CN102741281A

CN102741281A - PBP2-a蛋白的单克隆抗体和同源序列用于由厚壁菌门的细菌引起的免疫诊断和感染的处理

Info

Publication number: CN102741281A
Application number: CN201080043628XA
Authority: CN
Inventors: 若泽·普罗科皮奥·莫雷诺·塞纳; 乔奥·路易斯·桑帕约·凯罗斯; 纳迪娅·玛丽亚·巴特罗; 玛丽亚·达·格劳瑞娅·马丁斯·特谢拉
Original assignee: Fundacao Oswaldo Cruz
Current assignee: Fundacao Oswaldo Cruz
Priority date: 2009-08-10
Filing date: 2010-08-10
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2030-08-10
Also published as: HK1176077A1; AU2010282162B2; CU24095B1; JP5785544B2; CU20140101A7; AU2010282162A8; JP2013501732A; CU24180B1; AU2010282162A1; CN102741281B; CU20120026A7; RU2012108941A; SG178346A1

Abstract

本发明涉及一种能够识别和结合到PBP2a蛋白和其它具有同源于PBP2a的序列的蛋白的单克隆抗体，包括病原菌耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)-MRSA、凝胶酶阴性的葡萄球菌(Staphylococcus)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)、肠球菌(Enterococcusspp.)，和任何其它具有PBP2a或者同源于这个蛋白的序列的细菌。本发明还涉及能够识别和结合PBP2a蛋白和其它序列同源于PBP2Ar蛋白的单克隆抗体在检测耐β内酰胺的互补免疫诊断中的使用。

Description

PBP2-a蛋白的单克隆抗体和同源序列用于由厚壁菌门的细菌引起的免疫诊断和感染的处理

技术领域

本发明涉及能够识别和结合到PBP2a蛋白和其它与PBP2a的同源序列的其它蛋白的单克隆抗体，包括耐甲氧西林的金黄葡萄球菌-MRSA，凝固酶阴性的葡萄球菌和松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)，肠球菌(Enterococcus spp.)和任何其它有PBP2a或者有与该蛋白同源序列的细菌的病原体。本发明还涉及能够识别和结合PBP2a蛋白和与PBP2a同源序列表达的其它蛋白的单克隆抗体在检测耐β内酰胺的互补免疫诊断中的使用。

背景技术

由耐甲氧西林的金黄葡萄球菌-MRSA引起的感染是临床医生主要关注的，其呈现出的死亡率和发病率高于由甲氧西林敏感的葡萄球菌(1)引发的感染。而且，这些感染使住院治疗时间更长和抗生素费用更高，导致由这种病原体感染的患者的治疗花费更高(1)。

万古霉素是治疗由MRSA引发的感染的首选抗菌素。然而，在美国和澳大利亚的人群中的MRSA菌株(2，3，4)的生长分离，与在日本、美国(5)和巴西(6)的中介耐万古霉素的MRSA菌株的识别，导致当前的形势变得更加严峻。在2004(7)中对于完全耐万古霉素的MRSA菌株的描述引起药物科学界的高度关注。MRSA现在代表了变成可怕的“超级病菌或者超级细胞”的强势侯选者—一种当前对于所有可用药物均耐药的病原菌。

通常，在医院传染病中MRSA的流行率(由MRSA导致的金黄葡萄球菌引发的感染的比率)在最近几十年逐渐上升。在由Jarvis等人引导的研究中，包括在美国337个医院中的1268个ICU(加护病房)中，在ICU中由MRSA导致的感染数量从660例上升到2184例，流行率从35%上升到64.4%(8)。在日本，由MRSA导致的医院感染(HIs)的流行率呈现令人担扰的数值，从60%上升到90%(9)。在美国进行的研究中，百分比从1974年的2%上升到1997年的50%(10，11)，在美国的一些医院中，由MRSA导致的His超过80%。在英国，百分比在1989年到1995年之间从1.5%上升至15.2%，现在(2004年)估计为41.5%(13)。

除了高百分率，尤其是在教学医院和大型医院中，MRSA被认为是在巴西医院中流行病爆发的主要病原菌(14)。在1986年，从圣保罗的大学医院的患者身上分离的医院来源的超过50%的金黄葡萄球菌对甲氧西林耐药，在1993年，在保禄会医学院校(Paulista Medicine School)的儿科医院中MRSA的发生率是70%(15)。在贝洛奥里藏特(Belo Horizonte)的医院中进行的研究中，Resende等人(16)指出MRSA的流行率为71%。

MRSA菌株表达出对于抗菌素的亲和力非常低的β内酰胺酶族的青霉素结合蛋白，例如PBP2a(17)。在这种酶的存在下，其由mecA基因编码，细菌成功地合成肽聚酶，甚至在β内酰胺酶存在的情况下。这种酶还可以在正常的凝固酶阴性的金黄葡萄球菌和松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)中找到，松鼠葡萄球菌-一种在狗的正常微生物区系中存在的细菌中。除了耐β内酰胺酶，医院的MRSA菌株呈现出对于大多数其它可用的抗生素族的耐药性，使用糖肽(万古霉素和替考拉宁)仍然是首选治疗。

使用抗PBP2a的DNA疫苗的两项研究表明，在鼠类模型中进行的检测，该蛋白是有免疫原性的，其获得的免疫反应能够赋予抗MRSA的保护(18，19)。然而，众所周知，在医院感染中，大部分患者是免疫抑制的(20)。在这种情况下，疫苗无法及时地产生保护性抗体以控制细菌感染。

PBP2a的免疫原性

PBP2a根据Goffin和Ghuysen的分类是II类多组件酶(40)。这个76-千道尔顿的酶由膜结合区域、非转肽酶区域和转肽酶区域组成，包括4-氨基酸活性中心(STQK)，负责细菌的转肽作用(20 bis Ryfell, 1990)。

抗PBP2a的DNA疫苗研究的当前技术水平显示在接种动物中细菌减少(肾定量)的结果易于受到系统性感染的挑战是Ohwada等人的工作中是3-4倍，在Senna等人的工作中是1000倍。这些研究的作者分别使用mecA基因的全序列(除了膜固定区域)和转肽酶区域的内部片段。

但是，根据前述，疫苗无法及时地产生保护性抗体以控制细菌感染。这样，在受MRSA感染的情况下，抗PBP2a的单克隆抗体的施药是处理这些感染最合适的治疗。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种能够识别和结合PBP2a蛋白(SEQ ID NO:1)和表征PBP2a同源的其它蛋白的单克隆抗体，包括耐甲氧西林的金黄葡萄球菌—MRSA，凝固酶阴性的葡萄球菌、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、肠球菌(Enterococcus spp.)和任何其它拥有PBP2a或者有与该蛋白同源的序列的细菌的病原体。

另一发明目的是在检测耐β内酰胺酶的互补免疫诊断中使用能够识别和结合PBP2a蛋白和表征同源于PBP2a序列的其它蛋白的单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体是由序列SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17表征。

附图说明

图1是接种产生抗PBP2a抗体的动物血清的酶联免疫检测(ELISA)；

图2是粗样本和纯化样本的聚丙烯酰胺凝胶的结果；

图3是包含抗PBP2a单克隆抗体的上清液MRSA和MSSA溶菌液的免疫印迹检测；

图4表示与抗PBP2a的单克隆抗体和藻红蛋白(PE)共培养的MRSA(CEB)和MSSA细菌的流式细胞术检测结果；

图5显示不同的MRSA菌株的接种体给予抗PBP2a纯化的单克隆抗体和万古霉素的体外保护作用的测试(MIC-最小抑制浓度)；

图6A显示给予次致死剂量的MRSA CEB菌株的系统性感染，经抗PBP2a单克隆抗体治疗过和非治疗过的动物的肾脏定量测定的结果；

图6B显示给予次致死剂量的MRSA伊比利亚(Iberian)菌株(欧洲流行克隆)的系统性感染，经抗PBP2a单克隆抗体治疗过和非治疗过的动物的肾脏定量测定的结果；

图6C显示给予次致死剂量的WB79CA-MRSA菌株(巴西人群克隆)的系统性感染，经抗PBP2a单克隆抗体治疗过和非治疗过的动物的肾脏定量测定的结果；

图7A显示经致死细菌剂量(MRSA CEB)感染后经治疗(受保护的)和非治疗(控制)的动物的存活率曲线；

图7B显示经致死细菌剂量(伊比利亚MRSA)感染后经治疗(受保护的)和非治疗(控制)的动物的存活率曲线；

图7C显示经致死细菌剂量(WB79 CA-MRSA)感染后经治疗(受保护的)和非治疗(控制)的动物的存活率曲线；

图8A显示用细菌(MRSA CEB)感染后的动物经抗PBP2a单克隆抗体、万古霉素、和抗体+万古霉素联合治疗过的和非治疗过的肾脏的细菌数量；

图8B显示用抗PBP2a单克隆抗体治疗过的动物的肾脏细菌数量；

图9显示PBP2a(抗原)与单克隆抗体克隆株38(图9A)和克隆株10(图9B)的重新组合的交互作用；

图10是在FITC标记的抗PBP2a抗体存在下经MRSA样本的流式细胞术的二次分析图表；

图11显示给予抗VRE肠球菌菌株的抗体的体外保护的结果；

图12指的是LD₅₀和致死剂量的腹膜内感染的测定；

图13显示肠球菌素来源的抗PBP2a和PBP5单克隆抗体对抗系统性感染的体内保护作用的效价结果。

具体实施方式

由耐多种抗菌素的细菌的感染正在呈现令人担心的增长。由MRSA导致的医院感染的流行在全世界各地的增长呈现高发病率，并导致由于抗生素的加重而使用高花费，以及患者住院治疗的时间更长(24)。由于在市场上鲜有真正新颖和有效的药物出现，化学疗法的治疗正呈现出枯竭的迹象。

在本文中，被动的免疫治疗(再次)显现为有前途的选择，相比于传统的化学治疗具有一定的有利特点：其中，更低的毒性，更高的血液半衰期(其有利于减少剂量的治疗，可能产生更低的最终治疗花费)，尤其是在此呈现的产品中，可选的毒性，经Paul Ehrlich推荐(其中药物可选自消除所提及的病原菌)(25a)。这个最后的特征是极端地有用于阻止所谓的选定压力—通过广谱抗生素起作用—其提供了抗多重耐药性的细菌出现。

