CN105121473B - α-突触核蛋白抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了对聚合形式的α‑突触核蛋白具有高亲和性且对单体形式的α‑突触核蛋白具有低亲和性的抗体。该抗体用于诊断神经退行性疾病。

Description

α-突触核蛋白抗体及其用途
发明领域
本发明涉及对α-突触核蛋白聚合体(例如淀粉样纤维、初原纤维或低聚物)具有高结合亲和力且对α-突触核蛋白低聚物具有低结合亲和力的抗体或其片段。本发明还涉及这些抗体及片段在诊断、治疗和预防与α-突触核蛋白相关的神经病理中的用途。
背景
突触核蛋白是小分子蛋白家族，约14kDa，其在神经组织中高水平表达。该家族的三个成员是α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白。
α-突触核蛋白主要在脑组织中表达，并主要位于突触前神经元末梢。人类形式的α-突触核蛋白的一级结构是由140个氨基酸的多肽构成。人类α-突触核蛋白的野生型序列可见于图20(SEQ ID NO:49)。α-突触核蛋白通常以可溶性单体蛋白存在，但根据其环境可采用若干不同的折叠构象。单体α-突触核蛋白也可以聚合成低聚物和高分子量不溶性纤维。
与突触核蛋白异常相关的疾病通常被称为共核蛋白病(synucleinopathy)。共核蛋白病包括神经退行性疾病、帕金森氏病(PD)、路易氏体失智症(DLB)和多系统萎缩症(MSA)。在共核蛋白病中，已表明，在PD和DLB的脑匀浆中可溶性α-突触核蛋白低聚物与正常脑相比要高。此外，常常表征PD和DLB晚期的神经病理性病变(路易氏体)已经基本上被认为是由纤维状α-突触核蛋白沉积物组成。
市售α-突触核蛋白抗体是已知的，并且被广泛地用于表征脑中的PD病理。然而，这种抗体是非特异性的，并且既识别α-突触核蛋白的单体形式又识别α-突触核蛋白的聚合形式，并且无法识别α-突触核蛋白的所有聚合形式。
已知的α-突触核蛋白抗体包括Syn-1(BD生物科学(BD Biosciences))和mAb 211(圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))，已知它们同样结合α-突触核蛋白的单体形式和聚合形式。
WO2011/104696公开了特异性识别初原纤维形式的α-突触核蛋白的抗体。这些抗体显示与α-突触核蛋白原纤维和单体的低结合亲和力。
发明内容
本发明涉及对α-突触核蛋白聚合体具有高结合亲和力且对单体形式的α-突触核蛋白具有低结合亲和力的抗体及其片段。
本发明还涉及包含这种抗体或其片段的组合物、使用所述抗体或片段检测α-突触核蛋白聚合体的存在的方法，以及它们在诊断与α-突触核蛋白相关的疾病中的用途。
在其它实施方案中，本发明涉及包含这种抗体或其片段的组合物和使用所述抗体或片段治疗或预防与α-突触核蛋白的病理相关的疾病的方法。
使用对α-突触核蛋白聚合体有特异性的抗体可帮助揭示新的PD和其它共核蛋白病的病理。
通过产生对α-突触核蛋白聚合体有特异性并对α-突触核蛋白单体具有低结合亲和力的抗体，本发明提供了跟踪与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病的进展的新工具。本发明的抗体还提供了可用于治疗与α-突触核蛋白相关的疾病的抗体。
附图说明
现在将通过举例并参考附图来说明本发明，在附图中：
图1示出如实施例1中所描述的用α-突触核蛋白原纤维免疫的宿主(宿主19、22和23)和用α-突触核蛋白低聚物免疫的宿主(宿主210、211和212)的效价检测结果。
图2示出如实施例2所描述的用于筛选杂交瘤对α-突触核蛋白聚合体(原纤维(F)、低聚物(O)和单体(M))的特异性的点图(dot plots)结果。
图3示出如实施例4所描述的使用抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4以及对照Syn-1抗体(BD生物科学(BD Biosciences))进行的抑制ELISA的结果。
图4示出如实施例5(A)所描述的抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4以及Syn-1与由不同蛋白形成的淀粉样纤维的交叉反应性的结果。
图5示出如实施例5(B)所描述的抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4以及Syn-1与由β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白形成的淀粉样纤维的交叉反应性。
图6示出如实施例5(C)所描述的抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4以及Syn-1与由α-突触核蛋白肽NAC(61-98)、NAC(61-75)和截断型α-突触核蛋白(1-122)形成的淀粉样纤维的交叉反应性。
图7示出如实施例6所描述的使用Biacore的对于单克隆抗体(mAb)Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4以及mAb211(圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa CruzBiotechnology))的传感图结果。
图8示出如实施例7所描述的用于表位确定而通过斑点杂交进行的对于mAb Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4，以及Syn-1抗体(对照)的肽扫描结果。
图9示出如实施例7所描述的通过ELISA进行的肽扫描的结果。用本发明的单克隆抗体A)Syn-F1、B)Syn-F2、C)Syn-O1、D)Syn-O2、E)Syn-O3和F)Syn-O4，或者用对照抗体G)Syn 211、H)N-19、I)FL-140、J)Syn-1、K)3B6和L)5C2探测板。
图10示出如实施例7所描述的对放置在肽扫描ELISA的板上的X射线胶片的绘图。对照抗体N-19、FL-140、5C2、Syn-1、Syn-211、3B6的绘图示于图10(A)中。本发明的抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4示于图10(B)中。
图11示出如实施例8所描述的用于检测α-突触核蛋白聚合体的夹心ELISA的结果。抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4，以及Syn-1抗体被用作捕获抗体，FL-140被用作检测抗体。
图12示出如实施例9所描述的用于检测磷酸化Ser129-α-突触核蛋白聚合体的夹心ELISA的结果。抗体Syn-O2和Syn-F2，以及Syn-1被用作捕获抗体，并且兔抗p-S129-α-突触核蛋白被用作检测抗体。
图13示出如实施例10所描述的来自未患帕金森氏病的受试者的对照病例的组织的免疫组织化学分析。
图14示出如实施例10所描述的来自帕金森氏病病例的组织的免疫组织化学分析。
图15示出如实施例10所描述的来自多系统萎缩病例的组织的免疫组织化学分析。
图16示出如实施例11所描述的来自帕金森载体PD患者(A)、渐进性DLB患者(B)和典型PD患者的组织样品中Syn-O2染色的结果。
图17示出如实施例12所描述的来自海马CA2区(A)和内嗅皮层神经突(B)的脑切片的处理的用Syn-F2抗体染色的结果。切片进行以下处理：1)未处理，2)在柠檬酸盐缓冲液中在120℃下高压灭菌10分钟，3)甲酸15分钟，或4)20μg/ml蛋白酶K处理。具有Syn-1抗体的对照5)在已用甲酸处理15分钟的组织样品上进行。
图18示出如实施例14所描述的通过BiFC荧光分析显示形成斑点(箭头)而获得的图像。
图19示出如实施例14所描述的每个测试抗体的斑点阳性细胞的百分比％。
图20示出人类α-突触核蛋白的野生型序列。
详述
本发明涉及对α-突触核蛋白聚合体具有高结合亲和力且对α-突触核蛋白单体具有低结合亲和力的抗体。相比结合α-突触核蛋白单体形式，所述抗体具有提高的结合α-突触核蛋白聚合体的亲和力。
在一个实施方案中，本发明涉及对α-突触核蛋白聚合体具有高结合亲和力且对α-突触核蛋白单体具有低结合亲和力的抗体或其片段。
除非另有说明，术语α-突触核蛋白聚合体意图涵盖早期的可溶性聚合体形式的α-突触核蛋白(例如低分子量和高分子量可溶性低聚物，包括初原纤维)和成熟的不可溶性聚合体形式的α-突触核蛋白(例如成熟原纤维)。具体而言，所述抗体及其片段具有对α-突触核蛋白原纤维的高结合亲和力，和对α-突触核蛋白低聚物的高结合亲和力。
对α-突触核蛋白聚合体具有高亲和力意思是所述抗体或片段显示对于α-突触核蛋白聚合体的解离常数Kd小于10-7M。优选地，所述抗体显示Kd小于10-8M，或小于10-9M，或甚至更优选地，Kd小于10-10M，或甚至小于10-11M。优选地，所述α-突触核蛋白是人类α-突触核蛋白。
原纤维是不溶性高分子量聚合形式的α-突触核蛋白。
可溶性低聚形式的α-突触核蛋白以各种尺寸和形态出现，并包括二聚体、三聚体、四聚体和多聚体。初原纤维是从单体形式形成α-突触核蛋白原纤维的途径中的中间步骤。当使用术语低聚形式的α-突触核蛋白时，也意图包括初原纤维。
抗体的其片段意思是其活性片段，即具有用于限定根据本发明的抗体的相同特征的片段，也就是对α-突触核蛋白聚合体有高亲和力且对α-突触核蛋白单体有低结合亲和力。为方便起见，当使用术语抗体时，也考虑显示相同特征的其片段。
对α-突触核蛋白单体具有低结合亲和力意思是抗体或片段与α-突触核蛋白单体的结合比与α-突触核蛋白聚合体的结合小至少100倍，优选地约500倍，或者，与α-突触核蛋白单体的结合亲和力比与α-突触核蛋白聚合体低1000倍。在一个实施方案中，抗体或其片段对单体α-突触核蛋白的解离常数Kd大于10-5M。
在一个实施方案中，抗体对α-突触核蛋白原纤维的亲和力可以高于对低聚形式的α-突触核蛋白的亲和力。
抗体的结合亲和力可通过使用本领域中认可的各种方法来测定，包括等温量热法和基于表面等离子体共振的方法，例如实施例6中所描述的。结合也可以使用免疫测定如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫分析(RIA)来评价。优选地，使用表面等离子体共振分析利用BIACoreTM X-100测定结合亲和力。
