CN114213542A - Cps-i抗体及其用途 - Google Patents

Cps-i抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114213542A
CN114213542A CN202111598231.3A CN202111598231A CN114213542A CN 114213542 A CN114213542 A CN 114213542A CN 202111598231 A CN202111598231 A CN 202111598231A CN 114213542 A CN114213542 A CN 114213542A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cps
antigen
seq
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111598231.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114213542B (zh
Inventor
曹静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University Third Affiliated Hospital Henan Maternity and Child Health Care Hospital
Original Assignee
Zhengzhou University Third Affiliated Hospital Henan Maternity and Child Health Care Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University Third Affiliated Hospital Henan Maternity and Child Health Care Hospital filed Critical Zhengzhou University Third Affiliated Hospital Henan Maternity and Child Health Care Hospital
Priority to CN202111598231.3A priority Critical patent/CN114213542B/zh
Publication of CN114213542A publication Critical patent/CN114213542A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114213542B publication Critical patent/CN114213542B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407Specifically defined cancers
    • G01N33/57438Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52Constant or Fc region; Isotype
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565Complementarity determining region [CDR]
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015Ligases (6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及CPS‑I抗体及其用途。本发明涉及抗CPS‑I抗体或其抗原结合片段,所述抗CPS‑I抗体至少含有一个选自以下序列的CDR:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。实验结果表明,本发明抗体能够应用于针对CPS‑I的免疫反应。

Description

CPS-I抗体及其用途
技术领域
本发明涉及免疫领域,具体涉及CPS-I抗体及其用途。
背景技术
氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ(carbamoyl phosphate synthetase I,CPS-I)存在于肝线粒体中,以游离的氨作为氨基供体合成氨甲酰磷酸,参与鸟氨酸循环最终合成代谢产物尿素。CPS-I在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达,这对于后期评价癌组织有着重要的意义。目前,在针对肝细胞及肿瘤的检测过程当中,包括小肠粘膜中局灶、胃和食道的肠化生中,HepPar1单克隆抗体均发挥了重要的检测作用。HepPar1抗原即氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS-I)的鸟氨酸循环酶,定位于线粒体。
此外,如果氨基甲酰磷酸合成酶1异常,也会导致体内对氨合成尿素的异常,所以会进一步引起患者肝性脑病发生的可能性。对于有基础性肝病,如慢性肝炎患者。如果进一步形成肝炎、肝硬化,或者是由于肝恶性肿瘤而进一步引起患者肝脏疾病终末期,都会形成患者氨基甲酰磷酸合成酶1的异常。
目前,CPS-I常用的体外免疫检测方法为免疫组织化学(IHC)法。特异性结合人CPS-I的单克隆抗体,其特异性和亲和力决定了检测方法的灵敏度和特异性。现临床中使用的CPS-I体外免疫检测抗体种类较少、且多为国外试剂公司长期占据,且灵敏度、特异性有待进一步提高,同时该试剂价格昂贵。目前常用的克隆号为OCH1E5,为国外1993年开发出的抗体。该抗体可以在肝细胞及相关癌症的检测过程中有着良好的效果,但是其免疫原为Anne E.Wennerberg通过福尔马林固定的失败的移植肝脏机械破碎后免疫,其方法开发具有高度随机性。开发出一种新的适应病理诊断的CPS1抗体,可解决现有CPS1抗体临床使用的选择性不强、价格昂贵等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CPS-I的单克隆抗体及其应用,实验结果表明,通过单克隆抗体制备工艺技术针对CPS-I成功得到高亲和力,高特异性以及多应用场景等特点的单克隆抗体。
本发明提供抗CPS-I抗体或其抗原结合片段,所述抗CPS-I抗体至少含有一个选自以下序列的CDR:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中,所述抗CPS-I抗体含有如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ IDNO:2所示的HCDR2和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3,和/或含有如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
在一些实施方案中,所述抗CPS-I抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,和/或VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方案中,所述抗CPS-I抗体的重链恒定区和/或轻链恒定区为鼠源的。
在一些实施方案中,本发明任一实施方案所述的抗CPS-I抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、鼠源抗体。
本发明还提供一种重组蛋白,具有:本文任意实施方案所述的抗体或其抗原结合片段,和任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在一些实施方案中,所述的标签序列选自下组:6×His标签、GGGS序列、FLAG标签。
