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶)、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、放射性核素、检测抗体或其组合。
在免疫检测时，将本发明的抗体作为抗原结合抗体(如捕获抗体或一抗)，其特异性识别和结合待检样本中的MPO蛋白，之后通过与其连接的可检测标记物产生可识别的信号变化，或者通过偶联有可检测标记物的检测抗体(或二抗)特异性结合本发明的抗体以产生可识别的信号变化，从而实现定性或定量检测人MPO蛋白。本发明提供的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体能够用于建立特异性好、准确性高的免疫学检测方法。
在较佳的实施方式中，所述免疫检测方法为免疫组织化学法，适用的免疫检测病理组织切片样本包括但不限于：扁桃体、结肠、结外NK/T细胞淋巴瘤、结肠浸润性腺癌、高级别尿路上皮癌、卵巢浆液性癌、肝、肝细胞癌、肺、肺鳞癌、肺腺癌、乳腺浸润性导管癌、胎盘和小细胞肺癌。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体的制备
1、抗原制备
本实施例选择人MPO蛋白(Uniprot数据库编号：P05164)Ser720-Ser745序列，利用体外合成技术合成Ser720-Ser745多肽与血蓝蛋白偶联作为免疫原。其中，MPO蛋白Ser720-Ser745的氨基酸序列如下所示：
SNSYPRDFVNCSTLPALNLASWREAS(SEQ ID NO.13)。
2、动物免疫
采用Ser720-Ser745多肽免疫新西兰大白兔，每只白兔免疫200μg，首次免疫前将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射。首次免疫后每间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，在兔腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次。三次免疫后采集兔子血清样本，用ELISA方法测定其针对MPO的血清效价。取OD450 nm大于0.2的兔子，用200μg免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后牺牲动物，取脾脏。
3、脾脏细胞分离
在生物安全柜中无菌操作，取出一个培养皿，加入30～40mL的基础培养基(RPMIMedium 1640basic+1％ Pen Strep；RPMI 1640购自Gibco，货号C11875500BT；Pen Strep购自Gibco，货号15140-163)，放入一个细胞筛网，将脾脏取出放置于细胞筛中，用无菌剪刀、镊子剪去脾脏上多余的结缔组织、脂肪组织后，将脾脏尽量剪碎于研筛中，取无菌洁净的研磨棒，用其按压处的末端对组织进行碾压研磨，尽可能研磨彻底至整个脾脏组织接近于白色；研磨后的细胞会通过细胞筛网过滤至培养基中；用移液管吸取含有细胞的培养基至无菌的50mL离心管中，并吸取10mL培养基再次清洗一遍培养皿，将残余在培养皿中的细胞尽可能吸取至离心管中；室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞，加入13mL常温的RBC红细胞裂解液(购自Biogems公司，货号64010-00-100)，用移液枪轻柔的吹打细胞几次后计时1min，进行红细胞裂解，计时完成后加入37mL的基础培养基以终止反应，室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞；加入40mL常温放置的基础培养基，用移液枪吹打重悬细胞，室温下以400g离心力离心5min，吸弃上清，保留细胞；加入20mL常温放置的B细胞培养基，用移液枪吹打重悬细胞，经由筛网再次过滤细胞，进行计数。
4、B淋巴细胞的分选和培养
参见专利“从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法(公开号：CN110016462A)”和专利“一种B淋巴细胞体外培养体系及应用(公开号：CN111518765A)”。
5、编码兔单克隆抗体基因的克隆