为了发展这种产品，发明人选择了PBP2a作为靶标，基于在鼠模型中DNA疫苗的初步研究(18，19，21)和免疫结构分子分析。PBP2a在2002(29)中阐明了其结构，存放在PDB(蛋白数据库)，在lwmr的编码下。

不同于其它方式，发明人与76个氨基酸的分子的内部区域工作，其侧包围酶活性区域(SxxK)，在转肽酶区域。在分子水平实施抗原决定部位识别分析，在它们出现在不同的II类CHM等位基因(Tepitope计划)中，在分子水平上稍后对于它们的位点识别(SPDB阅读器计划)。这个方法能够让我们评估抗体接近天然分子的这些靶标的可能性。

这个计算机化的分析显示出靠近酶活性中心的抗原决定部位的存在，经II类CHM等位基因具有卓越的识别程度，位于PBP2a表面(未示出数据)。

这些in silico预计已通过实施靶识别检测(免疫印迹和流式细胞术)确定，抗体结合到PBP2a区域显示能够给予较高的保护，并通过在体外和体内实施的检测获取的结果证明。由76个氨基酸片段产生的抗体显示出给予比由全PBP2a免疫产生的具有了更高的保护，如前述Ohwada和Senna的工作所示，经发明人获取的结果证实。

由MRSA导致感染的流行病学显示突出的克隆类型的存在，是造成在全世界的医院中爆发和流行的原因。这些克隆株相比于非流行的MRSA菌株存在着更高的复制能力和毒力(30)。

作为一种确认所获取的结果的方式，用不同的MRSA克隆株(流行性克隆株)，代表由MRSA导致的大多数感染(尤其是医院的感染)中的菌株，进行测试。

CEB菌株(巴西流行性菌株)是造成MRSA在巴西医院中的大多数感染的原因(31)，还在南美(32、33)的其它国家、葡萄牙和捷克斯洛伐克(34)中也经识别。欧洲流行菌株(伊比利亚-MRSA)是在欧洲国家和美国中发现的。

由于MRSA导致的群体感染的情况增加，这些菌株(WB79 CA-MRSA)中的一个，经巴西分离，包括在当时的检测中。这些检测呈现出不同于在医院发现的特征，具有更高的毒力(Panton-Valentine leukocidin基因的存在)和不同于医院MRSA菌株(36)的耐抗菌素的剖析图(氨基酸组成)。最近，发现CA-MRSA感染在美国男人与其它男人性交的人群中爆发(37)。从这个数据中，我们可以说明MRSA导致的感染呈STD(性传播疾病)的角色。

由抗PBP2a的抗体的施药获取的保护结果显示出抗所有不同的检测的克隆株的有效性，其让我们相信它们对于由任何MRSA类型导致的感染(人群或医院)的适应性。

需要提到本发明的产品的一些显著的特征

(i)体外保护结果使我们相信作用所涉及的机理—靠近分子活性区域的封闭—是足够抑制细菌生长和繁殖的。类似与β内酰胺抗生素中的一种，这个机制是时间依赖型，需要细菌是在繁殖阶段将靶标部位暴露于药物作用下。

(ii)这个特征是由抗体的药代动力学特性给予的，其代表长期的血液半衰期(38)。相比于抗生素疗法，这意味着更低剂量的给药，代理患者的治疗便利，进而可能花费更低的最终代价。这些想法在与万古霉素的保护比较检测的实践中得以证明。

(iii)体外的细菌生长抑制还意味着抗体不需要传统的辅助抗原—抗体反应机制，比如调理作用和互补活性。考虑大多数医院感染发生在具有免疫抑制数据的患者身上，这个产品的特点是极其重要的。

(iv)已知金黄色葡萄球菌在它的表面具有蛋白A。这个分子特征性的自身结合到免疫球蛋白的Fc区域中，阻止免疫系统的调理作用(38)。由于在我们的检测中获取的结果，我们相信施药的抗体浓度能够使存在细菌表面的蛋白A饱和，由所施予的抗体不阻止PBP2a的封闭。

由MRSA导致的系统感染使用糖肽进行治疗，尤其是万古霉素。然而，这个药物呈现出一定的副作用，免疫毒性(42)、耳毒性、肾脏毒性和短暂的嗜中性白血球减少症，而且需要长期的给药，导致最终的高额治疗费用。

通过使用鼠感染模型，比较万古霉素相对于单克隆抗体以及两种药物联合应用的治疗是可能的。获取的结果表明抗体剂量具有类似于或高于5倍万古霉素剂量的活性，并且两种药物的同时给药在减少细菌数量方面相比于单独给药绝对更为有效。具有使用万古霉素和抗体给药的重要数据，从而考虑使用抗体而使治疗费用更低，并且患者的康复更为有效成为可能，这些数据是极其重要的。

除使用抗PBP2a单克隆抗体治疗由MRSA导致的感染以外，本发明还考虑以下应用：

(i)通过抗PBP2a单克隆抗体来识别分子量接近于肠球菌(Enterococcus sp.)菌株的PBP5之一的蛋白的结果表明通过给予抗病原菌的抗体施药获取保护性反应是可能的。PBP5与PBP2a同源，都被分为多分子PBPs的B类，与β内酰胺具有低亲和力(40)。肠球菌是导致严重医院感染的细菌，表现出内在的和获得的耐抗生素的较高的程度。耐万古霉素(VRE)的菌株表现出耐糖肽基因的存在，能够转化成其它病原菌(41)。

(ii)这些抗体具有通过免疫诊断测试而识别PBP2a的能力。例如，使用基于结合抗体的乳胶颗粒的凝集反应的免疫检测能够在数小时内提供预知所有β内酰胺抗生素的耐药性。在传统的抗生素敏感度的检测中(例如抗生素敏感度检测)，这些结果仅在12至24个小时后释放。

(iii)一旦单克隆抗体成功用于对抗慢性疼痛(英夫利昔infliximab，参见Streit等人和WO1999041285A1)的局部用药时，这些抗体可以局部地给药，以促进由MRSA导致的鼻部感染的去殖化，以及用于治疗由这个病原菌导致的皮肤损伤的治疗。

基于本领域中找到的知识和主题，当前的发明人在动物中用DNA疫苗实施免疫，该DNA疫苗具有对应于不具有膜固定区域的mecA(SEQ ID NO:2)的基因的结构，包括酶活性中心的转肽酶区域(SEQ ID NO:3)的76个氨基酸内部区域的免疫作用。

免疫作用是用与Ohwada 等人and Senna 等人的工作中相同的条件实施，他们发展出抗PBP2a的DNA疫苗，使用mecA基因的全序列(除了膜固定区域)和转肽酶区域的内部片段。免疫作用以4个剂量实施，接种动物和非接种的控制组经受由MRSA导致的系统感染的挑战，在两个不同的时期里测定动物肾脏内存在的细菌数量。获取的结果显示相比于经mecA基因免疫的动物中的肾脏内细菌数量，由转肽酶片段的免疫作用给予在动物肾脏内存在的细菌数量的更为显著的减少。

这样，我们看到在使用的条件下(鼠模型中的DNA疫苗)由对抗转肽酶片段产生的抗体相比于抗PBP2a产生的抗体，提供更好的保护。转肽酶片段包括酶活性中心STQK(SEQ ID NO：4)。

因此，基于所发现的结果，发明人指出本发明生产能够识别和结合到PBP2a蛋白和其它蛋白的单克隆抗体具有与PBP2a蛋白同源的序列，使用包括酶活性中心的转肽酶片段。

本发明将在此结合以下实施例进行描述，但并不认为限于所述实施例。

材料和方法：

1.细菌

使用以下的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌株：伊比利亚-MRSA(Iberian-MRSA)、 COL-MRSA(ceded by Unité des Agents Antimicrobiens - Institut Pasteur [Unit of Antimicrobial Agents-Pasteur Institute], Dr. Patrice Courvalin), WB79 CA-MRSA, 和CEB-MRSA(ceded by Dr. Agnes Figueiredo, Instituto de Microbiologia [Microbiology Institute] of UFRJ); 耐万古霉素粪便肠球菌菌株；和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株(MSSA)。使用大肠杆菌菌株BL21 DE3 (Novagen) 和 TOP10 (Invitrogen) 作为控制。

2.动物

使用4至8周大，从CECAL-FIOCRUZ获得，和定居于LAEAN-BioManguinhos的雌性Balb/C鼠用于体内保护试验。

3.免疫

鼠(4个)收到100微克的pCI-Neo质粒的最初剂量：MRSA的mecA基因(18)的片段，14天之后接着使用10微克的纯化重组的蛋白，相应于MRSA PBP2a(21)的内部区域，在弗氏完全试剂中乳化。14天之后，具有最好的免疫反应的动物(经酶联免疫——ELISA测定)接受经静脉内在稀释在PBS(磷酸缓冲液)10微克的纯化蛋白的剂量。在IV注射三天后，动物在CO₂ (CEUA L0009-07 Protocol - FI℃RUZ)中窒息接受安乐死，将脾脏无菌地切除并作细胞融合。具有最好免疫反应的动物的血液用于其它免疫学测试的阳性控制。

4.单克隆抗体的制备

从脾脏中取出的淋巴细胞，根据Current Protocols in Immunology (22)中生产单克隆抗体的记录与SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞(ATCC 1581)融合，使用聚乙二醇融合，在37℃，10% CO₂的次黄嘌呤-氨喋呤-胸腺培养基中培养。根据如下所述，使用纯化的重组蛋白作为抗原，合成的杂交瘤通过ELISA检测在14天之后评价。最好的杂交瘤细胞用于克隆，通过ELISA选择最好的克隆株，然后这些克隆株被贮存在液氮中。