在一些实施方案中,所述的重组蛋白包括双特异性抗体、嵌合抗体。
本发明还提供一种多核苷酸,所述多核苷酸:
(1)编码本文任意实施方案所述的抗体或其抗原结合片段,或重组蛋白,和/或
(2)是(1)的长度为5-40bp的引物片段。
本发明还提供一种载体,其含有本发明任一实施方案所述的多核苷酸。
在一些实施方案中,所述的载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒。
本发明还提供一种遗传工程化的宿主细胞,其含有本发明任一实施方案所述的多核苷酸或载体,或基因组中整合有本发明任一实施方案所述的多核苷酸。
本发明还提供一种偶联物,所述偶联物包括:本发明任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段,或重组蛋白;和与所述抗体或其抗原结合片段或重组蛋白相连的可检测标记物。
在一些实施方案中,所述可检测标记物选自下组:生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、生物素标记、放射性核素、抗体、配体、抗原、受体、纳米粒子或其组合。
在一些实施方案中,所述酶选自下组:辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶或其组合。
本发明还提供一种检测制品,所述检测制品包括:本发明任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、重组蛋白或偶联物;和任选的缓冲溶液或缓冲剂。
在一些实施方案中,所述检测制品用于检测CPS-I。
在一些实施方案中,所述检测制品包括:检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板、检测片。
在一些实施方案中,所述检测制品还包括或固定有与抗CPS-I抗体(一抗)结合的抗体(二抗),所述二抗用于捕获所述抗CPS-I抗体(一抗)。
在另一优选例中,所述检测片选自:多孔板,较佳地为96孔板、PVDF膜。
在另一优选例中,所述与抗CPS-I抗体(一抗)结合的抗体(二抗)选自:HRP标记的羊抗鼠IgG二抗。
本发明还提供本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、偶联物、或检测制品的用途,用于制备检测样品中CPS-I的检测制品或试剂盒。
在一些实施方案中,所述的检测制品包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
在一些实施方案中,所述样品是组织或细胞样品。
本发明还提供一种检测试剂盒,所述检测试剂盒包含本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、偶联物、或检测制品。
本发明还提供一种检测样品中CPS-I的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供待检测的样品;
(b)将该样品与本文任一实施方案所述的抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、偶联物、或检测制品接触,形成混合物;
(c)检测所述混合物中是否存在CPS-I与抗体或其抗原结合片段的复合物,
其中如果存在所述复合物,则表明所述样品中存在CPS-I;如果不存在所述复合物,则表明所述样品中不存在CPS-I。
本发明还提供一种CPS-I蛋白的具有免疫原性的片段,所述片段具有SEQ ID NO:11所示的序列。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
本发明优点:
1、本发明提供的CPS-I抗原,是以CPS-I体外免疫检测抗体为研发为目标,经动物免疫,具有良好的抗原性,用其制备的免疫原免疫动物能够产生具有高度特异性和灵敏性的CPS-I抗体。
2、本发明提供了CPS-I单克隆抗体基因序列,利于后期工程化表达,产量高,表达稳定性好。
3、本发明提供的鼠抗人CPS-I单克隆抗体,能够用于体外免疫检测离体组织肝细胞中的表达情况,且具有特异性强、灵敏度高、准确性好的特点,相比于价格昂贵的进口抗体,特异性较进口抗体更强,且价格便宜,能够减轻病患负担,降低诊断费用。
附图说明
图1显示使用本发明抗体检测肝脏组织CPS-I的免疫组化结果。
图2显示使用本发明抗体检测肝癌组织CPS-I的免疫组化结果。
图3显示使用本发明抗体检测胃组织CPS-I的免疫组化结果。
图4显示使用本发明抗体检测胆管癌组织CPS-I的免疫组化结果。
图5显示使用本发明抗体检测食管组织CPS-I的免疫组化结果。
图6显示使用本发明抗体检测不同组织的芯片检测结果。
图7显示使用本发明抗体检测其他不同组织的芯片检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,意外地的发现CPS-I蛋白的免疫原性片段,并由此获得一株识别并结合CPS-I的高亲和力单抗,该抗体能够应用于针对CPS-I的免疫反应以及检测CPS-I的含量。在此基础上,完成了本发明。
除非另有定义,本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术,这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释,诸如《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处仅例举优选的方法和材料。
氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ(carbamoyl phosphate synthetase I,CPS-I)在Uniprot数据库中登录号为:P31327。其表达定位包括在细胞核与线粒体当中。该蛋白的长度为1500aa,分子量为约165KDa,它是由2号染色体上一段大于120kb的基因编码,含有38个外显子和37个内含子。“CPS-I”也包括CPS-I氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于N-和O-连接糖基化。
发明人发现,CPS-I蛋白的219-405位氨基酸具有免疫原性。因此,本发明提供一种CPS-I蛋白的具有免疫原性的片段,所述片段具有SEQ ID NO:11所示的序列。CPS-I蛋白的片段长度短于CPS-I蛋白的全长。
基于上述片段,本发明提供特异性地结合CPS-I的抗体。本文中,术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体,其具有免疫球蛋白Fc区),具有多表位特异性的抗体组合物,多特异性抗体(例如,双特异性抗体),双抗体和单链分子,以及抗体片段,尤其是抗原结合片段,例如,Fab,F(ab’)2和Fv。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的N-端有可变结构域(VH),其后是由多个(例如3个或4个)恒定结构域构成的恒定区(CH)。每条轻链的N-端有可变区(VL),另一端有恒定区(CL)。VL与VH排列在一起,而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。成对的VH和VL一起形成抗原结合位点。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。根据重链恒定结构域(CH)氨基酸序列,免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。本文抗CPS-I抗体可以是鼠抗、兔抗、羊抗、人源化抗体或人抗体。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中,分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,由形成连接环的三个CDR相连。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。FR区的变化不影响抗体的抗原特异性。抗体的有多种可变区标注方案,包括:Chothia、Kabat、IMGT和Contact。其中,Kabat较为常用。
