CN102703388A - 抗人mCRP蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞系和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗人 mCRP 蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏编号为 CCTCCNO ： C201243 的杂交瘤细胞系（ Hybridomacelllines ）所分泌，其识别位点为 mCRP 的 C 端 199~206 八 肽的表位；所述 mCRP 的 C 端 199~206 八 肽的氨基酸序列为 Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro 。该单克隆抗体经酶联免疫法筛选，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和免疫印迹分析等方法鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力等特性。

Description

抗人mCRP蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞系和试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种抗人mCRP蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞系和试剂盒。 

背景技术

C-反应蛋白(CRP)有两种存在形式：五聚体CRP(pCRP)和CRP异构体(monomeric CRP，mCRP)。pCRP由肝细胞分泌，作为炎症反应的一个重要标志，它还参与并加重了动脉粥样硬化形成、粥样斑块破裂及心肌梗死等炎症反应的过程。mCRP是由pCRP转变而来，这一转变过程出现在急性心梗、不稳定心绞痛等一些局部缺血缺氧导致的低pH和氧自由基富集或血小板活化等情况，具体过程如下：细胞损伤或血小板活化后其局部胞膜内侧磷脂酰胆碱外翻暴露于细胞膜表面，pCRP随后与PC结合。在短时间内(＜4h)，结合的pCRP迅速解聚形成mCRP，其空间构象发生改变，N端35～47位氨基酸(与公认的胆固醇结合序列一致)和C端199～206位氨基酸暴露形成新的抗原识别位点。 

研究发现，pCRP与细胞膜结合后经过空间构象改变形成mCRP是pCRP发挥生物学功能的先决条件，pCRP的致炎及致细胞损伤作用可能均来源于mCRP的形成。最近研究指出pCRP与活化的血小板膜表面结合后迅速转变为mCRP，mCRP的出现促进了血小板的进一步聚集以及其与动脉内皮细胞的相互作用，加重了局部血管的炎症反应，加速了动脉粥样硬化斑块不稳定过程。研究还发现mCRP可以促进巨噬细胞吞噬低密度脂蛋白，这对于动脉粥样硬化过程中泡沫细胞的形成极为关键。此外，mCRP还可以作用于中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞，促进IL-8，MCP-1及细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1以及E-选择素等的表达升高，进而加重局部细胞和组织的炎症状态。因此，mCRP不但可以作为炎症反应的标志，它也作为重要参与者参与了炎症反应过程及血小板的活化。 

在pCRP转变为mCRP过程中，mCRP分子C端199～206表位8个氨基酸暴露形成新的抗原识别位点是mCRP发挥生物学作用的重要靶点。该抗原识别表位只出现在mCRP上，而在pCRP分子中它被包裹在分子结构内 部不能被识别，因而，针对该抗原表位的单克隆抗体不但可以特异性识别mCRP，还可以为我们正确识别及区分mCRP和pCRP功能提供方便。因此，如果可以成功制备得到针对mCRP C端199～206氨基酸表位并且具有中和mCRP不良生物学作用的功能性抗人mCRP单克隆抗体，不仅可以更好的研究mCRP的生物学功能及其具体致病机制，还可以为mCRP抗原检测试剂盒的开发和应用提供便利。 

发明内容

本发明目的在于提供一种抗人mCRP的单克隆抗体以及能产生所述抗体的杂交瘤细胞株，本单克隆抗体识别序列为mCRP的C末端199～206八肽氨基酸表位。它是一种具有中和功能的高亲和力功能性抗人mCRP单克隆抗体；可用于检测游离mCRP抗原水平定量及定性检测试剂盒的开发，并用于临床疾病诊断和病情预后判断。 

为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是： 

一种杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines)，该细胞系的保藏编号为CCTCC NO：C201243，其具有分泌抗人mCRP蛋白的单克隆抗体的能力。 

本发明的另一目的在于提供一种所述的杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines)的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： 

