KR101868160B1 - Ｐｂｐ２－ａ 단백질용 단클론 항체 및 문 퍼미큐트 세균에 대한 면역진단 및 감염 치료를 위한 상동 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 병원체 메치실린 내성 황색 포도상 구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)-MRSA, 코아귤라제-음성 포도상 구균(coagulase-negative Staphylococcus), 포도상 구균 sciuri(Staphylococcus sciuri), 장내구균(Enterococcus spp.) 및 PBP2a 또는 이런 단백질과 상동인 서열을 가지는 다른 세균을 포함하여, PBp2a 단백질 및 PBP2a와 상동인 서열을 나타내는 다른 단백질을 인식 및 결합할 수 있는 단클론 항체에 관한 것이다.
본 발명은 베타-락탐에 대한 내성의 검출을 위한 보완적인 면역 진단에 있어서, PBP2a 단백질 및 PBP2a와 상동인 서열을 나타내는 다른 단백질을 인식 및 결합할 수 있는 단클론 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

ＰＢＰ２－Ａ 단백질용 단클론 항체 및 문 퍼미큐트 세균에 대한 면역진단 및 감염 치료를 위한 상동 서열{MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST PBP2-A PROTEIN AND HOMOLOGOUS SEQUENCES FOR THE TREATMENT OF INFECTIONS BY AND IMMUNODIAGNOSTICS OF BACTERIA OF THE FIRMICUTES PHYLUM}

본 발명은 병원체 메치실린-내성 황색 포도상 구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)-MRSA, 코아귤라제-음성 포도상 구균(coagulase-negative Staphylococcus), 포도상 구균 sciuri(Staphylococcus sciuri), 장내구균(Enterococcus spp.) 및 PBP2a 또는 이런 단백질과 상동인 서열을 가지는 다른 세균를 포함하여, PBP2a 단백질 및 PBP2a와 상동인 서열을 나타내는 다른 단백질을 인식 및 결합할 수 있는 단클론 항체에 관한 것이다.

본 발명은 베타-락탐에 대한 내성의 검출을 위한 보완적인 면역 진단에 있어서, PBP2a 단백질 및 PBP2a와 상동인 서열을 나타내는 다른 단백질을 인식 및 결합할 수 있는 단클론 항체를 사용하는 것에 관한 것이다.

발명 근거

메치실린-내성 황색 포도상 구균(MRSA)은 직접 환자를 상대하는 임상의를 위한 주된 관심 이유이고, 이는 메치실린-감성 포도상 구균(1)에 의해 야기되는 감염들 보다도 높은 치사율 및 발병률을 나타낸다. 게다가, 이러한 감염은 보다 장기간의 입원 시간과 항균 물질로 보다 높은 비용을 초래하고, 그 결과 이러한 병원체(1)에 의해 감염된 환자의 치료에는 상당히 높은 비용이 발생하게 된다.

반코마이신은 MRSA에 의해 야기되는 감염의 치료를 위해 선택할 수 있는 첫번째 항균제였다. 그러나, 일본, 미국(5), 및 브라질(6)에서의 반코마이신에 대한 중간 내성을 가진 MRSA 균주의 확인과 함께, 미국과 호주(2, 3, 4) 지역에서 점진적으로 증가하는 MRSA 균주의 분리(isolation)는 현 상황을 점점 더 심각하게 만들고 있다. 2004년(7)의 반코마이신에 대한 MRSA 균주의 내성에 대한 내용은 의학-과학 공동체에서 엄청난 우려를 야기시켜 왔다. 현재 MRSA는 지금 사용할 수 있는 모든 약품에 내성이 있는 병원체, 즉 공포스러운 "슈퍼버그 또는 슈퍼박테리아"의 가장 강력한 후보를 나타낸다.

통상적으로, 병원 감염에 있어서 MRSA 유병률(모든 감염중에서 MRSA에 의해 야기되는 황색 포도상 구균의 비율)은 지난 몇 십년에 걸쳐 점진적으로 증가하고 있다. 미국의 337개 병원에서의 1268 ICU(집중 치료 유닛)를 포함하여 Jarvis et al.에 의해 수행된 연구에서, ICU내에서 MRSA에 의해 야기된 감염수는 660으로부터 2184 건으로 변경되었고, 유병률 또한 35%에서 64,4%(8)로 증대되었다. 일본에서, MRSA에 의해 야기되는 병원 감염(HIs)의 유병률은 우려할만한 수치, 즉 60%에서 90%를 나타낸다. 미국에서 수행된 연구에서, 백분위수는 1974년에 2%로부터 1997년에 50%로 변하였고, 미국의 일부 병원에서는 HIs의 80% 이상이 MRSA(12)에 의해 야기된 것이었다. 영국에서 유병율은 1989년과 1995년 사이에 1.5%로부터 15.2%로 증가하였고, 지금 2004년에는 그 예측치가 41.5%(13)이다.

높은 유병률 이외에도, 특히 교육적 및 대형 병원에서는 MRSA가 브라질 병원에서 유행성 발병을 야기시키는 주된 병원체인 것으로 알려져 있다. 1986년에 상파울로 대학 병원의 환자와 격리된 병원 기원을 가지는 황색 포도상 구균 균주의 50% 이상이 메치실린에 내성을 가지고 있었고, 1993년에 파울리스타 의학교의 소아 병원에서의 MRSA의 발생률은 70%였다.(15). 벨로 호리존테의 병원에서 수행된 연구에서, Resende et al . (16)는 MRSA의 71% 유병률을 지적하였다.

MRSA 균주는 PBP2a와 같은 베타-락탐 클래스에서 항균제에 대한 매우 낮은 친화력을 가진 페니실린-결합 단백질을 제공한다(17). 유전자 mecA로 코드화되는 이러한 효소의 존재하에서, 세균은 심지어 베타-락탐의 존재하에서도 펩티드글리칸을 성공적으로 합성한다. 이러한 효소는 또한 코아귤라제-음성 포도상 구균과 포도상 구균 sciuri -개의 정상적인 균주에서 존재하는 세균에서도 발견될 수 있다. 베타-락탐에 대한 내성 이외에도, 병원 MRSA 균주는 치료를 위해 첫번째로 선택되는, 글리코펩티드(반코마이신 및 테이코플라닌)의 사용과 함께, 다른 이용가능한 항균성 클래스에 대하여도 내성을 나타낸다.

PBP2a에 대항하여 DNA 백신을 사용하는 두가지의 연구는 이러한 단백질이 면역원성이 있고, 그 획득된 면역 반응은 생쥐 모델에서 수행된 연구에서 MRSA에 대항하는 방어를 부여할 수 있었다는 것을 보여주었다. 그러나, 병원 감염에 있어서, 대부분의 환자는 면역 억제된 것으로 알려져 있다. 이러한 경우에는, 백신은 세균 감염을 제어하기 위하여 적절한 시간내에 방어적 항체를 생성할 수 없을 것이다.

PBP2a 면역원성

PBP2a는 고핀 및 구후센(Goffin and Ghuysen) 분류에 따르면 클래스 II 멀티모듈러 효소이다. 이러한 76-킬로달톤 효소는 막-결합 부위, 비-트랜스펩티다아제 영역 및 트랜스펩티다아제 영역으로 구성되고, 이는 4-아미노산 활성 코어(STQK)를 함유하는데, 이는 세균의 펩티드 전이 반응을 책임지게 된다. (20 bis Ryfell, 1990).

PBP2a에 대항하는 DNA 백신을 가진 종래 연구 논문에 의하면, 체계적인 감염에 의해 도전받는 환경에 있는 면역화된 동물에서 세균 감소 결과(신장 정량)는 Ohwada et al .의 연구에서는 3 내지 4배였고, Senna et al . 의 연구에서는 1000배였다. 이러한 연구 논문의 저자는 유전자 mecA의 전체 서열(막 고정 영역 제외)과 트랜스펩티다제 영역의 내부 조각을 각각 사용하였다.

그러나, 상술한 것에 따르면, 백신은 세균 감염을 제어하기 위하여 적절한 시간내에 방어 항체를 생성할 수 없다. 따라서, MRSA의 감염이 발생하는 경우에, 항-PBP2a 단클론 항체를 투여하는 것이 이러한 감염을 치료하는데 가장 적절한 치료법이다.

본 발명의 주된 목적은 병원체 메치실린 내성 황색 포도상 구균-MRSA, 코아귤라제-음성 포도상 구균, 포도상 구균 sciuri, 장내구균(Enterococcus spp.) 및 PBP2a 또는 이런 단백질과 상동인 서열을 가지는 다른 세균을 포함하여, PBp2a 단백질(SEQ ID NO.:1) 및 PBP2a와 상동인 서열을 나타내는 다른 단백질을 인식 및 결합할 수 있는 단클론 항체를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또다른 목적은 베타-락탐에 대한 내성의 검출을 위한 보완적인 면역 진단에 있어서, PBP2a 단백질 및 PBP2a와 상동인 서열을 나타내는 다른 단백질을 인식 및 결합할 수 있는 단클론 항체를 사용하는 것에 있다.

본 발명의 단클론 항체는 서열 SEQ ID NO.: 6, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 16, 및 SEQ ID NO.: 17로 나타내어진다.

도 1은 항-PBP2a 항체를 생성하기 위하여 면역된 동물 혈청에 대한 면역효소 테스트를 도시한다.
도 2는 로(raw) 샘플과 정제후 샘플과의 폴리아크릴아미드 겔 결과를 도시한다.
도 3은 항-PBP2a 단클론 항체를 함유하는 상청액에 대한 MRSA 및 MSSA 용해질의 면역탁본 테스트를 도시한다.
도 4는 항-PBP2a 단클론 항체와 함께 배양되고 피코에리트린(PE)로 표시된, MRSA(CEB) 및 MSSA 세균의 대표적인 유속 세포분석법에 따른 결과를 도시한다.
도 5는 상이한 MRSA 균주의 접종물에 대항하여 정제된 단클론 항체 및 반코마이신에 의해 부여되는 시험관내 방어 테스트(MIC-최소 억제 농도)를 도시한다.
도 6A는 MRSA CEB 균주의 준치사량으로 감염된 상태에서, 항-PBP2a 단클론 항체로 동물을 치료한 것과 치료하지 않은 것의 신장 정량 결과치를 도시한다.
도 6B는 MRSA Iberian 균주(유럽의 유행성 클론)의 준치사량으로 감염된 상태에서, 항-PBP2a 단클론 항체로 동물을 치료한 것과 치료하지 않은 것의 신장 정량 결과치를 도시한다.
도 6C는 WB79 CA-MRSA 균주(브라질 지역 균주)의 준치사량으로 감염된 상태에서, 항-PBP2a 단클론 항체로 동물을 치료한 것과 치료하지 않은 것의 신장 정량 결과치를 도시한다.
도 7A는 치사 세균량(MRSA CEB)에 의한 감염 후 치료받은 동물(방어)과 치료받지 않은 동물(조절)의 생존률 곡선을 도시한다.
도 7B는 치사 세균량(Iberian MRSA)에 의한 감염 후 치료받은 동물(방어)과 치료받지 않은 동물(조절)의 생존률 곡선을 도시한다.
도 7A는 치사 세균량(WB79 CA-MRSA)에 의한 감염 후 치료받은 동물(방어)과 치료받지 않은 동물(조절)의 생존률 곡선을 도시한다.
도 8A는 세균(MRSA CEB)에 의한 감염 후 치료받지 않은 동물과, 항-PBP2a 단클론 항체, 반코마이신 및 항체+반코마이신 연합으로 치료받은 동물의 신장내 세균 정량를 도시한다.
도 8B는 항-PBP2a 단클론 항체로 치료받은 동물의 신장내 세균 정량을 도시한다.
도 9는 PBP2a(항원)과 단클론 항체 클론 38(도 9A) 및 클론 10(도 9B)을 재결합하는 사이의 상호작용을 도시한다.
도 10은 FITC-표시 항-PBP2a 항체의 존재하에서 MRSA 샘플을 유속 세포분석법에 의해 두번째로 분석한 그래프이다.
도 11은 VRE enterococcus 균주에 대항하는 항체에 의해 부여되는 시험관내 방어에 대한 결과를 도시한다.
도 12는 복강내 감염 결정에 대한 LD₅₀ 및 치사량을 나타낸다.
도 13은 체계적 감염에 대항하여 enterococci로부터 항-PBP2a 및 PBP5 단클론 항체의 생체내 방어의 효능 결과치를 도시한다.

