DE102011008153A1 - Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper 5G4/F7 und die denselben produzierende Hybridomzellinie H-5G4/F7. Es ist die Aufgabe gestellt, einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der ein bisher nichtbekanntes Epitop besitzt und aufgrund seiner Struktur sich an ein oligomeres Alpha-Synuclein binden und dessen Identifizierung ermöglicht. Die Aufgabe wird gelöst durch Herstellen der Hybridomzellinie H-5G4/F7 und deren Kultivierung. Als Kopplungsstelle am oligomeren Alpha-Synuclein ist die Region HGVA erkannt worden. Es sind ein monoklonaler Antikörper und ein Assay angegeben, die zur Diagnostik von Parkinson und ähnlichen Synucleopathien eingesetzt werden können.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des monoklonalen Antikörpers (MAk) 5G4/F7, die murine monoklonale Hybridomzelllinie H-5G4/F7 und das Alpha-Synuclein-Peptid der Aminosäuresequenz TKEGVVHGVATVAE. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Diagnostik und die Therapie von Synucleopathien, einer Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen beim Menschen, deren häufigste Form Morbus Parkinson darstellt. Die Diagnostik kann in verschiedenen Körperflüssigkeiten oder Gewebsproben mittels immunochemischer Testverfahren erfolgen. Weiterhin kann der Antikörper für histologische Untersuchungen post mortem in der neuropathologischen Diagnostik eingesetzt werden.
  • Verfahren zur Herstellung MAk gehen auf Arbeiten von Köhler und Milstein (1975) zurück und sind in den vergangenen Jahren und Jahrzehnten breit erforscht und ausgebaut worden. Monoklonale Antikörper sind als Detektoren für Epitope auf Zelloberflächen unverzichtbar. In der Diagnostik von Krankheiten an Tier und Mensch werden sie vielfältig eingesetzt, als Bestandteile von Therapeutika ebenso.
  • M. Parkinson
  • Die Parkinson-Erkrankung (Morbus Parkinson) ist eine Krankheit, bei der es zu einem fortschreitenden Verlust bestimmter Zellen (dopaminproduzierender Zellen) des Gehirns kommt. Dadurch kann das Neurotransmitter Dopamin nicht mehr in ausreichender Menge produziert werden. Ohne die richtige Menge an Dopamin kann sich der Mensch nicht richtig bewegen. Es kommt zu den klassischen Symptomen mit Bewegungsarmut bzw. – verlangsamung (Akinese), Muskelsteifheit (Rigor) und Zittern (Tremor). Daher nannte James Parkinson diese Erkrankung in seiner Erstbeschreibung aus dem Jahr 1817 auch Schüttellähmung (Paralysis agitans).
  • Die Parkinson Krankheit ist eine Erkrankung vorwiegend des höheren Lebensalters. Nur etwa zehn Prozent der Patienten sind bei Diagnosestellung jünger als 40 Jahre. In der Regel fällt die Erkrankung zwischen dem 50. und 60. Lebensjahr auf. Die Häufigkeit nimmt mit dem Alter zu. In der Gesamtbevölkerung sind zwischen 100 und 200 pro 100 000 Personen betroffen. Bei Personen älter als 60 ist etwa einer von 100 erkrankt. Das männliche Geschlecht ist etwas häufiger betroffen.
  • Diagnose
  • Die Diagnose „Parkinson” ergibt sich aus den Symptomen, der Krankengeschichte und den Untersuchungsbefunden. Ein anfangs gutes Ansprechen auf die Gabe von L-Dopa, einer Vorstufe von Dopamin, ist richtungsweisend. Um andere Hirnerkrankungen auszuschließen, werden das CCT (Schädel-Computertomogramm) und MRT (Magnet-Resonanz-Tomogramm) eingesetzt. Spezielle Verfahren der Nuklearmedizin (PET und SPECT) erlauben zwar eine aussagekräftige Diagnose, sind jedoch sehr kostenintensiv. Labordiagnostische Verfahren zur Diagnose von Morbus Parkinson extistieren zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht, die Verwendung des Nachweises von Alpha-Synuclein wird aber diskutiert.
  • Nachteilig ist, dass bisherige immundiagnostische Techniken sich auf den Nachweis von Alpha-Synuclein konzentrieren, wobei keine Unterscheidung zwischen der ubiquitär vorkommenden, monomeren Form des Proteins und den bei pathologischen Prozessen auftretenden Aggregaten bzw. Oligomeren getroffen werden kann. In der Histopathologie werden unter Verwendung monoklonaer Antikörper gegen Alpha-Synuclein beide Formen dargestellt und über die Dichte der aggregierten Strukturen eine Differenzierung ermöglicht. In immunochemischen Testungen wird meist der Gesamtgehalt an Alpha-Synuclein bestimmt.
