JP2018508193A - メディンを認識する抗体 - Google Patents
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- G01N2800/7047—Fibrils-Filaments-Plaque formation
Abstract
Description
本出願は、その全体が参照によって組み入れられる2015年1月22日に出願された米国仮特許出願番号62/106,690の米国特許法第119条(e)のもとでの利益を主張する。
ファイル47381SEQLIST.txtに書き込まれた配列表は30.4キロバイトであり、2016年1月21日に創られ、参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の抗体は、たとえば、配列番号3を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号36を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体のようなモノクローナル抗体18G1の3つの軽鎖CDRと3つの重鎖CDRを含む。
一部の抗体は、ヒトメディンに特異的に結合するヒト化またはキメラの18G1抗体であり、その際、18G1は配列番号3の成熟重鎖可変領域と配列番号36の成熟軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である。
一部の抗体は、18G1の3つの重鎖CDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域と18G1の3つの軽鎖CDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体である。
一部のそのような抗体では、CDRは、Kabat/Chothia複合によって定義されるとおりであり、たとえば、重鎖CDRについては配列番号4、5及び6ならびに軽鎖CDRについては配列番号8、9及び10である。一部のそのような抗体では、CDRは、Kabat、Chothia、Kabat/Chothia複合、AbM及びContactの群から選択される定義のものである。
一部の抗体は、たとえば、定常領域による補体結合または補体の活性化を低下させる変異のような、たとえば、EU番号付けによる241、264、265、270、296、297、318、320、322、329及び331位の1以上での変異のような定常領域における少なくとも1つの変異を有してもよい。一部の抗体は、318位、320位及び322位でアラニンを有する。一部の抗体は少なくとも95%w/w純粋であることができる。抗体は治療剤または細胞傷害剤とコンジュゲートさせることができる。
配列番号1は、ヒトメディンのアミノ酸配列を示す。
モノクローナル抗体または他の生物学的実体は通常、単離された形態で提供される。これは、抗体または他の生物学的実体が通常、介在するタンパク質及びその製造または精製から生じる他の混入物から少なくとも50%w/w純粋であることを意味するが、モノクローナル抗体が過剰の薬学上許容できる担体(複数可)またはその使用を円滑にするように意図される他のビヒクルと合わせられる可能性を排除しない。モノクローナル抗体は介在するタンパク質及び製造または精製に由来する混入物から少なくとも60%、70%、80%、90%、95%または99%純粋であることがある。単離されたモノクローナル抗体または他の生物学的実体はその精製の後、残っている優勢な高分子種であることが多い。
I.一般
本発明はメディンに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、メディンのモノマー形態、誤って折り畳まれた形態、凝集した形態または原線維の形態に結合する能力を有する。抗体は、メディン、メディンの蓄積またはメディン沈着物の蓄積に関連する疾患または障害を治療するまたはその予防を達成するのに使用することができる。たとえば、大動脈瘤を治療するアプローチの1つは、モノクローナル抗体を用いてメディンを隔離し、それによって凝集を阻止し、または大動脈からアミロイド沈着物を取り除いてもよい。抗体は、数ある用途の中で、メディンアミロイドーシスを診断するのに、及びメディンの凝集を抑制するまたは減らすために使用することもできる。
メディンは、ラクトアドヘリンの酵素切断によって形成される50アミノ酸のペプチドであり、配列番号1の配列を有する。ラクトアドヘリンは、乳脂肪小球−EGF因子8(MFG−E8)、SED1、PAS6/7及びP47としても知られる364アミノ酸の糖タンパク質である。メディンは未知の過程によって切断され、エラスチンへの平滑筋のラクトアドヘリンによる固定を妨害し、それによって大動脈の弾力性の低下または「硬化」を招くと考えられている。老人性の大動脈アミロイド沈着の主要成分はメディンである(Haggqvist et al.,PNAS,96:8669−8674(1999))。研究は、成熟アミロイド原線維ではなくメディンの前線維オリゴマー凝集体が周辺細胞にとって毒性であることを示している(Peng et al.,Lab.Invest.87:1195−1205(2007))。文脈から別段明らかでない限り、メディン、ラクトアドヘリンまたはそれらの断片に対する参照は、そのアイソフォーム、変異体、対立遺伝子変異体を含む天然のヒトのアミノ酸配列を含む。
加齢、高血圧症、糖尿病またはアテローム性硬化症に伴って見られる炎症性リモデリングの間に動脈壁においてラクトアドヘリンの蓄積が起きる。動脈壁では、ラクトアドヘリンのシグナル伝達が血管平滑筋細胞の浸潤、増殖、及び炎症性分子の分泌を促進する。老人性大動脈アミロイド沈着の分析は、ラクトアドヘリンのC末端領域の内部切断産物であるメディンが主成分であることを明らかにした。メディンは、エラスチンへの平滑筋のラクトアドヘリンによる固定を妨害し、それによって大動脈の弾力性の低下または「硬化」を招くと考えられている。メディンアミロイドの沈着は、55歳を超えた患者の大動脈では非常に一般的であり、報告の1つは97%の発生率を推定している。メディンアミロイドの最高の有病率は胸部大動脈で見られる。これはこれらの血管における高レベルのエラスチンによる可能性がある。沈着は、エラスチン線維にごく近接した細胞外空間で見られている。メディンは、ラクトアドヘリンが発現されている他の組織ではあまり豊富ではない、または検出されていない。
A.結合特異性及び機能特性
本発明は、メディン内でのエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。一部のそのようなエピトープはラクトアドヘリンのネイティブな形態には埋め込まれ、誤って畳まれたラクトアドヘリンでは露出される。一部のエピトープは、メディンを生じるラクトアドヘリンの切断の際に露出される新エピトープである。一部のエピトープはメディンのC末端領域に位置する。エピトープは、配列番号1に由来する2〜5、3〜5、3〜6、3〜7、3〜9、4〜9または5〜9の隣接するアミノ酸のエピトープのように線状であることができる。一部のエピトープは配列番号2内にある。エピトープは、たとえば、配列番号1の残基1〜50内のアミノ酸の2以上の非隣接セグメントを含む立体構造エピトープであることができる。18G1及び6B3と称される抗体は2つのそのような例となるマウス抗体である。これらの抗体の重鎖及び軽鎖の成熟可変領域の配列はそれぞれ、配列番号3及び7、及び11及び15と呼ばれる。配列番号29は配列番号15で見られるC末端アルギニンが差し引かれたマウス6B3抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号36は配列番号7で見られるC末端アルギニンが差し引かれたマウス18G1抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。配列番号7及び配列番号29におけるC末端Argは可変領域を定常領域に連結する際に含められることがある。実施例に詳細に記載されているように、抗体は完全長メディンまたはメディンのC末端断片に対して作られ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、Biacore解析、ウエスタンブロット解析及び免疫組織化学法を含む多数の実験技法によってスクリーニングされた。