取培养后的B细胞上清，采用抗原包被的ELISA实验来鉴定能够识别和结合人MPO蛋白的B淋巴细胞阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后按Quick-RNATM MicroPrep试剂盒说明书(购自ZYMO，货号R1051)提取RNA，并反转录成cDNA。其中，反转录体系如下：Oligo(dT)12-18primer(Life)1μL、dNTPs(10mM)1μL、RNA 1μL；在PCR仪中65℃、5min后，向以上产物中加入5×FS Buffer(ABconal)4μL、DTT(100mM)1μL、RNase OUT(40U/μL)(life)1μL、ABScript Ⅱ RT(200U/μL)(购自ABconal)1μL，混匀后在42℃反应1h，之后85℃反应5min，得到cDNA。
以cDNA为模板，采用PCR方法，将天然配对的兔单克隆抗体轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因从对应阳性克隆的cDNA中扩增出来。PCR反应体系包括：4μL cDNA、1μL正向引物(10mM)、1μL反向引物(10mM)、12.5μL 2×Gloria HiFi(购自武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号RK20717)和6.5μL H2O。PCR扩增程序包括：98℃预变性30s，随后按照98℃10s，64℃30s，72℃30s的条件进行40次循环，最后在72℃保持5min，得到的反应液置于4℃保存。前述的VL和VH的正向引物和反向引物的核酸序列如下所示：
VL-Primer-F：5’-tgaattcgagctcggtacccatggacacgagggcccccac-3’(SEQ IDNO.14)；
VL-Primer-R：5’-cacacacacgatggtgactgttccagttgccacctgatcag-3’(SEQ IDNO.15)；
VH-Primer-F：5’-tgaattcgagctcggtacccatggagactgggctgcgctg-3’(SEQ IDNO.16)；
VH-Primer-R：5’-gtagcctttgaccaggcagcccagggtcaccgtggagctg-3’(SEQ IDNO.17)。
将扩增得到的重链、轻链的可变区基因纯化后，分别装载在表达载体pBR322上，所使用的哺乳动物表达载体pBR322预先携带轻链和重链恒定区，其表达图谱见图1，图中，pRB322origin和f1origin是在大肠杆菌(E.Coli)中的复制启动子，Ampcillin是质粒抗性基因，CMV immearly promotor为在真核生物中的启动子，SV40 PA terminator是加尾信号，Light chain constant为轻链恒定区(CL)的核酸序列(左图)，Heavy chain constant为重链恒定区(CH)的核酸序列(右图)，CL和CH可以通过查询IMGT在线数据库(www.imgt.org)获得。构建表达载体的方法包括：将含兔单克隆抗体CH和CL的哺乳动物细胞表达载体pBR322分别用NheI和XbaI限制性内切酶常规线性化处理，采取同源重组的方式，分别将上述扩增得到的上游具有信号肽编码基因的VL基因和VH基因构建到pBR322中，并经测序确定序列，测序工作由金开瑞生物科技有限公司完成，得到SEQ ID NO.11-12所示的轻链和重链编码基因。
需要说明的是，本实施例的信号肽可以采用本领域常用的抗体表达信号肽序列，如专利“抗人干扰素α2的兔单克隆抗体及其应用(公开号：CN116063487A，公开日期：2023-05-05)”，轻链可变区上游具有信号肽“MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATF”，编码基因为“ATG GACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGCCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCTGGAGCCAC ATTT”；重链可变区上游具有信号肽“METGLRWLLLVAVLKGVQC”，编码基因为“ATGG AGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCCGTGCTCAAGGGTGTCCAATGC”。
6、工程细胞培养获得纯化的抗人MPO蛋白兔单克隆抗体
将含有兔单克隆抗体轻链基因和重链基因的表达载体共转染到293F细胞；转染后培养72-96h，获得培养上清中含有重组的、识别人MPO蛋白的兔单克隆抗体。
