KR101990096B1

KR101990096B1 - 알파-시누클레인 항체와 그것의 용도

Info

Publication number: KR101990096B1
Application number: KR1020157025875A
Authority: KR
Inventors: 엘 아그나프 오마르
Original assignee: 유나이티드 아랍에미리트 대학교
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2019-06-19
Also published as: EP2961774A1; HK1217107A1; US20140241984A1; JP6261621B2; US9534044B2; EP2961774A4; CN105121473A; WO2014132210A1; US10208111B2; KR20160010402A; JP2016511254A; CN105121473B; EP2961774B1; US20170190765A1

Abstract

본 발명은 α-시누클레인 응집물(α-synuclein aggregates)(예를 들어 아밀로이드 피브릴(amyloid fibrils), 프로토피브릴(protofibrils) 또는 올리고머(oligomers))에 대해 높은 결합 친화성을 갖고 α-시누클레인 모노머(α-synuclein monomers)에 대해 낮은 결합 친화성을 가지는 항체 또는 그것의 단편(fragments)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 α-시누클레인과 관련된 신경병리(neuropathologies)의 진단, 치료 및 방지하는 것에 사용하는 항체와 절편에 관한 것이다.

Description

알파-시누클레인 항체와 그것의 용도{Alpha-synuclein antibodies and uses thereof}

본 발명은 α-시누클레인 응집물(α-synuclein aggregates)(예를 들어 아밀로이드 피브릴(amyloid fibrils), 프로토피브릴(protofibrils) 또는 올리고머(oligomers))에 대해 높은 결합 친화성을 갖고 α-시누클레인 모노머(α-synuclein monomers)에 대해 낮은 결합 친화성을 가지는 항체 또는 그것의 단편(fragments)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 α-시누클레인과 관련된 신경병리(neuropathologies)의 진단, 치료 및 예방하는 것에 사용하는 항체와 단편에 관한 것이다.

시누클레인은 신경 조직에서 높은 수준으로 발현되는 약 14kDa 크기의 작은 단백질 과이다. 상기 과의 세 가지 구성은 α-, β-, γ-시누클레인이다.

α-시누클레인은 주로 뇌 조직에서 발현되고 뉴론의 presynaptic terminal에 주로 위치한다. 인간의 α-시누클레인의 기본 구조는 140 개의 아미노산 폴리펩티드로 이루어져 있다. 인간 α-시누클레인의 야생형 서열(wild type sequence)은 도 20에서 찾을 수 있다(SEQ ID NO:49). α-시누클레인은 일반적으로 용해성 모노머 단백질(soluble monomeric protein)로 존재하지만 그것의 환경에 따라 여러 가지 다른 접혀진 형태를 채택할 수 있다. 모노머 α-시누클레인은 또한 올리고머(oligomers)와 그보다 고분자 불용성 피브릴(higher molecular weight insoluble fibrils)로 응집(aggregate)할 수 있다.

시누클레인 내의 이상과 관련된 질병은 종종 시뉴클레이노패씨(synucleinopathies)라고도 한다. 시뉴클레이노패씨는 파킨슨병(Parkinson's disease)(PD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies)(DLB)와 다계통 위축증(multiple system atrophy)(MSA)의 신경퇴행성 상태(neurodegenerative conditions)를 포함한다. 시뉴클레이노패씨에서 파킨슨병 및 루이소체 치매의 뇌 세포분해액(brain homogenates) 내의 용해성 α-시누클레인 올리고머는 일반적인 뇌와 비교하여 높은 것으로 나타났다. 또한 파킨슨병 및 루에소체 치매 말기를 종종 특징 짓는 신경병리적 병변(neuropathologic lesions)(루이소체)은 주로 미소 섬유성 α-시누클레인 침전물(fibrillar α-synuclein deposits)로 이루어져 있는 것으로 밝혀졌다.

상업적으로 이용가능한 α-시누클레인 항체는 공지되어 있고, 뇌 속의 파킨슨병 병리 특성화에 널리 사용된다. 그러나 그러한 항체는 비특이적(non-specific)이며 α-시누클레인 모노머와 α-시누클레인의 응집된 형태를 모두 인식하고, α-시누클레인의 모든 응집된 형태를 인식하지 못할 수도 있다.

공지된 α-시누클레인 항체는 α-시누클레인의 모노머 및 응집된 형태와 동등하게 결합되는 것으로 알려진 Syn-1(BD Bioscience)와 mAb 211(Santa Cruz Biotechnology)을 포함한다.

WO 2011/104696은 특히 α-시누클레인의 프로토피브릴 형태를 인식하는 항체를 개시한다. 상기 항체는 α-시누클레인 피브릴 및 모노머에 낮은 결합력을 보인다.

본 발명은 α-시누클레인 응집물에 대해 높은 결합력을 가지고 α-시누클레인의 모노머 형태에 대해 낮은 결합력을 가지는 항체 및 상기 항체의 단편에 관한 것이다.

본 발명은 또한 그러한 항체 또는 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이고 α-시누클레인 응집물의 존재를 감지하기 위한 항체 및 단편을 사용하는 방법과 α-시누클레인과 관련된 질병을 진단하는 상기 항체 및 단편의 용도에 관한 것이다.

추가적인 실시예에서, 본 발명은 α-시누클레인 병리와 관련된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 그러한 항체 및 단편을 포함하는 조성물과 상기 항체 및 단편을 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 α-시누클레인 응집물에 대해 높은 결합력을 가지고 α-시누클레인 모노머에 대해 낮은 결합력을 가지는 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 모노머 α-시누클레인 형태에 비하여 α-시누클레인 응집물에 대해 증가된 결합 친화성을 가진다.

일 실시예에서, 본 발명은 α-시누클레인 응집물에 대해 높은 결합친화성을 가지고 α-시누클레인 모노머에 대해 낮은 결합친화성을 가지는 항체 또는 상기 항체의 단편에 관한 것이다.

별다른 서술이 없으면, α-시누클레인 응집물이라는 용어는 α-시누클레인의 초기 가용성 응집 형태(프로토 피브릴을 포함하는, 저분자 및 고분자 가용성 올리고머와 같은)와 α-시누클레인의 성숙한 불용성 응집물 형태(성숙한 피브릴과 같은)를 포함하는 것을 의도하는 것이다. 특히 상기 항체와 그것의 단편은 α-시누클레인 피브릴에 대해 높은 결합친화성을 가지고 α-시누클레인 올리고머에 대해 높은 결합친화성을 가진다.

α-시누클레인 응집물에 높은 결합친화성을 가진다는 것은 상기 항체 또는 단편이 α-시누클레인 응집물에 대해 10^-7M보다 작은 해리 상수(dissociation constant) Kd을 보이는 것을 의미한다. 바람직하게 상기 항체는 10^-8M 또는 10^-9M보다 작은 Kd 또는, 더욱 바람직하게 10^-10M보다 작은 Kd, 또는 10^-11 보다도 작은 값을 보인다. 바람직하게 α-시누클레인은 사람의 α-시누클레인이다.

피브릴은 α-시누클레인의 불용성 고분자 응집 형태이다.

α-시누클레인의 가용성 올리고머 형태는 다양한 크기와 형태(morphologies)로 나오며 이합체, 삼합체, 사합체 및 다합체를 포함한다. 프로토피브릴은 모노머 형태로부터 α-시누클레인 피브릴을 형성하는 경로의 중간 단계이다. α-시누클레인의 올리고머 형태라는 용어가 사용될 때 이것은 또한 프로토피브릴을 포함하는 것으로 의도된다.

상기 항체의 단편은 그것의 활성 단편, 즉 본 발명에 따른 항체의 정의를 위해 사용되는 동일한 특성을 가지는 단편, 다시 말해 α-시누클레인 응집물에 대해 높은 결합친화성과 α-시누클레인 모노머에 대해 낮은 결합친화성을 가지는 단편을 의미한다. 편의를 위해, 항체라는 용어가 사용되는 경우, 동일한 특성을 보이는 상기 항체의 단편 역시 고려된다.

α-시누클레인 모노머에 낮은 결합친화성을 가진다는 것은 α-시누클레인 모노머에 대한 항체 또는 단편이 적어도 α-시누클레인 결합체에 대한 결합친화성에 비하여 약 100 배 작은 결합력인 것을 의미하며, 바람직하게 α-시누클레인 응집물에 비하여 α-시누클레인 모노머에 대한 결합친화성이 약 500배, 또는 약 1000배 작은 것을 의미한다. 일 실시예에서, 상기 항체 또는 그것의 단편은 α-시누클레인모노머에 대한 10^-5M보다 큰 해리상수 Kd를 가진다.

일 실시예에서, 상기 항체는 α-시누클레인의 올리고머 형태보다 α-시누클레인 피브릴에 대해 더 큰 결합친화성을 가질 수 있다.

상기 항체의 결합친화성은 예시 6에서 설명된 예와 같이, 등온선 열량측정법(isothermal calorimetry) 및 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 기반 접근을 포함하는 공지된 것으로 인식된 다양한 방법을 이용하여 알아낼 수 있다. 결합은 또한 이엘아이에스에이(ELISA) 또는 표지면역검정법(RIAs)과 같은 면역분석법(immunoassays)를 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게 상기 결합친화성은 BIACore^TM X-100을 사용한 표면 플라스몬 공명을 이용하여 밝혀진다.

일 실시예에서, 상기 항체는 입체적 항체이다. 상기 항체는 입체형태의 항원결정부(conformational epitopes)을 인식하며, 즉, 상기 항체가 인식하는 항원결정부는 α-시누클레인 응집물의 3차 구조(teriary structure)를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 항체는 표 5에 설명된 바와 같이 임의의 선형 펩티드 항원결정부(linear peptide epitopes)보다 α-시누클레인 피브릴에 대해 더 강하게 결합한다. 특히, 상기 항체의 결합력은 표 5에 설명된 바와 같이 선형 펩티드 항원결정부보다 α-시누클레인 피브릴에 대해 적어도 100배 높고, 바람직하게 500배 높거나, 바람직하게 1000배 높다.

본 발명의 항체는 α-시누클레인의 127-140 아미노산 부위 내의 선형 항원결정부에 약하게 결합할 수 있다. 약하게 결합한다는 것은 본 발명의 항체의 결합친화성이 α-시누클레인 응집물에 대한 항체의 결합친화성보다 α-시누클레인의 127-140 아미노산 부위 내에서 선형 항원결정부에 대한 결합친화성이 적어도 100배 작은 것을 의미하고, 특히 α-시누클레인 피브릴에 대한 결합친화성보다 적어도 100배 작은 것은 것을 의미한다. 바람직하게 α-시누클레인의 127-140 아미노산 부위 내의 선형 항원결정부에 대한 결합친화성이 α-시누클레인 응집물에 대한 항체의 결합친화성보다 1000배 작다. 일 실시예에서, 상기 항체는 α-시누클레인의 선형 항원결정부를 인식하거나 그와 결합하지 않는다.

일 실시예에서, 상기 항체에 의해 인식되는 항원결정부는 α-시누클레인의 C-말단영역을 포함한다. α-시누클레인의 C-말단영역을 포함하는 항원결정부를 인식한다는 것은 상기 항체가 결합할 수 있는 항원결정부의 적어도 일부가 α-시누클레인의 C-말단영역의 적어도 일부를 포함하는 것을 의미한다.

일 실시예에서, 본 발명의 항체는 또한 인산화 α-시누클레인(phosphorylated α-synuclein)의 응집된 형태에 결합할 수 있다. 상기 항체는 인산화 α-시누클레인의 응집 형태에 비하여 인산화 α-시누클레인의 모노머 형태에 대해 더 낮은 결합친화성을 보이며, 예를 들어 상기 항체의 결합친화성이 인산화 α-시누클레인 응집물에 비하여 인산화 α-시누클레인 모노머에 대해 적어도 100배 작고, 바람직하게 500배 작으며, 더욱 바람직하게 1000배 작다. α-시누클레인의 인산화는 Ser129에서 발생할 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 β-시누클레인, γ-시누클레인 모노머, IAPP(아일렛 아밀로이드 폴리펩티드)(islet amyloid polypeptide), β-아밀로이드 모노머, Tau 및 ABri를 포함하는 다른 아밀로이드 단백질에 대해 낮은 결합친화성을 보이며, 예를 들어 상기 펩티드/단백질의 하나 이상에 대한 상기 항체의 결합친화성이 α-시누클레인 응집물에 대한 결합친화성보다 적어도 100배 작다.

일 실시예에서, 본 발명의 α-시누클레인 응집물 항체의 결합친화성은 α-시누클레인 응집물보다 β-시누클레인에 대해 적어도 100배, 바람직하게 1000배 작다. 특히, 상기 항체의 결합친화성이 α-시누클레인 피브릴에 대한 결합친화성보다 β-시누클레인에 대해 적어도 100배, 바람직하게 1000배 작다.

일 실시예에서, 본 발명의 α-시누클레인 응집물 항체의 결합친화성은 α-시누클레인 응집물보다 γ-시누클레인에 대해 적어도 100배, 바람직하게 1000배 작다. 특히, 상기 항체의 결합친화성이 α-시누클레인 피브릴에 대한 결합성보다 γ-시누클레인에 대해 적어도 100배, 바람직하게 1000배 작다.

본 발명의 추가적인 실시예는 가변 중쇄(variable heavy(VH) chains)과 가변 경쇄(variable light(VL) chains) 상의 CDR 1-3 부위의 규정된 아미노산 서열을 포함하는 항체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 항체는 가변 중쇄를 포함하고, 상기 중쇄는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, 또는 SEQ ID NO:10에 보여지는 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

상기 항체 또는 단편은 이뮤노글로빈 경쇄 가변영역(immunoglobin light chain variable region)(VL)을 포함할 수 있고 상기 VL은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:12에 보여지는 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

특히, 상기 항체 또는 단편은 이뮤노글로빈 중쇄 가변영역(VH)과 이뮤노글로빈 경쇄 가변영역(VL)을 포함하고, 상기 VH는 SEQ ID NO:2에 보여지는 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 상기 VL은 SEQ ID NO:4에 보여지는 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 VH는 SEQ ID NO:6에 보여지는 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 상기 VL은 SEQ ID NO:8에 보여지는 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 VH는 SEQ ID NO:10에 보여지는 바와 같은 아미노산 서열을 포함하고 상기 VL은 SEQ ID NO:12에 보여지는 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

구체적인 일 실시예에서, 상기 항체 또는 상기 그것의 단편은 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:29, 또는 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CRD3 부위가 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:30, 또는 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지는 VH 사슬을 포함할 수 있다.

특히, 상기 항체 또는 그것의 결합 단편은 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 가지는 VH 사슬을 포함한다.

특히, 상기 항체 또는 그것의 결합 단편은 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 가지는 VH 사슬을 포함한다.