在一个实施方案中，抗体是构象抗体(conformational antibody)。所述抗体识别构象表位，即抗体所识别的表位包括α-突触核蛋白的聚合体的三级结构。在一个实施方案中，相比表5所描述的任何线型肽的表位，抗体结合较强地结合α-突触核蛋白原纤维。具体而言，抗体与α-突触核蛋白原纤维的结合比与表5所描述的线型肽的表位高至少100倍，优选500倍以上，或优选1000倍以上。
本发明的抗体可以弱结合α-突触核蛋白的氨基酸区127-140内的线型表位。弱结合的意思是本发明的抗体与α-突触核蛋白的氨基酸区127-140内的线型表位的结合亲和力比抗体与α-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小至少100倍，特别是比与α-突触核蛋白原纤维的结合亲和力小至少100倍。优选地，与α-突触核蛋白的氨基酸区127-140内的线型表位的结合亲和力比抗体与α-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小1000倍。在一个实施方案中，所述抗体不识别或不结合α-突触核蛋白的线型表位。
在一个实施方案中，被抗体所识别的表位包含α-突触核蛋白的C末端区。识别包含α-突触核蛋白的C末端区的表位的意思是所述抗体有能力结合的至少部分的表位包括至少部分的α-突触核蛋白的C末端区。
在一个实施方案中，本发明的抗体也可以结合磷酸化α-突触核蛋白的聚合形式。相比磷酸化α-突触核蛋白的聚合形式，所述抗体显示与磷酸化α-突触核蛋白的单体形式的低结合亲和力，例如抗体与磷酸化α-突触核蛋白的单体形式的结合亲和力比与聚合的磷酸化α-突触核蛋白的结合亲和力小至少100倍，优选小500倍，更优选小1000倍。α-突触核蛋白的磷酸化可发生在Ser129。
本发明的抗体还显示与其它淀粉样蛋白的低结合亲和力，所述淀粉样蛋白包括β-突触核蛋白、γ-突触核蛋白单体、IAPP(胰岛淀粉样多肽)、β-淀粉样蛋白单体、Tau(涛蛋白)和ABri，例如抗体与这些肽/蛋白中的一种或多种的结合亲和力比与α-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小至少100倍。
在一个实施方案中，本发明的α-突触核蛋白聚合体抗体与β-突触核蛋白的结合亲和力比与α-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小至少100倍，优选小1000倍。具体而言，所述抗体与β-突触核蛋白的结合亲和力比与α-突触核蛋白原纤维的结合亲和力小至少100倍，优选小1000倍。
在一个实施方案中，本发明的α-突触核蛋白聚合体抗体与γ-突触核蛋白的结合亲和力比与α-突触核蛋白聚合体的结合亲和力小至少100倍，优选小1000倍。具体而言，所述抗体与γ-突触核蛋白的结合亲和力比与α-突触核蛋白原纤维的结合亲和力小至少100倍，优选小1000倍。
本发明的其它实施方案提供了在可变重(VH)链和可变轻(VL)链上包含限定的CDR1-3区的氨基酸序列的抗体。
在本发明的一个实施方案中，抗体包含可变重链(VH)，其中所述VH包含如SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
所述抗体或片段可包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中所述VL包含如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或片段包含免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中：
所述VH包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，并且所述VL包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
所述VH包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，并且所述VL包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或
所述VH包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，并且所述VL包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述抗体及其片段可包含VH链，其中：
CDR1区具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
CDR2区具有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:41的氨基酸序列；且
CDR3区具有SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或其结合片段包含VH链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或其结合片段包含VH链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或其结合片段包含VH链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在其它实施方案中，所述抗体或其片段包含VL链，其中：
CDR1区具有SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
CDR2区具有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:47的氨基酸序列；且
CDR3区具有SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或其片段包含VL链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或其片段包含VL链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或其片段包含VL链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述抗体或其片段包含：
VH链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和
VL链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或其结合片段包含：
VH链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和
VL链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；CDR2区具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
具体而言，所述抗体或其结合片段包含：
VH链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列；且
VL链，其中CDR1区具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列，CDR2区具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列，且CDR3区具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其结合片段的特征是具有六个CDR序列(VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3)，其各自独立地选自在表A中的以下各组CDR序列，以任意组合均可。
表A：
另外提供了一种特异性结合人类α-突触核蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括VH和VL，其中VL包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:10至少90％、95％或100％相同的多肽序列。还提供了一种特异性结合人类α-突触核蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括VH和VL，其中VL包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12至少90％、95％或100％相同的多肽序列。
可以使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件测定任意特定多肽是否与另一多肽至少90％或95相同。这些多肽变体基本上保留具有相应亲本序列的多肽的相同性质。这种变体相对参考化合物具有保守型取代，例如大体相似的分子性质的氨基酸之间的变化。例如，可进行在“非必需”氨基酸处导致保守型取代或变化的氨基酸取代。氨基酸取代可包括用天然存在或非天然的氨基酸替换一个或多个氨基酸。保守型取代通常包括下组中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。
所述多肽可以与接头(linker)或其它序列框内融合或缀合。所述多肽可包括融合蛋白，例如所述融合蛋白包括编码α-突触核蛋白抗体或其片段的部分和至少一个异源部分。
另外提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸，例如编码本文所述的α-突触核蛋白抗体的一个或多个CDR或可变重链区或可变轻链区的核酸。核酸包括DNA和RNA。
本发明的一个方面提供了编码本文所述的α-突触核蛋白抗体的VH链的多核苷酸。具体而言，本发明的一个实施方案提供了分离的多核苷酸，其包含编码SEQ ID NO:2；SEQID NO:6或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的核酸。其它实施方案提供了一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9的核酸序列。
本发明的另一方面提供编码α-突触核蛋白抗体的VL链的多核苷酸。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12的氨基酸序列的核酸。其它实施方案提供了一种多核苷酸，其包含SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:11的核酸序列。
