CN105315367B - 用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC C2014128的杂交瘤细胞株PBP2α‑4B8‑G7‑H7所分泌的。本发明还公开了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，包被抗体为本发明所述的抗PBP2α单克隆抗体；检测抗体为HRP标记的抗PBP2α多克隆抗体。本发明所述的试剂盒能通过本发明所述的抗PBP2α单克隆抗体来检测样本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，具有简便、快捷、实用、灵敏、高效的特点。

Description

用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体，以及一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解β-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林(methicillin)。1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染，可英国的Jevons就首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，MRSA从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内和社区感染的重要病原菌之一。MRSA耐药性的产生与一种青霉素结合蛋白(PBP)有关。五种PBP(1，2，3，3′和4)，它们具有合成细菌细胞壁的功能。它们与β-内酰胺类抗生素有很高的亲和力，能共价结合于β-内酰胺类药物的活动位点上，失去其活性导致细菌死亡，而MRSA产生了一种独特的PBP，这种分子量增加了78～1000道尔顿的PBP，因其电泳率介于PBP2与PBP3之间，故称为PBP2α。PBP2α对β-内酰胺类抗生素亲和力很低，因而很少或不被β-内酰胺类药结合。在β-内酰胺类抗生素存在的情况下，细菌仍能生长，表现出耐药性。PBP2α的产生是受染色体甲氧西林耐药基因(mec A)来调节的。MRSA与MSSA根本区别在于它们的PBP不同。

MRSA的不均一耐药性，给其检测带来一定的困难。MRSA的检出率受孵育温度、时间、培养基的pH和NaCl的浓度、菌液的数量等多种因素的影响。因此，目前还没有一种最佳的检测方法。

MRSA感染的治疗是临床十分棘手的难题之一，关键是其对许多抗生素有多重耐药。因其耐药机制是PBPs(青霉素结合蛋白)性质的改变，因此，MRSA几乎对所有的β-内酰胺类抗生素耐药，且在同时，还可能对大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素等多种抗菌药物表现出耐药性。因此急需一种可抑制MRSA生长的非抗生素类药物。

目前检测MRSA的方法主要包括琼脂筛选法和PCR技术。

琼脂筛选法是1997年NCCLS推荐的MRSA的确证试验，即MH培养基加NaCl(40g/L)加苯唑西林(6μg/ml)，将菌液(0.5麦氏浊度)点种或画线35℃孵育24h，只要平皿有菌生长，即使一个菌落也是MRSA，该法敏感度为100％，常用作校正其它方法的标准，尤其适用于检测抑菌圈直径处于中介度的金黄色葡萄球菌。结果容易判断，但耗时，费力。

PCR法是指根据金黄色葡萄球菌的mec A基因DNA序列设计一引物，再裂解提取被测菌的DNA作为模板，在一定条件下进行扩增，经琼脂糖电泳后在紫外灯下观察有无与阳性对照菌株(金黄色葡萄球菌ATCC29213)相同的区带。PCR具有较高的灵敏度，只要被测菌有微量的基因，即出现阳性结果，因此常作为检测MRSA的参考方法。但PCR很灵敏，有时会因实验室的污染而出现假阳性，为使PCR具有更高的可靠性，必须对其扩增产物进行探针杂交或测序以提高特异性。而有一些耐药基因是沉默基因，不表达mec A基因产物，有时会出现假阴性，所以分子生物学方法并非100％的敏感和特异，加上该法前期处理操作繁琐，且需要一定的设备。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体。

本发明所述的抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体，是由保藏号为CCTCCNO.C2014128的杂交瘤细胞株PBP2α-4B8-G7-H7所分泌的。该杂交瘤细胞株保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2014年6月19日。

本发明的第二个目的在于提供一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，该试剂盒能通过本发明所述的抗PBP2α单克隆抗体来检测样本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，具有简便、快捷、实用、灵敏、高效的特点。

本发明所述的一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、标本稀释液、包被抗体、检测抗体、检测抗体稀释液、标准品、阳性对照、阴性对照、洗涤液、底物显色液、终止液；其中，包被抗体为本发明所述的抗PBP2α单克隆抗体；检测抗体为HRP标记的抗PBP2α多克隆抗体。