특히, 상기 항체 또는 그것의 결합 단편은 CDR1 부위가 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지는 VH 사슬을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 상기 항체 또는 그것의 단편은 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:22 또는 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 가지는 VL 사슬을 포함한다.

특히, 상기 항체 또는 그것의 단편은 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 가지는 VL 사슬을 포함한다.

특히, 상기 항체 또는 그것의 단편은 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 가지고; 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 가지고; 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 가지는 VL 사슬을 포함한다.

일 실시예에서 상기 항체 또는 그것의 단편은, 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 가지는 VH 사슬과, 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 가지는 VL 사슬을 포함한다.

특히, 상기 항체 또는 그것의 결합 단편은, 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 가지는 VH 사슬과, 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 가지는 VL 사슬을 포함한다.

특히, 상기 항체 또는 그것의 결합 단편은, 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지는 VH 사슬과, 상기 CDR1 부위가 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR2 부위가 SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 가지고, 상기 CDR3 부위가 SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 가지는 VL 사슬을 포함한다.

따라서 일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그것의 결합 단편은 표 1에서 임의의 조합으로 다음의 각각의 CDR 서열의 군으로부터 독립적으로 선택된 여섯 개의 CDR 서열(VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2와 VL-CDR3)을 가지는 특징이 있다.

VH-CDR1 SEQ ID NOs	VH-CDR2 SEQ ID NOs	VH-CDR3 SEQ ID NOs	VL-CDR1 SEQ ID NOs	VL-CDR2 SEQ ID NOs	VL-CDR3 SEQ ID NOs
16	17	18	22	23	24
16	29	30	22	23	24
40	41	42	46	47	48

추가로 제공되는 것은 특이적으로 인간 α-시누클레인에 결합하며 VH와 VL을 포함하는 분리된 항체(isolated antibody) 또는 그것의 항원 결합 단편이고, 상기 VL은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:10과 적어도 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또한, 제공되는 것은 사람 α-시누클레인에 특히 결합하며 VH와 VL을 포함하는 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이고, 상기 VL은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:12와 적어도 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.

임의의 특별한 폴리펩티드가 또 다른 폴리펩티드와 적어도 90% 또는 95% 동일한지 여부는 공지된 방법과 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 이용하여 판단될 수 있다. 이러한 변형 폴리펩티드는 대응하는 상위 서열을 가지는 폴리펩티드와 본질적으로 동일한 특성을 보유한다. 그러한 변형은 관련 화합물에 대한 보존적 치환, 예를 들어 대체로 유사한 분자 특성의 아미노산 간의 변경에 대하여 보존적 치환(conservative substitutions)을 가진다. 예를 들어, "비필수적인(non-essential)" 아미노산에서 보존적 치환 또는 변경으로 이어지는 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 하나 이상의 자연 또는 비자연 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은 일반적으로 다음 군의 치환을 포함한다: 글리신(glycine) 및 알라닌(alanine); 발린(valine), 이소류신(isoleucine)과, 류신(leucine); 아스파르트산(aspartic acid)과 글루타민산(glutamic acid); 아스파라진(asparagine) 및 글루타민(glutamine); 세린(serine) 및 트레오닌(threonine); 리신(lysine) 및 아르기닌(arginine); 및 페닐알라닌(phenylalanine) 및 티로신(tyrosine).

상기 폴리펩티드는 인프렘(in-frame)에 융합 또는 연결자(linker) 또는 다른 서열에 접합될 수도 있다. 상기 폴리펩티드는 예를 들어 α-시누클레인 항체 또는 그것의 단편과 적어도 하나의 비상동(heterologous) 부위를 암호화하는 부위를 포함하는 융합단백질(a fusion protein)을 포함할 수도 있다.

추가적으로 제공되는 것은 상기 항체 또는 그것의 항원 결합 단편을 암호화하는 고립된 폴리뉴클레오티드(polynucleotides)로, 예를 들어 하나 이상의 CDR을 암호화하는 핵산(nucleic acid), 또는 본 명세서에 서술된 α-시누클레인 항체의 가변 중쇄 또는 가변 경쇄이다. 핵산은 DNA와 RNA를 포함한다.

본 발명의 일 실시예는 본 명세서에 서술된 α-시누클레인 항체의 VH 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특히, 본 발명의 일 실시예는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 고립된 뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 실시예는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:9의 핵산 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예는 α-시누클레인 항체의 VL 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일 실시예에서 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시예는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:11의 핵산 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

일 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 α-시누클레인 항체의 중쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부위를 암호화한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, 및/또는 SEQ ID NO:39의 핵산 염기 서열을 포함할 수 있다.

또한, α-시누클레인 항체 경쇄의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, 및/또는 SEQ ID NO:45의 핵산 염기 서열을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 그것의 결합 단편은 표 2에서 임의의 조합으로 다음의 각각의 CDR 서열의 군으로부터 독립적으로 선택된 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 각 영역의 여섯 개의 CDR 서열(VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, VL-CDR2와 VL-CDR3)을 가지는 특징이 있다.

VH-CDR1 SEQ ID NOs	VH-CDR2 SEQ ID NOs	VH-CDR3 SEQ ID NOs	VL-CDR1 SEQ ID NOs	VL-CDR2 SEQ ID NOs	VL-CDR3 SEQ ID NOs
13	14	15	19	20	21
13	26	27	19	20	21
37	38	39	43	44	45

또한, 표 2에서 임의의 조합으로 VH-CDR 서열의 각각의 군으로부터 개별적으로 독립적으로 선택된 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 부위의 핵산 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

또한, 표 2에서 임의의 조합으로 VL-CDR 서열의 각각의 군으로부터 개별적으로 독립적으로 선택된 VL-CDR1, VL-CDR2 및 VL-CDR3 부위의 핵산서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

또한, 본 명세서에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 변이체가 제공된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 본 명세서에 서술된 α-시누클레인 항체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적 동일성을 가질 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 바람직하게 변이체의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 항체의 결합친화성이 본 명세서에 구체적으로 서술된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 항체에 비하여 실질적으로 감소되지 않는, 하나 이상의 치환, 추가(additions), 결실(deletions) 및/또는 삽입(insertions)을 포함할 것이다. 예를 들어, 암호화된 폴리펩티드 내 "비필수적인" 아미노산 잔기(amino acid residue)에 보존적 치환 또는 변경으로 이어지는 뉴클레오티드 치환이 이루어질 수 있다. 임의의 특정 폴리뉴클레오티드가 또다른 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한지 여부는 공지된 방법 및 컴퓨터 프로그램/소프트웨어를 이용하여 결정될 수 있다.

적어도 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인(variable domain)을 암호화하는 폴리펩티드는 양 면역글로빈 사슬들 또는 오직 하나의 면역글로빈 사슬의 가변 도메인을 암호화할 수 있다. 일 실시예는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터(expression vectors)를 제공한다.

추가적인 실시예는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포(host cell)에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 숙주 세포는 분리된다. 일 실시예에서, 상기 숙주 세포는 비인간 세포(non-human cell)이다. 상기 발현 벡터는 삽입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하고 또는 제어하는 핵산 염기 서열을 포함할 수 있다. 그러한 핵산 염기 서열은 프로모터 염기서열(promoter sequences),종결서열(terminator sequences), 아데닐산중합반응서열(polyadenylation sequences)와, 인핸서 서열(enhancer sequences)을 포함하는 조절염기서열(regulatory sequence)를 포함할 수 있다. 다양한 세포 내 폴리펩티드의 클로닝(cloning) 및 발현 시스템은 공지되어 있다.

본 발명에 따른 항체의 예는 기존의 하이브리도마 기법(hybridoma techniques)에 의해 개발되어 왔다. 상기 항체는 다클론성 (polyclonal) 또는 단클론성(monoclonal)일 수도 있다. 특정 실시 예에서, 상기 항체는 단클론성 항체이다.

일반적으로 상기 항체는 영장류, 인간, 설취류, 토끼, 양, 돼지 또는 말 항체와 같은 포유류의 항체이다. 상기 항체는, 예를 들어 IgM 또는 IgG와 같은 임의의 급(class) 또는 아이소타입(isotype) 항체일 수 있다. 바람직하게 상기 항체는 IgG이다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 항체는 샘플 내의 α-시누클레인 응집물의 존재를 검출하기 위한 진단 도구로 사용될 수 있다. 상기 항체는 한 개체에게서 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환을 모니터링하고 또는 진단하기 위하여 사용될 수도 있다.

상기 항체는 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다른 신경퇴행성 질환과 관련된 α-시누클레인을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환을 위한 진단 도구에 적합할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 α-시누클레인 응집물을 검출하는 방법에 관한 것이다:

- 생물학적 샘플에 상기 항체 또는 그것의 단편을 추가하는 단계와;

- α-시누클레인 응집물과 상기 항체 또는 단편 간의 복합체의 존재를 검출하는 단계.

복합체의 검출은 샘플 내 α-시누클레인 응집물의 존재를 의미한다.

상기 방법은 복합체의 레벨을 측정하는 단계와 그 레벨과 기준 레벨을 비교하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 기준 레벨은 α-시누클레인 병리를 가지고 있지 않은("정상 개체") 것으로 알려진 개체로부터 채취된 샘플 또는 테스트된 동일한 개체로부터 채취된 이전 테스트 샘플로부터 일반적으로 산출될 수 있다.

상기 방법은 α-시누클레인의 피브릴 및 올리고머를 검출할 수 있다.

상기 방법은 조직 또는 생물학적 유체 샘플 상에서 체외에서 수행될 수 있다. 테스트될 개체로부터 획득한 상기 샘플은 예를 들어 뇌척수액(cerebrospinal fluid)(CSF), 혈액, 소변(urine), 침(saliva), 또는 뇌, 소화관(gut), 결장(colon), 피부 또는 침샘 조직(salivary gland tissues)일 수 있다. 특히, 바람직한 방법에서 상기 샘플은 CSF 샘플이다. 또 다른 바람직한 방법에서 샘플은 뇌 조직 샘플이다.

상기 샘플은 샘플 내 α-시누클레인 응집물에 항체의 결합을 허용하는데 효과적인 조건 그리고 시간 동안 상기 항체와 결합한다.

상기 샘플은 표준 방법을 이용하여 분석되기에 앞서 가공될 수 있다. 일 실시예에서, 조직 샘플은 항체에 의해 테스트되기 전에 전처리(pre-treatment)를 하지 않는다. 전처리한다는 것은 획득한 상기 조직 샘플은 고압살균(autoclaving), 포름산(formic acid) 및/또는 단백질가수분해효소 K 처리(proteinase K treatment)와 같은 임의의 처리를 실시하지 않은 것을 의미한다.

공지된 표준 방법은 샘플 내 상기 항체와 α-시누클레인 응집물 간의 복합체의 레벨을 검출 및/또는 측정하는 것에 사용될 수 있다.

α-시누클레인의 존재를 위한 분석은 방사면역측정법(radioimmunoassay), 효소결합 면역 흡착법(enzyme-linked immunosorbant assay)(ELISA), 샌드위치 면역분석법(a sandwich immunoassay), 형광면역검정법(a fluorescent immunoassay), 침강반응(a precipitation reaction), 면역확산분석(a gel immunodiffusion assay), 응집 분석(an agglutination assay), 단백질 A 검정법(a protein A immunoassay), 면역 전기 영동 분석(an immunoelectrophoresis assay), 전기영동(an electrophoresis), 웨스턴 블로팅(western blotting)과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 테스트될 샘플 내 α-시누클레인의 존재를 측정 및/또는 검출할 수 있는 적합할 기법이 또한 사용될 수도 있다.

일 실시예에서, 상기 항체는 마이크로웰 플레이트(microwell plate) 또는 진단 시험 스트립(diagnostic test strip)과 같은 표면과, 항체에 첨가된 샘플에 코팅될 수 있고 결합을 허용하는 효과적인 조건 하에서 결합하도록 허용될 수 있다. 그리고 나서 복합체의 존재가 검출될 수 있다.

바람직한 방법에서, ELISA 분석이 α-시누클레인 응집물의 양을 검출 및/또는 수량화하는데 사용된다. 일 실시예에서, 본 발명은 테스트될 샘플을 표면이 본 발명에 따른 항체로 코팅된 마이크로플레이트(microplate)에 첨가하는 단계와; 상기 항체와 결합하기 위한 상기 샘플 내 임의의 α-시누클레인 응집물을 허용하는 단계와; 임의의 항체/α-시누클레인 응집물 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 샌드위치 ELISA(a sandwich ELISA)에 관한 것이다. 검출은 α-시누클레인과 결합하는 표지 항체(labelled antibodies)를 사용하여 수행될 수 있다.

상기 방법은 퇴행성 신경질환의 진단 및/또는 퇴행성 신경질환의 진행을 모디터링하는 것에 사용될 수 있다. 임의의 α-시누클레인의 양 및/또는 사이즈가 검출될 수 있다.

상기 퇴행성 신경질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 다운증후군(Down's syndrome), 다계통 위축증(multiple system atrophy), 정신병(psychosis), 정신분열증(schizophrenia) 또는 크로이츠펠트 야곱병(Creutzfeldt-Jakob disease)을 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 치매는 루이소체 치매일 수 있다.

본 발명은 또한 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 개체에게 본 발명의 항체를 투여하고 α-시누클레인 응집물의 유무를 검출하는 것을 포함한다. α-시누클레인 응집물과 항체 간에 형성된 복합체 유무가 검출될 수 있다.

α-시누클레인 응집물의 존재는 개체가 신경퇴행성 질환을 가지고 있는 것을 의미하고 α-시누클레인 결여는 개체가 신경퇴행성 질환을 가지고 있지 않는 것을 의미한다.

일 실시예에서, α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환을 진단하는 방법은 개체로부터 추출된 샘플에 본 발명의 항체를 첨가하고; α-시누클레인 응집물과 상기 항체 간에 형성된 복합체의 존재를 검출하고; 개체가 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환을 가지고 있는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.

개체가 신경퇴행성 질환을 가지고 있는지 여부를 결정하는 것은 샘플에 형성된 복합체의 레벨을 기준 레벨과 비교하고 상기 샘플 내에서 형성된 복합체의 레벨이 기준 레벨에 비교하여 감소했는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법은 신경 퇴행성 질환을 치료하기 위해 개체에게 물질의 치료상 효과적인 양을 투여하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.

추가적인 실시예에서 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환의 진행정도를 모니터링하는 방법은 개체로부터 추출된 샘플에 본 발명의 항체를 첨가하고; α-시누클레인과 항체 간에 형성된 복합체의 존재를 검출하고; 기준 레벨과 샘플 내 형성된 복합체의 레벨을 비교하는 것을 포함한다.