상세한 발명 내용

항균제에 대하여 다제 내성을 가진 세균에 의한 감염 사례가 나타나고 있고, 점진적으로 경각심을 불러일으킬 정도로 증가하고 있다. MRSA에 의해 야기되는 병원 감염의 유병률은 전세계적으로 사망률 또는 발병율을 증대시켜 왔고, 이는 항균제의 보다 집중적인 사용에 기인하는 매우 높은 비용을 초래하였고, 나아가 환자의 입원 기간을 점점 더 길게 하여왔다(24). 화학요법에 기초한 치료는 시장에서 매우 새롭고 효과적인 약물이 거의 출현하지 않으므로, 탈진 징후를 보여왔다(25).

이와 관련하여, 수동 면역요법이 유망한 대안으로 출현하였는데, 이는 종래의 화학요법과 비교하여 광범위한 이점을 가졌다. 그러한 이점 중에서 보다 낮은 독성, 보다 높은 혈장 반감기(이는 투여량 감소를 통해 치료를 용이하게 하고, 보다 낮은 치료비가 소요되게 한다) 및 특별히 여기서 제공되는 생성물의 경우, Paul Ehrlich (여기서, 약물은 상기 언급된 병원체를 선택적으로 제거한다)(25a)에 의해 추천된 선택적인 독성이 있다. 마지막에 언급된 이점은 광범위 항균제-이는 다제 내성 세균(26)의 출현을 제공한다-에 의해 작용하는 소위 선택 압력을 방지하는데 매우 유용하다.

이러한 생성물을 개발하기 위하여, 발명자는 생쥐 모델에서의 DNA 백신과 면역구조적 분자 분석과 관련된 예비적 연구에 기초하여 PBP2a를 표적으로 선택했다. PBP2a는 2002년에 밝혀진 그 자체의 구조를 가졌고(29), PDB(단백질 데이터 은행)에 맡겨졌다.

다른 접근접으로서, 발명자는 76 아미노산[이는 트랜스펩티다아제 영역에서 효소 활성 코어(SxxK) 측면에 배치된다]을 가지는 분자 내부 부위로 연구를 하였다. 항원결정인자 식별 분석이 상이한 클래스 II CHM 대립인자(Tepitope program)로의 제공 및 그 분자에서 수행되었는데, 이는 분자에서의 그 위치를 추후에 확인하는 방법으로 수행되었다(SPDB-Viewer program). 이러한 접근접은 자연발생적인 분자내에서 이러한 표적으로의 항체 접근 유출률을 평가할 수 있게 해 준다.

이러한 계산된 분석은 효소 활성 코어에 근접해 있는 항원결정인자의 존재를 보여주었고, 이는 PBP2a 표면에 위치하는(데이터가 도시되지 않음) 클래스 II CHM 대립인자에 의해 탁월한 인식률을 가진다.

이러한 컴퓨터 가상 환경에서의 프리뷰는 수행된 표적 인식 테스트(면역탁본법 및 유속 세포분석법)에 의해 확인되었고, PBP2a 부위에 결합하는 항체는 높은 방어력을 부여할 수 있음을 보여주었고, 이는 시행된 생체내 및 시험관내 시험에서 얻은 결과에 의해 증명되었다. 76-아미노산 조각에 의해 생성된 항체는 전체 PBP2a로 면역접종하여 생성된 항체 보다도 높은 방어력을 수반함을 보여주었고, 이러한 사실은 Ohwada 및 Senna 연구에서 이전에 알려진 것으로서 본 발명자가 얻은 결과로부터 확인되었다.

MRSA에 의해 야기되는 감염에 대한 역학은 전세계의 병원에서 발병 및 전염병에 대하여 책임이 있는 유력한 클론 타입이 존재함을 보여준다. 이러한 클론은 비-전염성 MRSA 균주(30)와 대비해 볼 때, 보다 높은 집락형성 및 발병력을 제공한다.

상기 획득한 결과의 유효성을 입증하기 위한 방법으로서, MRSA에 의해 야기되는 감염(특히 병원 감염) 대부분의 대표자격인 상이한 MRSA 클론(전염성 클론)으로 연구하는 것이 의도되어졌다.

CEB 균주(브라질의 전염성 클론)는 브라질 병원(31)에서 MRSA에 의해 야기되는 대부분의 감염에 대하여 원인이 되는데, 이는 또한 남아프리카(32, 33), 포르투갈 및 체코슬로바키아(34)와 같은 다른 나라에서도 동일하다. 유럽 전염성 클론(Iberian-MRSA)이 유럽 국가들과 미국(35)에서 발견되었다.

MRSA에 의해 야기되는 지역감염 건수의 증가에 기인하여, 브라질에서 분리된, 이러한 균주들(WB79 CA-MRSA) 중 하나가 금번 시험에 포함되었다. 이러한 시험은 보다 높은 발병력(Panton-Valentine leukocidin 존재)과 병원성 MRSA 균주(36)중 하나와 상이한 항균제에 대하여 내성을 가진 프로필과 함께, 병원에서 발견된 것들과 차별화되는 특징들을 보인다. 최근들어, 다른 남자들과 섹스를 하는 남자 주민에게서 CA-MRSA에 의한 감염 발병이 미국(37)에서 확인되었다. 이 시점 부터, MRSA에 의해 야기되는 감염은 STD(성적 접촉으로 전달되는 질병) 특성을 가지는 것으로 여겨진다.

항-PBP2a 항체의 투여에 의해 수반되는 방어 결과는 모든 다른 시험 클론에 대하여 효험을 보여왔고, 이는 우리로 하여금 모든 MRSA 타입에 의해 야기되는 감염(지역 또는 병원)에 대하여 그 적용성을 신뢰하게 하고 있다.

본 발명의 생성물에 대한 일부 중요한 특징은 다음과 같이 언급되어질 수 있다.

(i) 시험관내 결과치는 관련된 작용 메커니즘-분자 활성 코어에 근접한 부위의 차단-이 세균 증식 및 복제를 억제하기에 충분하다는 것을 믿게 한다. 베타-락탐 항생제 중 하나와 유사하게, 이러한 메커니즘은 시간-의존적이고, 세균이 그 표적을 약물 작용에 노출시킬 수 있도록 증식 단계에 있어야 할 필요가 있다.

(ii) 이러한 특징은 항체의 약물동력학적 특성에 의해 지지되고, 이는 긴 혈장 반감기(38)를 제공한다. 항생제 치료와 비교하여, 이는 더 적은 투여수의 약물 투여를 의미하고, 결과적으로 환자를 위한 치료 시설을 제공할 뿐더러 아마도 더 낮은 최종 비용을 필요로하게 될 것이다. 이러한 아이디어는 반코마이신으로 행해진 방어 비교 분석에서 실제 확인되었다.

(iii) 시험관내 세균 증식의 억제는 항체가 옵소닌화 및 보체활성작용과 같은 전통적인 보조적 항원-항체 반응 메커니즘을 필요로 하지 않음을 의미한다. 대부분의 병원 감염은 면역 저하 상태에 있는 환자에게서 발생함을 고려해 볼 때, 이러한 생성물 특성은 매우 중요한 의미를 가진다.

(iv) 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)은 그 표면상에 단백질 A를 제공한다. 이러한 특징적 분자는 그 자체를 면역글로불린항체의 Fc 부위에 결합하고, 면역 시스템(38)의 옵소닌화 작용을 방해한다. 시험에서 얻은 결과에 기인하여, 투여된 항체 농도는 세균 표면에 존재하는 단백질 A를 포화시킬 수 있고, 이는 투여된 항체에 의해 PBP2a 차단을 막지 못하게 한다.

MRSA에 의해 야기되는 체계적 감염은 글리코펩티드, 특히 반코마이신의 사용으로 치료되어 왔다. 그러나, 이러한 약물은 면역독성(42), 이독성(耳毒性), 콩팥독성, 일시적 호중구 감소증(43)과 같은 광범위한 부작용을 나타내고, 장 기간 동안의 약물 투여를 필요로 하고, 나아가 높은 치료 비용을 초래하게 된다.

생쥐 감염 모델을 사용함으로써, 반코마이신 대 단클론 항체 및 두 종류의 약물의 혼합을 가지고 행해진 치료를 비교하는 것이 가능하였다. 획득된 결과는 항체 투여량은 5 반코마이신 투여량과 유사하거나 또는 더 높은 작용을 가지며, 두가지 약물의 동시 투약은 분리된 투약 보다 세균을 박멸하는데 더 효과적이었음을 나타낸다. 이러한 데이터는 상당히 중요한데, 이는 반코마이신과 항체의 투여로 심각한 상태의 환자의 보다 효과적인 회복을 가능하게 하고, 항체로서 보다 낮은 치료 비용으로 치료할 수 있기 때문이다.

MRSA에 의한 감염을 치료하기 위한 항-PBP2a 단클론 항체의 사용에 더하여, 본 발명은 여전히 다음의 응용성을 고려하고 있다.

(i) 항-PBP2a 단클론 항체에 의해 Enterococcus sp. 균주내의 PBP5 중 하나와 근접한 분자량을 가진 단백질의 인식 결과에 의하면, 항체 투여로서 이러한 병원체에 대항하여 방어적 반응을 얻을 수 있음을 알 수 있다. PBP5는 PBP2a와 상동성을 제공하는데, 양자는 베타-락탐(40)에 대한 낮은 친화력을 가진 클래스 B 다중모듈 PBP로 분류된다. Enterococci는 심각한 병원 감염을 야기하는 세균이고, 이는 항균제에 대하여 높은 정도의 선천적 및 후천적 내성을 나타낸다. 반코마이신(VRE)에 대해 내성을 가진 균주는 글리코펩티드에 내성을 가진 유전자의 병원소를 나타내고, 다른 병원체(41)로 전이될 수 있다.

(ii) 이러한 항체는 면역진단 테스트에 의해 PBP2a 식별을 위해 응용될 수 있다. 예컨대, 항체에 결합된 라텍스 입자의 응집에 기초하여 면역 테스트를 사용해 본 결과, 적은 시간내에 모든 베타-락탐 항생제에 대한 내성을 예측할 수 있는 결과를 얻을 수 있다. (항생제 민감도 테스트와 같은) 종래의 항균제 민감도 테스트에서, 이러한 결과는 단지 12 내지 24 시간후에 얻어졌다.

(iii) 단클론 항체가 만성 궤양(참조 Streit et al ., 및 WO 1999041285 A1)에 대하여 주된 처방책으로 성공적으로 사용되어 왔다면, 이러한 항체는 MRSA에 의한 코 탈균을 촉진시키는데 투여되었을 것이고, 나아가 이러한 병원체에 의해 야기되는 피부 병변 치료를 위해서도 투여되었을 것이다.

종래 기술에서 발견된 지식과 이슈에 기초하여, 본 발명자는 막 고정 부위 없는 유전자 mecA (SEQ ID NO.: 2)에 대응되는 구조를 가지는 DNA 백신을 가지고 동물에 면역접종을 수행했다. 또한, 효소 활성 코어를 포함하는 트랜스펩티다아제 영역 (SED ID NO.: 3)의 76-아미노산 내부 부위로 면역접종을 하였다.