5.酶免疫检测—ELISA

Maxisorb96孔塑料板用于碳酸盐/重碳酸盐的缓冲液中重组蛋白(PBP2a片段)以500毫微克/孔包被，在4 ℃培养一整夜。在接下来的一天中，该板用包含0.05%的吐温20(Tween 20)的PBS洗涤三次，在37℃，PBS和5%脱脂奶中封闭两小时。分析样本(接种动物的免疫血清以1∶100稀释或细胞培养悬浮液)，在37℃培养2小时。该板用PBS和(0.05%)吐温20再次洗涤三次，抗Ig配对(抗鼠HRP Ig SIGMA A 0412)加入到1:5000的稀释液中，接着在37℃中培养90分钟。在这段时间后，该板用PBS和(0.05%)吐温20洗涤三次，加入TMB过氧化物酶显色(BioRad)，避光保存培养15分钟。加入0.5 N H₂SO₄中止反应，在450 nm读取。A 1:200稀释超免疫多克隆血清用作为阳性控制。

5.1基于酶免疫检测的亲和力测定

5.1.1用尿素的亲和力测定(Niederhouser 等人- 5.1):

方法类似于前述免疫测定方法(5)，具有以下修改：在37 ℃样品孵育(100 ng的纯化单克隆抗体的克隆10和 2.0 ng的纯化的单克隆抗体的克隆38)两小时后，样品经过三次在PBS和吐温20(0.05%)中的8M尿素的洗涤，再经过PBS和吐温20(0.05%)的四次洗涤，以相同正常处理过的样品作为控制(不经过尿素处理)。在样品的光密度值读取后，亲和力比率通过计算经尿素处理的样品的读取值除以未经尿素处理的样品的读取值，乘以100(百分比结果)。

5.1.2用硫氰酸铵的亲和力测定

方法类似于前述免疫测定方法(5)，具有以下修改：在37 ℃样品孵育(100 ng的纯化单克隆抗体的克隆10和 2.0 ng 的纯化的单克隆抗体的克隆38)两小时后，样品经硫氰酸铵在37℃在以下浓度下处理30分钟：3 M、1.5 M、1.0 M、0.75 M、0.50 M、0.25 M和0.125M。未经硫氰酸铵处理的样品用于每个克隆株的控制。

在样品的光密度的读取之后，亲和力比率通过以下公式计算：AR(亲和力比率)=[(log50-logA) x (B-A)/log B-logA] + A；其中log50 = 1.70。A是最低的硫氰酸铵浓度，其吸光率减少低于50%，B是最高的硫氰酸铵浓度，其致使吸光率减少高于50%。

6.单克隆抗体的制备和纯化：

预先选定的克隆10和38的样品在加入1%的BSA的无血清培养基 (GIBCO VP-SFM) 的100mL小瓶中，在通入10% CO₂的炉中生长。悬浮液经离心处理，经0.22微米过滤器过滤，用SelectSure 蛋白A MAB树脂(GE)在高效液相色谱(HPLC)中纯化。抗体用pH7.0的1M Tris盐调至pH10.0，在PBS 0.5x的去离子水中透析。样品经冻干法处理，在去离子水中再次悬浮，用Lowry方法定量，在聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳来评价。

7.靶向识别

7.1体外PBP2a识别-免疫印迹

MRSA(CEB)菌株，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株、耐万古霉素的肠球菌(Enterococcus faecium)菌株，BL-21 DE3大肠杆菌菌株在生长指数期中生长。每个样本的一毫升经离心，并在迷你珠搅拌器(mini-Bead Beater device (Biospect Products))中经玻璃珠搅拌作用而细胞溶解，3次，每次30秒。每个样本的一部分在12%的变性聚丙烯酰胺的凝胶(SDS-PAGE)中电泳，蛋白稍后转至尼龙膜(Hybond N-BioRad)上。膜在包含10%的脱脂奶和1%的BSA(小牛血清)的磷酸缓冲液中，经温和搅拌两小时后封闭。该膜在PBS和(0.05%)吐温20中洗涤3次，在PBS中洗涤3次。然后，后者与以1:1的比例在PBS中稀释的抗PBP2a的单克隆抗体的悬浮物放置培养两小时。在培养后，膜如前所述洗涤，碱性磷酸酶以1:15,000的比率结合(鼠抗IgG抗体Sigma A3688)，培养90分钟。在这个时期后，再次在PBS中洗涤，使用碱性磷酸酶(Promega)的Western Blue酶底物显色。

7.2 在细菌表面的PBP2a识别—流式细胞术

MRSA(CEB)菌株或以固定期(ON)或以指数生长期生长。这个样品在1x的 PBS中洗涤，在0.6的DO₆₀₀ (~10⁸ 细菌/mL)中再次悬浮。这些后者用1mL(10⁸细菌)中离心，在0.5%BSA和1:10在正常血清(鼠/人)稀释液中再次悬浮。然后，样本在4℃孵育30分钟，然后，浓缩物(小球)在PBS中洗涤两次，在包含0.5%BSA和1:10,000的抗PBP2a的单克隆抗体的稀释液的100微升PBS中再次悬浮，在4℃培养30分钟。在这个步骤之后，样品如前所述再次洗涤，在100微升的PBS和0.5% BSA以及(1:1000)的PE(藻红蛋白)鼠抗Ig结合物的稀释液中再次悬浮，然后在黑暗处，4℃培养30分钟。然后，样品再次经洗涤，在包含2%的多聚甲醛的PBS中4℃，15分钟固定。在这个制备步骤后，样品在流式细胞仪中分析(Becton 和Dickinson - FACScalibur)。

8. 体外保护测试-最小抑制浓度的测定

MRSA菌株(CEB、Iberian、COL和CA)在指数增长期的生长在600 nm的光密度为0.5。所用的接种体调节至大约100，000个细菌。Müller Hinton肉汤，细菌的接种体，纯化的抗PBP2a单克隆抗体的生长数量加到检测试管或者24孔板中。该板或试管在37℃培养12小时。在这个时期之后，可在样品中观察到混浊的存在或不存在。最小抑制浓度是能够抑制细菌接种体生长(100,000细菌)的最小抗体浓度。

9.体内保护检测:

9.1. 致死剂量和MRSA菌株的LD₅₀的测定

根据Reed-Muench的方法(23)实施MRSA菌株(CEB, Iberian, WB79 CA, 和 COL)的致死剂量和LD₅₀的测定。8周大的雌性Balb/C鼠的几个组通过经腹腔途径接种增长的细菌剂量，观察7天。动物在这个时期存活下来的，就根据制定的动物福利准则施加安乐死。

9.2系统性感染和细菌肾脏定量检测

MRSA菌株(CEB, Iberian和WB79 CA)在指数生长期生长(DO₆₀₀ ~0.6)，用在DO₆₀₀ ~0.5中的1x 的无菌PBS内洗涤和悬浮，相应于大约为2 x 10⁸细菌。这个浓度通过稀释液和接种于包含10微克的苯甲异噁唑青霉素/mL BHI琼脂平板来计算。雌性8周大的Balb/C鼠在第一天接受一个400微克的纯化抗PBP2a的单克隆抗体的腹膜内剂量。在第六天，动物被施予安乐死，无菌地切除肾脏。然后，肾脏在1mL无菌的Luria肉汤成为均匀分布的微粒，成功地溶解在一系列10中。每个稀释液以一百微升接种于包含10微克/mL的苯甲异噁唑青霉素BHI琼脂平板上，在37℃培养24个小时，计算结果的克隆株，并计算所用的总的稀释液。

9.3. 存活率检测

MRSA菌株在前述相同的条件下生长，以预先建立的LD₅₀实施对于接种体的调整。雌性8周大的Balb/C鼠在第一天接受一个500微克的纯化抗PBP2a的单克隆抗体的腹膜内剂量。在接下来的一天内，这些动物加上控制组被一个大约2.5至6.0 x 10⁸的细菌的剂量经腹腔途径感染，根据每个菌株的LD₅₀，观察这些动物10天，幸存者被施予安乐死。

10. 抗PBP2a的单克隆抗体和万古霉素肾脏定量的体内保护性研究的比较

检测 I

四组雌性8周大的Balb/C鼠(每组4个动物)经腹腔途径接收6.0 x 10⁷个细菌的感染性剂量。接受纯化的单克隆抗体(MAB)、万古霉素、MAB+万古霉素的药剂和阴性控制组的动物，根据如下组别：

组1：MAB(400微克)(第一天)

组2：万古霉素(150微克，肌肉途径，12/12小时)

组3：万古霉素+MAB(350微克)(感染后一天)

组4：控制组

抗体和万古霉素的第一剂量在施给感染性药剂之后4个小时。根据前述，动物在第四天被施予安乐死，肾脏被无菌地切除，给予肾脏的定量鉴定。

检测II

与前述一个相同的方法实施这个检测，但是，给予更低的感染性药剂(7.0 x 10⁶个细菌)，组1经500微克的纯化的单克隆抗体处理；组2经万古霉素(150微克，肌肉途径，12/12小时；5个剂量)处理；组3经万古霉素+500微克的单克隆抗体处理；组4为控制组(不经处理的动物)。

11. 抗PBP2a 的单克隆抗体的轻链和重链的互补决定区域(CDRs)的识别

11.1. 从杂交瘤细胞中对于mRNA的提取

产生单克隆抗体的杂交瘤的细胞培养基的10mL离心物(小球)使用RNeasy Minikit 试剂盒(Qiagen)进行mRNA的提取。

11.2. cDNA 的获取

逆转录酶反应：按照操作指南，使用M-MLV逆转录酶试剂盒(Invitrogen)获取互补DNA。

11.3. 经聚合酶的链式反应(PCR)的VH和VL链的扩增

实施反应是使用以下的启动序列(引物)。

11.4.抗PBP2a单克隆抗体的轻链和重链的测序

测序步骤：

I. 扩增

使用在先启动序列实施这个步骤，由SEQ ID NO: 18至SEQ ID NO: 39限定。

II. 测序

使用ABI Prism 3100基因分析仪(Genetic Analyser (Hitachi))的仪器。

11.5. CDR的轻链和重链的序列分析和识别

获得的DNA序列在DNA星计划(DNA Star program)的帮助下进行分析，并翻译成氨基酸序列(ExPASy site - Translate program)(ExPASy site-翻译程序)，通过Kabat’s和Chotia’s的运算法则作为后继的分析，以识别CDRs的轻链和重链。

12.(经表面质粒回响(surface plasmon resonance)[SPR]［Biacore］方法的克隆株10和克隆株38)单克隆抗体的联合常数和解离常数的测定

