CN117069835B - 一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体及其应用，具体涉及抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO：4所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：5所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：6所示的轻链可变区CDR3。本发明还提供了编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸分子、载体、宿主细胞、方法及应用。本发明还提供了包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的产品、组合物和衍生物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
经典肝素诱导性血小板减少症(Heparin induced thrombocytopenia,HIT)于1973年首次发现，以PF4-肝素复合物形成为特征、产生了肝素依赖性抗体。临床表现为血小板减少和血栓形成，发病率约为0.1％-5.0％，20％-64％患者确诊时已发生了难以逆转的多发性危及生命的静脉和动脉血栓，截肢率和死亡率可达5-10％和10-20％。PF4是一种高阳离子四聚体蛋白，与聚阴离子结合形成免疫复合物后，可被血小板活化抗PF4抗体的免疫球蛋白G类(immunoglobulin G,IgG)靶向，诱发免疫性血小板减少和血栓事件。PF4在体内以单体、二聚体和四聚体形式存在。
血管性血友病因子(Von Willebrand factor,VWF)是一种主要由血管内皮细胞和骨髓巨核细胞合成、参与止血作用的大型黏附多聚体蛋白。VWF在维持凝血和出血的平衡中起着至关重要的作用，VWF缺乏或缺陷可导致血管性血友病并引起出血，而VWF的增加可能创造一个促进血栓形成的环境。
vWF/PF4被提出作为HIT、自发性HIT及VITT的新型生物标志物，其表达水平升高可诱导抗体形成和血小板消耗，是免疫性血栓形成的关键诱因。然而，目前尚无针对vWF/PF4复合物抗体检测的方法，亟需开发新的抗体复合物以满足临床检测需求。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO：4所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：5所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：6所示的轻链可变区CDR3。
在某些具体的实施方案中，所述抗体包括多特异性抗体、裸抗体、抗体缀合物和抗体片段，只要它们表现出目的生物学活性即可。在某个具体的实施方案中，所述抗体包含完整(即完全)免疫球蛋白分子或包含互补位的抗体的抗原结合片段，包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、双抗体、线形抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异抗体。所述单链Fv或“sFv”抗体片段包含抗体重链和轻链可变区，这些结构域在单一多肽链上。
进一步，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4，轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4。
进一步，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO:7、8、9、10所示，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4的序列分别如SEQ ID NO:11、12、13、14所示。
进一步，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的序列如SEQ ID NO:15所示，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的序列如SEQ ID NO:16所示。
进一步，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施例中，本发明提供的单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施例中，本发明提供的单克隆抗体或其抗原结合片段是由本发明提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。
在某些实施例中，本发明提供的单克隆抗体和其功能片段进一步包含免疫球蛋白(Ig)恒定区，其任选地进一步包含重链和/或轻链恒定区。在某些实施例中，重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2、CH3区(或任选地CH2、CH3、CH4区)。本发明提供的单克隆抗体或其抗原结合片段的恒定区可与野生型恒定区序列一致或相差一或多个突变。
在某些实施例中，本发明提供的单克隆抗体或其抗原结合片段在CDR序列中的一或多个和/或FR序列中的一或多个中包含一或多个氨基酸残基取代。在某些实施例中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
本发明还提供了一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述单克隆抗体的抗原结合片段包括核酸功能片段或氨基酸功能片段。
在某些具体的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段可以偶联其功能片段(如核酸功能片段)和可检测标记物，其中抗原结合片段可以发挥结合抗原基因使其沉默、或剪切抗原基因等的功能。
本发明还提供了一种载体，所述载体包括前面所述的核苷酸分子。
进一步，所述载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、质粒、DNA载体、mRNA载体、基于转座子的载体、人工染色体、噬菌体、SV40、CMV、TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线形或环形DNA。
在某些具体的实施方案中，所述载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或“重组载体”。重组载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本申请的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，可以根据待表达的核酸分子或目的链接的宿主细胞的需求进行选择。