면역접종은 Ohwada et al . 및 Senna et al .의 연구에서 제시된 동일한 조건하에서 수행되었다. Ohwada et al . 및 Senna et al .는 유전자 mecA의 전체 서열(막 고정 부위 제외)과 트랜스펩티다아제 영역의 내부 조각을 사용하여, PBP2a에 대항하는 DNA 백신을 개발하였다. 면역접종은 4 투여로 수행되었고, 면역접종된 동물과 비-면역접종된 제어 그룹은 MRSA로 체계적 감염에 노출되어 도전받게 되었고, 두번의 상이한 기간에 동물 신장내에 존재하는 세균의 수를 측정하였다. 얻어진 결과에 의하면, 트랜스펩티다아제 조각으로 면역접종한 것이 유전자 mecA로 면역접종된 동물 보다도 신장내 존재하는 세균수에서 훨씬 더 큰 감소를 가져옴을 보여주었다.

따라서, 트랜스펩티다아제에 대항하도록 생성된 항체가 PBP2a에 대항하는 항체 보다도 사용된 조건(생쥐 모델에서의 DNA 백신)하에서 보다 우수한 방어력을 제공하였음을 알 수 있다. 트랜스펩티다아제 조각은 효소 활성 코어 STQK (SEQ ID NO.: 4)를 포함한다.

결과적으로, 상기 발견한 결과에 기초하여, 본 발명자는 효소 활성 코어를 포함하는 트랜스펩티다아제 조각을 사용하여 PBP2a 단백질 및 PBP2a 단백질과 상동인 서열을 제공하는 다른 단백질을 인식 및 결합할 수 있는 단클론 항체를 생산하기 위한 발명을 하게 된 것이다.

본 발명은 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이지만, 이는 제한적 의미로 해석되어서는 안된다.

자료 및 방법:

1. 세균:

다음의 메치실린-내성 황색 포도상 구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 균주가 사용되었다. 즉, Iberian-MRSA, COL-MRSA (ceded by Unite des Agents Antimicrobiens - Institut Pasteur [Unit of Antimicrobial Agents - Pasteur Institute], Dr. Patrice Courvalin), WB79 CA-MRSA, 및 CEB-MRSA (ceded by Dr. Agnes Figueiredo, Instituto de Microbiologia [Microbiology Institute] of UFRJ); 반코마이신-내성 Enterococcus faecalis 균주; 및 메치실린-민감 Staphylococcus aureus (MSSA) 균주. Escherichia coli 균주 BL21 DE3 (Novagen) 및 TOP10 (Invitrogen) 또한 사용되었다.

2. 동물:

CECAL-FIOCRUZ에서 가져와서 LAEAN-BioManguinhos에서 길러진 4 내지 8주된 암컷 Balb/C 쥐가 면역접종 및 생체내 방어 분석 측정에 사용되었다.

3. 면역접종:

생쥐들(4 동물)에게 pCI-Neo 플라스미드: MRSA mecA 유전자(18) 조각의 100 마이크로그램 투여량을 투여했고, 그 다음에 14일 후에 포로인트 완전면역보강제(complete Freund adjuvant)로 에멀젼화되고 MRSA PBP2a(21)의 내적 부위에 대응하도록 정제된 재결합 단백질 10 마이크로그램 투여량을 투여했고, 그 다음 14일 후에 포로인트 불완전면역보강제(incomplete Freund adjuvant)로 에멀젼화된 다른 투여량을 투여했다. 14일 후, 최상의 면역 반응(효소 면역 분석-ELISA에 의해 평가됨)을 가진 동물에게는 PBS(phosphate buffered saline)에서 희석된 정제 단백질 10 마이크로그램을 정맥내 투여하였다. IV 주사 후 3일 되는 날에, 동물은 CO₂ (CEUA L0009 -07 프로토콜 - FIOCRUZ)로 질식에 의한 안락사되었고, 비장이 세포 융합을 위하여 무균적으로 적출되었다. 최상의 면역 반응을 가진 동물의 혈청은 다른 면역학적 테스트를 위한 양성 조절자로서 사용되었다.

4. 단클론 항체의 생성:

비장으로부터 적출된 림프구는 융합을 위한 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여, SP2/0-Ag14 골수종 세포 (ATCC 1581)와의 융합상태에 놓여졌고, Current Protocols in Immunology (22)에서의 단클론 항체를 생성하기 위한 포로토콜에 따라, 10% CO₂의 분위기하에서 37℃에서 HAT 배지(hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium)에서 배양되었다. 결과적인 하이브리도마는 항원으로 정제된 재결합 단백질을 사용하여 14일 후 ELISA 테스트에 의해 평가되었다. 최상의 하이브리도마는 ELISA에 의한 최상의 클론 선택과 함께 유전자복제되었고, 이는 액체 질소내에 보관되었다.

5. 효소 면역 분석 - ELISA :

맥시소브 98-웰 플라스틱 플레이트는 탄산염/중탄산염 완충액내에서 재결합 단백질(PBP2a 조각)의 500 나노그램/웰로 민감화되었고(sensitized), 밤 동안에 4℃에서 배양되었다.

다음날, 플레이트는 Tween 20 0.05%를 함유하는 PBS로 3번 세척되었고, 37℃에서 두시간 동안 PBS와 5% 탈지유내에서 차단되었다. 분석할 샘플(1:100으로 희석된 면역 동물의 혈청 또는 세포 배양 상청액)로서 37℃에서 2 시간 동안 배양된 샘플이 사용되었다. 플레이트는 다시 PBS 및 Tween 20(0.05%)로 3번 세척되었고, 항-Ig 접합체(항-생쥐 HRP Ig SIGMA A 0412)가 1:5000 희석도로 첨가되었고, 90분 동안 37℃에서 배양되었다. 이 기간 이후에, 플레이트는 TMB 과산화효소 컬러 현상액(BioRad)의 첨가와 함께, PBS와 Tween 20(0.05%)로 3번 세척되었고, 15분 동안 빛으로부터 방어되면서 배양되었다. 반응은 0.5 N H₂SO₄의 첨가로 중단되었고, 판독이 450 nm에서 수행되었다. 1:200 희석 과면역 다클론 혈청이 양성 조절자로서 사용되었다.

5.1. 효소 면역 분석에 기초한 결합 활성 분석

5.1.1. 요소를 이용한 결합 활성 분석( Niederhouser et al . - 5.1):

프로토콜은 다음의 변경사항을 가진 면역분석(5)과 유사하다.

즉, 37℃에서 2 시간 동안의 샘플 배양(클론 10 정제 단클론 항체의 100 ng 및 클론 38 정제 단클론 항체의 2.0 ng) 후, 샘플은 PBS와 Tween 20(0.05%)내에서 8M 요소와 함께 3번 세척되었고, 이어서 PBS와 Tween 20(0.05%)내에서 4번 세척되었고, 이는 일반적으로 동일하게 처리된 샘플(요소로 처리되지 않음)을 조절자로 제공한다.

동일한 흡광도의 판독 후, 결합 활성률이 요소를 가진 판독량이 요소 없는 판독량으로 나누어진 비율로 계산되고, 거기에 100을 곱하여 (백분위수 결과치로) 계산되었다.

5.1.2. 암모늄 티오시안산염을 이용한 결합 활성 분석( Goldblat et al . - 5.2)

프로토콜은 다음의 변경사항을 가진 면역분석(5)과 유사하다.

즉, 37℃에서 2 시간 동안의 샘플 배양(클론 10 정제 단클론 항체의 100 ng 및 클론 38 정제 단클론 항체의 2.0 ng) 후, 샘플은 다음의 농도: 3 M; 1.5 M; 1.0 M; 0.75 M; 0.50 M; 0.25 M; 및 0.125 M로 37℃에서 30분 동안 암모늄 티오시안산염으로 처리되었다. 암모늄 티오시안산염으로 비-처리된 샘플이 각각의 클론을 위한 조절자로서 사용되었다.

동일한 흡광도의 판독 후, 결합 활성률이 다음의 공식, 즉 AR (avidity rate) = [(log 50 - log A) x (B - A)/log B - log A] + A; where log 50 = 1.70.으로 계산되었다. 여기서, A는 최저 암모늄 티오시안산염 농도이며, 이는 50% 보다 적은 흡광도 감소를 나타내고, B는 최고 암모늄 티오시안산염 농도이며, 이는 50% 보다 많은 흡광도 감소를 나타낸다.

6. 단클론 항체 생산 및 정제:

이전에 선택된 클론 10 및 38 샘플은 10% CO₂ 분위기를 가진 스토브내에서 100-mL 작은 병으로 1% BSA를 첨가하면서, 혈청 없는 배지(GIBCO VP-SFM)에서 배양되었다. 상청액은 원심분리되었고, 이어서 0.22-마이크로미터 필터로 여과되었고, SelectSure protein A MAB resin(GE)를 가진 고성능 크로마토그래피(HPLC)에서 정제되었다. 항체는 탈이온수에서 PBS 0.5x에 대하여 투석된 1 M Tris, pH 10.0를 가지고 pH 7.0에서 중화되었다. 샘플은 동결건조 과정을 거쳤고, 탈이온수내에서 재부유(resuspend)시켜졌고, Lowry 방법에 의해 정량화되었고, 폴리아크릴아미드 겔내에서의 전기영동(electrophoresis in polyacrylamide gel)에 의해 평가되었다.

7. 표적 인식:

7.1. 시험관내 PBP2a 인식 - 면역탁본법:

MRSA (CEB) 균주, 메치실린-민감 황색 포도상 구균(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (MSSA)) 균주, 반코마이신-내성 Enterococcus faecium 균주 및 BL-21 DE3 Escherichia coli 균주가 지수증식기내에서 증식되었다. 각각의 샘플 1 mL가 원심분리되었고, 30초 동안 3번, 미니-비드 비터 디바이스(mini-Bead Beater device (Biospect Products))의 글라스 비드에서 휘저어 용해되었다. 각각의 샘플의 부분 표본은 12% 변성 폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)내에서의 전기영동되었고, 그 후 단백질은 나일론 막(Hybond N-BioRad)으로 전달되었다. 상기 막은 10% 탈지유 및 1% BSA(소 혈청 알부민)를 함유하는 PBS 완충액내에서 2시간 동안 부드러운 교반하에서 차단되었다. 상기 막은 PBS 및 Tween 20(0.05%)로 3번 세척되었고, PBS로 3번 세척되었다. 그 다음, 1:1 비율로 PBS에서 희석된 항-PBP2a 단클론 항체의 상청액과 함께 두 시간 동안 배양 상태에 놓여졌다. 배양 후, 상기 막은 이전에 기술한 대로 세척되었고, 알칼리인산분해효소가 1:15,000 비율로 접합되었고(생쥐 항-IgG 항체-Sigma A3688), 90분 동안 배양되었다. 이 기간 이후에, PBS로 다시 세척되었고, 알칼리인산분해효소용 웨스턴 블루 서브스트레이트(Western Blue substrate for alkaline phosphatase (Promega))으로 현상이 수행되었다.