メディンに対する他の非ヒト抗体、たとえば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットの抗体の作出は、たとえば、メディンまたはその断片、たとえば、配列番号2または配列番号22のアミノ酸配列を有するペプチドで動物を免疫することによって達成することができる。Harlow及びLane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988)(あらゆる目的で参照によって組み入れられる)を参照のこと。そのような免疫原は天然の供給源から、ペプチド合成によって、または組換え発現によって得ることができる。任意で、キャリアタンパク質と融合させた、またはさもなければそれと複合体化した免疫原を投与することができる。任意で、免疫原をアジュバントと共に投与することができる。以下に記載されているように幾つかの種類のアジュバントを使用することができる。完全フロイントアジュバントとその後の不完全アジュバントが実験動物の免疫には好まれる。ウサギまたはモルモットは通常、ポリクローナル抗体を作製するのに使用される。マウスは通常、モノクローナル抗体を作製するのに使用される。抗体はメディンまたはその所望の断片への特異的な結合についてスクリーニングされる。そのようなスクリーニングは、メディン変異体の収集物に対する抗体の結合を測定し、どのメディン変異体が抗体に結合するかを判定することによって達成することができる。結合は、たとえば、ウエスタンブロット、FACSまたはELISAによって評価することができる。
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体に由来するCDRがヒトの「アクセプター」抗体の配列に移植される遺伝子操作された抗体である(たとえば、Queen,US5,530,101及び5,585,089;Winter,US5,225,539;Carter,US6,407,213;Adair,US5,859,205;ならびにFoote,US6,881,557を参照のこと)。アクセプター抗体の配列は、たとえば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域の配列であることができる。従って、ヒト化抗体は、ドナー抗体に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも3、4、5またはすべてのCDRを有する、及び存在するならば、ヒト抗体配列に全体としてまたは実質的に由来する可変領域フレームワーク配列及び定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、ドナー抗体重鎖に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも1、2及び普通3すべてのCDR、及び存在するならば、ヒト重鎖可変領域フレームワーク及び定常領域の配列に実質的に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、ドナー抗体軽鎖に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも1、2及び普通3すべてのCDR、及び存在するならば、ヒト軽鎖可変領域フレームワーク及び定常領域の配列に実質的に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列及び軽鎖定常領域を有する。ナノボディ及びdAbs以外、ヒト化抗体はヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体におけるCDRは、対応する残基(任意の従来の定義によって定義されるが、好ましくはKabatによって定義されるような)の少なくとも85%、90%、95%または100%が各CDR間で同一である場合、非ヒト抗体における対応するCDRに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Kabatによって定義される対応する残基の少なくとも85%、90%、95%または100%が同一である場合、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に実質的に由来する。
(1)抗原と直接非共有結合で結合する;
(2)Chothiaによって定義されるが、Kabatによって定義されないCDR領域に隣接するまたはCDRの中にある;
(3)さもなければ、CDR領域と相互作用する(たとえば、CDR領域の約6Åの範囲内にある)、(たとえば、相同の既知の免疫グロブリン鎖の解決済みの構造にて軽鎖または重鎖をモデル化することによって特定される);または
(4)VL−VHの界面にて関与する残基である
ことが無理なく予想されるならば、ヒトのフレームワークのアミノ酸をマウス抗体に由来する等価のフレームワークのアミノ酸によって置換することができる。
本発明はさらに、非ヒト抗体、特に実施例のメディン抗体のキメラ形態及びベニア化形態を提供する。
以下に記載されている種々の技法によってメディンに対するヒト抗体が提供される。一部のヒト抗体は、競合結合実験によって、Winterの、上記のまたは他のやり方のファージディスプレイ法によって、特定のマウス抗体、たとえば、実施例に記載されているマウスモノクローナル抗体の1つと同じエピトープ特異性を有するように選択される。ヒト抗体はまた、たとえば、メディンのC末端断片のようなメディンの断片のみを用いることによって特定のエピトープ特異性についてスクリーニングすることができる。
キメラ抗体、ベニア化抗体またはヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域はヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択はある程度、抗体依存性細胞介在性の細胞傷害性、抗体依存性の細胞性貪食作用及び/または補体依存性の細胞傷害性が所望であるかどうかに左右される。たとえば、ヒトのアイソタイプIgG1及びIgG3は補体依存性の細胞傷害性を有するが、ヒトのアイソタイプIgG2及びIgG4は有さない。ヒトのIgG1及びIgG3はヒトのIgG2及びIgG4よりも強い細胞介在性のエフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパであることができる。定常領域の番号付け様式には、EU番号付け(Edelman,G.M. et al.,Proc.Natl.Acad.USA,63,78−85(1969))、Kabatの番号付け(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)、IMGTユニーク番号付け(Lefranc,M.−P. et al.,IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C−like domains,Dev.Comp.Immunol.,29,185−203(2005)、及びIMGTエクソン番号付け(Lefranc,上記)が挙げられる。軽鎖及び/または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端における1個または数個のアミノ酸、たとえば、重鎖のC末端リジンは分子の一部またはすべてにおいて欠落してもよいし、誘導体化されてもよい。定常領域にて置換を行って、たとえば、補体介在性の細胞傷害性またはADCCのようなエフェクター機能を低下させるまたは高めることができ(たとえば、Winter et al.,米国特許第5,624,821号;Tso et al.,米国特許第5,834,597号;及びLazar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:4005,2006)、またはヒトにて半減期を延ばすことができる(Hinton et al.,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。例となる置換には、抗体の半減期を増やすための250位でのGln及び/または428位でのLeu(定常領域についてこの段落ではEU番号付けを使用する)が挙げられる。234位、235位、236位及び/または237位のいずれかまたはすべてにおける置換はFcγ受容体、特にFcγRI受容体についての親和性を低下させる(たとえば、US6,624,821を参照)。ヒトIgG1の234位、235位及び237位におけるアラニン置換はエフェクター機能を低下させるのに使用することができる。一部の抗体は、エフェクター機能を低下させるためにヒトIgG1の234位、235位及び237位にてアラニン置換を有する。任意で、ヒトIgG2における234位、236位及び237位がアラニンで置換され、235位がグルタミンで置換される(たとえば、US5,624,821を参照)。一部の抗体では、ヒトIgG1のEU番号付けによる241位、264位、265位、270位、296位、297位、322位、329位、及び331位の1以上での突然変異が使用される。一部の抗体では、ヒトIgG1のEU番号付けによる318位、320位及び322位の1以上での突然変異が使用される。一部の抗体では、234位及び/または235位がアラニンで置換され、及び/または329位がグリシンで置換される。一部の抗体では、234位及び235位がアラニンで置換される。一部の抗体では、アイソタイプはヒトのIgG2またはIgG4である。
