CN114989297B

CN114989297B - 包含辣根过氧化物酶标记的抗体的试剂盒

Info

Publication number: CN114989297B
Application number: CN202210663624.6A
Authority: CN
Inventors: 詹先发; 柳静
Original assignee: Beijing Key Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Key Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2042-06-14
Also published as: CN114989297A

Abstract

本发明涉及包含辣根过氧化物酶标记的抗体的试剂盒。本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌的鞭毛蛋白特异性的筛选获得了相应的单克隆抗体，所述抗体具有较好的特异性，并且通过包被抗体和酶标抗体的配对使用后，能够最低限度的检测单核细胞增生李斯特氏菌，具有较好的应用前景。

Description

包含辣根过氧化物酶标记的抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体的是涉及包含辣根过氧化物酶标记的抗体的试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特菌，革兰氏阳性小杆菌，大小为(0.4-0.5)μm×(0.5-2)μm，直或稍弯，多数菌体一端较大，似棒状，常呈V字型排列，有的呈丝状，偶尔可见双球状。在22℃-25℃环境可形成4根鞭毛。本菌对理化因素抵抗力较强。在士壤、粪便、青贮饲料和干草内能长期存活:对碱和盐抵抗力强，对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺等均敏感。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李斯特氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

目前，常规的检测方法主要包括细菌培养法，血清凝集法以及分子生物学检测方法。其中，细菌培养法中，特别是食品中李斯特氏菌的传统检验方法是进行前增菌或选择性增菌，以分离培养得到的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验(CAMP)等免疫学检测，被确定为李斯特氏菌后进一步进行血清分型。该方法中增菌和选择性增菌是不可缺少的步骤。增菌的方法主要包括：冷增菌法和常温培养方法。冷增菌法是在4℃培养30d，有时甚至长达一年。常温增菌需培养24h至7d。故传统检测方法需要7-11d才能分离鉴定出李斯特氏菌，故传统方法检测周期较长。PCR检测时目前较为常见的检测方法，PCR的发展已经相当成熟，广泛应用于李斯特氏菌的检测。PCR扩增特异性引物一种是依据李斯特氏菌的特异毒力基因序列而设计，一种是依据李斯特氏菌基因组中特异序列而设计。常用的靶序列为hlyA、iap、inl、Dth-18等毒力基因。利用PCR方法来检测李斯特氏菌的优点是方法的特异性好，不足之处是灵敏度较低；将样品培养物经化学抽提后再进行扩增，提高了样品的检出率；并且可以检测到传统增菌方法不能检出的“活的非可培养”的李斯特氏菌。PCR技术还可对李斯特氏菌进行定量检测。但是由于PCR检测需要特定的设备，分子生物学方法大多数用于科研，由于该方法的前处理较复杂，而且操作过程要求的技术较高，较难使用于大批量的食品样品的检测。并不适宜偏远地区的快速检测。

免疫学检测随之应用而生。现在已有德国拜发公司生产的商品化的单增李斯特菌检测试剂盒可供使用。用ELISA方法操作较简单，特异性强，反应灵敏度高，但由于单克隆抗体制备昂贵，所以用ELISA盒进行多种食品样品的检测费用较高。因此，开发自己生产的价格低廉的单克隆抗体避免被国外卡脖子，是目前研究的主要方向。

发明内容

一方面，本发明提供了一种特异性针对单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体。

进一步的，所述单克隆抗体是LM3F6，LM3F6单克隆抗体其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTQGYCRKLVGDYLYWFLQRPGQSPQLLIYWHPNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCLCCRCKSGGFGSGTKLEIK

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

VKPGGSLKLSCAASSWAQYINTMSWVRQTPDKRLEWVAIISYYSRDKYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCPYTRPPVIWMTWGQGTTVTVS。

进一步的，还提供了一种与LM3F6配对使用的LM6G3单克隆抗体，该抗体其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

DLVMTQTAPSVPVTPGESVSISCRSTFKPWPKYEPLHLYWFLQRPGQSPQLLIYMWFNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMNACCYYRQFGSGTKLEIK

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

VKPGGSLKLSCAASITAQPSPRMSWVRQTPDKRLEWVAICFEKKIGLYYPDSVKGRFTISRDQDKQTLYLQMSSLKSEDTAMYYCEHEWWDEQVSPWGQGTTVTVS。

在一些实施例中，抗体或其片段(如本文提供的抗SAA抗体)特异性结合靶(SAA)，结合常数至少为10^-9M或更大的结合常数。在一些实施例中，抗体(例如，单克隆抗体)或其片段，具有10nM或更小的平衡常数(Kd)，例如9nM或更小，8.1nM或更小，8nM或更小，7nM或更小，6nM或更小，6.5nM或更小，6.3nM或更小，5nM或更小，4.3nM或更小，4nM或更小，3nM或更小，2nM或更小，5nM或更小，5nM或更小，4nM或更小，3nM或更小或1.2nM或更小。例如，抗体或其片段以至少约0.1×10^-8M的结合亲和力与靶亲和，至少约0.3×10^-8M，至少约0.5×10^-8M，至少约0.75×10^-8M，至少约0×10^-8M，至少约3×10^-8M至少约5×10^-8M，或至少约2.0×10^- ⁸M，至少约2.5×10-8，至少约3.0×10-8，至少约3.5×10-8，至少约4.0×10-8，至少约4.5×10-8，至少约5.0×10-8M，至少约1×10-9M，至少约3×10-9M，至少约5×10-9M，至少约2×10-9M，至少约3×10-9M，至少约4×10-9M，至少约4.3×10-9M，至少约5×10-9M，至少约6×10-9M，至少约6.3×10-9M，至少约6.9×100.9M，至少约7×10-9M，至少约8×10-9M，至少约8.1×10-9M，或至少约10×10-9M.在某些实施例中，与靶结合的特异性结合剂的解离常数(Kd)为<100nM，<10nM，<9nM，<8nM，<7nM，<6.9nM，<6.5nM，<6.3nM，<5nM，<4nM，<4.5nM，<3nM，<2nM，<1.5nM，<1nM，<0.1nM，<0.01nM或<0.001nM(例如，<10nM，<9nM，<8nM，<7nM，<6.9nM，<6.5nM，<6.3nM，<5nM，<4nM，<4.5nM，<3nM，<2nM，<1.5nM，<1nM，<0.1nM，<0.01nM或<0.001nM)。10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13在一个实施方案中，通过用感兴趣抗体的Fab版本及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定(RIA)来测量Kd。

在一些实施例中，所述单克隆抗体的VH结构域的氨基酸序列至少为80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，与SEQ ID NO:198％或99％以上相同；和/或单克隆抗体的VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:2至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。在特定的非限制性实施例中，单克隆抗体的VH结构域的序列包括SEQ ID NO:1组成，和/或单克隆抗体的VL结构域的序列包括SEQ ID NO:2组成。

在一些实施例中，所述单克隆抗体的VH结构域的氨基酸序列至少为80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，与SEQ ID NO:398％或99％以上相同；和/或单克隆抗体的VL结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:4至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％相同。在特定的非限制性实施例中，单克隆抗体的VH结构域的序列包括SEQ ID NO:3组成，和/或单克隆抗体的VL结构域的序列包括SEQ ID NO:4组成。

