CN104745534B - 一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2h4及单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2H4及单克隆抗体。本发明所述降钙素原单克隆抗体杂交瘤2H4于2014年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014232。本发明针对降钙素原合成短肽制备出的单克隆抗体对检测降钙素原蛋白具有较高的特异性和灵敏度，为降钙素原的功能研究和开发以及相应的诊断试剂的研制奠定基础。

Description

一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2H4及单克隆抗体

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2H4及单克隆抗体。

背景技术

细菌或病毒等经由创面、呼吸道、泌尿道、消化道入侵，在严重创伤，全身抵抗力下降，体内正常菌群失调，细菌移位等时，均可引起机体出现严重的感染症状，是引起临床各种并发症，如脓毒症、败血症休克，多器官功能障碍症(multiple organ dysfunctionsyndrome,MODS),乃至死亡的主要原因。据美国2001年统计资料显示，该年仅重度脓血症就有75.1万例，平均死亡率高达28.5％，这意味着该年死亡的人数竟然是爱滋病(acquiredimmunodeficiency syndrome,AIDS)的近三倍。对感染性疾病及其并发症能早期诊断和及时治疗，可有效降低死亡率。

常规用于诊断炎症治疗过程的指标如体温、白细胞分类和计数、血沉或C反应蛋白(CRP)、血常规检查等,，用于感染性疾病的血清学诊断已沿用多年，因其都不是十分可靠的指标,是非特异性参数,所以易引起误诊或漏诊。1990年发现的降钙素原(procalcitonin,PCT)经证实其在血清中浓度的增高与感染的发生有密切关系，能为疾病的诊断、鉴别，治疗方案的选择，预后判断等提供新的实验室标准。

降钙素原(procalcitonin,PCT)是一种由116个氨基酸组成、分子量大约为13KD的糖蛋白,是降钙素(calcitonin,CT)的前肽物,无降钙素样的激素活性,其 分子由降钙素、下钙素和一个含57个氨基酸的N2末端碎片组成。它的半衰期为25-30h,在体内稳定性很好。因为在正常及健康的个体中，PCT经一系列的酶催化作用最后水解形成CT，故其血清PCT的浓度极低，仅为10～50pg/ml，一般的方法检测不到。在全身性细菌、真菌和寄生虫感染，系统炎症反应综合症(SIRS)、败血症、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎、创伤等患者的血清PCT水平异常增高，其浓度可达正常水平的几倍甚至上万倍，其生物学来源机制可能为靶细胞(PBMC)等在LPS血类败血症相关因子作用下，应急分泌PCT，这种应急分泌超过细胞后转换过程(由PCT分解为CT)或后转换过程缺少必需的水解酶，从而导致实验室观察到的PCT成倍增长，而CT水平不变或稍增高；在病毒感染，自身免疫性疾病，器官移植排斥反应等患者的血清PCT浓度不增加或轻微增加。这就决定了PCT的高度特异性，因此可用于此类疾病的鉴别诊断；在全身性细菌感染和脓毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗效观察等方面有很高的临床价值。

因此为了诊断细菌性或非细菌性炎症反应、鉴别诊断脓毒症和全身炎症反应堆的严重程度，预防抗生素滥用等，本领域迫切需要开发抗PCT单克隆抗体，以便开发一种PCT的诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗降钙素原的单克隆抗体。

本发明另一目的在于提供分泌上述抗降钙素原单克隆抗体的杂交瘤细胞2H4。

本发明还有一个目的在于提供上述杂交瘤细胞2H4的制备方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明所述的检测PCT的抗体是用合成PCT抗原多肽作为抗原免疫BALB/c小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株2H4，杂交瘤细胞分泌的抗体为IgG1阳性，轻链为κ型。所述抗PCT单克隆抗体杂交瘤2H4，于2014年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），保藏号为CCTCC NO：C2014232。

本发明中PCT的氨基酸序列为AGM62655.1，如SEQ ID NO：1所示。

本发明中PCT的抗原多肽序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的保藏号为CCTCC NO：C2014232的杂交瘤细胞株2H4的制备方法是：PCT抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间进行两次以上免疫，取血清效价大于1:10⁵的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-4000进行融合；用含20％小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用PCT抗原多肽包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗PCT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为2H4。应用此株杂交瘤细胞以1×10⁶/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