使用Protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人MPO蛋白的兔单克隆抗体，实验步骤如下：将培养上清转移至无菌50mL离心管中，1000g、4℃(或常温)离心10min，收集上清液。将预处理后的Protein A Agarose(购自天地人和，货号SA023100)悬浮液加入到离心后细胞上清液中，振荡孵育3-4h(室温)或4℃过夜。孵育完成后1000g离心10min，将Protein A Agarose悬浮液转移到吸附柱中，常温离心1min，使固液分离，收集流穿液。加入10倍Protein A Agarose体积的洗涤缓冲液(0.02M PB缓冲液，pH＝7.0)并重新悬浮颗粒，离心收集洗杂液(0.02M PB缓冲液，pH＝7.0)，再重复洗杂两次。向吸附柱中加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH＝3.0)，离心，用中和液(1M Tris-HCl，pH＝8.5)将pH调整至7.0获得抗体上清，将抗体上清装入透析袋中，透析过夜后，得到纯化后的、可以识别人MPO重组蛋白的兔单克隆抗体，命名为1F9。
使用12％ SDS-PAGE凝胶电泳验证抗体纯度，凝胶电泳结果见图2，泳道从左至右分别为Maker、牛血清白蛋白(BSA)和兔单克隆抗体1F9，图中可以清晰的看见抗体1F9的非还原条带，抗体纯度>90％，抗体浓度为1mg/mL，将抗体分装，于-20℃低温保存备用。
本实施例得到的兔单克隆抗体1F9的氨基酸序列和编码基因的核苷酸序列见表1，以下为描述方便，轻链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示，重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，AA表示氨基端序列，DNA表示核苷酸序列。
表1本发明的兔单克隆抗体1F9涉及的序列信息汇总
实施例2针对兔单克隆抗体1F9的免疫组织化学分析
1、芯片选择
病理芯片(购自百奥斯公司，货号TMA000-24–H，定制产品)包含表达人MPO蛋白的阳性样本和不表达人MPO蛋白的阴性样本，阳性样本(共计14例)包括：扁桃体、结肠、结外NK/T细胞淋巴瘤、结肠浸润性腺癌、高级别尿路上皮癌、卵巢浆液性癌、肝、肝细胞癌、肺、肺鳞癌、肺腺癌、乳腺浸润性导管癌、胎盘、小细胞肺癌；阴性样本(共计10例)包括：前列腺腺癌、恶性胶质瘤、脑(神经元)、卵巢、子宫内膜样癌、乳腺、宫颈、宫颈鳞状细胞癌、子宫内膜间质肉瘤、肝胆管癌。
2、免疫组织化学法(IHC)染色及分析
1)样本准备和烤片：将石蜡切片按同一朝向放置在切片架上，将其放入56℃的恒温箱中烤片30min；同时将脱蜡液1缸一起放入56℃的恒温箱中；脱蜡至水：将石蜡切片连同切片架一起放入脱蜡液1缸中，再一起从恒温箱中取出置于常温，5min后，将切片取出浸入到常温脱蜡液2缸中，并按照脱蜡液2、脱蜡液3、无水乙醇1、无水乙醇2、无水乙醇3的顺序依次将石蜡切片放入缸中，脱蜡液试剂缸每缸5min，无水乙醇试剂缸每缸3min；用流水清洗切片3min。前述的脱蜡液1-3购自无锡市江原实业技贸有限公司；
2)抗原修复：0.01M Tris-EDTA修复液(pH9.0)高压热修复；
3)内源性过氧化物酶灭活：用PBS缓冲液浸洗3次，每次1min，去除切片上的缓冲液；将切片完全浸入到3％过氧化氢溶液中，室温孵育10min；
4)封闭：用PBS缓冲液浸洗3次，每次3min，去除切片上的缓冲液；用免疫组化水笔圈定玻片上待检测组织区域，在圈定区域内滴加PBS封闭液；将切片水平放置在底部呈有水的孵育湿盒中，于常温孵育30min，从滴加封闭液开始计时；
5)一抗孵育：去除封闭液，在组织切片上滴加200uL用抗体稀释液-PBS工作液稀释的兔单克隆抗体1F9(一抗稀释比为1:2000)，水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育60min；去除抗体工作液，PBS缓冲液快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；
6)二抗孵育：在组织切片上滴加即用型二抗工作液(购自Dako公司，货号K5007)后水平放置于孵育湿盒中，于常温孵育25min；去除切片上的试剂，缓冲液PBS快速漂洗1次，用缓冲液PBS浸泡洗涤3次，每次3min；浸泡洗涤期间需反复上下提拉多次；