本文中,术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体,即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外,构成群体的各个抗体是相同的。针对单个抗原位点,单克隆抗体是高度特异性的。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比,每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外,单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成,未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如,将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种已知技术来生成,包括例如杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体展示技术、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成抗体的技术、单细胞测序法。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换地使用,是指基本上是其完整形式的抗体(与抗体片段相对比)。具体而言,完全抗体包括那些具有重链和轻链包括Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如,鼠、兔、羊或人的天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况中,完整抗体可具有一种或多种效应子功能。示例性重链恒定区如SEQ ID NO:9所示,示例性轻链恒定区如SEQ ID NO:10所示。
本发明还包括具有所述的抗CPS-I单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗CPS-I单克隆抗体可变区的单克隆抗体,以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地,本发明包括具有含超变区(互补决定区,CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物(例如可检测标记物)及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。本发明还包括与所述的抗CPS-I单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段。“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;scFv-Fc片段;由抗体片段形成的多特异性抗体;以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。
“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”,是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是,scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头,使得scFv形成期望的抗原结合结构。
优选地,所述抗体片段,尤其是抗原结合片段,由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们,所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力,对于CPS-I,优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100,在更优选方式中至少等于1/10。这种抗体片段将包含最少5个氨基酸,优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。
单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白),其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性。嵌合抗体包括人源化抗体,本领域知晓人源化抗体的制备方法。
本发明的抗CPS-I抗体也可以是微型抗体。微型抗体是包含与CH3结构域连接的scFv的最小化抗体样蛋白。本发明的抗CPS-I抗体还可以是结构域抗体。结构域抗体(dAb)是抗体的功能结合结构域,对应于人抗体dAB的重链(VH)或轻链(VL)的可变。
本发明中,抗CPS-I抗体的HCDR1可含有SEQ ID NO:1所示序列,和/或HCDR2可含有SEQ ID NO:2所示序列,和/或抗CPS-I抗体的HCDR3可含有SEQ ID NO:3所示序列,和/或抗CPS-I抗体的LCDR1可含有SEQ ID NO:4所示序列,和/或抗CPS-I抗体的HCDR2可含有SEQ IDNO:5所示序列,和/或抗CPS-I抗体的HCDR6可含有SEQ ID NO:3所示序列。优选地,本发明的抗CPS-I抗体含有如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2和如SEQ IDNO:3所示的HCDR3,和/或如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ ID NO:5所示的LCDR2和如SEQID NO:6所示的LCDR3。
本发明抗CPS-I抗体的VH的各FR各自独立地可为SEQ ID NO:7所示的VH的各FR或者可为本领域已知的任何其他抗体(特别是其他抗CPS-I抗体)的VH的各FR。同样地,所述抗CPS-I抗体的VL的各FR各自独立地可为SEQ ID NO:8所示的VL的各FR或者可为本领域已知的任何其他抗体(特别是其他抗CPS-I抗体)的VL的各FR。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用,术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。术语“互补决定区”与“CDR”可互换使用。在优选实施方案中,本发明的抗CPS-I抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,和/或VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在一个优选实施方案中,所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区,所述重链恒定区可以为鼠源。示例性重链恒定区如SEQ ID NO:9所示。在一个优选实施方案中,所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区,所述轻链恒定区可以为鼠源。示例性轻链恒定区如SEQ ID NO:10所示。
