CN105399798B - Trpc3抗原多肽和抗trpc3的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了TRPC3抗原多肽和抗TRPC3的单克隆抗体。该TRPC3抗原多肽由15个氨基酸组成，具体序列如SEQ ID NO:1所示。所述抗TRPC3的单克隆抗体的制备方法为：以TRPC3抗原多肽偶联KLH后作为抗原，免疫小鼠，筛选得到一株杂交瘤细胞株T‑Ⅱ，由杂交瘤细胞株T‑Ⅱ分泌得到抗TRPC3的单克隆抗体。该抗TRPC3的单克隆抗体能够特异性识别各种组织细胞所表达的TRPC3通道蛋白，可用于各组织细胞的TRPC3表达研究，借以监测与TRPC3分子相关的疾病。因此，抗TRPC3的单克隆抗体可以用于制备与TRPC3分子表达相关的疾病的诊断试剂中的应用。

Description

TRPC3抗原多肽和抗TRPC3的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种TRPC3抗原多肽和抗TRPC3的单克隆抗体。

背景技术

脉粥样硬化（atherosclorosis,AS）是动脉硬化血管病中最常见一种，其特点是受累动脉病变从内膜开始。AS的一般形成过程是先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，纤维组织增生及钙质沉着，接着是动脉中层的逐渐蜕变和钙化，病变常累及弹性及大中等肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。动脉粥样硬化的症状主要决定于血管病变及受累器官的缺血程度，冠状动脉粥样硬化者，若管径狭窄达75%以上,则可发生心绞痛、心肌梗塞、心律失常，甚至猝死。脑动脉硬化可引起脑缺血、脑萎缩，或造成脑血管破裂出血。肾动脉粥样硬化常引起夜尿、顽固性高血压、严重者可有肾功能不全。肠系膜动脉粥样硬化可表现为饱餐后腹痛便血等症状，对人类健康存在较大的威胁。

目前，对于心血管疾病最直接和最准确的方法是侵入性的血管介入诊断技术，但是该诊断技术存在有创伤性、滞后性、费用昂贵，不方便连续观察及随访的缺点，大大的限制了其在临床上的应用。因此，研究出无创性、使用简便、方法标准化、重复性好的冠状动脉粥样硬化检测技术仍然是当前医学研究的重点。

TRPC3（瞬时受体电位阳离子通道3）蛋白作为一种非选择性阳离子通道，可调控钙离子的通透性，而钙离子在循环系统疾病的产生机制中扮演着重要的角色，其表达异常易导致动脉粥样硬化（atherosclorosis,AS）。AS是引发心血管疾病的常见原因，而内皮细胞损伤是动脉粥样硬化形成的始动环节，其活性调节受胞内Ca²⁺浓度与膜电位的影响，在此过程中TRPC3分子的表达异常参与了AS的病理过程。利用TRPC3单克隆抗体构建体外免疫学技术方法，测定蛋白水平的表达，更有利于疾病的分析与病情愈后监测。

抗人TRPC3多肽单克隆抗体的制备是采用淋巴细胞杂交瘤技术，该技术的基础是细胞融合。骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合后，可形成能分泌针对单一抗原表位的均质的高特异性的抗体，即单克隆抗体。由于骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞不能在体外增殖，因此将两种细胞融合后既具有肿瘤细胞无限增殖特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力，同时克服了免疫淋巴细胞不能在体外增殖的缺点，融合的细胞被称为淋巴细胞杂交瘤。

然而，制备能特异性的结合TRPC3蛋白的抗体，首先需要筛选合适的TRPC3多肽序列，获得良好的免疫原，但目前并没有免疫原性好且特异性高的抗原多肽。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种TRPC3抗原多肽。

本发明的另一目的是提供一株能分泌抗上述TRPC3抗原多肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的又一目的是提供上述TRPC3抗原多肽的单克隆抗体。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供了一种TRPC3抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。TRPC3蛋白共有836个氨基酸，经过对其进行跨膜区域、膜内外区域和保守区域等多方面的研究，最终筛选确定15个氨基酸序列即YFTYARDKWLPSDPQ，作为抗原多肽，既避开了跨膜结构，又具有高度的保守性（在人、大鼠和小鼠中均有）。

本发明提供了一株杂交瘤细胞株T-Ⅱ，该杂交瘤细胞株是由所述的TRPC3多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH（keyhole limpet hemocyanin，血蓝蛋白）偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，培养，经ELISA检测筛选，得杂交瘤细胞株T-Ⅱ，于2015年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为C2015140。

另外，本发明还提供了一种抗TRPC3的单克隆抗体，该抗TRPC3的杂交瘤细胞株是由上述杂交瘤细胞株T-Ⅱ分泌得到的，所述抗TRPC3的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

S1 将合成后的TRPC3抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫小鼠；

S2取步骤S1得到的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，培养，经ELISA检测技术筛选，建立杂交瘤细胞株，得杂交瘤细胞株T-Ⅱ；

S3将步骤S2得到的杂交瘤细胞株T-Ⅱ分泌的单抗采用超滤离心管（15ml,50KD）浓缩后再进行辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，即得。

本发明提供的抗TRPC3的单克隆抗体可特异性识别各种组织细胞表达的TRPC3蛋白，该单克隆抗体可用于TRPC3表达研究，借以监测与TRPC3分子表达相关的组织和疾病，如动脉粥样硬化等。同时也可以用于TRPC3蛋白过表达的组织及疾病监测，亦或经过人源化改造后与药物偶联进行免疫靶向治疗。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优势：