在某些实施方案中，所述载体可以是重组表达载体或克隆载体，其含有编码抗vWF/PF4蛋白抗体的本发明提供的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子和/或至少一个选择标记。在一个具体的实施方案中，所述载体包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，如pcDNA3.3、pMD18 T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD Hyg GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TVL、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF 1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEFBos等。
本发明还提供了一种已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，所述已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体包括前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子，或前面所述的载体。
进一步，所述的宿主细胞包括真核细胞或原核细胞。
进一步，所述真核细胞包括具有细胞核的动物细胞、植物细胞、真菌细胞。
进一步，所述原核细胞包括没有核膜为界的细胞核的细菌、衣原体、支原体、蓝细菌、立克次氏体、放线菌。
进一步，所述宿主细胞包括杂交瘤细胞。
在某些具体的实施方案中，所述载体DNA可通过常规的转化或转染技术向原核和真核细胞内导入。在进一步的实施方案中，宿主细胞是抗原递呈细胞，尤其是树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。核酸可以以单拷贝或两个以上拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，所述核酸表达在宿主细胞中。
本发明还提供了一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段的抗体衍生物，所述抗体衍生物包含前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段直接或间接的偶联到可检测标记物或药物形成的复合物。
进一步，所述可检测标记物包括酶标记物如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶或苹果酸脱氢酶，荧光染料如荧光素、罗丹明及其衍生物、花菁类荧光染料、香豆素及其衍生物、吖啶、菲啶类、查尔酮和香豆素类、稠环芳烃类、噻嗪/噁嗪类、丹磺酞胺、卟啉类、镧系元素、上转化发光材料或量子点荧光材料，生物素标记如琥珀酰亚胺脂，胶体金标记，SPA标记或铁蛋白标记。
本发明还提供了一种检测vWF/PF4蛋白的产品，所述产品包括前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子、前面所述的载体、前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，或前面所述的抗体衍生物。
进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、芯片。
本发明还提供了一种检测肝素诱导性血小板减少症的产品，所述产品包括前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子、前面所述的载体、前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，或前面所述的抗体衍生物。
本发明还提供了一种组合物，所述组合物包括前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子、前面所述的载体、前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体。
进一步，所述组合物包括药学上可接受的辅料。
进一步，所述辅料包括静脉滴注、皮下注射、静脉推注、玻璃体内注射、肌肉注射所需的辅料。
进一步，所述辅料包括生理盐水、D5W、林格氏乳酸、透明质酸酶、溶液张力调节剂、溶液渗透压调节剂、冻干粉的冻干保护剂、降粘辅料、缓冲液或表面活性剂。
本发明还提供了一种生产前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的核苷酸分子或前面所述的载体转化到宿主细胞；在适宜条件下培养已转化的宿主细胞；在宿主细胞培养液中分离纯化得到前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述转化进入宿主细胞的方法包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击。
本发明还提供了一种体外抑制vWF/PF4蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子，或前面所述的载体导入到生物体细胞中，通过表达前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制vWF/PF4蛋白的活性。
本发明还提供了一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中vWF/PF4蛋白或编码其的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或将待测样品与前面所述的抗体衍生物接触；检测vWF/PF4蛋白或编码其的核酸分子与前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或与前面所述的抗体衍生物的复合物的形成。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子、前面所述的载体、前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，或前面所述的抗体衍生物在检测vWF/PF4蛋白或编码其的核酸片段中的应用。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子、前面所述的载体，或前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测vWF/PF4蛋白的产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子、前面所述的载体，或前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测肝素诱导性血小板减少症的产品中的应用。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子、前面所述的载体，或前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备预防或治疗肝素诱导性血小板减少症的药物中的应用。