  • Die Ursache liegt vor allem darin, dass zwischen der monomeren normalen Alpha-Synuclein Struktur und den pathologischen Formen zumindest in der Primärsequenz des Moleküls keine Unterschiede zu finden sind und diese für die tertiäre/quartäre Strukturen bisher auch noch nicht im Detail beschrieben sind. Entwickelte monoklonale Antikörper sind deshalb bisher nicht in der Lage, aufgrund des Vorhandenseins der Bindungsstelle auf dem Monomer wie auch Oligomer von Alpha-Synuclein diese zu unterscheiden.
  • Die Erfindung hat das Ziel, einen monoklonalen Antikörper zu entwickeln, der spezifisch oligomeres Alpha-Synuclein erkennt.
  • Die Erfindung hat die Aufgabe, einen monoklonalen Antikörper zur Verfügung zu stellen, der ein bisher nicht bekanntes Epitop besitzt und aufgrund dieser Struktur sich an ein oligomeres Alpha-Synuclein bindet und seine Identifizierung ermöglicht.
  • Bei der Auswahl des Immunogens wurde die Methode nach Kolaskar et al. verwendet. Mit dieser Methode können antigene Determinanten mit etwa 75% Genauigkeit ausgewählt werden. Aus der Alpha-Synuclein-Sequenz konnten demnach 4 Peptide als mögliche Kandidaten gefunden werden:
    • 1- EGVVAAAEKTKQGVAEA
    • 2- AGKTKEGVLYVGSK
    • 3- TKEGVVHGVATVAE
    • 4- TGVTAVAQKTVEGA
  • Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäss derart gelöst, dass in einem ersten Schritt Mäuse mit den 4 ausgewählten Peptiden aus der Alpha-Synuclein in Gerbu-Adjuvant immunisiert werden, den Mäusen die B-Lymphozyten entnommen und mit der Myelomzelllinie P3X63 Ag8.653 unter Verwendung von 50-%-igem Polyethylenglycol fusioniert werden.
  • Die Fusionsprodukte werden mittels HAT-Selektion nach Littlefield (1964) in Zellkulturplatten selektioniert. Die Charakterisierung der Primärzelllinie erfolgt durch folgende Testungen:
    • – Testung auf IgG-produzierende und wachstumfähige Hybridome,
    • – Prüfung der Reaktivität des produzierten IgG mit dem Immunogen im Western Blot,
    • – und Prüfung der Reaktivität des produzierten IgG mit dem monomeren und oligomeren Alpha-Synuclein im Western Blot.
  • Nach der Immunisierung und Charakterisierung war nur das Peptid Nr. 3 mit der Aminosäuresequenz TKEGVVHGVATVAE, Position 44–57 des humanen Alpha-Synuclein, für die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern geeignet.
  • Die entwickelten Hybridome, nach Immunisierung mit Peptid Nr. 3, Fusion mit der Myelomzelllinie P3X63 Ag8.653 und HAT-Selektion, werden per limiting dilution kloniert und subkloniert und zu monoklonalen Hybridomzellen kultiviert. Expandierte monoklonale Hybridome werden wiederum auf ihre Fähigkeit IgG zu produzieren und ihre Reaktivität gegenüber dem monomeren und oligomeren Alpha-Synuclein mittels ELISA und Western Blot getestet. Nach erfolgreicher Testung werden die Hybridome durch Einfrieren von 5 × 106 Zellen in fetalem Kälberserum + 10% Dimethylsulfoxide gesichert.
  • Aus der Vielzahl der entstandenen Hybridome wird die Zelllinie H-5G4/F7 als produktiver Klon ausgewählt und kultiviert.
  • Produktion und Sicherung des MAk und der Hybridomzelllinie H-5G4/F7
  • Zunächst wird eine master cell bank und eine working cell bank der monoklonalen Hybridomzelllinie H-5G4/F7 angelegt. Dann werden Chargen des MAk 5G4/F7 in MiniPerm-Kleinreaktoren produziert und nach Prüfung zur Verwendung freigegeben.
  • Charakterisierung des MAk 5G4/F7
    • – Der Antikörper der monoklonalen Hybridomzelllinie H-5G4/F7 wird charakterisiert unter Verwendung eines Maus-Hybridoma-Subtyping Kit der Firma Roche. Das Ergebnis dieser Analyse zeigt, daß der Antikörper den Isotyp IgG1[kappa] besitzt.
    • – Westernblot-Analysen werden durchgeführt und zeigen, dass der Antikörper mit den oligomeren Alpha-Synuclein reagiert.