在一个实施方案中，多核苷酸编码α-突触核蛋白抗体的重链的CDR1、CDR2和/或CDR3区。所述多核苷酸可包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38和/或SEQ ID NO:39的核酸序列。
还提供了一种多核苷酸，其编码α-突触核蛋白抗体的轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3区。所述多核苷酸可包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和/或SEQ ID NO:45的核酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体或其结合片段的特征是具有六个CDR序列(VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3)，每个区由多核苷酸编码，所述多核苷酸具有这样的序列，其各自独立地选自来自表B的以下各组CDR序列，以任意组合均可。
表B:
还提供了一种多核苷酸，其包含用于VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区的核酸序列，其各自独立地选自来自表B的各组VH-CDR序列，以任意组合均可。
另外提供了一种多核苷酸，其包含用于VL-CDR1、CL-CDR2和VL-CDR3区的核酸序列，其各自独立地选自来自表B的各组VL-CDR序列，以任意组合均可。
还提供了本文所限定的多核苷酸序列的多核苷酸变体。多核苷酸变体与编码本文所限定的α-突触核蛋白抗体或片段的多核苷酸序列基本相同。通常，多核苷酸变体将包含一个或多个取代、增添、缺失和/或插入，优选地使得由多核苷酸变体编码的抗体的结合亲和力相对于由本文具体描述的多核苷酸序列编码的抗体的结合亲和力不会大幅下降。例如，可进行导致在被编码的多肽的“非必需”氨基酸残基处的保守型取代或变化的核苷酸取代。可以使用本领域中已知的方法和计算机程序/软件测定任意特定多核苷酸是否与另一多核苷酸基本相同。
至少编码轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码两种免疫球蛋白链或仅一种免疫球蛋白链的可变结构域。一个实施方案提供了包含多核苷酸的表达载体。
其它实施方案涉及包括所述表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是分离的。在一个实施方案中，所述宿主细胞是非人类细胞。所述表达载体可包括核酸序列，其引导和/或控制插入的多核苷酸的表达。这种核酸序列可包括调控序列，其包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列和增强子序列。用于在各种细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。
根据本发明的抗体的实例已通过传统的杂交瘤技术而开发。所述抗体可以是多克隆的或单克隆的。在具体实施方案中，所述抗体是单克隆的。
通常，所述抗体是哺乳动物抗体，例如灵长类动物、人类、啮齿动物、兔、绵羊、猪或马的抗体。所述抗体可以是任何类型或同种型抗体，例如IgM或IgG。优选地，所述抗体是IgG。
在本发明的另一方面中，所述抗体可被用作用于检测样品中α-突触核蛋白聚合体的存在的诊断工具。所述抗体可用于监测和/或诊断在个体中与α-突触核蛋白相关的神经退行性紊乱。
这些抗体可适用于作为与α-突触核蛋白相关的神经退行性紊乱的诊断工具，所述神经退行性紊乱包括但不限于帕金森氏病、路易氏体失智症和其它α-突触核蛋白相关的神经退行性紊乱。
在一个实施方案中，本发明涉及检测α-突触核蛋白聚合体的方法，其包括以下步骤：
-在生物样品中加入所述抗体或其片段；以及
-检测在α-突触核蛋白聚合体和所述抗体或片段之间形成的复合体的存在。
检出复合体表明在样品中存在α-突触核蛋白聚合体。
所述方法可进一步包括测定形成的复合体的水平并将该水平与参考水平进行比较的步骤。将通常由来自已知不具有α-突触核蛋白病理的个体(“正常个体”)的样品或取自相同的被测试个体的样品的早期测试来计算所述参考水平。
所述方法可检测α-突触核蛋白的原纤维和低聚物。
所述方法可于体外在组织或生物体液样品上进行。获自待测试个体的样品可以是例如脑脊髓液(CSF)、血液、尿液、唾液，或脑、肠、结肠、皮肤或唾液腺的组织。在特别优选的方法中，所述样品是CSF样品。在另一优选方法中，所述样品是脑组织样品。
使样品与抗体在对允许抗体与样品中的α-突触核蛋白聚合体结合有效的条件下结合一段时间。
可以在使用标准方法分析前处理样品。在一个实施方案中，在用所述抗体测试前，所述组织样品未进行预处理。预处理的意思是获得的组织样品未经受任何处理，例如高压灭菌处理、甲酸处理和/或蛋白酶K处理。
本领域中已知的标准方法可用于检测和/或测定在所述抗体和样品中的α-突触核蛋白聚合体之间形成的复合体的水平。
通过例如放射免疫测定法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、夹心免疫测定法、荧光免疫测定法、沉淀反应、凝胶免疫扩散测定法、凝集测定法、蛋白A免疫测定法、免疫电泳测定法、电泳、蛋白免疫印迹(western blotting)的方法可进行对α-突触核蛋白的存在的分析。也可以使用能测定和/或检测待测样品中α-突触核蛋白的存在的其它适合的技术。
在一个实施方案中，可将所述抗体涂覆在表面上，例如微孔板或诊断测试条，将样品加到抗体中，并在允许结合的有效条件下使其结合。然后可检测所述复合体的存在。
在优选的方法中，使用ELISA分析来检测和/或定量α-突触核蛋白聚合体的量。在一个实施方案中，本发明涉及夹心ELISA，其包括：将待测样品加入微孔板，其中微孔板的表面已涂覆有根据本发明的抗体；使存在于样品中的α-突触核蛋白聚合体与抗体结合；以及检测任何抗体/α-突触核蛋白聚合体复合体的存在。使用结合α-突触核蛋白的标记抗体进行检测。
所述方法可用于诊断神经退行性疾病和/或监测神经退行性疾病的进展。可以检测任何α-突触核蛋白聚合体的量和/或尺寸。
神经退行性疾病可包括但不限于帕金森氏病、失智症、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、唐氏综合症(Down’s syndrome)、多系统萎缩、精神病、精神分裂症或克雅二氏症(Creutzfeldt-Jakob disease)。所述失智症可以是路易氏体失智症。
本发明还涉及诊断与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病的方法。所述方法包括对个体给药本发明的抗体，并检测α-突触核蛋白聚合体的存在与不存在。可以检测α-突触核蛋白聚合体和抗体之间形成的复合体的存在与不存在。
存在α-突触核蛋白聚合体表明个体患有神经退行性疾病，不存在α-突触核蛋白聚合体表明受试者未患有神经退行性疾病。
在一个实施方案中，诊断与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病的方法包括：将本发明的抗体加入来自个体的样品；检测α-突触核蛋白聚合体和抗体之间形成的复合体的存在；以及确定个体是否患有与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病。
确定个体是否患有与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病可包括将在样品中形成的复合体的水平与参考水平进行比较，并确定样品中形成的复合体的水平相对参考水平有所提高。
所述方法还可包括对个体给药治疗有效量的药剂以治疗神经退行性疾病。
在其它实施方案中，监测与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病进展的方法包括：将本发明的抗体加入来自个体的样品；检测α-突触核蛋白聚合体和抗体之间形成的复合体的存在；以及将样品中形成的复合体的水平与参考水平进行比较。
所述方法还可包括基于检测到的复合体的水平与参考水平的比较，改变个体的治疗方案。根据疾病进展，通过改变为治疗疾病而给药的药物，和/或改变所给药药物的频率和/或剂量，可以改变治疗方案。相比基线水平，复合体水平的提高通常将表明该个体患有α-突触核蛋白病理，或者在发展α-突触核蛋白病理的进程中。所述基线水平将通常由来自已知不具有α-突触核蛋白病理的个体(“正常个体”)的样品或取自相同的被测试个体的样品的早期测试来计算。
已表明，在CSFα-突触核蛋白低聚物的水平和疾病严重度之间存在一种关系。检测样品中低聚物或原纤维的存在和/或量可以用于跟踪神经退行性疾病的进展和或严重度，特别是在帕金森氏病和其它与α-突触核蛋白病理相关的疾病中使用抗体作为生物标记物。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体用于诊断个体是否患有帕金森氏病。CSF样品是从患者采样。在允许在抗体和样品中存在的聚合α-突触核蛋白之间形成复合体的有效条件下，使抗体与样品接触。然后可以检测抗体的存在。可测定形成的复合体的量，并将其与参考水平比较。
在本发明的一个实施方案中，可将所述抗体用于ELISA，以测定CFS中的聚合α-突触核蛋白。相比使用其它抗体的ELISA，所述抗体可用于以高敏感度和高特异性测定样品中的聚合α-突触核蛋白。具体而言，使用本发明的抗体的ELISA相比使用单克隆抗体(mAb)211作为捕获抗体和生物素化211作为检测抗体的ELISA具有检测CSF中的α-突触核蛋白低聚物和初原纤维的较高的敏感度和特异性。
通过使用所进行的分析的结果，所述方法可用于监测治疗剂的效果。有效的治疗剂可被确定为，引起所采集样品中存在的α-突触核蛋白聚合体的量相比参考值降低的治疗剂。参考值可以反映出治疗前患者中的α-突触核蛋白的量，或者可以代表在未经治疗的患者中发现的α-突触核蛋白的常见量。
可用可检测标记物来标记所述抗体。所述标记物会是在被结合至α-突触核蛋白聚合体时允许检测抗体的标记物。可检测标记物包括但不限于荧光标记物、放射性标记物和造影剂。适合的放射性标记物包括如F18、I123、In111、I131、C14、H3、Tc99m、P32、I125和镓68的那些。适合的荧光标记物可包括荧光素和若丹明。适合的造影剂包括：稀土离子，如钆(Gd)、镝和铁，以及磁化剂。其它标记物包括核磁共振活性标记物、通过PET扫描仪可检测的正电子发射同位素、化学发光标记物和酶标记物。
所述抗体可通过标准技术来标记。
