CN114894731A - 一种基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种α型抗独特型抗体的新型微囊藻毒素免疫检测方法。本发明方法利用氨基酸序列1~3所示的抗独特型抗体采用间接竞争ELISA法建立的新型免疫检测方法有潜力用于饮用水中微囊藻毒素的快速筛查检测。

Description

一种基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法
技术领域
本发明属于免疫学检测技术领域，具体为一种基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法。
背景技术
Hughes等人首次分离出铜绿微囊藻NRC-1提取物中的肝毒性“快速死亡因子”。这种肝毒性因子后来被重新命名为微囊藻毒素，微囊藻毒素（Microcystins, MC）具有蛋白磷酸酶抑制和强烈致肝癌作用。其产生的次级代谢产物毒素在湖泊海洋等水体中不断的累积，导致湖泊海洋水体质量下降，使得各类水生生物（鱼、虾）的生存环境遭到一定破坏，同时饮用水安全也受到威胁，对动物和人体的健康造成威胁，微囊藻毒素引起的人类和动物中毒事件已被多次报道。目前创建了很多基于微囊藻毒素的检测方法，主要有仪器分析法、生物测定法、蛋白磷酸酶抑制法和免疫分析技术。而免疫分析技术以其灵敏度高、检测通量大成为检测微囊藻毒素最快速、有效的方法。
根据其功能以及独特型和抗独特型之间的血清学反应，Bona将抗独特型抗体分为α、β、γ和δ四种亚型。其中Ab2α这类抗体识别与抗原决定簇分离的独特位点，即可变区的框架，并允许其与抗体结合而不影响抗体与半抗原的结合，因此它是半抗原非抑制的AId；Ab2β这类抗体与互补位上的独特位点结合，并与半抗原竞争结合，所以它是半抗原抑制性AId，在免疫学上称为抗原“内影像”。研究表明：某些 Ab2β可作为强毒性小分子半抗原的替代品建立相应的无毒免疫分析方法；Ab2γ这类抗体能识别抗体分子上与抗原结合部位相关的独特型决定簇，并与半抗原竞争或部分竞争结合，但是Ab2γ不具有 Ab2β的“内影像”，属于半抗原抑制性AId；Ab2δ这类抗体既能识别了抗体的Fc片段，同时亦能与抗原结合部位结合。目前常用来制备抗独特型抗体的方法有多克隆抗体技术、单克隆抗体技术和基因工程抗体技术。
本发明受到Mu等（Mu X, Tong Z, Huang Q, et al. Nano-magneticimmunosensor based on staphylococcus protein a and the amplification effectof HRP-conjugated phage antibody[J]. Sensors, 2015, 15(2):3896-910.）报道启发，由于噬菌体主要衣壳蛋白存在多拷贝(如主要衣壳蛋白PVIII含有多个2700多个拷贝)，可与多个抗噬菌体二抗发生结合，可能对检测信号起到放大作用，从而提高检测灵敏度的启发，设计基于α型抗独特型噬菌体纳米抗体的新型MC免疫检测方法。
发明人以实验室前期筛选制备的抗MC-LR单克隆抗体为靶标分子，在驼源纳米抗体库中成功筛选出α型抗独特型抗体，建立以α型抗独特型抗体为基础的间接竞争性ELISA检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于α型抗独特型噬菌体纳米抗体的新型MC免疫检测方法，以实现更有效的微囊藻毒素检测。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，包括如下步骤：
1）包被：用稀释的MC-LR-BSA包被酶标板；
2）封闭：将经过包被的酶标板孔进行封闭；
3）加样：向封闭好的酶标板孔中加入MC-LR和抗MC-LR单抗的混合物反应一段时间；
4）加抗独特型抗体：向反应好的酶标板孔中加入抗独特型抗体，反应一段时间；
5）加二抗：将经过HRP标记的二抗加入反应完成的酶标板孔中；
6）显色：加入TMB底物溶液显色，终止后用酶标仪读OD450值，
其中，所述抗独特型抗体是选自氨基酸序列1~3中的任一种。
具体地，在本发明方法的步骤1）中，所述包被过程包括：用CBS稀释的2μg/mL MC-LR-BSA包被酶标板孔，包被量100 μL/孔，4℃过夜包被。
具体地，在本发明方法的步骤2）中，所述封闭过程包括：包被好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，用4%MPBS封闭，300 μL/孔，37℃温育1h。