상기 방법은 기준 레벨과 복합체의 검출된 레벨의 비교를 기초로 하여 개체의 치료 요법은 변경하는 것을 또한 포함할 수 있다. 상기 치료 요법은 질병의 진행 정도에 따라서 질병을 치료하기 위해 투여된 약물을 변경하고 또는 약물 투여 횟수 및/또는 복용량을 변경하는 것에 의해 변경될 수 있다. 기준점 레벨과 비교하여 증가된 복합체의 레벨은 일반적으로 개체가 α-시누클레인 병리를 가지고 있거나 α-시누클레인 병리가 생기는 과정 중에 있는 것을 나타낸다. 상기 기준점 레벨은 일반적으로 α-시누클레인 병리를 가지고 있지 않은 것으로 알려진 개체("일반 개체")으로부터 추출된 샘플 또는 테스트된 동일한 개체로부터 추출된 이전 테스트 샘플로부터 산출될 수 있다.

상관관계는 CSF α-시누클레인 올리고머 레벨과 질병 중증도 사이에 존재하는 것으로 나타났다. 샘플 내 올리고머 또는 피브릴의 존재 및/또는 양을 검출하는 것은 예를 들어 파킨슨병 및 α-시누클레인 병리와 관련된 다른 질병에서 상기 항체를 바이오마커(biomarker)로 사용하는 것과 같은, 신경퇴행성 질환의 진행 및/또는 중증도를 추적하는 것에 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 항체는 개체가 파킨슨 병을 가지고 있는지 여부를 진단하는데 사용된다. CSF 샘플이 환자로부터 추출된다. 항체는 상기 항체와 샘플 내 존재하는 응집된 α-시누클레인 간 복합체 형성을 허용하는데 효과적인 조건 하에서 샘플과 접촉한다. 그리고 나서 상기 항체 복합체의 존재는 검출될 수 있다. 복합체의 양은 측정되고 기준 레벨과 비교될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 항체는 CFS 내 응집 α-시누클레인을 측정하기 위해 ELISA에서 사용될 수 있다. 상기 항체는 다른 항체를 사용한 ELISA와 비하여 높은 민감도와 특이도를 가진 샘플 내 응집 α-시누클레인을 측정하는 것에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 항체를 사용한 ELISA는 mAb 211를 포획항체(capture antibody)와 비오티닐화 211(biotinylated 211)을 검출항체(detection antibody)로 사용한 ELISA에 비하여 CSF 내 α-시누클레인 올리고머와 프로토피브릴을 검출하는 것에 있어 높은 민감도와 특이성을 가진다.

상기 방법은 수행분석결과를 이용하여 치료제의 효과를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 효과적인 치료제는 기준값과 비교하여 추출된 샘플 내에 존재하는 α-시누클레인 응집물의 양의 감소를 초래하는 것으로 결정될 수 있다. 상기 기준값은 치료 전 환자의 α-시누클레인의 양을 반영할 수 있거나, 치료되지 않은 환자 내에서 발견되는 α-시누클레인의 일반적인 양을 나타낼 수 있다.

상기 항체는 검출 가능한 라벨로 표식될 수 있다. 상기 라벨은 α-시누클레인 응집물에 결합되었을 때 상기 항체의 검출을 허용하는 것 중 하나일 수 있다. 상기 검출 가능한 라벨은 형광 라벨(fluorescent labels), 방사성 라벨(radioactive labels) 및 콘트라스트 촉진제(contrast agents)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 식별용 방사성 동위원소(radiolabels)는 F¹⁸, I¹²³, In¹¹¹, I¹³¹,C¹⁴, H³, Tc^99m, P³², I¹²⁵ 및 갈륨(gallium) 68과 같은 것을 포함한다. 적합한 형광 라벨은 플루오레세인(fluorescein) 및 로다민(rhodamine)을 포함할 수 있다. 적합한 콘트라스트 촉진제는 가돌리늄(gadolinium)(Gd), 디스프로슘(dysprosium) 및 철과 와 같은 회토류 이온(rare earth ions)과, 자기 에이전트(magnetic agents)를 포함한다. 다른 라벨은 핵자기공명활성라벨(nuclear magnetic resonance active labels), PET 스캐너에 의해 검출 가능한 양전자 방출 동위원소(positron emitting isotopes), 화학발광 표지(chemiluminescent markers) 및 효소 표지(enzymatic markers)를 포함한다.

상기 항체는 표준 기법에 의해 표식될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 항체는 이미징제(imaging agents)로 사용될 수 있다. 특히, 상기 항체는 인간과 동물 내 α-시누클레인 응집물의 검출 및 위치 측정 및/또는 정량 측정(quantitation)을 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 α-시누클레인 응집물에 대한 항체의 결합을 검출하는 것을 포함하는 α-시누클레인 응집물 이미징 방법을 제공한다.

일 실시예에서, 본 발명의 항체는 샘플과 접촉할 수 있고, 그리고 나서 α-시누클레인 응집물과 결합된 샘플 내 상기 항체는 검출될 수 있다. 상기 항체는 바람직하게 표지 항체이다. α-시누클레인 응집물의 유무는 임의의 적절한 영상 기술을 사용하여 생체 내 뇌 속에서 검출될 수 있다. 그러한 생체 내 방법에서, 상기 방법은 개체에게 상기 항체를 투여하고 상기 항체를 검출하는 것을 추가적으로 포함한다.

적합한 이미징 기법은 양전자 방사 단층촬영(portron emission tomography)(PET), 감마 신티그램촬영(gamma-scintigraphy), 자기공명영상(magnetic resonance imaging)(MRI), 기능성 자기공명영상(functional magnetic resonance imaging)(FMRI), 뇌자기도기록법(magnetoencephalography)(MEG) 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single photon emission computerized tomography)(SPECT)을 포함한다.

α-시누클레인 응집물의 유무는 예를 들어 뇌 부위와 같은 조직 샘플 내에서 생체 외에서 또한 검출될 수도 있다. 이러한 실시예에서, 적합한 이미징 기법은 전자현미경(electron microscopy), 다초점 현미경(confocal microscopy) 또는 광학 현미경(light microscopy)를 또한 포함할 수도 있다.

개체의 뇌에 존재하는 α-시누클레인 응집물의 개수 및/또는 크기는 α-시누클레인 관련 질병의 진행정도와 상관관계가 있다. α-시누클레인 응집물의 크기 또는 개수의 증가는 질병의 진행을 나타내는 반면, α-시누클레인 응집물의 크기 또는 개수의 감소는 질병의 퇴행을 나타낸다.

상기 진단방법은 또한 수의과용(veterinary use)일수도 있다.

본 발명은 또한 진단 방법을 수행하기 위해 본 발명에 따른 항체를 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 항체는 Fab,F(ab)2 또는 Fv 단편과 같은, 손상되지 않은 면역글로블린 분자 또는 그것의 단편일 수 있다. 상기 항체는 전술한 바와 같이 표식될 수 있다. 상기 키트는 개체가 신경퇴행성 질환을 가지고 있는지 여부를 결정하는 방법에 사용될 수 있다.

상기 키트는 임의의 방법이 수행되도록 가능하게 하는 하나 이상의 다른 시약 또는 기구를 추가적으로 포함할 수 있다. 그러한 시약 또는 기구는 적합한 완충제, 개체로부터 샘플을 획득하기 위한 수단, 양적 반응이 수행될 수 있게 하는 웰(wells)를 포함하는 보충제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 키트는 전술한 방법을 수행하기 위한 안내서를 선택적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 항체와 그것의 단편은 의약으로 사용될 수 있다.

본 발명은 개체의 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환의 치료에서 사용하기 위한 항체 또는 그것의 단편에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치료에 있어 효과적인 양의 항체 또는 그것의 단편을 개체에게 투여하는 것을 포함하는 개체의 α-시누클레인 병리와 관련된 신경퇴행성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머 병, 다운증후군, 다계통위축증, 정신질환, 정신분열증 또는 크로이츠펠트 야곱병을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 치매는 루이소체 치매일 수 있다.

α-시누클레인 응집은 항체 또는 그것의 단편을 투여함으로써 감소 또는 억제될 수 있다. 상기 항체는 가용성 시누클레인 종을 포함하는 샘플 또는 직접적으로 개체에게 투여될 수 있다.

상기 항체는 예를 들어 루이소체와 같은 α-시누클레인 응집물 디포짓(deposit) 위치에 직접적으로 투여될 수 있고, 일반적으로 뇌에 공급되는 혈관 내 또는 뇌에 직접적으로 주입될 수 있다.

개체는 사람 또는 사람 이외의 동물일 수 있다. 본 명세서에 서술된 조성물 및 방법은 또한 가축병원에서 사용될 수도 있다.

용어 "치료" 및 "치료하는" 및 그와 유사한 용어는 질환에서 발병의 치유, 완충, 역전, 완화, 관리 또는 지연을 포함하고, 또는 발병의 위험 또는 상태의 악화를 줄이는 것을 포함하는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한 병의 일시적인 처방(palliative), 예방을 위한 치료(prophylactic and preventative treatment)를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서, 의약조성물은 상기 항체 또는 그것의 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제(diluent) 또는 캐리어(carrier)를 포함한다.

일반적으로, 상기 캐리어의 특성은 사용되는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 조제 형태는 고형, 용액, 현탁액을 포함한다. 적합한 제약 담체(pharmaceutical carriers)는 불활성 희석제 또는 필러(fillers), 물 및 다양한 유기 용제를 포함한다. 조성물은 향료(flavourings), 바인더(binders) 및 첨가제(excipients)와 같은 추가적인 성분을 또한 포함할 수도 있다.

경구 투여에 적합한 제형은 정제(tablets), 캡슐제(capsules), 환제(pills), 파우더(powders), 서방성 제제(sustained release formulations), 용액과, 현탁액을 포함한다. 비경구투여(parenteral injection)를 위한 적합한 제형은 살균 용액(sterile solutions), 현탁액 또는 에멀젼(emulsions)을 포함한다.

예시적인 비경구 투여 제형은 살균 수용액 내 현탁액 또는 용액으로, 예를 들어 프로필렌 글리콜 수용액(aqueous propylene glycol) 또는 텍스트로오스 수용액(dextrose solutions)을 포함한다. 그러한 제형은 원하는 경우 적합하게 완충될 수 있다.

정제와 같은 예시적인 경구 제형은 녹말(starch), 알긴산(alginic acid) 및 복합 실리케이트(complex silicates)와 같은 붕괴제(disintegrants); 수크로오스(sucrose), 젤라틴(gelatin) 및 아카시아(acacia)와 같은 결합제(binding agents)와; 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 소듐라우릴설페이트(sodium lauryl sulfate) 및 활석(talc)와 같은 윤활제(lubricating agents)를 포함할 수 있다. 고형 조성물은 또한 연질 및 경질 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다. 바람직한 재료는 락토오스(lactose), 유당(milk sugar) 및 고분자 폴리에틸렌 글리콜(high molecular weight polyethylene glycols)를 포함한다.

다양한 약제학적 조성물을 제조하는 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있다. 'Remington's Pharmaceutical Sciences'가 참조되어 있다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 추가적인 치료제(therapeutic agents)와 결합한 항체 및 단편에 관한 것이다.

α-시누클레인 응집물에 특이적인 항체를 사용하는 것이 파킨슨병 및 다른 씨뉴클레이노패씨에 대한 새로운 병리학을 공개하는데 도움이 될 수 있다.

α-시누클레인 응집물에 특이적이고 α-시누클레인 모노머에 대해 낮은 결합력을 가지는 항체를 제공함으로서, 본 발명은 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환의 진행을 뒤따르기 위한 새로운 툴을 제공한다. 본 발명의 항체는 또한 α-시누클레인과 관련된 질병의 치료에 사용될 수 있는 항체를 제공한다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 예시로 설명될 것이다.
도 1a 및 도1b는 예시 1에 설명된 바와 같이 α-시누클레인 피브릴(숙주 19,22와, 23)과 α-시누클레인 올리고머(숙주 210,211 및 212)로 면역된 숙주의 역가 체크(titer chect)의 결과를 보여주는 도면
도 2는 예시 2에 설명된 바와 같이 α-시누클레인 응집물(피브릴(F), 올리고머(O) 및 모노머(M))에 대한 하이브리도마의 특이성을 스크리닝하기 위한 점블럿의 결과를 나타내는 도면
도 3a 내지 도 3c은 예시 4에 설명된 바와 같이 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4 항체와, 비교군으로 Syn-1 항체(BD Bioscience사)를 사용한 효소면역억제측정의 결과를 나타내는 도면
도 4는 예시 5(A)에 설명된 바와 같이 서로 다른 단백질로부터 형성된 아밀로이드 피브릴과 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4 항체와, Syn-1 항체의 교차반응의 결과를 나타내는 도면
도 5는 예시 5(B)에 설명된 바와 같이 β-, γ-시누클레인에 의해 형성된 아밀로이드 피브릴과 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4 항체와, Syn-1 항체의 교차반응을 나타내는 도면
도 6은 예시 5(C)에 설명된 바와 같이 α-시누클레인 펩티드 NAC(61-98), NAC(61-75) 및 절단된 α-시누클레인(1-122)에 의해 형성된 아밀로이드 피브릴과 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4 항체와, Syn-1 항체의 교차반응을 나타내는 도면
도 7a 내지 도 7d는 예시 6에 설명된 바와 같이 비아코어분석법을 사용한 mAb Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4와 mAb211(Santa Cruz Biotechnology사)에 대한 센서그램 결과를 보여주는 도면
도 8은 예시 7에 설명된 바와 같이 항원결정부 측정을 위한 점블럿에 의한 mAb Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4와, Syn-1 항체(비교군)에 대한 펩스캔분석 결과를 나타내는 도면
도 9a 내지 도 9f는 예시 7에서 설명된 바와 같이 ELISA에 의한 펩스캔 스크리닝 결과를 보여주는 도면. 플레이트는 본 발명의 단일클론 항체 A) Syn-F1, B) Syn-F2, C) Syn-O1, D) Syn-O2, E) Syn-O3와 F) Syn-O4, 또는 비교 항체 G) Syn 211, H) N-19, I) FL-140, J) Syn-1, K) 3B6 및 L) 5C2와 함께 검침되었다.
도 10은 예시 7에 설명된 바와 같이 펩스캔 ELISA의 플레이트 위에 배치된 X-ray 필름에 대한 플롯을 보여주는 도면. 비교 항체, N-19, FL-140, 5C2, Syn-1, Syn-211, 3B6에 대한 플롯은 도 10(A)에 보여진다. 본 발명의 항체, Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4에 대한 플롯은 도 10(B)에 보여진다.
도 11a 내지 도 11b는 예시 8에 설명된 바와 같이 α-시누클레인 응집물의 검출을 위한 샌드위치 ELISA의 결과를 보여주는 도면. 항체 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4와, Syn-1 항체가 포획 항체로 사용되었다. FL-140은 검출 항체로 사용되었다.
도 12는 예시 9에 설명된 바와 같이 인산화 Ser129-α-시누클레인 응집물의 검출을 위한 샌드위치 ELISA의 결과를 보여주는 도면. 항체 Syn-O2 및 Syn-F2와, Syn-1이 포획 항체로 사용되었고 rabbit anti-p-S129-α-시누클레인이 검출 항체로 사용되었다.
도 13은 예시 10에 설명된 바와 같이 파킨슨병이 없는 대상으로부터의 비교예로부터의 조직의 면역조직화학 분석을 보여주는 도면
도 14는 예시 10에 설명된 바와 같이 파킨슨병 케이스로부터의 조직의 면역조직화학 분석을 보여주는 도면
도 15는 예시 10에 설명된 바와 같이 다계통 위축증 케이스로부터의 조직의 면역조직화학 분석을 보여주는 도면
도 16은 예시 11에 설명된 바와 같이 파킨 캐리어 파킨슨병 환자(A), 진행중인 루이소체 치매 환자(B)와 전형적인 파킨슨병 환자로부터의 조직 샘플 내 Syn-O2 염색결과를 보여주는 도면
도 17은 예시 12에 설명된 바와 같이 해마의 CA2 부위(A), 내후각피질 신경돌기(B)로부터의 뇌 섹션의 처리의 Syn-F2 항체의 염색결과를 보여주는 도면. 상기 섹션은 다음의 처리가 수행되었다: 1) 사전 처리 없음, 2) 구연산염 완충제 내에서 10분 동안 120°C에서 고압살균, 3) 포름산 내에서 15분 또는 4) 20㎍/ml 프로테이나아제 K 처리. 5) Syn-1 항체와 함께 비교군은 15분 동안 포름산과 함께 처리된 조직 샘플 상에서 수행되었다.
도 18a 내지 도 18b는 예시 14에 설명된 바와 같이 BiFC 형상분석법에 의한 점대형(화살촉)을 보여주는 것을 보여주는 이미지에 대한 도면
도 19는 예시 14에 설명된 바와 같이 각각의 테스트된 항체의 점 양성 세포의 %를 보여주는 도면
도 20은 인간 α-시누클레인의 야생형 서열을 보여주는 도면