与现有技术相比，本发明特色如下：

本发明以合成的PCT抗原多肽包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性，并用此纯化抗体对病人血清进行Western-blot证明该抗体可以识别天然PCT蛋白。

本发明的单克隆抗体其免疫原是偶联了KLH的合成PCT抗原多肽，其肽序列全长27个氨基酸。

本发明针对PCT合成短肽制备出的单克隆抗体对检测PCT蛋白具有较高的 特异性和灵敏度，该抗体的应用将为PCT的功能研究和开发基于PCT的诊断试剂奠定基础。

附图说明

图1是本发明单抗2H4对病人血清免疫印迹的结果。泳道1：上样为正常人血清；泳道2，3：上样为细菌感染病人血清；泳道M：蛋白Marker。

具体实施方式

实施例1本发明单克隆抗体的制备和鉴定

1、单抗2H4的制备

1)PCT抗原多肽的设计、制备及载体偶联

根据GenBank上的人PCT序列(登录号：AGM62655.1)获得人PCT蛋白序列，含有116个氨基酸。用TMHMM软件分析PCT蛋白的跨膜域，IEDB软件分析PCT蛋白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明人PCT蛋白34-60aa有27个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强(图1)。经过上述分析，最终筛选多肽序列为：VQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKRC(34-60aa，SEQ ID NO:2)。该短肽(PCT-P1)及C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH的短肽(PCT-P1-KLH)由上海吉尔生化公司合成。

2)免疫小鼠

将合成肽PCT-P1-KLH与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性Balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，三周后抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后皮下多点注射，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，间隔三周后50μg不加佐剂腹腔注射，共免疫4次。

3)免疫血清效价测定

采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50μg合成肽PCT-P1溶解于10ml 0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μl/孔，4℃过夜。使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％BSA 10mM PBS进行10^-2～10^-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.)，100μl/孔37℃30min，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加50μl/孔2MH₂SO₂终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。

4)杂交瘤的制备

取血清效价大于1:10⁵的小鼠，融合前3天，取合成肽PCT-P1-KLH与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1：1的比例混合，1000×g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在37℃水浴保温的50％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1分钟加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物1000×g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma))轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液， 连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换HT培养液(次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)(HT，Sigma))培养。

5)筛选分泌抗PCT单克隆抗体的杂交瘤细胞

间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗PCT单克隆抗体细胞株，标记为2H4。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。

6)腹水的制备和纯化

将2H4杂交瘤细胞株以1×10⁶/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein GSepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。

2、本发明单克隆抗体的特性鉴定

1)抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞CCTCC No：C2014232制备的腹水经纯化后获得PCT单克隆抗体2H4，使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度为1.24mg/ml。

2)抗体亚型鉴定：采用Roche公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，2H4分泌抗体的亚型为IgG1型，轻链为κ链。

3)纯化抗体的效价鉴定：50μg合成肽PCT-P1溶于10ml pH9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl纯化抗体，37℃ 孵育1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl，TMB显色，37℃孵育15min后，加入2MH₂SO₄溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。

4)抗体的Western blot鉴定：分别收集正常人血清及细菌感染的病人血清，用生理盐水稀释后取上清上样，经SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，1:1000加入经纯化的杂交瘤细胞CCTCC No：C2014232制备的抗PCT单克隆抗体2H4，4℃孵育过夜，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，加入1:10000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma)为二抗，室温孵育2h，TBST洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1.4ml Pierce-Thermo Scientific ECL系列Western化学发光底物反应液(A:B＝1:1)，使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。杂交瘤细胞CCTCC No：C2014232制备的抗PCT单克隆抗体2H4与细菌感染病人血清发生特异性反应，出现单一的特异性条带，结果如图1所示。

Claims (2)

1.一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2H4，其特征在于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2014年12月16日，保藏号为CCTCC NO：C2014232。

2.权利要求1所述降钙素原单克隆抗体杂交瘤2H4分泌的单克隆抗体。