7.2. 세균 표면에서의 PBP2a 인식 - 유속 세포분석법:

MRSA (CEB) 균주는 정지기(停止期) (ON) 또는 지수증식기내에서 증식되었다. 샘플은 PBS 1x로 세척되었고, 0.6의 DO₆₀₀(~10⁸ 세균/mL)에서 재부유되었다. 1 mL (10⁸ 세균)에서 원심분리되었고, 0.5% BSA 및 일반 혈청의 1:10 희석(생쥐/인간)으로 재부유되었다. 그 다음, 샘플은 4℃에서 30분 동안 배양되었고, 그 후 농축물(펠릿)은 PBS로 2번 세척되었고, 항-PBP2a 단클론 항체의 1:10,000 희석 및 0.5% BSA를 함유하는 PBS의 100 마이크로리터에서 재부유되었고, 4℃에서 30분간 배양되었다. 이 단계 후, 샘플은 이전과 동일하게 다시 세척되었고, PE(피코에리트린) 생쥐 항-Ig 접합체의 희석(1:1000) 및 0.5% BSA를 함유하는 PBS의 100 마이크로리터에서 재부유되었고, 그 후 4℃에서 30분간 어두운 분위기하에서 배양되었다. 그 다음, 샘플은 다시 세척되었고, 2% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS로 4℃에서 15분 동안 고정되었다. 이러한 준비 후, 샘플은 유속 세포분석법(Becton and Dickinson - FACScalibur)으로 분석되었다.

8. 시험관내 방어 분석 - 최소 억제 농도의 결정:

MRSA 균주(CEB, Iberian, COL, 및 CA)는 지수증식기에 흡광도가 0.5에 달하는 600 nm까지 증식되었다. 접종물은 대략 100,000 세균을 함유하도록 조절되었다.

MHB(Mueller Hinton broth), 세균 접종물 및 정제된 항-PBP2a 단클론 항체의 증식된 양이 테스트 튜브 또는 24-캐비티 플레이트에 첨가되었다. 상기 플레이트 또는 튜브는 12 시간 동안 37℃에서 배양 상태에 놓여졌다. 이 기간 후, 혼탁도가 존재하는지 존재하지 않는지가 샘플에서 관찰되었다. 최소 억제 농도는 세균 접종물 증식(100,000 세균)을 억제할 수 있는, 보다 적은 항체 양으로 간주되었다.

9. 생체내 방어 분석:

9.1. MRSA 균주에 대한 치사량 및 LD ₅₀ 의 결정.

치사량과 LD₅₀ 결정은 MRSA 균주에 대하여 Reed-Muench method (23)에 따라 수행되었다(CEB, Iberian, WB79 CA, and COL). 8-주 암컷 Balb/C 생쥐 그룹은 복강내 경로를 통하여 증식하는 세균을 투여받았고, 7일 동안 관찰되었다. 이 기간 후에 생존하는 동물은 미리 제정된 동물 복지 규정에 따라 안락사시켜졌다.

9.2. 체계적 감염 및 세균 신장 정량 분석.

MRSA 균주(CEB, Iberian, 및 WB79 CA)는 지수증식기에서 증식되었고(DO₆₀₀ ~0.6), 세척되었고, 대략 2 x 10⁸ 세균에 대응하는 DO₆₀₀ ~0.5에서 무균 PBS 1x로 재부유되었다. 이 농도는 옥사실린/mL의 10마이크로그램을 함유하는 BHI 우무평판(agar plate)상에서 희석 및 씨딩(seeding)에 의해 계산되어졌다. 암컷 8-주 Balb/C 생쥐는 첫째날 정제된 항-PBP2a 단클론 항체의 400 마이크로그램을 복강내 투여 받았다. 6일째에, 동물은 안락사시켜졌고 신장이 무균적으로 적출되었다. 그 다음, 신장은 무균 Luria 배지의 1mL에서 균질화되었고, 10 연속적으로 성공적으로 희석되었다.

각 희석액의 100 마이크로리터가 10 마이크로그램/mL의 옥사실린을 함유하는 BHI 우무평판에 심어졌고(seed), 37℃에서 24 시간 동안 배양되었다. 이 때 결과적인 콜로니의 카운트 및 전체 희석액의 계산이 수행되었다.

9.3. 생존 분석.

MRSA 균주는 이전 기술한 것과 동일한 조건하에서 증식되었지만, 접종물 조정은 이전에 설립된 LD₅₀으로 수행되었다. 암컷 8-주 Balb/C 생쥐는 첫째 날 정제된 항-PBP2a 단클론 항체의 500 마이크로그램을 복강내로 투여받았다. 그 다음날, 그 동물과 조절 그룹은 각 균주의 LD₅₀에 따라 복강내 경로를 통하여 약 2.5 내지 6.0 x 10⁸ 세균의 투여량으로 감염되어졌다. 동물은 10일 동안 관찰되어졌고, 생존 동물들은 안락사시켜졌다.

10. 항- PBP2a 단클론 항체 및 반코마이신의 대비적 생체내 방어 연구-신장 정량:

분석 I

암컷 8-주 Balb/C 생쥐의 4 그룹(그룹당 4 동물)이 복강내 경로를 통하여 6.0 x 10⁷ 세균 (CEB-MRSA)의 감염량을 투여받았다. 동물은 정제된 단클론 항체(MAB), 반코마이신, MAB+반코마이신 및 음성 조절자를 아래의 그룹별로 투여받았다.

그룹 1: MAB (400 마이크로그램) (첫째 날)

그룹 2: 반코마이신 (150 마이크로그램, 근육내 경로, 12/12 시간)

그룹 3: 반코마이신 + MAB (350 마이크로그램) (감염후 첫날)

그룹 4: 조절자

항체 및 반코마이신의 첫번째 투여량은 감염 병균의 투여 후 4시간만에 투여되었다. 동물은 네째날이 지나면 안락사시켜졌고, 신장이 무균적으로 적출되었고, 전술한 방법에 따라 신장 정량 분석을 받았다.

분석 II

이 분석은 이전 분석과 동일한 방법으로 수행되었지만, 보다 적은 감염량 (7.0 x 10⁶ 세균)을 투여받았고, 그룹 1은 정제된 단클론 항체의 500 마이크로그램으로 치료받았고, 그룹 2는 반코마이신(150 마이크로그램, 근육내 경로, 12/12 시간; 5 투여량)으로 치료받았고, 그룹 3은 반코마이신+단클론 항체의 500 마이크로그램으로 치료받았고, 그룹 4는 조절자(비-치료된 동물)였다.

11. 항- PBP2a 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄 상보결정부위( CDRs ) 식별

11.1. 하이브리도마 세포로부터 mRNA 추출

단클론 항체-생산 하이브리도마의 세포 배양 10-mL 원심분리물(펠릿)이 RNeasy Minikit kit (Qiagen)를 사용하여 mRNA 추출을 위해 처리되었다.

11.2. cDNA 획득

역전사효소 반응: M-MLV 역전사효소 키트(Invitrogen)가 상보적인 DNA를 획득하기 위하여 사용되었고, 다음의 제조 가이드라인을 따랐다.

11.3. 중합효소 연쇄 반응( PCR )에 의하 VH 및 VL 사슬의 증폭

상기 반응은 아래의 시작자(始作子) 서열(프라이머)을 사용하여 수행되었다.

11.4. 항- PBP2a 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄 서열

시컨싱 단계:

I. 증폭

이는 이전의 시작자 서열을 사용하여 수행되었고, 이는 SEW ID NO.: 18 내지 SEQ ID NO.: 39로 정의된다.

II . 시퀀싱

ABI Prism 3100와 Genetic Analyser (Hitachi)라는 장치가 사용되었다.

11.5. 경쇄 및 중쇄 CDR 의 식별 및 서열 분석

획득된 DNA 서열은 DNA Star 프로그램의 도움으로 분석되었고, 경쇄 및 중쇄 CDR의 식별을 위한 Kabat(24) 및 Chotia(25) 알고리즘에 의한 추후 분석을 위해 아미노산 서열(ExPASy 사이트-번역 프로그램)로 번역되었다.

12. 단클론 항체를 위한 연합 및 해리 상수 결정(표면 플라즈몬 공명( surface plasmon resonance [ SPR ] [ Biacore ] 방법에 의한 클론 10 및 38 )

SPR 측정법이 Biacore X^® (Biacore AB, Uppsala, Sweden) 장치의 CM-5 센서를 사용하여 수행되었다. 결합 시약 및 HBS-EP 완충액(10 mM hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P20 [Tween 0, pH 7.4])이 회사 GE 헬스케어로부터 입수되었다.

실시예 2

1. 생쥐 항- PBP2a 단클론 항체의 획득:

동물 그룹은 이전에 기술된 방법에 따른 면역접종 프로토콜에 따라 시험되었다. ELISA 테스트에 의해 평가된 결과가 도 1에 도시되어 있다.

융합 과정 후(90-LATAM의 융합), 96 캐비티(하이브리도마)로부터의 상청액이 ELISA 테스트에 의해 분석되었다. 이러한 전체로부터, 5개의 최상의 샘플이 선택되었고, 그 세포들은 증식되었다(복제). 그 다음, 다시 그 결과적인 상청액은 ELISA에 의해 분석되었다. 긍정적 샘플은 ELISA에 의해 획득된 결과의 유효성을 입증하기 위하여 정제된 재결합 단백질(PBP2a)에 대하여 면역탁본법에 의해 유효성 입증되었다.

최종적인 결과는 표 I에 있다.

도 1은 항-PBP2a 항체를 생산하기 위한, 면역된 동물의 혈청에 대한 면역효소 테스트(ELISA)로부터 얻은 결과치를 나타낸다. 각각의 대싱(dashing)은 면역된 동물의 1:100 희석 혈청에 대응한다. 양성 조절자 혈청은 각진 대싱(

)을 나타낸다.

각각의 대싱의 첫번째 막대: 사전-면역 혈청

두번째 막대: 4번째 면역접종 후의 혈청

세번째 막대: 5번째 면역접종 후의 혈청

표 I. 융합 90의 복제: 최종 균형

선택된 클론으로부터, 클론 77-38이 단클론 항체를 숨기기 위한 세포 안정도를 확인하기 위하여 재복제 과정을 거치게 하였다. 50 분석된 캐비티로부터 모든 것이 ELISA 테스트에 의해 긍정적 결과를 제공하였다. 이러한 클론은 증식되었고, LATAM(단클론 항체 기술 연구소) 시설내의 액체 질소내에 저장되었다.

2. 단클론 항체의 증식, 생산 및 정제:

본 과정은 이전에 기술된 방법에 따라 표준화되었다. 얻은 성과는 상청액의 매 100mL에 대하여 단클론 항체 약 4 밀리그램이었고, 이는 정제 과정을 거쳤다. 획득된 결과치는 아래에서 확인할 수 있다.

도 2에서, 로(raw) 샘플과 정제후 샘플과 함께 있는 폴리아크릴아미드 겔을 볼 수 있다. 이러한 도 2는 MAB SelectSure 수지와 함께 있는 HPLC 칼럼(column)내에서의 정제 이전(기둥 1) 및 정제 후(기둥 2)의 상청액 샘플을 가지는 비-변성 폴리아크릴아미드 겔을 도시한다. 기둥 3 내지 9는 획득된 정제 샘플 부분에 대응한다. 화살표는 150 kDA의 대략적 사이즈를 나타낸다.

3. 단클론 항체의 기능적 특성:

3.1. 시험관내 PBP2a 인식 - 면역탁본법

병원체(PBP2a 및 유사 서열)내의 표적에 대한 항체의 인식 능력을 조사하기 위하여, 면역탁본법 테스트가 세균 제공 PBP2a (CEB 및 COL MRSA), MSSA (메치실린-민감 황색 포도상 구균(methicillin-sensitive Staphylococcus aureus) 균주 (PBP2a를 제공하지 않음), 반코마이신-내성 Enterococcus sp. strain (PBP5 제공), 베타-락탐 항생제에 대한 낮은-친화도를 가진 트랜스펩티다아제(PBP2a와 상동임), 및 음성 조절자로서의 Escherichia coli 균주 (여기서, 재결합 단백질이 생성됨) 로 수행되었다. 얻어진 결과는 항체가 MRSA 및 Enterococcus sp. 균주내에서, 각각 PBP2a와 PBP5의 사이즈에 대응되는 약 76 kDa의 분자량을 가진 단백질을 인식할 수 있음을 보여준다. Escherichia coli 균주를 가지는 메치실린-민감 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)(PBP2a-음성)의 단백질에 대해서는 단클론 항체의 어떠한 반응도 확인할 수 없었다.