根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述阳性对照为MRSA菌裂解液，所述阴性对照为MSSA菌裂解液。

根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述标本稀释液为含1-2％溶菌酶的20mM,pH7.4的PBS缓冲液。

根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述检测抗体稀释液为含2％BSA、4％蔗糖、150mM NaCl的20mM,pH7.4的PBS缓冲液。

根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述洗涤液为含0.5至1％吐温20的20mM,pH7.4的PBS缓冲液。

根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述底物显色液由底物液A和底物B缓冲液构成；底物液A的配制方法为：TMB200mg，无水乙醇(或DMSO)100ml，加双蒸水至1000ml；底物B缓冲液的配制方法为:Na₂HPO₄14.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4ml，加三蒸水至1000ml，调至pH5.0-5.4；将底物液A和底物B缓冲液按1：1混合即成酶的底物显色液。

根据本发明所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述终止液为2M硫酸溶液。

本发明还提供了所述的单克隆抗体的用途，也就是用于制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物的用途。

金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌。根据本发明所述的抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体，结合现有的制药方法，可以制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所述抗PBP2α抗体是经过实验筛选的优选抗体，具有较强的抑制MRSA生长的活性，可在免疫印迹实验中用于区分MRSA和MSSA，因此可作为ELISA试剂盒中的检测抗体，用于区分MRSA和MSSA。

(2)本发明酶联免疫试剂盒操作简单，耗时少，灵敏度高，适合大量样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速检测。

综上所述，本发明所述的利用抗PBP2α抗体制备的检测MRSA的ELISA试剂盒，可特异高效地检测MRSA，区分MRSA和MSSA，在抑制MRSA菌生长方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1显示抗PBP2α单抗通过免疫印迹法区别MRSA和MSSA。图1A的检测样品为细菌裂解液，图1B的检测样品为细菌培养液上清。

图2是抗PBP2α单抗抑制MRSA生长实验曲线图。

图3是抗PBP2α单抗抑制MSSA生长实验曲线图。

具体实施方式

实施例1：PBP2α蛋白的制备。

(1)mecA目的基因的克隆

PBP2α蛋白的氨基酸序列ID号为EUE27353。

mecA基因编码PBP2α蛋白，其基因序列来源自JBDL01000002(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/EUE27353)。

根据mecA基因序列，设计两条引物为：

ATCTTCACCAACACCTAGTT；

ATGAAAAAGATAAAAATTGT。

通过PCR扩增得到表达mecA目的基因，将载体pET-28a及经过琼脂糖凝胶纯化的mecA基因片段，用NcoI+XhoI进行双酶切处理，用T4DNA连接酶将纯化后酶切产物连接，得到重组质粒pET-28a-PBP2α，并连接产物转化进入大肠杆菌DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序结果表明重组的mecA片段与设计的序列完全一致。

(2)PBP2α重组蛋白的表达

PBP2α质粒经测序验证后，转化进入大肠杆菌(BL21)，在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，可在LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定，小量制备质粒，用双酶切PCR鉴定筛选出阳性克隆，最终获得含有mecA基因片段的重组质粒工程菌。

在表达时，重组质粒工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养，A600达到0.5-0.6之间，然后加入终浓度为0.5mM的Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)于37℃诱导4h，诱导完成后的菌液4,000rpm离心10min，收集菌体，并用PBS洗涤沉淀；PBS重悬沉淀后置于冰浴中，超声破菌后12000rpm离心20min，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果表明：表达的PBP2α重组蛋白为胞浆不可溶性表达，将该重组蛋白命名为BL21(DE3)-PBP2α，分子量为74kDa左右。

(3)PBP2α重组蛋白的纯化和定量

将大量表达得到的菌体，经超声破碎后离心，再进行包涵体洗涤，洗涤完成后用GEHealthcare公司的His Trap FF纯化柱将蛋白进行纯化(按照产品说明书进行试剂配制和纯化)。最终获得的蛋白用SDS-PAGE电泳进行分析，用BCA蛋白定量试剂盒测得其浓度为0.23mg/ml。