(1)合成人mCRP C末端199～206八肽，将人mCRP C末端199～206八肽分别与血蓝蛋白KHL及BSA偶联形成抗原肽，分别作为免疫原免疫BALB/c小鼠； 

(2)获取融合细胞生长克隆步骤：从免疫合格小鼠无菌取其脾脏细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，利用常规的HAT筛选方法筛选，获取融合细胞生长克隆； 

(3)经常规ELISA或竞争ELISA或免疫印迹技术筛选和鉴定，获取杂交瘤细胞系。 

本发明的又一目的在于提供一种抗人mCRP蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞系(Hybridoma cell lines)所分泌，其识别位点为mCRP的C端199～206八肽的表位；所述mCRP的C端199～206八肽的氨基酸序列为Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro。 

本发明的又一目的在于提供一种mCRP抗原检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含有效量的所述的抗人mCRP蛋白的单克隆抗体。 

本发明的又一目的在于提供一种所述的mCRP抗原检测试剂盒在检测mCRP抗原方面的应用。 

优选的，所述检测mCRP抗原包括定量检测和定性检测。 

优选的，所述检测mCRP抗原方法为酶联免疫吸附检测法。 

本发明的又一目的在于提供一种治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物，其特征在于所述药物包含药学上有效量的所述的抗人mCRP蛋白的单克隆抗体。 

本发明中抗人mCRP蛋白的单克隆抗体，其特征是：它是由保藏号为CCTCC NO：C201243的抗人mCRP单克隆抗体杂交瘤细胞杂交瘤细胞系，优选的是杂交瘤细胞株2C7所分泌，其识别位点为mCRP的C端199～206八肽氨基酸序列表位。 

本发明提供了该单克隆抗体在制备治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物中的应用。优选的，本发明还提供了该单克隆抗体在制备定量和定性mCRP抗原检测试剂盒及含有权利要求1所述的单克隆抗体在mCRP抗原检测中的应用。所述的抗人mCRP单克隆抗体制备的治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物，抗mCRP单克隆抗体具有中和mCRP不良生物学作用的功能。所述的抗mCRP单克隆抗体在制备mCRP抗原检测试剂盒及含有所述的单克隆抗体在定量和定性检测mCRP抗原的试剂盒中的应用，所述检测mCRP抗原方法为酶联免疫吸附检测法。 

分泌所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏号为CCTCC NO：C201243的抗人mCRP单克隆抗体的杂交瘤细胞系，优选的是杂交瘤细胞株2C7。 

本发明抗人C反应蛋白异构体(mCRP)单克隆抗体制备方法及其应用涉及生物医学领域，具体涉及一种能识别人mCRP的单克隆抗体的制备及其应用。本发明的杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤： 

(1)合成人mCRP C末端199～206八肽氨基酸，与血蓝蛋白KHL及BSA偶联形成抗原肽作为免疫原免疫BALB/c小鼠； 

(2)获取融合细胞生长克隆：从免疫合格小鼠无菌取其脾脏细胞作为 抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，利用常规的HAT筛选方法筛选，获取融合细胞生长克隆； 

(3)应用常规及竞争ELISA以及免疫印迹技术筛选和鉴定，获取高分泌抗体的杂交瘤细胞株。 

BALB/c小鼠腹腔内接种上述高分泌抗体杂交瘤细胞株，收获小鼠腹水后分离纯化得到所需单克隆抗体。 

本发明得到的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系的保藏信息为：保藏单位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址是湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心；保藏日期是2012年4月20日；保藏号是CCTCC No：C201243。杂交瘤细胞系的分类命名为杂交瘤细胞株2C7。具体的可以是杂交瘤细胞株1D9，杂交瘤细胞株2C7或杂交瘤细胞株1D6都能满足分泌类似抗体的要求。 

本发明得到的所述抗人mCRP单克隆抗体可以定量和定性检测人mCRP抗原，方便研究与mCRP相升高关疾病如急性心梗、不稳定性心绞痛等诊断和预后的试剂盒。进一步的技术方案中，本发明提供一种能减轻mCRP所致心肌损伤，尤其是急性心梗心肌缺血时保护心肌细胞，减少心肌细胞凋亡及炎症程度的药物，所述药物的主要成分为上述抗人mCRP单克隆抗体。 

