CN106831984A - 一种抗bex2单克隆抗体的制备和应用 - Google Patents

一种抗bex2单克隆抗体的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学生物工程技术领域，具体是一种抗BEX2单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC No：C201709的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明还提供分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在检测BEX2中的应用。本发明的抗BEX2单克隆抗体是一种免疫球蛋白，能够特异性识别BEX2蛋白，对于肿瘤的诊断和治疗具有十分重大的意义。

Description

一种抗BEX2单克隆抗体的制备和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，是一种抗BEX2单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在用于检测BEX2中的应用。
背景技术
越来越多的研究表明，肿瘤细胞与早期胚胎细胞、多能干细胞具有相似性，多种在胚胎期高表达的信号分子、转录因子在肿瘤细胞中的表达也异常增加。其中，一些与胚胎发育和肿瘤相关的癌胚分子已经被广泛地应用于肿瘤的早期诊断和预后分析。例如，癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)是胃癌早期诊断的重要标志分子，甲胎蛋白(AlphaFetoprotein，AFP)被用于肝癌的诊断和术后复发的评估。此外，以SALL4等癌胚基因为治疗靶点的抗肿瘤药物也在研发中。因此，癌胚基因对肿瘤的研究、诊断和治疗具有重要意义。
BEX2(Brain-expressed X-linked 2，BEX2)是定位于X染色体、在脑中高表达，并与胚胎发育相关的基因。通过对人成肝和胎肝的表达谱芯片分析，研究人员发现，BEX2分子在肝脏胚胎期表达显著高于成年期。同时，实时定量PCR检测结果显示BEX2在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织。有报道称，BEX2是重要的雷帕霉素靶蛋白(Target of Rapamycin，mTOP)通路的下游效应因子，参与乳腺癌细胞、神经胶质瘤细胞的增殖和转移。上述研究表明，BEX2是一个癌胚分子，与肿瘤的发生发展密切相关。因此，BEX2是一个很有前景的肿瘤诊断和治疗的靶分子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗BEX2单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体的应用。
本发明单克隆抗体的获得可采用本技术领域常规的方法，即通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞并产生腹水抗体，取出腹水经纯化得到。
本发明的第一方面，提供一种抗BEX2单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCC No：C201709的杂交瘤细胞株分泌产生。所述的抗BEX2单克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性识别BEX2蛋白。
本发明的第二方面，提供一种杂交瘤细胞株，命名为mBEX，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2017年1月6日，保藏编号CCTCC No：C201709。
本发明的第三方面，提供一种上述抗BEX2单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
a)针对BEX2的编码框氨基酸全序列(GENEBANK ID：568815575)，序列如SEQ IDNO：1所示，进行全基因合成，并将序列连接到表达载体中；鉴定阳性克隆，提取及表达菌转化；大量诱导表达生产；Ni磁珠亲和纯化，经纯化，得到蛋白抗原用于免疫；
b)将上述蛋白抗原作为免疫原免疫小鼠；
c)获取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；
d)经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为生产抗BEX2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
e)在免疫小鼠体内接种杂交瘤细胞获得腹水抗体，将腹水进行纯化，得到鼠来源的抗BEX2的单克隆抗体。
较优的，所述的步骤a中的表达载体为PET28a。
较优的，所述的步骤a中的表达菌为大肠杆菌。
较优的，所述的步骤a中通过添加终浓度为0.1-1mmol/L的IPTG诱导工程菌产生BEX2蛋白。
较优的，所述的步骤b中将蛋白抗原同免疫佐剂混合。其中，取25ul的BEX2蛋白溶液，加入25ul的生理盐水，成为50ul的抗原稀释液，与50ul的免疫佐剂迅速混合，免疫佐剂为KX0210041，即100ul的抗原混合液(此为每只BABL/C小鼠的免疫用量)。
较优的，所述的步骤c中免疫小鼠为鼠龄8～12周的雌性BALB/c健康小鼠；取免疫小鼠的脾脏细胞同小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞进行融合。
较优的，所述的步骤d中采用倍比稀释技术制备单克隆抗体细胞株，筛选出高特异性、高亲和力的单克隆抗体细胞株，作为抗BEX2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
较优的，所述的步骤e中扩大培养杂交瘤细胞至106个，接种免疫小鼠腹腔，生产腹水抗体，将腹水纯化获得抗BEX2的单克隆抗体。
本发明的第四方面，提供上述抗BEX2单克隆抗体在制备用于检测BEX2的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明的第五方面，提供上述杂交瘤细胞株在在制备用于检测BEX2的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
较优的，上述的免疫检测试剂或试剂盒为Western Blot或免疫组化检测试剂或试剂盒。
较优的，上述的免疫检测试剂或试剂盒是检测不同器官组织、不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中BEX2的试剂或试剂盒。
本发明优点在于：
本发明提供一种抗BEX2单克隆抗体，该单克隆抗体是一种免疫球蛋白，能够特异性识别BEX2蛋白，可以用于制备免疫检测试剂盒或试剂盒为Western Blot或免疫组化检测试剂或试剂盒，并应用于检测不同器官组织、不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中BEX2表达的检测，对于肿瘤的早期诊断和治疗具有十分重大的意义。
抗体制备过程中需要高纯度、具有空间结构的抗原以免疫小鼠，而高纯度的BEX2蛋白购买较为困难，本发明通过构建工程菌、诱导表达、磁珠纯化的方法获得了纯度较高的BEX2蛋白，为制备高选择性和亲和力的BEX2抗体奠定了基础。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)
地址：中国湖北省武汉市武汉大学
保藏日期：2017年1月6日
保藏编号：CCTCC No：C201709
分类命名：杂交瘤细胞株mBEX
附图说明
图1是抗体效价测定结果图，其中1K、3K、9K、27K、81K和162K分别为抗体的稀释倍数。
图2是Western Blot结果图，其中左边的条带为Marker，对应的分子量已经标出，右边的条带为BEX2抗体和蛋白结合条带。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1.抗原蛋白的制备
BEX2蛋白氨基酸(GENEBANK ID：568815575)，根据其氨基酸序列信息委托苏州省心生物技术有限公司设计并合成了如SEQ ID NO:1所述蛋白的基因。构建表达载体；诱导表达；Ni磁珠亲和纯化；获得蛋白抗原。
具体方法如下：