그 결과는 도 3에서 확인할 수 있다(MRSA와 MSSA에 대한 면역탁본법).

항-PBP2a 단클론 항체를 함유하는 상청액에 대한 MRSA와 MSSA 용해질의 면역탁본법 테스트의 결과가 도 3에 도시되어 있다.

1. - 분자량 마커(Kaleidoscope);

2. - 지수증식기에서 증식된 MSSA 샘플;

3 및 4. - 지수증식기에서 증식된 MRSA 샘플;

5. - 정지기내에서 밤 사이에 증식된 MSSA 샘플; 및

6 및 7. - 정지기내에서 증식된 MRSA 샘플.

왼쪽 화살표는 PBP2a 분자량을 나타낸다.

3.2. 세균 표면에서의 PBP2a 인식 - 유속 세포분석법

유속 세포분석법 테스트의 목적은 고유한 형태로 단클론 항체에 의한 세균내의 표적 인식 능률을 입증하기 위한 것이다. 이전의 테스트(면역탁본법)에서, 단백질에서의 표적 인식은 변성 과정을 거치게 됨을 관찰할 수 있었고, 이러한 변성 과정은 변성 폴리아크릴아미드 겔내에서의 전기영동에 의한 단백질 분리 동안에 일어난다. 또한, 음성 조절자 균주(MSSA, PBP2a-음성)와 MRSA 균주 (CEB)가 지수증식기 및 정지기에서 증식됨을 알 수 있었다. 얻은 결과는 항체가 양 조건하에서 세균 표면상의 표적을 인식할 수 있다는 것을 보여준다. Staphylococcus 표면에서의 단백질 A의 존재는 항체가 PBP2a와 결합하는 것을 억제할 수 없었다. 얻어진 결과는 도 4에서 확인할 수 있다.

도 4는 항-PBP2a 단클론 항체와 함께 배양되고 피코에리트린(PE)으로 표시된 MRSA(CEB)와 MSSA 세균에 대한 유속 세포분석의 결과치를 나타낸다. (1)은 MSSA 세균을, (2)는 정지기에서 증식된 MRSA를, (3)은 지수증식기에서 증식된 MRSA를 나타낸다. MRSA 집단은 우측으로 이동됨을 나타내는데, 이는 형광 접합체에 의해 표시된 세포의 증가를 의미한다.

4. 항- PBP2a 단클론 항체에 의해 부여되는 방어에 대한 평가

4.1. 시험관내 방어 테스트

최소 억제 농도( MIC )의 결정

이러한 분석은 폐쇄계에서 그 자체를 표적에 직접 결합시키기 위한 항체 능력을 평가하는 것을 목적으로 한다. 최종적인 치료를 위한 단클론 항체에 대하여, 긍정적 결과는 상당한 의미를 가진다. 이는 항체가 표적을 인식할 수 있고, 숙주의 선천적 및 적응성 면역 시스템과 관련된 결합 작용으로부터 얻을 수 있는 보체 활성화 및 옵소닌화 메커니즘과 같은, 숙주 면역 시스템의 도움 없이도 세균 증식을 차단할 수 있음을 의미한다.

CEB, COL, 및 Iberian MRSA 균주가 평가되었고, 여기서 유사한 MIC 값 (대략 500 마이크로그램)이 평가된 조건에서 확인되었다. 이러한 데이터는 상이한 MRSA 균주의 유전적 배경에 상관 없이, 증식을 차단하기 위해 필요한 항체 투여량이 동일하지 않음을 나타낸다.

이러한 결과치는 도 5에서 확인할 수 있다.

도 5는 상이한 MRSA 균주로부터의 10⁵ 세포의 접종물에 대하여, 항-PBP2a 정제 단클론 항체 및 반코마이신에 의해 부여되는 시험관내 방어(MIC-최소 억제 농도) 테스트를 나타낸다.

혼탁도의 부재는 분석된 조건하에서 세균 증식이 없음을 나타낸다.

1A: CEB MRSA (브라질 전염병 클론) + 항체 250 ㎍;

2A: CEB MRSA + 항체 500 ㎍;

3A: CEB MRSA + 항체 750 ㎍;

4A 및 6A: CEB MRSA 균주의 음성 조절자;

1B: COL MRSA + 항체 250 ㎍;

2B: COL MRSA + 항체 500 ㎍;

3B: COL MRSA + 항체 750 ㎍;

4B 및 6B: COL MRSA 균주의 음성 조절자;

1C: Iberian MRSA (유럽 전염병 클론 - EEC) + 항체 250 ㎍;

2C: EEC MRSA + 항체 500 ㎍;

3C: EEC MRSA + 항체 750 ㎍;

4C and 6C: EEC MRSA 균주의 음성 조절자

1D: CEB MRSA + 반코마이신 150 ㎍;

2D: CEB MRSA + 반코마이신 300 ㎍;

3D: CEB MRSA + 반코마이신 500 ㎍;

4D: CEB MRSA + 반코마이신 750 ㎍;

5D 및 6D: 음성 조절자.

4.2. 생체내 방어 테스트

4.2.1. CEB , Iberian , WB79 CA , 및 COL MRSA 균주에 대한 치시량 및 준치사 량 결정

이러한 분석은 동물(LD₅₀)의 약 50%에서 사망을 초래한, 두개의 사용된 모델-준치사량에 의한 신장 정량 및 더 많은 세균 접종물을 가진 체계적 감염후의 생존 테스트에서의 생체내 방어를 평가하기 위하여 필요하다. 선택된 경로는 복강내 투여 방식인데, 이는 투여 시설 및 손실을 줄이기 위한 것이다. Reed-Muench 방법이 이러한 분석을 수행하기 위하여 적응되게 사용되었는데, LD₅₀와 준치사량을 결정하기 위하여 조건당 두개의 동물(증가하는 농도로 감염된 세균 투여)을 가지고 수행되었고, 3개의 상이한 투여량이 테스트되었고, 이미 Staphylococcus aureus에 대한 평균적 치사량에 대한 지식을 가지고 있었다. COL MRSA 균주와 게놈을 서열화하기 위한 첫번째 MRSA 클론이 이러한 병원체에서 연구를 위한 참조 균주로 사용된다.

그러나, 그것은 병원성이 강하지 않았음을 보여주었으며, 동물에게서 감염을 야기하기 위하여는 다른 MRSA 클론과 관련하여 보다 높은 감염투여량을 필요로 함을 보여주었다. 따라서, 그것은 방어 분석에서 사용되지 않았다.

4.2.2. 준치사량을 가진 체계적 감염 후의 신장 방어 분석

감염 후의 신장 정량 모델을 사용함으로써, 이러한 분석은 체계적 감염 후 중요한 기간(신장)에서의 세균 존재를 감소시킬 수 있는 항체 능력을 평가할 수 있도록 해 준다. 3 log(1000 times) 보다 높은 감소는 상이한 유전적 배경으로부터의 병원성이 강한 MRSA 균주로 3번의 독립된 분석을 행함으로써 달성되었다. 이러한 분석에 있어서, 동물은 항체 500 마이크로그램의 투여량을 투여받았다. 보다 낮은 항체 투여량(250 마이크로그램)에 의해 부여되는 방어는 CA-MRSA 균주를 가지고 행한 분석에서 평가되었다. 여기서, 세균 감소가 또한 관찰되었지만, 그러나 500-마이크로그램 투여량으로 얻은 것 보다는 낮았다. 그 결과는 도 6A, 6B 및 6C에서 확인할 수 있다.

도 6A는 MRSA CEB 균주의 준치사량으로 체계적 감염되고, 항-PBP2a 단클론 항체로 치료받은 그리고 치료받지 않은 동물의 신장 정량 분석 결과를 도시한다. 수평 줄무늬: 치료하지 않은 각각의 동물의 신장으로부터 분리된 세균 농도에 대한 log. 바둑판 무늬: 항체로 치료한 동물 각각의 신장으로부터 분리된 세균량의 log. 세균 정량: 조절자: C1: 2000 세균; C2: 29,000 세균; C3: 220,000 세균;; C4: 52,000 세균 (75,750 세균의 평균). 치료된(방어된) 동물: P1: 20 세균; P2, P3, 및 P4: 10 세균 (12.5 세균의 평균). 비-치료된 동물과 관련하여 치료된 동물로부터 회수한 세균량의 감소: 6060 배.

도 6B는 Iberian MRSA 균주(유럽 전염병 클론)의 준치사량으로 체계적 감염되고, 항-PBP2a 단클론 항체로 치료받은 그리고 치료받지 않은 동물의 신장 정량 분석 결과를 도시한다. 수평 줄무늬: 치료하지 않은 각각의 동물의 신장으로부터 분리된 세균 농도에 대한 log. 큰 바둑판 무늬: 항체로 치료한 동물 각각의 신장으로부터 분리된 세균량의 log. 작은 바둑판 무늬 막대는 각각으로부터 평균값을 얻은 것을 나타낸다. 세균 정량: 조절자: C1: 210,000 세균; C2: 44,000 세균; C3: 300,000 세균;; C4: 290,000 세균 (211,000 세균의 평균). 치료된(방어된) 동물: P1: 80 세균; P2: 200 세균; P3: 10 세균, 및 P4: 60 세균 (87.5 세균의 평균). 비-치료된 동물과 관련하여 치료된 동물로부터 회수한 세균량의 감소: 2420 배.

도 6C는 WB79 CA-MRSA 균주(브라질 지역 균주)의 준치사량으로 체계적 감염되고, 항-PBP2a 단클론 항체로 치료받은 그리고 치료받지 않은 동물의 신장 정량 분석 결과를 도시한다. 다섯개의 처음 막대(xx 무늬, 수평 줄무늬 및 큰 바둑판 무늬): 치료하지 않은 각각의 동물의 신장으로부터 분리된 세균 농도에 대한 log. 첫번째 막대(xx 무늬): 안락사 전에 죽은 동물과 관련된 예측치. 막대 6, 7, 8 및 9(수평 줄무늬 및 바둑판 무늬): 항-PBP2a 단클론 항체 250 ㎍으로 치료한 동물의 신장으로부터 분리된 세균량의 log. 막대 10, 11, 12 및 13(삼각형 무늬): 항체 500 ㎍으로 치료한 동물 각각의 신장으로부터 분리된 세균량의 log. 바둑판 무늬 막대(5^th, 9^th, 및 13^th 막대)는 각각으로부터 평균값을 얻은 것을 나타낸다. 세균 정량: 조절자: C1: 650,000 세균; C2: 26,000 세균; C3: 17,000 세균;; C4: 500,000 세균 (죽은 동물 예측치)(231,000 세균의 평균). 항체 250 ㎍으로 치료한 동물: P1: 0; P2: 5,400 세균; P3: 830 세균, 및 P4: 10 세균 (1,560 세균의 평균). 항체 500 ㎍으로 치료한 동물: P1: 80; P2: 0; P3:210; P4:80 세균(92.5의 평균). 항체 250 ㎍으로 비-치료된 동물과 관련하여 치료된 동물로부터 회수한 세균 량의 감소: 149 배. 500 ㎍으로: 2,497 배.