由于上述技术方案的合理运用，相对于现有技术中的方案，本发明的优点是： 

1)ELISA及Western blot分析表明，本发明所述单克隆抗体可以很好的识别人mCRP抗原分子，并且与pCRP抗原无交叉反应。 

2)本发明所述单克隆抗体可以用于定量和定性检测人血循环中mCRP抗原，从而为临床研究与mCRP有关疾病如急性心梗、不稳定性心绞痛等诊断和预后提供依据。 

3)本发明所述单克隆抗体具有良好的生物学功能，可以中和mCRP所致的不良反应，抵抗mCRP所致心肌细胞凋亡，并可以减少mCRP升高所致炎性因子TNF-α的分泌，从而为临床急性心肌梗死及其他mCRP升高所致疾病的治疗提供手段。 

综上所述，本发明公开了一种抗人mCRP单克隆抗体的制备工艺，筛选能高特异性产生抗人mCRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明单克隆抗 体经酶联免疫法筛选，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和免疫印迹分析等方法鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力等特性。本发明还提供了抗人mCRP单克隆抗体在检测心梗患者外周血液循环中mCRP抗原的应用实例，并评价了该抗体对mCRP所致心肌细胞凋亡的保护作用，证明该抗体可以作为一种保护性分子阻断mCRP升高所致的心肌细胞凋亡及炎症因子的分泌，从而避免心肌梗死时梗死范围的扩大。因此，本发明的抗人mCRP单克隆抗体可应用于人mCRP的抗原的多种检测方法中，也可应用于制备人mCRP检测试剂盒，它还可以作为中和抗体抵抗心肌缺血时mCRP所致的心肌细胞凋亡及炎性细胞因子的分泌。 

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述： 

图1为mCRP蛋白经SDS-PAGE后与抗mCRP杂交瘤细胞株2C7细胞上清反应Western-Blot结果。 

图2为抗CRP单抗(可识别CRP及mCRP分子，左图)及2C7细胞株分泌单抗与pCRP及mCRP的非变性低还原凝胶电泳SDS-PAGE后Western-blot结果，其中商品化抗pCRP抗体可以识别mCRP和pCRP，而本发明制备的抗mCRP单克隆抗体只能识别mCRP分子，图中可见发明所述抗人mCRP单抗可以特异性识别mCRP而不识别pCRP分子。 

图3为2C7细胞株分泌抗mCRP单抗包被，检测心梗、感染致升高pCRP患者及正常健康对照组患者血浆mCRP水平；其中M、NM和C分别表示心梗组、非心梗CRP＞3mg/l患者组和健康志愿者，图中可见心梗组患者血浆mCRP水平显著高于对照组； 

图4为采用Tunnel法检测缺氧组(A)、缺氧+mCRP组(B)及缺氧+mCRP+mCRP单抗组(C)细胞凋亡情况。其中A、B和C分别表示单纯缺氧组、缺氧+mCRP组和缺氧+mCRP+抗mCRP单抗组，蓝色为DAPI染细胞核，绿色为FITC标记断裂DNA反映细胞凋亡情况，图中可见mCRP可导致心肌细胞凋亡明显增加(B组)，而加入mCRP单抗后(C组)细胞凋亡明显减少； 

图5为缺氧组(A)、缺氧+mCRP组(B)及缺氧+mCRP+mCRP单抗 组(C)心肌细胞分泌TNF-α及VEGF情况；其中A和B分别表示为缺氧组、缺氧+mCRP组和缺氧+mCRP+抗mCRP单抗组，图中可见mCRP可以促进细胞分泌TNF-α并抑制VEGF的分泌，而mCRP单抗则可以部分逆转这一现象。 