具体地，在本发明方法的步骤3）中，优选地，所述MC-LR和抗MC-LR单抗的混合物在加入酶标板孔之前先孵育一段时间，孵育时间0.5-6h。更优选地，孵育时间为3-6h。
具体地，在本发明方法的步骤3）中，所述加样过程包括：封闭好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，加入50μL纯化的稀释单抗溶液和50μL稀释成不同倍数的MC-LR标准品溶液，37℃温育1h，其中稀释单抗溶液的浓度为2.857 ng/mL，MC-LR标准品溶液的浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625、0 ng/mL。
具体地，在本发明方法的步骤4）中，抗独特型抗体的添加过程包括：反应好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，加入50μL 4％MPBS和50μL稀释至浓度为0.05~0.1μg/mL的抗独特型噬菌体纳米抗体救援上清，37℃温育1h。
具体地，在本发明方法的步骤5）中，加二抗过程包括：反应好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，用4%MPBS将HRP标记的抗M13二抗稀释至浓度为498 ng/mL，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃温育1h。
具体地，在本发明方法的步骤6）中，，显色过程包括：反应好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，加入现配的TMB底物溶液，100μL /孔，37℃显色15min，然后加入2MH2SO4终止反应，50μL/孔，用酶标仪读OD450值，其中所述TMB底物溶液为10mLCPBS+100μLTMB+25μL0.65%双氧水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首先提供了一种基于α型抗独特型抗体的新型微囊藻毒素LR免疫检测方法。利用添加回收试验对建立的方法进行验证，结果说明建立的新型微囊藻毒素免疫检测方法准确有效，该新型免疫分析方法的检测灵敏度比传统的间接竞争ELISA提高了5.6倍，且该检测模式具有潜在的商业价值。
附图说明
图1是MC-LR抗独特型抗体多克隆ELISA（左）和单克隆ELISA（右）的鉴定结果；
图2是4个阳性克隆的菌液PCR鉴定及氨基酸序列测序结果；
图3是不同孵育时间的剂量反应曲线；
图4是噬菌体克隆E8的竞争ELISA的标准抑制曲线；
图5是展示MC-LR抗独特型抗体的交叉反应率测定结果的表格；
图6是展示ELISA法和HPLC法检测自来水中MC-LR的添加回收实验结果的表格。
具体实施方式
下面将结合本发明的具体实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请采用了间接竞争ELISA法，利用α型抗独特型抗体E8进行微囊藻毒素LR的检测。
本发明首先提供了一种基于α型抗独特型抗体的新型微囊藻毒素LR免疫检测方法。将偶联复合物MC-LR-BSA包被于微量滴定孔上，添加不同梯度稀释的MC-LR和抗MC-LR单抗混合物，游离的MC-LR同固相化的MC-LR同时竞争抗MC-LR单抗，接着加入噬菌体纳米抗体上清，然后加入HRP标记的抗M13二抗，TMB底物显色并用2 M H2SO4终止反应，用酶标仪在450 nm下读取吸光值，颜色反应证实噬菌体抗体E8特异性结合抗MC-LR单抗。接着优化了不同的包被抗原抗体浓度和孵育时间，建立基于α型抗独特型抗体的MCs的间接竞争ELISA免疫分析检测方法。
利用添加回收试验对建立的方法进行验证，结果说明建立的新型微囊藻毒素免疫检测方法准确有效，且该检测模式具有潜在的商业价值。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的描述。
实施例中涉及的试剂、仪器来源：
抗MC-LR杂交瘤细胞（CCTCC No:C2019285）由本实验室制备获得。驼源噬菌体纳米抗体库购于成都阿帕克生物科技有限公司，该库的库容量为2×1010，噬菌体展示质粒为pComb3XSS，抗性为氨苄青霉素（Amp），宿主菌为E.coli TG1。
