CN102887952A

CN102887952A - 具有双重结合活性的抗MRSA-PBP 2a的单克隆抗体

Info

Publication number: CN102887952A
Application number: CN2012100343002A
Authority: CN
Inventors: 黄若磐; 张英
Original assignee: RAYBIOTECH Inc GUANGZHOU
Current assignee: RAYBIOTECH Inc GUANGZHOU; Raybiotech Inc
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2012-02-15
Publication date: 2013-01-23
Also published as: US20130022997A1; US8741588B2

Abstract

本发明公开了一种具有双重结合活性的抗MRSA-PBP 2a的单克隆抗体。该单克隆抗体对MRSA菌表达的PBP 2a蛋白抗原表位具有特异的高亲和力，而对MSSA表达的PBP 2a蛋白不能特异性结合，从而能区分MRSA菌和MSSA菌。所述的单克隆抗体能够特异性结合S.aureus表达的PBP 2a蛋白的27-46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY氨基酸片段和375-400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS氨基酸片段以及两者的结合的抗原表位。本发明将应用于医学技术、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等领域。

Description

具有双重结合活性的抗MRSA-PBP 2a的单克隆抗体

技术领域：

本发明属单克隆抗体技术领域(生物医学技术领域)，特别是，实验已证实了一种能够特异性识别金黄色葡萄球菌(MRSA)抗原表位，并可区分MRSA和MSSA的单克隆抗体。

背景技术：

MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus)，即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是全球性导致病人感染的最重要的耐药致病菌之一。此菌对常用的多种抗生素广泛耐药，其中包括甲氧西林，其主要耐药机制是由于MRSA菌体产生的青霉素结合蛋白2a(Penicillin Binding Protein 2a，PBP 2a)，蛋白分子量为75kDa；此蛋白由菌体染色体，即mecA基因编码，大量实验证实，PBP2a对β-内酰胺类抗生素呈现低亲和力的结合，从而导致耐药性。依据本菌对抗生素的耐药性和敏感性，在临床上分为MRSA和MSSA(对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌)两类。

发明内容：

制备和鉴定出能特异性且高亲和力结合MRSA的PBP 2a蛋白的两种单克隆抗体，该抗体也能进一步区别MRSA和MSSA。

确定了两种单克隆抗体结合MRSA的PBP2a蛋白抗原表位，10A10.F2细胞株产生的单克隆抗体结合表位是，DKEINNTIDAIEDKNFKQVY，即位于氨基酸27～46；4B10.B6细胞株产生的单克隆抗体结合表位是，SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS，即位于氨基酸375～400。

另一方面，本发明还包括一种来源于MRSA的PBP2a抗原表位，该抗原表位能与单克隆抗体特异性结合，从而用于区分MRSA和MSSA。

在本发明的具体实例中，所述的抗原表位为S.aureus(MRSA)的PBP2a蛋白的27～46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY 和375～400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。

在本发明的具体实例中，所述的两种抗原表位包括核心氨基酸EDK。

在本发明的具体实例中，所述的抗原表位能被4B10.B6细胞株产生单克隆抗体特异性识别。

在本发明的具体实例中，所述的抗原表位能被10A10.F2细胞株产生单克隆抗体特异性识别。

在本发明的另一具体实例中，还包括一种区别MSSA和MRSA的方法，步骤包括：(i)分离制备耐药性及非耐药性葡萄球菌，并获取菌体培养上清及裂解液为鉴定样品；

(ii)将能够与MRSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位结合而不能与MSSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位结合的单克隆抗体与生物样本作用，所述的单克隆抗体还具有能够区分MRSA和MSSA菌的特性；

(iii)检测单克隆抗体与生物样本的结合物，由此，鉴定生物样本中的MRSA菌。

在本发明的具体实例中，所述的单克隆抗体为鉴定的4B10.B6细胞株产生。

在本发明的另一具体实施例中，所述的单克隆抗体为鉴定的10A10.F2细胞株产生。

附图说明：

为使更加容易理解本发明，下面结合附图，进一步阐述本发明。

图1.鼠抗MRSA单克隆抗体与培养的MRSA细胞蛋白特异结合的免疫印迹分析。样品经12％SDS-PAGE电泳分析，1.MR1(15μL/泳道)；2.MS1(15μL/泳道)；3.E.coli(15μl/泳道)；4.MR2(15μl/泳道)；5.MS2(15μl/泳道)；6.Protein Marker，MR1和MR2来源于MRSA菌，MS1和MS2来源于MSSA菌。

