CN109652382A - 一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用 - Google Patents

一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用 Download PDF

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Abstract

本发明声明一种降钙素原杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用。本发明提供了分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC NO：C2018181，其能够稳定分泌高效价的抗降钙素原的单克隆抗体。另外，本发明还涉及上述单克隆抗体在制备检测或者定量降钙素原或其片段的免疫检测试剂的用途，该单克隆抗体可以应用于疾病的诊断或者相关领域，能够制备高亲和力PCT特异性单克隆抗体，为PCT的免疫检测提供关键原料，对于扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。

Description

一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的 应用
技术领域
本发明涉及一种可以产生特异针对降钙素原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其的产生的单克隆抗体制备方法，该杂交瘤制备的单克隆抗体可以应用于疾病的诊断或者相关领域。
背景技术
降钙素原(procalcitonin，PCT)是降钙素(Calcitonin，CT)的前体，是一种含116个氨基酸的无激素活性糖蛋白，分子量为13KD，由位于11号染色体上的CALC-I基因编码产生。PCT由降钙蛋白、降钙素、N端残基片段组成：在特殊的蛋白酶作用下N端会在57位开始被剪切，生成1～57的N残端和含有降钙素的60～116位氨基酸，同时，在91位也会被蛋白酶剪切，形成60～91位的降钙素和96～116位的降钙蛋白(katacalcin)。
PCT是上世纪九十年代才发现的细菌、真菌性感染的特异性标志物。在不存在感染的情况下，甲状腺外CALC-I基因表达被抑制，主要只局限在甲状腺和肺的神经内分泌细胞中有一定程度的表达，因此，在健康人血中PCT含量极少，通常低于0.10ng/mL。而当机体遭受严重真菌、细菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭等情况时，会诱导全身各种组织多种细胞类型的CALC-I基因表达，使PCT浓度迅速升高，甚至达到正常水平的数百至上万倍，但CT的含量则保持不变或略有增高。而在局部感染、病毒感染、过敏、自身免疫性疾病、慢性非特异性炎症等患者的血清中PCT浓度不增加或轻微增加，这就决定了PCT具有高度的特异性可作为细菌感染的特异性指标，用于细菌类疾病的鉴别诊断。
PCT在感染后2小时即可以检测到，感染后6-12小时达到峰值，12-24h为平台期，24h 后浓度下降，半衰期为25-30小时，能在一段时间维持在高水平。同时PCT水平与感染程度正相关，PCT浓度越高意味着受感染程度越严重，因此PCT水平对炎症的发生发展的诊断以及治疗预后等方面都具有重要意义。其他炎症因子如IL-6、IL-10、TNF-α在感染后2小时达到峰值，并迅速下降，不易被检测到；而C反应蛋白(CRP)在感染后24-48小时才达到峰值，且炎症控制后浓度仍保持较高水平，不利于早期诊断和治疗评价。在临床诊断治疗中，传统检测指标如体温、白细胞计数(WBC)的灵敏性和特异性均不高，而PCT与过去的生物学标记物相比，其具有较为理想的准确性和特异性，是一个理想的感染检测标志物，有助于临床的早期诊断和制定合理的治疗方案。
因此为了诊断细菌性或非细菌性炎症反应、鉴别诊断脓毒症和全身炎症反应堆的严重程度，预防抗生素滥用等，本领域迫切需要开发抗PCT单克隆抗体。PCT检测炎症的方法已获得美国食品药品管理局(FDA)的许可。近年来，PCT的检测多采用免疫学方法进行，具有特异性强、灵敏度高和容易操作等优点，包括双抗夹心免疫化学发光法、胶体金法和放射免疫法等。所有这些免疫学方法的前提都是制备针对PCT的特异性单克隆抗体，在健康人血浆中 PCT含量极低，在0.1ng/mL以下，因此，对所制备抗体的亲和力等参数要求很高。且目前检测体系所用的抗体均来自国外大公司，价格昂贵。因此，制备高亲和力PCT特异性单克隆抗体，为PCT的免疫检测提供关键原料，对于扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降钙素原的单克隆抗体。
本发明另一目的在于提供分泌上述降钙素原单克隆抗体的杂交瘤细胞株29A9。
本发明还有一个目的在于提供上述杂交瘤细胞29A9株的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
本发明所述的检测PCT的抗体是用合成PCT抗原多肽作为抗原免疫BALB/c小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株29A9，杂交瘤细胞株分泌的抗体为IgG1 阳性，轻链为κ型。所述抗PCT单克隆抗体杂交瘤细胞株29A9，于2018年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：武汉大学)，保藏号为CCTCC NO：C2018181。
本发明中PCT的氨基酸序列为NP_001029124，如SEQ ID NO:1所示。
本发明中PCT的抗原多肽序列如SEQ ID NO：2所示。