예시

다음의 예시는 설명을 위한 것이며 하기 특정 예시에 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

예시 1

α-시누클레인 응집물 항체의 준비

α- 시누클레인 피브릴의 준비

정제된 재조합 α-시누클레인이 사용되었다. 갓 준비된 α-시누클레인(50μM) 용액이 응집을 위해 7일 동안 써모믹서(thermomixer)(800 rpm) 내에서 37°C 온도에서 배양되었다. α-시누클레인의 응집 과정은 티오플라빈-S(Thioflavin-S)(Th-S) 결합 분석에 의해 모니터링되었다. 응집이 완료되고 나서, 상기 피브릴이 작은 샘플 내로 정제되었고 사용될 때까지 -80°C 온도에서 저장되었다.

α- 시누클레인 올리고머의 준비

갓 준비된 α-시누클레인 용액이 1:7 몰비(molar ration)(α-시누클레인: 도파민)로 도파민(dopamine)과 혼합되었고 하룻밤 동안 써모믹서(800 rpm) 내에서 37°C 온도에서 배양되었다. 다음날 올리고머를 함유하는 용액이 작은 샘플 내로 정제되었고 사용될 때까지 -80°C 온도에서 저장되었다.

면역조치

Balb/c 암컷 쥐가 α-시누클레인으로 피하 예방 접종(sub-cutaneous immunization)에 사용되었다. 각각의 쥐는 Freunds Complete Adjuvant와 혼합된 α-시누클레인 용액(1:1 v/v)의 50㎍의 초기 접종 뒤에 3주 간격을 두어 Freunds Incompletet Adjuvant와 혼합된 α-시누클레인 용액(1:1 v/v)의 25㎍의 재접종을 받았다. 각각의 재접종의 10일째 되는날, 꼬리 혈관으로부터 혈액이 수집되었고 혈청(serum)이 분리되었다. ELISA가 α-시누클레인에 대한 숙주의 면역반응을 체크하기 위해 수행되었다.

숙주의 면역반응을 체크하기 위한 ELISA

96 well clear maxisorp plate(NUNC)가 하룻밤 배양을 위해 인산완충식염수(PBS) 내에서 한 well 당(per well) 100㎕(70ng/well)로 코팅되었다. 상기 플레이트는 그 이후 PBST(0.05% Tween-20을 함유하는 PBS)로 세 번 세척되었고, 그 이후 실온에서 1 시간 동안 블로킹 완충액(blocking buffer)(2.25% gelatin을 함유하는 PBST)로 배양되었다. 상기 플레이트는 PBST로 세 번 세척되었고 쥐의 연속적으로 희석된 항혈청(diluted antiserum)(10번의 희석으로 1/100로 희석)의 100㎕가 각각 두 개씩 상기 well에 첨가되었고 상기 플레이트는 1시간 동안 실온에서 배양되었다. 상기 플레이트가 PBST로 세척된 이후, 1:2000 희석된 goat anti-mouse IgG-HRP(well 당 100㎕, Jackson Immunoresearch)가 각각의 well에 첨가되었고 실온에서 1시간 배양되었다. 그리고 나서 상기 플레이트는 PBST로 세 번 세척되었고 색깔이 나타날 때까지 TMB 기질(substrate)(KPL사, Gaitherburg, 미국) 100㎕로 배양되었다. 상기 반응은 H₂SO₄(0.6N, well 당 100㎕)를 첨가하여 중지되었고, 450 nm에서 흡광도값(absorbance values)은 Victor X3 마이크로타이터 플레이트 리더(microtiter plate reader)를 사용하여 측정되었다. 양호한 면역반응을 보인 숙주는 융합을 위해 추출되었다.

α-시누클레인 피브릴로 면역주사를 맞은 숙주(숙주 19,22와, 23) 및 α-시누클레인 올리고머로 면역주사를 맞은 숙주(숙주 210,211 및 212)에 대한 역가가 수행되었고 결과는 도 1a 내지 도 1b 및 표 3에서 볼 수 있다. 상기 숙주는 이전의 반응에 비하여 역가의 값이 절반 이하로 떨어진 때 융합을 위해 추출되었다.

면역원	숙주 ID (Host ID)	제 1 재접종 역가(1st Booster titer)	제 1 전-결합 역가(1st Pre-fusion titer)	제 2 전-결합 역가(2nd Pre-fusion titer)	제 3 전-결합 역가(3rd Pre-fusion titer)
α-시누클레인 피브릴	19	8871	13461	6061	1923
	22	4924	8543	1939	475
	23	10514	11402	7905	1595
α-시누클레인 올리고머	210	430	2138	1059	614
	211	578	1608	1205	604
	212	155	1522	891	339

α-시누클레인 피브릴로 면역된 쥐는 제 1 재접종 이후 즉시 매우 높은 역가를 보였다. 따라서 상기 숙주에 추가적인 재접종을 하지 않았다. α-시누클레인 올리고머로 면역된 쥐는 제 2 재접종 이후 만족할만한 반응을 보였다. 쥐를 결합을 위해 가져가기 전에, 전-결합 역가(1개월 휴식 이후)가 수행되었다. 몇몇 숙주는 α-시누클레인 응집물의 높은 면역원성 때문에 2달의 휴식 이후에도 높은 역가를 보였다.

지라세포(splenocytes)와 Sp2 /O 골수세포( myeloma cells)의 결합

이전의 실험에서의 쥐는 PBS 내에서 초기 투여량의 3배의 마지막 복강 내 면역예방주사(intra-peritoneal immmunization)을 주입받았다. 3일 후, 쥐는 죽었다. 비장은 무균성으로 분리되었고 IMDM(Gibco) 내에서 세척되었다. 지라세포는 추출되었고, 계산되었으며 50% PEG 4000(Merck)을 사용하는 Sp2/O 골수세포와 융합되었다. 상기 융합 세포는 HAT(1X, Sigma)와 대식세포(macrophages), 6 X 10⁵ 세포/플레이트(5-6주된 Balb/c 쥐로부터 갓 분리된)로 보충된 IMDM 증식 배지(growth media)(2mM glutamax)(Gibco), 1X penstrep(100U/ml penicillin과 100㎍/ml streptomycin; Sigma), 50㎍/ml Gentamycin(Sigma), 50μM 2-mercaptoethanol(Sigma)와 20% fetal bovine serum(Hyclone)을 함유하는 IMDM 내에서 재현탁되었다. 상기 세포는 96-well tissue culture plates(Nunc) 내에 놓여졌고 5% CO₂와 37°C에서 증식되었다. 배양 일주일 후, 상기 플레이트로의 배지는 HT(1X, Sigma)로 보충된 갓 준비된 IMDM 증식배지로 변경되었다. 하이브리도마(hybridomas)는 배지 색깔이 노란색으로 바뀔 때까지 증식되었다. 배양 상층액(culture supernatant)은 양성클론(positive clones)의 스크리닝을 위해 사용되었다.

양성클론의 스크리닝

96 well clear maxisorp plate(Nunc)는 PBS 내 α-시누클레인 피브릴 또는 올리고머 중 하나의 well 당 100㎕(70ng/well)로 하룻밤 배양에 의해 코팅되었다. 상기 플레이트는 그 이후 PBST(0.05% Tween-20을 함유하는 PBS)로 세 번 세척되었고, 블로킹 완충액(0.05% Tween-20을 함유하는 PBST)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 그리고 상기 플레이트는 융합 플레이트부터의 100㎕/well 배양 상층액을 첨가하기 전에 PBST로 세척된다. 상기 플레이트는 1시간 동안 실온에서 배양되었다. 상기 플레이트가 PBST로 세 번 세척된 이후, 1:20000 희석된 goat anti-mouse IgG-HRP(well 당 100㎕, Jackson Immunoresearch)가 각각의 well에 첨가되고 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 상기 플레이트는 그 이후 PBST로 세척되고 색깔이 나타날 내까지 TMB substrate(KPL, Gaitherburg, 미국)의 100㎕로 배양되었다. 상기 반응은 100㎕ H₂SO₄(0.6N)을 첨가하여 중지되었고, 450nm에서의 흡광도는 Victor³ 1420 multilabel microtiter plate reader를 이용하여 측정되었다. 상기 양성 클론은 24 well plate에 이송되고 안정적인 클론을 식별하기 위해 다시 스크리닝되었다.

총 1100 양성 클론이 첫 번째 스크리닝에 의해 얻어졌고 57 양성 클론(α-시누클레인 피브릴로 면역된 쥐로부터), 43 클론(α-시누클레인 올리고머로 면역된 쥐로부터)가 추가적인 특성화를 위해 선택되었다. 상기 양성 클론의 아이소타입(isotype)은 이형판별 키트(isotyping kit)(Sigma)를 이용하여 식별되었다. IgG 클론이 선택되었고, 안정적인 클론을 식별하기 위해 수차례 계대되었고 단일 세포 클로닝을 위해 사용되었다.

이형판별( Isotyping )

96 well clear maxisorp plate(Nurc)는 pH 7.4의 PBS 내에서 1/1000 희석된 anti-mouse heavy chain antibodies(Sigma, 이형판별 키트(isotyping kit))의 100㎕/well과 함께 4°C에서 하룻밤 배양에 의해 코팅되었다. 그리고 나서 상기 플레이트는 PBST(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)와 함께 3번 세척되었고, 실온에서 한 시간 동안 블로킹 완충액(2.5% gelatin 및 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS; 한 well당 400㎕)와 함께 배양되었다. 그리고 나서 상기 플레이트는 PBST와 함께 세 번 세척되었고, 각각의 클론으로부터의 배양상층액의 100㎕가 well에 첨가되었다. 상기 플레이트는 1시간 동안 실온에서 배양되었고, 상기 플레이트가 PBST와 함께 세척된 이후, 1:20000 희석된 goat anti-mouse IgG-HRP(100㎕/well)가 각각의 well에 첨가되었고 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 그리고 나서 상기 플레이트는 PBST와 함께 세척되었고 색깔이 발현될 때까지 TMB substrate(KPL, Gaitherburg, 미국)의 100㎕/well과 함께 배양되었다. 상기 반응은 H₂SO₄(0.6N)의 100㎕/well을 첨가함으로써 중지되었고, 450nm에서의 흡광도는 Victor³ 1420 multilabel microtiter plate reader에 의해 측정되었다. 상기 IgG 양성클론은 T-25 flask에 이송되었고 단일세포클로닝을 위해 사용되었다. α-시누클레인 피브릴 또는 올리고머로 면역화된 쥐로부터 얻어진 클론의 아이소타입은 표4에 나타난다.

α- 시누클레인 피브릴로 면역화된 쥐로부터 얻어진 클론		α- 시누클레인 올리고머로 면역화된 쥐로부터 얻어진 클론
클론명	아이소타입	클론명	아이소타입
Syn-F1	IgG1	Syn-O1	IgG2b
Syn-F2	IgG2a	Syn-O2	IgG1
Syn-F3	IgG2a	Syn-O3	IgG1
Syn-F4	IgG1	Syn-O4	IgG1
Syn-F5	IgG	Syn-O5	IgG1
Syn-F6	IgG2b	Syn-O6	IgG1
		Syn-O7	IgG1
		Syn-O8	IgG1

식별되고 선택된 100개의 클론부터부터, 33개의 부모형 클론(parental clones)이 IgG 아이소타입인 것으로 밝혀졌다. 나머지 클론은 IgG 또는 IgG와 IgM 아이소타입의 혼합 중 하나이다. 상기 IgM 또는 혼합된 아이소타입 클론은 냉동되었고 추가적인 특성화가 수행되지 않았다. 상기 IgG 클론은 적어도 3회 계대되고 14개의 안정적인 클론이 선택되었다. 10개의 클론이 IgG1인 것으로 밝혀졌고, 2개의 클론이 IgG2a 및 2개는 IgG2b 타입인 것으로 밝혀졌다.

단일세포 클로닝

세포는 양성 하이브리도마 클론의 T-25 flask로부터 수집되었다. 상기 세포는 계산되었고, IMDM 내에서 희석되었으며 100개의 세포가 추출되었고 20ml의 증식배지에 첨가되었다. 증식배지는 glutamax(2mM, Gibco), Penstrep(Sigma), 50㎍/ml Gentamycin(Sigma), 50μM beta-ME(Sigma), 20% 소태아혈청(Hyclone) 및 어린 BALB/c로부터 갓 분리된 macrophages(6000 세포/well)로 보충된 IMDM(Gibco)이었다. 상기 세포는 혼합되었고 96 well tissue culture plate 내에 놓여졌다(200㎕/well). 상기 플레이트는 37°C, 5% CO₂에서 배양되었다. 그것들이 융합할 때까지 상기 하이브리도마는 성장하였으며, 단일세포를 함유하는 well은 표식되었다. 상기 단일 콜로니(single colony)를 보여주는 well로부터의 배양상층액은 ELISA에 의한 스크리닝을 위해 추출되었으며 양성 well로부터의 세포는 24 well plate로 운반되었고, T-25 flask로 운반되기 전에 다시 한 번 스크리닝되었다. 상기 T-25 flask로부터의 배양상층액은 안정적인 클론을 선택하기 위해 적어도 세 번 스크리닝되었다.