图2A和2B.鼠抗MRSA单克隆抗体与体外表达的PBP2a蛋白结合免疫印迹分析。

2A：1.Marker；2.PBP2a(2μg/泳道)；3.MR1(15μL/泳道)。

2B：1.PBP2a(2μg/lane)；2.PBP2a(0.2μg/Lane)，3.MR1(15μL/泳道)。

图3.显示单克隆抗体4b10.b6与合成肽抗原1733和1734的结合。包被抗原(100ng/孔)，非相关肽作为对照，常规包被96孔板，4℃包被过夜，封闭液封闭1小时，加入抗体的系列稀释液，然后加入过氧化物酶标记的抗鼠二抗(1∶20,000)检测。

图4A和4B显示单克隆抗体与肽1733和1734的结合作用能被竞争ELISA所抑制。两图均显示抗体与肽1733和1734的结合作用被竞争性抑制。100ng每孔包被抗原，将非相关性肽作为对照肽加入96孔板，4℃过夜，封闭液封闭1小时，加入抗体的系列稀释液，然后加入过氧化物酶标记的抗鼠二抗(1∶20,000)检测。

图5.阐明选择抗体的竞争结合斑点杂交分析。两种纯化后的抗体与抗原1733和1734结合。MRSA实验对照抗体特异的单克隆抗体抗MRSA单抗仅能与1733结合，抗PBP2a单克隆抗体既能与1734结合，也能与整个表达蛋白相结合。图6A-6D.抗体结合样品中抗原的免疫印迹分析。6A：4B10.B6克隆(亚型IgG1)；6B：10A10克隆(亚型IgM)；6C：供应商提供的抗MRSA单克隆抗体；6D：商业购买的抗PBP2a单克隆抗体。1.Marker；2.MRSA；3.MSSA；4.SEP1；5.E.coli。

图7A和7B.单克隆抗体能特异性沉淀MRSA裂解液中的蛋白。7A：染色SDS-PAGE；7B：特异性测定。检测：先将MRSA菌与4B10.B6抗体共同孵育，然后再与抗鼠磁珠孵育；洗脱的混合物加入SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白转印膜经生物素标记的10A10.F2抗体和Streptavidin-HRP系统检测，1.Marker；2.MRSA样本+沉淀抗体(15μl/泳道)；3.MSSA样本+沉淀抗体(15μl/泳道)。

图8.PBP2a蛋白的氨基酸序列。本发明的单克隆抗体识别的抗原表位区域用下划线标出。

图9.两种抗体与MRSA的结合位点。

以下的描述和实例将对以上附图进行更详细的说明。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实例，进一步阐述本发明，即通过下面的说明、附图、具体实例和权力要求来阐明发明的功能、对象和优点。

具体实施方式：

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。

除非特别提出，每一居中值，应为最小界限的十个单位的每一组均值，即介于最高和最低界限范围，而且，其它数值和均值也同样列入此描述范围。

除非另有说明，本发明所涉及的技术和科学术语是公众所理解的普通技术，任何类似或等同于此处描述的方法和材料也适宜于本公开发明，但现对优选方案做一描述。

该说明书中引用的所有出版物和专利都包括在参考文献中，就如出版物和专利指明均要一一列出，同时，这些文献用于揭示和描述引用部分相关的方法和材料。引用的任何出版物都是在申请日期前公开的，但不要误解为承认是提前公布，现在的公开是晚于该出版物。此外，提供的出版日期可以不同于实际的出版日期，这需要另外专门来证实。

本发明中的技术是显而易见的，此处描述说明的每一个都有独特的部分和特征，这可能比较容易地与其它几个的特征有区分或结合，而不偏离本发明的范围。所有引用的方法均会以有序、合理的步骤加以实施。

除非另有说明，本发明涉及的实施例将应用于医学技术、有机化学、生物化学、分子生物学、药理学等领域。文献中对这项技术进行了充分的说明。

除非另外说明，优先使用以下定义。

定义

本发明所涉及的描述和要求依照以下所述来定义。

本发明所述的“特异性结合”是指两种不同分子能特异地识别，而与其它分子的识别结合能力很弱。一般情况下，两个分子在其表面或孔穴具有特异性识别的区域。如抗原抗体的相互作用、酶与底物的相互作用、核苷酸的相互作用等。