MC-LR、MC-YR标准品（纯度为95%）购自美国Abraxis公司， MC-RR MC-LA标准品（纯度为95%）购自农业部环境保护科研检测所。
96孔酶标板购自美国Corning公司。
辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自美国KPL公司。
12%预制胶、Tris-MOPS蛋白电泳缓冲液和Western blot TMB显色液（ChromoSensor TM One-Solution TMB Substrate）购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
脱脂奶粉购自索莱宝生物科技有限公司。
以下实施例所用其他化学试剂及有机溶剂均为国产分析纯。
台式冷冻离心机（Eppendoff）、电泳槽（北京君意JY-SCZ2+）、电泳仪（北京市六一仪器厂JY600E型）、小型台式离心机（Eppendorff Centrifuge 5424R）、酶标仪（ThermoMultiskan GO）、洗板机（Thermo Wellwash）、超低温冰箱（海尔）、纯水仪（MilliporeDirect-Q 3UV）、天平（良平仪器 FA2004）、pH计（Sartorius PB-10）、超净工作台（苏冻安泰有限公司SW-CJ-1F）、恒温培养箱（精宏仪器有限公司DNP-9082）。
实施例1微囊藻毒素LR抗独特型纳米抗体的筛选
参照商品化的天然纳米抗体文库说明书进行筛选：筛选中用到的是灭菌的96孔酶标板，每孔100 μL，至少准备4个孔，投入的噬菌体数量为109左右。
1）准备用无菌PBS稀释至终浓度为10 µg/mL 的纯化单抗溶液，包被量100 μL/孔，小心旋转直至微孔底部完全润湿，4℃过夜包被；2）次日，弃去包被液，用无菌PBS洗液洗板3次，每孔加满封阻液BSA-PBS，37℃作用1h；3）按上面所述方法除去封阻液，再用PBS缓冲液快速洗板3次，取10 μL噬菌体文库用390 μL无菌PBS缓冲液稀释，加入到4个已包被好的酶标孔中，100 μL/孔，37℃作用2h；4）弃去未与靶标分子结合的噬菌体，按3）中所述方法用无菌的0.05%PBST缓冲液洗涤5次；5）每孔加入100 μL非特异性缓冲液0.1M Glycine-HCl（pH2.2~2.5）缓冲液，37℃孵育10 min，洗脱分离已结合的噬菌体，接着将洗脱液移入到无菌1.5mL离心管中，加入30μL 1M Tris-HCl（pH 9.1）缓冲液用于中和；6）取少量（10 µL）洗脱物进行梯度稀释，用于测定滴度，取出一部分洗脱物于4℃中保存备用，剩余洗脱物混合后进行扩增，用于下一轮亲和淘选，共筛选3轮；7）将文库扩增结果进行第二、三轮淘选，改变淘选条件。重复步骤1）-5），抗原包被浓度分别降至5 μg/mL和2 μg/mL，封阻液BSA-PBS和OVA-PBS交替使用，结合时间分别降至1h和0.5h， PBST的洗涤次数分别增至10次和15次。其余步骤和上述相同。
实施例2微囊藻毒素LR抗独特型抗体的鉴定
采用多克隆ELISA和单克隆ELISA鉴定抗独特型抗体。多克隆ELISA具体步骤如下：1)用纯化单抗包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/mL，包被量 100 μL/孔，4℃过夜包被；2)次日用PBST洗液洗板3次后，用4%MPBS 封闭，300μL /孔，37℃温育1 h；3)洗板同上，每孔加入滴度相同（2×106）的经PEG/NaCl沉淀获得的每轮筛选的噬菌体上清，100 μL/孔，三个重复，37℃温育1 h；4)洗板同上，用4%MPBS将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗M13二抗稀释为5000倍，加入96孔板中，100μL/孔，37℃温育1 h；5)洗板同上，加入现配的底物溶液TMB（10mLCPBS+100μLTMB+25μL0.65%双氧水），100μL /孔，37℃显色15 min；6)加入2M H2SO4终止反应，50 μL/孔，用酶标仪读OD450值。