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 

实施例1免疫原准备与免疫 

(1)免疫原的制备 

采用化学合成方法合成mCRP的C端199～206氨基酸序列表位，为Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro，肽段经RP-HPLC色谱纯化，纯度为93.5％，然后分别与血蓝蛋白KHL及牛血清白蛋白BSA偶联，形成KHL-Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro和BSA-Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro八肽复合物(由杭州中肽生化有限公司合成、纯化并偶联)，色谱纯化，干燥。 

(2)动物免疫 

将上述合成KHL偶联肽采用PBS稀释为1mg/ml，按1∶1加入弗氏完全佐剂混合，振荡乳化半小时，皮下按50μg/鼠免疫BALB/c小鼠；2周后，改用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以同样方法进行再次免疫；免疫共4次后，尾静脉采血检测免疫效果，融合前3天，取50ug KLH-肽抗原尾静脉加强免疫，三天后融合。 

实施例2杂交瘤细胞的融合 

按常规方法进行杂交瘤细胞的融合。在融合前摘眼球法取阳性血备用。取脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞用PEG-2000融合。同时，分别从BALB/c免疫小鼠、提供饲养细胞的ICR小鼠采血，作为筛选单抗时对照用的阳性、阴性血清。融合后的细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃， 5％CO₂培养箱内培养，5-7d换加新鲜HAT，经常观察，适时换液和检测。 

实施例3杂交瘤细胞的检测 

(1)酶标板的包被 

在酶标板上，做方阵试验，即以合成的BSA-偶联肽段为抗原，横向用PBS倍比稀释包被ELISA板，以阳性血清为一抗，加入纵向以100倍、200倍、400倍、800倍稀释，根据反应结果选择包被浓度。酶标板的包被简述如下：取纯化的BSA-抗原肽，以碳酸盐缓冲液，即0.2mol/L Na₂CO₃8mL，0.2mol/L NaHCO₃17mL，加去离子水至100mL，pH9.6，稀释至包被浓度，同时设阴性对照；以100μL/孔加入ELISA板中，37℃，3小时；PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5％Tween-20，洗涤3次，5分钟/次；加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10％FCS或1％BSA，200μL/孔，37℃封闭3小时或4℃过夜；PBST洗3次，5分钟/次，晾干，-20℃或4℃存放备用。 

(2)杂交瘤细胞的检测 

用上述包被的ELISA板，常规间接ELISA及竞争ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，在常规间接ELISA法中，以待检杂交瘤细胞上清和抗原肽反应的值，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，P/N≥2.1为阳性判定标准；在筛选的阳性判定细胞上清中采用竞争ELISA法，即在细胞上清中加入10ng裸肽竞争孵育，采用竞争前后OD值比值≥2，且竞争后OD值＜0.20为阳性判断标准。 

根据所设定的判定标准，分别经过三次亚克隆后，经常规间接及竞争ELISA检测，得到三株符合条件的杂交瘤细胞株仍保持了分泌抗人mCRP抗体的能力，分别命名为1D9，2C7，1D6。 

结果显示，本研究制备杂交瘤细胞株有三株，分别为1D9，2C7和1D6符合研究设定要求。 

表1竞争ELISA结果 

实施例4细胞株的建立与腹水制备、纯化 

(1)细胞株的建立 

按上述判定标准，将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，取分泌抗体稳定的和四次亚克隆后细胞形态良好，生长旺盛的强阳性单克隆细胞，命名建株并扩大培养，一部分液氮冻存，一部分用于单抗腹水制备。 

(2)腹水制备 

每只BALb/c小鼠注射0.5mL降植烷与弗氏不完全佐剂的等体积混合物，7天后腹腔分别注射1D9，2C7和1D6株的杂交瘤细胞，接种量为5×10⁵个细胞，约经过一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000转/分钟离心15分钟，取上清，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水，即：VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg²⁺，0.3mmol/L Ca²⁺稀释；然后以每10ml腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22μm微孔滤膜过滤，备用。 