抗体を発現する細胞株(たとえば、ハイブリドーマ)を用いてキメラ抗体及びヒト化抗体を製造する多数の方法が知られる。たとえば、抗体の免疫グロブリン可変領域をクローニングし、周知の方法を用いて配列決定することができる。方法の1つでは、ハイブリドーマ細胞から調製されたmRNAを用いたRT−PCRによって重鎖可変VH領域をクローニングする。5’プライマーとしての翻訳開始コドンを包含するVH領域リーダーペプチドとg2b定常領域特異的な3’プライマーに対してコンセンサスプライマーを採用する。例となるプライマーはSchenkらによる米国特許公開US2005/0009150に記載されている(以後、「Schenk」)。複数の独立して導出したクローンの配列を比較して増幅の間に変化が導入されていないことを保証することができる。VH領域の配列は、5’RACE RT−PCR法及び3’のg2b特異的プライマーによって得られるVH断片を配列決定することによって決定するまたは確認することもできる。
抗体は、結合アッセイ、機能選抜、メディンに関連する疾患の動物モデルにおける選抜、及び臨床試験を含む幾つかの選抜の対象となることができる。結合アッセイは、メディン(またはその断片、たとえば、配列番号1のアミノ酸残基44〜50)に対する特異的な結合、及び任意で親和性及びエピトープ特異性について調べる。そのような選抜は、例となる抗体、たとえば、6B3または18G1との競合にて実施されることがある。任意で、抗体またはメディン標的のいずれかがそのようなアッセイで不動化される。
本発明はさらに、上述の重鎖及び軽鎖(たとえば、配列番号3、36、11及び29)のいずれかをコードする核酸を提供する。任意で、そのような核酸はさらに、シグナルペプチドをコードし、定常領域に連結されるシグナルペプチドと共に発現させることができる。核酸のコーディング配列は、たとえば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル等のようなコーディング配列の発現を確実にする調節性配列に操作可能に連結することができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は単離された形態で存在することができ、1以上のベクターにクローニングすることができる。核酸は、たとえば、重複するオリゴヌクレオチドの固相合成またはPCRによって合成することができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、たとえば、1つの発現ベクター内で1つの連続した核酸として連結することができ、または別々に、たとえば、それぞれそれ自体の発現ベクターにクローニングすることができる。
メディンのような抗原に特異的に結合するコンジュゲート抗体は大動脈瘤、マルファン症候群、膵炎、アルツハイマー病及び肥満症に有用である。たとえば、そのような抗体は他の治療に役立つ部分、他のタンパク質、他の抗体及び/または検出可能な標識とコンジュゲートすることができる。WO03/057838;US8,455,622を参照のこと。そのような治療に役立つ部分は、たとえば、大動脈瘤、マルファン症候群、膵炎、アルツハイマー病及び肥満症のような患者における望ましくない状態または疾患を治療する、それと闘う、それを改良する、予防するまたは改善するのに使用することができる作用物質であることができる。治療に役立つ部分には、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、放射性治療剤、免疫調節剤、または抗体の活性を助長するまたは高めるいずれかの生物学的に活性のある作用物質を挙げることができる。細胞傷害剤は細胞に対して毒性であるいずれかの作用物質であることができる。細胞増殖抑制剤は細胞増殖を阻害するいずれかの作用物質であることができる。免疫調節剤は免疫応答の発生または維持を刺激するまたは阻害するいずれかの作用物質であることができる。放射性治療剤は放射線を発するいずれかの分子または化合物であることができる。そのような治療に役立つ部分が、本明細書に記載されている抗体のような腫瘍特異的な抗体に結合されるならば、結合された治療に役立つ部分は正常細胞よりも腫瘍細胞または癌細胞に特異的な親和性を有するであろう。その結果、コンジュゲート抗体の投与は、周囲の正常で健常な組織に対する最小の損傷で癌細胞を直接標的とする。これは、毒性が強すぎてそれ自体で投与できない治療に役立つ部分に特に有用であることができる。加えて、さらに少量の治療に役立つ部分を使用することができる。
上記抗体は、少なくともある程度メディンが介在する疾患を有するまたはそのリスクがある患者にて疾患を治療するのにまたはその予防を達成するのに使用することができる。一部のそのような疾患では、たとえば、マルファン症候群の対象または大動脈瘤のリスクがある対象では、抗体は弾力性の劣化を低減してもよいし、及び/または大動脈中膜アミロイド沈着を低減してもよい。
本明細書で提供されるのは、メディンに関連する疾患または状態(たとえば、大動脈瘤、大動脈壁の層を弱め、胸部大動脈瘤のリスクを高める、マルファン症候群、ロイス・ディエツの及び他の家族性結合組織疾患、他の非特異的な結合組織疾患(動脈瘤の家族歴を特徴とする)を含む疾患、二尖大動脈弁の存在、感染症、炎症性疾患、及びたとえば、膵炎、アルツハイマー病、狼瘡、肥満症のような他の疾患)を診断する、モニターする、治療するまたはその予防を達成する幾つかの方法である。そのような方法で使用するために上述の抗体を医薬組成物に組み込むことができる。一般に、抗体または抗体を含有する医薬組成物はそれを必要とする対象に投与される。治療可能である患者には、症状を示していないが、メディンに関連する疾患のリスクがある個人、ならびに現在症状を示している患者が挙げられる。従って、医薬組成物は、大動脈瘤の既知の遺伝的リスクを有する個人、たとえば、マルファン症候群の対象に予防的に投与することができる。そのような個人には、そのような疾患を経験している親戚を有する者及びリスクが遺伝子マーカーまたは生化学マーカーによって判定される者が挙げられる。対象の特定は臨床環境にて、または対象に自宅のようなどこかで対象自身の自己試験キットの使用を介して発生し得る。家族歴、遺伝子試験または医療スクリーニングで保証されるように、治療はどんな年齢(たとえば、10、20、30、40、50、60、または70歳)でも開始することができる。しかしながら普通、患者が40、50、60または70歳に達するまで治療を開始する必要はない。治療は通常ある期間にわたって複数の投与量を必要とし、治療剤(たとえば、メディンの切り詰め形態)に対する抗体または活性化されたT細胞もしくはB細胞の応答を試験することにより経時的にモニターすることができる。応答が落ちると、追加免疫投薬が指示される。
提供されるのはまた、メディンに関連する疾患を患っているまたはそれに罹り易い患者にてメディンに対する免疫応答を検出する方法である。方法を用いて、本明細書で提供される作用物質による治療的または予防的処置の経過をモニターすることができる。たとえば、方法を用いて能動免疫(たとえば、免疫原の投与に応答して産生される抗体)及び受動免疫(たとえば、投与された抗体のレベルを測定すること)をモニターすることができる。
受動免疫に続く抗体プロファイルは通常、抗体濃度の即時のピークを示し、指数的な減衰がそれに続く。さらなる投薬がないと、減衰は投与された抗体の半減期に応じて数日から数カ月の期間内に治療前のレベルに近づく。たとえば、一部のヒト抗体の半減期は約20日である。
本発明はさらに、本明細書で開示されているメディン抗体または他のアンタゴニスト及び関連する素材、たとえば、使用のための指示書(たとえば、添付文書)を含むキット(たとえば、容器)を提供する。使用のための指示書は、たとえば、メディン抗体及び任意で1以上の追加の作用物質の投与のための指示書を含有してもよい。メディン抗体の容器は単位用量、バルク包装(たとえば、複数回用量包装)またはサブユニット用量であってもよい。
抗体は、臨床診断もしくは治療の背景でまたは研究にてメディンまたはその断片を検出するのに使用することができる。たとえば、抗体を用いて、生体試料がメディンを含むという徴候として生体試料または生検にてメディンの存在を検出することができる。抗体の生体試料への結合を抗体の対照試料への結合と比較することができる。対照試料及び生体試料は同じ組織起源の細胞を含む。対照試料及び生体試料は同じ時または異なる時に同じ個体または異なる個体から得ることができる。所望であれば、複数の生体試料及び複数の対照試料を複数の時に評価して試料間の差異に無関係な無作為の変動から守る。次いで生体試料(複数可)と対照試料(複数可)の間での直接比較を行って生体試料(複数可)への抗体の結合(すなわち、メディンの存在)が対照試料(複数可)への抗体の結合に比べて増加するのか、低下するのか、または同じなのかを判定することができる。対照試料に比べた生体試料(複数可)への抗体結合の増大は生体試料(複数可)におけるメディンの存在を示す。一部の例では、増大した抗体結合は統計的に有意である。任意で、生体試料への抗体結合は、対照試料への抗体結合よりも少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍または100倍高い。
マウスをC末端ペプチドまたは完全長のヒトメディンで免疫し、ハイブリドーマをクローニングし、ELISA、ウエスタンブロット、Biacore及び免疫細胞化学を用いて活性について抗体をスクリーニングした。