单克隆ELISA具体步骤如下：1）用纯化单抗包被96孔酶标板，包被浓度为2μg/mL，包被量 100 μL/孔，4℃过夜包被；2）次日用PBST洗液洗板3次后，用4%MPBS封闭，300μL/孔，37℃温育1 h；3）洗板同上，加入50μL噬菌体上清与50μL PBS，混合均匀，37℃温育1 h；4）洗板同上，用4%MPBS将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗M13二抗稀释为5000倍，加入96孔板中，100μL/孔，37℃温育1 h；5）洗板同上，加入现配的底物溶液TMB（10mLCPBS+100μLTMB+25μL0.65%双氧水），100μL /孔，37℃显色15 min；6）加入2M H2SO4终止反应，50μL/孔，用酶标仪读 OD450值。
采用菌液PCR和DNA和氨基酸测序进一步鉴定抗独特型抗体。具体步骤如下：经单克隆ELISA判定为阳性克隆的单菌落培养物各吸取10 μL转接到2×TY-AG液体培养基中，培养过夜后用于菌液PCR及其DNA和氨基酸测序鉴定。菌液PCR20μL反应体系如下所示：
菌液（模板） 1μL
2×Tap PCR Master Mix 10μL
特异性上游引物 1μL
特异性下游引物 1μL
ddH2O 7μL
总体积 20μL
PCR扩增反应条件设定为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
利用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行鉴定，验证PCR扩增产物的目的片段大小是否符合预期。
DNA和氨基酸序列测序，阳性克隆经过夜表达培养，次日吸取500μL培养液作好标记送往擎科生物科技有限公司进行测序。
图1显示了MC-LR抗独特型抗体多克隆ELISA（左）和单克隆ELISA（右）的鉴定结果。如图1（左）结果所示，经过三轮的筛选富集，噬菌体纳米抗体结合MC-LR单抗的能力逐渐增强。第三轮筛选后，多克隆ELISA 结果显示其结合能力最强。三轮筛选结束后，挑选300个单菌落进行单克隆ELISA鉴定，结果鉴定出4个阳性克隆（图1右）。其中 F7，E8单克隆阳性反应值最高。本实验筛选出的阳性克隆的表现是与抗体结合而且不影响MC-LR与抗体的结合，无抑制作用，可以判定这4个抗独特型抗体为Ab2α型。
图2显示了4个阳性克隆的菌液PCR鉴定及氨基酸序列测序结果。4个阳性单克隆的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结束后放置在凝胶成像分析仪中进行拍照，均出现了一条单一的条带，与预期的目的基因（358bp）大小片段相符。氨基酸测序结果中F7和E8的氨基酸序列相同，最终获得3个阳性克隆，均具有不同的氨基酸序列。
实施例3孵育时间的优化
采用间接竞争ELISA法检测微囊藻毒素。具体步骤如下：
1）包被：用CBS稀释的2μg/mL MC-LR-BSA包被96孔酶标板，包被量100 μL/孔，4℃过夜包被；
2）封闭：次日用0.05%PBST洗液洗板3次后，用4%MPBS封闭，300 μL/孔，37℃温育1h；
3）加样：洗板同上，加入分别预孵育0.5 h、1h、3h、6h的50μL纯化的稀释单抗和50μL稀释成不同倍数的MC-LR标准品混合物，每个浓度设三个重复，100μL/孔，设空白对照（100μL PBS），37℃温育1 h；
4）加二抗：洗板同上，用4%MPBS将辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗稀释为5000倍，加入96孔板中，100μL/孔，37℃温育1 h；
5）显色：洗板同上，加入现配的底物溶液TMB（10mLCPBS+100μLTMB+25μL0.65%双氧水），100μL /孔，37℃显色15 min；
6）终止：加入2M H2SO4终止反应，50μL/孔，用酶标仪读OD450值。
以MC-LR浓度的对数值为横坐标，以B/B0为纵坐标，生成MC-LR标准抑制曲线，运用四参数模型计算抑制中浓度IC50，观察几组实验IC50的变化差异，判断最佳孵育时间。
图3显示了不同孵育时间的剂量反应曲线。随着孵育时间的增加，测定灵敏度逐渐提高。在3小时和6小时观察到 IC50 值约为4.61 ng/mL 和4.665 ng/mL，与未孵育时的IC50 值相比，分别降低了2.97倍和3.08倍。但是当孵育时间长达6小时，其最大反应信号降低了50%。过夜孵育后未获得剂量依赖性曲线，显示接近背景信号值。因此，3h是达到最佳灵敏度的最佳孵育时间。
实施例4基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素竞争ELISA检测方法的建立
采用间接竞争ELISA法检测微囊藻毒素。具体步骤如下：