1. 分析特性表明，本发明提供的TRPC3抗原多肽的抗原指数预测0.995，表露性预测值1.000，柔韧性预测值1.003，β-转角预测值1.080，B细胞表位预测较佳，通过免疫小鼠，检测小鼠血清抗体效价1:12800，达到制备单克隆抗体的要求。

2. 本发明的杂交瘤细胞株可以在体外“永久”地存活并传代，适合持续性研究以及进一步的扩大化制备。

3. 本发明的抗TRPC3的单克隆抗体，同已有的多克隆抗体相比，具有以下优点：①可获得大量高度特异的、均一的抗体，理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制。②能得到“无限量”的均一性抗体，适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如 ELISA技术、免疫印记技术等。③单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，经改造人源化并与药物偶联后可免疫靶向治疗，此外，也可用于放射免疫诊断等。

本发明提供的杂交瘤细胞株T-Ⅱ，于2015年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC-C2015140。

附图说明

图1为TRPC3合成肽序列图谱；

图2为TRPC3单抗纯化的SDS-PAGE结果图，其中：1，2，3表示三批样品，55KD和25KD分别为IgG的重链和轻链。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1、TRPC3抗原多肽设计

表1 TRPC3抗原多肽

TRPC3抗原多肽

YFTYARDKWLPSDPQ（SEQ ID NO:1）

将上述TRPC3抗原多肽的α-螺旋、β-转角、亲水性以及抗原指数进行检测，其检测结果为：本发明提供的TRPC3抗原多肽的抗原指数预测0.995，表露性预测值1.000，柔韧性预测值1.003，β-转角预测值1.080，B细胞表位预测较佳。即所述TRPC3抗原多肽的α-螺旋、β-转角、亲水性以及抗原指数均符合B细胞表位分析结果，其中TRPC3抗原多肽的抗原指数优势显著，结果见图1所示。

实施例2、抗TRPC3的单克隆抗体的制备

1、试验对象：选取4只BALB/c健康小鼠，鼠龄在6～8周。

2、试验方法：

（1）TRPC3抗原肽合成

根据实施例1设计的抗原多肽，与KHL偶联，免疫BALB/c健康小鼠，接着采用间接ELISA法测定小鼠血清效价，选择免疫效价高者进行加强免疫后准备细胞融合；

（2）培养骨髓瘤细胞

将骨髓瘤SP2/0细胞株（由暨南大学生命科学院免疫重点实验室赠送）用10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，传代3代后收集细胞，计算细胞数量，以备细胞融合使用；选用8周左右的Balb/c小鼠，制备脾细胞悬液，作为培养细胞备用；

（3）细胞融合

取步骤（1）得到的加强免疫的小鼠，首先进行眼球放血，收集血清作为阳性对照，然后拉颈处死小鼠，取小鼠脾细胞培养，获得免疫小鼠脾细胞悬液，将脾细胞与步骤（2）得到的骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合，所述脾细胞与骨髓瘤细胞的体积比为5:1，然后加入96孔培养板中，选择HAT作为培养基培养，观察生长情况，当细胞克隆长满覆盖大于10％孔底时测定上清中单抗分泌阳性者为保留阳性孔，将进一步经过有限稀释法进行亚克隆筛选；

（4）单克隆抗体的制备

采用小鼠腹腔接种法制备单克隆抗体，先用液体石蜡对小鼠进行腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞株T-Ⅱ接种到小鼠腹腔中，正常饲养7-10天后收集小鼠的腹水；

（5）单克隆抗的纯化

将步骤（4）得到的3批小鼠腹水使用正辛酸-硫酸铵法纯化，SDS-PAGE电泳鉴定重链和轻链；同时采用ELISA法分析抗体的类型及其亚类，其类型为IgG，亚类为IgG1。

3、试验结果：

试验结果如表2和图2所示。其中，抗TRPC3的单克隆抗体含量如表2所示，抗TRPC3的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图如图2所示。

表2 杂交瘤T-Ⅱ培养上清液及小鼠腹水中抗TRPC3的单克隆抗体的含量

	第1批	第2批	第3批
				杂交瘤T-Ⅱ培养上清液抗TRPC3的单克隆抗体含量（mg/ml）	1.560	1.423	1.526
小鼠腹水中抗TRPC3的单克隆抗体含量（mg/ml）	9.906	10.210	10.402

SEQUENCE LISTING

<110> 广东药学院

<120> TRPC3抗原多肽和抗TRPC3的单克隆抗体

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Phe Thr Tyr Ala Arg Asp Lys Trp Leu Pro Ser Asp Pro Gln

1 5 10 15

Claims (5)

1.一种TRPC3抗原多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一株杂交瘤细胞株T-II，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为C2015140。

3.一种抗TRPC3的单克隆抗体，其特征在于，由权利要求2所述的杂交瘤细胞株T-II分泌得到，所述抗TRPC3的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

S1将合成后的TRPC3抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混合免疫小鼠；

S2取步骤S1得到的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，培养，经ELISA检测技术筛选，建立杂交瘤细胞株，得杂交瘤细胞株T-II；

S3将步骤S2得到的杂交瘤细胞株T-II分泌的单抗采用超滤离心管(15ml，50m)浓缩后再进行辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，即得。

4.权利要求3所述的抗TRPC3的单克隆抗体在制备与TRPC3分子表达相关的疾病的诊断试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述与TRPC3分子表达相关的疾病为动脉粥样硬化。