在本发明的另一方面中，所述抗体可被用作显像剂。具体而言，所述抗体可用于在人类和动物组织中的α-突触核蛋白聚合体的检测和定位和/或定量。
本发明提供了对α-突触核蛋白聚合体成像的方法，其包括检测所述抗体与α-突触核蛋白聚合体的结合。
在一个实施方案中，可使本发明的抗体与样品接触，然后可以检测样品中与α-突触核蛋白聚合体结合的抗体。所述抗体优选为标记抗体。可以使用任何适合的成像技术在体内检测脑中α-突触核蛋白聚合体的存在或不存在。在这种体内方法中，所述方法还可包括将所述抗体给药个体并检测所述抗体。
适合的成像技术包括正电子发射断层扫描(PET)、γ-闪烁扫描、磁共振成像(MRI)、功能磁共振成像(FMRI)、脑磁图描记术(MEG)和单光子发射计算机断层显像(SPECT)。
α-突触核蛋白聚合体的存在或不存在也可以在体外检测，例如在组织样品如脑切片中检测。在这类实施方案中，适合成像技术还可包括电子显微镜、共聚焦显微镜和光学显微镜。
在个体的脑中存在的α-突触核蛋白聚合体的数量和/或尺寸与α-突触核蛋白相关疾病的进展有关。α-突触核蛋白聚合体的尺寸或数量上的增加象征疾病的发展，而α-突触核蛋白聚合体的尺寸或数量上的降低象征疾病的复原。
诊断方法也可以用于兽医学用途。
本发明还涉及一种试剂盒(kit)，其包括用于进行诊断方法的根据本发明的抗体。所述抗体可以是完整免疫球蛋白分子或其片段，例如Fab、F(ab)2或Fv片段。所述抗体可按照上文所描述地进行标记。所述试剂盒可用在确定个体是否患有神经退行性疾病的方法中。
所述试剂盒可另外包括使所述方法的任意一种能够进行的一种或多种其它试剂或仪器。这种试剂或仪器包括但不限于以下的一种或多种：适合的缓冲液、从个体获得样品的装置、在上面可进行定量反应的包括孔的支持物。所述试剂盒可任选地包括用于进行以上方法的说明书。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体及其片段可被作用药物。
本发明涉及抗体或其片段，其用于治疗个体中的与α-突触核蛋白相关的神经退行性紊乱。
本发明还涉及治疗个体中具有α-突触核蛋白病理的神经退行性紊乱的方法，其包括对所述个体给药治疗有效量的所述抗体或其片段。
神经退行性紊乱可包括但不限于帕金森氏病、失智症、阿尔茨海默病、唐氏综合症、多系统萎缩、精神病、精神分裂症或克雅二氏症。所述失智症可以是路易氏体失智症。
通过给药所述抗体或其片段可降低或抑制α-突触核蛋白的聚合。可将所述抗体给药包含多个可溶性突触核蛋白种类(species)的样品或直接给药个体。
所述抗体可以通常通过将其注入供应脑的血管或脑本身而直接给药至α-突触核蛋白聚集体的沉积物如路易氏体的位点。
个体可以是人类或非人类动物。本文所述的组合物和方法也可用于兽医学实践中。
术语“治疗(treatment和treating)”等意图包括治愈、减轻、逆转、缓解、管理或延迟病症的发作，或降低病症发展或恶化的危险。该术语也意图包括病症的缓和性治疗、预防性(prophylactic)治疗和预防(preventative)治疗。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物包括所述抗体及其片段和药学上可接受的稀释剂或载体。
一般而言，所述载体的性质将取决于采用的具体给药方式。药物形式包括固体剂、溶液剂和混悬剂。适合的药物载体包括惰性的稀释剂或填充剂、水和各种有机溶剂。组合物还可包括附加的成分，如调味剂、粘合剂和赋形剂。
适合口服的形式包括片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、缓释制剂、溶液剂和混悬剂。适合肠胃外注射的形式包括无菌溶液剂、混悬剂或乳液剂。
示例性肠胃外给药形式包括在无菌水溶液中的混悬剂或溶液剂，例如丙二醇或右旋糖(dextrose)的水溶液。必要时，这种剂型可以适当地被缓冲。
示例性口服形式如片剂可包括：崩解剂如淀粉、海藻酸和复合硅酸盐；粘合剂如蔗糖、明胶和阿拉伯胶；以及润滑剂如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石。固体组合物还可包括软质和硬质明胶胶囊。优选的材料包括乳糖、奶糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇。
制备各种药物组合物的方法是本领域技术人员熟知的。参考雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)。
本发明还涉及所述抗体和片段与一种或多种其它治疗剂结合。
实施例
以下实施例以说明目的提供，并不意图将本发明限制为这些具体实施例。
实施例1
α-突触核蛋白聚合体抗体的制备
α-突触核蛋白原纤维的制备
使用纯化的重组α-突触核蛋白。将新鲜制备的α-突触核蛋白(50μM)溶液在37℃恒温混匀器(800rpm)中孵育7天，以进行聚合。通过硫磺素-S(Th-S)结合分析监测α-突触核蛋白的聚合过程。一旦聚合完成，便将原纤维平均分配成小份样品，并储存在-80℃下直到使用。
α-突触核蛋白低聚物的制备
将新鲜制备的α-突触核蛋白溶液与多巴胺以1:7的摩尔比(α-突触核蛋白:多巴胺)混合，并在37℃恒温混匀器(800rpm)中孵育过夜。第二日，将含有低聚物的溶液平均分配为小份样品，并储存在-80℃下直到使用。
免疫作用
Balb/c雌鼠被用于用α-突触核蛋白的皮下免疫。每个小鼠接受50μg的混有弗氏完全佐剂的α-突触核蛋白溶液(1:1v/v)的初次免疫，随后，用25μg的混有弗氏不完全佐剂的α-突触核蛋白(1:1v/v)以3周的间隔进行加强免疫。在每次加强免疫的第10天，从尾静脉收集血液，并分离血清。进行ELISA以检查宿主对α-突触核蛋白的免疫应答。
ELISA检查宿主的免疫应答
以每孔100μl(70ng/孔)涂布洁净的96孔马克西索普板(mixisorp plate)(能肯(NUNC))，用于在PBS中过夜孵育。然后用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤板三次，然后用封闭缓冲液(含2.25％明胶的PBST)在室温下孵育1小时。用PBST洗涤该板三次，将来自小鼠的100μl的系列稀释抗血清(1/100，接着是10个稀释液)一式两份加入孔中，并将板在室温下孵育1小时。用PBST洗涤板后，在每个孔中加入以1:20000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(每孔100μl，杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))，并在室温下孵育1小时。然后用PBST洗涤该板三次，并用100μl TMB底物溶液(KPL，盖瑟斯堡，USA)孵育直到显色。通过加入H2SO4(0.6N，每孔100μl)来终止反应，使用Victor X3微量滴定板读数器测定在450nm下的吸光值。然后取显示良好免疫应答的宿主用于融合。
记录用α-突触核蛋白原纤维免疫的宿主(宿主19、22和23)和用α-突触核蛋白低聚物免疫的宿主(宿主210、211和212)的效价值，且结果如图1和表1所示。当效价值降到先前应答的一半时，取宿主用于融合。
表1
用α-突触核蛋白原纤维免疫的小鼠在第一次增强后立即显示非常高的效价。因此，对这些宿主不再给予另外的加强免疫。用α-突触核蛋白低聚物免疫的小鼠在第二次增强后显示令人满意的应答。在取小鼠用于融合之前，进行预融合效价测定(在一个月休息后)。由于α-突触核蛋白聚合体的高免疫原性，甚至在2个月的休息后，一些宿主仍显示高效价。
脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞的融合
给予前面实验的小鼠在PBS中的3倍初始剂量的最终腹膜内免疫。三天后，牺牲小鼠。无菌分离脾脏，并在思考夫改良杜尔贝可培养基(IMDM)(吉毕科(Gibco))中洗涤。提取脾细胞，计数，并使用50％PEG 4000(默克(Merck))使其与Sp2/O骨髓瘤细胞融合。将融合细胞重悬于IMDM生长培养基(含2mM glutamax吉毕科(Gibco)的IMDM)、1X Penstrep(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；西格玛(Sigma))、50μg/ml庆大霉素(Gentamycin)(西格玛(Sigma))、50μM 2-巯基乙醇(西格玛(Sigma))和补充有HAT(1X,西格玛(Sigma))和巨噬细胞的20％胎牛血清(海克隆(Hyclone))，6×105个细胞/板(从5-6周龄Balb/c小鼠新鲜分离)。将细胞铺入96孔组织培养板(能肯(Nunc))(200μl/孔)，并在37℃、5％CO2下生长。孵育一周后，将来自板的培养基改变为新鲜制备的补充有HT(1X，西格玛(Sigma))的IMDM生长培养基。使杂交瘤生长直到培养基颜色变为黄色。将培养上清液用于筛选阳性克隆。
阳性克隆的筛选
通过用在PBS中的每孔100μl(70ng/孔)的α-突触核蛋白原纤维或α-突触核蛋白低聚物孵育过夜来涂布洁净的96孔maxisorp板(能肯(Nunc))。然后用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗涤板三次，并用封闭缓冲液(含0.05％吐温-20的PBST)在室温下孵育1小时。然后用PBST洗涤该板，之后加入100μl/孔的来自融合板的培养上清液。将板在室温下孵育1小时。在用PBST(3X)洗涤板后，将以1:20000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(每孔100μl，杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))加入每孔，并在室温下孵育1小时。然后用PBST洗涤该板，并用100μl TMB底物溶液(KPL，盖瑟斯堡，USA)孵育直到显色。通过加入100μl H2SO4(0.6N)来终止反应，使用Victor31420多标记微量滴定板读数器测定在450nm下的吸光度。将阳性克隆转移到24孔板中，并再次筛选以鉴定稳定克隆。
从初期筛选获得总共1100个阳性克隆，并选择57个阳性克隆(来自用α-突触核蛋白原纤维免疫的小鼠)和43个克隆(来自用α-突触核蛋白低聚物免疫的小鼠)用于进一步表征。使用分型试剂盒(西格玛(Sigma))鉴定阳性克隆的同种型。选择IgG克隆，多次传代以鉴定稳定的克隆，并取样用于单细胞克隆。
分型