使用Biacore X? (Biacore AB, Uppsala, Sweden)仪器中的CM-5传感器进行SPR测量。由GE健康关注公司获取结合试剂和HBS-EP缓冲液(10 mM hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P20 [Tween 0, pH 7.4])。

实施例2

1 鼠抗PBP2a单克隆抗体的获取

根据前述的免疫方法对于一组动物实施免疫。通过ELISA评价的结果描述于图1中。

在融合程度后(90-LATAM的融合)，从96孔板(杂交瘤)的悬浮物经由ELISA检测进行分析。从这个总量中，选取五个最好的样品，扩大细胞(克隆)。然后，再次，得到的悬浮物由ELISA方法得以分析。通过抗纯化重组蛋白(PBP2a)r 免疫印迹并确认阳性样品，以确认由ELISA获得的结果。最后的结果在表I中。

图1显示接种动物的血清中产生抗PBP2a的抗体的酶免疫检测(ELISA)获取的结果。每个跳跃的波对应于接种动物的1:100稀释的血清。阳性控制血清是有角的柱[

]。每个跳跃的第一个柱：预免疫血清；第二柱：第四次免疫后的血清；和第三个柱：第五次免疫后的血清。

表I：融合90的克隆株：最终平衡

从选取的克隆中，77-38克隆株进行再克隆过程，以确认分泌单克隆抗体的细胞稳定性。从50个分析孔中，由ELISA检测显示所有均呈现阳性的结果。这些克隆株经扩大，并在LATAM (单克隆抗体技术实验室Laboratory of monoclonal antibody technology)设备的液氮中保存。

2 单克隆抗体的生长、产生和纯化

根据前述的程序进行标准化。得到的生产率是大约每100mL的悬浮物在纯化程序后得到大约4毫克的单克隆抗体。获取的结果如下可见。

参见图2，我们可以看见有粗样品和经纯化的样品的聚丙烯酰胺凝胶。这个图2显示经MAb SelectSure树脂的高效液相色谱柱(HPLC)纯化前(柱1)和纯化后(柱2)的悬浮样品的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。柱3至9对应于所获取的纯化样品片段。箭头指明大约150kDa的大小。

3 单克隆抗体的功能特性

3.1体外PBP2a免疫印迹识别

为了调查在病原菌(PBP2a)的靶位的抗体识别能力，用表征PBP2a的细菌(CEB和COL MRSA)、MSSA(甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌)菌株(不表征PBP2a)、耐万古霉素肠球菌菌株(不表征PBP5)、与β内酰胺抗生素(与PBP2a同源的)亲和力低的转肽酶、大肠杆菌菌株(其产生了重组蛋白)进行免疫印迹检测，其中大肠杆菌菌株作为阴性控制。获取的结果显示抗体能够识别在MRSA和肠球菌菌株中具有大约76kDa分子量的蛋白，对应于PBP2a和PBP5的大小。甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(PBP2a阴性的)的蛋白和大肠杆菌菌株的蛋白均未见到单克隆抗体的反应性。结果在图3中可见(抗MRSA和MSSA的免疫印迹)。

MRSA和MSSA溶菌产物与含抗PBP2a单克隆抗体的悬浮物的免疫印迹检测的结果在图3中显示。

1 分子量标记(Kaleidoscope)；

2 在指数生长期生长的MSSA样品；

3和4在指数生长期生长的MRSA样品；

5在静止生长期生长(整晚)的MSSA；和

6和7在静止生长期生长的MRSA样品。左侧箭头指向PBP2a的分子量。

3.2 PBP2a在细胞表面的识别-流式细胞术

流式细胞检测的目的是通过单克隆抗体确认靶向识别天然形式的细菌的能力。在前述的检测(免疫印迹法)中，我们观察到蛋白的靶向识别经过变性的过程，其发生在蛋白通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离过程中。我们再次分析在指数生长期和静止生长期的阴性控制菌株(MSSA, PBP2a阴性)和MRSA菌株(CEB)。得到的结果显示抗体能够在前述两种条件下均靶向识别细菌表面。金黄色葡萄球菌表面蛋白A的存在不能够抑制抗体与PBP2a的结合。得到的结果可见于图4中。

图4显示MRSA(CEB)和MSSA细菌与抗PBP2a的单克隆抗体培养并由藻红蛋白(PE)标记的流式细胞测量术的结果。(1)为MSSA细菌；(2)为在静止生长期的MRSA；(3)为在指数生长期的MRSA。对应于经荧光共轭物标记的细胞的增长，MRSA总体呈现右移。

4 抗PBP2a的单克隆抗体给予的保护的评估

4.1体外保护检测

最小抑制浓度(MIC)的测定

这些检测旨在评价抗体在封闭系统中立即结合到靶点的能力。作为治疗的最终选择的单克隆抗体，阳性结果非常显著，因为它们意味着抗体能够靶向识别，在不需要宿主免疫系统的帮助下封闭细菌生长，即不需要宿主先天的和后天调整的免疫系统的结合作用，如互补活性和调理机制。评价CEB、COL和伊比利亚(Iberian) MRSA菌株，其中类似的MIC值(大约500微克)可见于评价条件中。这些数据表明不论不同的MRSA菌株的基因背景，需要用于封闭生长的抗体的确并不相同。这些结果可见于图5中。

图5显示抗PBP2a的纯化单克隆抗体和万古霉素对于不同的MRSA菌株的10⁵细菌的接种体的检测体外保护(MIC-最小抑制浓度)。未见混浊就表明在分析条件下无细菌生长。

1A: CEB MRSA (巴西流行克隆株) + 250 mg 的抗体；

2A: CEB MRSA + 500 mg 的抗体；

3A: CEB MRSA + 750 mg的抗体；

4A 和6A: CEB MRSA 菌株的阴性控制。

1B: COL MRSA + 250 mg的抗体；

2B: COL MRSA + 500 mg的抗体；

3B: COL MRSA + 750 mg的抗体；

4B 和6B: COL MRSA菌株的阴性控制。

1C: 伊比利亚(Iberian)MRSA (欧洲流行克隆株- EEC) + 250 mg 的抗体；

2C: EEC MRSA + 500 mg的抗体；

3C: EEC MRSA + 750 mg 的抗体；

4C和6C: EEC MRSA菌株的阴性控制。

1D: CEB MRSA + 150 mg的万古霉素；

2D: CEB MRSA + 300 mg的万古霉素；

3D: CEB MRSA + 500 mg的万古霉素；

4D: CEB MRSA + 750 mg的万古霉素；

5D和6D: 阴性控制。

4.2. 体内保护力的检测

4.2.1. CEB、Iberian、WB79 CA和COL MRSA菌株的致死剂量和亚致死剂量的确定:

为了评价体内保护力的作用，这些检测是必需的，在两个已用模型中—经亚致死剂量导致的肾脏定量，和更大的细菌接种体的系统性感染后的存活率检测—能够导致大约50%的动物死亡(LD₅₀)。基于施药的便利性以及无损失，所选途径为腹膜内给药。经修改的Reed-Muench方法用于实施这种检测，每个条件两个动物(在生长浓度的感染细菌剂量)用于确定LD₅₀和亚致死剂量，检测三个不同的剂量，一旦我们预先知晓金黄色葡萄球菌COL MRSA菌株的平均致死剂量，黄色葡萄球菌COL MRSA菌株是第一个已基因组测序的MRSA克隆株，就可作为研究这个病原菌的参考菌株。然而，它显示出很小的毒性，相对于其它导致动物感染的MRSA克隆株需要较高的感染剂量。因此，它并没有用在这个保护力的检测中。

4.2.2. 经亚致死剂量的系统性感染后的肾脏保护力

使用感染后的肾脏定量模型，这些检测是以在系统性感染后重要器官(肾脏)细菌存在的减少来评价抗体的能力。从不同的基因背景中来的有毒MRSA菌株的三个独立检测达到减少数量达到高于3 log (1000 倍)。在这些检测中，动物受到500微克抗体的预先剂量。由更低的抗体剂量(250微克)给予的保护力在有CA-MRSA菌株的检测中评价，其中观察到细菌数量的减少，但低于在500微克剂量中得到的保护力。这些结果可在图6A、6B和6C中可见。

图6A显示遭受亚致死剂量的MRSA CEB菌株的系统性感染的动物，经抗PBP2a的单克隆抗体处理的和未经抗PBP2a的单克隆抗体处理的肾脏定量测定的结果。在水平条带部分：是每个未经处理的动物肾脏中分离的细菌浓度的记录。在方格模式中：是经抗体处理的每个动物的肾脏分离的细菌数量的记录。细菌定量测定：控制：C1为2000个细菌；C2：29，000个细菌：C3：220，000个细菌：C4：52，000个细菌(平均为75，750个细菌)。经处理的(受保护的)动物：P1：20个细菌；P2、P3和P4：10个细菌(平均12.5个细菌)。从经处理的动物中恢复的细菌数量的减少相比于未经处理的动物：6060倍。

图6B显示遭受亚致死剂量的伊比利亚(Iberian)MRSA菌株(欧洲流行克隆株)的系统性感染的动物，经抗PBP2a的单克隆抗体处理的和未经抗PBP2a的单克隆抗体处理的肾脏定量测定的结果。在水平条带部分：是每个未经处理的动物肾脏中分离的细菌浓度的记录。在大方格模式中：是经抗体处理的每个动物的肾脏分离的细菌数量的记录。细菌定量测定：控制：C1为210,000个细菌；C2：44，000个细菌：C3：300，000个细菌：C4：290，000个细菌(平均为211，000个细菌)。经处理的(受保护的)动物：P1：80个细菌；P2：200个细菌；P3：10个细菌；和P4：60个细菌(平均87.5个细菌)。从经处理的动物中恢复的细菌数量的减少相比于未经处理的动物：2420倍。