개별 클론으로부터 얻어진 단일세포클론은 24 well plate에 운반되었고, 안정성을 위해 추가적으로 체크되었다. 각각의 부모형 클론으로부터의 적어도 2개의 단일세포 클론이 추가적인 특성화를 위해 T-25 flask에 운반되었다.

예시 2

점블럿검정(Dot Blot)에 의해 α-시누클레인 응집에 대한 하이브리도마의 특이성 선별

α-시누클레인 피브릴(F), 올리고머(O) 또는 모노머(O)의 50 ng(PBS 내 5㎕)가 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane) 상에 놓여졌고 30분동안 실온에서 건조되었다. 상기 막은 실온에서 1시간 동안 PBST(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS) 내에서 5% 탈지우유(skimmed milk)와 함께 차단되었다. 그 이후 상기 막은 PBST 내에서 1:1로 희석된 배양상층액과 함께 탐침하기 전에 PBST와 함께 3번 세척되었고 실온에서 2시간 동안 배양되었다. Syn-1 항체는 대조군으로 사용되었다. 상기 막이 PBST로 세척된 이후, 1:20000 비율로 희석된 염소 항마우스 IgG-HRP가 첨가되었고 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 그리고 나서 상기 막은 PBST로 세척된 후 PBS에 의한 2번 세척되었다. 상기 막은 Super signal West pico Chemiluminescent substrate(Pierce)와 함께 성장하였다.

점블럿의 나머지는 도 2에 도시되어 있다. 점블럿검정에 의해 테스트된 278개의 클론 중, 45개의 클론이 안정적인 것으로 밝혀졌고 그 중에서 14개의 클론이 α-시누클레인 응집물에 특이적이었다.

예시 3

단일 클론 항체의 대량 배양 및 정제

α-시누클레인 응집물에 특이적인 것으로 확인된 6개의 클론이 대량 배양을 위해 추출되었다. 상기 클론은 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4이다. 증식 배지는 2mM glutamax(Gibco), Penstrep(Sigma), 50㎍/ml Gentamycin(Sigma) 및 50μM beta-ME(Sigma)로 보충된 CDM4mAb(Hyclone)이었다. 상기 세포가 융합되고 배지 색깔이 노란색으로 변하면, 배양상층액이 수집되고 사용될 때까지 -20°온도에서 저장되었다. 단일클론 항체는 Protein G-Agarose affinity chromatography를 이용하여 배양상층액으로부터 정제되었다. 단백질 G-Agarose column이 준비되었고 pH 7.2의 20mM 인산완충액(Phosphate buffer)의 20 흡착제부피(bed volumes)와 함께 평형화되었다. 상기 배양상층액(200ml)은 4°C에서 10분동안 1500rpm에서 원심분리되었다. 상기 배양상층액은 수집되었고 유량 ~1㎖/분으로 유지한 채 5-6회 상기 컬럼을 통과하였다. 그리고 나서 상기 컬럼은 단백질 제거를 위해 p.H 7.2의 20mM 인산완충제의 15 흡착제부피로 세척되었다. 결합된 항체는 용출완충액(elution buffer)(50mM Glycine pH 2.5)을 사용하여 500㎕로서 50㎕ 중성완충액(neutralization buffer)(1M Tris pH 8.0)을 함유하는 1.5 ml 원심분리 튜브로 용출되었다. 정제된 항체는 마지막으로 PBS에 거슬러져 투석되었다. 서로 다른 배치(batch)로부터 정제된 단일클론 항체는 함께 모아졌고 농도는 BCA assay에 의해 측정되었다. 상기 단일클론 항체는 동결건조되었고 사용될 때까지 -20°C에서 100㎍ 부분표본으로 저장되었다.

예시 4

정제된 항체의 특성화

효소면역억제측정(Inhibition ELISA)

384 well black maxisorp plate(NUNC)가 pH 7.4의 PBS 내에서 α-시누클레인 피브릴의 well 당 50㎕(1.4㎍/ml)과 함께 4°C에서 하룻밤 배양되었다. 상기 플레이트는 PBST(0.05% Tween의 PBS)로 4번 세척되었고 블로킹 완충액(0.05% Tween을 가진 PBS 내 2.25% gelatin)와 함께 실온에서 한 시간동안 차단되었다. 0.6 ml의 실리콘으로 처리된 튜브들(siliconized tubes)에서 α-시누클레인 피브릴, 올리고머 또는 모노머의 연속적인 이중 희석이 블로킹 완충액(18번의 연속적인 이중희석으로 이어진 80μM에서 시작) 내에서 실행되었다. 각각의 튜브에, 비교예로서 사용된 상기 정제된 단일클론 항체(Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3, Syn-O4) 또는 Syn-1(BD Bioscience)의 균등한 체적의 20ng/ml가 최종 농도 10ng/ml를 수득하기 위해 통제집단으로 사용되기 위해 첨가되었고, 실온에서 2.5시간 동안 혼합하여 튜브를 배양하였다. 그리고 나서 전배양용액은 ELISA 플레이트에 첨가되었고, 실온에서 10분 동안 배양되었다. PBST로 상기 플레이트를 4번 세척한 이후, 1/15000로 희석된 goat anti-mouse IgG-HRP conjugate(Dako)가 첨가되었고 상기 플레이트는 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 상기 플레이트는 PBST로 세척되었고 50 ㎕의 기질(SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Scientific)이 첨가되었고 즉시 Victor X3 microtiter plate reader에 의해 읽혀졌다. x축의 α-시누클레인 농도와 y축의 CPS 값의 로그 희석(log dilution)을 수행함으로써, 그래프가 그려졌다.

효소면역 억제측정에 의해 mAb의 결합친화력의 비교에 대한 결과는 도 3a 내지 도 3c와 표 5에서 알 수 있다.

mAbs	IC 50( μM ) 피브릴	IC 50( μM ) 모노머	피브릴에 접힘친화성(fold affinity)
Syn-F1	0.00012	2.083	16558
Syn-F2	0.00118	3.707	3141
Syn-O1	0.00037	4.793	12737
Syn-O2	0.00012	3.283	27312
Syn-O3	0.00047	5.329	11129
Syn-O4	0.00052	3.605	6932
Syn-1	0.00210	0.001	0.476

모든 단일클론 항체, Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4는 α-시누클레인 피브릴에 대해 특이성이 있는 것으로 밝혀졌다

예시 5

항체의 교차반응 시험- 점블럿

A) 다양한 아밀로이드 단백질 및 펩티드의 서로 다른 단백질 50 ng(5㎕ PBS 내, PH 7.4)에 의해 형성된 아밀로이드 피브릴과의 교차반응을 시험하기 위해, α-시누클레인, Tau, A-beta, IAPP와 ABri의 피브릴(F)과 모노머(M)가 니트로셀룰로오스막 위에 놓여졌고 30분 동안 실온에서 건조되었다. 상기 막은 PBST(0.05% Tween을 함유하는 PBS) 내에서 5% 탈지우유와 함께 차단되었고 실온에서 1시간동안 배양되었다. PBST로 상기 막을 3번 세척한 이후, 상기 막은 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3, Syn-O4인 단일클론 항체, 또는 α-시누클레인에 대한 Syn-1(BD Bioscience), Tau에 대한 5E2(Harvard Medical School의 Dr.D.Walsh의 기증), A-beta에 대한 82E1(IBL), IAPP에 대한 R10/99(Santa Cruz Biotechnology)와 Abri에 대한 anti-ABri antiserum의 비교항체(control antibodies)와 함께 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 상기 막은 세척되었고 1/20000로 희석된 goat anti-mouse IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch) 또는 1/10000로 희석된 goat anti-mouse IgG-HRP(Jackson Immunoresearch) 중 하나와 함께 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 그리고 나서 상기 블럿은 Super signal West Pico chemiluminescent substrate과 함께 성장되었다.

서로 다른 단백질로부터 형성된 아밀로이드 피브릴과의 교차반응의 결과는 도 4에서 볼 수 있다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 α-시누클레인 아밀로이드 피브릴에 특이성이 있는 것으로 밝혀졌고 다른 아밀로이드 피브릴 또는 모노머와 교차반응 하지 않았다.

B) 본 발명의 입체적 단일클론 항체(conformational monoclonal antibodies)의 β- 및 γ-시누클레인에 의해 형성된 아밀로이드 피브릴에 대한 교차반응을 시험하기 위하여, α-, β- 및 γ-시누클레인의 50ng 피브릴(F) 및 모노머(M)가 니트로셀룰로오스막 상에 놓였다. 상기 막은 PBST 내에서 5% 탈지우유와 함께 1시간 동안 차단되었고 그리고 나서 본 발명의 단일클론 항체(Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-o3, Syn-O4), 또는 α-시누클레인에 대한 Syn-1(BD Bioscience), 베타-시누클레인에 대한 안티-베타 시누클레인(Santa Cruz Biotechnology) 및 감마-시누클레인에 대한 C-20(Santa Cruz Biotechnology)의 비교항체와 실온에서 두 시간 동안 검침되었다. 상기 막은 세척되었고 1/20000으로 희석된 goat anti-mouse IgG-HRP conjugate(Jackson Immunoresearch) 또는 1/300000으로 희석된 chicken anti-goat IgG-HRP conjugate(Santa Cruz Biotechnology)와 함께 실온에서 한시간 동안 배양되었다. 상기 블럿은 super signal West Pico chemiluminescent subsstrate와 함께 성장하였다.

β-시누클레인 또는 γ-시누클레인에 의해 형성된 아밀로이드 피브릴과의 교차반응의 결과는 도 5에서 볼 수 있다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 α-시누클레인 피브릴에 특이성이 있는 것으로 발견되었고 상기 피브릴 또는 모노머 형태(monomeric form)의 β- 또는 γ-시누클레인의 어느 하나에는 반응하지 않았다.

C) 본 발명의 입체형태 단일클론 항체의 α-시누클레인 단편에 대한 교차반응을 시험하기 위하여, 전체길이 α-시누클레인(1-140)으로부터의 피브릴(F) 및 모노머(M)와 펩티드 단편의 50ng, α-시누클레인(1-122), NAC(61-95) 및 NAC(61-78)가 니트로셀룰로오스막 위에 놓여졌다. 상기 막은 PBST 내에서 5% 탈지우유와 함께 1시간 동안 차단되었고 상기 단일클론항체(Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3, Syn-O4) 와, α-시누클레인에 대한 Syn-1(BD Bioscience)와, 5C2(Santa Cruz Biotechnology)의 비교 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 검침되었다. 상기 막은 1/20000로 희석된 goat anti-mouse IgG-HRP conjugate(Jackson Immunoresearch) 또는 1/300000 희석된 chicken anti-goat IgG-HRP conjugate(Santa Cruz Biotechnology) 중 하나와 함께 실온에서 1시간 동안 배양되기 전에 세척되었다. 그리고 나서 상기 블럿은 Super signal West Pico chemiluminescent substrate와 함께 성장되었다.

서로 다른 α-시누클레인 단편으로부터 형성된 아밀로이드 피브릴과의 교차반응 결과는 도 6에서 볼 수 있다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 절단된(truncated) α-시누클레인(1-122), NAC 부위(61-95) 또는 NAC(61-78) 중 어느 것에 의해 형성된 아밀로이드 피브릴과 반응하지 않았으며 오직 상기 전체길이 α-시누클레인(1-140)에 의해 형성된 상기 피브릴에만 반응하였는데, 이는 α-시누클레인의 C-말단영역(C-terminal region) 내에 있을 수 있음을 시사한다. 우리 mAb의 α-시누클레인 모노머에 대한 비반응성은 우리의 mAb에 의해 인식되는 항원결정부가 입체형태 특이성이 있을 수 있음을 시사한다.

예시 6

열반응 상수(kinetic constants)의 결정

비아코어 분석법( Biacore analysis)

우리의 mAb와 -시누클레인 피브릴 간의 상호작용에 대한 열반응 상수는 BIAcore X 100 기구를 사용한 표면 플라스민 공진측정(surface plasmin resonance measurements)에 의해 결정된다. 알파-시누클레인은 pH 4.5의 10mM 초산나트륨 완충제(Sodium acetate buffer) 내에서 120㎍/ml의 -시누클레인 피브릴의 35㎕를 주입하여 N-하이드록시 석신이미드(N-hydroxy succinimide)(NHS)와 N-에틸-N(N ethyl-N)(디메틸아미노프로필)(dimethylaminopropyl) 카르보디이미드(carbodiimide)(EDC)와 함께 활성화된 CM5 sensor chip에 고정되었다. 연관비율상수(the association rate constant)는 유량 10㎕/분으로 HBS 전기영동용 완충용액(running buffer)(10mM HEPES, 0.15m NaCl, 3.4 mM EDTA 및 0.005% surfactant P20; pH 7.4) 내에서 0.01에서 10 nM의 상기 mAb들(Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3, Syn-O4) 및 mAb 211(Santa Cruz Biotechnology))의 8가지 다른 농도를 주입하여 얻어졌다. 해리속도(the dissociation rate)는 40㎕/분의 유량으로 측정되었다. 상기 센서 칩은 100mM NaHCo₃ pH 9.6을 사용하여 재생되었다. 센서그램(Sensorgrams)은 BOA evaluation software를 사용하여 해석되었다.

비아코어 분석에 의한 mAb들의 비교를 보여주는 결과는 도 7a 내지 도 7d 및 표 6에서 볼 수 있다. 10^- ⁸ 보다 작은 해리 상수 Kd를 가지는 단일클론 항체가 발견되었다. mAb Syn-O1은 KD 15.9 pM의 가장 높은 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 6개의 mAb들 중 가장 낮은 친화도는 2.6 nM의 Syn-F2인 것으로 밝혀졌다.

mAb	ka (1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)
Syn-F1	1.230E+7	0.001564	1.272E-10
Syn-F2	1.256E+6	0.003377	2.688E-9
Syn-O1	5.857E+6	9.360E-5	1.598E-11
Syn-O2	1.314E+7	0.001274	9.694E-11
Syn-O3	2.217+6	3.789E-4	1.709E-10
Syn-O4	7.236E+6	9.964E-4	1.377E-10
mAb 211	1.648E+5	4.220E-4	2.560E-9

예시7

mAb들에 대한 항원결정부맵핑 ( Epitope mapping)

본 발명의 mAb가 선형 또는 입체적 항원결정부를 검지하는지 여부를 알아내기 위하여, 항체의 친화도가 α-시누클레인 서열을 포함하는 펩티드 라이브러리(peptide library)에 대해 테스트되었다. 인간 α-시누클레인을 포함하는, 7개의 아미노산 오버랩을 가진, 14개의 아미노산 길이의 펩티드(표 7 참조)가 합성되었다(Shanghai Hanhong Chemical Co., 중국). 상기 펩티드는 최종 농도 1mg/ml를 주기 위해서 가압 멸균된 물 또는 DMSO 중 하나 내에서 용해되었다.