所述的保藏号为CCTCC NO：C2018181的杂交瘤细胞株29A9的制备方法是：PCT抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间进行两次以上免疫，取血清效价大于1:105的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-4000进行融合；用含20％小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用PCT抗原多肽包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗PCT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为29A9。应用此株杂交瘤细胞以 1×106/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein G Sepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。
与现有技术相比，本发明特色如下：
本发明以合成的PCT抗原多肽包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性，并用此纯化抗体对病人血清进行Western-blot证明该抗体可以识别天然PCT蛋白。
本发明的单克隆抗体其免疫原是偶联了KLH的合成PCT抗原多肽，其多肽序列全长11个氨基酸。
本发明针对PCT合成短肽制备出的单克隆抗体对检测PCT蛋白具有较高的特异性和灵敏度，该抗体的应用为PCT的功能研究和开发基于PCT的诊断试剂奠定基础。
附图说明
图1是本发明单克隆抗体29A9制备的试剂与市面常用国际品牌试剂盒同时检测血清样本反应的相关性关系。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例1:本发明单克隆抗体的制备和鉴定
1、单克隆抗体29A9的制备
1)PCT抗原多肽的设计、制备及载体偶联
根据GenBank上的人降钙素前体蛋白序列(登录号：NP_001029124)获得人PCT蛋白序列 (SEQ ID NO:1)。经过免疫原性、亲疏水性及表面可及性分析，最终筛选降钙蛋白区的多肽序列为抗原PCT-kata：SDLERDHRPHV(99-109aa，SEQ ID NO:2)。该短肽(PCT-kata)及C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH的合成肽(PCT-kata-KLH)由杭州中肽生化有限公司合成。
2)免疫小鼠
将合成肽PCT-kata-KLH与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后，皮下多点注射6-8 周龄雌性Balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，三周后抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后皮下多点注射，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，间隔三周后50 μg不加佐剂腹腔注射，共免疫4次。
3)免疫血清效价测定
采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50μg合成肽PCT-kata溶解于10ml 0.05MpH9.6 磷酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯96孔板，100μl/孔，4℃过夜。使用PBS(含有0.05％ (V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％BSA 10mM PBS进行10-2～10-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(Sigma,INC.)，100μl/孔37℃30min，同上洗板后，TMB显色，100μl/孔，室温避光10min，加50 μl/孔2M H2SO4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价。
4)杂交瘤的制备
取血清效价大于1:105的小鼠，融合前3天，取合成肽PCT-kata-KLH与等体积的PBS混匀后，以每只50μg/500μL的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠进行加强免疫。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按1：1的比例混合，1000g室温离心5min，弃上清，用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在 37℃水浴保温的50％聚乙二醇(PEG，MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1min加入37℃预热的无血清1640培养基 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物1000g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液(次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma))轻轻重悬细胞，将细胞分至96孔板中，每孔200μl。培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换HT培养液(次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)(HT，Sigma))培养。
5)筛选分泌抗PCT单克隆抗体的杂交瘤细胞株
间接ELISA法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率，最后获得稳定分泌抗PCT单克隆抗体细胞株，标记为29A9。将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。
6)腹水的制备和纯化
将杂交瘤细胞株29A9以1×106/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法Protein GSepharose Fast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。