    • – Epitop-mapping erfolgt mittels Pepscan nach Osman et al. (2001). Der Antikörper erkennt das Epitop HGVA am humanen Alpha-Synuclein.
    • – Reaktivitätsnachweis in Immuno-Assays vom oligomeren Alpha-Synuclein ist im Ausführungsbeispiel erbracht.
  • Ausführungsbeispiele
  • 1) Herstellung des oligomeren Alpha-Synuclein
  • Zur Herstellung oligomeren Alpha-Synucleins (70 μM; 1 mg/ml) wird monomeres Alpha-Synuclein in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,7 inkubiert unter Zusatz von 0,5 mM SDS, 100 mM NaCl für 20 Stunden bei 37°C unter Rühren. Portionen oligomeren Alpha-Synucleins werden stabil gelagert bei –80°C.
  • 2) Alpha-Synuclein-Oligomer-ELISA
  • Der ELISA ist ein enzymimmunologischer Assay, der aus einem Fang-Antikörper (monoklonal), einer Präparation an oligomeren Alpha-Synuclein und einem POD-markierten Nachweis-Antikörper (monoklonal) besteht. Beide Antikörper binden an unterschiedlichen Bindungsdomänen des Alpha-Synuclein, so dass das oligomere Alpha-Synuclein eine spezifische Brücke zwischen beiden Antikörpern (sandwich) bildet.
  • Beschreibung der Durchführung des ELISA
  • Hundert Mikroliter des Antikörpers 5G4/F7 werden in 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte (MTP) pipettiert und für 18 Stunden beladen. Der Inhalt wird abgesaugt und die freien Bindungsstellen werden mittels 3%iger Rinderserumalbuminlösung (Assaypuffer) abgesättigt. 100 μl Alpha-Synuclein-Oligomer-Präparation in einer Verdünnungsreihe bzw. einer unbekannter Konzentration werden in der Vertiefung der MTP gegeben und für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3-maligem Waschen werden 100 μl Nachweis-Antikörper-POD (Klon 10D2, spezifisch für Alpha-Synuclein, Eigentümer AJ Roboscreen GmbH) pipettiert und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Über eine nachgeschaltete Substrat-POD(Horseradishperoxidase)-Reaktion kann die gebundene Menge des oligomeren Alpha-Synuclein bestimmt werden. Als Substrat wird Tetramethylbenzidin (TMB) verwendet. Die Höhe des Signals ist proportional der Menge des vorhandenen oligomeren Alpha-Synculeins. Unbekannte Proben werden anhand ihrer Signalhöhe aus einer Eichkurve bestimmt.
  • Ergebnis des ELISA
  • Es wird im ELISA die Bindung von oligomeren Alpha-Synuclein an eine mit 5G4/F7 beschichtete Mikrotiterplatte im Vergleich zu nicht bindenden monomeren Alpha-Synuclein gezeigt.
  • Oligomeres und monomeres Alpha-Synuclein werden in Form einer Verdünnungsreihe inkubiert. Gebundenes Alpha-Synuclein wird nachgewiesen mit dem Antikörper 10D2, der beide Formen an Alpha-Synuclein erkennt und im ELISA mit Meerettichperoxidase konjugiert verwendet wird. In einem weiteren Ansatz wird die Inhibierung der Bindung von oligomeren Alpha-Synuclein an 5G4/F7 durch Zusatz des Alpha-Synuclein Peptides 44–57 gezeigt, dass die spezifische Bindungsstelle von 5G4/F7 (Epitop) enthält. Dazu wird der Reaktionsansatz mit 1 μg Peptid ko-inkubiert. Das Ergebnis des ELISA ist in dargestellt.
  • 3) Alpha-Synuclein-Fang-Assay
  • Der Fangassay ist ein Bead-basierender Test, der spezifisch oligomeres Alpha-Synuclein aus Präparationen isoliert und dieses dann nach Auftrennung mittels SDS-PAGE und Übertragung auf Nitrozellulose mittels Wetsern Blot durch ein spezifisches Alpha-Synclein Antiserum nachweisen lässt.