进一步的，抗体可与可检测标记物缀合；例如，一种可通过ELISA检测的可检测标记物，分光光度法，流式细胞术，显微镜或诊断成像技术(例如计算机断层摄影(CT)，计算机轴向断层摄影(CAT)扫描，磁共振成像(MRI)，核磁共振成像(NMRI)，磁共振断层摄影(MTR)，超声，纤维光学检查和腹腔镜检查)。可检测标记物的具体，非限制性例子包括荧光团，化学发光剂，酶键，放射性同位素和重金属或化合物(例如用于MRI检测的超顺磁性氧化铁纳米晶体)。例如，有用的可检测标记包括荧光化合物，包括荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，5-二甲基胺-1-萘磺酰氯，藻红蛋白，镧系磷光体等。生物发光标记也是有用的，例如荧光素酶，绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。抗体或抗原结合片段也可与可用于检测的酶缀合，例如辣根过氧化物酶，-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等。当抗体或抗原结合片段与可检测的酶偶联时，可通过加入酶用于产生可被识别的反应产物的额外试剂来检测。例如，当试剂辣根过氧化物酶存在时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入导致有色反应产物，该有色反应产物在视觉上是可检测的。抗体或抗原结合片段也可与生物素缀合，并通过间接测量亲和素或链霉亲和素结合来检测。应当注意，亲和素本身可以与酶或荧光标记缀合。

进一步更优选的，本发明的单克隆抗体被辣根过氧化物酶标记。

优选的，所述抗体标记的方法为称取辣根过氧化物酶HRP溶于双蒸水中，溶液呈浅棕黄色。在上述溶液中加入新鲜配制的的高碘酸溶液，4℃，避光混合30min，活化的HRP溶液呈现浅绿色。取乙二醇加入双蒸水中混匀。在活化的HRP溶液中加入乙二醇混匀，室温避光放置30min，此时溶液呈现棕色。在单抗中分别加入等体积2倍浓度的辣根过氧化物酶，将单抗和酶的混合物加入透析袋中，在碳酸盐透析液中，4℃透析过夜，中途换液3次。次日，加入新鲜配制的NaBH₄。室温，静置4小时。将上述液体装入透析液袋中，4℃透析过夜。在透析好的单抗溶液中逐滴滴加等体积的饱和硫酸铵，4℃，静置1h，4℃，5000r·min^-1离心30min。弃上清液，沉淀溶于PBS缓冲液中，将上述溶液装入透析袋中透析过夜。即得到标记好的单克隆抗体。

进一步的，本发明提供了单克隆抗体LM3F6和与LM3F6配对使用的LM6G3单克隆抗体在制备检测单核细胞增生李斯特氏菌的ELISA试剂盒中的用途；其中，LM3F6单克隆抗体其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

与LM3F6配对使用的LM6G3单克隆抗体，该抗体其轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.3所示：

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

有益效果

本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌的鞭毛蛋白特异性的筛选获得了相应的单克隆抗体，所述抗体具有较好的特异性，并且通过包被抗体和酶标抗体的配对使用后，能够最低限度的检测单核细胞增生李斯特氏菌，具有较好的应用前景。

附图说明

图1单克隆抗体的亚型鉴定结果图

图2直接ELISA法检测HRP标记的抗体和抗原的结合能力效果图

图3双夹心法检测单克隆抗体的结合能力效果图

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

实施例1单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体的制备

一、免疫原的制备

将甘油保存的单核细胞增生李斯特氏菌LM(北京华越洋生物NRR00470)划线接种于OXA平板上，37℃培养24h后，用接种针挑取典型菌落穿刺于含半固体动力培养基的U形管一端。23℃养5d后，可见U形管的另一端变浑浊。取U型管未穿刺端的LM接种到10mL LB肉汤培养基中，23℃静置培养24h。再移接到盛250mL LB肉汤培养基中，共接种1肉汤培养基，23℃，静置培养24h。将培养24h的增菌液5000r/min离心10min收集菌体，收集的菌体用0.01MPBS洗涤3次。之后用5mL 0.01M PBS重悬，滴加1M的HCl将pH调至2.0，4℃下磁力搅拌40min。12000r/min，4℃离心30min，去除菌体，吸取上清，缓慢滴加1M NaOH将pH调回7.2。取1mL上清液加入洁净的超滤管中(截留量为10KD)，4000r/min，常温下离心15min。重复离心操作，期间不断补充超滤管中上清量。当全部上清超滤浓缩约500μL时，加入超纯水再重复两次，最终浓缩至200μL。吸取液体，-20℃保存备用。提取到的鞭毛蛋白通过SDS-PAGE验证，在33kD位置有目的条带，表明制备得到了鞭毛蛋白免疫原。