通过在4℃下孵育过夜将在pH7.4的PBS中的100μl/孔的以1/1000稀释的抗小鼠重链抗体(西格玛(Sigma)，分型试剂盒)涂布于洁净的96孔maxisorp酶标板(能肯(Nunc))。然后用PBST(含0.05％吐温20的PBS)洗涤板3次，并用封闭缓冲液(含2.5％明胶和0.05％吐温20的PBS；每孔400μl)在室温下孵育1小时。然后用PBST洗涤该板3次，并将100μl的来自每个克隆的培养上清液加入孔中。在室温下孵育板1小时，并在用PBST洗涤板后，在每个孔中加入以1:20000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(100μl/孔)，并在室温下孵育1小时。然后用PBST洗涤该板，并用100μl/孔的TMB底物溶液(KPL，盖瑟斯堡，USA)孵育直到显色。通过加入100μl/孔的H2SO4(0.6N)来终止反应，通过Victor31420多标记微量滴定板读数器测定在450nm下的吸光度。将IgG阳性克隆转移到T-25烧瓶中，并取样用于单细胞克隆。
获自用α-突触核蛋白原纤维或低α-突触核蛋白低聚物免疫的小鼠的克隆的同种型如表2所示。
表2
从鉴定并选择出的100个克隆中，发现33个亲本克隆是IgG同种型。剩下的克隆抑或是IgM、抑或是IgG和IgM同种型的混合物。冷冻IgM或混合的同种型克隆，其不用为进一步表征而取样。IgG克隆至少进行3次传代，并选择14个稳定克隆。发现10个克隆是IgG1，2个克隆是IgG2a，并且发现2个属于IgG2b同种型。
单细胞克隆
阳性杂交瘤克隆的T-25烧瓶中收集细胞。对细胞计数，并在IMDM中稀释，取约100个细胞，并将其加入20ml的生长培养基中。生长培养基是补充有glutamax(2mM，吉毕科(Gibco))的IMDM(吉毕科(Gibco))、Penstrep(西格玛(Sigma))、50μg/ml庆大霉素(西格玛(Sigma))、50μM β-ME(西格玛(Sigma))、20％胎牛血清(海克隆(Hyclone))和从青年BALB/c新鲜分离的巨噬细胞(6000个细胞/孔)。将细胞混合并铺入96孔组织培养板中(200μl/孔)。在37℃、5％CO2下孵育该板。使杂交瘤生长，标记含单细胞的孔，直到它们融合生长。取来自显示单菌落的孔的培养上清液用于通过ELISA进行筛选，并将来自阳性孔的细胞转移至24孔板，再次筛选之后，转移至T-25烧瓶。将来自T-25烧瓶的培养上清液筛选至少三次，以选择稳定克隆。
将获自每个克隆的单细胞克隆转入24孔板，并进一步检查稳定性。将来自每个亲本克隆的至少两个单细胞克隆转入T-25烧瓶，用于进一步表征。
实施例2
通过斑点杂交(Dot Blot)筛选杂交瘤对α-突触核蛋白聚合体的特异性
将50ng(5μl，于PBS中)的α-突触核蛋白原纤维(F)、低聚物(O)或单体(M)点样到硝酸纤维素膜上，并在室温下干燥30分钟。将膜用5％脱脂奶的PBST(含0.05％吐温20的PBS)在室温下封闭1小时。然后将膜用PBST洗涤3次，之后用在PBST中以1:1稀释的培养上清液探测，并在室温下孵育2小时。使用Syn-1抗体作为对照。在用PBST洗涤膜后，将以1:20000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP加入，并在室温下孵育1小时。然后用PBST洗涤膜，随后用PBS洗涤2次。用Super signal West pico(超级信号西部超微)化学发光底物(Pierce)使膜显色。
其余的斑点杂交示于图2中。在通过斑点杂交测试的278个克隆之中，发现45个克隆是稳定的，并且其中14个克隆对α-突触核蛋白聚合体有特异性。
实施例3
单克隆抗体的大量培养和纯化
取被鉴定出对α-突触核蛋白聚合体有特异性的六种克隆进行大量培养。这些克隆是Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4。生长培养基是补充有2mM glutamax(吉毕科(Gibco))的CDM4mAb(海克隆(Hyclone))、Penstrep(西格玛(Sigma))、50μg/ml庆大霉素(Gentamycin)(西格玛(Sigma))和50μM β-ME(西格玛(Sigma))。一旦细胞融合且培养基颜色变为黄色，便收集培养上清液，并储存在-20℃直到使用。使用蛋白质G-琼脂糖(Protein G–Agarose)亲和层析从培养上清液中纯化单克隆抗体。制备蛋白质G-琼脂糖柱，并用20床体积的20mM pH 7.2的磷酸盐缓冲液平衡柱。在4℃下以1500rpm离心培养上清液(200ml)10分钟。收集上清液，并过柱5-6次，将流速保持在约1ml/分钟。然后用15床体积的20mM pH 7.2的磷酸盐缓冲液洗涤柱，以去除蛋白质。使用洗脱缓冲液(50mM pH 2.5的甘氨酸)将结合的抗体按500μl级分洗脱入1.5ml离心管，离心管中含有50μl的中和缓冲液(1MpH8.0的Tris)。被纯化的抗体最终在PBS中透析。从不同批次纯化的单克隆抗体汇集在一起，并通过BCA分析测定浓度。将这些单克隆抗体冻干，并以100μg小份在-20℃储存直到使用。
实施例4
纯化抗体的表征
抑制ELISA
用在pH7.4的PBS中的每孔50μl(1.4μg/ml)的α-突触核蛋白原纤维通过在4℃下孵育过夜涂布384孔黑色maxisorp酶标板(能肯(NUNC))。用PBST(含0.05％吐温的PBS)洗涤板4X，并用封闭缓冲液(2.25％明胶的PBS，含0.05％吐温)在室温下封闭1小时。在0.6ml硅化管中，在封闭缓冲液中制备α-突触核蛋白原纤维、低聚物或单体的系列双倍稀释液(从80μM开始，接着是18个系列双倍稀释液)。向每个管中加入等体积的20ng/ml的纯化单克隆抗体(Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3、Syn-O4)或对照Syn-1(BD生物科学(BDBiosciences))，给到最终浓度为10ng/ml，并通过混合在室温下将管孵育2.5小时。然后，将预孵育的溶液加入ELISA板，并在室温下孵育10分钟。在用PBST(4X)洗涤板后，加入以1/15000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(达科(Dako))，并将板在室温下孵育1小时。用PBST洗涤板，加入50μl的底物(SuperSignal ELISA Femto最高敏感度底物,赛默飞科技(ThermoScientific))，并立即使用Victor X3微量滴定板读数器读取板。取α-突触核蛋白浓度的对数稀释为x轴、CPS值为y轴，绘制曲线图。
通过抑制ELISA比较mAb的结合亲和力的结果可见于图3和表3。
表3
发现所有单克隆抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4对α-突触核蛋白原纤维有特异性。
实施例5
测试抗体的交叉反应性-斑点杂交
A)为测试与由不同蛋白形成的淀粉样纤维的交叉反应性，将50ng(在5μl pH7.4的PBS中)的各淀粉样蛋白和肽、来自α-突触核蛋白的原纤维(F)和单体(M)、Tau、A-beta、胰岛淀粉样多肽(IAPP)和ABri点样在硝酸纤维素膜上，并在室温下干燥30分钟。将膜用5％脱脂奶的PBST(含0.05％吐温的PBS)在室温下孵育1小时。在用PBST洗涤膜3X后，用用于α-突触核蛋白的单克隆抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3、Syn-O4或对照抗体Syn-1(BD生物科学(BD Biosciences))、用于Tau的5E2(由Dr.D.Walsh馈赠，哈佛医学院(HarvardMedical School))、用于A-Beta的82E1(IBL)、用于IAPP的R10/99(圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))、用于Abri的兔抗ABri抗血清在室温下孵育(50ng/ml在PBST中)膜2小时。洗涤膜，并用以1/20000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))或以1/10000稀释的山羊抗兔IgG-HRP(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))在室温下孵育1小时。然后用Super signal West Pico化学发光底物使斑点显色。
与由不同蛋白形成的淀粉样纤维的交叉反应性的结果可见于图4。发现根据本发明的单克隆抗体对α-突触核蛋白淀粉样纤维具有特异性，并且不与其它淀粉样纤维或单体交叉反应。
B)用于测试本发明的构象单克隆抗体与由β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白形成的淀粉样纤维的交叉反应性。将50ng来自α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白的原纤维(F)和单体(M)点样在硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶的PBST封闭膜1小时，然后用用于α-突触核蛋白的本发明的单克隆抗体(Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3、Syn-O4)或对照抗体Syn-1(BD生物科学(BD Biosciences))、用于β-突触核蛋白的抗β-突触核蛋白(圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))和用于γ-突触核蛋白的C-20(圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))在室温下探测2小时。洗涤膜，并用以1/20000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(杰克逊免疫研究(JacksonImmunoresearch))或以1/300000稀释的鸡抗山羊IgG-HRP缀合物(Santa Cruz生物技术)在室温下孵育1小时。用Super signal West Pico化学发光底物使斑点显色。
与由β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白形成的淀粉样纤维的交叉反应性的结果可见于图5。发现根据本发明的单克隆抗体对α-突触核蛋白原纤维具有特异性，并且不与原纤维形式或单体形式的β-突触核蛋白或γ-突触核蛋白反应。