本发明还包括所述抗体或其抗原结合片段的衍生物和类似物。如本文所用,术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽(抗体或其抗原结合片段)与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在不实质性影响抗体活性的前提下,本领域技术人员可以对本发明的序列取代、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸,以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区的FR和/或CDR区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。取代优选是保守性取代;可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。在一些实施方案中,本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95%、96%、97%、98%或99%的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST,尤其是BLASTP或TBLASTN。
本发明还包括抗体的变异形式,包括但不限于:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还包括那些具有CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子,只要其CDR与本文所述的CDR具有90%以上(较佳地95%以上,最佳地98%以上)的同源性。
本发明的抗CPS-I抗体可以被修饰以影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗CPS-I抗体。可进行修饰以除去不期望的糖基化位点,或在寡糖链上不存在岩藻糖部分,或可进行半乳糖基化修饰。
本发明抗CPS-I抗体通常可具备约10-9至约10-13M的亲和力常数。
可采用本领域常规的方法制备本发明的抗CPS-I抗体,如本领域熟知的杂交瘤技术。本发明包含发明人在制备抗CPS-I抗体中所获得的杂交瘤细胞。优选的,本发明提供了高效价的针对CPS-I单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在获得生产本发明的CPS-I单克隆抗体的杂交瘤之后,本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞,例如鼠类的骨髓瘤细胞株SP2/0。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体。对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生,如,通过体外结合分析例如,酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。然后,可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆,并通过本领域常规方法生长。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括,例如,DMEM或RPMI-1640培养基。此外,杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离,这些纯化工艺本领域已知,例如凝胶电泳、透析或亲和层析。在本发明的一个优选的方案中,单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液,经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱纯化。
或者,本发明的抗CPS-I抗体可在除杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区),然后可通过重组并转化合适的宿主细胞的方法来制备本发明的单克隆抗体。转化可采用任何已知的方法进行,例如包括将多核苷酸包装在载体中转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法以及可用于表达的宿主哺乳动物细胞系为本领域所熟知。尤其优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有基本CPS-I结合特性的抗体来进行选择。
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本文提供编码重链可变区、轻链可变区、重链、轻链以及各CDR的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸分子包括单链和双链形式的DNA和RNA,以及相应的互补序列。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、化学合成的DNA、PCR扩增的DNA及其组合。本发明的核酸分子包括全长基因或cDNA分子以及其片段的组合。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明中,分离的多核苷酸指独立片段形式或作为较大核酸构建体组分的多核苷酸分子。多核苷酸的序列优选地以未受内部非翻译序列或内含子(典型地在真核基因中存在)中断的开放阅读框形式来提供和/或构建。非翻译DNA的序列可存在于开放阅读框的5'或3'处,其同样不影响编码区的操纵或表达。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。本发明中,“严谨条件”包括但不限于在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱的条件,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外,还可将重链的编码序列和表达标签融合在一起,形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
如本领域技术人员将了解,由于遗传密码的简并性,可制得极大量的核酸,它们全部编码本发明的抗CPS-I抗体或其抗原结合片段。因此,在已鉴定特定氨基酸序列的情况下,本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的表达系统和构建体(如载体)。这些构建体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
另外,本发明提供包含所述表达系统或构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用,也可与可检测标记物结合或偶联。用于检测目的的可检测标记物包括但不限于:生物素、荧光素、化学发光基团、化学荧光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、生物素标记、放射性核素、抗体、配体、抗原、受体,纳米粒子或其组合。示例性地,所述纳米粒子包括:纳米金、纳米银、量子点或其组合;所述酶包括:辣根过氧化物酶、酸性磷酸酶或其组合。
本发明的抗CPS-I抗体与CPS-I抗原的结合特异性好,亲和力高,可以用于检测胞内或胞外CPS-I,例如使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法来检测和/或定量CPS-I。适用于检测CPS-I的存在的方法实例包括ELISA、FACS、RIA等。
为了便于检测,可以用可检测的标记基团来标记抗CPS-I抗体。或者,可以以抗CPS-I抗体作为抗原,使用带有可检测标记(例如过氧化物酶)的抗体(常称为二抗)与抗CPS-I抗体发生免疫反应,通过检测二抗来检测抗CPS-I抗体从而最终检测CPS-I。二抗可以是单抗或多抗,只要其能识别作为抗原的抗CPS-I抗体(尤其是恒定区)即可。二抗可以通过用抗CPS-I抗体免疫动物来制备。或者,可以使用市售的针对不同抗体(例如鼠抗、兔抗、羊抗、人抗)的恒定区的二抗或二抗混合物。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。