7)显色：在组织切片上滴加显色液工作液，显微镜下密切观察颜色变化情况，得到合适的染色强度后；将切片浸入大量蒸馏水中终止显色；终止显色后，将切片入流水中清洗10min；
8)复染：稍沥干的组织切片浸入Mayer’s苏木素复染1min，之后用流水清洗3min；
9)返蓝：将稍沥干的切片浸入碳酸锂饱和水溶液中蓝化3s，用流水清洗3min。
10)脱水：将清洗后的切片于无水乙醇中浸泡1次，浸泡期间需上下提拉数次，计时10s后，取出；置于恒温鼓风干燥箱中高温(54-58℃)下完全干燥。
11)封片：在切片中心滴加适量中性树胶，并加盖盖玻片，加胶量需适量，加封盖玻片后需完全覆盖组织，且不能有胶溢出；
12)切片扫描：组织芯片检测结果详见图3，阴性组织使用灰色背景标记。
免疫组化染色结果分为：阳性和阴性，其中在相应细胞和组织特定的抗原部位有棕黄色着色视为阳性，其余为阴性，例如粒细胞呈强阳性反应(棕褐色)，单核细胞呈弱阳性反应(浅棕色)，其余细胞阴性。在24点组织切片，在14个阳性样本的抗原表达细胞均有特异性染色，灵敏度达到14/14＝100％，具体为：1/1例扁桃体、1/1例结肠、1/1例结外NK/T细胞淋巴瘤、1/1例结肠浸润性腺癌、1/1例高级别尿路上皮癌、1/1例卵巢浆液性癌、1/1例肝、1/1例肝细胞癌、1/1例肺、1/1例肺鳞癌、1/1例肺腺癌、1/1例乳腺浸润性导管癌、1/1例胎盘、1/1例小细胞肺癌可见明显中高强度阳性着色，少数组织伴中到低等强度非特异着色，部分阳性结果展示见图4-6，其中图4-6分别为人扁桃体(Human tonsil)、人结肠(Human colon)和人结肠癌(Human colon carcinoma)采用兔单克隆抗体1F9的检测结果。在10个阴性样本中均无特异性染色，特异度达到10/10＝100％，具体为：1/1例前列腺腺癌、1/1例恶性胶质瘤、1/1例脑(神经元)、1/1例卵巢、1/1例子宫内膜样癌、1/1例乳腺、1/1例宫颈、1/1例宫颈鳞状细胞癌、1/1例子宫内膜间质肉瘤、1/1例肝胆管癌阴性，图7示出了阴性对照人脑(Human brain)采用兔单克隆抗体1F9的检测结果。
本发明的兔单克隆抗体1F9用于IHC分析的整体阳性强度高，棕黄色染色明显，特异性好且基本无非特异性染色，背景干净，有利于提高检测的准确性，而且分析灵敏度和特异度高，能够有效避免假阳性和假阴性结果，可满足多病理样本的高准确性和高精度检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区，其中：
轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示；
重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括4个框架区，4个所述框架区与3个所述互补决定区按顺序交错排列，构成可变区；
所述轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
3.根据权利要求1所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区为κ链，所述重链恒定区为IgG1型。
4.根据权利要求3所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求1或2所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为全长抗体或抗体片段；
所述抗体片段选自Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、(Fv)2片段、scFv片段和sc(Fv)2片段中的至少一种。
6.一种核酸分子，其特征在于，用于编码如权利要求1-5任一项所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述兔单克隆抗体的轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
8.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求6-7任一项所述的核酸分子。
9.如权利要求1-5任一项所述的针对人MPO蛋白的兔单克隆抗体在制备人MPO蛋白免疫检测试剂和/或试剂盒中的应用。
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