4.2.3. 생존 분석

이러한 분석 방법으로, 동물(LD₅₀)의 50% 이상을 죽일 수 있는 세균량으로 감염시킨 후, 그 동물에 대하여 항체에 의해 부여되는 방어를 평가할 수 있다. 신장 정량 분석에서 사용된 3개의 균주에 대한 방어가 평가되었다. 항-MRSA 단클론 항체로 치료중인 동물의 (i) 생존 시간 및 (ii) 생존률의 증대가 3개의 독립적 분석에서 관찰되어졌다. CEB MRSA 균주와 관련된 분석에서는, 치료중인 동물의 70%가 감염을 극복하고 생존하였고, 이에 반하여 조절자 그룹(비-치료)의 단지 10%만이 생존하였다. Iberian MRSA 균주와 관련해서는, 얻은 결과가 유사한데, 치료중인 동물의 60%가 방어되어 생존하였고, 조절자 그룹의 100%가 죽었다. CA MRSA 균주와 관련한 분석에서는, 조절자 동물에서의 70%와 대비하여 100%의 방어가 관찰되어졌다. 이러한 결과는 도 7a, 7b 및 7c에서 확인할 수 있다.

도 7A는 복강내 경로(LD₅₀)를 통하여 투여된 2.3 x 10⁸ 세균(CEB MRSA)의 투여량에 의한 감염 후, 치료받은(방어된) 동물과 치료받지 않은(조절자) 동물의 생존률 곡선을 도시한다.

도 7B는 복강내 경로(~LD₅₀)를 통하여 투여된 4.2 x 10⁸ 세균(Iberian MRSA)의 투여량에 의한 감염 후, 치료받은(방어된) 동물과 치료받지 않은(조절자) 동물의 생존률 곡선을 도시한다.

도 7A는 복강내 경로(~LD₅₀)를 통하여 투여된 1.1 x 10⁹ 세균(WB79 CA-MRSA)의 투여량에 의한 감염 후, 치료받은(방어된) 동물과 치료받지 않은(조절자) 동물의 생존률 곡선을 도시한다.

4.2.4. 단클론 항체 대 반코마이신에 의해 부여되는 방어에 대한 비교 연구

반코마이신은 MRSA에 의한 심각한 감염의 치료를 위해 첫번째로 선택되는 항균제이기 때문에, 방어에 대한 비교 연구가 이전의 모델과 상이한 모델에서 수행되었다. 이러한 연구에서, 동물은 감염되었고, 항균제 또는 단클론 항체의 투여는 감염 4 시간 바로 후에 개시되었다. 본 연구는 3개의 별개 그룹으로 수행되었는데, 하나는 반코마이신으로 치료받았고, 다른 하나는 단클론 항체로 치료받았고, 그리고 세번째는 항균제+항체를 동시 투약하여 치료하였다. 반코마이신 투여량은 조절되었고, 인체 감염의 경우와 유사한 방법으로 투여되었다(매 12 시간 마다 500 mg). 얻은 결과는 감염 후 3일째 항균제 또는 항체로 치료한 동물의 신장에 존재하는 세균량에서 대략 15 배의 감소가 있었음을 나타낸다. 그러나, 4,617배의 감소가 항균제 및 항체로 치료받은 그룹에서 볼 수 있었다. 이러한 결과에 기초하여, 항체 투여량에 의해 부여되는 방어는 5 반코마이신 투여량과 대응하고, 반코마이신과 항체의 동시 투여가 감염된 동물의 신장에서 관찰되는 세균수를 감소시키는데 있어 가장 효과적이었음을 결론지을 수 있었다. 이러한 연구는 반코마이신과 분리되거나 또는 반코마이신과 연합하는 항-MRSA 단클론 항체의 방어 작용을 보다 더 잘 관찰할 수 있도록 하기 위하여 몇몇 더 적은 감염량으로 반복되었다(도 8 참조). 보다 적은 감염 투여량을 가지고 두번째 분석을 수행한 후에, 얻어진 결과는 최초의 결과를 확인해 주었다. 단클론 항체에 의한 치료로 부여된 방어는 89배의 감소를 가져왔는데, 이는 5 반코마이신 투여량에 의한 치료(35배의 감소)로 얻은 방어 보다도 높았다. 그러나, 가장 상당한 감소 결과를 보이는 것은 항체+반코마이신으로 치료한 그룹에서 관찰되었는데, 이는 450배의 감소를 가져왔다.

도 8A는 6.0 x 10⁷ 세균 (CEB MRSA) 감염 후, 항-PBP2a 단클론 항체, 반코마이신 및 항체+반코마이신 연합으로 치료한 동물과 비-치료한 동물의 신장에서의 세균 정량분석을 도시한다. 감염 후 4시간 지나 치료가 시행되었다. 반코마이신은 매 12시간 마다 투여되었다(5 투여량). 막대 1, 2, 3, 4, 및 5 (줄무늬): 비-치료된 동물(조절자)로부터 회수한 세균 농도의 log. C1: 7,000,000; C2: 295,000; C3: 380,000; C4: 3,200,000 (평균: 2,718,750 세균). 막대 6, 7, 8, 9, 및 10 (바둑판 무늬): 항-PBP2a 단클론 항체의 400 ㎍으로 치료한 동물로부터 회수한 세균 농도의 log. P1: 4,200; P2: 310,000; P3: 330,000; P4: 90,000 (183,550 세균의 평균). 막대 11, 12, 13, 14, 및 15 (구 모양): 반코마이신으로 치료한 동물. P1: 110,000; P2: 58,000; P3: 500,000; P4: 21,000 (172,250 세균의 평균). 막대 16, 17, 18, 19, 및 290 (삼각형 모양): 항체 (300 ㎍) + 반코마이신으로 치료한 동물로부터 회수한 세균 농도의 log. P1: 1,100; P2: 700; P3: 450; P4: 90 (585 세균의 평균).

도 8B는 7.0 x 10⁶ 세균 (CEB MRSA) 감염 후, 항-PBP2a 단클론 항체(막대 7 내지 12), 반코마이신(막대 13 내지 18), 항체+반코마이신 연합(19 내지 24)으로 치료한 동물과 비-치료한 동물(막내 1 내지 6)의 신장에서의 세균 정량 분석을 도시한다. 감염 후 4시간 지나 치료가 시행되었다. 반코마이신은 매 12시간 마다 투여되었다(5 투여량). 막대 1 내지 6: 비-치료된 동물(조절자)로부터 회수한 세균 농도의 log. C1: 6,000; C2: 1,000; C3: 500; C4: 118,000; 및 C5: 1,000 (평균: 25,220 세균). 막대 7 내지 12: 항-PBP2a 단클론 항체 500 ㎍으로 치료한 동물로부터 회수한 세균 농도의 log. MB1: 450; MB2: 200; MB3: 100; MB4: 20; MB5: 0 (284 세균의 평균). 막대 13 내지 18: 반코마이신으로 치료한 동물. VC1: 100; VC2: 700; VC3: 0; VC4: 0; VC5: 2800 (720 세균의 평균). 막대 19 내지 24: 항체 500 ㎍+반코마이신으로 치료한 동물로부터 회수한 세균 농도의 log. MBV1: 130; MBV2: 20; MBV3: 10; MBV4: 80; MBV5: 20 (56 세균의 평균).

5. 결합 활성 분석

단클론 항체 클론 10 및 38의 결합 활성 테스트 결과:

요소 프로토콜 결합 활성:

클론 10: 1.03/1.46 (DOs with/without 치료) = 70.5%

클론 38: 1.00/1.21 = 82.6%

암모늄 티오시안산염 프로토콜 결합 활성:

Clone 10 (DOs):

조절자: 1.12

티오시안산염-치료 샘플:

2 M = 0.046; 1.5 M = 0,047; 1 M = 0.107; 0.75 M = 0.483; 0.5 M = 0.602; 0.375 M = 0.684

결합 활성률: 2.47

클론 38 (DOs):

조절자: 1.22

티오시안산염-치료 샘플:

2 M = 0.056; 1.5 M = 0.062; 1 M = 0.129; 0.75 M = 0.648; 0.5 M = 0.758; 0.375 M = 0.793

결합 활성률: 4.40

양쪽 분석에 있어서 클론 38의 결합 활성률은 클론 10의 결합 활성률보다 더 높은 것을 볼 수 있다. 게다가, 양 프로토콜에 따르면, DO가 1.0에 근접하게 도달하도록 하기 위하여 클론 38 보다는 클론 10으로부터 50배 많은 항체를 사용하는 것이 필요하였다.

6. 단클론 항체의 연합 및 해리 상수의 결정(표면 플라즈몬 공명 방법[ SPR ] [BIAcore]에 의한 클론 10 및 38)

SPR 방법에 얻은 결과는 항체 결합 활성의 예비적 결과를 확인해 주는데, 클론 38은 다시 클론 10 보다 더 높은 결과를 보였다. 표 II에 나타낸 데이터에 의하면, 클론 38이 클론 10 보다 450배 높은 친화도를 가짐을 보여준다. 이러한 친화도는 주로 그 자체의 높은 연합률(association rate) 때문이고, 이는 클론 10 보다 대략 100배 더 높다. 클론 38의 매우 높은 친화도에 기인하여, 그 측정치는 장비 검출 한계점에 근접하는 한계를 제공한다. 그러나, 시행 계획 및 수행에서 주의를 기함으로써, Langmuir 모델을 사용하여 시행 데이터에 대한 탁월한 조절을 할 수 있고, 그 결과 얻어진 데이트는 신뢰할만 하다.

도 9는 재결합 PBP2a (항원) 및 단클론 항체 클론 38(도 9A) 및 클론 10(도 9B) 사이의 상호작용을 나타낸다. 흐린 줄무늬 커버는 우측 키에 따른 농도에서의 SPR 데이터를 나타낸다. 모든 샘플은 복제되어 분석되었고, 각각의 커버에 대한 1:1 Langmuir 이론적 모델이 각 커버 아래에 검은색으로 표시된다. 반응 유닛은 수직 축으로 표시되고, 시간은 초 단위로 수평선에 나타내어진다. 수평 축을 나타내는 가장 근접한 선은 각각의 샘플(음성 조절자)을 위한 기준선을 나타낸다.

표 II

항원(PBP2a)과 단클론 항체 클론 10 및 38 사이의 해리 및 상호작용 상수

7. 항- PBP2a 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄에 대한 상보적결정부위(CDRs)의 식별

사용된 항체(클론 38)를 생산하는 클론의 하이브리도마 세포내에서의 mRNA 추출 과정 후에, cDNA 획득이 수행되었고, PCR 반응은 상이한 경쇄 및 중쇄 대립인자에 대하여 이러한 물질을 가지고 수행되었다. 얻어진 물질은 PCR 반응에서 사용된 동일한 시작자 서열(SEQ ID NO.: 18 to SEQ ID NO.: 39로 정의됨)을 사용하여 시퀀싱되었다. 경쇄(391) 및 중쇄(310)는 3개의 상이한 시퀀싱에서 확인되었다. Kabat 및 Chotia 알고리즘을 적용하여, 경쇄 및 중쇄 CDRs를 식별할 수 있고, 이는 첨부된 청구범위의 목적이 된다.

아래와 같은 경쇄 및 중쇄 CDRs 서열을 제공한다.

SEQ ID NO.: 6 - CDR 1 경쇄 아미노산.

RSSQSIGHSNGNTYLE

SEQ ID NO.: 7 - CDR 2 경쇄 아미노산.

KVSNRFS

SEQ ID NO.: 8 - CDR 3 경쇄 아미노산.

FQGSYVPLT

SEQ ID NO.: 9 - CDR 1 경쇄 DNA.

cgcagcagccagagcattggccatagcaacggcaacacctatctggaa

SEQ ID NO.: 10 - CDR 2 경쇄 DNA.

aaagtgagcaaccgctttagc

SEQ ID NO.: 11 - CDR 3 경쇄 DNA.

tttcagggcagctatgtgccgctgacc

SEQ ID NO.: 12 - CDR 1 중쇄 아미노산.

GFSITSSSSCWH

SEQ ID NO.: 13 - CDR 2 중쇄 아미노산.

RICYEGSISYSPSLKS

SEQ ID NO.: 14 - CDR 3 중쇄 아미노산.