实施例2：单抗的制备

1)鼠抗PBP2α杂交瘤细胞株的建立及单抗亚型的鉴定

a.免疫程序采用4次基础免疫和1次加强免疫。选用6-8周龄、体重18g左右且健康的雌性BalB/c小鼠2只，适应性饲养1周后，采集阴性血作为对照用；

b.采用中程免疫方案(0.3mL/只，2周/次)，首次免疫时(50μg/只)按免疫原与等体积的弗氏完全佐剂搅拌乳化，背部皮下多点注射，此后按免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂搅拌乳化进行常规免疫；

c.3次免疫时，一般50μg抗原+TiterMax等量混合乳化后背部多点注射，7天后测效价。效价达到4万以上后，准备加强免疫，加强免疫不加佐剂，加强免疫剂量为50μg，加强免疫后3天，摘眼球采血，分离血清保存。同时取2#小鼠脾脏进行融合。

表1：PBP2α小鼠三次免疫后效价测定

血清稀释度(1:X)	1#小鼠	2#小鼠
			5000	0.457	1.639
10000	0.241	1.442
			20000	0.171	1.037
40000	0.133	0.679
			80000	0.116	0.441
160000	0.110	0.275
			血清负对照	0.114	0.116
空白对照	0.120	0.134

d.细胞融合时，将脾细胞与骨髓瘤细胞按4:1左右进行混合，并在聚乙二醇(PEG，分子量为1450)的促融作用下进行融合，融合细胞再HAT选择性培养液中进行培养，10天后通过间接ELISA方法筛选出能与PBP2α肽段反应的阳性杂交瘤细胞，并将初筛得到的阳性杂交瘤细胞扩大培养，两天后进行标签蛋白(His-tag)杂交瘤细胞的排除，以复筛出针对PBP2α肽段而非标签的杂交瘤细胞；

e.用有限稀释法将获得的阳性杂交瘤细胞连续亚克隆至少两次以上，每次亚克隆用HT选择性培养基进行培养，亚克隆8-10天后进行ELISA筛选，直至单克隆细胞阳性率为100％为止，获得5株能稳定分泌抗PBP2α抗体的单克隆细胞株(编号为0028，0029，0030，0031，0032)。

f.应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定芯片试剂盒(购自美国Raybiotech公司)鉴定单抗亚型，按芯片试剂盒说明书将单克隆细胞株上清分别用DMEM无血清培养基进行80-100倍稀释，加入到阵列中，一个孔含有测定所有亚型的阵列，每个亚型有4次重复。

g.鼠抗PBP2α的腹水抗体制备及纯化

a)选择8-12周龄雌性健康BalB/c小鼠，腹腔注射降植烷，0.5mL/只；7-10天后，给每只小鼠腹腔注射1*10⁶～5*10⁶个单克隆杂交瘤细胞，注意吹下细胞或稀释细胞需用PBS或无血清培养基；

b)将腹水10,000r/min离心15min，除去细胞成分和其他的沉淀物、脂肪以及油层等，收集中间层，测定抗体效价，分装，置-700C冻存备用。

c)饱和硫酸铵沉淀：吸取5mL处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，逐滴加入过0.22μm滤膜的PBS5.0mL；混合均匀后，再逐滴加入10mL饱和硫酸铵溶液(pH7.4)，继续缓慢搅拌30min；静置2h后10,000r/min离心15分钟，弃去上清，沉淀物用过0.22μm滤膜的PBS重悬，然后再将该重悬液过0.22μm滤膜；

d)根据抗体不同亚型，选定不同的GE Healthcare公司的纯化柱，IgG和IgM的柱子均有相应说明书，根据其说明书配置不同的缓冲液进行纯化：以IgG抗体纯化为例，先用结合缓冲液、洗脱缓冲液及再生缓冲液将柱子进行平衡，通常平衡5个柱体积，然后将重悬的腹水缓冲液以1mL/min的速度上样，上样完成后用结合缓冲液平衡，再用洗脱液洗至基线位置，收集抗体峰；用PBS缓冲液将抗体进行透析，用BCA蛋白定量试剂盒测定抗体浓度，并将抗体分装保存，并用间接ELISA进行效价测定。