펩티드 번호	서열 번호	펩티드 서열
1	1-14	H-MDVFMKGLSKAKEG-OH
2	8-21	H-LSKAKEGVVAAAEK-OH
3	15-28	H-VVAAAEKTKQGVAE-OH
4	22-35	H-TKEQVAEAAGKTKE-OH
5	29-42	H-AAGKTKEGVLYVGS-OH
6	36-49	H-GVLYVGSKTKEGVV-OH
7	43-56	H-KTKEGVVHGVATVA-OH
8	50-63	H-HGVATVAEKTKEQV-OH
9	57-70	H-EKTKEQVTNVGGAV-OH
10	64-77	H-TNVGGAVVTGVTAV-OH
11	71-84	H-VTGVTAVAQKTVEG-OH
12	78-91	H-AQKTVEGAVSIAAA-OH
13	85-98	H-AGSIAAATGFVKKD-OH
14	92-105	H-TGFVKKDQLGKNEE-OH
15	99-112	H-QLGKNEEGAPQEGI-OH
16	106-119	H-GAPQEGILEDMPVD-OH
17	113-126	H-LEDMPVDPDNEAYE-OH
18	120-133	H-PDNEAYEMPSEEGY-OH
19	127-140	H-MPSEEGYQDYEPEA-OH

점블럿에 의한 펩스캔분석 ( Pepscan )

니트로셀룰로오스막이 실온에서 10분 동안 0.1% EDC(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필](1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] 카르보디이미드 염산염(carbodiimide hydrochloride))와 함께 PBS 내에서 전처리되었고 공기건조되었다. 펩티드 1-19(α-시누클레인 펩티드 라이브러리, 표5)의 200ng(pH 7.4의 5㎕ PBS 내)와 α-시누클레인 피브릴(스팟 20)의 50ng가 상기 막 위에 놓여졌다. 공기 건조 이후, 상기 막은 PBST 내에서 5% 탈지우유와 함께 차단되었고 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 상기 막은 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3, Syn-O4 또는 Syn-1 단일클론 항체와 함께 배양되기 전에 PBST로 세 번 세척되었고 실온에서 2시간 동안 배양되었다. 상기 막은 PBST로 세척되었고 1:20000로 희석된(PBST 내) goat anti-mouse IgG-HRP(Jackson immunoResearch사)와 함께 배양되었다. 상기 블럿은 Super signal West Pico chemiluminescent substrate(Thermo Scientific)를 사용하여 성장되었다. 상기 펩스캔분석의 결과는 도 8에서 볼 수 있다.

점블럿을 이용한 펩스캔 결과는 mAb, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3, Syn-O4, Syn-F1, 또는 Syn-F2가 선형 항원결정부를 인식하는 않는다는 것을 시사한다.

ELISA에 의한 펩스캔분석 ( Pepscan )

점블럿을 사용하여 펩스캔분석결과를 확인하기 위해, 상기 mAb들이 ELISA를 사용한 펩스캔분석에 의해 또한 테스트되었다. 384 well black maxisorp plate(NUNC)가 pH 9.6의 0.2M NaHCO₃ 내에 50㎕(500ng/well)의 펩티드(표 5에 구체적으로 표시된 α-시누클레인 펩티드 1-19) 및 pH 7.4의 PBS 내의 50㎕(100ng/well) α-시누클레인 피브릴과 함께 완전 건조를 할 수 있도록 37°C에서 하룻밤 배양에 의해 코팅되었다. 상기 플레이트는 PBST로 세 번 세척되었으며 블로킹 완충액(PBST 내의 2.25% gelatin) 100㎕와 함께 실온에서 한 시간동안 차단되었다. PBST로 세 번 세척한 이후, 상기 mAb들(Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4)의 50㎕(100ng/ml)과, Syn-1(Mouse anti-α-시누클레인; BD Bioscience)의 비교 항체 50㎕(100ng/ml), N-19의 50㎕(100ng/ml)(Goat anti-α-시누클레인;Santa Cruz Biotechnology), 211(Mouse anti-α-시누클레인; Santa Cruz Biotechnology) 50㎍(100ng/ml), FL-140(Rabbit anti-α-시누클레인; Santa Cruz Biotechnology) 50㎕(200ng/ml), 5C2(Mouse anti-α-시누클레인; Santa Cruz Biotechnology) 50㎕(1㎍/ml) 및 3B6(Mouse anti-α/β-시누클레인; Santa Cruz Biotechnology) 50㎕(1㎍/ml)가 첨가되었고 실온에서 한시간 동안 배양되었다. 상기 플레이트는 PBST로 세c척되었고 goat anti-mouse IgG-HRP conjugate(1/20000; Jackson ImmunoResearch) 또한 goat anti-rabbit IgG-HRP(1/5000; Jackson Immunoresearch) conjugate 또는 희석된 chicken anti-goat IgG-HRP conjugate(1/20000) 중 하나가 첨가되었고 상기 플레이트를 실온에서 한시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트는 PBST로 세척되었고 기질(SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate, Thermo Scientific) 50㎕가 첨가되었고 즉시 Victor X3 마이크로 타이터 플레이트 리더(microtiter plate reader)를 사용하여 읽혀졌다. ELISA 신호가 측정된 이후, 상기 플레이트는 스팟을 현상시키기 위해 또한 X-ray 필름 상에 노출되었다.

ELISA를 이용한 펩스캔 스크리닝의 결과는 도 9a 내지 도 9f 및 도 10에서 볼 수 있다(비교 항체, A, 본 발명의 항체, B). ELISA에 의한 상기 펩스캔분석방법은 또한 상기 항체는 어느 펩티드에도 반응하지 않고 입체적 항원결정부를 형성하는 것에 있어 C-말단영역의 관여를 제시하는 C-말단 펩티드(127-140)과 함께 약간 반응한 것을 보여주었다.

예시 8

알파-시누클레인 응집물을 검출하기 위한 샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA)

384 well ELISA black microplate(Nunc Maxisorp, NUNC, 덴마크)는 pH 9.6의 200mM NaHCO₃ 내에서 본 발명의 입체적 단일클론 항체(Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 또는 Syn-O4)(50㎕/well) 중 하나의 단일클론 항체 0.1㎍/ml와 함께 4°C 내에서 하룻밤 배양에 의해 코팅되었다.

상기 플레이트는 0.05% Tween-20(PBST)를 함유하는 PBS로 네 번 세척되었고, 100㎕/well의 블로킹 완충액(2.5% gelatin 및 1% BSA를 함유하는 PBST)와 함께 37°C에서 2시간 동안 배양되었다.

상기 플레이트는 PBST로 네 번 세척되었고 다양한 농도(PBS 내 10,5,1,0.5,0.1 및 0.05nM)의 모노머의, 올리고머의 또는 응집된 α-시누클레인 50㎕가 첨가되었다. 그리고 나서 상기 플레이트는 2.5시간 동안 37°C에서 배양되었다.

PBST로 네 번 세척된 이후, 블로킹 완충액 내에서 1/1000로 희석된 FL-140(토끼 다중클론성 항체(polyclonal antibody), Santa Cruz Biotechnology사) 50㎕가 첨가되었고, 2시간 동안 37°C에서 배양되었다.

상기 well이 PBST로 네 번 세척된 이후, 블로킹 완충액 내에서 1:10000으로 희석된 Goat anti Rabbit IgG HRP(Jackson ImmunoResearch)가 첨가되었고, 37°C에서 1.5시간 동안 배양되었다.

상기 플레이트는 PBST로 네 번 세척되었고, 결합된 HRP 활성은 향상된 화학발광 기질(SuperSignal ELISA Femto, Pierce Biotechnology)을 사용한 화학발광 반응에 의해 분석되었고, RLU(relative light units) 내의 화학발광은 즉시 PerkinElmer microplate reader로 측정되었다.

입체적 mAb가 오직 α-시누클레인의 응집된 형태만을 검출하고 상기 α-시누클레인의 모노머 형태를 검출하지 못한 것을 확인하기 위해, 위에서 설명된 추가적인 ELISA 분석이 Syn-1를 포획항체(capture antibody)로 사용하여 비교예(통제집단)으로서 수행되었다.

결과는 도 11a 및 도 11b에 보여지는 바와 같다. 상기 결과는 입체적 mAb들인 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3와, Syn-O4가 α-시누클레인의 올리고머 형태와 응집된 형태 모두에 반응하는 것을 보여준다. Syn-1은 α-시누클레인의 모노머 형태와 응집된 형태 모두에 반응한다.

ELISA가 모든 mAb들에 의한 α-시누클레인의 모노머 형태에 대한 검출이 없고, α-시누클레인의 올리고머 및 피브릴 형태 모두의 검출이 있음을 보여주는 동안, 상기 ELISA의 결과는 Syn-F1 및 Syn-F2에 대해 α-시누클레인의 올리고머 형태를 넘어 α-시누클레인 피브릴을 향해 다소 약간의 특이성이 있었다는 것을 나타냈다.

예시 9

응집된 인산화 Ser129-alpha-시누클레인(phosphorylated Ser129-alpha-synuclein)(p-S129-α-syn)을 검출하기 위한 샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA)

384 well ELISA black microplate(Nunc Maxisorp, NUNC, 덴마크)가 0.1㎍/ml의 우리의 입체적 단일클론 항체(Syn-F2, Syn-O2)(50㎕/well) 중 하나와 함께 pH 9.6 200mM의 NaHCO₃ 내에서 4°C에서 하룻밤 배양에 의해 코팅되었다.

상기 플레이트는 0.05% Tween-20(PBST)를 함유하는 PBS로 네 번 세척되었고, 100㎕/well의 블로킹 완충제(2.5% gelatin 및 1% BSA를 함유하는 PBST)와 함께 37°C에서 2시간 동안 배양되었다.

상기 플레이트는 PBST로 네 번 세척되었고 다양한 농도(PBS 내에서 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005nM)의 모노머의 p-S129-α-syn 또는 응집된 p-S129-α-syn 50㎕가 첨가되었다. 그리고 나서 상기 플레이트는 2.5시간동안 37°C에서 배양되었다.

PBST로 네 번 세척된 이후, 블로킹 완충제 내에서 1/1000로 희석된 rabbit anti-p-S129-α-시누클레인(Epitomics) 50㎕가 첨가되었고, 2시간 동안 37°C에서 배양되었다.

well이 PBST로 네 번 세척된 이후 블로킹 완충제 내에서 1:10,000으로 희석된 Goat anti Rabbit IgG HRP(Jackson ImmunoResearch)가 첨가되었고 37°C에서 1.5시간 동안 배양되었다.

상기 플레이트는 PBST로 네 번 세척되었고, 결합된 HRP 활성은 향상된 화학발광 기질(SuperSignal ELISA Femto, Pierce Biotechnology사)을 사용한 화학발광 반응에 의해 분석되었고, 그 후 RLU(relative light units) 내의 화학발광은 즉시 PerkinElmer microplate reader로 측정되었다.

상기 입체적 mAb가 오직 α-시누클레인의 응집된 형태만 검출하고 상기 α-시누클레인의 모노머 형태를 검출하지 않은 것을 확인하기 위하여, 위에서 설명된 바와 같은 추가적인 ELISA 분석이 Syn-1를 포획항체로 사용하여 비교예(통제집단)로서 수행되었다.

결과는 도 12를 통해 볼 수 있다. 상기 결과는 입체적 mAb인 Syn-F2 및 Syn-O2가 응집 인산화 α-시누클레인(aggregated phosphorylated α-synuclein) 형태와 반응하는 것을 보여준다. Syn-1은 유사하지만 인산화 S129 α-시누클레인의 모노머 및 응집 형태 모두에 낮은 반응을 보였다.

시누클레인의 응집 및 인산화는 파킨슨병(PD) 발병에 결정적인 역할을 하는 것으로 생각된다. 따라서, 생물학적 유체 내 α-시누클레인의 인산화 또는 비인산화 형태의 검출은 PD에 표시된 잠재적 생물학적 표시로 사용될 수 있다.

ELISA 분석은 특이적으로 α-시누클레인의 응집된 형태를 검출하고 α-시누클레인의 모노머 형태를 검출하지 않는 것으로 개발되어 왔다. 상기 분석은 응집 α-시누클레인에 대한 FL-140(전체길이 α-시누클레인에 대해 길러진 rabbit 다중클론 항체, Santa Cruz Biotechnology), 또는 p-S129-α-시누클레인의 응집에 대한 rabbit anti-p-S129-α-시누클레인(Epitomics)와 같은 항체로 검출로 이어지는 항체 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3, 또는 Syn-O4를 포획항체로 사용한다.

예시 10

면역조직화학( Immunohistochemistry )

상기 mAb는 파킨슨병 케이스의 뇌 부위 내의 페록시다아제 면역조직화학(peroxidase immunohisochemistry)을 사용하여 테스트되었다. Syn-F1 및 Syn-O2는 1/10000(0.1㎍/ml)으로 희석되어 사용되었고 Syn-F2, Syn-O1, Syn-O3 및 Syn-O4는 1/5000(0.2㎍/ml)으로 희석되어 사용되었다. 마우스 음성 비교군 슬라이드(a mouse negative control slide)가 또한 동시에 처리되었고 거기서 모든 면역조직화학 단계가 포함되었으나 1차 항체(primary antibody)가 생략되었다.

결과

상기 mAb는 파킨슨병(PD) 및 멀티시스템 위축(Multi-system atrophy)(MSA) 케이스에서 페록시다아제 면역조직화학을 사용하여 검사가 시행되었다. 모든 항체는 PD 뇌 내의 루이소체 및 루이 뉴라이터스(도 14)와, 다계통위축증 뇌의 백질 회돌기교세포(white matter oligodendrocytes) 내의 아교세포질포함체(glial cytoplasmic inclusions)(도 15) 내에서 강렬한 면역 염색법(intense immunostaining)을 제공하였다. 마우스 음성 대조군 슬라이드는 또한 처리되었고 상기 섹션에서 어떠한 면역반응도 생산하지 않았다(도 13).