本发明的实施方案包括进行上述CPS-I检测的检测制品。该或检测制品还任选包含免疫组织学检测所需的其他试剂,包括但不限于选自以下的一种或多种试剂:二抗、缓冲液等。对于过氧化物酶标记的二抗,所述或检测制品还包含过氧化氢封闭剂、DAB底物、DAB缓冲液、染色液(例如苏木素)。
本发明的抗CPS-I抗体或检测制品可以检测任何样品(例如组织或细胞)中的CPS-I。所述组织或细胞包括源自以下器官的组织或细胞:肝脏、肝癌、胃、胆管癌、食管、扁桃体、阑尾、胎盘、脾脏、结肠、胰腺、肺、肾脏、甲状腺、宫颈、气管、胸腺、乳腺、输尿管、腮腺。所述组织或细胞还包括源自以下任意病灶的组织或细胞:阑尾炎、乳腺癌、生殖细胞肿瘤、卵巢癌、卵巢囊肿、宫颈癌、气管癌、恶性黑色素瘤、嗜铬细胞瘤、胸腺瘤、尿路上皮癌、胶质母细胞瘤、滑膜肉瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、乳腺癌、乳腺纤维腺瘤、孤立性纤维瘤、乳腺浸润导管癌、输卵管、输卵管伞及大网膜高级别腺癌、输尿管小细胞肿瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、精原细胞癌、神经鞘瘤、梭型细胞肿瘤、星形细胞瘤、腮腺瘤。
CPS-I在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。此外,如果CPS-I异常,也会导致体内对氨合成尿素的异常,会进一步引起患者肝性脑病。对于有基础性肝病的患者,如果进一步形成肝炎、肝硬化,或者是由于肝恶性肿瘤而进一步引起患者肝脏疾病终末期,都会形成患者CPS-I的异常。
因此,本发明的抗CPS-I抗体可用于诊断测定,例如使用前述试剂盒检测和/或定量在组织或细胞中表达的CPS-I,从而检测、诊断或监控与CPS-I相关的疾病和/或病况。与CPS-I相关的疾病和/或病况包括但不限于:肝细胞癌、肝性脑病、肝炎、肝硬化。抗CPS-I抗体可用在进一步研究CPS-I在疾病中的作用的研究中。适用于检测CPS-I的存在的方法实例包括ELISA、FACS、RIA等。
本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合CPS-I的测试分子的存在的方法。一种所述方法的实例涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量CPS-I的溶液中的游离抗体的量。游离抗体(即,未结合CPS-I的抗体)的量增加将表示测试分子能与该抗体竞争结合CPS-I。在一个实施方案中,用标记基团标记抗体。或者,标记测试分子并在存在或不存在抗体的情形下监控游离测试分子的量。
本文中,术语“患者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用,包括任何生物体,优选动物,更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等),且最优选的是人。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解,这些实施例仅仅是阐述性的,并非意图限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的方法和材料,除非另有说明,否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
实施例1,制备CPS-I免疫原
本实施例利用真核表达的方式构建免疫原。
选择表达载体:pcDNA3.1
表达宿主:哺乳动物表达系统293T细胞
序列为:219-405aa
氨基酸序列:
KVVAVDCGIKNNVIRLLVKRGAEVHLVPWNHDFTKMEYDGILIAGGPGNPALAEPLIQNVRKILESDRKEPLFGISTGNLITGLAAGAKTYKMSMANRGQNQPVLNITNKQAFITAQNHGYALDNTLPAGWKPLFVNVNDQTNEGIMHESKPFFAVQFHPEVTPGPIDTEYLFDSFFSLIKKGKAT(SEQ ID NO:11)
对应基因序列为:
ATGAAAGTGGTAGCTGTAGACTGTGGGATTAAAAACAATGTAATCCGCCTGCTAGTAAAGCGAGGAGCTGAAGTGCACTTAGTTCCCTGGAACCATGATTTCACCAAGATGGAGTATGATGGGATTTTGATCGCGGGAGGACCGGGGAACCCAGCTCTTGCAGAACCACTAATTCAGAATGTCAGAAAGATTTTGGAGAGTGATCGCAAGGAGCCATTGTTTGGAATCAGTACAGGAAACTTAATAACAGGATTGGCTGCTGGTGCCAAAACCTACAAGATGTCCATGGCCAACAGAGGGCAGAATCAGCCTGTTTTGAATATCACAAACAAACAGGCTTTCATTACTGCTCAGAATCATGGCTATGCCTTGGACAACACCCTCCCTGCTGGCTGGAAACCACTTTTTGTGAATGTCAACGATCAAACAAATGAGGGGATTATGCATGAGAGCAAACCCTTCTTCGCTGTGCAGTTCCACCCAGAGGTCACCCCGGGGCCAATAGACACTGAGTACCTGTTTGATTCCTTTTTCTCACTGATAAAGAAAGGAAAAGCTACCTAG(SEQ ID NO:12)
具体方法为:
1)首先获取目的基因,通过公司进行合成载体连接的上下游引物,酶切位点选择分别为XhoI与HindIII,上下游引物分别为:
F:CTATAGGGAGACCC-AAGCTT-ATGAAAGTGGTAGCTGTAG
R:GGCTCTAGATGCATG-CTCGAG-CTAGGTAGCTTTTCCTTTC
2)将目的基因遵循KOD酶说明书要求进行扩增,同时分别用XhoI与HindIII酶切割pcDNA3.1载体,利用SDS-PAGE电泳方式进行切胶回收,回收操作按照切胶回收试剂盒说明书操作进行。
3)将目的基因与双酶切回收的质粒,利用无缝克隆试剂盒进行无缝克隆,随后转入大肠杆菌表达系统中(DH5α)将单克隆菌扩大培养后提质粒双酶切鉴定,将阳性菌的构建质粒进行测序。
4)复苏293T细胞,利用DMEM+20%FBS进行培养,第二天换液,调整细胞状态至生长达到80%左右,利用Trypsin酶进行消解,观察细胞完全从壁上脱落为止,计数后离心,添加完全培养基后调整密度至1×10 5个/mL铺入6孔细胞培养板中至于二氧化碳培养箱中进行培养。
瞬时转染前,待细胞融合度达到70%,进行转染。分别取3支1.5mL无菌离心管,每支加入100μL的DMEM培养基,再分别加入转染试剂8、6、4μL,轻轻混匀,静置计时5min。再依次加入pcDNA-3.1-siglec-10质粒2μg,轻轻混匀后静置15min。将细胞上清进行换液,加入不含抗生素的细胞培养液2mL,随即加入上述复合物,置于二氧化碳培养箱中培养48h。通过WB进行鉴定,确定最佳的转染试剂比例。
5)将293T细胞按照1×105个/mL密度均匀铺在T75培养瓶中2瓶,按照上述4中的最佳转染比例进行转染收获,通过镍柱进行目的蛋白的纯化与富集。
实施例2,筛选抗体
1、动物免疫:将实施例1制备获得的CPS-I抗原与水溶性佐剂混合,采用肌肉注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠,免疫剂量为100μg/只,免疫21天后进行第二次免疫,免疫剂量同第一次。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价。
2、效价测定:
1)首先通过PB缓冲液包被CPS-I免疫原至ELISA检测板中,剂量为200ng/孔。置于2~8℃条件过夜。
2)弃包被液,向每孔中加入150μL封闭液,至于37℃条件下封闭2h。