本发明还提供了前面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、前面所述的核苷酸分子、前面所述的载体，或前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备调节vWF/PF4蛋白活性或表达水平的药物中的应用。
具体实施方式
在描述本发明方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本发明所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
定义
本发明所使用的术语“抗体”或“抗体分子”指免疫球蛋白分子(包括IgG、IgE、IgA、IgM、IgD)和/或免疫球蛋白分子的免疫活性部分即包含抗体结合部位或互补位并能结合抗原的分子。“抗原结合片段”、“抗体结合片段”、“抗体结合部位”或“抗原结合部位”是特异结合抗原的包含重链和轻链可变区和高可变区(CDR)的抗体分子的结构部分。如本领域已知，抗体的特定特性涉及免疫球蛋白同种型。在代表性实施方案中，抗体或抗原结合片段是IgG1同种型分子。抗体或片段还可以来自包括鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等)和哺乳动物(例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫等)种的任何来源的物种。
本发明所使用的术语“单克隆抗体”或“mAb”指从基本上同质的抗体群体得到的抗体，即群体中包含的单个抗体是相同的，除了少量存在的天然发生突变的可能性以外。mAb是高度特异的并且直接针对抗原上的单一抗原决定簇(即表位)。这种特性与多克隆抗体制品形成对照，多克隆抗体一般包括针对不同抗原决定簇的抗体。
本发明所用的术语“蛋白质”和“肽”指氨基酸残基聚合物(氨基酸序列)，不意味着分子的特定长度。该术语也指或包括任何多肽的修饰(例如翻译后)，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。当在定量，或测定样品中蛋白质或肽的蛋白质水平的背景下使用术语“水平”或“定量的”时可指绝对或相对定量。绝对定量可通过加入一种或多种已知浓度的对照分析物，并将检测到的靶蛋白或肽的水平比照已知对照分析物(例如通过产生标准曲线)实现。
本发明所使用的术语“载体”指这样的核酸分子，其能够运输与这种核酸分子所结合的其它核酸。载体的一个类型是“质粒”，即可连接额外的DNA片段的环状双链DNA环。载体的另一个类型是病毒载体，对额外的DNA片段而言有可能向这种病毒的基因组内连接。某些载体能够在已导入这些载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制原点的细菌载体)。其它载体当向宿主细胞导入时有利地在宿主细胞的基因组内整合并且因此随宿主基因组一起复制。而且某些载体能够控制与这些载体有效连接的基因的表达。这些载体在本上下文中称为“表达载体”。通常适用于DNA重组技术的表达载体采用了质粒的形式。在本说明书中由于质粒是最常用的载体形式，故“质粒”和“载体”可交换使用。然而本发明还将覆盖具有类似功能的其它形式的表达载体如病毒载体。
本发明中所使用的术语“转化”和“转染”、接合和转导如在本上下文中所用，旨在包含本领域众知的用于向宿主细胞内导入外源核酸(如DNA)的多种方法，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔或粒子轰击。
本发明中所使用的术语“宿主细胞”涉及任何能被外源性核酸转化或转染的细胞。术语“宿主细胞”根据本发明包含原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人类、小鼠、仓鼠、猪、山羊、猿类的细胞。细胞可以来源于多种多样的组织细胞，并且包含原代细胞和细胞系。特异性样品包含角质细胞、外周血白细胞、骨髓的干细胞和胚胎干细胞。
本发明中所使用的术语“表达”是指最一般意义的表达，并且包含RNA或者RNA和蛋白质的生产。它还包含核酸的部分表达。
本发明中所使用的术语“可检测标记物”是指任何部分，该部分通过与该部分(moiety)偶联的分子状态的光学、电学或其它物理指标的改变生成可测定信号。此类物理指标包括光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学和化学手段，例如但不限于荧光、化学荧光和化学发光等。
除非另外定义，否则本发明所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本发明所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本发明所提到的所有出版物均通过全文引用的方式并入本发明中。
实施例1 vWF/PF4复合物单克隆抗体的杂交瘤制备
1、vWF/PF4复合物的制备
将天然提取的VWF蛋白和重组PF4蛋白分别对PBS缓冲液进行透析。结束后用PBS分别将VWF蛋白和重组PF4蛋白稀释至0.5mg/mL，按照VWF蛋白和重组PF4蛋白摩尔比1:1的比例进行混合，4℃孵育2小时。经过分子筛高效色谱纯化，得到VWF/PF4复合物。
2、免疫小鼠
将0.5mg/mL VWF/PF4复合物(抗原)与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μL乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠接种VWF/PF4复合物100μg。三周后将0.5mg/mL抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μL乳化后皮下多点注射，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，以此作为加强免疫。间隔三周、六周以及九周后按照前述加强免疫的流程再次免疫，总共进行4次加强免疫。