비교예(도 13)에서, 상기 이미지는 우리의 mAb 및 시판되는 비교예로부터의 전방의 대상피질(anterior cingulate cortex) 내 마우스 단일항체 안티-α-시누클레인 항체(Syn-1) 또는 마우스 단일항체 안티-인산화 Ser129 α-시누클레인(phospho-syn)에 대해 면역염료된 섹션을 보여준다. 마우스와 토끼 음성 비교군 슬라이드 또한 동시에 처리되었다. 모든 섹션은 세포핵(cell nuclei) 및 세포막(cell membranes)를 시각화하기 위해 Cresyl violet(파란색)으로 대비 착색되었다. 밝기에 대한 동일한 조절이 모든 이미지에 적용되었다. 기준자(scale bar)는 20㎛를 나타낸다(모든 패널에 적용).

파킨슨 병의 경우(도 14), 이미지는 본 발명의 mAb 및 비교예의 전방의 대상피질 내의 시판되는 마우스 단일항체 anti-α-시누클레인 항체(Syn-1) 또는 마우스 단일항체 anti-phosphorylated Ser129 α-시누클레인에 대해 면역반응하는 루이소체를 보여준다. 모든 섹션은 세포핵 및 세포막을 시각화하기 위해 Cresyl violet(파란색)으로 대비 착색되었다. 밝기에 대한 동일한 조절이 모든 이미지에 적용되었다. 기준자(scale bar)는 20㎛를 나타낸다(모든 패널에 적용).

다계통 위축증의 경우(도 15), 이미지는 본 발명의 mAb 및 다계통위축증의 피각(putamen) 내의 시판되는 마우스 단일클론 anti-α-시누클레인 항체(Sun-1) 또는 마우스 단일클론 anti-phophorylated Ser129 신경교세포포함체(glial-cell inclusions)의 면역반응성을 보여준다. 섹션들은 세포핵 및 세포막을 시각화하기 위해 Cresyl violet(파란색)으로 대비 착색되었다. 밝기에 대한 동일한 조절이 모든 이미지에 적용되었다. 기준자(scale bar)는 20㎛를 나타낸다(모든 패널에 적용).

예시 11

신경퇴행성 질환을 가지고 있는 것으로 알려진 환자의 뇌조직이 Syn-O2 항체와 함께 테스트되었다. 상기 항체는 1/5000(0.2㎍/ml)로 희석되어 사용되었다. 상기 항체는 모든 환자 샘플에서 강렬한 착색을 생산했다.

환자 A는 파킨 유전자(parkin gene) 내의 이질 접합 엑손 삭제(heterozygous exon deletion)와 결합하여 이질 접합 미스센스 돌연변이(heterozygous missense mutation)와 함께 상염색체 열성 조기발생 파킨슨증후군(autosomal recessive early-onset Parkinsonism)을 가지는 것으로 알려졌다. 도 16(A)에서 볼 수 있듯이, 올리고머 α-시누클레인은 시냅스 및 세포과정에서 관찰되었다(화살촉). 매우 작은 응집물이 뉴로멜라닌을 함유하는 뉴론의 세포질 내에서 보여졌다.

환자 B는 루이소체 치매가 진행되고 있는 환자이다. 도 16(B)에서 볼 수 있듯이, 올리고머 α-시누클레인 면역반응이 시냅스, 루이 신경돌기 유사구조(Lewy neurite-like structures) 및 세포 외 응집물 내에서 관찰되었다.

환자 C는 원발성의 후발성 파킨슨병(late-onset idiopathic Parkinson)을 가지고 있다. 도 16(C)에서 볼 수 있듯이, 올리고머 α-시누클레인 면역반응이 루이소체-유사 세포질내봉입체(Lewy body-like intracytoplasmic inclusions) 및 루이 신경돌기 내에서 관찰되었다.

결과는 본 발명의 항체가 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환의 진단에 사용될 수 있음을 보여준다.

예시 12

뇌조직 샘플의 서로 다른 부위(해마(hippocampus)의 CA2 부위, 내후각피질 표면층(Entorhinal cortex superficial layers) 1-3, 내후각피질 표면층 4-6, 내후각피질 신경돌기(Entorhinal cortex neutries)가 Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3, Syn-O4, Syn-F1 및 Syn-F2 항체로 테스트되었다. 상기 항체는 1/5000으로 희석되어 사용되었다. 상기 뇌조직은 4개의 처리 중 하나로 진행되었다 1) 전처리 없음 2) 구연산염 완충제(citrate buffer) 내에서 10분 동안 120°C에서 고압살균, 3) 포름산 내에서 15분, 또는 4) 20㎍/ml 프로테이나아제 K 처리.

배양은 4°C에서 하룻 밤동안 진행되었다. 검출은 발색체(Chromogen)로서 로물린(Romulin)과 함께 Histostain HP kit와 함께 진행되었다. 비교 항체 Syn-1은 1:1000 희석에 사용되었다. 상기 비교 항체로 테스트된 조직 샘플은 15분 동안 폼산(Formic acid)로 전처리되었다.

결과는 상기 항체가 심지어 뇌조직의 사전처리 없이도 작동하는 것을 보여주었다. 그러나 상기 항체는 전처리와 함께 더 좋게 픽업되었다. 단백질 K 처리된 샘플이 더 나은 결과를 보여두었다. 프로테이나아제 K 처리는 변형 시누클레인(즉, 세포질내 응집물)의 면역반응을 향상시키고 시냅스 염색의 발산을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 해마 (A)의 CA2 부위 및 내후각피질 신경돌기(B) 내 비교 항체 및 Syn-F2 항체에 대한 결과는 도 17에서 볼 수 있다.

예시 13

여섯 가지 항체 클론 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4에 대한 중쇄 및 경쇄의 다양한 부위의 폴리뉴클레오티드 아미노산 서열은 결정되었다.

RNA는 기술 메뉴얼에 따라 TRlzol®Plus RNA purification System(Invitrogen)를 사용하여 하이브리도마 클론 Syn-F1, Syn-F2, Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4로부터 추출되었다. 격리된 Total RNA는 아르고스 겔 전기영동(argose gel electrophoresis)에 의해 분석되었다.

Total RNA는 기술 매뉴얼에 따른 SuperScript™ Ⅲ First-strand synthesis System을 사용한 isotype-specific anti-sense primers 또는 universal primers를 이용한 cDNA 내로 역전사되었다. VH 또는 VL의 항체 단편은 GenScript사의 RACE의 표준운영절차에 따라 증폭되었다.

증폭된 항체 단편은 표준 분자 클로닝 기술을 사용한 클로닝 벡터 내로 클로닝되었다. colony PCR screening은 올바른 크기의 주입물을 가진 클론을 식별하기 위해 수행되었다. 올바른 크기의 주입물을 가진 적어도 5개의 단일클론이 각각의 항체 단편에 대해 시퀀싱되었다.

각각의 VH 영역(VH region) 및 VL 영역(VL region)에 대해 상기 DNA 서열이 결정되었고, 그에 상응하는 아미노산 서열이 결정되었다. 상기 선도 서열(leader sequence), 골격구역(framework regions)(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 및 상보성결정부(complementarity determining regions)(CDR1, CDR2 및 CDR3)가 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대해 결정되었다. 결과는 표 8에서 볼 수 있다. 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 폴레뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 SEQ ID NOs:13-48에서 볼 수 있다.

Syn-F1의 VH 및 VL 영역을 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:1 및 3에 각각 제공된다. Fyn-F1의 VH 및 VL 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 및 4에 제공된다. Syn-F1의 VH 영역의 CDR1, CDR2과, CDR3 영역은 SEQ ID NO:13,14 및 15에 각각 제시된다. 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16,17 및 18에 제시된다. Syn-F1의 VL 영역의 CDR1, CDR2와, CDR3 영역은 SEQ ID NO:19,20 및 21에 각각 제시된다. 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:22,23과, 24에 제시된다.

Syn-F2의 VH 및 VL 영역을 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:5 및 7에 각각 제공된다. Syn-F2의 VH 및 VL 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6 및 8에 제공된다. Syn-F2의 VH 영역의 CDR1, CDR2와, CDR3 영역은 SEQ ID NO:13, 26 및 27에 각각 제시된다. 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16,29 및 30에 제시된다. Syn-F1의 VL 영역의 CDR1, CDR2와, CDR3 영역은 SEQ ID NO:19, 20 및 21에 각각 제시된다. 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:22,23 및 24에 제시된다.

Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4의 VH 및 VL 영역을 암호화하는 DNA 서열은 SEQ ID NO:9 및 11에 각각 제공된다. Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4의 VH 및 VL 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10 및 12에 제공된다. Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4의 VH 영역의 CDR1, CDR2와, CDR3 영역은 SEQ ID NO:37, 38 및 39에 각각 제시된다. 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:40,41 및 42에 제시된다. Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4의 VL 영역의 CDR1, CDR2와, CDR3 영역은 SEQ ID NO:43,44 및 45에 각각 제시된다. 상응하는 아미노산 서열은 SEQ ID NO:46,47 및 48에 제시된다.

Syn-O1, Syn-O2, Syn-O3 및 Syn-O4의 VH 및 VL 영역의 서열은 같은 것으로 밝혀졌다.

항체	SEQ ID NO:	서열 (Leader-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)
SYN-F1 (VH)	1	ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTGTCCTTA TTTTAAAAGGTGTCCAGTGT GATGTGCAGCTGGTGGA GTCTGGGGGAGACTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGG AAACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACTTTCAGTAG CTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGG GGCTGGAGTGGGTCGCA TACATTAATAGTGGCAGTAGT ACCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGC CGATTCAC CATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGC AGATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTAT TACTGTGCAAGG GGAAATAACCCTGGGACGGGATATTA CTATTCTATGGACTAC TGGGGTCAGGGAACCTCAGTCA CCGTCTCCTCA
SYN-F1 (VH)	2	MDSRLNLVFLVLILKGVQC DVQLVESGGDLVQPGGSRKLSCAAS GFTFSSFGMH WVRQAPEKGLEWVA YINSGSSTIYYADTVKG RFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAR GNNPGTGYYY SMDY WGQGTSVTVSS
SYN-F1 (VL)	3	ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGA TTCAGGAAACCAACGGTG ATGTTGTGATGACCCAGACTCCAC TCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCTTG CAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTA TTTGAATTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGC CTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACA GGTTCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAA TCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCG TGCAAGGTACACATTTTCCCACGTTCGGAGTGGGGACCAAGC TGGAAATAAAA
SYN-F1 (VL)	4	MMSPAQFLFLLVLWIQETNG DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC KSSQSLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRF TGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPTFGVGTKLEIK
SYN-F2 (VH)	5	ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTTGTCCTTATTTTAAAAGG TGTCCAGTGT GATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCT TAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTC TGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAG GCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATACATTAGTAGT GGCAGTAGTACCATCTACTATGCAGACACAGTGAAGGGCCGA TTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTGTTCCTGC AAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACT GTGCAAGAGGAAATAACCCTGGGACGGGATATTACTATGCTA TGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
SYN-F2 (VH)	6	MDSRLNLVFLVLILKGVQC DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAAS GFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTI SRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARGNNPGTGYYYAMDY WGQGTSVTVSS
SYN-F2 (VL)	7	ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTC AGGAAACCAACGGT GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCA CTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCTATCTCTTGCAA GTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTAATGGAAAAACCTATTTG AATTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTA ATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGT TCACTGGCAGTGGATCAGGAACAGATTTTACACTGAAAATCA GCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTACTGCGTGC AAGGTACACATTTTCCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGG AAATAAAA
SYN-F2 (VL)	8	MMSPAQFLFLLVLWIQETNG DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKS SQSLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGS GSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPTFGGGTKLEIK
SYN-O1 (VH)	9	ATGGTGTTGGGGCTTAAGTGGGTTTTCTTTGTTGTTTTTTATCAAGG TGTGCATTGT GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATT GGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTCT GGTTTCACCTTCAATACCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTA AAAGTAGTAATTATGCAACATATTATGCCGACTCAGTGAAAG ACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTA TCTGCAAATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACAGCCATGTA TTACTGTGTGAGACCCCTTAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGC ACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SYN-O1 (VH)	10	MVLGLKWVFFVVFYQGVHC EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAAS GFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSSNYATYYADSVK DRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRPLKWYFDVW GTGTTVTVSS
SYN-O1 (VL)	11	ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCT CAGTATCCAGAGGA CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAAT CTTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGT GCCAGCTCAACTGTTAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAG TCAGGCACCTCCCCCAAAATATGGATTTATGACACATCCAAAC TGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTTG GACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGAT GCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAATAGTAACCCACCCA CGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SYN-O1 (VL)	12	MDFQVQIFSFLLISASVSRG QIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCSAS STVNYMHWYQQKSGTSPKIWIYDTSKLASGVPARFSGSGSWTSY SLTISSMEAEDAATYYCQQWNSNPPTFGAGTKLELK
SYN-O2 (VH)	9	ATGGTGTTGGGGCTTAAGTGGGTTTTCTTTGTTGTTTTTTATCAAGG TGTGCATTGT GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATT GGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTCT GGTTTCACCTTCAATACCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTA AAAGTAGTAATTATGCAACATATTATGCCGACTCAGTGAAAG ACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTA TCTGCAAATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACAGCCATGTA TTACTGTGTGAGACCCCTTAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGC ACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SYN-O2 (VH)	10	MVLGLKWVFFVVFYQGVHC EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAAS GFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSSNYATYYADSVK DRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRPLKWYFDVW GTGTTVTVSS
SYN-O2 (VL)	11	ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCT CAGTATCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAA TCTTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAG TGCCAGCTCAACTGTTAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAA GTCAGGCACCTCCCCCAAAATATGGATTTATGACACATCCAA ACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCT TGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAG ATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAATAGTAACCCACC CACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SYN-O2 (VL)	12	MDFQVQIFSFLLISASVSRGQIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCSASST VNYMHWYQQKSGTSPKIWIYDTSKLASGVPARFSGSGSWTSYSL TISSMEAEDAATYYCQQWNSNPPTFGAGTKLELK
SYN-O3 (VH)	9	ATGGTGTTGGGGCTTAAGTGGGTTTTCTTTGTTGTTTTTTATCAAGG TGTGCATTGT GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATT GGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTCT GGTTTCACCTTCAATACCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTA AAAGTAGTAATTATGCAACATATTATGCCGACTCAGTGAAAG ACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTA TCTGCAAATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACAGCCATGTA TTACTGTGTGAGACCCCTTAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGC ACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SYN-O3 (VH)	10	MVLGLKWVFFVVFYQGVHC EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAAS GFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSSNYATYYADSVK DRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRPLKWYFDVW GTGTTVTVSS
SYN-O3 (VL)	11	ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCT CAGTATCCAGAGGA CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAAT CTTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGT GCCAGCTCAACTGTTAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAG TCAGGCACCTCCCCCAAAATATGGATTTATGACACATCCAAAC TGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTTG GACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGAT GCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAATAGTAACCCACCCA CGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SYN-O3 (VL)	12	MDFQVQIFSFLLISASVSRG QIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCSASS TVNYMHWYQQKSGTSPKIWIYDTSKLASGVPARFSGSGSWTSYS LTISSMEAEDAATYYCQQWNSNPPTFGAGTKLELK
SYN-O4 (VH)	9	ATGGTGTTGGGGCTTAAGTGGGTTTTCTTTGTTGTTTTTTATCAAGG TGTGCATTGT GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAGGATT GGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTCT GGTTTCACCTTCAATACCTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGG CTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTA AAAGTAGTAATTATGCAACATATTATGCCGACTCAGTGAAAG ACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTA TCTGCAAATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACAGCCATGTA TTACTGTGTGAGACCCCTTAAGTGGTACTTCGATGTCTGGGGC ACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SYN-O4 (VH)	10	MVLGLKWVFFVVFYQGVHC EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAAS GFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRSKSSNYATYYADSVK DRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRPLKWYFDVW GTGTTVTVSS
SYN-O4 (VL)	11	ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCT CAGTATCCAGAGGA CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAAT CTTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGT GCCAGCTCAACTGTTAATTACATGCACTGGTACCAGCAGAAG TCAGGCACCTCCCCCAAAATATGGATTTATGACACATCCAAAC TGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTTG GACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGAT GCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAATAGTAACCCACCCA CGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
SYN-04 (VL)	12	MDFQVQIFSFLLISASVSRG QIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCSASS TVNYMHWYQQKSGTSPKIWIYDTSKLASGVPARFSGSGSWTSYS LTISSMEAEDAATYYCQQWNSNPPTFGAGTKLELK

상기 선도 서열(leader sequences)은 이탤릭체이고 상기 CDR 부위는 밑줄 그어져 있다.