完全長ヒトメディン(50aa、図1A及びB)またはC末端ヒトペプチド(7aa、図1B)によるマウスの免疫によって対象とする抗メディンモノクローナル抗体のパネルを生成した。これら抗体のクローニングから生じるIgGを先ず、ヒトのラクトアドヘリンポリペプチド及びヒトメディンペプチド(50aa)への結合を測定するアッセイである二叉ELISAにて評価した。この最初の選抜の結果は、完全長メディンペプチドに対して作った抗体のほとんどすべてがメディン及びラクトアドヘリンの双方と結合できる一方で、C末端ペプチドに対して作った抗体は大部分メディンに特異的であることを明らかにした(データは示さず)。ELISAで使用されたラクトアドヘリンは合成ポリペプチドであり、正しく折り畳まれるとは思えなかったので、ネイティブのラクトアドヘリンを発現するヒトの乳癌細胞株であるMDA−MB−231細胞で追加のFACS試験を行った。興味深いことに、これらの試験の結果は、完全長のペプチドに対して作った抗体はラクトアドヘリンが細胞で発現され、正しく折り畳まれるとメディンと結合できないことを示した(データは示さず)。これらのデータは、メディンペプチドがラクトアドヘリン分子の内部に隠され、ラクトアドヘリンが誤って折り畳まれたまたは変性させられた場合にのみ露出する可能性があることを示唆した。
ELISA試験の結果は、一部の抗メディンモノクローナル抗体が完全長のラクトアドヘリン及び切断されたメディンペプチドに差別的に結合し得ることを示した。抗メディン抗体の選択性をさらに良く理解し、メディンのマルチマー形態またはオリゴマー形態も認識されるのかどうかを知るために、ウエスタンブロット解析を使用した。図3Aに示すように、市販の抗ラクトアドヘリン抗体の使用は約46kDaにて優勢なラクトアドヘリンのバンドを示したが、50aaのメディンペプチドを認識しなかった。しかしながら、抗メディン抗体6B3を使用すると、抗ラクトアドヘリン抗体で検出されたものに類似するバンドである明白なラクトアドヘリンのバンドが見られた(図3A及び3B)。対照的に、6B3はメディンの予測されるモノマー形態に相当する3〜4.5kDaのバンドを含むメディン試料における幾つかのバンドも認識した(図3B)。加えて、より高分子量の幾つかのより弱いメディンのバンドも観察された。メディンは凝集する傾向があるので、これらのバンドはメディンのマルチマーまたはオリゴマーを表すと思われる。完全長メディン抗体とC末端メディン抗体(6B3と18G1、図4)の比較はさらに、これらの抗体間での差異を強調した。6B3は50aaのメディンペプチドと同様にラクトアドヘリンペプチドに埋め込まれたメディンを認識した(図4A)のに対して、18G1は切断されたメディンペプチドしか認識しなかった(図4B)。18G1がメディンモノマー及びメディンのマルチマーの双方を認識する能力で6B3と同一に見えるのは注目に値する。
ヒト組織による抗メディン抗体の免疫組織化学的な性状分析
ELISA及びウエスタンブロットのデータは、抗メディン抗体が、生体内で見いだされ、大動脈のアミロイド斑に沈着すると考えられる予測された形態(Haggqvistら)である完全長のヒトメディンと結合できることを明瞭に示した。内在性のヒトメディンに対する6B3及び18G1の特異性をさらに評価するために、動脈瘤患者の胸部大動脈試料で一連の免疫組織化学試験を行った。染色の強度及びパターンは抗体特異的であると思われたが、これらの試験の結果は評価された抗メディン抗体はすべて内在性のメディンと結合できることを実証した。組織を染色するのに抗体6B3を使用した場合、免疫反応性は患者の動脈瘤における及びその周辺の領域に限局した。特に、6B3は密に凝集した物質またはアミロイド沈着物を高親和性で染色した。これらの沈着物が誤って折り畳まれたアミロイドタンパク質のマーカーであるチオフラビンSによっても染まったという知見は、6B3が以前記載された(Haggqvistら;Pengら)メディン凝集体を染めたことを示唆した。興味深いことに、6B3は、密な凝集体のごく近傍で見られる緩い原線維のチオフラビンS陰性の構造も染色した。これら沈着物の正確な性質は未知である一方で、これらはさらに大きなチオフラビンS陽性の構造体に集合するメディンのオリゴマーまたはマルチマーであるかもしれない可能性がある。
メディン及びラクトアドヘリンの結合アッセイ、組織染色及び他の試験管内アッセイ(データは示さず)から生成されたデータに基づいて、さらなる解析のために幾つかの抗体を選択した。第1の工程として、18G1及び6B3の可変領域の完全なアミノ酸配列を決定した(図5及び6)。この作業の結果は、メディンに対するそれらの親和性にもかかわらず、これらの抗体の間での差異を強調した。
抗メディンモノクローナル抗体の生成
RIBIアジュバント(Sigma Adjuvant System,Sigma−Aldrich)と共にKLHにコンジュゲートした10、25、または50μgの完全長のヒトメディン(図1A及びBを参照)(配列番号1)またはヒトC末端ペプチド(図1B)(配列番号2)によって毎週、4〜10週間、マウスを免疫した。融合の3〜4日前、完全長のヒトメディンについて最高力価で選択したマウスに対して生理食塩水溶液における免疫原の最終的なIV追加免疫を与えた。Kohler及びMilstein(Kohler and Milstein,1975)によって記載された改変された手順及び電気融合を用いて融合を行った。選択培地における融合細胞を96穴プレートに播き、ELISA選抜を用いて7〜10日後にスクリーニングした。
一次選抜として直接ELISA法を用いてハイブリドーマの選択を行った。手短には、96穴プレート(CostarのRIA/EIAプレート)を完全長のヒトメディン(図1B)で被覆し、室温で1時間インキュベートした。次いで1%BSA(ウシ血清アルブミン)/PBS(リン酸緩衝生理食塩水)によって室温でプレートをブロックした。約15分後、プレートを空にし、次いで融合プレートまたはクローニングプレートからの上清を加え、室温で1時間インキュベートした。インキュベートと洗浄緩衝液(PBS+0.05%のツイーン20)における洗浄の後、1:2,000に希釈し、室温で1時間インキュベートした西洋ワサビのペルオキシダーゼ(Jackson ImmunoResearch)にコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体によって抗体結合を検出した。次いで、基質としてのABTS(Thermo Scientific)によって西洋ワサビのペルオキシダーゼのレベルを視覚化し、マイクロプレートリーダーにて405nmで読み取った。約1.0OD単位のウェルを陽性と見なした。
ウエスタンブロット解析を用いて、完全長のメディンペプチド(図1A及びB)またはラクトアドヘリン(図1A)への抗メディンモノクローナル抗体のパネルの結合をさらに評価した。手短には、0.2−1ugのラクトアドヘリン(Sino Biologicals,Inc.;カタログ番号10853−H08B)またはメディンペプチド(American Peptide、カタログ番号:366587)を1×LDS試料緩衝液(Life Technologies)で希釈し、10%のNuPAGEビス−トリスゲルに負荷し、2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸緩衝液での90Vの定電圧で105分間の電気泳動に供した。電気泳動の後、SDS−PAGEゲルをニトロセルロース濾紙(iBlot、P7プログラム)上にブロットし、ブロッキング緩衝液(Licor)で30分間ブロックした。次いでブロッキング緩衝液中の0.5ug/mlのウサギ抗ラクトアドヘリン(Santa Cruz Biotech、カタログ番号sc−33546)またはマウス抗メディン抗体(6B3及び18G1を含む)にて室温で1時間(または4℃で一晩)、濾紙をインキュベートし、その後1×TBSによる10分間の洗浄を3回行った。ブロッキング緩衝液で1:20,000に希釈した適当なIRDye 800CWをコンジュゲートした二次抗体(ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ、Odyssey)に濾紙を入れた。室温で1時間二次抗体溶液にて濾紙をインキュベートした後、濾紙を洗浄し、Odyssey CLx赤外線撮像装置(Licor)で画像化した。