C)用于测试本发明的构象单克隆抗体与α-突触核蛋白的不同片段的交叉反应性。将50ng来自全长α-突触核蛋白(1-140)和来自肽片段α-突触核蛋白(1-122)、NAC(61-95)和NAC(61-78)的原纤维(F)和单体(M)点样在硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶的PBST封闭膜1小时，用用于α-突触核蛋白的本发明的单克隆抗体(Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3、Syn-O4)和对照抗体Syn-1(BD生物科学(BD Biosciences))，和5C2(圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))在室温下探测2小时。洗涤膜，之后用以1/20000稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))或以1/300000稀释的鸡抗山羊IgG-HRP缀合物(圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))在室温下孵育1小时。然后用Super signal West Pico化学发光底物使斑点显色。
与由α-突触核蛋白的不同片段形成的淀粉样纤维的交叉反应性的结果可见于图6。根据本发明的单克隆抗体不与由任何截断型α-突触核蛋白(1-122)、NAC区(61-95)或NAC(61-78)形成的淀粉样纤维反应，但仅与由全长α-突触核蛋白(1-140)形成的纤维反应，这表明，部分表位可能在α-突触核蛋白的C末端区。本发明的mAb与α-突触核蛋白单体的非反应性也表明由本发明的mAb识别的表位可具有构象特异性。
实施例6
动力学常数的测定
Biacore分析
使用BIAcore X 100仪器通过表面等离子共振测定本发明的mAb和-突触核蛋白原纤维之间相互作用的动力学常数。通过在10mM pH4.5的醋酸钠缓冲液中注入35μl 120μg/ml的-突触核蛋白原纤维，将α-突触核蛋白原纤维固定至用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N乙基-N(二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)活化的CM5传感芯片。通过将范围在0.01至10nM的8个不同浓度的mAb(Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3、Syn-O4和mAb 211(Santa CruzBiotechnolgy))以10μl/分钟的流速注入HBS电泳缓冲液(10mM hepes、0.15m NaCl、3.4mMEDTA和0.005％表面活性剂P20；pH7.4)，来获得结合速率常数。以40μl/分钟的流速测定解离速率。使用100mM pH9.6的NaHCO3再生传感芯片。用BOA评价软件分析传感图。
示出由Biacore进行的mAb的对比的结果可见于图7和表4。发现单克隆抗体的Kd小于10-8。发现mAb Syn-O1具有KD15.9pM的最高的亲和力。发现6个单克隆抗体(mAb)之中最低亲和力是具有2.6nM的Syn-F2。
表4
mAb ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
Syn-F1 1.230E+7 0.001564 1.272E-10
Syn-F2 1.256E+6 0.003377 2.688E-9
Syn-O1 5.857E+6 9.360E-5 1.598E-11
Syn-O2 1.314E+7 0.001274 9.694E-11
Syn-O3 2.217E+6 3.789E-4 1.709E-10
Syn-O4 7.236E+6 9.964E-4 1.377E-10
mAb 211 1.648E+5 4.220E-4 2.560E-9
实施例7
对mAb的表位作图
为了揭露本发明的mAb是否检测线型表位或构象表位，针对覆盖α-突触核蛋白序列的肽文库测试抗体的亲和性。合成了覆盖人类α-突触核蛋白序列(参见表5)的14个氨基酸长、具有7个氨基酸重叠的肽(上海瀚鸿化工有限公司(Shanghai Hanhong ChemicalCo.),中国)。将肽溶解于高压灭菌的水或DMSO中，给到1mg/ml的最终浓度。
表5
肽编号 序列编号 肽序列
1 1-14 H-MDVFMKGLSKAKEG-OH
2 8-21 H-LSKAKEGVVAAAEK-OH
3 15-28 H-VVAAAEKTKQGVAE-OH
4 22-35 H-TKEQGVAEAAGKTKE-OH
5 29-42 H-AAGKTKEGVLYVGS-OH
6 36-49 H-GVLYVGSKTKEGVV-OH
7 43-56 H-KTKEGVVHGVATVA-OH
8 50-63 H-HGVATVAEKTKEQV-OH
9 57-70 H-EKTKEQVTNVGGAV-OH
10 64-77 H-TNVGGAVVTGVTAV-OH
11 71-84 H-VTGVTAVAQKTVEG-OH
12 78-91 H-AQKTVEGAGSIAAA-OH
13 85-98 H-AGSIAAATGFVKKD-OH
14 92-105 H-TGFVKKDQLGKNEE-OH
15 99-112 H-QLGKNEEGAPQEGI-OH
16 106-119 H-GAPQEGILEDMPVD-OH
17 113-126 H-LEDMPVDPDNEAYE-OH
18 120-133 H-PDNEAYEMPSEEGY-OH
19 127-140 H-MPSEEGYQDYEPEA-OH
通过斑点杂交进行的肽扫描
在室温下用0.1％EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳化二亚胺盐酸盐)的PBS预处理硝酸纤维素膜10分钟，并空气干燥。将200ng(在5μl pH7.4的PBS中)的肽1-19(α-突触核蛋白肽文库，表5)和50ng的α-突触核蛋白原纤维(点20)点样在膜上。在空气干燥后，用含5％脱脂奶的PBST封闭膜，并在室温下孵育1小时。用PBST洗涤膜三次，之后用Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3、Syn-O4或Syn-1单克隆抗体孵育(50ng/ml，在PBST中)，并在室温下孵育2小时。用PBST洗涤膜，并用以1:20000稀释(在PBST中)的山羊抗小鼠IgG-HRP(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))孵育。使用Super signal West Pico化学发光底物(赛默飞科技(Thermo Scientific))使斑点显色。肽扫描的结果示于图8中。
使用斑点杂交进行的肽扫描的结果表明mAb、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3、Syn-O4、Syn-F1或Syn-F2不识别线型表位。
通过ELISA进行的肽扫描
为确认使用斑点杂交的肽扫描结果，也通过使用ELISA的肽扫描测试mAb。用在0.2M pH9.6的NaHCO3中的50μl(500ng/孔)肽(表5中具体描述的α-突触核蛋白肽1-19)和在pH7.4的PBS中的50μl(100ng/孔)α-突触核蛋白原纤维通过在37℃下孵育过夜以允许完全干燥，来涂布384孔黑色maxisorp酶标板(能肯(NUNC))。用PBST洗涤板三次，并用100μl封闭缓冲液(含2.25％明胶的PBST)在室温下封闭1小时。在用PBST洗涤板三次后，加入50μl(100ng/ml)的mAb(Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4)，以及对照抗体(50μl(100ng/ml)的Syn-1(小鼠抗α-突触核蛋白；BD生物科学(BD Biosciences))、50μl(100ng/ml)的N-19(山羊抗α-突触核蛋白；圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa CruzBiotechnology))、50μl(100ng/ml)的211(小鼠抗α-突触核蛋白；圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))、50μl(200ng/ml)的FL-140(兔抗α-突触核蛋白；圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))、50μl(1μg/ml)的5C2(小鼠抗α-突触核蛋白；圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))和50μl(1μg/ml)的3B6(小鼠抗α/β-突触核蛋白；圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))，并在室温下孵育1小时。用PBST洗涤板，加入山羊抗小鼠IgG-HRP缀合物(1/20000；杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))或山羊抗兔IgG-HRP(1/5000；杰克逊免疫研究(JacksonImmunoresearch))缀合物或稀释的鸡抗山羊IgG-HRP缀合物(1/20000)，并在室温下孵育板1小时。用PBST洗涤板，加入50μl的底物(超级信号SuperSignal ELISA Femto最高敏感性底物，赛默飞科技(Thermo Scientific))，并立即使用Victor X3微量滴定板读数器读取板。在测定ELISA信号后，也将板暴露在X射线胶片上，以使点显色。
通过ELISA进行的肽扫描的结果可见于图9和图10(对照抗体：A,本发明的抗体：B)。通过ELISA进行的肽扫描方法还显示抗体不与任何肽反应，但是与C末端肽(127-140)略微反应，这表明C末端区参与形成构象表位。
实施例8
检测α-突触核蛋白聚合体的夹心ELISA
用在200mM pH9.6的NaHCO3中的0.1μg/ml本发明的构象单克隆抗体(Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3或Syn-O4)中的一种(50μl/孔)通过在4℃下过夜孵育来涂布384孔ELISA黑色微孔板(Nunc Maxisorb,能肯(NUNC),丹麦(Denmark))。