1）包被：用CBS稀释的2μg/mL MC-LR-BSA包被96孔酶标板，包被量100 μL/孔，4℃过夜包被；
2）封闭：次日用0.05%PBST洗液洗板3次后，用4%MPBS封闭，300 μL/孔，37℃温育1h；
3）加样：洗板同上，加入预孵育3h的50μL纯化的稀释单抗和50μL稀释成不同倍数的MC-LR标准品混合物，每个浓度设三个重复，100μL/孔，设空白对照（100μL PBS），37℃温育1 h；
4）加噬菌体E8：洗板同上，加入50μL 4％MPBS和50μL抗独特型噬菌体纳米抗体E8救援上清，上清被稀释大约1万倍，浓度为0.05~0.1μg/mL，37℃温育1h；
5）加二抗：洗板同上，用4%MPBS将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗M13二抗稀释为5000倍，加入96孔板中，100μL/孔，37℃温育1 h；
6）显色：洗板同上，加入现配的底物溶液TMB（10mLCPBS+100μLTMB+25μL0.65%双氧水），100μL /孔，37℃显色15 min；
7）终止：加入2M H2SO4终止反应，50μL/孔，用酶标仪读OD450值。
图4显示了噬菌体克隆E8的竞争ELISA的抑制曲线。噬菌体ELISA测定的的抑制中浓度IC50为2.8 ng/mL，线性检测范围为1.2-6.9 ng/mL，最低检测限IC10为0.8 ng/mL。噬菌体ELISA的IC10为0.8 ng/mL，达到了WHO规定的饮用水中MC的限量标准1ng/mL。
实施例5交叉反应率的测定
配制MC-LR及其结构类似化合物的梯度稀释标准溶液，按照基于E8的间接竞争ELISA检测步骤，建立MC-LR及其结构类似化合物的标准曲线计算抑制中浓度IC50，并计算其交叉反应率。交叉反应率越低，E8对MC-LR的特异性越强。
本实验测定了MC-RR、MC-YR 和 MC-LA 的交叉反应率。图5所示三种同系化合物的IC50分别为6.895 ng/mL、6.33 ng/mL和14.3 ng/mL，对应交叉反应率分别为 99.19%、107%和 48%。结果表明，E8对MC-RR、MC-YR具有相似的识别能力，对MC-LA识别能力较差。
实施例6 MC-LR毒素的添加回收试验
（1）HPLC法检测自来水样本
参照上海市地方标准DB31/T 1178-2019水源水中微囊藻毒素测定，检测条件为：色谱柱采用C18反相色谱柱(250×4.6 mm)；柱温为30℃；流动相为甲酸乙腈溶液（0.1%甲酸）和甲酸水溶液（0.1%甲酸）；流速为0.4 mL/min；紫外检测为238 nm；进样量为20μL。用20%甲醇将微囊藻毒素LR标品稀释为10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.01μg/mL，按照检测条件依次进样，获得微囊藻毒素LR的标准曲线。
将实验室自来水样品过膜处理，量取10mL水样品分别添加终浓度为4、14、30、60ng/mL的微囊藻毒素LR标品。经冷冻干燥机冻干处理成粉末，用1mL 20%甲醇10倍浓缩重悬，用于仪器测定回收MC-LR浓度。
（2）ELISA法检测自来水样本
在10 mL过膜处理后的自来水空白样品中添加终浓度为4、14、30，60ng/mL微囊藻毒素LR标品，在旋转混合仪上震荡混匀3h；将混匀后的样品直接用ELISA法检测。
图6显示了ELISA法和HPLC法的平均回收率分别在89.28-99.29%和97.1-114.34%之间。ELISA法和HPLC法的变异系数CV分别在2.85-11.97和1.62-4.12之间。相关系数为R2=0.9535。该结果说明二者具有良好的相关性。该新型ELISA检测方法有潜力应用于饮用水中MC的快速筛查检测。
序列表
氨基酸序列1（E8/F7）：
QVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAAAGFTFSTEPMDWVRQAPGKGLEWVSSISSDGGRTLYRDSVKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYFCARSDGEARGQGTQVSVSSAHHSEDPHGQAGQ
氨基酸序列2（B5）：
EVQLVESGGGSVQTGGSLRLSCVTSGISTSRECLGWFRQSPGKGREGVAILDSSNEITDHADSVKGRFTISRDTAKNTMYLQMDSLNTEDTGVYTCARSSQGQGTQVTVSSAHHSEDPGQAGQ