1)合成BEX2的mRNA序列，并克隆入PET28a载体中。将载体转化入Bl21表达菌中。
2)将表达菌添加到LB培养基中，并在37度下扩增，然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导表达。
3)通过离心，收集细菌沉淀，用5mm变幅杆，35％功率，3.5s工作，7s休息，循环50min，超声破菌。
4)Ni磁珠纯化，将磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取5mL磁珠悬液于15mL离心管中，进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管，将表达菌裂解液加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15s。将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合20～30min。将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，加入10mLWashing Buffer到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，弃去上清。重复该操作2-3次，加入2～10mL Elution Buffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品。
实施例2.抗BEX2的单克隆抗体的制备和纯化
1.抗原混合液的制备
取25ul的BEX2蛋白溶液，加入25ul的生理盐水，成为50ul的抗原稀释液，与50ul的佐剂迅速混合，即100ul的抗原混合液(此为每只BABL/C小鼠的免疫用量)。
2.免疫动物
本发明所用免疫动物为BALB/c小鼠，免疫佐剂为KX0210041，购自北京博奥龙免疫技术有限公司。
1)腿部肌肉注射免疫BABL/C小鼠(100ul/只)。
2)每隔一个月进行重复免疫，免疫三次。
3.单克隆抗体的制备和纯化
将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，将3只小鼠的脾脏混合进行融合。
免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。
具体方法如下：
1)将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。
2)ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100％，即认为此为单克隆。即通常认为的建株成功的细胞株。
3)将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1-2×106/管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。
4)细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。
5)腹水完成后采用Protein G柱纯化腹水。
实施例3.抗BEX2的单克隆抗体的鉴定
1.腹水效价鉴定
取2只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后取杂交瘤细胞(效价较高同时细胞状态好)重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5ml/只量注射石蜡小鼠，注射细胞约7至14天后收集腹水。
采用间接ELISA的方法测定腹水效价，具体方法如下：
1)包被：2ug/ml抗原浓度，100ul/孔，4℃过夜，洗液洗涤3次。
2)封闭：加150ul/孔封闭液，37℃2小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。
3)加待测样品：第一个孔1:1000稀释，往下以1:3的梯度倍比稀释，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
4)加二抗：取辣根酶标记的羊抗鼠IgG(IgG特异二抗)按1：5000倍稀释后，100ul/孔，37℃孵育20至30min,洗涤4次，拍干。
5)显色：稀释20×TMB至1×TMB，按100ul/孔加入，37℃显色15-30min。
6)终止：加入终止液(2M H2SO4)50ul/孔
7)读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
阳性判定标准：样品检测孔OD450与阴性对照孔OD450之比(P/N)≥2.1，结果表明抗体效价为162K(图1)。
2.亚型鉴定
采用购自北京博奥龙免疫技术有限公司的鼠源单抗亚型鉴定用ELISA试剂盒，对本发明所得到的BEX2抗体亚型进行鉴定，其亚型鉴定结果表明，单克隆抗体为IgG2b亚型，结果见表1。
表1抗体亚型鉴定结果
样品 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA
阳性对照 2.64 2.22 2.63 2.53 2.66 2.69
阴性对照 0.05 0.05 0.04 0.05 0.04 0.05
BEX2抗体稀释液 0.09 0.12 1.8 0.09 0.12 0.08
实施例4.抗BEX2的单克隆抗体的Western Blot检测应用
变性的BEX2蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳；电泳结束后，进行湿法转膜。封闭液室温封闭2h；用单克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜；PBST洗液洗膜3次，PBS洗液洗膜1次；加二抗1:5000稀释后室温孵育45min，孵育过程中轻微振荡；用PBST洗液洗膜3次，PBS洗液洗膜1次，用Odyssey红外成像系统扫描。结果见图2。结果表明该单克隆抗体能特异性的识别BEX2蛋白。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中的知识说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种抗BEX2单克隆抗体的制备和应用
<130> /
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 160
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Gln Lys Met Val Val Cys Gly Ala Lys Cys Cys Gly Asp Ala Pro
1 5 10 15
His Val Glu Asn Arg Glu Glu Glu Thr Ala Arg Ile Gly Pro Gly Val
20 25 30
Met Glu Ser Lys Glu Glu Arg Ala Leu Asn Asn Leu Ile Val Glu Asn
35 40 45
Val Asn Gln Glu Asn Asp Glu Lys Asp Glu Lys Glu Gln Val Ala Asn
50 55 60
Lys Gly Glu Pro Leu Ala Leu Pro Leu Asn Val Ser Glu Tyr Cys Val
65 70 75 80
Pro Arg Gly Asn Arg Arg Arg Phe Arg Val Arg Gln Pro Ile Leu Gln
85 90 95
Tyr Arg Trp Asp Ile Met His Arg Leu Gly Glu Pro Gln Ala Arg Met
100 105 110
Arg Glu Glu Asn Met Glu Arg Ile Gly Glu Glu Val Arg Gln Leu Met
115 120 125
Glu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Leu Ser His Ser Leu Arg Ala Val Ser
130 135 140
Thr Asp Pro Pro His His Asp His His Asp Glu Phe Cys Leu Met Pro
145 150 155 160