二、杂交瘤细胞的制备

首次用弗氏完全佐剂与抗原乳化皮下多点注射，100μg前述制备的免疫原/只，共6只，然后每隔2周后以弗氏不完全佐剂与抗原乳化后皮下注射免疫，100μg/只，直至尾静脉采血测定抗体效价达到1:16000以上。选择效价最高的一只小鼠，于融合前3天腹腔注射100μg/只进行加强免疫。

末次加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞(1×10⁸个细胞)与骨髓瘤细胞SP/20(1×10⁷个细胞)，在50％PEG1450作用下进行融合。融合细胞先用HAT培养基选择培养，10d后改用HT培养基，20d后改用普通RPMI1640培养基培养(含20％小牛血清)。采用间接ELISA法筛选阳性细胞，包被抗原为免疫原，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，并以免疫小鼠血清为阳性对照和SP2/0细胞培养上清为阴性对照。共筛选获得阳性反应较强的杂交瘤细胞株12株。采用有限稀释法对鉴定出来的12株阳性克隆细胞连续亚克隆，至每株细胞亚克隆阳性率达到100％，共获得3株稳定分泌抗体的单抗抗体分别是LM2A9、LM3F6和LM6G3，将细胞扩大培养后液氮冻存。

三、抗体亚型及效价测定

效价及亲和力鉴定，亚类鉴定按鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒说明书进行操作，抗体效价的测定采用间接ELISA法，每株单克隆抗体的腹水按200倍比稀释。

通过鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒对3个杂交瘤培养上清液进行检测，结果如图1所示，所检测的3株抗体均为IgG1，轻链为κ型。

单克隆抗体腹水的抗体效价如表1所示。

表1三株单克隆抗体的腹水效价

抗体名称	效价
		LM2A9	1:4.096×10<sup>5</sup>
LM3F6	1:2.048×10<sup>5</sup>
		LM6G3	1:2.048×10<sup>5</sup>

从表3可以看出，本发明制备的3株单克隆抗体腹水效价均在200000以上。

四、腹水及抗体的纯化

在预先1周注射石蜡油(0.5ml/只)的BALB/c小鼠腹腔分别接种已建株的杂交瘤细胞LM2A9、LM3F6和LM6G3约107个/只，10d后采集腹水12000r/min，10min，离心去除细胞沉淀，取上清用0.22μM过滤。采用Protein-G亲和层析纯化已制备的腹水上清。再将纯化的腹水直接上样SepharoseS-200分子筛脱盐，1×PBS洗脱，收集纯化的抗体，将抗体浓度调整为15mg/mL，低温保存备用。

五、单抗特异性鉴定

采用间接ELISA法，以免疫原、LM全菌裂解液、大肠杆菌裂解液、BSA、小鼠血清为包被抗原对抗体进行特异性检测。结果如表2所示。

表2单抗特异性鉴定结果

从表2的结果可以看出，本发明制备的三株单克隆抗体均具有较好的特异性。

另外，针对三株单克隆抗体进行配对检测，判定LM2A9和LM6G3、LM3F6和LM6G3互为配对抗体。

实施例2LM3F6和LM6G3单抗的亲和力鉴定及可变区序列

采用AffinitySensors公司生产的生物传感器IAsysPlus对单克隆抗体的亲和常数进行测定。羧甲基葡聚糖(carboxymethyldextran,CMD)预处理样品池，在样品池中加入不同浓度的免疫原蛋白,5min后用乙醇胺封闭空余羧基3min。然后用1mol/L甲酸洗去游离及非特异结合之蛋白分子。将包被好免疫原的样品池放入生物传感器,平衡10min。基线(baseline):加入pH7.2,0.01mol/L PBS 50μl,等待5min,作一平稳基线。结合(asso-ciation):吸去PBS,加入45μl PBS和5μl单抗,待单抗结合至饱和时吸去单抗液。解离(dissociation):换50μlPBS,待单抗结合与解离达到平衡。再生(regeneration):换20mmol/LHCl 50μl作用2min以完全洗脱结合的单抗。回复基线:换PBS,再次回到基线,即可开始下1个循环。将每种单抗用PBS稀释为5个不同浓度,依次分别测定各浓度单抗与包被抗原结合、解离速率,并通过随机附送之专用软件FASTfit计算各株单抗的亲和常数。结果如表3所示。