3、免疫血清效价测定
第四次加强免疫后10天小鼠尾静脉采血，采用间接ELISA法测定免疫血清效价。间接ELISA法如下：用50mM PBS将VWF/PF4复合物稀释至50μg/mL，按100μL/孔量加入聚苯乙烯96孔板中，4℃过夜包被。将包被液丢弃后，按200μL封闭液(含1％胎牛血清的PBS)/孔量加入聚苯乙烯96孔板中，37℃封闭2小时。用PBST洗板三次，鼓风干燥箱，37℃烘干4小时，铝塑封口袋封口，4℃保存待用。鼠免疫血清用含稀释液(含1％胎牛血清的PBS)进行102～106倍稀释，加入96孔板，100μL/孔，随后在37℃条件下孵育1h，后采用PBST洗板三次后，加入1:50000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG，100μL/孔，随后在37℃条件下孵育30min，采用PBST洗板三次。随后每孔加入TMB显色100μL/孔，于室温避光10min，后按照50μL/孔的量加入1M H2SO4终止反应。测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2.1为阳性判断值来确定免疫血清效价，结果如表1所示。
表1
| 稀释倍数 | 免疫小鼠1 | 免疫小鼠2 | 免疫小鼠3 | 免疫小鼠4 |
| 10000 | 3.37 | 3.25 | 3.34 | 3.20 |
| 100000 | 2.38 | 2.28 | 2.33 | 2.31 |
| 500000 | 1.41 | 1.36 | 1.32 | 1.49 |
| 1000000 | 0.71 | 0.67 | 0.83 | 0.76 |
4、杂交瘤的制备
取血清效价大于1:105的小鼠，融合前3天，取复合物蛋白与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。
饲喂层细胞制备流程：Balb/c(4周左右)小鼠眼眶静脉放血处死，75％乙醇浸泡3分钟，腹侧面向上；打开胸腔分离出胸腺，使用细胞筛研磨，使用预热好的基础培养基冲悬细胞。腹腔巨噬细胞的制备：融合当天，选择健康小鼠1只(1个脾脏取一只)，摘其眼球放血，待血滴不出为止。颈椎脱臼致死，75％酒精浸泡消毒5分钟，移入超净工作台，腹部朝上固定于解剖板上。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口(注意不可损伤腹膜、以免腹腔液外流)，经钝性剥离使腹膜充分暴露，并用酒精擦拭消毒。用一次性无菌注射器吸取基础培养液5～10mL注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左手用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部1～2分钟，促使巨噬细胞游出。再用注射器吸出腹腔内的培养液转移至15mL离心管中。将腹腔巨噬细胞与胸腺细胞混匀后，1200r/min离心10分钟，弃上清。使用预热好含20％ FBS 1×HAT培养基(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma))重悬，于37℃备用。
细胞融合当日上午，脾细胞的制备流程：取已经加强免疫后3～4天的小鼠，摘除眼球采血，并收集分离血清作为抗检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5分钟消毒，并立即放超净台内。于解剖台板上固定小鼠，无菌开腹，后掀开右侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪，用无菌手术剪剪开腹膜，镊子取出脾脏，生理盐水冲洗脾脏后，使用剪刀将脾脏剪碎，放置在一次性细胞筛内，用注射器内芯轻轻挤压脾脏，并用生理盐水反复冲洗细胞筛，至细胞筛中只剩结缔组织，后再次使用一次性细胞筛过滤细胞悬液。收获脾细胞悬液，1200r/min离心10分钟，用30 40mL的重悬离心洗涤1次(尽量去除红细胞团)。将脾细胞重悬加入含10％ FBS的基础培养液后，放入T75细胞瓶于37℃、5％CO2培养箱中培养2-3小时，使细胞悬液中的巨噬细胞贴壁。
融合细胞当日下午，骨髓瘤细胞的制备流程：将3瓶T75骨髓瘤细胞，弃上清，使用50mL预热的生理盐水吹下，与脾细胞共同离心，1200r/min离心10分钟。将脾细胞与3瓶T75骨髓瘤细胞充分混匀，弃上清，使用40ml预热的生理盐水重悬，1200r/min离心10分钟。
细胞融合过程：弃上清液，将上清液尽量弃尽，用滴管吸净残留液体，以免影响细胞融合剂的浓度，尽量去除红细胞。用手指轻轻弹击离心管底混匀使沉淀细胞松散均匀成糊状。在室温下融合：细胞融合剂、及含有饲喂层的培养基在准备脾脏细胞的时候需放入培养箱保温。用巴氏吸管吸取分装好的1mL细胞融合剂溶液(尽量接近细胞处离心管壁一圈旋加入)。60s-90s内轻轻混匀。计时完成后一次性加入30mL预热37℃基础培养基，使细胞融合剂稀释而失去促融作用，37℃静置5min。800r/min离心6分钟，弃去上清液。加入预热好的
20％ FBS 1×HAT培养基轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀(充分混匀，减少细胞团)，动作轻柔。此次试验按照制备10块96孔细胞培养板，每孔200μL，需要200mL 20％FBS 1×HAT培养基。
37℃、5％CO2孵箱培养，细胞融合后7d显微镜观察，计数96孔细胞培养板中出现明显细胞克隆的培养孔，计算融合率，融合率＝(融合的细胞数/总细胞数)×100％。
5、筛选分泌抗VWF/PF4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞
间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率。对于最终得到的10株效价格较高的杂交瘤细胞株培养上清进行间接ELISA方法检测，同时采用0.02M PBS进行稀释检测，检测结果如表2所示。
表2
通过比较杂交瘤细胞株培养上清进行的ELISA方法的检测数据，可以从中进一步挑选出稳定分泌抗vWF/PF4单克隆抗体且抗体效价较高细胞株，分别标记为H4E2等。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。
6、腹水的制备和纯化
将杂交瘤细胞株H4E2等以1×106/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到95％以上。
实施例2、单克隆抗体的特性鉴定
1、抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞H4E2等制备的腹水经纯化后获得抗VWF/PF4单克隆抗体，使用BCA法测定，其浓度为>1mg/mL。