ENHDWFFDV

SEQ ID NO.: 15 - CDR 1 중쇄 DNA.

ggctttagcattaccagcagcagcagctgctggcat

SEQ ID NO.: 16 - CDR 2 중쇄 DNA.

cgcatttgctatgaaggcagcattagctatagcccgagcctgaaaagc

SEQ ID NO.: 17 - CDR 3 중쇄 DNA.

gaaaaccatgattggttttttgatgtg

상보적 데이터

게다가, 본 발명의 발전을 이끄는 다른 분석이 수행되었다. 이는 아래의 실시예를 통하여 설명된다.

실시예 3

CEB MRSA 균주를 사용한 두번째 연구가 수행되었고, 실시예 1, 항목 7.2에 기술된 것과 동일한 프로토콜을 따랐다. 다만, 각각의 세척 후 각 15 초 동안 소용돌이로 휘젖는 두개의 펄스를 추가하였는데, 이는 Staphylococcus aureus 덩어리를 분해하고 항체에 노출되는 PBP2a의 양을 증대시키기 위한 목적이다.

표시자 FITC(형광물질 이소티오시안산염) 및 PE(피코에리트린)이 조절자 샘플들(i. 순수 세균, 단클론 항체와 접촉 없음; 및 ii. 순수 세균 + FITC 또는 PE 표시자)로 테스트되었고, 단클론 항체로 치료되고 PE 또는 FITC로 표시된 샘플이 분석되었다. FACsalibur 디바이스에서의 판독은 선형 모드로 수행되었다.

도 10은 FITC-표시 항-PBP2a 항체의 존재하에서 MRSA 샘플에 대하여 유속 세포분석법으로 분석한 그래프이다. 커버 (x)는 비-표시 샘플에 대응하고, 커버 (y)는 표시 샘플에 대응한다. 얻어진 결과는 표시 집단의 약 22%가 디바이스에 의해 검출되었고, 이는 항-PBP2a 항체에 의해 세균 표면상에 존재하는 표적(PBP2a)가 인식되었음을 확인해 주는 것이다(도 10).

실시예 4

발명자는 enterococcus과 메치실린-내성 Staphylococcus aureus에 대하여 항-PBP2a 단클론 항체에 의해 부여되는 방어를 여전히 조사해 왔다. 이미 앞서 언급한 것에 따르면, 항체는 Enterococcus sp. 균주내에 존재하는 단백질, 아마도 PBP5-베타락탐에 대하여 낮은 친화도를 가진 트랜스펩티다아제로서 약 76 kDA(237 아미노산)의 분자량을 가지고 모든 enterococcus 균주내에 존재하는 단백질을 인식한다.

이러한 효소는 아래에 관련된 배열(ClustalW)에 따라 MRSA의 PBP2a를 나타내는 상동성을 제공한다.

배열은 MRSA PBP2a를 가지는 enterococci E. faecalis (Efas) 및 E. faecium (Efam)로부터 PBP5에 대응하는 서열을 가지고 수행되었다. 표시된 서열(굵게 표시된 서열-PBP5; 밑줄친 서열-PBP2a)은 단클론 항체를 생산하기 위하여 사용된 PBP2a 부위에 대응한다. 효소 활성 코어에 대응하는 아미노산은 이탤릭체로 표시되어 있다.

따라서, 시험관내 방어 분석에서의 치사량 및 LD₅₀ 결정이 수행되었고 생쥐 모델(Balb/C 생쥐)에서의 enterococcus 균주를 가지고 생체내 분석(신장 정량에 의한 준치사량 및 치사량을 이용한 생존 분석)이 수행되었는데, 이는 이전에도 MRSA를 가지고 수행된 적이 있었다.

이러한 결과는 대응하는 보고서에서 확인할 수 있다.

1.1. 시험관내 방어 분석

이러한 분석의 목적은 VRE enterococcus 균주에 대하여 항체가 부여하는 ㅅ시험관내 방어를 평가하기 위한 것이다. 시험관내 방어 테스트(MIC)에서, Enterococcus f. 임상 균주(VRE)에 대한 클론 38 정제 단클론 항체 (90/DA5/CB5/AA3 hib 77), 리쳇 연구소(Richet laboratory).

조건:

샘플: HPLC에 의한 상청액으로부터 정제, SelecSure MAB 수지, 투석, 동결건조. 항체 정량(Lowry 방법): 3.5 mg/mL

접종물 : VRE 균주

사전-접종물: 1 VRE 콜로니 in 20 mL Lb 및 반코마이신 (10 mg/mL), ON 37^oC, 160 rpm

접종물: 20 mL Lb내의 사전-접종물 400 mL, 200-mL erlenmayer, 37^oC, 160 rpm

7 시간 후의 DO_600nm 판독: 0.7

정량: 5.5 x 10⁸ 세균/mL

테스트 조건:

접종물: 5.5 x 10⁵ 세균

항체 농도: 항체 300, 400, 500, 600, 및 700 mg

배양 배지: 1 mL의 Luria 배지

세포 배양판, 24 캐비티

양성 조절자: Luria 배지 + 세균l 접종물

음성 조절자: Luria 배지

배양: 18 시간, 37^oC

도 11은 항체에 의해 부여된 방어력을 평가한 결과를 도시한다. 도 11에서 다음을 가진다.

A. 항체 300 mg

B. 항체 400 mg

C. 항체 500 mg

D. 항체 600 mg

E. 음성 조절자

F. 양성 조절자

G. 항체 700 mg

1.2. 복강내 경로에 의한 LD ₅₀ 및 치사량 결정 - 반코마이신-내성 Enterococcus faecium

프로토콜:

암컷 7-주 Balb/C 동물, 평균 20 그램의 무게

Day 01 - 사전-접종물: 10 mL의 Lb 배지내의 1 VRE 균주 콜로니 및 반코마이신(10 mg/mL), 50-mL Falkow 튜브, 증식 ON 37^oC, 160 rpm

Day 02 - 접종물: 50 mL의 Lb 배지내의 사전-접종물 1mL/반코마이신 (250-mL erlenmayer) - 4 작은병, 37^oC, 160 rpm, OD_600nm = 0.80까지 증식

10분 동안 원심분리, 4000 rpm, PBS 1x 무균으로 재부유시킴, OD 1.2

정량: 2.1 x 10⁸ 세균/mL

A. 60 마이크로리터 (1.5 x 10⁷)

B. 300 마이크로리터 (6.5 x 10⁷)

C. 900 마이크로리터 (300 마이크로리터/dose까지 감소됨) (1.5 x 10⁸)

D. 4.5 mL (300 마이크로리터/dose까지 감소됨) (6.5 x 10⁸)

E. 9.0 mL (1.2 x 10⁹ 세균) (300 마이크로리터/dose까지 감소됨)

F. 45.0 mL (6.5 x 10⁹ 세균) (300 마이크로리터/dose까지 감소됨)

동물 관찰은 시험 날짜 02부터 10일째까지 수행되었다. 결과가 도 12에 도시되어 있고, 치사량이 1.2 x 10⁹ 세균 및 LD₅₀ 이 6.5 x 10⁸ 세균이라는 결론에 도달했다.

7일째 날에 생존하는 동물의 신장 정량:

A (1.5 x 10⁷): 세균 증식 없음

B (6.5 x 10⁷): 세균 증식 없음

C (1.5 x 10⁸): 3100 세균

D (6.5 x 10⁸): 2.8 x 10⁴ 세균

1.3. 생체내 방어 테스트 - 생존 테스트 - 치사량, 생쥐 모델에서 복강내 경로를 통한 체계적 감염

이러한 분석의 목적은 치사량의 Enterococcus faecium (VRE) 균주로 체계적 감염된 동물에 대한, 항-PBP2a 단클론 항체의 생체내 방어력의 효험성을 평가하는 것에 있다.

1. 항체 (혈청을 가진 배지내의 세포 배양을 통한 상청액으로부터 정제됨)

- 투석 및 동결건조된 정제 샘플(HPLC SelecSure MAB), 사용 이전에 ㅈ재잽재부유 및 여과됨.

- 정량 (Lowry 방법): 1.0 mg/mL

2. 생쥐 모델: 암컷, 8-주 Balb/C 동물, 23 내지 25 그램의 무게

3. 프로토콜:

그룹 A (6 동물): 항체 650 mg (350 mg + 300 mg)

그룹 B (6 동물): 조절자 (식염수 투여)

4. 세균 접종물의 준비:

VRE 균주:

사전-접종물, 날짜 01, 10 mL의 BHI 배지 및 반코마이신 10 mg/mL ON, 37^oC, 160 rpm

접종물, 날짜 03: 300 mL의 사전-접종물 in 30 mL BHI 및 반코마이신, DO₆₀₀ 1.31, 10분 동안 원심분리, 4,000 rpm, 무균 PBS 0.5x에서 재부유됨, OD = 1.10으로 조절, 정량 (2.0 x 10⁸ 세균/mL)을 위한 희석 및 플레이트; 접종물: 12 mL, 원심분리, 300mL로 재부유, IP 경로 (~2.2 x 10⁹ 세균)

시간 일정:

날짜 01: 항체 (350 mg)의 IP 접종

날짜 02: 항체 (300 mg)의 IP 접종, 오후에 체계적 감염 (IP, 250 mL의 세균 용액 - 2.2 x 10⁹ 세균)

날짜 02 내지 날짜 13: 동물 관찰.

결과는 도 13에 도시된다. 단지 2개의 치료된 동물이 죽었다(66.6%의 방어). 모든 조절자 동물은 둘째날에 죽었다.

1.4. 생체내 방어 테스트 - 반코마이신-내성 Enterococcus faecium 에 대하여 생쥐 모델에서 복강내 경로를 통한 체계적 감염

목적은 E. faecium (VRE) 균주의 체계적 감염에 대한, 항-PBP2a 및 PBP5 단클론 항체의 생체내 방어력의 효험성을 평가하는 것에 있다.

시험:

1. 항체 (혈청을 가진 배지내의 세포 배양을 통한 상청액으로부터 정제됨)

- 투석, 동결건조 및 재부유 정제 샘플(AffiPrep ProteinA Biorad/HPLC SelecSure MAB).

- 정량 (Lowry 방법): 1.5 ㎍/mL

2. 생쥐 모델: 암컷, 8-주 Balb/C 동물, 19 내지 23 그램의 무게

3. 프로토콜 :

그룹 A (4 동물): 항체 500 마이크로그램(2 달 이내, d01, d02)

그룹 B (4 동물): 비-방어된 조절자

4. 세균 접종물의 준비:

Iberian MRSA 균주:

사전-접종물, 10 mL의 Lb 배지 ON, 37℃, 120 rpm

접종물: 200 마이크로리터의 사전-접종물 in 20 mL의 Lb, DO₆₀₀ 0.80, 10 분 동안 원심분리, 4,000 rpm, 무균 PBS 0.5x에서 재부유됨, OD = 0.51로 조절, 정량 (2.4 x 10⁸ 세균/mL)을 위한 희석 및 플레이트; 접종물: 500 마이크로리터, IP 경로 (2.4 x 10⁸ 세균)

시간 일정:

Day 01: 복강내 경로를 통하여 250 마이크로그램 항체 접종

Day 02: 복강내 경로를 통하여 250 마이크로그램 항체 접종 및 체계적 감염(복강내, 500 마이크로리터의 세균 용액)

Day 06: 안락사, 신장의 세균 정량

상기 결과에 기초하여 다음을 강조할 수 있다:

시험관내 방어 분석 - 최소 억제 농도의 결정:

전체 700 마이크로그램의 항체가 550,000 세균의 증식을 차단할 수 있다. 이러한 값은 대략 500 마이크로그램이었던 MRSA에 대하여 얻어진 MiC 보다 더 높다.