表3抗体的亲和常数

抗体名称	亲和常数(nM)
		LM3F6单克隆抗体	2.46±0.02
LM6G3单克隆抗体	8.73±0.06

从表3的结果可以看出，LM3F6和LM6G3这两个单克隆抗体具有较好的亲和能力，结合能力较好。

采用试剂盒提取2个杂交瘤细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。设计引物，扩增重链和轻链，测序，测序结果用软件进行分析，经过序列鉴定，获得了单克隆的轻重链序列，

LM3F6单克隆抗体其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

LM6G3单克隆抗体其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

实施例3辣根过氧化物酶标记LM3F6和LM6G3单克隆抗体

称取5mg辣根过氧化物酶HRP溶于1mL双蒸水中，溶液呈浅棕黄色。在上述溶液中加入1mL新鲜配制的13mg·mL^-1的高碘酸溶液，4℃，避光混合30min，活化的HRP溶液呈现浅绿色。取9μL的乙二醇加入1mL双蒸水中混匀。在活化的HRP溶液中加入0.5mL乙二醇混匀，室温避光放置30min，此时溶液呈现棕色。在1mL LM3F6单抗或LM6G3单抗中分别加入等体积2倍浓度的辣根过氧化物酶，将单抗和酶的混合物加入透析袋中，在0.05M的碳酸盐透析液中，4℃透析过夜，中途换液3次。次日，加入0.1mL新鲜配制的4mg·mL^-1NaBH₄。室温，静置4小时。将上述液体装入透析液袋中，4℃透析过夜。在透析好的单抗溶液中逐滴滴加等体积的饱和硫酸铵，4℃，静置1h，4℃，5000r·min^-1离心30min。弃上清液，沉淀溶于1mL的PBS缓冲液中，将上述溶液装入透析袋中透析过夜。即得到标记好的LM3F6单克隆抗体和LM6G3单克隆抗体。

实施例4直接ELISA法检测HRP标记的LM3F6抗体和抗原的结合能力

用PBS将免疫原稀释成1μg·mL^-1，按照每孔加入100μL至96孔酶标板中。37℃孵育2h。甩去孔内液体，用PBS洗3次，250μL/孔，拍干。将HRP标记LM3F6抗体用0.5％BSA的PBS稀释成0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μg·mL^-1，每孔加入100μL，每个浓度3平行，37℃孵育1h。甩去孔内液体，用PBS洗3次，拍干。预热TMB底物于室温，同时开启酶标仪预热。每孔加入四甲基联苯胺(TMB)底物A(将TMB粉溶于DMSO中，使终浓度为11mg·mL^-1，再加入1/10体积的甘油)、B液(pH5.5，0.2mol·L^-1磷酸氢二钠与0.1mol·L^-1柠檬酸缓冲液配制过氧化脲素浓度为0.74mg·mL^-1)各加50μL，37℃显色20min，发现孔变成蓝色后加入终止液(1mol·L^-1硫酸)50μL，此时蓝色变为浅黄色。运用酶标仪在450nm处读取吸光度值。结果如图2所示。