3)弃封闭液,加入梯度稀释好的尾血100μL,尾血稀释比例分别为:1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000,每个稀释比例下分别重复3孔;将加过稀释尾血的96孔板置于37℃条件下孵育1h。
4)洗板5次,加入1:5000稀释的羊抗鼠HRP标记二抗,每孔100μL,置于37℃条件下孵育1h。
5)洗版5次,加入显色液A、B各50μL。置于37℃条件下孵育10min。
6)加入终止液50μL,至于酶标板下读数。
检测结果如下表所示:
稀释度 小鼠1 小鼠1 小鼠1 小鼠2 小鼠2 小鼠2 小鼠3 小鼠3 小鼠3
1/2000 2.234 2.198 2.205 2.105 2.111 2.126 2.291 2.287 2.198
1/4000 2.063 2.033 1.985 1.989 2.058 1.964 2.044 2.122 2.164
1/8000 1.844 1.838 1.826 1.745 1.733 1.748 1.884 1.894 1.858
1/16000 1.451 1.447 1.427 1.339 1.362 1.355 1.663 1.653 1.627
1/32000 1.106 1.111 1.096 0.987 0.963 0.959 1.334 1.367 1.352
1/64000 0.773 0.753 0.761 0.722 0.738 0.734 0.944 0.962 0.917
1/128000 0.329 0.335 0.322 0.265 0.276 0.249 0.444 0.472 0.451
阴性对照 0.033 0.032 0.033 0.033 0.032 0.032 0.032 0.033 0.032
由上表可知,3只小鼠效价水平达均到了106,同时进行冲击免疫与细胞融合操作。
3、细胞融合:骨髓瘤细胞为SP2/0,调整细胞生长状态,使细胞进行融合时正处于对数生长期;引颈处死小鼠,取经过冲击免疫的小鼠脾脏,制成淋巴细胞单细胞悬液;小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞按照1:8混合,滴加37℃的50%PEG1500约1mL,加入不完全培养基及其余终止液,离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀,定容到50mL,滴加到96孔细胞培养板中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中进行培养。
4、筛选和克隆:融合7-10天内挑选细胞克隆,使用CPS-I抗原进行间接ELISA检测,步骤如下:
1)以CPS-I抗原为包被用抗原,PB为包被液,按照100ng/孔浓度至于2~8℃条件下进行过夜孵育,每孔上清体积为100μL;
2)第二日弃去上清,每孔加入150μL封闭液,至于37℃培养箱中孵育2h;
3)弃去上清,每孔加入100μL细胞融合上清,至于37℃条件下孵育30min,随后利用洗板机进行洗板,每次5遍;
4)加入按照1:2000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗,每孔100μL,至于37℃条件下孵育30min,随后利用洗板机进行洗板,每次5遍;
5)依次加入显色液A、显色液B各50μL,至于37℃条件下孵育3~5min。显色后加入50μL终止液进行终止;
6)酶标仪读数。
对阳性孔细胞进行有限稀释,每次有限稀释后5-6天测定ELISA值,挑取OD450阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释,直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆确定细胞株。
通过3次亚克隆筛选,最终挑选出分泌抗体稳定、且细胞株状态较好的细胞株12C15,并将获得的细胞株进行重轻链调取。测序获得轻重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:7和8)。
实施例3,抗原检测
将12C15抗体用于组成检测人CPS-I组织表达情况的检测试剂盒,包括过氧化氢封闭剂、一抗(12C15)、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠与羊抗兔二抗(Dako)、DAB底物、DAB缓冲液、苏木素染色液。
具体操作:
1)将石蜡组织进行切片,切片厚度为3μm,置于65℃条件下进行烤片2h。
2)按照二甲苯15min、二甲苯15min、无水乙醇5min、无水乙醇5min、95%乙醇5min、80%乙醇5min、70%乙醇5min、50%乙醇5min进行梯度脱蜡。
3)将脱蜡后的切片置于纯水中浸泡5min。
4)将切片置于pH9.0的ETDA修复液中,高压条件下修复3min。
5)自然冷却后,置于PBST洗液中浸泡5min。
6)加入过氧化氢封闭剂,室温条件下封闭5min。
7)分别加入一抗,以对照抗体OCH1E5为阳性对照,37℃条件下1h。
8)PBST洗液洗涤2次,每次浸泡5min。
9)加入二抗,37℃条件下30min。
10)PBST洗液洗涤2次,每次浸泡5min。
11)加入DAB显色液,室温孵育10min。
12)纯水洗涤2次,每次浸泡5min。
13)加入苏木素复染5min。纯水冲洗干净。
14)按照50%乙醇2min、70%乙醇2min、80%乙醇2min、95%乙醇2min、无水乙醇I、II各2min、二甲苯I、II各2min过片后加中性树胶封片。
15)阅片拍照。
实验结果
对比免疫组化包括芯片与组织单品,统计与拍照如下:
特异性:
OCH1E5 12C15
阳性例数 33 33
阴性例数 46 46
结果:图1-图5分别显示肝脏组织、肝癌组织、胃组织、胆管癌组织、食管组织的结果。图6和图7分别显示不同组织的芯片检测结果。
图6各点所对应的样品来源如下表所示。
Figure BDA0003432115260000181
图7各点所对应的样品来源如下表所示。
Figure BDA0003432115260000182
可以看出,12C15在染色中的质染与核染较对照抗体OCH1E5清晰,且核染较对照强,清晰。周围对照细胞无着色。12C15较对照抗体,在多组织评价中,有更好的特异性和较好的亲和力。
序列表
<110> 郑州大学第三附属医院(河南省妇幼保健院)
<120> CPS-I抗体及其用途
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser His
1 5
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Ala Arg Arg Gly Pro Leu Ile His Gly Ser Tyr Tyr Leu Asp Phe
1 5 10 15
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Arg Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Trp Val Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Lys Gln Gly Ser His Asp Val Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Gln Val His Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Thr Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Asp Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser His Glu Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Ile Lys Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Pro Leu Ile His Gly Ser Tyr Tyr Leu Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 102