实施例3：抗PBP2α抗体的筛选及表位的确定

(1)在本实施例中，应用MRSA菌培养上清作为包被抗原，以实施例2中制备的5株单克隆抗体作为检测抗体经生物素偶联后，建立检测PBP2α的间接ELISA的方法。

a)酶标板的包被

用包被液(Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，Na₂N₃1.2g，加ddH₂O到1L，调pH到9.6)将抗原混合均匀后加入到96孔酶标板中，每孔100μl，将板密封于4℃过夜。

b)酶标板的封闭

用含有5％脱脂牛奶的PBS作为封闭液。首先将包被过夜的酶标板拍干，加入200μl/孔的封闭液，37℃封闭2h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，并于4℃备用，或-20℃长期保存。

c)加入本发明中制备的生物素化单克隆抗体，100μl/孔，于37℃温育1h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，再加入一定浓度的链霉亲和素(HRP-Strp)，100μl/孔，于37℃温育1h；洗板后加入TMB显色液，待显色完全后，加入2M的浓硫酸终止显色，并用酶标仪(美国Biotek)测定OD450。

表2：抗PBP2α单克隆抗体的筛选

抗原为MRSA培养上清按梯度稀释加入，一抗为生物素化抗MRSA单抗，稀释倍数为1：8000。

由表2的结果可知，第0029号抗体对应MRSA培养上清的浓度下降呈显著递减关系。因此，选择第0029号抗PBP2α单抗用于制作ELISA试剂盒的抗体原料。

第0029号抗PBP2α单抗的分泌细胞株的为PBP2α-4B8-G7-H7，送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，地址是中国湖北省武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO:C2014128，保藏日期为2014年6月19日。

(2)抗原表位的确定

根据Swiss model及DNAStar软件根据亲水性等特征设计抗原表位，由上海吉尔生化生物公司公司合成三组肽段：

NH2-CGSKKFEKGMKKLGVGEDIPSDYPF

NH2-CSKDKEINNTIDAIEDKNFKQVY

NH2-CSNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS

上述肽段与KLH载体蛋白偶联，进行间接ELISA法确认第0029号单抗的识别位点。结果可知，肽段NH2-CGSKKFEKGMKKLGVGEDIPSDYPF为此单抗的识别位点。

(3)抗PBP2α多克隆抗体的制备

1)PBP2α多克隆抗体的制备

用上述纯化的PBP2α蛋白免疫SPF级新西兰兔子：通过弗氏佐剂乳化抗原，从SPF级兔子背部多点注射的方法免疫动物。三次免疫后从耳缘静脉采集小量血清进行ELISA检测。如效价达到要求，对动物进行最后一次加强免疫，三天后从心脏采集大量血清。

2)ELISA酶联免疫吸附方法检测血清效价

包被每孔100ng免疫原于酶标板，依次加入5％脱脂奶粉，不同浓度多克隆抗体，生物素标记的种属二抗羊抗兔，HRP-链亲和素和TMB底物显色。Bio-Tek酶标仪读数，根据OD值绘制标准曲线。

抗原抗体的相对亲和力将使用抗原来包被的直接酶联免疫吸附试验检测，抗原0.1μg/ml包被96孔板，5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液封闭后，加入针对包被抗原的抗体孵育。洗涤后，加入10ng/ml的辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体，清洗后，加入TMB将产生颜色。扣除背景后，信号强度表明了抗体抗原的结合。

3)多克隆抗体的纯化

ProteinG/A预装柱纯化血清抗体：大量采取的血清用50％饱和硫酸铵沉淀初步纯化后，与磷酸盐缓冲液混合通过ProteinG/A预装柱，再用洗脱缓冲液收集高纯度的抗体蛋白。使用Bradford法检测抗体定量，分装冻干制作抗体制品。