  • Beschreibung der Durchführung des Fang-Assay
  • Biotinylierter Antikörper 5G4/F7 wird mit vorgewaschenen Streptavidin beschichteten Dynabeads M-280 nach Herstellervorschrift inkubiert (Invitrogen Dynal AS, Oslo, Norway). Die mit biotinyliertem Antikörper beladenen Beads werden mittels Magnet separiert und nach Waschen in Pufferlösung mit 200 ng Alpha-Synuclein (rPeptide) bzw. 200 ng oligomeren Alpha-Synuclein über Nacht bei 4–8°C mit leichtem Schwenken der Röhrchen inkubiert. Die Beads werden mittels Magnet und Pufferlösung 6 Mal gewaschen und dann in 50 μl SDS-Probenpuffer aufgenommen (10 mM Tris pH 6,8 mit 1,6% Glycerol, 4% SDS and 10% Mercaptoethanol) und für 10 min bei 99°C gekocht. Die magnetischen Beads ohne die abgetrennten Antikörper-Antigen-Komplexe werden mittels Magnet abgetrennt und die Überstande werden auf ein Gradientengel von 4–20% Acrylamidgel geladen und getrennt mittels SDS-PAGE. Die aufgetrennten Proteine werden auf eine 0,45 μm Nitrozellulose-Membran mittels Trans-BlotR SD semi-dry electrophoretic transfer cell (Bio-Rad Laborstories GmbH, Munich, Germany) übertragen. Die NC wird anschließend blockiert in 50 mM Tris/150 mM NaCl Puffer pH 10 mit 0,05% Tween 20 (Waschpuffer) und 5% Milchpulver bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. Die NC wird dann mit 0,2 μg/ml Anti-human-Alpha-Synuclein Kaninchenserum FL140 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) über Nacht inkubiert und der Nachweis der gebundenen Kaninchenantikörper an Alpha-Synuclein erfolgt nach Waschen mittels Anti-Kaninchen IgG Serum Peroxidase konjugiert und anschließender TMB/Peroxid-Färbung.
  • Ergebnis des Fang-Assay
  • Nachweis von gebundenem oligomeren Alpha-Synuclein im Vergleich zu nichtgebundenen monomeren Alpha-Synuclein an biotinylierten 5G4/F7, der an magnetische Streptavidinbeads gebunden ist. Der Nachweis erfolgte nach Separation mittels SDS-PAGE und Übertragung auf Nitrozellulose mittels Western Blot. Als Kontrolle wurde eine Isotypkontrolle eines nicht relevanten monoklonalen Antikörpers eingesetzt.
  • erbringt den Nachweis des Fangens an Antigen durch biotinylierten Antikörper 5G4/F7 (1) beladen auf magnetische Streptavidin-Beads von monomeren (a) bzw. oligomeren (b) Alpha-Synuclein-Präparationen nachgewiesen im Western Blot auf Nitrozellulose. Zum Nachweis von Alpha-Synuclein wurde ein spezifisches Kaninchenantiserum (FL140) verwendet. Als Isotypkontrolle wurde ein monoklonaler IgG1-Antikörper, der nicht an Alpha-Synuclein bindet, verwendet.
  • 4) Immunhistochemische Untersuchung von Patientenproben
  • Immunhistochemsscher Nachweis von pathologischen Alpha-Synuclein Ablagerungen in Paraffin eingebetteten Gewebsschnitten des Mesencephalon mit Substantia nigra, Amygdala, Hippocampus und von temporalen Cortex von Individuen mit neuropathologisch bestätigten Parkinson Erkrankung und Lewy-Body-Demenz und von Striatum von Patienten mit multipler Systematrophy.
  • Beschreibung der Durchführung der immunhistochemischen Untersuchungen
  • Die Gewebsschnitte wurden evaluiert durch Austestung unterschiedlicher Behandlungen zur Epitopfreisetzung und verschiedenen Verdünnungen an 5G4/F7 Antikörper. Für vergleichende Untersuchungen wurde eine 1:1000 Verdünnung von 5G4/F7 verwendet. Als Vorbehandlung wurde eine 10 min Mikrowellen-Inkubation in Citratpuffer pH 6 gefolgt von einer Behandlung mit 80% Formic acid Behandlung für 5 min gewählt. Die Immunfärbung wurde verglichen zwischen 5G4/F7 und verfügbaren kommerziellen Antikörpern gegen Alpha-Synuclein (gegen komplettes Alpha-Synuclein).
  • Ergebnis der immunhistochemischen Untersuchungen
  • Der Antikörper 5G4/F7 zeigt keine Hintergrundfärbung mit normalen synaptischen Strukturen (sogenannte Synapsenfärbung mit anderen Antikörpern). 5G4/F7 weist nur pathologische Strukturen nach. Die Anfärbung intrazellulärer und Neuritenstrukturen ist signifikant höher als mit anderen kommerziell erhältlichen Antikörpern. Außerdem ist 5G4/F7 in der Lage pathologische Strukturen auch nach sehr langer Formalinfixierung des Gewebes nachzuweisen. Der Antikörper 5G4/F7 weist auch kleine Granula in synaptischen Strukturen nach (klar zu unterscheiden von feinem präsynaptischen Markierungen der physiologischen Form mit anderen Antikörpern) und auch in Astrogliazellen. Mit dem Antikörper 5G4/F7 kann granuläre Immunreaktivität nachgewiesen werden, die zu den meisten klinischen Symptomen korrespondiert (zum Beispiel im Striatum und der Substantia nigra in Patienten mit Parkinson Syndrom und im Cortex bei Patienten mit Demenz).
  • Durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen in Hirngewebsproben von Patienten mit der Lewy-Körperchen-Krankheit zeigen den Unterschied im Ausmass der Pathologie und den Mangel an normaler synaptischer Färbung mit 5G4/F7.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Kolaskar et al. [0010]
    • Osman et al. (2001) [0016]

Claims (11)

  1. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen oligomeres Alpha-Synuclein durch Immunisierung von Mäusen oder anderen geeigneten Tieren oder In-vitro-Zellkulturen mit dem Peptid TKEGVVHGVATVAE des Alpha-Synucleins, gekoppelt an einen geeigneten Träger zur Induktion einer adäquanten Immunantwort in Adjuvant, Entnahme der B-Lymphozyten, Fusion dieser mit einer für eine nachfolgende Selektion von Fusionszellen geeigneten murinen Myelomzelllinie unter Verwendung von Polyethylenglycol 1500, nachfolgender HAT-Selektion der Fusionsprodukte in Zellkulturgefäßen unter geeigneten Kulturbedingungen. Auswahl Immunglobulin produzierender und unter Selektionsbedingungen wachsender Hybridome und aufgrund ihrer Reaktivität gegenüber dem Immunogen bzw. oligomeren Alpha-Synuclein, Vereinzeln der Hybridome auf Einzelzellebene zur Sicherstellung der Monoklonalität der Hybridomkultur, Kultivierung der Hybridome, wobei das Kultivieren der Hybridome in vitro oder in vivo monoklonale Antikörper 5G4/F7 ergibt, die das Epitop HGVA auf oligomeren Alpha-Synuclein erkennen.
  2. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper 5G4/F7 durch Kultivieren der Hybridomzellinie DSM ACC3099.
  3. Hybridomzellinie DSM ACC3099
  4. Monoklonale Antikörper 5G4/F7.
  5. Epitop HGVA auf Alpha-Synuclein, bestehend aus Histidin, Glycin, Valin, Alanin.
  6. Verwendung monoklonaler Antikörper 5G4/F7 zum Erkennen von oligomeren Alpha-Synuclein.
  7. Verwendung monoklonaler Antikörper 5G4/F7 zum Nachweis pathologischer Alpha-Synculein-Strukturen in biologischen Proben von Menschen.
  8. Verwendung humanisierter monoklonaler Antikörper 5G4/F7 als Therapeutikum für Alpha-Synuclein assoziierte Krankheiten beim Menschen in dem Zusammenhang, dass die Antikörper an Alpha-Synuclein-Oligomere, den wichtigsten Bestandteil der intrazellulären Aggregate, die sich im Gehirn von Synucleopathie-Patienten bilden, binden.
  9. Verwendung von Peptiden oder Proteinen, die die Sequenz TKEGVVHGVATVAE enthalten, als Therapeutikum für eine aktive Immunisierung bei Menschen.
  10. Testkit zum immunologischen Nachweis von oligomeren Alpha-Synuclein, bestehend aus 1. 5G4/F7 als Fang-Antikörper, beschichtet auf einer Mikrotiterplatte. 2. 10D2 als Nachweis-Antikörper (monoklonaler Antikörper, IgG1 [kappa], spezifisch gegen Alpha-Synuclein, konjugiert an Meerettich-Peroxidase). 3. Negative Kontrollen (Probenpuffer). 4. Positive Kontrollen (rekombinantes Alpha-Synuclein, oligomerisiert, in Probenpuffer portioniert und lyophilisiert). 5. Färbe-Lösung (Kaliumcitratpuffer pH 4,0 mit 41 mM TMB-Lösung und 185 mM Peroxid-Lösung). 6. Stoplösung (0,5 M Schwefelsäure) 7. Proben-Puffer (20 mM Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,5 mit 3% BSA und 0,05% Tween 20). 8. Waschpuffer (0,5 M Tris pH 7,5, 1,5 M NaCl, 0,5% Tween 20). 9. Probenvorbereitungskit
  11. Verwendung eines Testkit nach Anspruch 10 in der Humandiagnostik zur Untersuchung von Blutplasma, Blutserum, Liquor oder anderen Körperflüssigkeiten.
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