用含0.05％吐温-20(PBST)的PBS洗涤板四次，并用100μl/孔的封闭缓冲液(含2.5％明胶和1％BSA的PBST)在37℃下孵育2小时。
用PBST洗涤板4次，并加入50μl的各浓度(10、5、1、0.5、0.1和0.05nM，于PBS中)的单体的、低聚的或聚合的α-突触核蛋白。然后将板在37℃下孵育2.5小时。
在用PBST洗涤四次后，加入以1:1000稀释于封闭缓冲液的50μl FL-140(兔多克隆抗体，圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))，并在37℃下孵育2小时。
在用PBST洗涤孔4次后，加入以1:10000稀释于封闭缓冲液的50μl/孔的山羊抗兔IgG HRP(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))，并在37℃下孵育1.5小时。
用PBST洗涤板4次，使用增强化学发光底物(SuperSignal ELISA Femto,皮尔斯生物技术(Pierce Biotechnology))通过化学发光反应分析结合的HRP的活性，之后，立即用珀金埃尔默酶标仪(PerkinElmer microplate reader)测定化学发光，以相对光单位为单位。
为了确认构象mAb仅检出聚合形式的α-突触核蛋白，而未检出单体形式的α-突触核蛋白，使用对照Syn-1作为捕获抗体进行上述的进一步的ELISA分析。
结果如图11所示。结果显示，构象mAb Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4同时与低聚形式和聚合形式的α-突触核蛋白反应。Syn-1同时与单体形式和聚合形式的α-突触核蛋白反应。
然而，ELISA显示，对于所有mAb，单体形式的α-突触核蛋白未检出，低聚形式和原纤维形式的α-突触核蛋白被检出，ELISA的结果显示，对于Syn-F1和Syn-F2，α-突触核蛋白原纤维的特异性比低聚形式的α-突触核蛋白的特异性高一些。
实施例9
用于检测聚合的磷酸化Ser129-α-突触核蛋白(p-S129-α-syn)的夹心ELISA
用在200mM pH9.6的NaHCO3中的0.1μg/ml本发明的构象单克隆抗体(Syn-F2、Syn-O2)中的一种(50μl/孔)通过在4℃下过夜孵育来涂布384孔ELISA黑色微孔板(NuncMaxisorb,能肯(NUNC),丹麦(Denmark))。
用含0.05％吐温-20(PBST)的PBS洗涤板四次，并用100μl/孔的封闭缓冲液(含2.5％明胶和1％BSA的PBST)在37℃下孵育2小时。
用PBST洗涤板4次，并加入50μl的各浓度(1、0.5、0.1、0.05、0.01和0.005nM，于PBS中)的单体的p-S129-α-syn或聚合的p-S129-α-syn。然后将板在37℃下孵育2.5小时。
在用PBST洗涤四次后，加入以1:1000稀释于封闭缓冲液的50μl兔抗p-S129-α-突触核蛋白(宜佰康(Epitomics))，并在37℃下孵育2小时。
在用PBST洗涤孔4次后，加入以1:10000稀释于封闭缓冲液的50μl/孔的山羊抗兔IgG HRP(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))，并在37℃下孵育1.5小时。
用PBST洗涤板4次，使用增强化学发光底物(SuperSignal ELISA Femto,PierceBiotechnology)通过化学发光反应分析结合的HRP的活性，之后，立即用珀金埃尔默酶标仪(PerkinElmer microplate reader)测定化学发光，以相对光单位为单位。
为了确认构象mAb仅检出聚合形式的α-突触核蛋白，而未检出单体形式的α-突触核蛋白，使用对照Syn-1作为捕获抗体进行上述的进一步的ELISA分析。
结果可见于图12中。结果显示构象(confirmation)mAb Syn-F2和Syn-O2与聚合形式的磷酸化α-突触核蛋白反应。Syn-1显示相似的情况，但在两种情况中，与单体形式和聚合形式的磷酸化S129α-突触核蛋白均显示低反应。
突触核蛋白的聚合和磷酸化被认为在PD发病机理中起到决定性作用。因此，在生物体液中检测磷酸化或未磷酸化形式的α-突触核蛋白可被用作潜在的用于PD的生物学标记(potential biological marked)。
已经开发出可以特异性地检测聚合形式的α-突触核蛋白但不检测单体形式的α-突触核蛋白的ELISA分析。该分析使用抗体Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3或Syn-O4作为捕获抗体，随后对于聚合的α-突触核蛋白用抗体如FL-140(针对全长α-突触核蛋白产生的兔多克隆抗体，圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology))、对于p-S129-α-突触核蛋白的聚合体用兔抗p-S129-α-突触核蛋白(宜佰康(Epitomics))进行检测。
实施例10
免疫组织化学
在来自帕金森氏病病例的脑切片中使用过氧化物酶免疫组织化学法测试mAb。Syn-F1和Syn-O2以1比10000(0.1μg/ml)稀释液使用，而Syn-F2、Syn-O1、Syn-O3和Syn-O4以1比5000(0.2μg/ml)稀释液使用。也同时对小鼠阴性对照载片进行处理，其中包括所有免疫组织化学步骤，但将一级抗体删除。
结果
通过在帕金森氏病(PD)和多系统萎缩(MSA)病例中使用过氧化物免疫组织化学法使mAb已得到逐步发展。所有抗体在PD脑中(图14)产生路易氏体和路易氏神经突的强免疫染色，在多系统萎缩的脑(图15)的白质少突细胞中产生神经胶质细胞质内含物。也对小鼠阴性对照载片进行处理，并且在切片(图13)中未产生任何免疫反应性。
在对照病例(图13)中，图像示出了在来自对照病例的前扣带皮层中的对本发明的mAb免疫染色的切片和市售的小鼠单克隆抗α-突触核蛋白抗体(Syn-1)或小鼠单克隆抗磷酸化Ser129α-突触核蛋白(phospho-syn)。同时也处理小鼠和兔的阴性对照载片。所有切片用甲酚紫(蓝色)复染色，以使细胞核和细胞膜可视化。将相同的亮度调节应用于所有图像。比例尺代表20μm(应用于所有图(panel))。
在帕金森氏病病例(图14)中，图像示出了在来自帕金森氏病病例的前扣带皮层中的对本发明的mAb有免疫反应的路易氏体和市售的小鼠单克隆抗α-突触核蛋白抗体(Syn-1)或小鼠单克隆抗磷酸化Ser129α-突触核蛋白抗体(phospho-syn)。所有切片用甲酚紫(蓝色)复染色，以使细胞核和细胞膜可视化。将相同的亮度调节应用与所有图像。比例尺代表20μm(应用于所有图)。
在多系统萎缩病例(图15)中，图像示出了在来自MSA病例的硬膜(putamen)中的对本发明的mAb有免疫反应的神经胶质细胞内含物和市售的小鼠单克隆抗α-突触核蛋白抗体(Syn-1)或小鼠单克隆抗磷酸化Ser129α-突触核蛋白抗体(phospho-syn)。切片用甲酚紫(蓝色)复染色，以使细胞核和细胞膜可视化。将相同的亮度调节应用于所有图像。比例尺代表20μm(应用于所有图)。
实施例11
用Syn-O2抗体测试来自已知患有神经退行性紊乱的患者的脑组织样品。抗体以1比5000(0.2μg/ml)稀释液使用。在所有患者样品中，抗体均产生强染色。
已知患者A患有常染色体隐性遗传性早发型帕金森综合征，其具有杂合性错义突变结合帕金基因中的杂合性外显子缺失。如图16(A)所示，在突触和细胞进程中观察到低聚α-突触核蛋白(箭头)。在含少量神经黑色素的神经元的细胞质内可见到非常小的聚合体(箭状记号)。
患者B是渐进性DLB患者。如图16(B)所示，在突触、路易氏神经突样结构和胞外聚合体中观察到低聚α-突触核蛋白的免疫反应性。
患者C具有迟发型先天性帕金森。如图16(C)所示，在路易氏体样胞质内内含物和路易氏神经突中观察到低聚α-突触核蛋白的免疫反应性。
这些结果显示本发明的抗体可用于诊断与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病。
实施例12
用Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3、Syn-O4、Syn-F1和Syn-F2抗体测试不同的脑组织样品切片(海马CA2区、内嗅皮层浅层1-3、内嗅皮层浅层4-6、内嗅皮层神经突)。抗体以1比5000稀释液使用。脑样品进行以下四种处理的一种：1)未处理，2)在柠檬酸盐缓冲液中在120℃下高压灭菌10分钟，3)甲酸15分钟，或4)20μg/ml蛋白酶K处理。
在4℃下孵育过夜。用含罗姆林(Romulin)作为色原体的组织染色HP试剂盒进行检测。对照抗体Syn-1以1:1000稀释液使用。用甲酸将用对照抗体测试的组织样品预处理15分钟。
结果显示，甚至在未对脑组织预处理的情况下，抗体也起作用。然而，用预处理使抗体更好地作用。经蛋白酶K处理的样品显示更好的结果。已知蛋白酶K处理增强异常突触核蛋白(即胞质内聚合体)的免疫反应性，并降低弥漫性突触染色。在海马CA2区(A)和内嗅皮层神经突(B)中的对照抗体和Syn-F2抗体的结果示于图17中。
实施例13
确定对于六种抗体克隆Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4的重链和轻链的可变区的多核苷酸和氨基酸序列。
根据技术手册，使用Plus RNA纯化系统(英杰公司(Invitrogen))从杂交瘤克隆Syn-F1、Syn-F2、Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4中提取RNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析分离的总RNA。
根据技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物利用SuperScriptTM III第一链合成系统将总RNA反转录为cDNA。根据金斯瑞(GenScript)的RACE的标准操作流程扩增VH和VL的抗体片段。
使用标准分子克隆技术将扩增的抗体片段克隆入克隆载体。进行菌落PCR筛选以鉴定具有正确尺寸的插入的克隆。对每个抗体片段的不少于5种具有正确尺寸的插入的单一克隆进行测序。