采用上述方法产生抗体的结果为：腹水形成率在95％，腹水的产量平均为3.2ml/只。 

(3)抗体纯化 

用结合缓冲液，即20mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，平衡HiTrap ProteinG HP层析柱。用结合缓冲液稀释样品后通过层析株。待蛋白峰下降后，用0.1M甘氨酸缓冲液pH2.7，洗脱层析柱，收集洗脱液。用1M Tris，pH9.0，调节pH至7，PBS透析，纯化的抗体进行SDS-PAGE电泳，用ELISA检测抗体效价。 

采用上述方法分离纯化后得到的结果为：纯化所得抗体蛋白含量为3.0mg/ml。 

实施例5单克隆抗体的鉴定 

(1)单克隆抗体亚类鉴定 

使用捕获ELISA试剂盒检测单克隆抗体的亚类：1)将表位特征性抗体IgA，IgG1，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分别用PBS进行1∶1000稀释，100ul/孔包被，每种特征性抗体包被两孔，37℃孵育1小时。2)用洗涤液 PBST洗涤3次，5分钟/次。3)每孔加入100ul待检测的单抗上清，37℃孵育1小时。4)用洗涤液洗涤3次，5分钟/次。5)用PBST将辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体进行1∶1000稀释，每孔100ul，37℃孵育30分钟。6)用洗涤液洗涤三次，5分钟/次。7)每孔加入新鲜配置的底物溶液100μl，37℃避光孵育20分钟。8)每孔加入50ul 2M H₂SO₄终止反应。在酶标仪上读取OD450的值，以OD值明显高于其他各个孔的表位特征性抗体判为其单抗亚类。 

鉴定结果表明，本发明制备的抗mCRP单克隆抗体2C7株产生的抗体亚类为IgG2a。 

(2)CRP的纯化及mCRP的制备 

收集新鲜肿瘤及感染患者胸腹水标本，采用乳胶比浊法测定其CRP浓度，合并CRP浓度＞20mg/l的胸腹水，12，000g，4℃离心20分钟，弃沉淀，上清重复上述步骤2次，采用亲和层析方法对胸腹水样品过亲和层析柱Immobilized p-Aminophenyl phosphoryl Choline Gel：先用20倍柱床体积的wash buffer平衡柱床，根据比浊法CRP测定结果，取约含25mgCRP的腹水过柱，再以wash buffer冲洗去除杂质，当流出液OD280＜0.02时停止冲洗，通过starting buffer洗脱特异性结合的CRP，纯化收集样品，考马斯亮蓝定量后行SDS-PAGE电泳，根据电泳及蛋白定量结果合并各合适的收集管样品，按上述步骤对层析柱再次进行亲和层析，收集蛋白样品，浓缩即得纯化CRP样品。mCRP制备参照经典文献方法，将CRP蛋白稀释至1mg/ml，70℃加热1小时即得mCRP蛋白样品。 

(3)间接ELISA 

mCRP蛋白以5μg/mL的浓度100μl/孔包被ELISA板，37℃湿盒作用2.5小时，PBST洗3次，5分钟/次；拍干后用含5％小牛血清的PBS封闭，37℃湿盒作用2.5小时，PBST洗3次，5分钟/次，拍干后加入100倍、200倍、400倍、800倍稀释、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600、51200稀释的本研究制备的单抗腹水，37℃湿盒作用90分钟，PBST洗3次，5分钟/次，拍干后加入1∶1000稀释的过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，37℃湿盒作用90分钟，以TMB显色，设正常ICR小鼠的血清为阴性对照。 

结果显示，本研究制备的2C7单抗腹水与mCRP的反应为阳性，与正 常SP2/0细胞培养上清反应为阴性，表2。 

表2间接ELISA结果 

(4)免疫印迹(Western-blot) 