Western Blotting免疫印迹检测多克隆抗体特异性：生产出来的抗体将用免疫印迹分析来测试特异性。

实施例4：抗体特异性的鉴定与对临床样品的检测

(1)Western Blotting法鉴定MRSA。

实验步骤：

A)上样：操作方法与SDS-PAGE电泳，上样顺序如下图2。

B)转膜：剪与凝胶胶块同样大小6张定性滤纸和1张的硝酸纤维素(NitrocellLose，NC)膜，并将凝胶块、定性滤纸、NC膜以及海绵垫浸泡在转移缓冲液中平衡20min。

打开转印夹子，在负极面上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回擀几遍，以防留有气泡。在垫子上垫三层滤纸，然后贴上凝胶块，再把NC膜盖于胶上，NC膜上边再铺三层滤纸。注意每次都要用玻棒擀走里边气泡，NC膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。最后盖上另一个海绵垫，夹好夹子，准备电转。将夹子放入转移槽中，接好正负极，打开电源，调电流为250毫安，电转90min。由于电转移时会产热，在槽里放一个小冰袋，在槽外可以放些冰块，控制其温度不要太高。转膜结束后，取出NC膜，剪下Marker条带在氨基黑染液中染5min，再用脱色液脱色，直到蛋白带清晰为止；凝胶用考马司亮蓝染液中染色，以检查蛋白质是否转移完全；膜用丽春红染液染5min，用ddH₂O冲洗残留的染液，看是否有蛋白条带。

C)封闭：NC膜加入5％脱脂奶粉中，37℃封闭1h，PBST洗3次，每次10min。

D)一抗：把抗PBP2α单抗0029适当稀释，37℃孵育45min，PBST洗3次，每次10min。

E)二抗：加入适量的AP标记的山羊抗兔IgG，37℃温育30min，PBST洗3次，每次10min。

F)显色：在18mL的PBS溶液中溶解0.012g二氨基联苯胺(DAB)，加入1mL0.3％(w/v)CoCl₂，再加入10μL30％H₂O₂，混匀。把NC膜放入底物溶液中，蛋白条带出现后，立即用自来水冲洗，用吸水纸吸干。

G)把带有Marker的膜与经显色的膜按原来剪下的痕迹拼在一起，拍照、记录实验结果。见图1A和图1B。

因为PBP2α蛋白有可能分泌到细菌外面而存在培养液中。本实施例的实验做了两个样品的测试，一个上样的是细菌细胞的裂解液(见图1A)，另一个是细菌培养液的上清(见图1B)。图中，泳道1为分子量Maker，泳道2-5为阳性对照菌MRSA(ATCC编号43300)，泳道6-8为阴性对照菌MSSA(ATCC编号25923)。

由结果可知，抗PBP2α单抗0029可通过免疫印迹区别MRSA和MSSA。

(2)抗体对临床样本的检测

采用本发明提供的检测MRSA的试剂盒，针对20例临床样本培养物进行检测，具体操作步骤如下：

A.酶标板的包被：用包被液(Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，Na₂N₃1.2g，加ddH₂O到1L，调pH到9.6)将定量临床样本蛋白浓度稀释成1μg/mL，混合均匀后加入到96孔酶标板中，每孔100μL，将板密封于4℃过夜。

B.酶标板的封闭：首先将包被过夜的酶标板拍干，加入200μL/well的封闭液，37℃封闭2h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，并于4℃备用，或-200C长期保存。

C.加入本发明中制备的抗体，100μL/well，于37℃温育1h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，再加入一定浓度的HRP标记羊抗-小鼠IgG抗体(购自美国Raybiotech)，100μL/well，于37℃温育1h；洗板后加入TMB显色液，待显色完全后，加入2M的浓硫酸终止显色，并用酶标仪(美国Biotek)测定OD450。