图6C显示遭受亚致死剂量的WB79 CA-MRSA菌株(巴西人群菌株)的系统性感染的动物，经抗PBP2a的单克隆抗体处理的和未经抗PBP2a的单克隆抗体处理的肾脏定量测定的结果。五个第一条带(在xx，水平跳跃波、和大方格模式中)：是每个未经处理的动物肾脏中分离的细菌浓度的记录。第一条带(在xx中)：相对于在安乐死之前死亡的动物的评价。条带6、条带7、条带8和条带9(在水平跳跃波和方格模式中)：经250mg的抗PBP2a的单克隆抗体处理的动物肾脏中分离的细菌数量的记录。条带10、条带11、条带12和条带12(在三角形中)：经500mg的抗体处理的每个动物肾脏中分离的细菌数量的记录。方格条带(第5个、第9个和第13个条带中)表明分别得到的平均数。细菌定量测定：控制：C1为650,000个细菌；C2：26，000个细菌：C3：17，000个细菌：C4：500，000个细菌(死亡动物的测量值)(平均为231，000个细菌)。经250mg的抗体处理的动物：P1：0个细菌；P2：5，400个细菌；P3：830个细菌；和P4：10个细菌(平均1，560个细菌)。经500mg抗体处理过的动物：P1：80个细菌；P2：0个细菌；P3：210个细菌；P4：80个细菌(平均92.5), 相比于未经处理的动物,经250mg抗体处理的动物中恢复的细菌数量的减少：149倍。经500mg处理的动物：2，497倍。

4.2.3. 存活率检测

在这个检测型中，我们评价由能够导致50%或更多的动物(LD₅₀)死亡的细菌负载量感染后的动物从抗体中获得的保护力。测量在肾脏定量测定中抗这三个菌株的保护力。在这三个独立检测中，已观察到经抗MRSA的单克隆抗体处理的动物(i)存活时间和(ii)存活率的显著减少。

在CEB MRSA菌株的检测中，经处理的70%的动物存活下来，相比于控制组(未经处理的)的仅为10%。在Iberian MRSA菌株的检测中，获得的结果是相似的，经处理的动物为60%的保护力，而控制组为100%的死亡率。在CA MRSA菌株的检测中，可见100%的保护力，相比于控制组的70%。这些结果均在图7A、7B和7C中可见。

图7A显示经腹腔途径(LD₅₀)给予2.3 x 10⁸ 个(CEB MRSA)细菌剂量而感染后的动物经处理的(未受保护的)和未经处理的(控制组)动物的存活率曲线。

图7B显示经腹腔途径(~LD₅₀)给予4.2 x 10⁸ 个(Iberian MRSA)细菌剂量而感染后的动物经处理的(未受保护的)和未经处理的(控制组)动物的存活率曲线。

图7C显示经腹腔途径(~LD₅₀)给予1.1 x 10⁹ 个(WB79 CA-MRSA)细菌剂量而感染后的动物经处理的(未受保护的)和未经处理的(控制组)动物的存活率曲线。

4.2.4. 单克隆抗体与万古霉素相比给予的保护力的比较研究

万古霉素是处理由MRSA导致的急性感染的首选抗生素，关于保护力的比较性研究在一个与以往不同的模型中实施。在这个研究中，动物遭受感染，并在感染的整四个小时之后即给予抗生素或者单克隆抗体。这个研究在三个不同的组中实施：一个经万古霉素处理、另一个经单克隆抗体处理、第三个同时给予抗生素+抗体的联合给药。万古霉素的剂量经调节，并以与给人施药的类似的方式给药(每12小时500mg)。

得到的结果显示，在感染发生后三天经抗生素或者抗体处理的动物的肾脏内存在的细菌数量减少程度大约15倍。然而，在接受抗生素和抗体处理的动物组中可见到4617倍的减少。

基于这些结果，我们可以得出结论，由抗体药剂获得的保护相应于5个万古霉素剂量，并且万古霉素和抗体的同时联合用药在减少受感染动物肾脏内观察到的细菌量来说，是非常有效的。这个研究再次以略微减少的感染剂量重复，为了我们能够更好地观察到抗MRSA单克隆抗体单独使用和与万古霉素联合使用的保护作用(参见图8)。

在更低感染剂量的第二次检测的实施中，得到的结果证实了最初的结论。由单克隆抗体获得的保护作用导致89倍的减少，其高于经5个万古霉素剂量(35倍的减少)的处理而获得的保护力。然而，最为显著的减少结果在经抗体+万古霉素治疗的组中可见，导致450倍的减少。

图8A显示由6.0 x 10⁷(CEB MRSA)个细菌感染后的动物，经抗PBP2a单克隆抗体处理、万古霉素处理、和抗体+万古霉素联合给药处理以及未处理的动物肾脏中细菌数量。治疗处理开始于感染后4个小时。万古霉素每12小时给药(5个剂量)。柱1、柱2、柱3、柱4和柱5(跳跃波)：从未经处理的动物(控制组)恢复的细菌浓度的记录。C1：7,000,000；C2：295,000；C3：380,000；C4：3,200,000 (平均：2,718,750个细菌)。柱6、柱7、柱8、柱9和柱10 (方格模式)：经 400mg的抗PBP2a的单克隆抗体处理的动物中恢复的细菌浓度的记录。P1：4,200；P2：310,000；P3：330,000；P4：90,000 (平均183,550个细菌)。柱11、12、13、14和 15 (球状)：动物经万古霉素处理。P1：110,000； P2: 58,000; P3: 500,000; P4: 21,000 (平均172,250个细菌). 柱16, 17, 18, 19和 20 (三角形)：经抗体(300 mg) + 万古霉素处理的动物中恢复的细菌浓度的记录。P1: 1,100; P2: 700; P3: 450; P4: 90 (平均585个细菌)。

图8B显示由7.0 x 10⁶(CEB MRSA)个细菌感染后的动物，经抗PBP2a的单克隆抗体(柱7至12)、万古霉素(柱13至18)、抗体+万古霉素联合给药(柱19至24) 和未经处理的(柱1至6)动物肾脏的细菌数量。治疗处理从感染后4个小时开始。万古霉素每12小时给药(5个剂量)。柱1至6：未处理的动物(控制组)中恢复的细菌浓度的记录。C1: 6,000; C2: 1,000; C3: 500; C4: 118,000; 和C5: 1,000 (平均25,220个细菌)。柱7至12：经500 mg的抗PBP2a的单克隆抗体处理的动物中恢复的细菌浓度的记录。MB1: 450; MB2: 200; MB3: 100; MB4: 20; MB5:0(平均284个细菌)。柱13至18：经万古霉素处理的动物。VC1: 100; VC2: 700; VC3: 0; VC4: 0; VC5: 2800 (平均720个细菌)。柱19至24：由抗体(500 mg) +万古霉素联合处理的动物中恢复的细菌浓度的记录。MBV1: 130; MBV2: 20; MBV3: 10; MBV4: 80; MBV5: 20 (平均56 个细菌)。

5. 亲和力测定

单克隆抗体克隆株10和38的亲和力测定的结果

尿中亲和力测定的方法：

克隆株(clone) 10: 1.03/1.46 (读取经处理的/未经处理的DOs) = 70.5%；

克隆株(clone)38: 1.00/1.21 = 82.6%。

硫氰酸铵的方法的亲和力测定：

克隆株(clone)10 (DOs):

控制组: 1.12。

硫氰酸盐处理过的样品(Thiocyanate-treated samples)：

2 M = 0.046; 1.5 M = 0,047; 1 M = 0.107; 0.75 M = 0.483; 0.5 M = 0.602; 0.375 M = 0.684；

亲和力比率：2.47；

克隆株(clone) 38 (DOs):

控制组: 1.22。

硫氰酸盐处理过的样品(Thiocyanate-treated samples)：

2M = 0.056; 1.5M = 0.062; 1M = 0.129; 0.75M = 0.648; 0.5M = 0.758; 0.375 M = 0.793；

亲和力比率：4.40。

可见在两个测试中，克隆株38的亲和力比率都高于克隆株10的亲和力比率。进一步地，根据两个方法，为了达到DO接近1.0，确认需要使用比克隆株38的抗体多50倍多的克隆株10的抗体。

6.单克隆抗体的联合常数和解离常数的测定(经表面质粒回应方法(surface plasmon resonance method [SPR] [BIAcore])克隆株10和克隆株38)

SPR方法获得的结果证实抗体亲和力的初步结果，其中克隆株38再次显示高于克隆株10的亲和力。根据表II中所示的数据，我们发现克隆株38的亲和力显示比克隆株10高450倍。

这个亲和力主要由于它的更高的联合率，其中比克隆株10高约100倍。基于克隆株38的非常高的亲和力，它测得的参数接近于设备的测量阈。但是，基于试验的计划和实施的关注，我们获得的使用Langmuir’s模型的试验数据的卓越的调整，其表明获得的数据是可信的。

图9显示重组PBP2a(抗原)和单克隆抗体克隆株38(图9A)和克隆株10(图9B)之间的相互作用。烟熏状曲线代表根据正确的关键点的浓度的SPR数据。所有样品均在复制中分析，每个曲线的1:1 的Langmuir’s理论模型是在每个曲线下显示成黑色。应答单元在垂直轴中体现，时间以秒为单位在水平轴中体现。最靠近水平轴的线代表了每个样本的基础线(阴性控制)。

表II

抗原(PBP2a)和单克隆抗体的克隆株10和克隆株38之间的解离常数和交互常数

Figure 201080043628X100002DEST_PATH_IMAGE004

7. 抗PBP2a的单克隆抗体的轻链和重链的互补决定区域(CDRs)的确定

在生产所用的抗体(克隆株38)的克隆株的杂交瘤细胞中的mRNA提取之后，实施获取cDNA，用不同的轻链和重链等位基因的这个材料实施PCR反应。在PCR反应中使用相同的启动序列(由SEQ ID NO: 18至SEQ ID NO: 39限定)获取的材料有利于测序。轻链391和重链310在三个不同的测序中确定。应用Kabat’s 和Chotia’s算法，我们获得轻链和重链的CDRs的确认，其是本申请所附的权利要求的目标。

我们将在以下呈现CDRs的轻链和重链的序列。

SEQ ID NO: 6-CDR1轻链氨基酸

RSSQSIGHSNGNTYLE

SEQ ID NO: 7-CDR2轻链氨基酸

KVSNRFS

SEQ ID NO: 8-CDR3轻链氨基酸

FQGSYVPLT

SEQ ID NO: 9-CDR1轻链DNA

cgcagcagccagagcattggccatagcaacggcaacacctatctggaa

SEQ ID NO: 10-CDR2轻链 DNA

aaagtgagcaaccgctttagc

SEQ ID NO: 11-CDR3轻链DNA

tttcagggcagctatgtgccgctgacc

SEQ ID N.: 12-CDR1 重链氨基酸.