2、本发明单克隆抗体29A9的特性鉴定
1)抗体浓度的测定：经杂交瘤细胞CCTCC No：C2018181制备的腹水经纯化后获得PCT单克隆抗体29A9，使用BIO-RAD公司生产的Smart Spec plus核酸蛋白测定仪测定，其浓度为 3.20mg/ml。
2)抗体亚型鉴定：采用Roche公司的鼠单抗亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株的亚型，29A9分泌抗体的亚型为IgG1型，轻链为κ链。
3)纯化抗体的效价鉴定：50μg合成肽PCT-kata溶于10mlpH9.6的0.05M碳酸盐包被缓冲液中，加入96孔板，每孔100μL，4℃过夜。PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，用10mM PBS含1％BSA封闭液150μl/孔，37℃封闭2h，使用PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20) 洗板三次，每孔加入100μl纯化抗体，37℃孵育1h，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多克隆抗体为二抗，37℃孵育30min，PBS(含有0.05％(V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μl，TMB显色，37℃孵育15min后，加入 2MH2SO4溶液终止反应，酶标仪在吸光度值450nm处检测。多次结果显示抗体的效价在1× 106以上。
4)抗体的Western blot鉴定：分别收集正常人血清及细菌感染的病人血清，用生理盐水稀释后取上清上样，经SDS-PAGE后用Bio-Rad电转移装置将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min， 1:1000加入经纯化的杂交瘤细胞CCTCC No：C2018181制备的抗PCT单克隆抗体29A9，4℃孵育过夜，pH7.4的Tris-HCl缓冲液(含有0.1％(V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min，加入 1:10000稀释的羊抗鼠IgG多克隆抗体(Sigma)为二抗，室温孵育2h，TBST洗膜3次，用滤纸吸去多余的溶液，平铺于干净的保鲜纸上，加入1.4ml Pierce-Thermo Scientific ECL系列Western化学发光底物反应液(A:B＝1:1)，使膜完全浸润于反应液中，迅速取出，用滤纸吸去多余液体，铺于另一张保鲜纸上，用保鲜纸把膜包好，放入X射线摄影暗盒，在暗房中显影。杂交瘤细胞CCTCC No：C2018181制备的抗PCT单克隆抗体29A9与细菌感染病人血清发生特异性反应，出现单一的特异性条带。
实施例2:本发明单克隆抗体的应用效果
选择同类产品中目前市场上具有良好信誉的Roche公司降钙素原化学发光检测试剂作对照产品进行比对验证。首先利用双抗体夹心ELISA检测抗体灵敏度，利用辣根过氧化物酶HRP 对本发明的单克隆抗体29A9进行标记，用市面已有的Roche公司的PCT单抗包被酶标板，将 PCT抗原按比例稀释为0ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、 50ng/ml、100ng/ml进行双抗体夹心实验。结果显示在抗原浓度为0.05ng/ml时就可以检测到OD450值，且线性范围达到0.05～100ng/ml，R2≥0.99。
其次按上述方法利用本发明的单克隆抗体29A9检测Roche公司的PCT临床血清样本，用 Roche公司降钙素原化学发光检测试剂盒作对照产品进行比对验证。对照和待评价产品的检测结果显示相关系数R2≥0.989，说明两种方法检测结果有较好的相关性(如附图1)。表明本发明提供的抗体制备的检测试剂对降钙素原的检测具有较高的灵敏度和准确性。
综上所述，本发明提供的降钙素原抗体可与降钙素原高度特异性的结合，且灵敏度高、稳定性好，用本发明提供的降钙素原抗体研制的免疫试剂可以精确地测定血清样本中的降钙素原，具有高灵敏度、准确性，与市场上在售试剂检测结果具有高度相关性，与临床诊断具有较高的诊断一致性，可用于临床上对脓毒症或细菌性感染的辅助诊断。
。

Claims (5)

1.一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2018181，保藏日为2018年9月11日。
2.一种降钙素原单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌产生。
3.根据权利要求2所述的降钙素原单克隆抗体，其特征在于所述降钙素原单克隆抗体包含SDLERDHRPHV(SEQ ID NO:2)所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于检测降钙素原的诊断试剂中的应用。
5.一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于包括如下步骤：降钙素原抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，期间进行两次以上免疫，取血清效价大于1:105的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50％PEG-4000进行融合；用含20％小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用PCT抗原多肽包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗PCT单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
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