本发明所述的抗体是一种免疫球蛋白，此蛋白因特定的空间互补结构或极性作用能够与另一分子特异性结合。这些抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体，可以通过常规技术方法制备，免疫动物并收集血清制备(多克隆抗体)，培养连续混合细胞系并收集分泌蛋白(单克隆抗体)，核苷酸序列的克隆与表达或者具有天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列编码的诱导片段。抗体包括完整的免疫球蛋白或者其片段，免疫球蛋白包括各类亚型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgY等。这些片段可能包括Fab、Fv、F(ab′)2、Fab′和scFv等。此外，也可以用免疫球蛋白或其片段的聚合物、集合体、耦合物维持对特定分子结合的亲和力。

说明

4B10.B6和10A10.F2两种鼠单克隆抗体分别特异性识别并结合MRSA表达的PBP2a蛋白，这两种单克隆抗体依常规技术制备。MRSA菌表达PBP2a重组蛋白，用该蛋白作为免疫原免疫小鼠，产生免疫反应。用该蛋白免疫小鼠后，取B细胞和骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞制备单克隆抗体，单克隆抗体经亲和层析进行纯化。

ELISA、Western Blotting和免疫沉淀法用来分析单克隆抗体与MRSA分泌的天然PBP2a的结合特性。如图1所示，4B10.B6和10A10.F2单克隆抗体均不能与分离自MSSA菌的蛋白相结合。

资料显示，本发明的两种单克隆抗体都能区分MRSA和MSSA菌。两种抗体识别PBP2a蛋白不同序列(图8和图9所示)。单克隆抗体10A10.F2特异性识别PBP2a蛋白的27-46位的氨基酸片段，而单克隆抗体4B10.B6特异性识别375-400位的氨基酸片段(图8所示)。两个表位，都有一个包含EDK氨基酸核心序列。

与商业化的MRSA抗体相比，4B10.B6单克隆抗体有独特的结合特性，此结合特性在于所述抗体能够特异性识别来自不同区域的合成肽。因此，可以认为PBP2a蛋白有两个区域作为结构相似的抗原表位被一种单克隆抗体所识别。本发明所述两种单克隆抗体能够将MRSA和MSSA区别开的特性是临床诊断检测的基础。

因此，本发明包括如下实施方案：杂交瘤细胞和该杂交瘤细胞制备的单克隆抗体、能够特异性识别PBP2a蛋白的单个或多个区域的单克隆抗体。而且，本发明所述单克隆抗体能够区别MRSA菌和MSSA菌。本发明还涉及一种鉴别MRSA菌和MSSA菌的方法。

本发明所述单克隆抗体能够高亲和的结合MRSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位，而对MSSA菌蛋白抗原没有任何结合活性。因而，所述单克隆抗体具有区别MRSA菌和MSSA菌的特性。

在本发明的具体实施例中，所述的两种单克隆抗体具有特异性结合S.aureus菌表达的PBP2a蛋白的抗原表位，即定位于27-46位、375-400位氨基酸，序列分别为DKEINNTIDAIEDKNFKQVY和SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。

在本发明的具体实施例中，所述的单克隆抗体能够特异性结合S.aureus菌表达的PBP2a蛋白的27-46位，即氨基酸片段DKEINNTIDAIEDKNFKQVY，将此单克隆抗体克隆命名为10A10.F2。

在本发明的具体实施例中，所述的单克隆抗体能够特异性结合S.aureus菌表达的PBP2a 蛋白的376-400位，即氨基酸片段SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS，将此单克隆抗体克隆命名为4B 10.B6。

在本发明的具体实施例中，阐述了分离自MRSA菌PBP2a蛋白的抗原表位，及所述单克隆抗体特异性结合，而且，能区分MRSA和MSSA菌。

在本发明的具体实施例中，所述的抗原表位位于S.aureus菌PBP2a蛋白的27-46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY 和375-400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。

在本发明的具体实施例中，所述的抗原表位包括核心氨基酸EDK。

在本发明的具体实施例中，所述的抗原表位能够被单克隆抗体4B10.B6特异性识别。

在本发明的具体实施例中，所述的抗原表位能够被单克隆抗体10A10.F2特异性识别。

在本发明的具体实施例中，还包括一种区别MRSA和MSSA的方法，步骤包括：(i)获得包括葡萄球菌的生物样本；(ii)将能结合MRSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位而不能结合MSSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位的单克隆抗体与生物样本反应；(iii)检测单克隆抗体与生物样本的结合产物，由此，检定生物样本中的MRSA，因此，所述单克隆抗体还具有能够区分MRSA和MSSA菌的特性。