胸部大動脈瘤またはマルファン症候群の患者に由来するヒト大動脈試料を入手し、ホルマリンで固定し、パラフィンワックスに包埋し、5〜6μmの切片に切り、顕微鏡スライド上で集めた。染色時に、切片を載せたスライドを60℃で20分間乾燥させ、キシレンで処理し(2×10分間)、段階的な一連のエタノールすすぎによって再水和した。次いで、組織切片を0.01Mのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4;Sigma)で5分間すすぎ、グルコースオキシダーゼブロッキング溶液(Andrew et al.,J.Histochem.19:426)にて37℃で60分間インキュベートした。その後、スライドをPBSですすぎ(3×5分間)、6B3または18G1(1%BSA/0.3%トリトンX100/PBSにて.25〜1μg/mlに希釈された)のような抗メディン抗血清と共に4℃で24〜72時間インキュベートした。染色を視覚化するために切片をPBSで洗浄し(3×10分間)、次いで抗マウス標識ポリマーDAB染色システム(室温で30分間、Dako EnVision)と共にインキュベートした。10分間のDAB反応(100mgの3,3’−ジアミノベンジジン、250mlのTris、30μlの30%H2O2)の前に、切片をPBS(3×10分間)及び0.05MのTris(pH7.6、1×10分間)で洗浄した。次いで、切片をTrisに移し(2×5分間)、H2Oですすぎ(1分間)、Myerのヘマトキシリン(Dako)で染色した。次いでCytoseal 60(Richard Allen Scientific)で切片にカバースリップを載せた。追加の切片をヘマトキシリン工程の後にチオフラビンS(5分間、0.5g/50mlのH2O)で染色して組織にて凝集したアミロイド沈着物を視覚化した。これらのスライドを70%エタノール(5分間)及びH2O(2×30秒間)ですすぎ、Prolong Gold(Life Technologies)でカバースリップを載せた。スライドを明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡によって視覚化し、MetaMorphソフトウエアを用いてデジタル画像を取得した。
GE Healthcareの抗マウスキットで提供された指示書に従って、アミンのカップリングを介して抗マウス抗体(GE Healthcare)をセンサーチップC5(デキストラン鎖を欠く)上に不動化した。次いで、30〜50RUにて検体の最大結合を確保するレベルで対象とする抗メディンモノクローナル抗体をチップ上に捕捉した。広げた濃度範囲の大きさに応じて、2倍または3倍の希釈でランニング緩衝液(HEPES緩衝生理食塩水+0.05%P−20、1mg/mlのBSA)にて30ul/分で捕捉されたリガンド上に種々の濃度の検体、完全長のヒトメディン(50aa、図1A及びB)を通した。各濃度について、さらに高い検体濃度が会合の間に平衡に達するのに、ならびに少なくとも10%のシグナルが解離の間に崩壊するのに必要とされる時間の間、反応は進行した。少なくとも1つの濃度(最高または最低ではない)を2つ組で実行した。検体の濃度範囲は、KDを少なくとも10倍上回るからKDを10倍下回るに及ぶ予備実験に基づいて選択した。データは、メディン抗体を含有しない無関係なセンサー及び抗マウスセンサーからの抗体の解離を説明するメディンの0nM濃度の双方を二重参照した。次いでBiacoreソフトウエアを用いて全体的な1:1の適合でデータを解析した。
各メディンモノクローナル抗体の可変ドメインの配列を決定するために、Oligotex Direct mRNAミニキット(Qiagenカタログ番号72022)を用いて1×107個のハイブリドーマ細胞から全mRNAを抽出した。次いで80μgの全mRNAを鋳型として用い、Marathon cDNA増幅キット(Clontechカタログ番号634913)を用いて二本鎖cDNAを生成した。配列決定用に可変領域重鎖(VH)及び可変領域軽鎖(VL)のDNAを増幅するために、VH及びVL双方の増幅のための5’プライマーとしてMarathon cDNA増幅キットに含まれている万能アダプタープライマーを用いることによってPCRを行った。対象とする抗メディンモノクローナル抗体はカッパ軽鎖を有するので、CK 3’プライマーACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG(配列番号19)をVLのPCR増幅に用いた。VHの増幅については、以下の3’プライマーをそれぞれ用いた:
18G1(重鎖はガンマ2aである):
GGATCCCGGGAGTGGATAGACCGATGG(配列番号20)
6B3(重鎖はガンマ2bである):
GGATCCCGGGAGTGGATAGACTGATGG(配列番号21)
ヒト化のための出発点またはドナー抗体はマウス抗体6B3だった。成熟m6B3の重鎖可変アミノ酸配列は配列番号11として提供されている。成熟m6B3の軽鎖可変アミノ酸配列は配列番号29として提供されている。重鎖のKabat/Chothia複合のCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号12〜14として提供されている。軽鎖のKabatのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号16〜18として提供されている。全体を通してKabatの番号付けが使用されている。
ヒト化のための出発点またはドナー抗体はマウス抗体18G1だった。成熟m18G1の重鎖可変のアミノ酸配列は配列番号3として提供される。成熟m18G1の軽鎖可変のアミノ酸配列は配列番号36として提供される。重鎖のKabat/Chothia複合のCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号4〜6として提供される。軽鎖のKabatのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号8〜10として提供される。全体を通してKabatの番号付けが使用される。
Claims (108)
- ヒトメディンへの結合について抗体18G1または6B3と競合する単離されたモノクローナル抗体。
- ヒトメディンにて18G1または6B3と同じエピトープに結合する、請求項1に記載の抗体。
- メディンと特異的に結合し、且つネイティブのラクトアドヘリンには特異的に結合しない、請求項2に記載の抗体。
- メディンと特異的に結合し、且つMDA−MB−231細胞上に発現されたネイティブのラクトアドヘリンには特異的に結合しない、請求項2に記載の抗体。
- メディンがラクトアドヘリンから切断される際に作り出される新エピトープを特異的に認識する、請求項2に記載の抗体。
- モノマーまたはオリゴマーのメディンと特異的に結合し、且つ密に凝集したメディンまたはメディンの沈着物には特異的に結合しない、請求項2に記載の抗体。
- 密に凝集したメディンまたはメディンの沈着物と特異的に結合し、且つモノマーまたはオリゴマーのメディンには特異的に結合しない、請求項2に記載の抗体。
- モノクローナル抗体18G1の3つの軽鎖CDRと3つの重鎖CDRとを含み、18G1が、配列番号3を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号36を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 前記3つの重鎖CDRがKabat/Chothia複合によって定義されたとおりであり(配列番号4、5及び6)、且つ前記3つの軽鎖CDRがKabat/Chothia複合によって定義されたとおりである(配列番号8、9及び10)、請求項8に記載の抗体。
- モノクローナル抗体6B3の3つの軽鎖CDRと3つの重鎖CDRとを含み、6B3が、配列番号11を含むアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号29を含むアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 前記3つの重鎖CDRがKabat/Chothia複合によって定義されたとおりであり(配列番号12、13及び14)、且つ前記3つの軽鎖CDRがKabat/Chothia複合によって定義されたとおりである(配列番号16、17及び18)、請求項10に記載の抗体。
- 18G1またはそのキメラ形態、ベニア化(veneered)形態またはヒト化形態である、請求項1に記載の抗体。
- 6B3またはそのキメラ形態、ベニア化形態またはヒト化形態である、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体がヒト化抗体である、先行請求項のいずれか1項に記載の抗体。
- ヒトメディンに特異的に結合するヒト化またはキメラの18G1抗体であり、その際、18G1が、配列番号3の成熟重鎖可変領域と配列番号36の成熟軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である、請求項12に記載の抗体。
- 18G1の前記3つの重鎖CDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域と18G1の前記3つの軽鎖CDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項15に記載のヒト化抗体。