생체내 방어 분석:

생체내 방어 테스트 - 반코마이신-내성 Enterococcus faecium의 치사량을 가지고 생쥐 모델에서 복강내 경로를 통해 체계적 감염

동물은 복강내 경로(IP)를 통해 500 마이크로그램의 단클론 항체를 투여받았고, 2.4 x 10⁸ 세균을 가지는 IP 경로를 통해 체계적 감염 상황에 놓여졌다. 4일 후, 그 동물은 안란사되었고 세균 정량 분석을 위해 신장이 적출되었다. 치료받은 동물은 평균 87.5 세균/동물을 나타내는 반면, 조절자(비-치료된 감염 동물)는 평균 211,000 세균/동물를 나태내었다.

치사량 투여후의 생존 테스트

동물은 단클론 항체(IP 경로) 650 마이크로그램을 투여받았고, 체계적 감염(IP 경로) 상태에 놓여졌고, 10일 동안 매일 관찰되었다. 감염 후 둘째날 까지 조절자(비-치료된) 동물은 죽었고, 치료된 동물(6) 중 두개가 둘째날 죽었고, 다른 것들은 시험 끝까지 생존하였다. 생존률은 66.6%였다.

따라서, 한번 더 우리는 MRSA 항-PBPa 단클론 항체가 enterococci에 대하여 교차 방어를 부여함을 보여주었다. 그러나, 방어를 부여하기 위해 필요한 투여량은 유사한 조건하에서 MRSA에 대항하여 사용된 것 보다 더 많았다. 이는 아마도 항체가 PBP2a와 동일한 효험도를 가진 PBP5를 인식하는데 있어서의 보다 낮은 능력에 기인한 것으로 보인다.

따라서, 여기서 설명된 본 발명-PBP2a 및 상동의 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 항-PBP2a 단클론 항체-은 이러한 단백질 또는 유사한 기질(MRSA, MRSE, 및 Enterococcus spp., 그리고 PBP2a와 상동인 단백질을 가지는 모든 다른 병원체)을 제공하는 세균에 의해 야기되는 감염에의 적용성을 가진다.

이러한 감염은 전세계적인 문제가 되고 있고, 그러한 분석은 공지의 전염성 MRSA 클론에 대하여 수행되었고, 본 발명의 생성물은 이러한 병원체에 의한 감염이 있는 모든 곳에서 널리 적용될 수 있음을 다시 한번 강조하고자 한다.

본 발명의 상세한 설명에서 언급된 바와 같이, 발명자의 종래 기술에 대한 인용과 관련된 문서는 다음과 같이 나열된다.

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tgtcttttaa 360 taagtgaggt gcgttaatat tgccattatt ttctaatgcg ctatagattg aaaggatctg 420 tactgggtta atcagtattt caccttgtcc gtaacctgaa tcagctaata atatttcatt 480 atctaaattt ttgtttgaaa tttgagcatt ataaaatgga taatcacttg gtatatcttc 540 accaacacct agttttttca tgcctttttc aaatttctta ctgcctaatt cgagtgctac 600 tctagcaaag aaaatgttat ctgatgattc tattgcttgt tttaagtcga tattaccatt 660 taccacttca tatcttgtaa cgttgtaacc accccaagat ttatcttttt gccaaccttt 720 accatcgatt ttataacttg ttttatcgtc taatgttttg ttatttaacc caatcattgc 780 tgttaatatt ttttgagttg aacctggtga agttgtaatc tggaacttgt tgagcagagg 840 ttctttttta tcttcggtta atttattata ttcttcgtta ctcatgccat acataaatgg 900 atagacgtca tatgaaggtg tgcttacaag tgctaataat tcacctgttt gagggtggat 960 agcagtacct gagccataat catttttcat gttgttataa atactctttt gaactttagc 1020 atcaatagtt agttgaatat ctttgccatc ttttttcttt ttctctatta atgtatgtgc 1080 gattgtattg ctattatcgt caacgattgt gacacgatag ccatcttcat gttggagctt 1140 tttatcgtaa agtttttcga gtcccttttt accaataact gcatcatctt tatagccttt 1200 atattctttt tgttttaatt cttcagagtt aatgggacca acataaccta atagatgtga 1260 agtcgctttt tctagaggat agttacgact ttctgtttca ttagttgtaa gatgaaattt 1320 ttttgcgaaa tcacttaaat attcatccat ttttttaacg gttttaagtg gaacgaaggt 1380 atcatcttgt acccaatttt gatccatttg ttgtttgata tagtcttcag aaatacttag 1440 ttctttagcg attgctttat aatctttttt agatacattc tttggaacga tgcctatctc 1500 atatgctgtt cctgtattgg ccaattccac attgtttcgg tctaaaattt taccacgttc 1560 tgattttaaa ttttcaatat gtatgctttg gtctttctgc attcctggaa taatgacgct 1620 atgatcccaa tctaacttcc acataccatc ttctttaaca aaattaaatt gaacgttgcg 1680 atcaatgtta ccgtagtttg ttttaatttt atattgagca tctactcgtt ttttattttt 1740 agatactttt tttattttac gatcctgaat gtttatatct ttaacgccta aactattata 1800 tatttttatc ggacgttcag tcatttctac ttcaccatta tcgcttttag aaatataact 1860 gctatcttta taaacttgtt tgaaattttt atcttcaatt gcatcaatag tattattaat 1920 ttctttatct tttgaagcat aaaaatatat accaaacccg acaactacaa ctattaaaat 1980 aagtggaaca atttttatct ttttcat 2007 <210> 3 <211> 76 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <223> sequencia de amino acido de fragmento de PBP2a <400> 3 Met Tyr Gly Met Ser Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys 1 5 10 15 Lys Glu Pro Leu Leu Asn Lys Phe Gln Ile Thr Thr Ser Pro Gly Ser 20 25 30 Thr Gln Lys Ile Leu Thr Ala Met Ile Gly Leu Asn Asn Lys Thr Leu 35 40 45 Asp Asp Lys Thr Ser Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Gly Trp Gln Lys Asp 50 55 60 Lys Ser Trp Gly Gly Tyr Asn Val Thr Arg Tyr Glu 65 70 75 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <223> sequencia de amino acido do centro ativo da PBP2a <400> 4 Ser Thr Gln Lys 1 <210> 5 <211> 228 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 5 atgtatggca tgagcaacga agaatataac aaactgaccg aagataaaaa agaaccgctg 60 ctgaacaaat ttcagattac caccagcccg ggcagcaccc agaaaattct gaccgcgatg 120 attggcctga acaacaaaac cctggatgat aaaaccagct ataaaattga tggcaaaggc 180 tggcagaaag ataaaagctg gggcggctat aacgtgaccc gctatgaa 228 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <223> sequencia de amino acido da cadeia leve para CDR1 <400> 6 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Gly His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <223> sequencia de amino acido da cadeia leve para CDR2 <400> 7 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <223> sequencia de amino acido da cadeia leve para CDR3 <400> 8 Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <221> misc_feature <223> sequencia de DNA da cadeia leve para CDR1 <400> 9 cgcagcagcc agagcattgg ccatagcaac ggcaacacct atctggaa 48 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <221> misc_feature <223> sequencia de DNA da cadeia leve para CDR2 <400> 10 aaagtgagca accgctttag c 21 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <221> misc_feature <223> sequencia de DNA da cadeia leve para CDR3 <400> 11 tttcagggca gctatgtgcc gctgacc 27 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <223> sequencia de amino acido da cadeia pesada para CDR1 <400> 12 Gly Phe Ser Ile Thr Ser Ser Ser Ser Cys Trp His 1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <223> sequencia de amino acido da cadeia pesada para CDR2 <400> 13 Arg Ile Cys Tyr Glu Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> MISC_FEATURE <223> sequencia de amino acido da cadeia pesada para CDR3 <400> 14 Glu Asn His Asp Trp Phe Phe Asp Val 1 5 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <221> misc_feature <223> sequencia de DNA da cadeia pesada para CDR1 <400> 15 ggctttagca ttaccagcag cagcagctgc tggcat 36 <210> 16 <211> 48 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <221> misc_feature <223> sequencia de DNA da cadeia pesada para CDR2 <400> 16 cgcatttgct atgaaggcag cattagctat agcccgagcc tgaaaagc 48 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <220> <221> misc_feature <223> sequencia de DNA da cadeia pesada para CDR3 <400> 17 gaaaaccatg attggttttt tgatgtg 27 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 18 atggaagctt gctgggtcta caagctgtgg att 33 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 19 atggaaatgg cagcctggtc ttattcctct 30 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 20 gatgtgaagc ttcaggagtc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 21 caggtgcagc tgaaggagtc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 22 caggtgcagc tgaagcagtc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 23 caggttactc tgaaagagtc 20 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 24 gaggtccagc tgcaacaatc t 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 25 gaggtccagc tgcagcagtc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 26 caggtccaac tgcagcagcc t 21 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 27 gaggtgaagc tggtggagtc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 28 gatgtgaact tggaagtgtc 20 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 29 tggacaggga tccagagttc caggtcact 29 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 30 gacattgtga tgacccagtc t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 31 gatgttttga tgacccaaac t 21 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 32 gatattgtga taacccag 18 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 33 gacattgtgc tgacccaatc t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 34 gatattgtgc taactcagtc t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 35 gatatccaga tgacacagac t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 36 gacatccagc tgactcagtc t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 37 caaattgttc tcacccagtc t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 38 caggctgttg tgactcagga a 21 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 39 tacagttggt gcagcatc 18

Claims (19)

1. 경쇄 가변 영역에서 SEQ ID NO.: 6을 포함하는 CDR1 영역, SEQ ID NO.: 7을 포함하는 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO.: 8을 포함하는 CDR3 영역을 가지며,
   중쇄 가변 영역에서 SEQ ID NO.: 12을 포함하는 CDR1 영역, SEQ ID NO.: 13을 포함하는 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO.: 14를 포함하는 CDR3 영역을 가지는 것을 특징으로 하는, 메티실린-내성 세균 (MRSA)으로부터의 PBP2a 단백질에 그 자체가 결합하는 분리된 단클론 항체.
2. 제1항에 있어서, 그룹 SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 16, 및 SEQ ID NO.: 17 중에서 선택되는 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 사슬 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 단클론 항체.
3. 경쇄 가변 영역에서 SEQ ID NO.: 6을 포함하는 CDR1 영역, SEQ ID NO.: 7을 포함하는 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO.: 8을 포함하는 CDR3 영역을 가지며,
   중쇄 가변 영역에서 SEQ ID NO.: 12을 포함하는 CDR1 영역, SEQ ID NO.: 13을 포함하는 CDR2 영역, 및 SEQ ID NO.: 14를 포함하는 CDR3 영역을 가지는 것을 특징으로 하는, Enterococcus spp.으로부터의 PBP5 단백질에 그 자체가 결합하는 분리된 단클론 항체.
4. 제3항에 있어서, 그룹 SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 16, 및 SEQ ID NO.: 17 중에서 선택되는 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 가변 사슬 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 단클론 항체.
5. PBP2a 또는 그것과 상동인 단백질을 함유한다고 의심되는 세균 샘플에 대해서, 순수하게 또는 다른 물질과 연합하여, 청구항 제1항 또는 제2항 중 어느 한항에서 정의한 것에 따르는, 분리된 단클론 항체의 첨가를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-락탐 항균제에 대한 내성을 검출하는 방법.
6. 청구항 제1항 또는 제2항에서 정의된 것에 따르는 다량의 분리된 단클론 항체와 약제학적 매개체인, 운반체 또는 부형제 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, PBP2a 또는 그것과 상동인 단백질을 갖는 세균에 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 제약 조성물.
7. 청구항 제1항 또는 제2항에서 정의된 것에 따르는 다량의 분리된 단클론 항체를, 인간을 제외한 동물에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, PBP2a 또는 그것과 상동인 단백질을 갖는 세균에 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
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