예시 14

BiFC 배양계(BiFC culture system) 내 α-시누클레인의 공동응집

BiFC(2분자 형광 상보성(bimolecular fluorescence complementation)) 배양계를 구축하기 위하여, SH-SY5Y 세포가 GN-link-α시누클레인(GN-link-αSyn)(V1S) 또는 αSynGC(SV2)(Dr. Pamela McLean의 기증, Massachusetts General Hospital, Charlestown, MA)와 함께 전기천공법(eletroporation)을 사용하여 형질주입되었다. 형질주입된 세포는 콜로니가 드러날 때까지 600㎍/ml의 G418(Invitrogen사, Carlsbad, CA)과 함께 2-3주동안 선택되었다. 안정적인 세포계가 200㎍/ml의 G418과 함께 유지되었다.

상기 SV2 세포, 비너스 형광 단백질의 C-말단 단편과 융합된 안정적으로 과발현하는 인간-시누클레인은 1㎍/ml normal mouse IgG 또는 α-시누클레인 항체(274, Syn-O1, Syn-O2, Syn-F1, Syn-F2, B11D12, F7A11) 중 하나의 존재하에 N-말단 비너스 단편이 표식된 α-시누클레인을 과발현하는 V1S 안정적인 세포계와 함께 공생배양되었다. 배양 3일 후, 상기 BiFC 형광발광은 Olympus(Tokyo, 일본) FV1000 공초점 레이저 현미경으로 분석되었다.

점 대형이 세포 내에서 관찰되었다(화살촉). 점 대형을 포함하는 세포의 수는 세어졌고 점 양성 세포 비율이 계산되었다. 결과는 도 18a 내지 18b 및 19를 통해 알 수 있다. 그래프는 α-시누클레인 응집물을 포함하는 세포의 퍼센티지를 나타낸다. 본 명세서에 설명된 특정 예시 및 실시예는 본질적으로 단지 예시적인 것이며 본 발명을 제한하는 것을 의도하는 것은 아니다. 추가적인 실시예 및 예시와, 그것의 이점은 서 본 발명의 명세서 및 청구범위에 비추어 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

<110> United Arab Emirates El-Agnaf, Omar <120> ALPHA-SYNUCLEIN ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> RCD12001 <140> 10-2015-7025875 <141> 2015-09-18 <150> US 13/781,158 14/138,347 <151> 2013-02-28 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(57) <223> Leader <220> <221> misc_feature <222> (58)..(132) <223> FR1 <220> <221> misc_feature <222> (123)..(162) <223> CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (163)..(204) <223> FR2 <220> <221> misc_feature <222> (205)..(255) <223> CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (256)..(351) <223> FR3 <220> <221> misc_feature <222> (352)..(393) <223> CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (394)..(426) <223> FR4 <400> 1 atggactcca ggctcaattt agttttcctt gtccttattt taaaaggtgt ccagtgtgat 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggagactta gtgcagcctg gagggtcccg gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tttggaatgc actgggttcg tcaggctcca 180 gagaaggggc tggagtgggt cgcatacatt aatagtggca gtagtaccat ctactatgca 240 gacacagtga agggccgatt caccatctcc agagacaatc ccaagaacac cctgttcctg 300 cagatgacca gtctaaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag gggaaataac 360 cctgggacgg gatattacta ttctatggac tactggggtc agggaacctc agtcaccgtc 420 tcctca 426 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Asn Pro Gly Thr Gly Tyr Tyr Tyr Ser 115 120 125 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 3 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> Leader <220> <221> misc_feature <222> (61)..(129) <223> FR1 <220> <221> misc_feature <222> (130)..(177) <223> CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (178)..(222) <223> FR2 <220> <221> misc_feature <222> (223)..(243) <223> CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (244)..(339) <223> FR3 <220> <221> misc_feature <222> (340)..(363) <223> CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (364)..(393) <223> FR4 <400> 3 atgatgagtc ctgcccagtt cctgtttctg ttagtgctct ggattcagga aaccaacggt 60 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 120 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 180 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 240 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttccc 360 acgttcggag tggggaccaa gctggaaata aaa 393 <210> 4 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Gln 1 5 10 15 Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser 20 25 30 Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Val Gln Gly Thr His Phe Pro Thr Phe Gly Val Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 5 <211> 426 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(57) <223> Leader <220> <221> misc_feature <222> (58)..(132) <223> FR1 <220> <221> misc_feature <222> (133)..(162) <223> CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (163)..(204) <223> FR2 <220> <221> misc_feature <222> (205)..(255) <223> CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (256)..(351) <223> FR3 <220> <221> misc_feature <222> (352)..(393) <223> CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (394)..(426) <223> FR4 <400> 5 atggactcca ggctcaattt agttttcctt gtccttattt taaaaggtgt ccagtgtgat 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtcccg gaaactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tttggaatgc actgggttcg tcaggctcca 180 gagaaggggc tggagtgggt cgcatacatt agtagtggca gtagtaccat ctactatgca 240 gacacagtga agggccgatt caccatctcc agagacaatc ccaagaacac cctgttcctg 300 caaatgacca gtctaaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag aggaaataac 360 cctgggacgg gatattacta tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 420 tcctca 426 <210> 6 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Asn Asn Pro Gly Thr Gly Tyr Tyr Tyr Ala 115 120 125 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 7 <211> 393 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> Leader <220> <221> misc_feature <222> (61)..(129) <223> FR1 <220> <221> misc_feature <222> (130)..(177) <223> CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (178)..(222) <223> FR2 <220> <221> misc_feature <222> (223)..(243) <223> CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (244)..(339) <223> FR3 <220> <221> misc_feature <222> (340)..(363) <223> CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (364)..(393) <223> FR4 <400> 7 atgatgagtc ctgcccagtt cctgtttctg ttagtgctct ggattcagga aaccaacggt 60 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 120 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatagtaatg gaaaaaccta tttgaattgg 180 ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 240 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggaa cagattttac actgaaaatc 300 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgcg tgcaaggtac acattttccc 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393 <210> 8 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Gln 1 5 10 15 Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser 20 25 30 Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Val Gln Gly Thr His Phe Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 9 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(57) <223> Leader <220> <221> 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Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asn Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Pro Leu Lys Trp Tyr Phe Asp Val Trp 115 120 125 Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 11 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> Leader <220> <221> misc_feature <222> (61)..(129) <223> FR1 <220> <221> misc_feature <222> (130)..(159) <223> CDR1 <220> <221> misc_feature <222> (160)..(204) <223> FR2 <220> <221> misc_feature <222> (205)..(225) <223> CDR2 <220> <221> misc_feature <222> (226)..(321) <223> FR3 <220> <221> misc_feature <222> (322)..(348) <223> CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (349)..(378) <223> FR4 <400> 11 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt atccagagga 60 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc ttgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 120 atgacctgca gtgccagctc aactgttaat tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 180 acctccccca aaatatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 240 ttcagtggca gtgggtcttg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 300 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg aatagtaacc cacccacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg agctgaaa 378 <210> 12 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Thr 35 40 45 Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys 50 55 60 Ile Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Trp Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser 100 105 110 Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggattcactt tcagtagctt tggaatgcac 30 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 tacattaata gtggcagtag taccatctac tatgcagaca cagtgaaggg c 51 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 ggaaataacc ctgggacggg atattactat tctatggact ac 42 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His 1 5 10 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Asn Asn Pro Gly Thr Gly Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 aagtcaagtc agagcctctt atatagtaat ggaaaaacct atttgaat 48 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ctggtgtcta aactggactc t 21 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gtgcaaggta cacattttcc cacg 24 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Gln Gly Thr His Phe Pro Thr 1 5 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ggattcactt tcagtagctt tggaatgcac 30 <210> 26 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 tacattagta gtggcagtag taccatctac tatgcagaca cagtgaaggg c 51 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ggaaataacc ctgggacggg atattactat gctatggact ac 42 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His 1 5 10 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gly Asn Asn Pro Gly Thr Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 aagtcaagtc agagcctctt atatagtaat ggaaaaacct atttgaat 48 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 ctggtgtcta aactggactc t 21 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 gtgcaaggta cacattttcc cacg 24 <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Val Gln Gly Thr His Phe Pro Thr 1 5 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 ggtttcacct tcaataccta tgccatgcac 30 <210> 38 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 cgcataagaa gtaaaagtag taattatgca acatattatg ccgactcagt gaaagac 57 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ccccttaagt ggtacttcga tgtc 24 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 41 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Arg Ile Arg Ser Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Pro Leu Lys Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 agtgccagct caactgttaa ttacatgcac 30 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 gacacatcca aactggcttc t 21 <210> 45 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 cagcagtgga atagtaaccc acccacg 27 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ser Ala Ser Ser Thr Val Asn Tyr Met His 1 5 10 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 49 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val 1 5 10 15 Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys 20 25 30 Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val 35 40 45 Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr 50 55 60 Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys 65 70 75 80 Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys 85 90 95 Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro 115 120 125 Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala 130 135 140

Claims

α-시누클레인 올리고머에 대해 높은 결합친화성, α-시누클레인 피브릴에 대해 높은 결합친화성과, α-시누클레인 모노머에 대해 낮은 결합친화성을 가지는 항체 또는 그것의 단편으로서,
상기 항체 또는 그것의 단편은, CDR1 부위가 SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 가지고, CDR2 부위는 SEQ ID NO17, SEQ ID NO:29, 또는 SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 가지고, CDR3 부위는 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:30, 또는 SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 가지는 이뮤노글로빈 중쇄 가변영역(VH)을 포함하고,
상기 항체 또는 그것의 단편은, CDR1 부위가 SEQ ID NO:22 또는 SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 가지고, CDR2 부위가 SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 가지고, CDR3 부위가 SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 가지는 이뮤노글로빈 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 이뮤노글로빈 중쇄 가변영역(VH)은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, 또는 SEQ ID NO:10에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 이뮤노글로빈 경쇄 가변영역(VL)은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:12에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 이뮤노글로빈 중쇄 가변영역(VH)과 이뮤노글로빈 경쇄 가변영역(VL)은 각각 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6과 SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:10과 SEQ ID NO:12에 도시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체 또는 그것의 단편은 인간 α-시누클레인 올리고머와 피브릴에 대해 10^-7M보다 작은 해리상수 Kd를 가지는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체 또는 그것의 단편은 모노머의 α-시누클레인에 대해 10^-5M보다 큰 해리상수 Kd를 가지는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체는 α-시누클레인의 올리고머 형태에 대해서 보다 α-시누클레인 피브릴에 대해 더 높은 친화성을 가지는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체 또는 그것의 단편은 α-시누클레인의 C-말단영역을 포함하는 항원결정부에 결합하는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체 또는 그것의 단편은 입체구조의 항체인 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그것의 단편은 α-시누클레인의 선형 항원결정부를 인식하지 않는 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서,
상기 항체는 단일클론 항체인 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 따른 항체 또는 그것의 단편과 약제학적으로 허용가능한 희석액 또는 캐리어를 포함하는, 개체 내의 α-시누클레인 병리에 의한 신경퇴행성 질환을 치료하는데 사용을 위한 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 있어서, 개체에 상기 항체 또는 그것의 단편을 투여하는 것을 포함하는 개체 내의 α-시누클레인 병리에 의한 신경퇴행성 질환을 치료하는데 사용을 위한 항체 또는 그것의 단편.
제14항에 있어서,
상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 루이소체 치매, 알츠하이머병, 다계통위축증, 정신이상, 정신분열증, 또는 크로이츠펠트 야곱병인 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 따른 항체 또는 그것의 단편을 포함하며 개체가 신경퇴행성 질환을 가지는지 여부를 결정하는 방법에 사용되는 시험 키트.
생물학적 샘플에 제1항에 따른 항체 또는 그것의 단편을 첨가하는 단계와, α-시누클레인 응집물과 항체 또는 그것의 단편 간에 형성된 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 α-시누클레인 응집물을 검출하는 방법.
피험자의 생물학적 샘플에 제1항에 따른 항체 또는 그것의 단편을 첨가하고, α-시누클레인 응집물과 항체 또는 그것의 단편 간에 형성된 복합체의 존재 여부를 검출하는 것을 포함하는 α-시누클레인과 관련된 신경퇴행성 질환을 진단하는 방법에 사용되는 항체와 그것의 단편.
제1항에 있어서,
이미징제로 사용하기 위한 항체 또는 그것의 단편.
제1항에 따른 항체 또는 그 단편을 개체에 투여하고, 상기 항체를 검출하는 것을 포함하는 α-시누클레인 응집물을 이미징하는 방법에 사용되는 항체와 그것의 단편.
제20항에 있어서,
상기 항체는 검출가능한 라벨을 포함하는 항체와 그것의 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체는 검출가능한 라벨에 결합되어 있는 항체와 그것의 단편.
제22항에 있어서, 상기 검출가능한 라벨은, 형광라벨, 방사성 라벨 또는 조영제로부터 선택되는 항체와 그것의 단편.
제12항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 루이소체 치매, 알츠하이머병, 다계통위축증, 정신이상, 정신분열증, 또는 크로이츠펠트 야곱병인, 개체 내의 α-시누클레인 병리에 의한 신경퇴행성 질환을 치료하는데 사용을 위한 약제학적 조성물.
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