GFSITSSSSCWH

SEQ ID NO: 13-CDR2重链氨基酸

RICYEGSISYSPSLKS

SEQ ID NO: 14-CDR3重链氨基酸

ENHDWFFDV

SEQ ID NO: 15-CDR1 重链 DNA

ggctttagcattaccagcagcagcagctgctggcat

SEQ ID NO: 16-CDR2重链 DNA

cgcatttgctatgaaggcagcattagctatagcccgagcctgaaaagc

SEQ ID NO: 17-CDR3 重链DNA

gaaaaccatgattggttttttgatgtg

完整数据

实施进一步的其它检测，进行本发明的发展。这些将在以下通过实施例阐明。

实施例3

使用CEB MRSA菌株的第二项研究，用在实施例1，第7.2条中描述的相同方法，在每次洗涤后，辅助以两个脉冲的旋涡搅动，每次15秒，以帮助金黄色葡萄球菌团块的解离，并且增加PBP2a暴露于抗体之下的数量。

在控制组样品(i纯的细菌，不接触单克隆抗体；和ii纯的细菌加上FITC或者PE标记物)和经单克隆抗体处理的样品中，经可分析用的PE或FITC标记后，检测标记物FITC(荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanate))和PE(藻红蛋白)。在FACsalibur仪中以线性模式读取。

图10是经FITC标记的抗PBP2a的抗体存在下MRSA样品的流式细胞仪的分析图表。曲线(x)对应于非标记样品，曲线(y)对应于标记样品。

得到的结果显示大约22%的标记群落经仪器检测，确定抗PBP2a抗体对于在细菌表面存在的靶点(PBP2a)的识别(图10)。

实施例4

发明人还研究了由耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的抗PBP2a的单克隆抗体具有抗肠球菌而给予的保护作用。根据在此前描述的内容，抗体识别存在于肠球菌中的蛋白，可能是PBP5-一种对于β内酰胺亲和力低的转肽酶，存在于所有的肠球菌菌株中，具有大约76kDa (237个氨基酸)的分子量。根据以下的相关基因序列(ClustalW)的比较，这个酶呈现与MRSA的PBP2a的同源性。

PBP5Efas MERSNRNKKSSKNPLILGVSALVLIAAAVGGYYAYSQWQAKQELAEAKKTATTFLNVLSK 60

PBP5efam -----KHGKNRTGAYIAG--AVILIAAAGGGYFYYQHYQETQAVEAGEKTVEQFVQALNK 53

PBP2a ------------MKKIKIVPLILIVVVVGFGIYFYASKDKEINNTIDAIEDKNFKQVYKD 48

* ::::... * : * : * :. ..

PBP5Efas QEFDKLPSVVQEASLKKNGYDTKSVVEKYQAIYSGIQAEGVKASDVQVKKAKDNQYTFTY 120

PBP5efam GDYNKAAEMTSKKAANKSALSEKEILDKYQNIYGAADVKGLQISNLKVDKKDDSTYSFSY 113

PBP2a SSY-----------ISKSDNGEVEMTERPIKIYNSLGVKDINIQDRKIKKVSKNKKRVDA 97

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PBP5Efas KLSMSTPLGEMKDLSYQSSIAKKGDTYQIAWKPSLIFPDMSGNDKISIQVDNAKRGEIVD 180

PBP5efam KAKMNTSLGELKDLSYKGTLDRNDGQTTINWQPNLVFPEMEGNDKVSLTTQEAARGNIID 173

PBP2a QYKIKTNYGNIDRN-VQFNFVKEDGMWKLDWDHSVIIPGMQKDQSIHIENLKSERGKILD 156

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PBP5Efas RNGSGLAINKVFDEVGVVPGKLGSGAEKTANIKAFSDKFGVSVDEIN---QKLSQGWVQA 237

PBP5efam RNGEPLATTGKLKQLGVVPSKLGDGDEKTANIKAIASSFDLTEDAIN---QAISQSWVQP 230

PBP2a RNNVELANTGTHMRLGIVPKNVS-----KKDYKAIAKELSISEDYINNKWIKIGYKMIPS 211

**. ** . .:*:** ::. . : **::..:.:: * ** :. : .

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从具有MRSA PBP2A的粪肠球菌(enterococci E. faecalis (Efas))和屡肠球菌(enterococci E. faecium (Efam))中的PBP5对应的序列进行比较。标记的序列(粗体-PBP5；下划线-PBP2a)对应于产生单克隆抗体的所用的PBP2a区域。对应于酶活性中心的氨基酸以斜体标记。

这样，体外的保护作用的检测，致死剂量和LD₅₀的测定，体内的检测(肾脏定量的亚致死剂量和致死剂量的存活率检测)是在鼠模型(Balb/C 鼠)中用肠球菌菌株实施，如前述用MRSA所实施的方式。这些结果在相应的报告中可见。

1.1. 体外的保护作用的检测

这个检测的目的是评价抗VRE肠球菌菌株的抗体给予的体外保护作用。

体外保护作用检测(MIC)，克隆株38纯化的单克隆抗体 (90/DA5/CB5/AA3 hib 77) 抗肠球菌临床菌株(Enterococcus f. clinical strain (VRE)), Richet实验室。

条件:

样品:悬浮物经SelecSure MAB树脂的HPLC纯化，析出，冻干；

抗体定量测定 (Lowry’s法): 3.5 mg/mL；

接种体: VRE菌株；

预接种体: 在20 mL的Lb和万古霉素(10 mg/mL)的 1 VRE 群体，在37℃, 160 rpm；

接种体: 400 mL在20 mL的Lb中的预接种体, 200-mL erlenmayer, 37℃, 160 rpm；

在7个小时后读取DO_600nm为: 0.7；

定量测定: 5.5 x 10⁸ 个细菌/mL。

检测条件:

接种体: 5.5 x 10⁵ bacteria；

抗体浓度：300, 400, 500, 600,和700 mg 的抗体；

培养基: 1 mL of Luria肉汤；

细胞培养皿, 24孔；

阳性对照：Luria肉汤+细菌接种体；

阴性对照l: Luria 肉汤；

孵育: 18个小时, 37℃。

图11显示由抗体给予的保护作用的评价结果。在图11中，我们具有：

A. 300 mg的抗体；

B. 400 mg 的抗体；

C. 500 mg的抗体；

D. 600 mg的抗体；

E. 阴性对照；

F. 阳性对照；

G. 700 mg的抗体。

1.2.经腹腔途径进入的耐万古霉素的屎肠球菌(Enterococcus faecium)的LD₅₀和致死剂量的测定

方案:

雌性7周大的Balb/C动物，平均体重为 20克；

第1天–预接种：在10 mL 的Lb的肉汤和万古霉素(10 mg/mL)、50 mL的Falkow中的1 VRE菌株群，在37℃生长, 160 rpm；

第2天–接种: 1 mL的预接种体在50 mL的Lb肉汤/万古霉素(250-mL erlenmayer) – 4小瓶, 37℃，160 rpm，生长直到OD_600nm = 0.80；

离心10分钟，4000 rpm，悬浮在1x 的无菌的PBS中, OD 1.2。

定量测定: 2.1 x 10⁸ 个细菌/mL

A. 60 微升 (1.5 x 10⁷)；

B. 300微升(6.5 x 10⁷)；

C. 900微升(减少至300微升/剂) (1.5 x 10⁸)；

D. 4.5 mL (减少至300微升/剂) (6.5 x 10⁸)；

E. 9.0 mL (1.2 x 10⁹个细菌) (减少至 300微升/剂)；

F. 45.0 mL (6.5 x 10⁹个细菌) 减少至300微升/剂)；

检测的第2天至第10天实施对于动物的观察。

结果显示在图12中，它包括致死剂量是1.2 x 10⁹ 个细菌， LD₅₀为6.5 x 10⁸个细菌。

在第7天存活的动物的肾脏细菌定量测定：

A (1.5 x 10⁷): 无细菌生长；

B (6.5 x 10⁷): 无细菌生长；

C (1.5 x 10⁸): 3100细菌；

D (6.5 x 10⁸): 2.8 x 104细菌。

1.3. 体内的保护检测-存活率检测-致死剂量，在鼠模型中腹腔途径给药导致的系统性感染

这个检测的目的是评价用抗PBP2a单克隆抗体对抗由致死剂量的屎肠球菌菌株( Enterococcus faecium (VRE) )导致的系统性感染的体内的保护作用。

1. 抗体 (血清培养基中的细胞培养的悬浮物中纯化的)

–析出和冻干纯化的样品 (HPLC SelecSure MAB), 在使用前重新悬浮和过滤。

–定量测定(Lowry’s法): 1.0 mg/mL。

2. 鼠模型：雌性, 8周大的Balb/C动物，体重从23 至25克。

3. 方案:

组A (6 个动物): 650 mg 的抗体 (350 mg + 300 mg)

级B (6个动物): 控制组 (碱给药)

4. 细菌接种体的制备:

VRE菌株:

预接种，第1天, 10 mL的BHI肉汤和10 mg/mL的万古霉素，ON, 37℃, 160 rpm；

接种, 第3天: 300 mL的预接种体在30 mL的BHI肉汤和万古霉素，DO₆₀₀为1.31, 离心10 分钟, 4,000 rpm,悬浮于无菌的0.5x PBS, 调至OD = 1.10, 定量测定的稀释液和平板(2.0 x 10⁸ 个细菌/mL); 接种: 12 mL, 离心悬浮于300 mL, IP途径 (~2.2 x 10⁹个细菌)。

时间表:

第1天: 抗体的IP接种 (350 mg)；

第2天: 抗体的IP接种(300 mg), 下午的系统性感染 (IP, 250 mL的细菌溶液- 2.2 x 10⁹ 个细菌)；

第2至13天：动物观察；

结果显示在图13中。仅2个经处理的动物死亡(66.6% 的保护作用)。控制组的所有动物均在第二天死亡。

1.4. 体内保护作用的检测- 耐万古霉素的屎肠球菌在鼠模型中经腹腔途径导致的系统性感染

目的是在于评价在肠球菌，屎肠球菌菌株(E. faecium (VRE) strain)导致的系统性感染的方面，抗PBP2a和PBP5的单克隆抗体的体外保护作用的效力。