表3：ELISA区分MRSA与MSSA的实验

样本编号	细菌种类	细菌培养上清	细菌裂解液上清	细菌沉淀
					1	MRSA	1.31	1.032	1.629
2	MRSA	1.034	0.786	0.689
					3	MRSA	1.182	10.97	0.786
4	MRSA	0.352	0.678	0.769
					5	MRSA	0.232	0.518	0.735
6	MRSA	0.233	0.604	0.829
					6	MRSA	0.836	1	1.049
7	MRSA	0.986	0.892	1.006
					6	MRSA	0.871	0.985	0.435
7	MRSA	0.877	1.14	1.081
					7	MRSA	0.716	1.174	1.768
6	MRSA	1.236	0.897	0.406
					7	MRSA	1.734	0.844	1.295
7	MRSA	0.344	0.312	0.58
					7	MRSA	0.979	0.876	1.308
7	MRSA	0.448	0.51	1.158
					7	MSSA	0.369	0.262	0.301
7	MSSA	0.372	0.349	0.214

7	MSSA	0.121	0.112	0.311
					7	MSSA	0.376	0.299	0.252

由表3可知，MRSA的检测数值偏高，MSSA的数值偏低，可证明此抗体能区别MRSA和MSSA。

实施例5：抗体抑制MRSA生长的实验

(1)在一块48孔板上，最左边的两个孔为对照，不加任何抗体，只加甘氨酸缓冲液；右边两孔加入25ul抗体(1mg/ml)，陆续一共加4种抗体，最后一孔是每种抗体各加入6.25ul。

(2)每孔加入500ul MRSA,设置对照MSSA，每隔一个小时读一次板OD595。

(3)最后一次读板为第二天早上，肉眼能见菌体沉淀死亡，所以结果不可信，取前一天最后一次测得数值来计算。

(4)图2和图3分别显示了抗体抑制MRSA和MSSA生长实验抑制率。由图示的结果可知，第0028号单抗的抑制率可达30％，第0029号单抗的抑制率最高，达到41％。如混合四个抗体一起加入，效果会更好，达到42％。

MRSA抑制率＝(对照OD值-抗体OD值)/对照OD值

抗体	抑制率
		0028	(0.4105-0.2855)/0.4105＝0.304506699
0029	(0.4105-0.241)/0.4105＝0.412911084
		0030	(0.4105-0.2535)/0.4105＝0.382460414
0031	(0.4105-0.2515)/0.4105＝0.387332521
		4Ab	(0.4105-0.2375)/0.4105＝0.421437272

MSSA抑制率＝(对照OD值-抗体OD值)/对照OD值

抗体	抑制率
		0028	(0.441-0.3435)/0.441＝0.221088435
0029	(0.441-0.3085)/0.441＝0.300453515
		0030	(0.441-0.315)/0.441＝0.285714286
0031	(0.441-0.373)/0.441＝0.154195011
		4Ab	(0.441-0.344)/0.441＝0.219954649

Claims (9)

1.一种抗青霉素结合蛋白PBP2α的单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC NO:C2014128的杂交瘤细胞株PBP2α-4B8-G7-H7所分泌的。

2.一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、标本稀释液、包被抗体、检测抗体、检测抗体稀释液、标准品、阳性对照、阴性对照、洗涤液、底物显色液、终止液；其特征在于：包被抗体为如权利要求1所述的抗PBP2α单克隆抗体；检测抗体为HRP标记的抗PBP2α多克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为MRSA菌裂解液，所述阴性对照为MSSA菌裂解液。

4.根据权利要求2所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述标本稀释液为含1-2％溶菌酶的20mM,pH7.4的PBS缓冲液。

5.根据权利要求2所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述检测抗体稀释液为含2％BSA、4％蔗糖、150mM NaCl的20mM,pH7.4的PBS缓冲液。

6.根据权利要求2所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为含0.5-1％吐温20的20mM,pH7.4的PBS缓冲液。

7.根据权利要求2所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述底物显色液由底物液A和底物B缓冲液构成；底物液A的配制方法为：TMB200mg，无水乙醇(或DMSO)100ml，加双蒸水至1000ml；底物B缓冲液的配制方法为:Na₂HPO₄14.60g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素6.4ml，加三蒸水至1000ml，调至pH5.0-5.4；将底物液A和底物B缓冲液按1：1混合即成酶的底物显色液。

8.根据权利要求2所述的用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述终止液为2M硫酸溶液。

9.根据权利要求1所述的单克隆抗体用于制备抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长的药物的用途。