确定每个VH和VL区的DNA序列，并确定相应的氨基酸序列。确定每个重链和轻链可变区的先导序列、框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)和互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。结果如图6所示。CDR1、CDR2和CDR3多核苷酸和氨基酸序列示于SEQ ID NO:13-48。
编码Syn-F1的VH和VL区的DNA序列分别在SEQ ID NO:1和3中提供。Syn-F1的VH和VL氨基酸序列在SEQ ID NO:2和4中提供。Syn-F1的VH区的CDR1、CDR2和CDR3区分别列于SEQID NO:13、14和15。相应的氨基酸序列列于SEQ ID NO:16、17和18中。Syn-F1的VL区的CDR1、CDR2和CDR3区分别列于SEQ ID NO:19、20和21。相应的氨基酸序列列于SEQ ID NO:22、23和24中。
编码Syn-F2的VH和VL区的DNA序列分别在SEQ ID NO:5和7中提供。Syn-F2的VH和VL氨基酸序列在SEQ ID NO:6和8中提供。Syn-F2的VH区的CDR1、CDR2和CDR3区分别列于SEQID NO:25、26和27。相应的氨基酸序列列于SEQ ID NO:28、29和30中。Syn-F1的VL区的CDR1、CDR2和CDR3区分别列于SEQ ID NO:31、32和33。相应的氨基酸序列列于SEQ ID NO:34、35和36中。
编码Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4的VH和VL区的DNA序列分别在SEQ ID NO:9和11中提供。Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4的VH和VL氨基酸序列在SEQ ID NO:10和12和中提供。Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4的VH区的CDR1、CDR2和CDR3区分别列于SEQ IDNO:37、38和39。相应的氨基酸序列列于SEQ ID NO:40、41和42中。Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4的VL区的CDR1、CDR2和CDR3区分别列于SEQ ID NO:43、44和45。相应的氨基酸序列列于SEQ ID NO:46、47和48中。
结果发现，Syn-O1、Syn-O2、Syn-O3和Syn-O4的VH和VL区的序列是相同的。
表6:
前导序列用斜体印刷，CRD区被加注下划线。
实施例14
在BiFC培养系统中的α-突触核蛋白的共聚合
为了建立BiFC(双分子荧光互补)培养系统，使用电穿孔用GN-接头(link)-αSyn(V1S)或αSynGC(SV2)(由Dr.Pamela McLean馈赠，马萨诸塞州查尔斯镇麻省综合医院(Massachusetts General Hospital，Charlestown，MA))将SH-SY5Y细胞转染。用600μg/mlG418(英杰公司(Invitrogen),加利福尼亚卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))选择转染的细胞2-3周，直到菌落出现。用200μg/ml G418维持稳定的细胞系。
在1μg/ml正常小鼠IgG或α-突触核蛋白抗体(274、Syn-O1、Syn-O2、Syn-F1、Syn-F2、B11D12、F7A11)的存在下，将稳定过表达融合有维纳斯荧光蛋白(venus fluorescenceprotein)的C末端片段的人类α-突触核蛋白的SV2细胞与过表达被N末端venus片段标记的α-突触核蛋白的V1S稳定细胞系共培养。在3天孵育后，用奥林巴斯(东京，日本)FV1000共聚焦激光扫描显微镜分析BiFC荧光。
在细胞中观察到色斑(punct)的形成(箭头)。对含有色斑形成的细胞的数量计数，计算色斑阳性细胞的比例。结果如图18和图19所示。图中指出含有α-突触核蛋白聚合体的细胞的百分比。本文所述的具体实施例和实施方案本质上仅是示例性的，并不意图限制本发明。鉴于本说明书的其它实施方案和实施例及其优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并在本发明要求保护的范围内。

Claims (23)

1.一种抗体或其片段，所述抗体或其片段对α-突触核蛋白低聚物和α-突触核蛋白原纤维的亲和力高于对α-突触核蛋白单体的亲和力，其中所述抗体或其片段包括：
免疫球蛋白重链可变区(VH)，其中CDR1区为SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列；其中，CDR2区为SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；并且其中，CDR3区为SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列；以及
免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其中CDR1区为SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列；其中，CDR2区为SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列；并且其中，CDR3区为SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述VH包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述VL包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述VH和VL分别包含如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段对人类α-突触核蛋白低聚物和原纤维的解离常数Kd小于10-7M。
6.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段对单体的α-突触核蛋白的解离常数Kd大于10-5M。
7.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体对α-突触核蛋白原纤维的亲和力高于对低聚形式的α-突触核蛋白的亲和力。
8.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段结合包含α-突触核蛋白的C末端区的表位。
9.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段是构象抗体。
10.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段不识别α-突触核蛋白的线型表位。
11.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体是单克隆抗体。
12.权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段还包括可检测标记物。
13.权利要求12所述的抗体或其片段，其中所述可检测标记物选自荧光标记物、放射性标记物和造影剂。
14.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段和药学上可接受的稀释剂或载体。
15.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1-13任意一项所述的抗体或其 片段。
16.权利要求15所述的多核苷酸，所述多核苷酸其包含如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的核酸序列。
17.权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段、权利要求14的药物组合物或权利要求15-16中任意一项所述的多核苷酸在制备用于预防或治疗个体中与α-突触核蛋白病理相关的神经退行性紊乱的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述神经退行性紊乱为帕金森氏病、路易氏体失智症、阿尔茨海默病、多系统萎缩、精神病、精神分裂症或克雅二氏症。
19.一种测试试剂盒，其用于确定个体是否患有神经退行性疾病的方法中，所述测试试剂盒包括根据权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段、权利要求14的药物组合物或权利要求15-16中任意一项所述的多核苷酸。
20.权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段在制备用于检测α-突触核蛋白原纤维和聚合体的药物中的用途，所述用途包括以下步骤：
-在生物样品中加入根据权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段；以及
-检测在α-突触核蛋白原纤维和/或聚合体与所述抗体或片段之间形成的复合体的存在。
21.权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段在制备用于诊断与α-突触核蛋白相关的神经退行性疾病的药物中的用途，所述用途包括：
-在来自受试者的生物样品中加入权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段；以及
-检测在α-突触核蛋白聚合体和所述抗体或片段之间形成的复合体的存在或不存在。
22.权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段在制备用于在人类和动物组织中的α-突触核蛋白聚合体的检测和定位和/或定量的药物中的用途。
23.权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段、权利要求14的药物组合物或权利要求15-16中任意一项所述的多核苷酸在制备对α-突触核蛋白聚合体成像的药物中的用途，其包括：
-对个体给药权利要求1-13中任意一项所述的抗体或其片段，以及
-检测所述抗体。
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