- 前記CDRがKabat、Chothia、Kabat/Chothia複合、AbM及びContactの群から選択される定義のものである、請求項16に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が18G1の前記3つのKabat/Chothia複合の重鎖CDR(配列番号4〜6)を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が18G1の前記3つのKabat/Chothia複合の軽鎖CDR(配列番号8〜10)を含む、請求項16に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が18G1の前記3つのKabat重鎖CDR(CDR−H1配列番号4の残基6〜10;CDR−H2配列番号5、CDR−H3配列番号6)を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が18G1の前記3つのKabat軽鎖CDR(配列番号8〜10)を含む、請求項17に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が18G1の前記3つのChothia重鎖CDR(CDR−H1配列番号4の残基1〜7;CDR−H2配列番号5の残基3〜8、CDR−H3配列番号6)を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が18G1の前記3つのChothia軽鎖CDR(配列番号8〜10)を含む、請求項17に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が18G1の前記3つのAbM重鎖CDR(CDR−H1配列番号4;CDR−H2配列番号5の残基1〜10、CDR−H3配列番号6)を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が18G1の前記3つのAbM軽鎖CDR(配列番号8〜10)を含む、請求項17に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が18G1の前記3つのContact重鎖CDR(CDR−H1配列番号3の残基30〜35;CDR−H2配列番号3の残基47〜59、CDR−H3配列番号3の残基97〜108)を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が18G1の前記3つのContact軽鎖CDR(CDR−L1配列番号36の残基30〜36;CDR−L2配列番号36の残基46〜55、CDR−L3配列番号36の残基89〜96)を含む、請求項16に記載のヒト化抗体。
- 配列番号34〜35のいずれか1つに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と配列番号37〜39のいずれか1つに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項15〜22のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 以下の位置の少なくとも1つが特定されるようなアミノ酸によって占有される:L3位がVによって占有され、L10位がSによって占有され、L13位がVによって占有され、L15位がPによって占有され、L19位がAによって占有され、L20位がSによって占有され、L22位がSによって占有され、L42位がQによって占有され、L70位がDによって占有され、L77位がRによって占有され、L78位がVによって占有され、L80位がAによって占有され、及びL85位がVによって占有される、請求項23に記載のヒト化抗体。
- 以下の位置の少なくとも1つが特定されるようなアミノ酸によって占有される:L3位がVによって占有され、L10位がSによって占有され、L13位がVによって占有され、L15位がPによって占有され、L19位がAによって占有され、L20位がSによって占有され、L22位がSによって占有され、L24位がKによって占有され、L28位がNによって占有され、L29位がVによって占有され、L42位がQによって占有され、L46位がLによって占有され、L70位がDによって占有され、L77位がRによって占有され、L78位がVによって占有され、L80位がAによって占有され、及びL85位がVによって占有される、請求項17に記載のヒト化抗体。
- L3、L10、L13、L15、L19、L20、L22、L42、L70、L77、L78、L80、及びL85位がそれぞれV、S、V、P、A、S、S、Q、D、R、V、A、及びVによって占有されるという条件である、請求項24に記載のヒト化抗体。
- 以下の位置の少なくとも1つが特定されるようなアミノ酸によって占有される:H1がEまたはQによって占有され、H5位がVまたはQによって占有され、H13位がQまたはKによって占有され、H19位がRまたはKによって占有され、H40位がAまたはTによって占有され、H42位がGまたはDによって占有され、H44位がGまたはRによって占有され、H49位がSまたはAによって占有され、H77位がSまたはTによって占有され、H82a位がNまたはSによって占有され、H83位がRまたはKによって占有され、H84位がAまたはSによって占有され、H89位がVまたはMによって占有され、H93がVまたはAによって占有され、H108位がTまたはMによって占有され、L45位がQによって占有され、L60位がDによって占有され、及びL83位がLによって占有される、請求項23〜26のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 以下の位置の少なくとも1つが特定されるようなアミノ酸によって占有される:H1位がEまたはQによって占有され、H5位がVまたはQによって占有され、H13位がQまたはKによって占有され、H19位がRまたはKによって占有され、H40位がAまたはTによって占有され、H42位がGまたはDによって占有され、H44位がGまたはRによって占有され、H49位がSまたはAによって占有され、H50位がGによって占有され、63位がTによって占有され、H77位がSまたはTによって占有され、H82a位がNまたはSによって占有され、H83位がRによって占有され、H84位がAによって占有され、H89位がVまたはMによって占有され、H93がVまたはAによって占有され、H108位がTまたはMによって占有される、請求項17または25に記載のヒト化抗体。
- H1、H5、H13、H19、H40、H42、H44、H49、H77、H82a、H83、H84、H89、H93、及びH108位がそれぞれE、V、Q、R、A、G、G、S、S、N、R、A、V、V、及びTによって占有されるという条件である、請求項27に記載のヒト化抗体。
- L45位、L60位及びL83位の少なくとも1つがそれぞれQ、D及びLによって占有されるという条件である、請求項27に記載のヒト化抗体。
- L45位がQによって占有されるという条件である、請求項27に記載のヒト化抗体。
- L60位及びL83位がそれぞれD及びLによって占有されるという条件である、請求項27に記載のヒト化抗体。
- 配列番号34〜35のいずれか1つに対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号38〜39のいずれか1つに対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項23に記載のヒト化抗体。
- 配列番号34〜35のいずれか1つに対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号38〜39のいずれか1つに対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項33に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号34〜35のいずれかのアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号38〜39のいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項34に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号34のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号38のアミノ酸配列を有する、請求項35に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号34のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号39のアミノ酸配列を有する、請求項35に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号35のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号38のアミノ酸配列を有する、請求項35に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号35のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号39のアミノ酸配列を有する、請求項35に記載のヒト化抗体。
- ヒトメディンに特異的に結合するヒト化またはキメラの6B3抗体であり、その際、6B3は、配列番号11の成熟重鎖可変領域と配列番号29の成熟軽鎖可変領域とを特徴とするマウス抗体である、請求項35に記載の抗体。