在本发明的具体实施例中，所述的单克隆抗体细胞株为4B10.B6。

在本发明的具体实施例中，所述的单克隆抗体细胞株为10A10.F2。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。上述实施例中也许会有一些变化和修改，但不偏离于实施例的精神和原则。这些变化和修改包括在此发明范围内，此发明权利要求如下。

下列实施例用以说明本发明所用的一般技术和方法，如何用所述组分和成分实施方案，力求数据的准确性(如数量、温度等)，但是，一些差错和误差也在所难免。除非另有说明，组成用质量分数，温度单位为℃，压强为大气压。标准温度和大气压定义为20℃和一个大气压。

应该指出，本发明所述比例、浓度、数量和其他的数值数据用一定的格式表示。应理解，固定格式是为方便和简洁，因此，应灵活理解，数值不但明确地限定范围，而且，如果每个数值和子范围应用是，还包括所有的个别数值或数值的子范围。举例说明，浓度范围为，0.1％-5％应理解为不仅包括0.1wt.％，而且包括5wt.％的确切范围，还包括制定范围内的个别浓度(如，1％、2％、3％和4％)和子浓度范围(如，0.5％、1.1％、2.2％、3.3％和4.4％)。所述术语“约” 包括±1％、±2％、±3％、±4％、±5％、±6％、±7％、±8％、±9％或±10％，或者更多变更后的数值。

实施例1

图1.免疫印迹中使用一抗为纯化的鼠抗MRSA抗体(2μg/ml)，二抗为HRP标记的抗鼠二抗(1∶5000)，再用化学发光系统检测抗体结合的特异蛋白。图中箭头示抗体特异性识别结合细菌样品中的目标蛋白。

Claims

1.一种具有双重结合活性的抗MRSA-PBP 2a的单克隆抗体，其生物特征型是，该单克隆抗体对MRSA菌表达的PBP2a蛋白抗原表位具有特异的高亲和结合力，而不能结合MSSA菌表达的蛋白，从而能特异性地鉴定出MRSA和MSSA两种菌。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，该单克隆抗体能够特异性结合S.aureus表达的PBP2a蛋白的27-46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY氨基酸片段和375-400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS氨基酸片段以及两者的结合的抗原表位。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体能够特异性结合S.aureus菌表达的PBP2a蛋白的27-46位的DKEINNTIDAIEDKNFKQVY氨基酸片段，分泌此抗体的细胞株命名为10A10.F2。

4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体能够特异性结合S.aureus表达的PBP2a蛋白的376-400位的SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS氨基酸片段，分泌此抗体的细胞株命名为4B10.B6。

5.所鉴定出的抗体结合MRSA菌的PBP2a蛋白抗原表位，其特征在于，所述抗体仅特异性地结合此表位，用以鉴定MRSA和MSSA两种菌。

6.根据权利要求5所述的抗原表位，其特征在于，该抗原表位分别位于S.aureus(金黄色葡萄球菌)PBP2a蛋白的氨基酸序列的27-46位，DKEINNTIDAIEDKNFKQVY和375-400位SNEEYNKLTEDKKEPLLNKFQITTS。

7.根据权利要求6所述的抗原表位，其特征在于，所述的抗原表位包括核心氨基酸EDK。

8.根据权利要求5和4所述的抗原表位，其特征在于，所述的抗原表位能被4B10.B6细胞株产生的单克隆抗体特异性的识别。

9.根据权利要求5和4所述的抗原表位，其特征在于，所述的抗原表位能被10A10.F2细胞株产生的单克隆抗体特异性的识别。

10.一种鉴定MRSA和MSSA两种金黄色葡萄球菌的方法，其主要步骤包括：

(i)分离制备耐药性及非耐药性葡萄球菌，并获取菌体培养上清及裂解液为鉴定样品；

(ii)将能结合MRSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位而不能结合MSSA菌来源的PBP2a蛋白抗原表位的单克隆抗体与生物样本作用，所述的单克隆抗体还具有能够区分MRSA和MSSA菌的特性；

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述为4B10.B6细胞株产生的单克隆抗体。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述为10A10.F2细胞株产生的单克隆抗体。