2、抗体亚型鉴定：采用Thermofisher的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，H4E2等分泌抗体的亚型为IgG1型，轻链为κ链。
3、纯化抗体的效价鉴定：用50mM PBS将VWF/PF4复合物稀释至50μg/mL，按100μL/孔量加入聚苯乙烯96孔板中，4℃过夜包被。将包被液丢弃后，按200μL封闭液(含1％胎牛血清的PBS)/孔量加入聚苯乙烯96孔板中，37℃封闭2小时。用PBST洗板三次，鼓风干燥箱，37℃烘干4小时，铝塑封口袋封口，4℃保存待用。鼠免疫血清用含稀释液(含1％胎牛血清的PBS)进行102～106倍稀释，加入96孔板，100μL/孔，随后在37℃条件下孵育1h，后采用PBST洗板三次后，加入1:50000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG，100μL/孔，随后在37℃条件下孵育30min，采用PBST洗板三次。随后每孔加入TMB显色100μL/孔，于室温避光10min，后按照50μL/孔的量加入1M H2SO4终止反应。
测450nm吸收值，以PBS作为阴性对照，以测定值与对照值之比≥2.1为阳性判断值来确定效价。纯化抗体的效价＞500000。
4、单抗测序
取纯化后的杂交瘤细胞H4E2制备的抗VWF/PF4单克隆抗体，对轻链可变区与重链可变区的测序结果如表3所示。
表3抗体序列
具有相应可变区序列的抗体亲和力高，特异性好；因此相应的抗体可变区域可以用于重组抗体、单链抗体、双特异性抗体的开发，用于诊断用途或者治疗用途的相关产品开发。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (16)
1.一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO：4所示的轻链可变区CDR1、SEQ IDNO：5所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：6所示的轻链可变区CDR3。
2.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
3.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求2所述的核苷酸分子。
4.一种已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，其特征在于，所述已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体包括权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子，或权利要求3所述的载体。
5.一种抗vWF/PF4蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段的抗体衍生物，其特征在于，所述抗体衍生物包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段直接或间接的偶联到可检测标记物或药物形成的复合物。
6.一种检测vWF/PF4蛋白的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，或权利要求5所述的抗体衍生物。
7.一种检测肝素诱导性血小板减少症的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，或权利要求5所述的抗体衍生物。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的载体、或权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体。
9.一种生产权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求2所述的核苷酸分子或权利要求3所述的载体转化到宿主细胞；在适宜条件下培养已转化的宿主细胞；在宿主细胞培养液中分离纯化得到权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
10.一种体外抑制vWF/PF4蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子，或权利要求3所述的载体导入到生物体细胞中，通过表达权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段抑制vWF/PF4蛋白的活性。
11.一种非诊断和非治疗目的的检测待测样品中vWF/PF4蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或将待测样品与权利要求5所述的抗体衍生物接触；检测vWF/PF4蛋白与权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，或与权利要求5所述的抗体衍生物的复合物的形成。
12.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，或权利要求5所述的抗体衍生物在检测vWF/PF4蛋白中的应用，其特征在于，所述应用为非诊断目的与非治疗目的的。
13.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的载体，或权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测vWF/PF4蛋白的产品中的应用。
14.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的载体，或权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测肝素诱导性血小板减少症的产品中的应用。
15.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的载体，或权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备预防或治疗肝素诱导性血小板减少症的药物中的应用。
16.权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的核苷酸分子、权利要求3所述的载体，或权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备调节vWF/PF4蛋白活性或表达水平的药物中的应用。
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