氨基酸序列3（D11）：
EVQLVESGGGSVQAGGSLTLSCALSQYTSHCLAWFREAPGKEREGVAAMDPAGNTYYLDAIKGRFTISKDSANKRLDLQMNSLKPEDTATYKCAGSGGGQGTRVSVSSAHHSEDPGQAGQ
本发明未详述之处，均为本领域技术人员的公知技术。
最后所要说明的是：以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改和等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）包被：用稀释的MC-LR-BSA包被酶标板；
2）封闭：将经过包被的酶标板孔进行封闭；
3）加样：向封闭好的酶标板孔中加入MC-LR和抗MC-LR单抗的混合物反应一段时间；
4）加抗独特型抗体：向反应好的酶标板孔中加入抗独特型抗体，反应一段时间；
5）加二抗：将经过HRP标记的二抗加入反应完成的酶标板孔中；
6）显色：加入TMB底物溶液显色，终止后用酶标仪读OD450值，
其中，所述抗独特型抗体是选自氨基酸序列1~3中的任一种。
2. 如权利要求1所述的基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，所述包被过程包括：用CBS稀释的2μg/mL MC-LR-BSA包被酶标板孔，包被量100 μL/孔，4℃过夜包被。
3. 如权利要求1所述的基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，所述封闭过程包括：包被好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，用4%MPBS封闭，300μL/孔，37℃温育1h。
4.如权利要求1所述的基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，所述MC-LR和抗MC-LR单抗的混合物在加入酶标板孔之前先孵育一段时间，孵育时间0.5-6h。
5.如权利要求4所述的基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，孵育时间为3-6h。
6. 如权利要求1所述的基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，所述加样过程包括：封闭好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，加入50μL纯化的稀释单抗溶液和50μL稀释成不同倍数的MC-LR标准品溶液，37℃温育1h，其中稀释单抗溶液的浓度为2.857 ng/mL，MC-LR标准品溶液的浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.390625、0 ng/mL。
7. 如权利要求1所述的基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，抗独特型抗体的添加过程包括：反应好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，加入50μL 4％MPBS和50μL稀释至浓度为0.05~0.1μg/mL的抗独特型噬菌体纳米抗体救援上清，37℃温育1h。
8. 如权利要求1所述的基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，加二抗过程包括：反应好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，用4%MPBS将HRP标记的抗M13二抗稀释至浓度为498 ng/mL，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃温育1h。
9. 如权利要求1所述的基于α型抗独特型抗体的微囊藻毒素免疫检测方法，其特征在于，显色过程包括：反应好的酶标板孔用0.05%PBST洗液洗板3次后，加入现配的TMB底物溶液，100μL /孔，37℃显色15min，然后加入2M H2SO4终止反应，50μL/孔，用酶标仪读OD450值，其中所述TMB底物溶液为10mLCPBS+100μLTMB+25μL0.65%双氧水。
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