检测:

1. 抗体 (血清培养基中细胞培养的悬浮物中纯化的)

–纯化的样品析出、冻干和再悬浮(AffiPrep 蛋白A Biorad/HPLC SelecSure MAB)；

–定量测定 (Lowry’s法): 1.5 mg/mL；

2.鼠模型:雌性，8周大的Balb/C动物,体重从19至23克。

3. 方案:

组 A (4 个动物): 500 微克的抗体(在2个月内，第1天，第2天)；

组B (4个动物): 未经保护的控制组。

4. 细菌接种体的制备:

Iberian MRSA 菌株:

预接种, 10 mL的Lb肉汤ON, 37℃, 120 rpm

接种: 在20 mL 的Lb肉汤中的 200 微升的预接种体, DO₆₀₀ 为0.80, 离心10分钟，4,000 rpm, 在0.5x的无菌 PBS中再悬浮,调至 OD = 0.51, 定量测定的稀释液和平板(2.4 x 10⁸ 个细菌/mL)；接种体: 500微升, IP途径(2.4 x 10⁸个细菌)。

时间表:

第1天: 250 微克的抗体经腹腔途径接种；

第2天: 250 微克的抗体经腹腔途径接种，并且系统性感染(腹腔内，500微克的细菌溶液)；

第6天: 安乐死，在肾脏内的细菌定量测定。

基于上述结果，我们可以明确如下：

体外保护作用的检测-最小抑制浓度的测定：

总量700微克的抗体能够封闭550,000个细菌的生长。这些值高于从MRSA菌株中得到的MIC，其大约为500微克。

体内保护作用的检测：

体内保护作用的测定-在鼠模型中给予致死剂量的耐万古霉素的屎肠球菌经腹腔途径的系统性感染

动物接受500微克的单克隆抗体，腹腔途径(IP)，遭受系统性感染，IP途径，具有2.4x 10⁸的细菌。第四天后，它们接受安乐死，切下肾脏作细菌定量测定。经处理的动物呈现平均87.5个细菌/个动物，当控制组(未经处理的感染动物)呈现平均为211,000个的细菌/个动物。

致死剂量施药的存活率测定

动物接受650微克的单克隆抗体(IP途径)，遭受系统性感染，每天观察，观察10天。控制组(未经处理的)动物在感染后的第二天死亡；经处理的动物(6)中的两个在第二天死亡；其它动物仍然活着直到试验结束。存活率达到66.6%。

因此，我们已经证实MRSA的抗PBPa的单克隆抗体显示出给予抗肠球菌的交叉保护。然而，给予保护作用所需的剂量高于在类似的条件下用以抗MRSA的剂量。这可能是由于抗体识别PBP5的能力低于其已被开发的识别PBP2a的相同的效价。

因此，在此描述的当前发明-抗PBP2A的单克隆抗体，能够特异性地结合PBP2a和同源序列-具有携带这种蛋白或者类似物质的细菌(MRSA、MRSE、和肠球菌和任何其它具有同源于PBP2a的蛋白的病原菌)导致感染的能力。

值得强调的是，一旦这些感染成为全球问题时，实施的对抗主要已知的流行的MRSA克隆株的检测，本发明的产品可在由这种病原菌导致的感染的任何方面进行应用。

本发明人的技术领域的相关文献，在当前说明性报告中引用，以下列出。

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SEQUENCE LISTING

<110> 奥斯瓦尔多.克鲁斯基金会

奥斯瓦尔多.克鲁斯基金会

<120> 单克隆抗体

<130> P1704

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 668

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> PBP2a氨基酸序列

<400> 1

Met Lys Lys Ile Lys Ile Val Pro Leu Ile Leu Ile Val Val Val Val

1 5 10 15

Gly Phe Gly Ile Tyr Phe Tyr Ala Ser Lys Asp Lys Glu Ile Asn Asn

20 25 30

Thr Ile Asp Ala Ile Glu Asp Lys Asn Phe Lys Gln Val Tyr Lys Asp

35 40 45

Ser Ser Tyr Ile Ser Lys Ser Asp Asn Gly Glu Val Glu Met Thr Glu

50 55 60

Arg Pro Ile Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Val Lys Asp Ile Asn Ile

65 70 75 80

Gln Asp Arg Lys Ile Lys Lys Val Ser Lys Asn Lys Lys Arg Val Asp

85 90 95

Ala Gln Tyr Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Gly Asn Ile Asp Arg Asn Val

100 105 110

Gln Phe Asn Phe Val Lys Glu Asp Gly Met Trp Lys Leu Asp Trp Asp

115 120 125

His Ser Val Ile Ile Pro Gly Met Gln Lys Asp Gln Ser Ile His Ile

130 135 140

Glu Asn Leu Lys Ser Glu Arg Gly Lys Ile Leu Asp Arg Asn Asn Val

145 150 155 160

Glu Leu Ala Asn Thr Gly Thr Ala Tyr Glu Ile Gly Ile Val Pro Lys

165 170 175

Asn Val Ser Lys Lys Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Lys Glu Leu Ser Ile

180 185 190

Ser Glu Asp Tyr Ile Lys Gln Gln Met Asp Gln Asn Trp Val Gln Asp

195 200 205

Asp Thr Phe Val Pro Leu Lys Thr Val Lys Lys Met Asp Glu Tyr Leu

210 215 220

Arg Asp Phe Ala Lys Lys Phe His Leu Thr Thr Asn Glu Thr Glu Ser

225 230 235 240

Arg Asn Tyr Pro Leu Gly Lys Ala Thr Ser His Leu Leu Gly Tyr Val

245 250 255

Gly Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Lys Gln Lys Glu Tyr Lys Gly Tyr

260 265 270

Lys Asp Asp Ala Val Ile Gly Lys Lys Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Asp

275 280 285

Lys Lys Leu Gln His Glu Asp Gly Tyr Arg Val Thr Ile Val Asp Asp

290 295 300

Asn Ser Asn Thr Ile Ala His Thr Leu Ile Glu Lys Lys Lys Lys Asp

305 310 315 320

Gly Lys Asp Ile Gln Leu Thr Ile Asp Ala Lys Val Gln Lys Ser Ile

325 330 335

Tyr Asn Asn Met Lys Asn Asp Tyr Gly Ser Gly Thr Ala Ile His Pro

340 345 350

Gln Thr Gly Glu Leu Leu Ala Leu Val Ser Thr Pro Ser Tyr Asp Val

355 360 365

Tyr Pro Phe Met Tyr Gly Met Ser Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Leu Thr

370 375 380

Glu Asp Lys Lys Glu Pro Leu Leu Asn Lys Phe Gln Ile Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro Gly Ser Thr Gln Lys Ile Leu Thr Ala Met Ile Gly Leu Asn Asn

405 410 415

Lys Thr Leu Asp Asp Lys Thr Ser Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Gly Trp

420 425 430

Gln Lys Asp Lys Ser Trp Gly Gly Tyr Asn Val Thr Arg Tyr Glu Val

435 440 445

Val Asn Gly Asn Ile Asp Leu Lys Gln Ala Ile Glu Ser Ser Asp Asn

450 455 460

Ile Phe Phe Ala Arg Val Ala Leu Glu Leu Gly Ser Lys Lys Phe Glu

465 470 475 480

Lys Gly Met Lys Lys Leu Gly Val Gly Glu Asp Ile Pro Ser Asp Tyr

485 490 495

Pro Phe Tyr Asn Ala Gln Ile Ser Asn Lys Asn Leu Asp Asn Glu Ile

500 505 510

Leu Leu Ala Asp Ser Gly Tyr Gly Gln Gly Glu Ile Leu Ile Asn Pro

515 520 525

Val Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Ala Leu Glu Asn Asn Gly Asn Ile