- 6B3の前記3つの重鎖CDRを含むヒト化成熟重鎖可変領域と6B3の前記3つの軽鎖CDRを含むヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項40に記載のヒト化抗体。
- 前記CDRがKabat、Chothia、Kabat/Chothia複合、AbM及びContactの群から選択される定義のものである、請求項41に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が6B3の前記3つのKabat/Chothia複合の重鎖CDR(配列番号12〜14)を含み、且つ前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が6B3の前記3つのKabat/Chothia複合の軽鎖CDR(配列番号16〜18)を含む、請求項42に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が6B3の前記3つのKabatの重鎖CDR(CDR−H1配列番号12の残基6〜12;CDR−H2配列番号13、CDR−H3配列番号14)を含み、且つ前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が6B3の前記3つのKabatの軽鎖CDR(配列番号16〜18)を含む、請求項42に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が6B3の前記3つのChothiaの重鎖CDR(CDR−H1配列番号12の残基1〜9;CDR−H2配列番号13の残基3〜7、CDR−H3配列番号14)を含み、且つ前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が6B3の前記3つのChothiaの軽鎖CDR(配列番号16〜18)を含む、請求項42に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が6B3の前記3つのAbMの重鎖CDR(CDR−H1配列番号12;CDR−H2配列番号13の残基1〜9、CDR−H3配列番号14)を含み、且つ前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が6B3の前記3つのAbMの軽鎖CDR(配列番号16〜18)を含む、請求項42に記載のヒト化抗体。
- 前記ヒト化成熟重鎖可変領域が6B3の前記3つのContactの重鎖CDR(CDR−H1配列番号11の残基30〜37;CDR−H2配列番号11の残基49〜60、CDR−H3配列番号11の残基98〜106)を含み、前記ヒト化成熟軽鎖可変領域が6B3の前記3つのContactの軽鎖CDR(CDR−L1配列番号29の残基30〜36;CDR−L2配列番号29の残基46〜55、CDR−L3配列番号29の残基89〜96)を含む、請求項42に記載のヒト化抗体。
- 配列番号26〜28のいずれか1つに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟重鎖可変領域と配列番号31〜32のいずれか1つに対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するヒト化成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項40〜47のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 以下の位置の少なくとも1つが特定されるようなアミノ酸によって占有される:H3がQによって占有され、H5がQによって占有され、H10がGによって占有され、H15がSによって占有され、及びH19がSによって占有される、請求項48に記載のヒト化抗体。
- H3、H5、H10、H15、及びH19位がそれぞれQ、Q、G、S、及びSによって占有されるという条件である、請求項49に記載のヒト化抗体。
- 以下の位置の少なくとも1つが特定されるようなアミノ酸によって占有される:位置:H1がEまたはQによって占有され、H44がGによって占有され、H48がIまたはLによって占有され、H49がGまたはAによって占有され、H67がVまたはLによって占有され、H78がFまたはVによって占有され、H79がSまたはVによって占有され、H81がKまたはTによって占有され、H82がLまたはMによって占有され、H82aがSまたはTによって占有され、H82bがSまたはNによって占有され、H82cがVまたはMによって占有され、H83がTまたはDによって占有され、H84がAまたはPによって占有され、H85がAまたはVによって占有され、H89がVまたはTによって占有され、H108がTまたはLによって占有され、L71がYまたはFによって占有され、L87がFまたはYによって占有され、L100がQまたはGによって占有され、及びL104がLまたはVによって占有される、請求項48〜50のいずれかに記載のヒト化抗体。
- 以下の位置の少なくとも1つが特定されるようなアミノ酸によって占有される:位置:H1がEまたはQによって占有され、H35がGによって占有され、H35bがGによって占有され、H44がGまたはAによって占有され、H48がIまたはLによって占有され、H49がGまたはAによって占有され、H50がHによって占有され、H58がYによって占有され、H60がNによって占有され、H61がIによって占有され、H62がAによって占有され、H65がNによって占有され、H67がVまたはLによって占有され、H78がFまたはVによって占有され、H79がSまたはVによって占有され、H81がKまたはTによって占有され、H82がLまたはMによって占有され、H82aがSまたはTによって占有され、H82bがSまたはNによって占有され、H82cがVまたはMによって占有され、H83がTまたはDによって占有され、H84がAまたはPによって占有され、H85がAまたはVによって占有され、H89がVまたはTによって占有され、H102がYによって占有され、H108がTまたはLによって占有され、L71がYまたはFによって占有され、L87がFまたはYによって占有され、L100がQまたはGによって占有され、及びL104がLまたはVによって占有される、請求項42に記載のヒト化抗体。
- H1、H44、H79、H81、H82、H82b、H82c、H83、H84、H85、及びH89位がそれぞれE、G、S、K、L、S、V、T、A、A、及びVによって占有されるという条件である、請求項51に記載のヒト化抗体。
- H48、H49、H67、H78、H82a、及びH108位がそれぞれI、G、V、F、S、及びTによって占有されるという条件である、請求項53に記載のヒト化抗体。
- L71、L87、L100、及びL104がそれぞれY、F、Q、及びLによって占有されるという条件である、請求項51に記載のヒト化抗体。
- 配列番号26〜28の少なくとも1つに対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号31〜32の少なくとも1つに対して少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項48に記載のヒト化抗体。
- 配列番号26〜28に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域と配列番号31〜32に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を有する成熟軽鎖可変領域とを含む、請求項56に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号26〜28のいずれかのアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号31〜32のいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項57に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号26のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号31のアミノ酸配列を有する、請求項58に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号26のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号32のアミノ酸配列を有する、請求項58に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号27のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号31のアミノ酸配列を有する、請求項58に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号27のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号32のアミノ酸配列を有する、請求項58に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号28のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号31のアミノ酸配列を有する、請求項58に記載のヒト化抗体。