检测单克隆抗体的特异性分别以CRP及mCRP蛋白为电泳样品进行非变性低还原状态SDS-PAGE电泳(SDS用量为常规SDS-PAGE的1/20，蛋白样品不进行煮沸5min的变性处理，由于CRP在SDS等还原剂及加热煮沸情况下会变成mCRP，因此采用上述处理方法)，按常规方法将蛋白转印于NC膜上。转印结束后，取出硝酸纤维素膜，作好标记，放入平皿中，用PBST(含5％脱脂奶粉)室温封闭过夜，将硝酸纤维素膜转移到封闭液稀释的抗人mCRP单克隆抗体及商品化抗CRP抗体(可与CRP及mCRP反应，cat：ab78051，Abcam公司)中，室温作用2小时之后，用PBS洗膜3次，每次10分钟。再分别将膜转移入用封闭液1∶100倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体中，室温作用2小时后，再用PBS洗3遍，每次10分钟，DAB进行显色。 

免疫印迹结果表明此抗人mCRP单克隆抗体能与mCRP反应，但不能与pCRP分子反应，而商品化的CRP抗体能与CRP及mCRP反应(在非变性低还原SDS-PAGE条件下mCRP分子约位于55KD处，pCRP分子约位于140KD处)，见图1(SDS-PAGE后用Western-blot方法检测制备的单抗与mCRP的结合)及图3。 

实施例6急性心梗患者血清mCRP抗原浓度测定 

(1)酶标板的包被 

在酶标板上，做方阵试验，即以PBS倍比稀释抗人mCRP单克隆抗体，横向包被ELISA板，纵向加入以100倍、200倍、400倍、800倍稀释的mCRP溶液，根据反应结果选择包被浓度。酶标板的包被简述如下：取抗人mCRP 单克隆抗体，以碳酸盐缓冲液，即0.2mol/L Na₂CO₃8mL，0.2mol/L NaHCO₃17mL，加去离子水至100mL，pH9.6，稀释至包被浓度，同时设阴性对照；以100μL/孔加入ELISA板中，37℃，3小时；PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5％Tween-20，洗涤3次，5分钟/次；加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10％FCS或1％BSA，200μL/孔，37℃封闭3小时或4℃过夜；PBST洗3次，5分钟/次，晾干，-20℃或4℃存放备用。 

(2)急性心梗患者血清mCRP的检测 

干燥管抽取急性心梗(M组，47例)、CRP水平＞3mg/l的非冠心病患者(NM组，包括感染、自身免疫及创伤患者46例)和正常健康对照者(C组，30例)全血3ml，3，000rpm离心10分钟后吸取血清，按每孔100ul(500ng/ml)加入包被有2C7细胞株来源抗人mCRP单克隆抗体的酶标板，设加入有100ul CRP阴性对照血清孔为空白对照孔，37℃孵育1小时后，PBST洗3次，5分钟/次，加入1∶∶1000稀释的HRP标记的抗人CRP单克隆抗体(cat：ab19175，Abcam公司)，再次37℃孵育1小时，PBST洗3次，5分钟/次，后加入四甲基联苯胺(TMB)37℃孵育显色15min后，加入2M H₂SO₄终止，于酶标仪450nm波长读取OD值。 

ELISA检测结果表明急性心梗患者血清中存在较高水平的游离mCRP抗原(OD值，中位数(M)，25％～75％四分位数(IQR)：0.0598，0.0428～0.138)，其水平显著高于其他CRP水平较高非冠心病患者(M，IQR：0.0239，0.0178～0.0344)及正常对照者(OD值M，IQR：0.0107，0.009～0.014，)(三组相比，p＜0.0001)，见图4。 