从图2的结果可以看出，本发明制备的HRP标记的LM3F6抗体能够较好的与免疫原进行反应。免疫原在浓度范围为0.2-6.4μg·mL^-1均可以显著的被识别。

实施例5双夹心法检测单克隆抗体的结合能力

运用PBS稀释单克隆抗体LM3F6和LM6G3，在96孔酶标板中每孔分别包被100μL(优化后的质量浓度为0.4μg/mL)上述抗体，3平行。4℃过夜。次日，甩去孔内液体，用PBS洗3次，拍干。每孔包被不同浓度模拟污染LM肉样(10⁷，10⁶，10⁵，10⁴，10³，100，50，10，1CFU/mg)反应，37℃、孵育2h。甩去孔内液体，用PBS洗3次，每次5min，拍干。运用HRP标记的优化后的质量浓度为0.4μg/mL对应的配对抗体37℃孵育1h(包被LM3F6抗体的酶标板，应用LM6G3孵育检测；包被LM6G3抗体，应用LM3F6孵育检测)。甩去孔内液体，用PBS洗3次，每次5min，拍干。预热TMB底物至室温，同时开启酶标仪预热。每孔加入TMB底物各加50μL。37℃，显色20min，发现变成蓝色后加入终止液50μL/孔，运用用酶标仪在450nm处读取吸光度值。结果如图2所示。

从图3的结果可以看出，当LM3F6作为包被抗体，LM6G3作为酶标抗体时检测LM的灵敏度可以达到10CFU/mg，具有较好的灵敏度。而采用LM6G6包被，采用LM3F6作为美标抗体时检测LM的灵敏度为50CFU/mg，因此，选择LM3F6作为包被抗体，LM6G3作为酶标抗体具有更好的效果。

应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。

这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。

虽然已描述并详细举例说明本发明至足以使本领域技术人员制备和使用它，但是在不背离本发明的精神和范围的情况应清楚各种替代方案、修改和改进。本文所提供的实施例代表优选的实施方案，为示例性的，并且不旨在为对本发明的范围的限制。其中的修改和其他用途将是本领域技术人员能够想到的。在本发明的精神内涵盖这些修改并且由权利要求书的范围限定这些修改。

序列表

<110> 北京科跃中楷生物技术有限公司

<120> 包含辣根过氧化物酶标记的抗体的试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Leu Val Met Thr Gln Thr Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Gln Gly Tyr Cys Arg Lys

20 25 30

Leu Val Gly Asp Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Trp His Pro Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Cys Cys

85 90 95

Arg Cys Lys Ser Gly Gly Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Trp

1 5 10 15

Ala Gln Tyr Ile Asn Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys

20 25 30

Arg Leu Glu Trp Val Ala Ile Ile Ser Tyr Tyr Ser Arg Asp Lys Tyr

35 40 45

Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gln Asp

50 55 60

Lys Gln Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr

65 70 75 80

Ala Met Tyr Tyr Cys Pro Tyr Thr Arg Pro Pro Val Ile Trp Met Thr

85 90 95

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asp Leu Val Met Thr Gln Thr Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Phe Lys Pro Trp Pro Lys

20 25 30

Tyr Glu Pro Leu His Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Met Trp Phe Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Asn Ala

85 90 95

Cys Cys Tyr Tyr Arg Gln Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 4

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ile Thr

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ser Pro Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys

20 25 30

Arg Leu Glu Trp Val Ala Ile Cys Phe Glu Lys Lys Ile Gly Leu Tyr

35 40 45

Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gln Asp

50 55 60

Lys Gln Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr

65 70 75 80

Ala Met Tyr Tyr Cys Glu His Glu Trp Trp Asp Glu Gln Val Ser Pro

85 90 95

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

100 105

Claims

1.结合单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体LM3F6和与LM3F6配对使用的结合单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体LM6G3在制备检测单核细胞增生李斯特氏菌的ELISA试剂盒中的用途；其中，LM3F6单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；与LM3F6配对使用的LM6G3单克隆抗体，该抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.结合单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体LM3F6在制备检测单核细胞增生李斯特氏菌的ELISA试剂盒中的用途；其中，LM3F6单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体LM3F6，其特征在于，该抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种结合单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体LM6G3 ，该抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的单核细胞增生李斯特氏菌单克隆抗体LM3F6或者含有权利要求4所述的结合单核细胞增生李斯特氏菌的单克隆抗体LM6G3。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体被辣根过氧化物酶标记。