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Ser Met Ser Cys Arg Ser Ser
1 5 10 15
Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Arg Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln
20 25 30
Xaa Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Val Ser Thr
35 40 45
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr
50 55 60
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Arg Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Lys Gln Gly Ser His Asp Val Pro Thr Phe Gly Ala Gly
85 90 95
Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100
<210> 9
<211> 324
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 12
<211> 186
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Lys Val Val Ala Val Asp Cys Gly Ile Lys Asn Asn Val Ile Arg Leu
1 5 10 15
Leu Val Lys Arg Gly Ala Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp
20 25 30
Phe Thr Lys Met Glu Tyr Asp Gly Ile Leu Ile Ala Gly Gly Pro Gly
35 40 45
Asn Pro Ala Leu Ala Glu Pro Leu Ile Gln Asn Val Arg Lys Ile Leu
50 55 60
Glu Ser Asp Arg Lys Glu Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu
65 70 75 80
Ile Thr Gly Leu Ala Ala Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala
85 90 95
Asn Arg Gly Gln Asn Gln Pro Val Leu Asn Ile Thr Asn Lys Gln Ala
100 105 110
Phe Ile Thr Ala Gln Asn His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro
115 120 125
Ala Gly Trp Lys Pro Leu Phe Val Asn Val Asn Asp Gln Thr Asn Glu
130 135 140
Gly Ile Met His Glu Ser Lys Pro Phe Phe Ala Val Gln Phe His Pro
145 150 155 160
Glu Val Thr Pro Gly Pro Ile Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe
165 170 175
Phe Ser Leu Ile Lys Lys Gly Lys Ala Thr
180 185
<210> 12
<211> 564
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atgaaagtgg tagctgtaga ctgtgggatt aaaaacaatg taatccgcct gctagtaaag 60
cgaggagctg aagtgcactt agttccctgg aaccatgatt tcaccaagat ggagtatgat 120
gggattttga tcgcgggagg accggggaac ccagctcttg cagaaccact aattcagaat 180
gtcagaaaga ttttggagag tgatcgcaag gagccattgt ttggaatcag tacaggaaac 240
ttaataacag gattggctgc tggtgccaaa acctacaaga tgtccatggc caacagaggg 300
cagaatcagc ctgttttgaa tatcacaaac aaacaggctt tcattactgc tcagaatcat 360
ggctatgcct tggacaacac cctccctgct ggctggaaac cactttttgt gaatgtcaac 420
gatcaaacaa atgaggggat tatgcatgag agcaaaccct tcttcgctgt gcagttccac 480
ccagaggtca ccccggggcc aatagacact gagtacctgt ttgattcctt tttctcactg 540
ataaagaaag gaaaagctac ctag 564

Claims (11)

1.一种CPS-I抗体或其抗原结合片段,所述抗CPS-I抗体至少含有一个选自以下序列的CDR:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,
优选地,所述抗CPS-I抗体含有如SEQ ID NO:1所示的HCDR1、如SEQ ID NO:2所示的HCDR2和如SEQ ID NO:3所示的HCDR3,和/或含有如SEQ ID NO:4所示的LCDR1、如SEQ IDNO:5所示的LCDR2和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片,其特征在于,所述抗体的VH具有如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列,和/或VL具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列,
优选地,
所述抗体的轻链还具有轻链恒定区,和/或
所述抗体的重链还具有重链恒定区,和/或
所述的抗体为鼠源抗体,和/或
所述的抗体为单克隆抗体。
3.一种重组蛋白,具有:权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段,和任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
4.一种多核苷酸,所述多核苷酸:
(1)编码权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求3所述的重组蛋白,和/或
(2)是(1)的长度为5-40bp的引物片段。
5.一种载体,其含有权利要求4所述的多核苷酸,
优选地,所述的载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒。
6.一种宿主细胞,其含有权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体,或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。