实施例7抗人mCRP单克隆抗体对心肌细胞凋亡及炎症因子分泌的影响 

具体实验方法如下：①心肌细胞的分离培养：取SD乳大鼠(1-3天)心尖部，0.125％胰酶分步消化收集细胞，差速贴壁法除去心肌成纤维细胞，在含10％胎牛血清DMEM培养液(热灭活血清以排除血清补体对实验干扰)中培养48～72h(采用细胞爬片方法时，取一块清净载玻片置于六孔板底部，让细胞自然生长于载玻片表面，用于Tunnel实验)，至细胞成片搏动，融合至培养皿70～85％时进行干预。②细胞分组：更换细胞培养液8h，细胞分 为(1)对照组，缺氧6h；(2)缺氧+mCRP干预组；(3)缺氧+mCRP+抗mCRP单克隆抗体组；③细胞干预：无血清培养8小时后按实验分组情况：(1)组为缺氧组；(2)组细胞中加入mCRP至终浓度为50μg/ml；(3)组中同时加入终浓度为50μg/ml的mCRP和2C7细胞株来源抗mCRP单克隆抗体，各组细胞干预后均在充氮环境中培养8小时，收集细胞及培养上清进行下述实验。a)细胞凋亡情况检测：采用Tunel法检测各组细胞凋亡情况，具体如下：吸尽培养液，加入1ml多聚甲醛固定，4℃过夜。PBS洗两遍，每次3分钟，Proteinase K工作液通透处理细胞30min，PBS漂洗3次×5min；样本加入50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀，加盖玻片在暗湿盒中反应37℃×1h；PBS漂洗3次×5min；滴加一滴荧光淬灭封片液及DAPI于覆盖有细胞的载玻片表面，立即在荧光显微镜下观察样本荧光情况，在520nm的荧光下观察绿色荧光，在460nm观察蓝色的DAPI荧光。细胞发生凋亡时可见绿色团块状染色浓聚。b)收集细胞上清，采用ELISA法同时测定各组细胞上清中VEGF及TNF-alpha的含量。 

凋亡检测结果表明：心肌细胞经缺氧干预后细胞发生凋亡，凋亡率25％，而加入人mCRP干预后细胞凋亡显著增加，约有90％细胞发生凋亡，当加入抗人mCRP单抗保护后细胞凋亡得到明显抑制，凋亡率降至30～40％左右，图中蓝色为DAPI染细胞核，绿色荧光为凋亡小体，见图5。 

细胞培养上清中细胞因子检测结果表明：心肌细胞经人mCRP干预后细胞上清VEGF表达水平明显减低，而TNF-alpha水平基本不变，而当加入抗人mCRP单抗保护后细胞上清中VEGF水平则明显升高，TNF-alpha水平则显著减低，差异有显著统计学意义，见图5。 

统计：以上实施例中的统计学方法为：利用SPSS 13.0统计软件，采用t检验及单因素方差分析方法进行统计学分析，数据以均数±标准差(X±SD)或中位数(25％～75％四分位数)表示。 

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 

Claims (8)

1. 一种杂交瘤细胞系（Hybridoma cell lines），该细胞系的保藏编号为CCTCC No：C201243，其具有分泌抗人mCRP蛋白的单克隆抗体的能力。

2. 一种权利要求1所述的杂交瘤细胞系（Hybridoma cell lines）的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）合成人mCRP C末端199~206八肽，将人mCRP C末端199~206八肽分别与血蓝蛋白KHL及BSA偶联形成抗原肽，分别作为免疫原免疫BALB/c小鼠；

（2）获取融合细胞生长克隆步骤：从免疫合格小鼠无菌取其脾脏细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，利用常规的HAT筛选方法筛选，获取融合细胞生长克隆；

（3）经常规ELISA或竞争ELISA或免疫印迹技术筛选和鉴定，获取杂交瘤细胞系。

3. 一种抗人mCRP蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞系（Hybridoma cell lines）所分泌，其识别位点为mCRP的C端199~206八肽的表位；所述mCRP的C端199~206八肽的氨基酸序列为Phe-Thr-Lys-Pro-Gln-Leu-Trp-Pro。

4. 一种mCRP抗原检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含有效量的权利要求3所述的抗人mCRP蛋白的单克隆抗体。

5. 一种权利要求4所述的mCRP抗原检测试剂盒在检测mCRP抗原方面的应用。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述检测mCRP抗原包括定量检测和定性检测。

7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述检测mCRP抗原方法为酶联免疫吸附检测法。

8. 一种治疗或预防mCRP升高所导致疾病的药物，其特征在于所述药物包含药学上有效量的权利要求3所述的抗人mCRP蛋白的单克隆抗体。

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