Claims (8)

1.一种抗BEX2单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC No：C201709的杂交瘤细胞株分泌产生。
2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号CCTCC No：C201709。
3.一种如权利要求1所述的抗BEX2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)针对BEX2的编码框氨基酸全序列，序列如SEQ ID NO：1所示，进行全基因合成，并将序列连接到表达载体中；鉴定阳性克隆，提取及表达菌转化；大量诱导表达生产；Ni磁珠亲和纯化，经纯化，得到蛋白抗原用于免疫；
b)将上述蛋白抗原作为免疫原免疫小鼠；
c)获取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；
d)经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为生产抗BEX2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
e)在免疫小鼠体内接种杂交瘤细胞获得腹水抗体，将腹水进行纯化，得到鼠来源的所述的抗BEX2的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的抗BEX2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中的表达载体为PET28a；表达菌为大肠杆菌。
5.如权利要求3所述的抗BEX2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中通过添加终浓度为0.1-1mmol/L的IPTG诱导工程菌产生BEX2蛋白。
6.一种如权利要求1所述的抗BEX2单克隆抗体在制备用于检测BEX2的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
7.一种如权利要求2所述的杂交瘤细胞株在在制备用于检测BEX2的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的免疫检测试剂或试剂盒为WesternBlot或免疫组化检测试剂或试剂盒。
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