- 前記成熟重鎖可変領域が配列番号28のアミノ酸配列を有し、且つ前記成熟軽鎖可変領域が配列番号32のアミノ酸配列を有する、請求項58に記載のヒト化抗体。
- 前記抗体がキメラ抗体である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体がベニア化抗体である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体。
- インタクトな抗体である、請求項1〜66のいずれか1項に記載の抗体。
- 結合断片である、請求項1〜66のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記結合断片が単鎖抗体、Fab、またはFab’2の断片である、請求項68に記載の抗体。
- Fab断片または単鎖Fvである、請求項1〜66のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記アイソタイプがヒトIgG1である、先行請求項のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合され、且つ前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合される、請求項15〜64及び66〜71のいずれか1項に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖定常領域が、天然のヒト重鎖定常領域に比べてFcγ受容体への結合が低下している前記天然のヒト重鎖定常領域の変異形態である、請求項72に記載のヒト化抗体。
- 前記重鎖定常領域がIgG1アイソタイプのものである、請求項72または73に記載のヒト化抗体。
- 前記定常領域にて少なくとも1つの突然変異を有する、先行請求項のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記突然変異が前記定常領域による補体結合または補体の活性化を低下させる、請求項75に記載の抗体。
- EU番号付けによる241、264、265、270、296、297、318、320、322、329及び331位の1以上にて突然変異を有する、請求項76に記載の抗体。
- 318位、320位及び322位にてアラニンを有する、請求項77に記載の抗体。
- 前記アイソタイプがヒトのIgG2またはIgG4のアイソタイプのものである、請求項1〜73のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体が少なくとも95%w/w純粋である、請求項1〜79のいずれか1項に記載の抗体。
- 前記抗体が治療剤または細胞傷害剤にコンジュゲートされる、先行請求項のいずれかに記載の抗体。
- 請求項1〜81のいずれかに定義の抗体と薬学上許容できる担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1〜82のいずれか1項に記載の抗体の前記重鎖及び/または軽鎖をコードする核酸。
- 請求項83に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項84に記載の組換え発現ベクターによって形質転換される宿主細胞。
- マウス抗体をヒト化する方法であって、前記方法が、
(a)1以上のアクセプター抗体を選択することと;
(b)保持される前記マウス抗体のアミノ酸残基を特定することと;
(c)前記マウス抗体の重鎖のCDRを含むヒト化重鎖をコードする核酸と、前記マウス抗体の軽鎖のCDRを含むヒト化軽鎖をコードする核酸とを合成することと;
(d)宿主細胞にて前記核酸を発現させてヒト化抗体を産生させることとを含み、
その際、前記マウス抗体は6B3または18G1であり、6B3は配列番号11の成熟重鎖可変領域と配列番号29の成熟軽鎖可変領域とを特徴とし、18G1は配列番号3の成熟重鎖可変領域と配列番号36の成熟軽鎖可変領域とを特徴とする、前記方法。 - ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニア化抗体の産生方法であって、前記方法が
(a)細胞が前記抗体を分泌するように、前記抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸で形質転換された前記細胞を培養することと;
(b)細胞培養培地から前記抗体を精製することとを含み、
その際、前記抗体が、6B3または18G1のヒト化形態、キメラ形態またはベニア化形態である、前記産生方法。 - ヒト化抗体、キメラ抗体またはベニア化抗体を産生する細胞株の作出方法であって、前記方法が、
(a)抗体の重鎖及び軽鎖ならびに選択可能なマーカーをコードするベクターを細胞に導入することと;
(b)増えたコピー数の前記ベクターを有する細胞を選択する条件下で前記細胞を増殖させることと;
(c)前記選択した細胞から単一細胞を単離することと;
(d)抗体の収率に基づいて選択される単一細胞からクローニングされる細胞を貯めることとを含み、
その際、前記抗体は6B3または18G1のヒト化形態、キメラ形態またはベニア化形態である、前記作出方法。 - 選択的条件下で前記細胞を増殖させることと、自然に発現し、少なくとも100mg/L/106個の細胞/24時間を分泌する細胞株をスクリーニングすることとをさらに含む、請求項88に記載の方法。
- メディンが介在するアミロイドーシスを有するまたはそれを発症するリスクがある対象にてメディンの凝集を阻害するまたは低減する方法であって、請求項1〜82のいずれか1項に記載の抗体の有効な投薬計画を前記対象に行い、それによって前記対象にてメディンの凝集を阻害するまたは低減する、前記方法。
- 前記アミロイドーシスが大動脈中膜アミロイドである、請求項90に記載の方法。
- 前記抗体が6B3のヒト化バージョンである、請求項91に記載の方法。
- 前記抗体が18G1のヒト化バージョンである、請求項91に記載の方法。
- 対象にてメディンの凝集または沈着に関連する疾患を治療するまたはその予防を達成する方法であって、請求項1〜82のいずれか1項により定義される抗体の有効な投薬計画を行い、それによって前記疾患を治療するまたはその予防を達成する、前記方法。
- 前記疾患または疾病が膵炎、狼瘡、アルツハイマー病、肥満症、心疾患、マルファン症候群、大動脈瘤、または血管系を冒す炎症性の状態である、請求項94に記載の方法。
- 前記疾患が血管系を冒す炎症性の状態である、請求項95に記載の方法。
- 前記疾患が巨細胞性動脈炎である、請求項96に記載の方法。
- 前記対象がマルファン症候群であると診断されている、請求項94に記載の方法。
- 前記対象が大動脈瘤についての1以上のリスク因子を有する、請求項94に記載の方法。
- 前記対象が、喫煙、高血圧症、アテローム性硬化症、二尖大動脈弁及び遺伝性結合組織障害のリスク因子の1以上を有する、請求項99に記載の方法。
- 前記疾患が大動脈瘤である、請求項100に記載の方法。
- 大動脈瘤を有するまたはそのリスクがある対象にて大動脈中膜アミロイドの形成を低減する方法であって、有効量の請求項1〜82のいずれか1項により定義される抗体を前記対象に投与し、それによって前記対象にて大動脈中膜アミロイドの形成を低減することを含む、前記方法。
- 大動脈瘤を有するまたはそのリスクがある対象にてメディンの凝集を阻害するまたは大動脈中膜アミロイドを低減する方法であって、有効量の請求項1〜82のいずれか1項により定義される抗体を前記対象に投与し、それによって前記対象にてメディンの凝集を阻害するまたは大動脈中膜アミロイドを低減することを含む、前記方法。
- 前記抗体が18G1のヒト化バージョンである、請求項103に記載の方法。
- 前記抗体が6B3のヒト化バージョンである、請求項103に記載の方法。
- 大動脈中膜アミロイドを有する対象における大動脈の弾力性の改善方法であって、有効量の請求項1〜82のいずれか1項により定義される抗体を前記対象に投与し、それによって前記対象にて大動脈の弾力性を改善することを含む、前記改善方法。
- 前記対象が胸部大動脈にて大動脈中膜アミロイドを有する、請求項106に記載の方法。
- メディンの凝集または沈着に関連する疾患を有するまたはそのリスクがある対象における大動脈中膜アミロイドの検出方法であって、抗体が大動脈中膜アミロイドに結合する、有効量の請求項1〜82のいずれか1項により定義される前記抗体を前記対象に投与することと、前記対象にて結合した抗体を検出することとを含む、前記検出方法。
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