530 535 540

Asn Ala Pro His Leu Leu Lys Asp Thr Lys Asn Lys Val Trp Lys Lys

545 550 555 560

Asn Ile Ile Ser Lys Glu Asn Ile Asn Leu Leu Thr Asp Gly Met Gln

565 570 575

Gln Val Val Asn Lys Thr His Lys Glu Asp Ile Tyr Arg Ser Tyr Ala

580 585 590

Asn Leu Ile Gly Lys Ser Gly Thr Ala Glu Leu Lys Met Lys Gln Gly

595 600 605

Glu Thr Gly Arg Gln Ile Gly Trp Phe Ile Ser Tyr Asp Lys Asp Asn

610 615 620

Pro Asn Met Met Met Ala Ile Asn Val Lys Asp Val Gln Asp Lys Gly

625 630 635 640

Met Ala Ser Tyr Asn Ala Lys Ile Ser Gly Lys Val Tyr Asp Glu Leu

645 650 655

Tyr Glu Asn Gly Asn Lys Lys Tyr Asp Ile Asp Glu

660 665

<210> 2

<211> 2007

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> 编码PBP2a 的mecA 基因核酸

<400> 2

ttattcatct atatcgtatt ttttattacc gttctcatat agctcatcat acactttacc 60

tgagattttg gcattgtagc tagccattcc tttatcttgt acatctttaa cattaatagc 120

catcatcatg tttggattat ctttatcata tgatataaac cacccaattt gtctgccagt 180

ttctccttgt ttcattttga gttctgcagt accggatttg ccaattaagt ttgcataaga 240

tctataaata tcttctttat gtgttttatt tacgacttgt tgcataccat cagttaatag 300

attgatattt tctttggaaa taatattttt cttccaaact ttgtttttcg tgtcttttaa 360

taagtgaggt gcgttaatat tgccattatt ttctaatgcg ctatagattg aaaggatctg 420

tactgggtta atcagtattt caccttgtcc gtaacctgaa tcagctaata atatttcatt 480

atctaaattt ttgtttgaaa tttgagcatt ataaaatgga taatcacttg gtatatcttc 540

accaacacct agttttttca tgcctttttc aaatttctta ctgcctaatt cgagtgctac 600

tctagcaaag aaaatgttat ctgatgattc tattgcttgt tttaagtcga tattaccatt 660

taccacttca tatcttgtaa cgttgtaacc accccaagat ttatcttttt gccaaccttt 720

accatcgatt ttataacttg ttttatcgtc taatgttttg ttatttaacc caatcattgc 780

tgttaatatt ttttgagttg aacctggtga agttgtaatc tggaacttgt tgagcagagg 840

ttctttttta tcttcggtta atttattata ttcttcgtta ctcatgccat acataaatgg 900

atagacgtca tatgaaggtg tgcttacaag tgctaataat tcacctgttt gagggtggat 960

agcagtacct gagccataat catttttcat gttgttataa atactctttt gaactttagc 1020

atcaatagtt agttgaatat ctttgccatc ttttttcttt ttctctatta atgtatgtgc 1080

gattgtattg ctattatcgt caacgattgt gacacgatag ccatcttcat gttggagctt 1140

tttatcgtaa agtttttcga gtcccttttt accaataact gcatcatctt tatagccttt 1200

atattctttt tgttttaatt cttcagagtt aatgggacca acataaccta atagatgtga 1260

agtcgctttt tctagaggat agttacgact ttctgtttca ttagttgtaa gatgaaattt 1320

ttttgcgaaa tcacttaaat attcatccat ttttttaacg gttttaagtg gaacgaaggt 1380

atcatcttgt acccaatttt gatccatttg ttgtttgata tagtcttcag aaatacttag 1440

ttctttagcg attgctttat aatctttttt agatacattc tttggaacga tgcctatctc 1500

atatgctgtt cctgtattgg ccaattccac attgtttcgg tctaaaattt taccacgttc 1560

tgattttaaa ttttcaatat gtatgctttg gtctttctgc attcctggaa taatgacgct 1620

atgatcccaa tctaacttcc acataccatc ttctttaaca aaattaaatt gaacgttgcg 1680

atcaatgtta ccgtagtttg ttttaatttt atattgagca tctactcgtt ttttattttt 1740

agatactttt tttattttac gatcctgaat gtttatatct ttaacgccta aactattata 1800

tatttttatc ggacgttcag tcatttctac ttcaccatta tcgcttttag aaatataact 1860

gctatcttta taaacttgtt tgaaattttt atcttcaatt gcatcaatag tattattaat 1920

ttctttatct tttgaagcat aaaaatatat accaaacccg acaactacaa ctattaaaat 1980

aagtggaaca atttttatct ttttcat 2007

<210> 3

<211> 76

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> PBP2a片段氨基酸序列

<400> 3

Met Tyr Gly Met Ser Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys

1 5 10 15

Lys Glu Pro Leu Leu Asn Lys Phe Gln Ile Thr Thr Ser Pro Gly Ser

20 25 30

Thr Gln Lys Ile Leu Thr Ala Met Ile Gly Leu Asn Asn Lys Thr Leu

35 40 45

Asp Asp Lys Thr Ser Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Gly Trp Gln Lys Asp

50 55 60

Lys Ser Trp Gly Gly Tyr Asn Val Thr Arg Tyr Glu

65 70 75

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> PBP2a活性中心氨基酸序列

<400> 4

Ser Thr Gln Lys

1

<210> 5

<211> 228

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 5

atgtatggca tgagcaacga agaatataac aaactgaccg aagataaaaa agaaccgctg 60

ctgaacaaat ttcagattac caccagcccg ggcagcaccc agaaaattct gaccgcgatg 120

attggcctga acaacaaaac cctggatgat aaaaccagct ataaaattga tggcaaaggc 180

tggcagaaag ataaaagctg gggcggctat aacgtgaccc gctatgaa 228

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR1轻链氨基酸序列

<400> 6

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Gly His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR2轻链氨基酸序列

<400> 7

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR3轻链氨基酸序列

<400> 8

Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR1轻链DNA序列

<400> 9

cgcagcagcc agagcattgg ccatagcaac ggcaacacct atctggaa 48

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR2轻链DNA序列

<400> 10

aaagtgagca accgctttag c 21

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR3轻链DNA序列

<400> 11

tttcagggca gctatgtgcc gctgacc 27

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR1重链氨基酸序列

<400> 12

Gly Phe Ser Ile Thr Ser Ser Ser Ser Cys Trp His

1 5 10

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR2重链氨基酸序列

<400> 13

Arg Ile Cys Tyr Glu Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR3重链氨基酸序列

<400> 14

Glu Asn His Asp Trp Phe Phe Asp Val

1 5

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR1重链DNA序列

<400> 15

ggctttagca ttaccagcag cagcagctgc tggcat 36

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR2重链DNA序列

<400> 16

cgcatttgct atgaaggcag cattagctat agcccgagcc tgaaaagc 48

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<220>

<221> 其他特征区

<223> CDR3重链DNA序列

<400> 17

gaaaaccatg attggttttt tgatgtg 27

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 18

atggaagctt gctgggtcta caagctgtgg att 33

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 19

atggaaatgg cagcctggtc ttattcctct 30

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 20

gatgtgaagc ttcaggagtc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 21

caggtgcagc tgaaggagtc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 22

caggtgcagc tgaagcagtc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 23

caggttactc tgaaagagtc 20

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 24

gaggtccagc tgcaacaatc t 21

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 25

gaggtccagc tgcagcagtc 20

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 26

caggtccaac tgcagcagcc t 21

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 27

gaggtgaagc tggtggagtc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 28

gatgtgaact tggaagtgtc 20

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 29

tggacaggga tccagagttc caggtcact 29

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 30

gacattgtga tgacccagtc t 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 31

gatgttttga tgacccaaac t 21

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 32

gatattgtga taacccag 18

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 33

gacattgtgc tgacccaatc t 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 34

gatattgtgc taactcagtc t 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 35

gatatccaga tgacacagac t 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 36

gacatccagc tgactcagtc t 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 37

caaattgttc tcacccagtc t 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 38

caggctgttg tgactcagga a 21

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 金黄色葡萄球菌

<400> 39

tacagttggt gcagcatc

Claims

1.分离的单克隆抗体，其自身结合耐甲氧西林的细菌MRSA中的PBP2a蛋白，特征在于，其包括一个包含氨基酸序列的可变链区域，该氨基酸序列选自SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或者至少80%与它们相同的氨基酸序列。

2.分离的单克隆抗体，其自身结合耐甲氧西林的细菌MRSA中的PBP2a蛋白，特征在于，其包括一个包含DNA序列的可变链区域，该DNA序列选自SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 或者与它们至少80%相同的DNA序列。

3.分离的单克隆抗体，其自身结合肠球菌Enterococcus spp.的PBP5蛋白，特征在于，其包括一个包含氨基酸序列的可变链区域，该氨基酸序列选自SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或者至少80%与它们相同的氨基酸序列。

4.分离的单克隆抗体，其自身结合肠球菌Enterococcus spp.的PBP5蛋白，特征在于，其包括一个包含DNA序列的可变链区域，该DNA序列选自SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17或者至少80%与它们相同的DNA序列。

5.确定耐β内酰胺的抗生素的方法，特征在于，包括加入纯的或者与其它物质联用的根据权利要求1或2中一个分离的单克隆抗体到怀疑含有PBP2a或者同源于PBP2a的蛋白的细菌样品中。

6.治疗或者预防含有PBP2a或者同源于PBP2a的蛋白的细菌导致的感染的药物成分，特征在于，包含根据权利要求1或2分离的单克隆抗体的数量和药物上可接受的辅料，或者载体或者赋形剂。

7.治疗或者预防含有PBP2a或者同源于PBP2a的蛋白的细菌导致的感染的方法，其特征在于，包括一定量的根据权利要求1或2分离的单克隆抗体施药给人类或者动物患者。

8.根据权利要求1所述的抗体，特征在于，包括具有序列GFSITSSSSCWH (SEQ ID NO: 12) (CDR1 VH)的CDR1区域的可变重链，和相应的核酸序列，具有可能的降解作用。

9.根据权利要求1所述的抗体，特征在于，包括具有序列RICYEGSISYSPSLKS (SEQ ID NO: 13) (CDR2 VH)的CDR2区域的可变重链，和相应的核酸序列，具有可能的降解作用。

10.根据权利要求1所述的抗体，特征在于，包括具有序列ENHDWFFDV (SEQ ID NO: 14) (CDR3 VH)的CDR3区域的可变重链，和相应的核酸序列，具有可能的降解作用。

11.根据权利要求1所述的抗体，特征在于，包括具有序列RSSQSIGHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 6) (CDR1 VL)的CDR1区域的可变轻链，和相应的核酸序列，具有可能的降解作用。

12.根据权利要求1所述的抗体，特征在于，包括具有序列KVSNRFS (SEQ ID NO: 7) (CDR2 VL)的CDR2区域的可变轻链，和相应的核酸序列，具有可能的降解作用。

13.根据权利要求1所述的抗体，特征在于，包括具有序列FQGSYVPLT (SEQ ID NO: 8) (CDR3 VL)的CDR3区域的可变轻链，和相应的核酸序列，具有可能的降解作用。

14.根据权利要求2所述的抗体，特征在于，包括具有序列SEQ ID NO: 9的CDR1区域的可变轻链，和相应的核苷酸序列，具有可能的降解作用。

15.根据权利要求2所述的抗体，特征在于，包括具有序列SEQ ID NO: 10的CDR2区域的可变轻链，和相应的核苷酸序列，具有可能的降解作用。

16.根据权利要求2所述的抗体，特征在于，包括具有序列SEQ ID NO: 11的CDR3区域的可变轻链，和相应的核苷酸序列，具有可能的降解作用。

17.根据权利要求2所述的抗体，特征在于，包括具有序列SEQ ID NO: 15的CDR1区域的可变重链，和相应的核苷酸序列，具有可能的降解作用。

18.根据权利要求2所述的抗体，特征在于，包括具有序列SEQ ID NO: 16的CDR2区域的可变重链，和相应的核苷酸序列，具有可能的降解作用。

19.根据权利要求3所述的抗体，特征在于，包括具有序列SEQ ID NO: 16的CDR3区域的可变重链，和相应的核苷酸序列，具有可能的降解作用。