7.一种偶联物,所述偶联物包括:权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段,或权利要求3所述的重组蛋白;和与所述抗体或其抗原结合片段或重组蛋白相连的可检测标记物,
优选地,所述可检测标记物选自下组:生物素、荧光素、化学发光基团、荧光蛋白、酶、胶体金、彩色磁珠、乳胶颗粒、生物素标记、放射性核素、抗体、配体、抗原、受体、纳米粒子或其组合。
8.一种检测制品,所述检测制品包括:权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的重组蛋白或权利要求7所述的偶联物;和任选的缓冲溶液或缓冲剂,
优选地,
所述检测制品包括:检测试剂、侧流片、芯片、测试条、检测板如多孔板或PVDF膜,和/或
所述检测制品还包括或固定有二抗,所述二抗是与抗CPS-I抗体结合的抗体,所述二抗用于捕获所述抗CPS-I抗体,和/或
所述二抗是HRP标记的羊抗鼠IgG二抗。
9.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的重组蛋白、权利要求7所述的偶联物、或权利要求8所述的检测制品的用途,用于制备检测样品中CPS-I的检测制品或试剂盒。
10.一种检测试剂盒,所述检测试剂盒包含权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的重组蛋白、权利要求7所述的偶联物、或权利要求8所述的检测制品。
11.一种CPS-I蛋白的具有免疫原性的片段,所述片段具有SEQ ID NO:11所示的序列。
CN202111598231.3A 2021-12-24 2021-12-24 Cps-i抗体及其用途 Active CN114213542B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111598231.3A CN114213542B (zh) 2021-12-24 2021-12-24 Cps-i抗体及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111598231.3A CN114213542B (zh) 2021-12-24 2021-12-24 Cps-i抗体及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114213542A true CN114213542A (zh) 2022-03-22
CN114213542B CN114213542B (zh) 2023-06-23

Family

ID=80705926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111598231.3A Active CN114213542B (zh) 2021-12-24 2021-12-24 Cps-i抗体及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114213542B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101407545A (zh) * 2008-11-27 2009-04-15 重庆医科大学 131i标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1e2及其应用
WO2018183928A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101407545A (zh) * 2008-11-27 2009-04-15 重庆医科大学 131i标记的抗肺癌人源化单克隆抗体1e2及其应用
WO2018183928A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMBL: "Carbamoylphosphate synthetase I", EMBL, pages 1 - 4 *
MASAHITO OGURA等: "Overexpression of SIRT5 confirms its involvement in deacetylation and activation of carbamoyl phosphate synthetase 1", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 393, pages 73 - 78, XP026925625, DOI: 10.1016/j.bbrc.2010.01.081 *
鞠艳芳等: "氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用", 细胞与分子免疫学杂志, vol. 24, no. 05, pages 479 - 481 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114213542B (zh) 2023-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9823251B2 (en) Anti-Uroplakin II antibodies systems and methods
KR20130108069A (ko) Her2 항원에 대한 모노클로날 항체 및 그를 위한 용도
EP4170021A1 (en) Mouse anti-mcr-1 protein hybridoma cell strain, monoclonal antibody, and application
CN116731181B (zh) 抗人cd10蛋白的兔单克隆抗体及其应用
CN116355091A (zh) 一种抗人神经丝轻链的单克隆抗体21d2-30d3及其产品和应用
CN113493508A (zh) 一种用于检测新冠病毒n蛋白的双抗体夹心elisa试剂盒
JP6749901B2 (ja) モノクローナル抗gpc−1抗体およびその使用
CN110950959B (zh) 靶向EpCAM的抗体及其制备和应用
CN116535510B (zh) 一种抗人pla2r的抗体、试剂盒及其应用
CN112898430B (zh) Ca242的结合蛋白及其应用、检测方法和试剂盒
CN111848750A (zh) 一种快速富集和检测2019-nCoV的方法及试剂盒
CN116396387A (zh) Pd-l1单克隆抗体、重链、轻链可变区、单克隆细胞株及运用和试剂盒
CN114213542B (zh) Cps-i抗体及其用途
CN111434686B (zh) 一种抗人pbx1单克隆抗体,其制备方法及其在复发性流产临床诊断中的用途
CN110540591A (zh) 一种抗糖蛋白A33(Glycoprotein A33)单克隆抗体及其免疫检测应用
CN110579610A (zh) 用于检测t细胞活化的v域免疫抑制因子的试剂盒
CN112724253B (zh) 抗人穹窿体蛋白的抗体及其应用
CN116987186B (zh) 针对人erg蛋白的兔单克隆抗体及其应用
CN117487008B (zh) 抗人Lin28A蛋白的兔单克隆抗体及其应用
CN117467003B (zh) 抗人msh6蛋白的兔单克隆抗体及其应用
CN114990074B (zh) 一种杂交瘤细胞株、抗人延胡索酸水合酶单克隆抗体及其应用
CN107286240B (zh) 抗ctrp4单克隆抗体及其应用
CN117467004A (zh) 抗人钙网膜蛋白的兔单克隆抗体及其应用
CN106831984A (zh) 一种抗bex2单克隆抗体的制备和应用
CN104830804B (zh) 一种翻译控制肿瘤蛋白的单克隆抗体杂交瘤及其单克隆抗体与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant