KR102471787B1 - 타우 인식 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 타우에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는 타우 연관된 병리학 및 연관된 증상성 악화를 저해하거나 지연시킨다.

Description

타우 인식 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 5월 2일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/330,789호(모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)에 관한 것이다.
서열 목록에 대한 참조
파일 497107SEQLIST.txt로 작성된 서열 목록은 65킬로바이트이고, 2017년 5월 2일자로 출원되고, 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
타우(tau)는 인산화된 형태로 존재할 수 있는 널리 공지된 인간 단백질이다(예를 들어, 문헌[Goedert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4051-4055(1988); Goedert, EMBO J. 8:393-399(1989); Lee, Neuron 2:1615-1624(1989); Goedert, Neuron 3:519-526(1989); Andreadis, Biochemistry 31:10626-10633(1992) 참조). 타우는 특히 중추 신경계에서 미세소관을 안정화시키는 데 역할을 하는 것으로 보고되었다. 총 타우(t-타우, 즉, 인산화된 및 비인산화된 형태) 및 포스포-타우(p-타우, 즉, 인산화된 타우)는 뉴런 손상 및 신경퇴행에 반응하여 뇌에 의해 방출되고, 일반 집단과 비교하여 알츠하이머 환자의 CSF에서의 증가된 수준으로 발생하는 것으로 보고되었다(Jack et al., Lancet Neurol 9: 119-28 (2010)).
타우는 플라크와 함께 알츠하이머병에 특징적인 특질인 신경섬유 매듭의 주요 구성성분이다. 매듭은 80㎚의 규칙적인 주기성으로 나선 방식으로 감긴 쌍으로 발생하는 직경 10㎚로 측정되는 비정상 피브릴을 구성한다. 신경섬유 매듭 내의 타우는 분자에서 특정한 부위에 부착된 포스페이트기에 의해 비정상적으로 인산화(과인산화)된다. 신경섬유 매듭의 몇몇 관여는 알츠하이머병에서 내후각 피질의 II층 뉴런, 해마의 CA1 및 해마 이행부 영역, 편도체 및 신피질의 더 깊은 층(III층, V층 및 표피 VI층)에서 보인다. 과인산화된 타우는 또한 뉴런 네트워크 분해를 촉진할 수 있는 미세소관 어셈블리를 방해하는 것으로 보고되었다.
타우 포함은 알츠하이머병, 전측두엽 변성, 진행성 핵상 마비 및 픽병을 포함하는 몇몇 신경퇴행성 질환의 한정하는 신경병리학의 부분이다.
일 양태에서, 본 발명은 타우에 특이적으로 결합하는 단리된 단일클론 항체를 제공한다. 이러한 항체의 예는 (서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응하는) 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기 내의 에피토프에 결합한다.
몇몇 이러한 항체는 인간 타우에 대한 결합에 대해 항체 3D6과 경쟁한다. 몇몇 이러한 항체는 인간 타우에서 3D6과 동일한 에피토프에 결합한다.
몇몇 항체는 단일클론 항체 3D6의 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하고, 3D6은 서열 번호 7을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 11을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 마우스 항체이다. 몇몇 항체에서, 3개의 중쇄 CDR은 카밧/쵸티아 컴포지트(서열 번호 8, 9 및 10)에 의해 정의된 바와 같고, 3개의 경쇄 CDR은 카밧/쵸티아 컴포지트(서열 번호 12, 13 및 14)에 의해 정의된 바와 같다.
예를 들어, 항체는 3D6 또는 이의 키메라, 비니어드(veneered) 또는 인간화된 형태일 수 있다. 몇몇 이러한 항체에서, 가변 중쇄는 인간 서열에 85% 이상의 동일성을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, 가변 경쇄는 인간 서열에 85% 이상의 동일성을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 각각은 인간 생식선 서열에 85% 이상의 동일성을 갖는다.
몇몇 이러한 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 카밧/쵸티아 컴포지트(서열 번호 8, 9 및 10)에 의해 정의된 바와 같은 3개의 중쇄 CDR을 포함하고, 3개의 경쇄 CDR은 카밧/쵸티아 컴포지트(서열 번호 12, 13 및 14)에 의해 정의된 바와 같고; 단 H27 위치는 F 또는 Y에 의해 점유되고, H28 위치는 N 또는 T에 의해 점유되고, H29는 I 또는 F에 의해 점유되고, H30은 K 또는 T에 의해 점유되고, H51 위치는 I 또는 V에 의해 점유되고, H54 위치는 N 또는 D에 의해 점유되고, H60 위치는 D 또는 A에 의해 점유되고, H61은 P 또는 E에 의해 점유되고, H102는 F 또는 Y에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 58을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 59를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 60을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H2는 서열 번호 43을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H2는 서열 번호 61을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H2는 서열 번호 62를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H2는 서열 번호 63을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H2는 서열 번호 64를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H3은 서열 번호 65를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 이러한 항체에서, 항체는 인간화된 항체이다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열 번호 43을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열 번호 61을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열 번호 64를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열 번호 63을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H3은 서열 번호 65를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 58을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열 번호 62를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 59를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열 번호 63을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR-H1은 서열 번호 60을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, CDR-H2는 서열 번호 62를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체는 인간 타우에 특이적으로 결합하는 인간화된 또는 키메라 3D6 항체이고, 3D6은 서열 번호 7의 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 11의 성숙 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 마우스 항체이다. 몇몇 이러한 항체는 3D6의 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역 및 3D6의 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체이다. 몇몇 이러한 항체에서, CDR은 카밧, 쵸티아, 카밧/쵸티아 컴포지트, AbM 및 컨택트의 그룹으로부터 선택된 정의에 있다.
몇몇 이러한 항체에서, 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 카밧/쵸티아 컴포지트 경쇄 CDR(서열 번호 8 내지 10)을 포함하고, 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 카밧/쵸티아 컴포지트 경쇄 CDR(서열 번호 12 내지 14)을 포함한다.
몇몇 이러한 항체에서, 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 카밧 중쇄 CDR(서열 번호 32, 서열 번호 9 및 서열 번호 10)을 포함하고, 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 카밧 경쇄 CDR(서열 번호 12 내지 14)을 포함한다.
몇몇 이러한 항체에서, 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 쵸티아 중쇄 CDR(서열 번호 33, 서열 번호 34 및 서열 번호 10)을 포함하고, 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 쵸티아 경쇄 CDR(서열 번호 12 내지 14)을 포함한다.
몇몇 이러한 항체에서, 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 AbM 중쇄 CDR(서열 번호 8, 서열 번호 35 및 서열 번호 10)을 포함하고, 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 AbM 경쇄 CDR(서열 번호 12 내지 14)을 포함한다.
몇몇 이러한 항체에서, 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 컨택트 중쇄 CDR(서열 번호 39 내지 41)을 포함하고, 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역은 3D6의 3개의 컨택트 경쇄 CDR(서열 번호 36 내지 38)을 포함한다.
몇몇 항체에서, H17 위치가 T 또는 S일 수 있고, H20 위치가 I 또는 V일 수 있다는 것을 제외하고는, 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15 내지 19 및 서열 번호 46 내지 57 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖고, 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20 내지 23 중 임의의 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 이러한 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H38은 R에 의해 점유되고, H93은 S에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체에서, VH 영역에서의 H38 및 H93 위치는 각각 R 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 이러한 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H38은 R에 의해 점유되고, H43은 Q에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유되고, H93은 S에 의해 점유된다. 몇몇 이러한 항체에서, VH 영역에서의 H38, H43, H83 및 H93 위치는 각각 R, Q, T 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H12는 V에 의해 점유되고, H24는 A에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H67은 A에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H81은 Q에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H48, H67, H80, H81 및 H91 위치는 각각 V, A, I, A, L, Q 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H13은 R에 의해 점유되고, H66은 K에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H13 및 H66 위치는 각각 R 및 K에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H40은 R에 의해 점유되고, H82a는 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H40 및 H82a 위치는 각각 R 및 G에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H42는 E에 의해 점유되고, H76은 N에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H42 및 H76 위치는 각각 E 및 N에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H40은 R에 의해 점유되고, H82a는 G에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H40, H82a 및 H83 위치는 각각 R, G 및 T에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12 위치는 V에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H80 위치는 L에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H24는 A에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H67은 A에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H24, H48, H67, H80 및 H91 위치는 각각 A, I, A, L 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H43은 Q에 의해 점유되고, H81은 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H43 및 H81 위치는 각각 Q 및 Q에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H24는 A에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H24 및 H91 위치는 각각 A 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H13은 R에 의해 점유되고, H17은 L에 의해 점유되고, H29는 F에 의해 점유되고, H42는 E에 의해 점유되고, H43은 Q에 의해 점유되고, H61은 E에 의해 점유되고, H76은 N에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H81은 Q에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H13, H17, H29, H42, H43, H61, H76, H80 및 H81 위치는 각각 R, L, F, E, Q, E, N, L 및 Q에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H24는 A에 의해 점유되고, H28은 T에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H54는 D에 의해 점유되고, H60은 A에 의해 점유되고, H67은 A에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H24, H28, H48, H54, H60, H67, H80 및 H91 위치는 각각 A, T, I, D, A, A, L 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H10은 D에 의해 점유되고, H17은 L에 의해 점유되고, H24는 A에 의해 점유되고, H28은 T에 의해 점유되고, H43은 Q에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H60은 A에 의해 점유되고, H61은 E에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유되고, H108은 T에 의해 점유되고, H109는 L에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H10, H17, H24, H28, H43, H48, H60, H61, H91, H108 및 H109 위치는 각각 D, L, A, T, Q, I, A, E, F, T 및 L에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H17은 L에 의해 점유되고, H27은 Y에 의해 점유되고, H29는 F에 의해 점유되고, H61은 E에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H17, H27, H29 및 H61 위치는 각각 L, Y, F 및 E에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H17은 L에 의해 점유되고, H27은 Y에 의해 점유되고, H29는 F에 의해 점유되고, H61은 E에 의해 점유되고, H76은 N에 의해 점유되고, H82a는 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H17, H27, H29, H61, H76, 및 H82a 위치는 각각 L, Y, F, E, N 및 G에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H12는 V에 의해 점유되고, H17은 L에 의해 점유되고, H24는 A에 의해 점유되고, H43은 Q에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H17, H24, H43, H48, H83 및 H91 위치는 각각 V, L, A, Q, I, T, F에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H12는 V에 의해 점유되고, H24는 A에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H67은 A에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H48, H67, H80, H83 및 H91 위치는 각각 V, A, I, A, L, T 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H10은 E 또는 D에 의해 점유되고, H12는 K 또는 V에 의해 점유되고, H13은 K 또는 R에 의해 점유되고, H17은 T, L 또는 S에 의해 점유되고, H24는 V 또는 A에 의해 점유되고, H27은 F 또는 Y에 의해 점유되고, H28은 N 또는 T에 의해 점유되고, H29는 I 또는 F에 의해 점유되고, H30은 K 또는 T에 의해 점유되고, H38은 Q 또는 R에 의해 점유되고, H40은 A 또는 R에 의해 점유되고, H42는 G 또는 E에 의해 점유되고, H43은 K 또는 Q에 의해 점유되고, H48은 M 또는 I에 의해 점유되고, H51은 V 또는 I에 의해 점유되고, H54는 N 또는 D에 의해 점유되고, H60은 D 또는 A에 의해 점유되고, H61은 P 또는 E에 의해 점유되고, H66은 R 또는 K에 의해 점유되고, H67은 V 또는 A에 의해 점유되고, H76은 D 또는 N에 의해 점유되고, H80은 M 또는 L에 의해 점유되고, H81은 E 또는 Q에 의해 점유되고, H82a는 S 또는 G에 의해 점유되고, H83은 T 또는 R에 의해 점유되고, H91은 Y 또는 F에 의해 점유되고, H93은 A 또는 S에 의해 점유되고, H102는 F 또는 Y에 의해 점유되고, H108은 T 또는 L에 의해 점유되고, H109는 L 또는 V에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H13, H17, H24, H38, H42, H43, H48, H66, H67, H76, H80, H81, H83, H91 및 H93 위치는 각각 V, R, L, A, R, E, Q, I, K, A, N, L, Q, T, F 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H38, H42, H43, H76, H83 및 H93 위치는 각각 R, E, Q, N, T 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H13, H17, H24, H38, H40, H42, H43, H48, H66, H67, H76, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 각각 V, R, L, A, R, R, E, Q, I, K, A, N, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H38, H40, H43, H48, H67, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 각각 V, A, R, R, Q, I, A, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H28, H38, H40, H43, H48, H54, H60, H67, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 각각 V, A, T, R, R, Q, I, D, A, A, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H28, H38, H40, H48, H51, H54, H60, H67, H80, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 각각 V, A, T, R, R, I, V, D, A, A, L, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H28, H38, H40, H48, H54, H60, H67, H80, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 각각 V, A, T, R, R, I, D, A, A, L, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H13, H17, H24, H29, H38, H40, H42, H43, H54, H61, H76, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 각각 R, L, A, F, R, R, E, Q, N, E, N, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H13, H17, H24, H27, H28, H29, H30, H38, H40, H42, H43, H51, H54, H60, H61, H76, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 각각 R, L, A, Y, T, F, T, R, R, E, Q, V, D, A, E, N, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H10, H12, H17, H24, H28, H38, H40, H42, H43, H48, H54, H60, H61, H76, H80, H82A, H83, H91, H93, H108 및 H109 위치는 각각 D, V, L, A, T, R, R, E, Q, I, N, A, E, N, L, G, T, F, S, T 및 L에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H10, H12, H17, H24, H28, H38, H40, H43, H48, H51, H54, H60, H61, H82A, H83, H91, H93, H102, H108 및 H109 위치는 각각 D, V, L, A, T, R, R, Q, I, V, D, A, E, G, T, F, S, Y, T 및 L에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H38 및 H93 위치는 각각 R 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H17, H27, H29, H38, H61, H76, H82A 및 H93 위치는 각각 L, Y, F, R, E, N, G 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H17, H27, H28, H29, H30, H38, H51, H54, H60, H61, H76, H82A 및 H93 위치는 각각 L, Y, T, F, T, R, V, D, A, E, N, G 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H38, H40, H48, H66, H67, H76, H80, H82A, H83 및 H93 위치는 각각 V, R, R, I, K, A, N, L, G, T 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H17, H27, H29, H38, H40, H61, H80, H82A, H83 및 H93 위치는 각각 V, L, Y, F, R, R, E, L, G, T 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VH 영역에서의 H12, H17, H27, H28, H29, H30, H38, H40, H51, H54, H60, H61, H80, H82A, H83 및 H93 위치는 각각 V, L, Y, T, F, T, R, R, V, D, A, E, L, G, T 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VL 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L36은 L에 의해 점유되고, L37은 L에 의해 점유되고, L100은 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VL 영역에서의 L36, L37 및 L100 위치는 각각 L, L 및 G에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VL 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L12는 S에 의해 점유되고, L45는 K에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VL 영역에서의 L12 및 L45 위치는 각각 S 및 K에 의해 점유된다.
몇몇 항체에서, VL 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L2는 V 또는 I이고, L7은 S 또는 T이고, L12는 P 또는 S이고, L15는 L 또는 I이고, L36은 L이고, L37은 L이고, L45는 R 또는 K이고, L60은 D 또는 S이고, L100은 G이다.
몇몇 항체에서, VL 영역에서의 L12, L36, L37, L45 및 L100 위치는 각각 S, L, L, K 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VL 영역에서의 L36, L37 및 L100 위치는 각각 L, L 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VL 영역에서의 L36, L37, L60 및 L100 위치는 각각 L, L, S 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VL 영역에서의 L2, L7, L12, L15, L36, L37, L45 및 L100 위치는 각각 I, T, S, I, L, L, K 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 항체에서, VL 영역에서의 L2, L7, L12, L15, L36, L37, L45 및 L100 위치는 각각 V, S, P, L, L, L, R 및 G에 의해 점유된다.
몇몇 항체는, H17 위치가 T 또는 S일 수 있고, H20 위치가 I 또는 V일 수 있다는 것을 제외하고는, 서열 번호 15 내지 19, 46 내지 57 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20 내지 23 중 임의의 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 항체는, H17 위치가 T 또는 S일 수 있고, H20 위치가 I 또는 V일 수 있다는 것을 제외하고는, 서열 번호 15 내지 19, 46 내지 57 중 임의의 하나와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20 내지 23 중 임의의 하나와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15 내지 19 및 서열 번호 46 내지 57 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20 내지 23 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 46의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 48의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 56의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 항체에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖고, 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
예를 들어, 항체는 키메라 항체일 수 있다. 예를 들어, 항체는 비니어드 항체일 수 있다.
항체는 온전한 마우스, 키메라, 비니어드 또는 인간화된 항체, 또는 결합 단편, 단쇄 항체 Fab 단편, Fab'2 단편 또는 단쇄 Fv일 수 있다. 몇몇 항체는 인간 IgG1 아이소타입을 갖는 한편, 다른 것은 인간 IgG2 또는 IgG4 아이소타입을 가질 수 있다. 몇몇 항체는 경쇄 불변 영역에 융합된 성숙 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역에 융합된 성숙 중쇄 가변 영역을 갖는다. 몇몇 항체의 중쇄 불변 영역은 천연 인간 중쇄 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 천연 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이체 형태이다.
몇몇 항체는 불변 영역에서 적어도 하나의 돌연변이, 예컨대 불변 영역에 의한 보체 고정 또는 활성화를 감소시키는 돌연변이, 예를 들어 EU 넘버링에 의한 241, 264, 265, 270, 296, 297, 318, 320, 322, 329 및 331 위치 중 하나 이상에서의 돌연변이를 가질 수 있다. 몇몇 항체는 318, 320 및 322 위치에서 알라닌을 갖는다. 몇몇 항체는 적어도 95% w/w 순수할 수 있다. 항체는 치료학적, 세포독성, 세포정지, 신경영양 또는 신경보호 물질에 접합될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 항체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 재조합 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
더 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 비인간 항체, 예를 들어 마우스 항체 3D6을 인간화하는 방법을 제공하고, 3D6은 서열 번호 7의 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 11의 성숙 경쇄 가변 영역을 특징으로 한다. 이러한 방법은 하나 초과의 억셉터 항체를 선택하는 단계, 마우스 중쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 코딩하는 핵산 및 마우스 항체 경쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 경쇄를 코딩하는 핵산을 합성하는 단계 및 숙주 세포에서 핵산을 발현시켜 인간화된 항체를 제조하는 단계를 수반할 수 있다.
항체, 예컨대 인간화된, 키메라 또는 비니어드 항체, 예를 들어 3D6의 인간화된, 키메라 또는 비니어드 형태를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법에서, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산에 의해 형질전환된 세포는 배양되어서, 세포는 항체를 분비한다. 이후, 항체는 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 항체를 생산하는 세포주는 세포로 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터 및 선택 가능한 마커를 도입하는 단계, 벡터의 증가된 카피수를 갖는 세포를 선택하기 위한 조건 하에 세포를 증식시키는 단계, 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리하는 단계; 및 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
몇몇 세포는 선택적 조건 하에 증식되고, 적어도 100㎎/ℓ/106개의 세포/24시간을 천연으로 발현하고 분비하는 세포주에 대해 스크리닝될 수 있다. 단일 세포는 선택된 세포로부터 단리될 수 있다. 이후, 단일 세포로부터 클로닝된 세포는 뱅킹될 수 있다. 단일 세포는 원하는 특성, 예컨대 항체의 수율에 기초하여 선택될 수 있다. 예시적인 세포주는 3D6을 발현하는 세포주이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 항체의 효과적인 섭생을 대상체에게 투여하여서, 대상체에서 타우의 응집을 저해하거나 감소시키는 단계를 포함하는, 타우 매개된 아밀로이드증을 갖거나 이를 발생시킬 위험에 있는 대상체에서 타우의 응집을 저해하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 예시적인 항체는 3D6의 인간화된 버전을 포함한다.
본 명세서에 개시된 항체의 효과적인 섭생을 투여하여서, 질환을 치료하거나 이의 예방을 수행하는 단계를 포함하는, 대상체에서 타우 관련된 질환을 치료하거나 이의 예방을 수행하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 질환의 예는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)이다. 몇몇 방법에서, 타우 관련된 질환은 알츠하이머병이다. 몇몇 방법에서, 환자는 ApoE4 보균자이다.
본 명세서에 개시된 항체의 효과적인 섭생을 투여하여서, 타우의 전달을 감소시키는 단계를 포함하는, 타우의 비정상 전달을 감소시키는 방법이 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 항체의 효과적인 섭생을 투여하여서, 타우의 식세포작용을 유도하는 단계를 포함하는, 타우의 식세포작용을 유도하는 방법이 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 항체의 효과적인 섭생을 투여하여서, 타우 응집 또는 침착을 저해하는 단계를 포함하는, 타우 응집 또는 침착을 저해하는 방법이 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 항체의 효과적인 섭생을 투여하는 단계를 포함하는, 타우 매듭의 형성을 저해하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 항체를 대상체에게 투여하는 단계 및 대상체에서 타우에 결합된 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환을 갖거나 이의 위험에 있는 대상체에서 타우 단백질 침착물을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 질환의 예는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)이다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 대상체의 신체에 정맥내 주사에 의해 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 두개내 주사에 의해 대상체의 뇌에 직접적으로 또는 대상체의 두개골을 통해 홀을 드릴링함으로써 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 표지된다. 몇몇 실시형태에서, 항체는 형광성 라벨, 상자성 라벨 또는 방사성 라벨에 의해 표지된다. 몇몇 실시형태에서, 방사성 라벨은 양성자 방출 단층촬영(positron emission tomography: PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(single-photon emission computed tomography: SPECT)를 이용하여 검출된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 항체를 대상체에게 투여하고, 대상체에서 타우에 결합된 항체의 제1 양을 검출함으로써 치료 전에 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제1 수준을 측정하는 단계, 대상체에게 치료를 투여하는 단계, 항체를 대상체에게 투여함으로써 치료 후 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제2 수준을 측정하는 단계 및 대상체에서 타우에 결합된 항체를 검출하는 단계(여기서, 타우 단백질 침착물의 수준의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 나타냄)를 포함하는, 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환에 대해 치료되는 대상체에서의 치료의 효율을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 항체를 대상체에게 투여하고, 대상체에서 타우에 결합된 항체의 제1 양을 검출함으로써 치료 전에 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제1 수준을 측정하는 단계, 대상체에게 치료를 투여하는 단계, 항체를 대상체에게 투여함으로써 치료 후 대상체에서의 타우 단백질 침착물의 제2 수준을 측정하는 단계 및 대상체에서 타우에 결합된 항체의 제2 양을 검출하는 단계(여기서, 타우 단백질 침착물의 수준의 무변화 또는 타우 단백질 침착물의 작은 증가는 치료에 대한 양성 반응을 나타냄)를 포함하는, 타우 응집 또는 침착과 연관된 질환에 대해 치료되는 대상체에서의 치료의 효율을 측정하는 방법을 제공한다.
도 1은 쥣과 3D6 단일클론 항체에 의해 결합된 에피토프(들)을 맵핑하도록 설계된 실험의 결과를 도시한다.
도 2는 마우스 3D6 항체의 중쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화된 버전(VHv1, VHv2, VHv1b, VHv1bA11 및 VHv5)의 정렬을 도시한다. 마우스 3D6 항체의 중쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화된 버전(VHv1, VHv2, VHv1b, VHv1bA11 및 VHv5) 중에 공통 아미노산 서열은 "다수"로 표지된다. 카밧/쵸티아 컴포지트에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 볼드체이다. 마우스 3D6 항체의 중쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화된 버전(VHv1, VHv2, VHv1b, VHv1bA11 및 VHv5)에서의 위치(여기서, 아미노산 잔기는 "다수" 서열과 다름)는 박스로 있다.
도 3은 마우스 3D6 항체의 경쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화된 버전의 정렬을 도시한다. 마우스 3D6 항체의 경쇄 가변 영역과 선택된 인간화된 3D6 항체 사이의 공통 아미노산 서열은 "다수"로 표지된다. 카밧에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 볼드체이다. 마우스 3D6 항체의 경쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화된 버전에서의 위치(여기서, 아미노산 잔기는 "다수" 서열과 다름)는 박스로 있다.
도 4a 및 도 4b는 마우스 3D6 항체의 중쇄 가변 영역 및 3D6 항체의 인간화된 버전의 정렬을 도시한다(VHv1, VHv1b, VHv1bA11, VHv1bA11B6G2, VHv1bA11B6H3, VHv1c, VHv1d, VHv1e, VHv1f, VHv2, VHv3, VHv3b, VHv3c, VHv4, VHv4b, VHv4c 및 VHv5). 3D6 항체의 인간화된 버전의 중쇄 가변 영역(VHv1, VHv1b, VHv1bA11, VHv1bA11B6G2, VHv1bA11B6H3, VHv1c, VHv1d, VHv1e, VHv1f, VHv2, VHv3, VHv3b, VHv3c, VHv4, VHv4b, VHv4c 및 VHv5) 중에 공통 아미노산 서열은 "다수"로 표지된다. 카밧/쵸티아 컴포지트에 의해 정의된 바와 같은 CDR은 볼드체이다. 3D6 항체의 인간화된 버전의 중쇄 가변 영역(VHv1, VHv1b, VHv1bA11, VHv1bA11B6G2, VHv1bA11B6H3, VHv1c, VHv1d, VHv1e, VHv1f, VHv2, VHv3, VHv3b, VHv3c, VHv4, VHv4b, VHv4c 및 VHv5)에서의 위치(여기서, 아미노산 잔기는 "다수" 서열과 다름)는 박스로 있다.
도 5a, 도 5b 및 도 5c는 선택된 마우스 단일클론 항-타우 항체에 대한 ELISA 스크리닝 검정의 결과를 도시한다.
도 6은 재조합 인간 타우에 대한 선택된 마우스 단일클론 항-타우 항체에 대한 결합 동역학을 도시한다.
도 7은 선택된 마우스 단일클론 항-타우 항체에 대한 기능적 차단 검정의 결과를 도시한다.
도 8은 선택된 마우스 단일클론 항-타우 항체에 대한 분해 검정의 결과를 도시한다.
도 9는 3D6 및 5G8이 인간 알츠하이머병 조직으로부터의 타우를 면역포획한다는 것을 보여주는 실험의 결과를 도시한다.
도 10a, 도 10b 및 도 10c는 타우에 대한 인간화된 3D6 변이체의 친화도를 보여주는 실험의 결과를 도시한다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 인간 타우의 아이소폼의 아미노산 서열(Swiss-Prot P10636-8)을 기재한다.
서열 번호 2는 인간 타우의 아이소폼의 아미노산 서열(Swiss-Prot P10636-7)을 기재한다.
서열 번호 3은 인간 타우의 아이소폼의 아미노산 서열(Swiss-Prot P10636-6), (4R0N 인간 타우)을 기재한다.
서열 번호 4는 인간 타우의 아이소폼의 아미노산 서열(Swiss-Prot P10636-5)을 기재한다.
서열 번호 5는 인간 타우의 아이소폼의 아미노산 서열(Swiss-Prot P10636-4)을 기재한다.
서열 번호 6은 인간 타우의 아이소폼의 아미노산 서열(Swiss-Prot P10636-2)을 기재한다.
서열 번호 7은 마우스 3D6 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 8은 마우스 3D6 항체의 카밧/쵸티아 컴포지트 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 9는 마우스 3D6 항체의 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 10은 마우스 3D6 항체의 카밧 CDR-H3의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 11은 마우스 3D6 항체 및 마우스 6A10 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 12는 마우스 3D6 항체 및 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-L1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 13은 마우스 3D6 항체 및 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-L2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 14는 마우스 3D6 항체 및 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-L3의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 15는 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 16은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 17은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1b의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 18은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1bA11의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 19는 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 20은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VLv1의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 21은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VLv2의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 22는 인간화된 3D6 항체 hu3D6VLv3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 23은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VLv4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 24는 중쇄 가변 억셉터 Acc.# BAC01986.1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 25는 중쇄 가변 억셉터 Acc.# IMGT# IGHV1-69-2*01의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 26은 중쇄 가변 억셉터 Acc.# IMGT#IGKJ1*01의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 27은 경쇄 가변 억셉터 수탁 번호 IMGT#IGKV2-30*02의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 28은 경쇄 가변 억셉터 수탁 번호 IMGT#IGKJ2*01의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 29는 경쇄 가변 억셉터 수탁 번호 AAZ09048.1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 30은 마우스 3D6 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 기재한다.
서열 번호 31은 마우스 3D6 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 기재한다.
서열 번호 32는 마우스 3D6 항체의 카밧 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 33은 마우스 3D6 항체의 쵸티아 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 34는 마우스 3D6 항체의 쵸티아 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 35는 마우스 3D6 항체의 AbM CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 36은 마우스 3D6 항체의 컨택트 CDR-L1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 37은 마우스 3D6 항체의 컨택트 CDR-L2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 38은 마우스 3D6 항체의 컨택트 CDR-L3의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 39는 마우스 3D6 항체의 컨택트 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 40은 마우스 3D6 항체의 컨택트 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 41은 마우스 3D6 항체의 컨택트 CDR-H3의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 42는 (hu3D6VHv5, hu3D6VHv1bA11B6G2, hu3D6VHv1bA11B6H3, hu3D6VHv1e 및 hu3D6VHv1f로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 43은 (hu3D6VHv5 및 hu3D6VHv1bA11B6H3으로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 44는 마우스 3D6 및 선택된 인간화된 3D6 항체(VHv1, VHv2, VHv1b, VHv1bA11 및 VHv5)(도 2에서 "다수'로 표지)의 중쇄 가변 영역 중에 공통 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 45는 마우스 3D6 및 선택된 인간화된 3D6 항체(도 3에서 "다수'로 표지)의 경쇄 가변 영역 사이에 공통 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 46은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1bA11B6G2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 47은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1bA11B6H3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 48은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1c의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 49는 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1d의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 50은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1e의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 51은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv1f의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 52는 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 53은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv3b의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 54는 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv3c의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 55는 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 56은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv4b의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 57은 인간화된 3D6 항체 hu3D6VHv4c의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 58은 (hu3D6VH1c로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 59는 (hu3D6VHv1d, hu3D6VHv3c 및 hu3D6VHv4c로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 60은 (hu3D6VHv3b 및 hu3D6VHv4b로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 61은 (hu3D6VHv1bA11B6G2로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 62는 (hu3D6VHv1c, hu3D6VHv3b 및 hu3D6VHv4b로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 63은 (hu3D6VHv1d, hu3D6VHv1f, hu3D6VHv3c 및 hu3D6VHv4c로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 64는 (hu3D6VHv1e로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 65는 (hu3D6VHv1f로부터 유래된) 인간화된 3D6 항체의 교대하는 카밧 CDR-H3의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 66은 마우스 6A10 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 67은 마우스 6A10 항체의 카밧/쵸티아 컴포지트 CDR-H1의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 68은 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-H2의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 69는 마우스 6A10 항체의 카밧 CDR-H3의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 70은 중쇄 인간화에 대한 구조 주형으로서 사용된 마우스 항체(pdb 코드 1CR9)의 VH 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 71은 선택된 인간화된 3D6 항체(VHv1, VHv1b, VHv1bA11, VHv1bA11B6G2, VHv1bA11B6H3, VHv1c, VHv1d, VHv1e, VHv1f, VHv2, VHv3, VHv3b, VHv3c, VHv4, VHv4b, VHv4c 및 VHv5)(도 4a 및 도 4b에서 "다수'로 표지)의 중쇄 가변 영역 중에 공통 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 72는 키메라 3D6 항체의 중쇄의 아미노산 서열을 기재한다.
서열 번호 73은 키메라 3D6 항체의 경쇄의 아미노산 서열을 기재한다.
정의
단일클론 항체 또는 다른 생물학적 집합체는 통상적으로 단리된 형태로 제공된다. 이것은 항체 또는 다른 생물학적 집합체가 이의 제조 또는 정제로부터 생긴 방해하는 단백질 및 다른 오염물질이 통상적으로 적어도 50% w/w 순수하지만, 단일클론 항체가 과량의 약제학적으로 허용 가능한 담체(들) 또는 이의 사용을 수월하게 하도록 의도된 다른 비히클과 조합될 가능성을 배제하지 않는다는 것을 의미한다. 때때로, 단일클론 항체는 제조 또는 정제로부터 방해하는 단백질 및 오염물질이 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% w/w 순수하다. 대개 단리된 단일클론 항체 또는 다른 생물학적 집합체는 이의 정제 후 남은 주요 거대분자 종이다.
표적 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 또는 1012M-1의 친화도 및/또는 결합도를 의미한다. 특이적 결합은 규모가 검출 가능하게 더 높고, 적어도 하나의 관련되지 않은 표적에 생기는 비특이적 결합으로부터 구별 가능하다. 특이적 결합은 특정한 작용기 또는 특정한 공간 피트(예를 들어, 락 및 키 타입) 사이의 결합의 형성의 결과일 수 있는 한편, 비특이적 결합은 보통 반 데르 발스 힘의 결과이다. 그러나, 특이적 결합은 항체가 하나의 및 오직 하나의 표적에 결합한다는 것을 필수적으로 함축하지 않는다.
기본적인 항체 구조 단위는 아단위의 사합체이다. 각각의 사합체는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 포함하고, 각각의 쌍은 하나의 "중쇄"(약 25kDa) 및 하나의 "경쇄"(약 50 내지 70kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 이것 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 이 가변 영역은 초기에 절단 가능한 신호 펩타이드에 연결되어 발현된다. 신호 펩타이드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙 가변 영역이라 불린다. 따라서, 예를 들어 경쇄 성숙 가변 영역은 경쇄 신호 펩타이드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각각의 사슬의 카복시 말단 부분은 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 한정한다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7(모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함됨)]을 참조한다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 가변 영역(또한 본 명세서에서 각각 "경쇄 가변 도메인"("VL 도메인") 또는 "중쇄 가변 도메인"("VH 도메인")이라 칭함)은 3개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에 의해 차단된 "프레임워크" 영역으로 이루어진다. 프레임워크 영역은 항원의 에피토프에 대한 특이적 결합에 대해 CDR을 정렬하도록 작용한다. CDR은 주로 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 포함한다. 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로, VL 및 VH 도메인 둘 다는 하기 프레임워크(FR) 및 CDR 영역을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. VL 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본 명세서에서 각각 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3이라 칭해지고; VH 도메인의 CDR 1, 2 및 3은 또한 본 명세서에서 각각 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3이라 칭해진다.
각각의 VL 및 VH 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 CDR의 임의의 종래의 정의에 따른다. 종래의 정의는 카밧 정의(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), the Chothia definition (Chothia & Lesk, J. Mol . Biol. 196:901-917, 1987; Chothia et al., Nature 342:878-883, 1989); CDR-H1이 쵸티아 및 카밧 CDR의 컴포지트인 쵸티아 카밧 CDR의 컴포지트; Oxford Molecular의 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된 AbM 정의; 및 Martin 등의 컨택트 정의(bioinfo.org.uk/abs)(표 1 참조)를 포함한다. 카밧은 상이한 중쇄 또는 상이한 경쇄 사이의 상응하는 잔기가 동일한 수에 배정된 널리 사용된 넘버링 관례(카밧 넘버링)를 제공한다. 항체가 CDR의 소정의 정의(예를 들어, 카밧)에 의해 CDR을 포함한다고 말해지는 경우, 그 정의는 항체에 존재하는 최소 수의 CDR 잔기(즉, 카밧 CDR)를 규정한다. 이것은 또 다른 종래의 CDR 정의 내에 해당하지만 규정된 정의 밖의 다른 잔기가 또한 존재한다는 것을 배제하지 않는다. 예를 들어, 카밧에 의해 정의된 CDR을 포함하는 항체는, 다른 가능성 중에서, CDR이 카밧 CDR 잔기를 함유하고 다른 CDR 잔기를 함유하지 않는 항체 및 CDR H1이 컴포지트 쵸티아-카밧 CDR H1이고, 다른 CDR이 다른 정의에 기초하여 카밧 CDR 잔기를 함유하고 추가적인 CDR 잔기를 함유하지 않는 항체를 포함한다.
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용어 "항체"는 온전한 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 통상적으로, 단편은 이것이 별개의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dab, 나노바디 및 Fv를 포함하는 표적에 대한 특이적 결합에 대해 유래된 온전한 항체와 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 온전한 면역글로불린의 효소 또는 화학 분리에 의해 제조될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 이중특이적 항체 및/또는 인간화된 항체를 포함한다. 이중특이적 또는 이작용성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다(예를 들어, 문헌[Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)] 참조). 몇몇 이중특이적 항체에서, 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍은 인간화된 3D6 중쇄/경쇄 쌍 및 3D6에 의해 결합된 것보다 타우에서 상이한 에피토프에 특이적인 중쇄/경쇄 쌍을 포함한다.
몇몇 이중특이적 항체에서, 하나의 중쇄/경쇄 쌍은 하기 추가로 개시된 바와 같은 인간화된 3D6 항체이고, 다른 중쇄/경쇄 쌍은 혈액 뇌 장벽에서 발현된 수용체, 예컨대 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 수용체, 렙틴 수용체 또는 지단백질 수용체 또는 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체 유래이다(Friden et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). 이러한 이중특이적 항체는 수용체 매개된 통과세포외배출에 의해 혈액 뇌 장벽을 거쳐 전달될 수 있다. 이중특이적 항체의 뇌 흡수는 혈액 뇌 장벽 수용체에 대한 이의 친화도를 감소시키기 위해 이중특이적 항체를 조작함으로써 추가로 증대될 수 있다. 수용체에 대한 감소된 친화도는 뇌에서의 더 넓은 분포를 발생시킨다(예를 들어, 문헌[Atwal et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al., Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011] 참조).
예시적인 이중특이적 항체는 또한 (1) 이중 가변 도메인 항체(DVD-Ig)(여기서, 각각의 경쇄 및 중쇄는 짧은 펩타이드 연결을 통해 탠덤으로 2개의 가변 도메인을 함유함)(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) Tandab(각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성시키는 2개의 단쇄 다이아바디의 융합임); (3) 플렉시바디(flexibody)(scFv와 다가 분자를 발생시키는 다이아바디의 조합임); (4) Fab에 적용될 때, 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 4가 이중특이적 결합 단백질을 생성시킬 수 있는 단백질 키나제 A에서의 "이합체화 및 도킹 도메인"에 기초한 소위 "독 및 락" 분자; 또는 (5) 예를 들어 인간 Fc-영역의 말단 둘 다에 융합된 2개의 scFv를 포함하는 소위 스콜피온(Scorpion) 분자일 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하기에 유용한 플랫폼의 예는 BiTE(Micromet), DART(MacroGenics), Fcab 및 Mab2(F-star), Fc 조작된 IgGl(Xencor) 또는 DuoBody(Fab 아암 교환에 기초함, Genmab)를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원에서의 부위를 의미한다. 에피토프는 하나 초과의 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프(선형 에피토프로도 공지됨)는 통상적으로 변성 용매에 대한 노출에 보유되는 한편, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프(구조적 에피토프로도 공지됨)는 통상적으로 변성 용매에 의한 처리에서 소실된다. 에피토프는 통상적으로 고유한 공간 구성에서 적어도 3개, 더 보통, 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 구성을 결정하는 방법은 예를 들어 x선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어 문헌[Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)]을 참조한다.
동일한 또는 중첩하는 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합과 경쟁하는 하나의 항체의 능력을 보여주는 단순한 면역검정에서 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 확인하기 위해 이의 항원에 결합된 항체의 X-선 결정학에 의해 정의될 수 있다. 대안적으로, 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 몇몇 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 중첩하는 에피토프를 갖는다.
항체 사이의 경쟁은 시험 중인 항체가 공통 항원에 대한 기준 항체의 특정한 결합을 저해하는 검정에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 시험 항체는 과량의 시험 항체(예를 들어, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바대로 적어도 50%로 기준 항체의 결합을 저해하는 경우 기준 항체와 경쟁한다. 몇몇 시험 항체는 적어도 75%, 90% 또는 99%로 기준 항체의 결합을 저해한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항체(경쟁하는 항체)는 기준 항체 및 입체 장애가 발생하는 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근위인 인접한 에피토프에 결합하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제가 제제의 다른 성분과 상용성이고, 이의 수혜자에게 실질적으로 해롭지 않다는 것을 의미한다.
용어 "환자"는 예방학적 또는 치료학적 치료를 받는 인간 및 다른 포유류 대상체를 포함한다.
개인은 대상체가 그 위험 인자를 갖는 개인을 위험 인자가 없는 개인보다 질환을 발생시킬 통계학적으로 유의미한 더 큰 위험에서 놓는 적어도 하나의 공지된 위험 인자(예를 들어, 유전적, 생화학적, 가족 병력 및 상황 노출)를 갖는 경우 질환의 증가된 위험에 있다.
용어 "생물학적 샘플"은 생물학적 공급원, 예를 들어 인간 또는 포유류 대상체 내의 또는 이로부터 얻을 수 있는 생물학적 재료의 샘플을 의미한다. 이러한 샘플은 기관, 소기관, 조직, 조직의 절편, 체액, 말초 혈액, 혈액 혈장, 혈액 혈청, 세포, 분자, 예컨대 단백질 및 펩타이드, 및 이로부터 유래된 임의의 부분 또는 조합일 수 있다. 용어 생물학적 샘플은 샘플을 가공함으로써 유래된 임의의 재료를 또한 포함할 수 있다. 유래된 재료는 세포 또는 이의 자손을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 가공은 방해하는 성분 등의 여과, 증류, 추출, 농축, 고정, 불활성화 중 하나 초과를 수반할 수 있다.
용어 "대조군 샘플"은 타우 관련된 질환 이환된 영역을 포함하는 것으로 공지되거나 의심되지 않거나, 소정의 유형의 이환된 영역을 포함하는 것으로 적어도 공지되거나 의심되지 않는 생물학적 샘플을 의미한다. 대조군 샘플은 타우 관련된 질환에 의해 영향을 받지 않는 개인으로부터 얻어질 수 있다. 대안적으로, 대조군 샘플은 타우 관련된 질환에 의해 영향을 받는 환자로부터 얻어질 수 있다. 이러한 샘플은 타우 관련된 질환을 포함하는 것으로 생각된 생물학적 샘플과 동일한 시간에 또는 상이한 경우에 얻어질 수 있다. 생물학적 샘플 및 대조군 샘플은 둘 다 동일한 조직으로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 대조군 샘플은 본질적으로 또는 전부 보통의, 건강한 영역으로 이루어지고, 타우 관련된 질환 이환된 영역을 포함하는 것으로 생각된 생물학적 샘플과 비교하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 대조군 샘플에서의 조직은 생물학적 샘플에서의 조직과 동일한 유형이다. 바람직하게는, 생물학적 샘플에 있는 것으로 생각된 타우 관련된 질환 이환된 세포는 대조군 샘플에서의 세포의 유형과 동일한 세포 유형(예를 들어, 뉴런 또는 신경교)으로부터 생긴다.
용어 "질환"은 생리학적 기능을 손상시키는 임의의 비정상 상태를 의미한다. 상기 용어는 병인의 성질과 무관하게 임의의 장애, 병, 비정상, 병리학, 질병, 병태 또는 생리학적 기능이 손상되는 증후군을 포괄하도록 광범위하게 사용된다.
용어 "증상"은 대상체가 인식하는 바와 같은 변경된 보행과 같은 질환의 주관적인 증거를 의미한다. "징후"는 의사가 관찰하는 바와 같은 질환의 객관적인 증거를 의미한다.
용어 "치료에 대한 양성 반응"은 치료를 받지 않는 대조군 집단에서의 평균 반응에 비해 개인 환자에서의 더 양호한 반응 또는 환자의 집단에서의 평균 반응을 의미한다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로 분류할 목적을 위해, 아미노산은 하기와 같이 그룹화된다: I군(소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; II군(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; III군(산성 측쇄): asp, glu; IV군(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; V군(사슬 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 VI군(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 종류에서의 아미노산 사이의 치환을 수반한다. 비보존적 치환은 이 종류 중 하나의 구성원을 또 다른 것의 구성원에 의해 교환하는 것을 구성한다.
백분율 서열 동일성은 카밧 넘버링 관례에 의해 최대로 정렬된 항체 서열에 의해 결정된다. 정렬 후, 해당 항체 영역(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 기준 항체의 동일한 영역과 비교되는 경우, 해당 항체 영역과 기준 항체 영역 사이의 백분율 서열 동일성은 2개의 영역의 정렬된 위치의 전체 수(갭은 계수되지 않음)로 나누고, 백분율로 전환하기 위해 100을 곱한, 해당 항체 영역 및 기준 항체 영역 둘 다에서의 동일한 아미노산이 점유한 위치의 수이다.
하나 초과의 언급된 부재를 "포함하는" 또는 "함유하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 부재를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 "포함하는" 또는 "함유하는" 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분과 조합으로 함유할 수 있다.
값의 범위의 지칭은 범위 내의 또는 이를 한정하는 모든 정수 및 범위 내의 정수에 의해 한정된 모든 하위범위를 포함한다.
문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 용어 "약"은 대단찮은 변동, 예컨대 기재된 값의 측정의 표준 오차 범위(예를 들어, SEM) 내의 값을 포함한다.
통계 유의성은 p≤0.05를 의미한다.
관사 "하나", "일" 및 "이"의 단수 형태는, 문맥이 명확히 달리 기재하지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
상세한 설명
I. 일반사항
본 발명은 타우에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 항체는 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 잔기(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 잔기에 상응) 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 인산화 상태와 무관하게 타우에 결합한다. 본 발명의 몇몇 항체는 타우 연관된 병리학 및 연관된 증상성 악화를 저해하거나 지연시키도록 작용한다. 기전의 이해가 본 발명의 실행에 필요하지 않지만, 독성의 감소는 다른 기전 중에서 비독성 형태를 안정화시킴으로써, 병원성 타우 형태의 세포간 또는 세포내 전달을 저해함으로써, 타우 인산화의 봉쇄에 의해, 세포에 대한 타우의 결합을 방지함으로써 또는 타우의 단백질분해 절단을 유도함으로써 타우의 식세포작용을 유도하고, 분자간 또는 분자내 응집, 또는 다른 분자에 대한 결합으로부터 타우를 저해하는 항체의 결과로서 발생할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이러한 항체를 유도하는 물질은 알츠하이머 및 타우와 연관된 다른 질환의 치료 또는 예방의 실행의 방법에서 사용될 수 있다.
II. 표적 분자
문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 타우에 대한 언급은 번역 후 변형(예를 들어, 인산화, 당화반응 또는 아세틸화)이 존재하는지와 무관하게 모든 아이소폼을 포함하는 타우의 천연 인간 형태를 의미한다. 인간 뇌에서 생기는 타우의 6개의 주요 아이소폼(스플라이스 변이체)이 존재한다. 이들 변이체 중 가장 긴 것은 441개의 아미노산을 갖고, 이들 중 초기 met 잔기는 절단된다. 잔기는 441개의 아이소폼에 따라 번호 매겨진다. 따라서, 예를 들어 404번 위치에서의 인산화에 대한 언급은 441개의 아이소폼과 최대로 정렬될 때 441개의 아이소폼의 404번 위치 또는 임의의 다른 아이소폼의 상응하는 위치를 의미한다. 아이소폼의 아미노산 서열 및 Swiss-Prot 번호는 하기 표시된다.
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타우에 대한 언급은 약 30개의 공지된 천연 변이(이들은 Swiss-Prot 데이터베이스 및 이의 순열에 기재됨), 및 타우 병리학, 예컨대 치매, 픽병, 핵상 마비 등과 연관된 돌연변이를 포함한다(예를 들어, 문헌[Swiss-Prot 데이터베이스 및 Poorkaj, et al. Ann Neurol. 43:815-825(1998)] 참조). 441개의 아이소폼으로 번호 매긴 타우 돌연변이의 몇몇 예는 257번 아미노산 위치에서의 트레오닌으로의 라이신 돌연변이(K257T), 260번 아미노산 위치에서의 발린으로의 아이소류신 돌연변이(I260V); 272번 아미노산 위치에서의 글라이신으로의 발린 돌연변이(G272V); 279번 아미노산 위치에서의 라이신으로의 아스파라긴 돌연변이(N279K); 296번 아미노산 위치에서의 히스티딘으로의 아스파라긴 돌연변이(N296H); 301번 아미노산 위치에서의 세린으로의 프롤린 돌연변이(P301S); 301번 아미노산 위치에서의 류신으로의 프롤린 돌연변이(P301L); 303번 아미노산 위치에서의 발린으로의 글라이신 돌연변이(G303V); 305번 아미노산 위치에서의 아스파라긴으로의 세린 돌연변이(S305N); 335번 아미노산 위치에서의 세린으로의 글라이신 돌연변이(G335S); 337번 아미노산 위치에서의 메티오닌으로의 발린 돌연변이(V337M); 342번 아미노산 위치에서의 발린으로의 글루탐산 돌연변이(E342V); 369번 아미노산 위치에서의 아이소류신으로의 라이신 돌연변이(K3691); 389번 아미노산 위치에서의 아르기닌으로의 글라이신 돌연변이(G389R); 및 406번 아미노산 위치에서의 트립토판으로의 아르기닌 돌연변이(R406W)이다.
타우는 18번, 29번, 97번, 310번 및 394번 아미노산 위치에서의 타이로신; 184번, 185번, 198번, 199번, 202번, 208번, 214번, 235번, 237번, 238번, 262번, 293번, 324번, 356번, 396번, 400번, 404번, 409번, 412번, 413번 및 422번 아미노산 위치에서의 세린; 및 175번, 181번, 205번, 212번, 217번, 231번 및 403번 아미노산 위치에서의 트레오닌을 포함하는 하나 초과의 아미노산 잔기에서 인산화될 수 있다.
문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 타우, 또는 이의 단편에 대한 언급은 이의 아이소폼, 돌연변이체 및 대립유전자 변이체를 포함하는 천연 인간 아미노산 서열을 포함한다.
III. 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 특성
본 발명은 타우에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 항체는 383개의 아미노산 4R0N 인간 타우 단백질의 199번 내지 213번 잔기(서열 번호 3)(서열 번호 1의 257번 내지 271번 잔기에 상응) 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 383개의 아미노산 4RON 인간 타우 단백질의 262번 내지 276번 잔기(서열 번호 3)(서열 번호 1의 320번 내지 334번 잔기에 상응) 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 몇몇 항체는 인산화 상태와 무관하게 타우에 결합한다. 몇몇 항체는 인산화로 처리된 잔기를 포함하지 않는 에피토프에 결합한다. 이 항체는 천연 공급원으로부터 정제된 또는 재조합으로 발현된 타우 폴리펩타이드에 의해 면역화함으로써 얻어질 수 있다. 항체는 비인산화된 형태, 및 인산화에 민감한 하나 초과의 잔기가 인산화된 형태의 타우에 대한 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 항체는 바람직하게는 구별 불가능한 친화도로 또는 비인산화된 타우(즉, "pan-특이적"임)와 비교하여 인산화된 타우에 적어도 1.5배, 2배 또는 3배의 인자 내로 결합한다. 3D6은 pan-특이적 단일클론 항체의 예이다. 본 발명은 또한 임의의 상기 항체와 동일한 에피토프, 예를 들어 3D6의 에피토프 등에 대한 항체 결합을 제공한다. 타우에 대한 결합에 대해 임의의 상기 항체와 경쟁하는, 예를 들어 3D6와 경쟁하는 항체가 또한 포함된다.
상기 언급된 항체는 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 잔기를 포함하는 펩타이드(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 잔기에 상응)에 의해 면역화함으로써 또는 이러한 잔기를 포함하는 전장 타우 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 의해 면역화하고 이러한 잔기를 포함하는 펩타이드에 대한 비특이적 결합을 스크리닝함으로써 신생 생성될 수 있다. 이러한 펩타이드는 바람직하게는 펩타이드에 대한 항체 반응을 유발하는 것을 돕는 비상동성 접합체 분자에 부착된다. 부착은 스페이서 펩타이드 또는 아미노산을 통해 지시될 수 있다. 이의 유리 SH 기가 운반 분자의 부착을 수월하게 하므로, 시스테인은 스페이서 아미노산으로서 사용된다. 글라이신과 펩타이드 사이에 시스테인 잔기를 갖거나 갖지 않는 폴리글라이신 링커(예를 들어, 2개 내지 6개의 글라이신)를 또한 사용할 수 있다. 운반 분자는 펩타이드에 대해 항체 반응을 유발하는 것을 돕는 T 세포 에피토프를 제공하도록 작용한다. 몇몇 운반체, 특히 키홀 림펫 헤모사이아닌(KLH), 난알부민 및 소 혈청 알부민(BSA)을 보통 사용한다. 펩타이드 스페이서는 고상 펩타이드 합성의 일부로서 펩타이드 면역원에 첨가될 수 있다. 운반체는 통상적으로 화학 가교결합에 의해 첨가된다. 사용될 수 있는 화학 가교결합제의 몇몇 예는 크로스-N-말레이미도-6-아미노카프로일 에스터 또는 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스터(MBS)를 포함한다(예를 들어, 문헌[Harlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1988; Sinigaglia et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz et al., J. Exp. Med., 178:27-47 (1993); Hammer et al., Cell 74:197-203 (1993); Falk K. et al., Immunogenetics, 39:230-242 (1994); WO 98/23635; 및 Southwood et al. J. Immunology, 160:3363-3373 (1998))] 참조). 운반체 및 스페이서는 존재하는 경우 면역원의 양 말단에 부착될 수 있다.
임의의 스페이서 및 운반체를 갖는 펩타이드는 하기 더 자세히 기재된 바대로 실험실 동물 또는 B 세포를 면역화하도록 사용될 수 있다. 하이브리도마 상청액은 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 잔기를 포함하는 하나 초과의 펩타이드(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 잔기에 상응) 및/또는 타우의 인산화된 및 비인산화된 형태, 예를 들어 인산화된 형태의 404번 위치를 갖는 타우의 전장 아이소폼 등에 결합하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 펩타이드는 스크리닝 검정을 수월하게 하도록 운반체 또는 다른 태그에 부착될 수 있다. 이러한 경우에, 운반체 또는 태그는 타우 펩타이드보다는 스페이서 또는 운반체에 특이적인 항체를 제거하도록 면역화에 사용된 스페이서 및 운반 분자의 조합과 우선적으로 다르다. 임의의 타우 아이소폼을 사용할 수 있다.
본 발명은 타우 내의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 3D6이라 지칭되는 항체는 이러한 하나의 예시적인 마우스 항체이다. 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 3D6에 대한 언급은 이 항체의 임의의 마우스, 키메라, 비니어드 및 인간화된 형태를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 항체는 [DEPOSIT NUMBER]로 기탁되었다. 이 항체는 383개의 아미노산 4R0N 인간 타우 단백질의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기(서열 번호 3)(서열 번호 1의 각각 257-271 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응) 내에 특이적으로 결합한다. 이 항체는 인산화된 및 비인산화된 타우(둘 다 비병리학적 및 병리학적 형태) 및 타우의 입체형태, 및 타우의 미스폴딩된/응집된 형태에 결합하는 이의 능력을 추가로 특징으로 한다. 6A10이라 지칭되는 항체는 이러한 하나의 예시적인 마우스 항체이다. 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 6A10에 대한 언급은 이 항체의 임의의 마우스, 키메라, 비니어드 및 인간화된 형태를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 6A10의 중쇄의 카밧/쵸티아 컴포지트 CDR은 각각 서열 번호 67, 68 및 69로 지칭되고, 6A10의 경쇄의 카밧 CDR은 각각 서열 번호 12, 13 및 14로 지칭된다. 마우스 6A10은 마우스 3D6의 각각 VH 사슬 및 VL 사슬과 82.1%의 VH 서열 동일성 및 100%의 VL 서열 동일성을 공유한다.
본 발명의 몇몇 항체는 3D6이라 지칭된 항체와 동일한 또는 중첩하는 에피토프에 결합한다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 영역의 서열은 각각 서열 번호 7 및 11이라 지칭된다. 이러한 결합 특이성을 갖는 다른 항체는 마우스를 원하는 에피토프(예를 들어, 서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 잔기에 상응하는 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번)를 포함하는 타우 또는 이의 부분에 의해 면역화하고, 임의로 마우스 3D6의 가변 영역을 갖는 항체(IgG1 카파)와의 경쟁에서 타우에 대한 결합에 대해 생성된 항체를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 원하는 에피토프를 포함하는 타우의 단편은 단편에 대한 항체 반응을 유발하도록 돕는 운반체에 연결되고/되거나, 이러한 반응을 유발하도록 돕는 애쥬번트와 조합될 수 있다. 이러한 항체는 특정한 잔기의 돌연변이체와 비교하여 타우 또는 이의 단편에 대한 차등 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 돌연변이체에 대한 스크리닝은 결합 특이성을 더 정확하게 한정하여서, 결합이 특정한 잔기의 돌연변이유발에 의해 저해되고, 다른 예시된 항체의 기능적 특성을 공유할 것 같은 항체의 확인을 허용한다. 돌연변이는 표적에 걸쳐 또는 에피토프가 있는 것으로 공지된 이의 섹션에 걸쳐 한 번에, 또는 더 광범위하게 떨어진 간격으로 알라닌(또는 알라닌이 이미 존재하는 경우 세린) 하나의 잔기에 의한 체계적인 대체 치환일 수 있다. 돌연변이의 동일한 세트가 2개의 항체의 결합을 유의미하게 감소시키는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합한다.
선택된 쥣과 항체(예를 들어, 3D6)의 결합 특이성을 갖는 항체는 파지 디스플레이 방법의 변형을 이용하여 또한 제조될 수 있다. WO 92/20791(Winter)을 참조한다. 이 방법은 인간 항체를 제조하는 데 특히 적합하다. 이 방법에서, 선택된 쥣과 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나는 출발 재료로서 사용된다. 예를 들어 경쇄 가변 영역이 출발 재료로서 선택되는 경우, 구성원이 동일한 경쇄 가변 영역(즉, 쥣과 출발 재료) 및 상이한 중쇄 가변 영역을 디스플레이하는 파지 라이브러리가 구성된다. 중쇄 가변 영역은 예를 들어 재배열된 인간 중쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 타우 또는 이의 단편에 대한 강한 특이적 결합(예를 들어, 적어도 108 및 바람직하게는 적어도 109M-1)을 나타내는 파지가 선택된다. 이후, 이 파지로부터의 중쇄 가변 영역은 추가의 파지 라이브러리를 구성하기 위한 출발 재료로서 작용한다. 이 라이브러리에서, 각각의 파지는 동일한 중쇄 가변 영역(즉, 제1 디스플레이 라이브러리로부터 확인된 영역) 및 상이한 경쇄 가변 영역을 디스플레이한다. 경쇄 가변 영역은 예를 들어 재배열된 인간 가변 경쇄 영역의 라이브러리로부터 얻어질 수 있다. 다시, 타우 또는 이의 단편에 대한 강한 특이적 결합을 보여주는 파지가 선택된다. 생성된 항체는 보통 쥣과 출발 재료와 동일한 또는 유사한 에피토프 특이성을 갖는다.
3D6의 중쇄의 카밧/쵸티아 컴포지트 CDR은 각각 서열 번호 8, 9 및 10으로 지정되고, 3D6의 경쇄의 카밧 CDR은 각각 서열 번호 12, 13 및 14로 지정된다.
표 2는 카밧, 쵸티아, 쵸티아 및 카밧의 컴포지트(또한 본 명세서에서 "카밧/쵸티아 컴포지트"라 칭함), AbM 및 컨택트에 의해 정의된 바와 같은 3D6 CDR을 나타낸다.
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다른 항체는 예시적인 항체, 예컨대 3D6의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 얻어질 수 있다. 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에서 3D6과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하고, 이의 기능적 특성을 유지하고/하거나, 적은 수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입으로 각각의 항체와 다른 단일클론 항체는 또한 본 발명에 포함된다. 3D6의 상응하는 CDR과 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한, 임의의 종래의 정의, 그러나 바람직하게는 카밧에 의해 정의된 바와 같은, 적어도 하나 또는 모든 6개의 CDR(들)을 갖는 단일클론 항체는 또한 포함된다.
본 발명은 또한 전부 또는 실질적으로 3D6으로부터의 CDR의 일부 또는 전부(예를 들어, 3개, 4개, 5개 및 6개)를 갖는 항체를 제공한다. 이러한 항체는 전부 또는 실질적으로 3D6의 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 2개 및 보통 모든 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 전부 또는 실질적으로 3D6의 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 2개 및 보통 모든 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함할 수 있다. (카밧에 의해 정의될 때) CDR-H2가 6개 이하, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다는 것을 제외하고, 이것이 4개 이하, 3개, 2개 또는 1개의 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 때, CDR은 실질적으로 상응하는 3D6 CDR 유래이다. 이러한 항체는 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에서 3D6과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있고, 이의 기능적 특성을 유지하고/하거나, 적은 수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입으로 3D6과 다르다.
이러한 검정에 의해 확인된 몇몇 항체는 타우의 단량체, 미스폴딩된, 응집된, 인산화된 또는 비인산화된 형태에 또는 달리 결합할 수 있다. 마찬가지로, 몇몇 항체는 비병리학적 및 병리학적 형태 및 타우의 입체형태에서 면역반응성이다.
B. 비인간 항체
타우 또는 이의 단편(예를 들어, 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기)(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응)에 대한 다른 비인간 항체, 예를 들어 쥣과, 기니아 피그, 영장류, 토끼 또는 랫트의 제조는 예를 들어 타우 또는 이의 단편에 의해 동물을 면역화함으로써 달성될 수 있다. 문헌[Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988)(모든 목적을 위해 참조로 포함됨)]을 참조한다. 이러한 면역원은 천연 공급원으로부터, 펩타이드 합성에 의해 또는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다. 임의로, 면역원은 운반 단백질과 융합되어 또는 달리 복합체화되어 투여될 수 있다. 임의로, 면역원은 애쥬번트와 투여될 수 있다. 애쥬번트의 몇몇 유형은 하기 기재된 바대로 사용될 수 있다. 완전 프로인트 애쥬번트, 이어서 불완전 애쥬번트는 실험실 동물의 면역화에 바람직하다. 토끼 또는 기니아 피그는 통상적으로 다중클론 항체를 제조하기 위해 사용된다. 마우스는 통상적으로 단일클론 항체를 제조하기 위해 사용된다. 항체는 타우 또는 타우 내의 에피토프(예를 들어, 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기 중 하나 초과를 포함하는 에피토프)(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응)에 대한 특이적 결합에 대해 스크리닝된다. 이러한 스크리닝은 타우 변이체, 예컨대 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기를 함유하는 타우 변이체(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응) 또는 이들 잔기 내의 돌연변이의 수집에 대해 항체의 결합을 결정하고, 어떠한 타우 변이체가 항체에 결합하는지를 결정함으로써 달성될 수 있다. 결합은 예를 들어 웨스턴 블롯, FACS 또는 ELISA에 의해 평가될 수 있다.
C. 인간화된 항체
인간화된 항체는 비인간 "도너" 항체로부터의 CDR이 인간 "억셉터" 항체 서열로 그래프팅된 유전자 조작된 항체이다(예를 들어, US 5,530,101 및 5,585,089(Queen); US 5,225,539(Winter); US 6,407,213(Carter); US 5,859,205(Adair); 및 US 6,881,557(Foote) 참조). 억셉터 항체 서열은 예를 들어 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열의 컴포지트, 인간 항체 서열의 공통 서열 또는 생식선 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화된 항체는 전부 또는 실질적으로 도너 항체로부터의 적어도 3개, 4개, 5개 또는 모든 CDR 및 존재하는 경우 전부 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크 서열 및 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화된 중쇄는 전부 또는 실질적으로 도너 항체 중쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 보통 모든 3개의 CDR, 및 존재하는 경우 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 유사하게, 인간화된 경쇄는 전부 또는 실질적으로 도너 항체 경쇄로부터의 적어도 1개, 2개 및 보통 모든 3개의 CDR, 및 존재하는 경우 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 나노바디 및 dAb 이외에, 인간화된 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 인간화된 항체에서의 CDR은 (임의의 종래의 정의에 의해 정의된 바대로, 그러나 바람직하게는 카밧에 의해 정의된) 상응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 각각의 CDR 사이에 동일할 때 실질적으로 비인간 항체에서 상응하는 CDR 유래이다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 카밧에 의해 정의된 상응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일할 때 실질적으로 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역 유래이다. 인간화된 항체의 2014 세계보건기구(WHO) 국제 일반명(INN) 정의 하에 인간화로 분류되기 위해, 항체는 인간 생식선 항체 서열과 적어도 85%의 동일성(즉, 체세포 초돌연변이 전에)을 가져야 한다. 혼합된 항체는 하나의 항체 사슬(예를 들어, 중쇄)이 한계치를 만족시키지만, 다른 사슬(예를 들어, 경쇄)이 한계치를 만족시키지 않는 항체이다. 사슬 둘 다에 대한 가변 프레임워크 영역이 몇몇 쥣과 역돌연변이에 의해 실질적으로 인간이더라도, 사슬 중 어느 것도 한계치를 만족시키지 않는 경우, 항체는 키메라로 분류된다. 문헌[Jones et al. (2016) The INNs and outs of antibody nonproprietary names, mAbs 8:1, 1-9, DOI: 10.1080/19420862.2015.1114320]을 참조한다. 또한 "WHO-INN: 생물학적 및 생명공학 물질에 대한 국제 일반명(INN) (리뷰)" (인터넷) 2014. (http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf로부터 이용 가능)(본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다. 의심을 피하기 위해, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "인간화"는 인간화된 항체의 2014 WHO INN 정의로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에 제공된 인간화된 항체 중 몇몇은 인간 생식선 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖고, 본 명세서에 제공된 인간화된 항체 중 몇몇은 인간 생식선 서열과 85% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 본 명세서에 제공된 인간화된 항체의 중쇄 중 몇몇은 예를 들어 약 60% 내지 69%, 70% 내지 79%, 80% 내지 84% 또는 85% 내지 89%의 범위로 인간 생식선 서열과 약 60% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 중쇄는 2014 WHO INN 정의 하에 해당하고, 인간 생식선 서열과 예를 들어 약 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81% 또는 82%, 83% 또는 84%의 서열 동일성을 갖는 한편, 다른 중쇄는 2014 WHO INN 정의를 충족하고, 인간 생식선 서열과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 이것 초과의 서열 동일성을 갖는다. 본 명세서에 제공된 인간화된 항체의 경쇄 중 몇몇은 예를 들어 약 80% 내지 84% 또는 85% 내지 89%의 범위로 인간 생식선 서열과 약 60% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 경쇄는 2014 WHO INN 정의 하에 해당하고, 인간 생식선 서열과 예를 들어 약 81%, 82%, 83% 또는 84%의 서열 동일성을 갖는 한편, 다른 경쇄는 2014 WHO INN 정의를 충족하고, 인간 생식선 서열과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89% 또는 이것 초과의 서열 동일성을 갖는다. 2014 WHO INN 정의 하에 "키메라"인 본 명세서에 제공된 몇몇 인간화된 항체는 인간 생식선 서열과 85% 미만의 동일성을 갖는 경쇄와 쌍을 지은 인간 생식선 서열과 85% 미만의 동일성을 갖는 중쇄를 갖는다. 본 명세서에 제공된 몇몇 인간화된 항체는 예를 들어 인간 생식선 서열과 85% 미만의 서열 동일성을 갖는 경쇄와 쌍을 지은 인간 생식선 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 갖거나, 그 반대로 2014 WHO INN 정의 하에 "혼합"된다. 본 명세서에 제공된 몇몇 인간화된 항체는 "인간화"의 2014 WHO INN 정의를 충족하고, 인간 생식선 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 경쇄와 쌍을 지은 인간 생식선 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 갖는다. 본 발명의 추가적인 인간화된 항체는 "혼합"의 2014 WHO INN 정의를 충족하고, 임의의 서열 번호 20 내지 23의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄와 쌍을 지은 임의의 서열 번호 15 내지 19 및 서열 번호 46 내지 57의 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄를 갖는 항체를 포함한다.
인간화된 항체가 대개 마우스 항체로부터 (임의의 종래의 정의에 의해 정의되지만, 바람직하게는 카밧에 의해 정의된 바와 같은) 모든 6개의 CDR을 도입하지만, 이들은 또한 마우스 항체로부터 전부가 아닌 CDR(예를 들어, 적어도 3개, 4개 또는 5개의 CDR)에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., J. of Mol . Biol., 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol . Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, J. Immunol., 164:1432-1441, 2000]) 참조.
몇몇 항체에서, CDR의 오직 일부, 즉 SDR이라 불리는, 결합에 필요한 CDR 잔기의 부분집합은 인간화된 항체에서의 결합을 보유하는 데 필요하다. SDR에 없고 항원과 접촉하지 않는 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해 및/또는 경험적으로, 또는 문헌[Gonzales et al., Mol . Immunol. 41: 863, 2004]에 기재된 바대로 쵸티아 초가변 루프 밖에 있는 카밧 CDR의 영역(Chothia, J. Mol . Biol. 196:901, 1987)으로부터 이전의 연구(예를 들어, CDR H2에서의 잔기 H60-H65는 대개 필요하지 않음)에 기초하여 확인될 수 있다. 하나 초과의 도너 CDR 잔기가 부재하거나, 전체 도너 CDR이 생략된 위치에서의 이러한 인간화된 항체에서, 위치를 점유하는 아미노산은 억셉터 항체 서열에서 (카밧 넘버링에 의해) 상응하는 위치를 점유하는 아미노산일 수 있다. CDR에서의 도너 아미노산이 포함되기 위한 억셉터의 이러한 치환의 수는 경쟁하는 고려사항의 균형을 반영한다. 이러한 치환은 인간화된 항체에서 마우스 아미노산의 수를 감소시키고, 결과적으로 잠재적인 면역원성을 감소시키고/시키거나, "인간화"의 WHO INN 정의를 충족시키는 데 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화도의 변경을 발생시킬 수 있고, 친화도의 유의미한 감소는 바람직하게는 회피된다. 치환하기 위한 CDR 및 아미노산 내의 치환에 대한 위치는 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
인간 억셉터 항체 서열은 임의로 도너 항체 사슬의 인간 억셉터 서열 가변 영역 프레임워크와 상응하는 가변 영역 프레임워크 사이에 높은 정도의 서열 동일성(예를 들어, 65% 내지 85%의 동일성)을 제공하도록 많은 공지된 인간 항체 서열 중에서 선택될 수 있다.
중쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 NCBI 수탁 코드 BAC01986.1(서열 번호 24)을 갖는 인간 성숙 중쇄 가변 영역이다. 중쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 NCBI 수탁 코드 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열 번호 25)을 갖는 인간 성숙 중쇄 가변 영역이다. 중쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 NCBI 수탁 코드 IMGT#IGKJ1*01(서열 번호 26)을 갖는 인간 성숙 중쇄 가변 영역이다. IMGT# IGHV1-69-2*01(서열 번호 25)은 마우스 3D6 중쇄 CDR-H1 및 H2의 전형적 형태(canonical form)를 공유한다. IMGT# IGHV1-69-2*01(서열 번호 25) 및 IMGT#IGKJ1*01(서열 번호 26) 및 둘 다는 인간 중쇄 하위그룹 1에 속한다. 경쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 NCBI 수탁 코드 IMGT#IGKV2-30*02(서열 번호 27)를 갖는 인간 성숙 경쇄 가변 영역이다. 경쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 NCBI 수탁 코드 IMGT#IGKJ2*01(서열 번호 28)을 갖는 인간 성숙 경쇄 가변 영역이다. 경쇄에 대한 억셉터 서열의 예는 NCBI 수탁 코드 AAZ09048.1(서열 번호 29)을 갖는 인간 성숙 경쇄 가변 영역이다. IMGT#IGKV2-30*02(서열 번호 27)는 마우스 3D6과 CDR-L1, CDR-L2 및 L3에 대한 동일한 전형적 종류를 갖는다. IMGT#IGKV2-30*02(서열 번호 27) 및 IMGT#IGKJ2*01(서열 번호 28)은 인간 카파 하위그룹 2에 속한다.
하나 초과의 인간 억셉터 항체 서열이 선택되면, 이 억셉터의 컴포지트 또는 하이브리드를 사용할 수 있고, 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 영역에서 상이한 위치에서 사용된 아미노산은 사용된 임의의 인간 억셉터 항체 서열로부터 취해질 수 있다. 예를 들어, NCBI 수탁 코드 IMGT# IGHV1-69-2*01(서열 번호 25) 및 BAC01986.1(서열 번호 24)인 인간 성숙 중쇄 가변 영역은 3D6 성숙 중쇄 가변 영역의 인간화를 위한 억셉터 서열로서 사용된다. 이 2개의 억셉터가 다른 위치의 예는 위치 H17(T 또는 S) 및 H20(I 또는 V) 위치를 포함한다. 3D6 중쇄 가변 영역의 인간화된 버전은 이들 위치 중 어느 하나에서의 어느 하나의 아미노산을 포함할 수 있다.
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 소정의 아미노산은 CDR 입체형태에 대한 이의 가능한 영향 및/또는 항원에 대한 결합에 기초하여 치환에 대해 선택될 수 있다. 이러한 가능한 영향의 조사는 모델링, 특정한 위치에서의 아미노산의 특징의 검사 또는 특정한 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 효과의 경험적 관찰에 의한다.
예를 들어, 아미노산이 쥣과 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에 다른 경우, 아미노산이
(1) 직접적으로 항원에 비공유로 결합하거나;
(2) 카밧이 아닌 쵸티아에 의해 정의된 바와 같이 CDR 영역에 인접하거나 CDR 내이고;
(3) (예를 들어, 상동성의 공지된 면역글로불린 사슬이 해결된 구조에서 경쇄 또는 중쇄를 모델링함으로써 확인된) 달리 (예를 들어, CDR 영역의 약 6Å 내인) CDR 영역과 상호작용하거나;
(4) VL-VH 계면에서 참여하는 잔기라는 것을 제외하고는, 이것이 합당하게 예상될 때, 인간 프레임워크 아미노산은 마우스 항체로부터 동등한 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
본 발명은 17개의 예시된 인간화된 중쇄 성숙 가변 영역(hu3D6VHv1(서열 번호 15), hu3D6VHv2(서열 번호 16), hu3D6VHv1b(서열 번호 17), hu3D6VHv1bA11(서열 번호 18), hu3D6VHv5(서열 번호 19), hu3D6VHv1bA11B6G2(서열 번호 46), hu3D6VHv1bA11B6H3(서열 번호 47), hu3D6VHv1c(서열 번호 48), hu3D6VHv1d(서열 번호 49), hu3D6VHv1e(서열 번호 50), hu3D6VHv1f(서열 번호 51), hu3D6VHv3(서열 번호 52), hu3D6VHv3b(서열 번호 53), hu3D6VHv3c(서열 번호 54), hu3D6VHv4(서열 번호 55), hu3D6VHv4b(서열 번호 56) 및 hu3D6VHv4c(서열 번호 57)) 및 4개의 예시된 인간화된 경쇄 성숙 가변 영역(hu3D6VLv1(서열 번호 20), hu3D6VLv2(서열 번호 21, hu3D6VLv3(서열 번호 22) 및 hu3D6VLv4(서열 번호 23))을 포함하는 쥣과 3D6 항체의 인간화된 형태를 제공한다.
실시형태에서, 인간화된 서열은 QuikChange 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여 다수의 돌연변이, 결실 및 삽입의 도입을 허용하는 2단계 PCR 프로토콜을 이용하여 생성된다[Wang, W. and Malcolm, B.A. (1999) BioTechniques 26:680-682)].
US 5,530,101(Queen)에 의해 정의된 바와 같은 종류 (1) 내지 (3)으로부터의 프레임워크 잔기는 때때로 전형적 및 버니어 잔기라 대안적으로 칭해진다. CDR 루프의 입체형태를 한정하는 것을 돕는 프레임워크 잔기는 때때로 전형적 잔기라 칭해진다(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). 항원-결합 루프 입체형태를 지지하고, 항체 대 항원의 피트의 미세 조정에서 역할을 하는 프레임워크 잔기는 때때로 버니어 잔기라 칭해진다(Foote & Winter, J. Mol. Biol 224:487-499 (1992)).
치환에 대한 후보인 다른 프레임워크 잔기는 잠재적인 글라이코실화 부위를 생성하는 잔기이다. 치환에 대한 더 다른 후보는 그 위치에서 인간 면역글로불린에 드문 억셉터 인간 프레임워크 아미노산이다. 이 아미노산은 마우스 도너 항체의 동등한 위치 또는 더 통상적인 인간 면역글로불린의 동등한 위치로부터의 아미노산에 의해 치환될 수 있다.
치환에 대한 후보인 다른 프레임워크 잔기는 피로글루타메이트 전환에 대한 가능성을 최소화하기 위해 글루탐산(E)에 의해 대체될 수 있는 N 말단 글루타민 잔기(Q)이다[Y. Diana Liu, et al., 2011, J. Biol. Chem., 286: 11211-11217]. 피로글루타메이트(pE)로의 글루탐산(E) 전환은 글루타민(Q)으로부터보다 더 서서히 발생한다. pE로의 글루타민 전환에서 1차 아민의 손실 때문에, 항체는 더 산성이 된다. 불완전환 전환은 전하-기반 분석 방법을 이용하여 다수의 피크로서 관찰될 수 있는 항체에서의 이종성을 생성한다. 이종성 차이는 공정 제어의 부족을 나타낼 수 있다.
예시적인 인간화된 항체는 Hu3D6으로 지정된 마우스 3D6의 인간화된 형태이다.
마우스 항체 3D6은 각각 서열 번호 7 및 서열 번호 11을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명은 17개의 예시된 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역을 제공한다: hu3D6VHv1, hu3D6VHv2, hu3D6VHv1b, hu3D6VHv1bA11, hu3D6VHv5, hu3D6VHv1bA11B6G2, hu3D6VHv1bA11B6H3, hu3D6VHv1c, hu3D6VHv1d, hu3D6VHv1e, hu3D6VHv1f, hu3D6VHv3, hu3D6VHv3b, hu3D6VHv3c, hu3D6VHv4, hu3D6VHv4b 및 hu3D6VHv4c. 본 발명은 추가로 4개의 예시된 인간 성숙 경쇄 가변 영역을 제공한다: hu3D6VLv1, hu3D6VLv2, hu3D6VLv3 및 VLv4. 도 2 및 도 3은 쥣과 3D6 및 다양한 인간화된 항체의 각각 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 정렬을 보여준다.
CDR 입체형태 및/또는 중쇄와 경쇄 사이의 상호작용을 매개하는 항원에 대한 결합에 대한 가능한 영향, 불변 영역과의 상호작용, 원하는 또는 원치않는 전사 후 변형에 대한 자리인 것, 인간 가변 영역 서열에서 이의 위치에 대해 드문 잔기 인 것 및 따라서 잠재적으로 면역원성, 응집되는 가능성과 같은 이유 및 다른 이유로, 하기 30개의 가변 영역 프레임워크 위치는, 예에 추가로 기재된 바대로, 4개의 예시된 인간 성숙 경쇄 가변 영역 및 17개의 예시된 인간 성숙 중쇄 가변 영역에서 치환에 대한 후보로서 생각되었다: L2(V2I), L7(S7T), L12(P12S), L15(L15I), L36(F36L), L37(Q37L), L45(R45K), L60(D60S), L100(Q100G), H10(E10D), H12(K12V), H13(K13R), H17(T17L), H24(V24A), H38(Q38R), H40(A40R), H42(G42E), H43(K43Q), H48(M48I), H66(R66K), H67(V67A), H76(D76N), H80(M80L), H81(E81Q), H82a(S82a-G), H83(R83T), H91(Y91F), H93(A93S), H108(L108T) 및 H109(V109L). 하기 9개의 가변 영역 CDR 위치는, 예에 추가로 기재된 바대로, 17개의 예시된 인간 성숙 중쇄 가변 영역에서 치환에 대한 후보로서 생각되었다: H27(F27Y), H28(N28T), H29(I29F), H30(K30T), H51(I51V), H54(N54D), H60(D60A), H61(P61E) 및 H102(F102Y). 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열 번호 43을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열 번호 61을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1은 서열 번호 58을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열 번호 62를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열 번호 64를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H3은 서열 번호 65를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1은 서열 번호 42를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열 번호 64를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1은 서열 번호 59를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열 번호 63을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧-쵸티아 컴포지트 CDR-H1은 서열 번호 60을 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 카밧 CDR-H2는 서열 번호 62를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
여기서, 그 외로서, 처음에 언급된 잔기는 인간 억셉터 프레임워크로 CDR-H1의 경우에 카밧 CDR 또는 컴포지트 쵸티아-카밧 CDR을 그래프팅함으로써 형성된 인간화된 항체의 잔기이고, 두 번째로 언급된 잔기는 이러한 잔기를 대체하는 것으로 생각되는 잔기이다. 따라서, 가변 영역 프레임워크 내에, 처음에 언급된 잔기는 인간이고, CDR 내에, 처음에 언급된 잔기는 마우스이다.
예시된 항체는 예시된 성숙 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VHv1/VLv1, VHv1/VLv2, VHv1/VLv3, VHv1/VLv4, VHv2/VLv1, VHv2/VLv2, VHv2/VLv3, VHv2/VLv4, VHv1b/VLv1, VHv1b/VLv2, VHv1b/VLv3, VHv1b/VLv4, VHv1bA11/VLv1, VHv1bA11/VLv2, VHv1bA11/VLv3, VHv1bA11/VLv4, VHv5/VLv1, VHv5/VLv2, VHv5/VLv3, VHv5/VLv4, VHv1bA11B6G2/VLv1, VHv1bA11B6G2/VLv2, VHv1bA11B6G2/VLv3, VHv1bA11B6G2/VLv4,VHv1bA11B6H3/VLv1, VHv1bA11B6H3/VLv2, VHv1bA11B6H3/VLv3, VHv1bA11B6H3/VLv4, VHv1c/VLv1, VHv1c/VLv2, VHv1c/VLv3, VHv1c/VLv4, VHv1d/VLv1, VHv1d/VLv2, VHv1d/VLv3, VHv1d/VLv4, VHv1e/VLv1, VHv1e/VLv2, VHv1e/VLv3, VHv1e/VLv4, VHv1f/VLv1, VHv1f/VLv2, VHv1f/VLv3, VHv1f/VLv4, VHv3/VLv1, VHv3/VLv2, VHv3/VLv3, VHv3/VLv4, VHv3b/VLv1, VHv3b/VLv2, VHv3b/VLv3, VHv3b/VLv4, VHv3c/VLv1, VHv3c/VLv2, VHv3c/VLv3, VHv3c/VLv4, VHv4/VLv1, VHv4/VLv2, VHv4/VLv3, VHv4/VLv4, VHv4b/VLv1, VHv4b/VLv2, VHv4b/VLv3, VHv4b/VLv4, VHv4c/VLv1, VHv4c/VLv2, VHv4c/VLv3 또는 VHv4c/VLv4의 임의의 순열 또는 조합을 포함한다.
본 발명은 인간화된 성숙 중쇄 가변 영역이 hu3D6VHv1(서열 번호 15), hu3D6VHv2(서열 번호 16), hu3D6VHv1b(서열 번호 17), hu3D6VHv1bA11(서열 번호 18), hu3D6VHv5(서열 번호 19), hu3D6VHv1bA11B6G2(서열 번호 46), hu3D6VHv1bA11B6H3(서열 번호 47), hu3D6VHv1c(서열 번호 48), hu3D6VHv1d(서열 번호 49), hu3D6VHv1e(서열 번호 50), hu3D6VHv1f(서열 번호 51), hu3D6VHv3(서열 번호 52), hu3D6VHv3b(서열 번호 53), hu3D6VHv3c(서열 번호 54), hu3D6VHv4(서열 번호 55), hu3D6VHv4b(서열 번호 56) 및 hu3D6VHv4c(서열 번호 57)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보여주고, 인간화된 성숙 경쇄 가변 영역이 hu3D6VLv1(서열 번호 20), hu3D6VLv2(서열 번호 21, hu3D6VLv3(서열 번호 22) 및 hu3D6VLv4(서열 번호 23)와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 보여주는 3D6 인간화된 항체의 변이체를 제공한다. 몇몇 이러한 항체에서, 서열 번호 15 내지 19, 서열 번호 20 내지 23 및 서열 번호 46 내지 57에서의 역돌연변이 또는 다른 돌연변이의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개 또는 모든 39개가 보유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H38은 R에 의해 점유되고, H93은 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H38 및 H93 위치는 각각 R 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H38은 R에 의해 점유되고, H43은 Q에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유되고, H93은 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H38, H43, H83 및 H93 위치는 각각 R, Q, T 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H12는 V에 의해 점유되고, H24는 A에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H67은 A에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H81은 Q에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H48, H67, H80, H81 및 H91 위치는 각각 V, A, I, A, L, Q 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H13은 R에 의해 점유되고, H66은 K에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H13 및 H66 위치는 각각 R 및 K에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H40은 R에 의해 점유되고, H82a는 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H40 및 H82a 위치는 각각 R 및 G에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H42는 E에 의해 점유되고, H76은 N에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H42 및 H76 위치는 각각 E 및 N에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H40은 R에 의해 점유되고, H82a는 G에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H40, H82a 및 H83 위치는 각각 R, G 및 T에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12는 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H80은 L에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H24는 A에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H67은 A에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H24, H48, H67, H80 및 H91 위치는 각각 A, I, A, L 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H43은 Q에 의해 점유되고, H81은 Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H43 및 H81 위치는 각각 Q 및 Q에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H24는 A에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H24 및 H91 위치는 각각 A 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H13은 R에 의해 점유되고, H17은 L에 의해 점유되고, H29는 F에 의해 점유되고, H42는 E에 의해 점유되고, H43은 Q에 의해 점유되고, H61은 E에 의해 점유되고, H76은 N에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H81은 Q에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H13, H17, H29, H42, H43, H61, H76, H80 및 H81 위치는 각각 R, L, F, E, Q, E, N, L 및 Q에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H24는 A에 의해 점유되고, H28은 T에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H54는 D에 의해 점유되고, H60은 A에 의해 점유되고, H67은 A에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H24, H28, H48, H54, H60, H67, H80 및 H91 위치는 각각 A, T, I, D, A, A, L 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H10은 D에 의해 점유되고, H17은 L에 의해 점유되고, H24는 A에 의해 점유되고, H28은 T에 의해 점유되고, H43은 Q에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H60은 A에 의해 점유되고, H61은 E에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유되고, H108은 T에 의해 점유되고, H109는 L에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H10, H17, H24, H28, H43, H48, H60, H61, H91, H108 및 H109 위치는 각각 D, L, A, T, Q, I, A, E, F, T 및 L에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H17은 L에 의해 점유되고, H27은 Y에 의해 점유되고, H29는 F에 의해 점유되고, H61은 E에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H17, H27, H29 및 H61 위치는 각각 L, Y, F 및 E에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H17은 L에 의해 점유되고, H27은 Y에 의해 점유되고, H29는 F에 의해 점유되고, H61은 E에 의해 점유되고, H76은 N에 의해 점유되고, H82a는 G에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H17, H27, H29, H61, H76 및 H82a 위치는 각각 L, Y, F, E, N 및 G에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H12는 V에 의해 점유되고, H17은 L에 의해 점유되고, H24는 A에 의해 점유되고, H43은 Q에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H17, H24, H43, H48, H83, 및 H91 위치는 각각 V, L, A, Q, I, T, F에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H12는 V에 의해 점유되고, H24는 A에 의해 점유되고, H48은 I에 의해 점유되고, H67은 A에 의해 점유되고, H80은 L에 의해 점유되고, H83은 T에 의해 점유되고, H91은 F에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H48, H67, H80, H83 및 H91 위치는 각각 V, A, I, A, L, T 및 F에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: H10은 E 또는 D에 의해 점유되고, H12는 K 또는 V에 의해 점유되고, H13은 K 또는 R에 의해 점유되고, H17은 T, L 또는 S에 의해 점유되고, H24는 V 또는 A에 의해 점유되고, H27은 F 또는 Y에 의해 점유되고, H28은 N 또는 T에 의해 점유되고, H29는 I 또는 F에 의해 점유되고, H30은 K 또는 T에 의해 점유되고, H38은 Q 또는 R에 의해 점유되고, H40은 A 또는 R에 의해 점유되고, H42는 G 또는 E에 의해 점유되고, H43은 K 또는 Q에 의해 점유되고, H48은 M 또는 I에 의해 점유되고, H51은 V 또는 I에 의해 점유되고, H54는 N 또는 D에 의해 점유되고, H60은 D 또는 A에 의해 점유되고, H61은 P 또는 E에 의해 점유되고, H66은 R 또는 K에 의해 점유되고, H67은 V 또는 A에 의해 점유되고, H76은 D 또는 N에 의해 점유되고, H80은 M 또는 L에 의해 점유되고, H81은 E 또는 Q에 의해 점유되고, H82a는 S 또는 G에 의해 점유되고, H83은 T 또는 R에 의해 점유되고, H91은 Y 또는 F에 의해 점유되고, H93은 A 또는 S에 의해 점유되고, H102는 F 또는 Y에 의해 점유되고, H108은 T 또는 L에 의해 점유되고, H109는 L 또는 V에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H13, H17, H24, H38, H42, H43, H48, H66, H67, H76, H80, H81, H83, H91 및 H93 위치는 hu3D6VHv1에서처럼 각각 V, R, L, A, R, E, Q, I, K, A, N, L, Q, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H38, H42, H43, H76, H83, 및 H93 위치는 hu3D6VHv2에서처럼 각각 R, E, Q, N, T 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H13, H17, H24, H38, H40, H42, H43, H48, H66, H67, H76, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 hu3D6VHv1b에서처럼 각각 V, R, L, A, R, R, E, Q, I, K, A, N, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H38, H40, H43, H48, H67, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 hu3D6VHv1bA11에서처럼 각각 V, A, R, R, Q, I, A, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H28, H38, H40, H43, H48, H54, H60, H67, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 hu3D6VHv5에서처럼 각각 V, A, T, R, R, Q, I, D, A, A, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H28, H38, H40, H48, H51, H54, H60, H67, H80, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 hu3D6VHv1bA11B6G2에서처럼 각각 V, A, T, R, R, I, V, D, A, A, L, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H24, H28, H38, H40, H48, H54, H60, H67, H80, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 hu3D6VHv1bA11B6H3에서처럼 각각 V, A, T, R, R, I, D, A, A, L, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H13, H17, H24, H29, H38, H40, H42, H43, H54, H61, H76, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 hu3D6VHv1c에서처럼 각각 R, L, A, F, R, R, E, Q, N, E, N, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H13, H17, H24, H27, H28, H29, H30, H38, H40, H42, H43, H51, H54, H60, H61, H76, H80, H81, H82A, H83, H91 및 H93 위치는 hu3D6VHv1d에서처럼 각각 R, L, A, Y, T, F, T, R, R, E, Q, V, D, A, E, N, L, Q, G, T, F 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H10, H12, H17, H24, H28, H38, H40, H42, H43, H48, H54, H60, H61, H76, H80, H82A, H83, H91, H93, H108 및 H109 위치는 hu3D6VHv1e에서처럼 각각 D, V, L, A, T, R, R, E, Q, I, N, A, E, N, L, G, T, F, S, T 및 L에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H10, H12, H17, H24, H28, H38, H40, H43, H48, H51, H54, H60, H61, H82A, H83, H91, H93, H102, H108 및 H109 위치는 hu3D6VHv1f에서처럼 각각 D, V, L, A, T, R, R, Q, I, V, D, A, E, G, T, F, S, Y, T 및 L에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H38 및 H93 위치는 hu3D6VHv3에서처럼 각각 R 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H17, H27, H29, H38, H61, H76, H82A 및 H93 위치는 hu3D6VHv3b에서처럼 각각 L, Y, F, R, E, N, G 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H17, H27, H28, H29, H30, H38, H51, H54, H60, H61, H76, H82A 및 H93 위치는 hu3D6VHv3c에서처럼 각각 L, Y, T, F, T, R, V, D, A, E, N, G 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H38, H40, H48, H66, H67, H76, H80, H82A, H83 및 H93 위치는 hu3D6VHv4에서처럼 각각 V, R, R, I, K, A, N, L, G, T 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H17, H27, H29, H38, H40, H61, H80, H82A, H83 및 H93 위치는 hu3D6VHv4b에서처럼 각각 V, L, Y, F, R, R, E, L, G, T 및 S에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VH 영역에서의 H12, H17, H27, H28, H29, H30, H38, H40, H51, H54, H60, H61, H80, H82A, H83 및 H93 위치는 hu3D6VHv4c에서처럼 각각 V, L, Y, T, F, T, R, R, V, D, A, E, L, G, T 및 S에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VL 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L36은 L에 의해 점유되고, L37은 L에 의해 점유되고, L100은 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 위치 L36, L37 및 L100 영역은 각각 L, L 및 G에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VL 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L12는 S에 의해 점유되고, L45는 K에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 13D6 항체에서, VL 영역에서의 L12 및 L45 위치는 각각 S 및 K에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VL 영역에서의 하기 위치 중 적어도 하나는 기재된 바와 같은 아미노산에 의해 점유된다: L2는 V 또는 I이고, L7은 S 또는 T이고, L12는 P 또는 S이고, L15는 L 또는 I이고, L36은 L이고, L37은 L이고, L45는 R 또는 K이고, L60은 D 또는 S이고, L100은 G이다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VL 영역에서의 L12, L36, L37, L45 및 L100 위치는 hu3D6VLv1에서처럼 각각 S, L, L, K 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VL 영역에서의 L36, L37 및 L100 위치는 hu3D6VLv2에서처럼 각각 L, L 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VL 영역에서의 L36, L37, L60 및 L100 위치는 hu3D6VLv3에서처럼 각각 L, L, S 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VL 영역에서의 L2, L7, L12, L15, L36, L37, L45 및 L100 위치는 hu3D6VLv4에서처럼 각각 I, T, S, I, L, L, K 및 G에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, VL 영역에서의 L2, L7, L12, L15, L36, L37, L45 및 L100 위치는 각각 V, S, P, L, L, L, R 및 G에 의해 점유된다.
몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 가변 중쇄는 인간 서열에 85% 이상의 동일성을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 가변 경쇄는 인간 서열에 85% 이상의 동일성을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 각각은 인간 생식선 서열에 85% 이상의 동일성을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 3개의 중쇄 CDR은 카밧/쵸티아 컴포지트(서열 번호 8, 9 및 10)에 의해 정의된 바와 같고, 3개의 경쇄 CDR은 카밧/쵸티아 컴포지트(서열 번호 12, 13 및 14)에 의해 정의된 바와 같고; 단 H27 위치는 F 또는 Y에 의해 점유되고, H28 위치는 N 또는 T에 의해 점유되고, H29 위치는 I 또는 F에 의해 점유되고, H30 위치는 K 또는 T에 의해 점유되고, H51 위치는 I 또는 V에 의해 점유되고, H54 위치는 N 또는 D에 의해 점유되고, H60 위치는 D 또는 A에 의해 점유되고, H61 위치는 P 또는 E에 의해 점유되고, H102 위치는 F 또는 Y에 의해 점유된다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧/쵸티아 컴포지트 CDR-H1은 서열 번호 42, 서열 번호 58, 서열 번호 69 또는 서열 번호 60을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧 CDR-H2는 서열 번호 43, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63 또는 서열 번호 64를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 인간화된 3D6 항체에서, 카밧 CDR-H3은 서열 번호 65를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
이러한 인간화된 항체의 CDR 영역은 3D6의 CDR 영역과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있고, CDR 영역은 임의의 종래의 정의(예를 들어, 쵸티아, 또는 쵸티아 및 카밧의 컴포지트)에 의해 정의될 수 있지만, 바람직하게는 카밧에 의해 정의된 바와 같다.
가변 영역 프레임워크 위치는, 달리 기재되지 않는 한, 카밧 넘버링에 따른다. 다른 이러한 변이체는 통상적으로 대체, 결실 또는 삽입의 작은 수(예를 들어, 통상적으로 1개, 2개, 3개, 5개, 10개 또는 15개 이하)로 예시된 Hu3D6 중쇄 및 경쇄의 서열과 다르다. 이러한 차이는 보통 프레임워크에 있지만, 또한 CDR에서 발생할 수 있다.
인간화된 3D6 변이체에서의 추가적인 변이에 대한 가능성은 가변 영역 프레임워크에서 추가적인 역돌연변이이다. 인간화된 mAb에서 CDR과 접촉하지 않는 많은 프레임워크 잔기는 도너 마우스 mAb 또는 다른 마우스 또는 인간 항체의 상응하는 위치로부터 아미노산의 치환을 수용할 수 있고, 심지어 많은 가능한 CDR-접촉 잔기는 또한 치환에 수정 가능하다. 심지어 CDR 내의 아미노산은 예를 들어 가변 영역 프레임워크를 공급하기 위해 사용된 인간 억셉터 서열의 상응하는 위치에서 발견된 잔기에 의해 변경될 수 있다. 또한, 대안적인 인간 억셉터 서열을 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄에 사용할 수 있다. 상이한 억셉터 서열이 사용되는 경우, 상응하는 도너 및 억셉터 잔기가 이미 역돌연변이가 없는 것이므로, 상기 추천된 하나 초과의 역돌연변이를 수행할 수 없다.
바람직하게는, 인간화된 3D6 변이체에서의 대체 또는 역돌연변이(보존되든 또는 아니든)는 인간화된 mAb의 결합 친화도 또는 효력, 즉 타우에 결합하는 이의 능력에 실질적인 효과를 갖지 않는다.
인간화된 3D6 항체는 인산화된 및 비인산화된 타우 및 타우의 미스폴딩된/응집된 형태 둘 다에 결합하는 이의 능력을 추가로 특징으로 한다.
D. 키메라 및 비니어드 항체
본 발명은 비인간 항체의 키메라 및 비니어드 형태, 특히 실시예의 3D6 항체를 추가로 제공한다.
키메라 항체는 비인간 항체(예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합되는 항체이다. 이러한 항체는 실질적으로 또는 전부 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하고, 인간 서열의 약 2/3이다. 실시형태에서, 키메라 3D6 항체는 서열 번호 72의 중쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 73의 경쇄 아미노산 서열을 갖는다.
비니어드 항체는 CDR의 몇몇 및 보통 전부 및 비인간 항체의 비인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 몇몇을 보유하지만, 인간 항체 서열의 상응하는 위치로부터의 잔기에 의해 B 또는 T 세포 에피토프를 구성할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들어 노출된 잔기(Padlan, Mol . Immunol. 28:489, 1991)를 대체하는 인간화된 항체의 형태이다. 결과는 CDR이 전부 또는 실질적으로 비인간 항체 유래이고 비인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 치환에 의해 더 인간 같이 만들어진 항체이다. 3D6 항체의 비니어드 형태는 본 발명에 포함된다.
E. 인간 항체
타우 또는 이의 단편에 대한 인간 항체(예를 들어, 서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응하는 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기)는 하기 기재된 다양한 기법에 의해 제공된다. 몇몇 인간 항체는 실시예에 기재된 마우스 단일클론 항체 중 하나와 같은 특정한 마우스 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖도록 경쟁적 결합 실험에 의해, 상기 또는 달리 Winter의 파지 디스플레이 방법에 의해 선택된다. 인간 항체는 표적 항원으로서 오직 타우의 단편, 예컨대 오직 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응)를 함유하는 타우 단편을 사용함으로써, 및/또는 타우 변이체, 예컨대 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응) 내의 다양한 돌연변이를 함유하는 타우 변이체의 수집에 대해 항체를 스크리닝함으로써 특정한 에피토프 특이성에 대해 또한 스크리닝될 수 있다.
인간 항체를 제조하는 방법은 Oestberg et al., Hybridoma 2:361-367 (1983) 등의 트리오마 방법[미국 특허 제4,634,664호(Oestberg); 및 US 특허 제4,634,666호(Engleman 등)], 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 형질전환 마우스의 사용(예를 들어, WO93/12227(1993)(Lonberg 등); US 5,877,397; US 5,874,299; US 5,814,318; US 5,789,650; US 5,770,429; US 5,661,016; US 5,633,425; US 5,625,126; US 5,569,825; US 5,545,806; Neuberger, Nat. Biotechnol . 14:826 (1996); 및 Kucherlapati, WO 91/10741(1991) 참조); 파지 디스플레이 방법(예를 들어, WO 91/17271(Dower 등); WO 92/01047(McCafferty 등); US 5,877,218; US 5,871,907; US 5,858,657; US 5,837,242; US 5,733,743; 및 US 5,565,332 참조); 및 WO 2008/081008에 기재된 방법(예를 들어, 예를 들어 EBV에 의해 인간으로부터 단리된 기억 B 세포의 불멸화, 원하는 특성에 대한 스크리닝, 및 재조합 형태의 클로닝 및 발현)을 포함한다.
F. 불변 영역의 선택
키메라, 비니어드 또는 인간화된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 일부에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은 부분적으로 항체 의존적 세포 매개된 세포독성, 항체 의존적 세포 식세포작용 및/또는 보체 의존적 세포독성이 원해지는지에 따라 달라진다. 예를 들어, 인간 아이소타입 IgG1 및 IgG3은 보체 의존적 세포독성을 갖지만, 인간 아이소타입 IgG2 및 IgG4는 갖지 않는다. 인간 IgG1 및 IgG3은 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다 더 강한 세포 매개된 효과기 기능을 유도한다. 경쇄 불변 영역은 람다 또는 카파일 수 있다. 불변 영역에 대한 넘버링 관례는 EU 넘버링(Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)), 카밧 넘버링(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991), IMGT 고유 넘버링(Lefranc M.-P. et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor constant domains and Ig superfamily C-like domains, Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)) 및 IMGT 엑손 넘버링(상기 Lefranc)을 포함한다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에서의 하나의 또는 몇몇 아미노산, 예컨대 중쇄의 C 말단 라이신은 분자의 일부 또는 전부에서 소실되거나 유도체화될 수 있다. 치환은 효과기 기능, 예컨대 보체 매개된 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 증가시키기 위해(예를 들어, US 특허 제5,624,821호(Winter 등); US 특허 제5,834,597호(Tso 등); 및 Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해(예를 들어, 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004] 참조) 불변 영역에서 이루어질 수 있다. 예시적인 치환은 항체의 반감기를 증가시키기 위해 250번 위치에서의 Gln 및/또는 428번 위치에서의 Leu(EU 넘버링은 불변 영역에 대해 이 문단에 사용됨)를 포함한다. 임의의 또는 모든 234번, 235번, 236번 및/또는 237번 위치에서의 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다(예를 들어, US 6,624,821 참조). 인간 IgG1의 234번, 235번 및 237번 위치에서의 알라닌 치환은 효과기 기능을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 항체는 효과기 기능을 감소시키기 위해 인간 IgG1의 234번, 235번 및 237번 위치에서의 알라닌 치환을 갖는다. 임의로, 인간 IgG2에서의 234번, 236번 및/또는 237번 위치는 알라닌에 의해 치환되고, 235번 위치는 글루타민에 의해 치환된다(예를 들어, US 5,624,821 참조). 몇몇 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의한 241번, 264번, 265번, 270번, 296번, 297번, 322번, 329번 및 331번 위치 중 하나 초과에서의 돌연변이를 사용한다. 몇몇 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의한 318번, 320번 및 322번 위치 중 하나 초과에서의 돌연변이를 사용한다. 몇몇 항체에서, 234번 및/또는 235번 위치는 알라닌에 의해 치환되고/되거나, 329번 위치는 글라이신에 의해 치환된다. 몇몇 항체에서, 234번 및 235번 위치는 알라닌에 의해 치환된다. 몇몇 항체에서, 아이소타입은 인간 IgG2 또는 IgG4이다.
항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 사합체로서, 별개의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv로서 또는 중쇄 및 경쇄 성숙 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결된 단쇄 항체로서 발현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개인 사이에 알로타입 변동 및 아이소알로타입 변동을 보여주고, 즉 불변 영역은 하나 초과의 다형 위치에서 상이한 개인에서 다를 수 있다. 아이소알로타입은 아이소알로타입을 인식하는 혈청이 하나 초과의 다른 아이소타입의 비다형 영역에 결합한다는 점에서 알로타입과 다르다. 따라서, 예를 들어 또 다른 중쇄 불변 영역은 C 말단 라이신을 갖거나 갖지 않는 IgG1 G1m3 이다. 인간 불변 영역에 대한 언급은 임의의 천연 알로타입을 갖는 불변 영역 또는 천연 알로타입에서 위치를 점유하는 잔기의 임의의 순열을 포함한다.
G. 재조합 항체의 발현
항체 발현 세포주(예를 들어, 하이브리도마)를 사용하여 키메라 및 인간화된 항체를 제조하기 위한 다수의 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 항체의 면역글로불린 가변 영역은 널리 공지된 방법을 이용하여 클로닝되고 서열분석될 수 있다. 일 방법에서, 중쇄 가변 VH 영역은 하이브리도마 세포로부터 제조된 mRNA를 사용하여 RT-PCR에 의해 클로닝된다. 공통 프라이머는 5' 프라이머 및 g2b 불변 영역 특이적 3' 프라이머로서 번역 개시 코돈을 포함하는 VH 영역 리더 펩타이드에 사용된다. 예시적인 프라이머는 미국 특허 공보 US 2005/0009150(Schenk 등)(이하, "Schenk")에 기재되어 있다. 다수의 독립적으로 유래된 클론으로부터의 서열은 증폭 동안 변경이 도입되지 않도록 보장하도록 비교될 수 있다. VH 영역의 서열은 5' RACE RT-PCR 방법론 및 3' g2b 특이적 프라이머에 의해 얻은 VH 단편을 서열분석함으로써 또한 결정되거나 확인될 수 있다.
경쇄 가변 VL 영역은 유사한 방식으로 클로닝될 수 있다. 일 접근법에서, 공통 프라이머 세트는 번역 개시 코돈을 포함하는 VL 영역을 혼성화하도록 설계된 5' 프라이머 및 V-J 연결 영역의 하류의 Ck 영역에 특이적인 3' 프라이머를 사용하여 VL 영역의 증폭에 설계된다. 제2 접근법에서, 5'RACE RT-PCR 방법론은 cDNA를 코딩하는 VL을 클로닝하도록 이용된다. 예시적인 프라이머는 상기 Schenk 문헌에 기재되어 있다. 이후, 클로닝된 서열은 인간(또는 다른 비인간 종) 불변 영역을 코딩하는 서열과 조합된다.
일 접근법에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각의 VDJ 또는 VJ 연접부의 하류에 스플라이스 도너 서열을 코딩하도록 재조작되고, 포유류 발현 벡터, 예컨대 중쇄에 대해 pCMV-hγ1 및 경쇄에 대해 pCMV-Mcl로 클로닝된다. 이 벡터는 삽입된 가변 영역 카세트의 하류에 엑손 단편으로서 인간 γ1 및 Ck 불변 영역을 코딩한다. 서열 검증 이후, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터는 키메라 항체를 제조하기 위해 CHO 세포로 동시형질주입될 수 있다. 컨디셔닝된 배지를 형질주입 후 48시간에 수집하고, 항체 제조를 위해 웨스턴 블롯 분석에 의해 또는 항원 결합을 위해 ELISA에 의해 평가한다. 키메라 항체는 상기 기재된 바대로 인간화된다.
키메라, 비니어드, 인간화된 및 인간 항체는 통상적으로 재조합 발현에 의해 제조된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물은 통상적으로 천연으로 연관된 또는 비상동성인 발현 제어 유전요소, 예컨대 촉진자를 포함하는 항체 사슬의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 발현 제어 서열은 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질주입시킬 수 있는 벡터에서 촉진자 시스템일 수 있다. 벡터가 적절한 숙주로 도입되면, 숙주는 뉴클레오타이드 서열의 높은 수준 발현 및 교차반응하는 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에 유지된다.
이 발현 벡터는 통상적으로 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합 부분으로서 숙주 유기체에서 복제 가능하다. 흔히, 발현 벡터는 원하는 DNA 서열에 의해 형질전환된 이 세포의 검출을 허용하도록 선택 마커, 예를 들어 암피실린 내성 또는 하이그로마이신 내성을 함유한다.
이. 콜라이는 항체, 특히 항체 단편을 발현하기에 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 미생물, 예컨대 효모는 발현에 또한 유용하다. 사카로마이세스는 원하는 바대로 발현 제어 서열, 복제 기원, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 갖는 효모 숙주이다. 통상적인 촉진자는 3-포스포글라이세레이트 키나제 및 다른 해당 효소를 포함한다. 유도성 효모 촉진자는 무엇보다도 알코올 탈수효소로부터의 촉진자, 아이소사이토크롬 C, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소를 포함한다.
포유류 세포는 면역글로불린 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오타이드 분절을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 문헌[Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987)]을 참조한다. 온전한 비상동성 단백질을 분비할 수 다수의 적합한 숙주 세포주가 있는 개발되었고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포 및 비항체 생성 골수종, 예를 들어 Sp2/0 및 NS0을 포함한다. 세포는 비인간일 수 있다. 이 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기원, 촉진자, 인핸서(Queen et al., Immunol . Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 처리 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 내인성 유전자로부터 유래된 촉진자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스 등을 포함할 수 있다. 문헌[Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992)]을 참조한다.
대안적으로, 항체 코딩 서열은 형질전환 동물의 게놈으로의 도입 및 형질전환 동물의 젖에서 후속하는 발현을 위해 전이유전자로 도입될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,741,957호; 미국 특허 제5,304,489호; 및 미국 특허 제5,849,992호 참조). 적합한 전이유전자는 카제인 또는 베타 락토글로불린과 같은 유선 특이적 유전자로부터의 촉진자 및 인핸서에 의해 작동 가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄를 위한 코딩 서열을 포함한다.
관심 대상의 DNA 분절을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 방법에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질주입 원핵 세포에서 흔히 사용되는 한편, 인산칼슘 처리, 전기영동, 리포펙션, 유전자총법 또는 바이러스 기반 형질주입은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. 포유류 세포를 형질전환하기 위해 사용된 다른 방법은 폴리브렌의 사용, 원형질체 융합, 리포솜, 전기영동 및 미량주사를 포함한다. 형질전환 동물의 제조를 위해, 전이유전자는 수정된 난모세포로 미량주사될 수 있거나, 배아 줄기 세포의 게놈, 및 유핵 난모세포로 전달된 이러한 세포의 핵으로 도입될 수 있다.
세포 배양물로 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터(들)가 도입되면, 세포 풀은 혈청 비함유 배지에서 성장 생산성 및 생성물 품질에 대해 스크리닝될 수 있다. 이후, 상부-생성 세포 풀은 단일클론 라인을 생성하도록 FACS 기반 단일 세포 클로닝으로 처리될 수 있다. 특이적 생산성은 매일 세포마다 50pg 또는 100pg 초과이고, 이는 배양물 ℓ당 7.5g 초과의 생성물 역가에 상응하고, 사용될 수 있다. 단일 세포 클론에 의해 제조된 항체는 혼탁도, 여과 특성, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고사카라이드 맵핑, 질량 분광법 및 결합 검정, 예컨대 ELISA 또는 Biacore에 대해 또한 시험될 수 있다. 이후, 선택된 클론은 다수의 바이알에서 뱅킹되고, 후속하는 사용을 위해 냉동 저장될 수 있다.
발현되면, 항체는 단백질 A 포획, HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당해 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로 문헌[Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)] 참조).
항체의 상업적 제조를 위한 방법론은 코돈 최적화, 촉진자의 선택, 전사 유전요소의 선택, 종결자의 선택, 혈청 비함유 단일 세포 클로닝, 세포 뱅킹, 카피수의 증폭을 위한 선택 마커의 사용, CHO 종결자 또는 단백질 역가의 개선을 포함하여 이용될 수 있다(예를 들어, US 5,786,464; US 6,114,148; US 6,063,598; US 7,569,339; W02004/050884; W02008/012142; W02008/012142; W02005/019442; W02008/107388; W02009/027471; 및 US 5,888,809 참조).
IV. 능동 면역원
능동 면역화에 사용된 물질은 환자에서 상기 수동 면역화와 연결되어 기재된 항체의 동일한 유형을 유도하도록 작용한다. 능동 면역화에 사용된 물질은 실험실 동물에서 단일클론 항체를 생성하기 위해 사용된 면역원의 동일한 유형, 예를 들어 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 잔기에 상응하는 타우의 영역(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 잔기에 상응)으로부터의 3개 내지 15개 또는 3개 내지 12개 또는 5개 내지 12개, 또는 5개 내지 8개의 인접 아미노산의 펩타이드, 예를 들어 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 잔기(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 잔기에 상응)를 포함하는 펩타이드 등일 수 있다. 3D6과 동일한 또는 중첩하는 에피토프에 대한 항체 결합을 유도하기 위해, 이 항체의 에피토프 특이성은 (예를 들어, 타우에 걸친 중첩하는 펩타이드의 시리즈에 대한 결합을 시험함으로써) 맵핑될 수 있다. 이후, 에피토프로 이루어지거나 이를 포함하거나 이를 중첩시키는 단편은 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 단편은 통상적으로 비인산화된 형태로 사용된다.
비상동성 운반체 및 애쥬번트는 사용되는 경우 단일클론 항체를 생성하기 위해 사용된 것과 동일할 수 있지만, 인간에서 사용하기에 더 양호한 약제학적 적합성에 대해 또한 선택될 수 있다. 적합한 운반체는 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모사이아닌, 면역글로불린 분자, 타이로글로불린, 난알부민, 테타누스 톡소이드 또는 다른 병원성 박테리아, 예컨대 디프테리아(예를 들어, CRM197)로부터의 톡소이드, 이. 콜라이, 콜레라 또는 에이치. 파일로리 또는 약독화된 독소 유도체를 포함한다. T 세포 에피토프는 또한 적합한 운반 분자이다. 몇몇 접합체는 본 발명의 물질을 면역자극 중합체 분자(예를 들어, 트라이팔미토일-S-글라이세린 시스테인(Pam3Cys), 만난(만노스 중합체), 또는 글루칸(β1→2 중합체)), 사이토카인(예를 들어, IL-1, IL-1 알파 및 β 펩타이드, IL-2, γ-INF, IL-10, GM-CSF) 및 케모카인(예를 들어, MIP1-α 및 β, 및 RANTES)에 연결함으로써 형성될 수 있다. 면역원은 스페이서 아미노산(예를 들어, gly-gly)과 함께 또는 이것 없이 운반체에 연결될 수 있다. 추가적인 운반체는 바이러스 유사 입자를 포함한다. 슈도비리온 또는 바이러스 유래 입자로도 불리는 바이러스 유사 입자(VLP)는 바이러스 캡시드 및/또는 생체내의 한정된 구형 대칭의 VLP로 자가 조립할 수 있는 엔벨로프 단백질의 다수의 카피로 이루어진 아단위 구조를 나타낸다. (Powilleit, et al., (2007) PLoS ONE 2(5):e415.) 대안적으로, 펩타이드 면역원은 MHC 클래스 II 분자, 예컨대 pan DR 에피토프("PADRE")의 많은 비율에 결합할 수 있는 적어도 하나의 인공 T 세포 에피토프에 연결될 수 있다. PADRE는 문헌[US 5,736,142, WO 95/07707, 및 Alexander J et al, Immunity, 1:751-761 (1994)]에 기재되어 있다. 능동 면역원은 면역원의 다수의 카피 및/또는 이의 운반체가 단일 공유 분자로서 제시되는 다합체 형태로 제시될 수 있다.
단편은 대개 약제학적으로 허용 가능한 애쥬번트와 함께 투여된다. 애쥬번트는 펩타이드가 단독으로 사용되는 경우의 상황에 대해 유도된 항체의 역가 및/또는 유도된 항체의 결합 친화도를 증가시킨다. 다양한 애쥬번트는 면역 반응을 유발하도록 타우의 면역원성 단편과 조합되어 사용될 수 있다. 바람직한 애쥬번트는 반응의 정성적 형태에 영향을 미치는 면역원에서의 구성적 변경을 발생시키지 않으면서 면역원에 대한 고유 반응을 증대시킨다. 바람직한 애쥬번트는 알루미늄염, 예컨대 수산화알루미늄 및 알루미늄 포스페이트, 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL(상표명))를 포함한다(GB 2220211(RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, 현재 Corixa의 일부) 참조). Stimulon(상표명) QS-21은 남아메리카에서 발견되는 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 나무의 껍질에서 단리된 트라이테르펜 글라이코사이드 또는 사포닌이다(문헌[Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US 5,057,540), (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA; 현재 Antigenics, Inc.(뉴욕주 뉴욕)) 참조). 다른 애쥬번트는 임의로 면역 자극제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A와 조합된 수중유 에멀션(예컨대, 스쿠알렌 또는 땅콩유)(문헌[Stoute et al., N. Engl . J. Med . 336, 86-91 (1997)] 참조), 플루로닉 중합체 및 사멸된 마이코박테리아이다. Ribi 애쥬번트는 수중유 에멀션이다. Ribi는 Tween 80을 함유하는 식염수에 의해 유화된 대사 가능한 오일(스쿠알렌)을 함유한다. Ribi는 면역자극제 및 박테리아 모노포스포릴 지질 A로서 작용하는 정제된 마이코박테리아 생성물을 또한 함유한다. 또 다른 애쥬번트는 CpG(WO 98/40100)이다. 애쥬번트는 활성제를 갖는 치료학적 조성물의 성분으로서 투여될 수 있거나, 치료제의 투여 전에, 이와 동시에 또는 이것 후에 별개로 투여될 수 있다
타우에 대해 항체를 유도하는 타우의 천연 단편의 유사체를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 하나 초과의 또는 모든 L-아미노산은 이러한 펩타이드에서 D 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 또한, 아미노산의 순서는 역전될 수 있다(레트로 펩타이드). 임의로, 펩타이드는 역전된 순서로 모든 D-아미노산(레트로-인베르소 펩타이드)을 포함한다. 펩타이드 및 다른 화합물은 타우 펩타이드와 상당한 아미노산 서열 유사성을 가질 필요는 없지만, 그럼에도 불구하고 타우 펩타이드의 모방체로서 작용하고, 유사한 면역 반응을 유도한다. 상기 기재된 바와 같은 타우에 대한 단일클론 항체에 대한 항-이디오타입 항체를 또한 사용할 수 있다. 이러한 항-Id 항체는 항원을 모방하고, 이것에 면역 반응을 생성한다(문헌[Essential Immunology, Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6th ed., p. 181] 검토).
펩타이드(및 임의로 펩타이드에 융합된 운반체)는 펩타이드를 코딩하고 환자에서 인시츄로 발현된 핵산의 형태로 또한 투여될 수 있다. 면역원을 코딩하는 핵산 분절은 환자의 의도된 표적 세포에서 DNA 분절의 발현을 허용하는 조절 유전요소, 예컨대 촉진자 및 인핸서에 통상적으로 연결된다. 혈액 세포에서의 발현을 위해, 면역 반응의 유도에 바람직한 것처럼, 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 촉진자 및 인핸서 유전요소 또는 CMV 주요 중간 초기 촉진자 및 인핸서는 발현을 지시하기에 적합하다. 연결된 조절 유전요소 및 코딩 서열은 대개 벡터로 클로닝된다. 항체는 항체 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산의 형태로 또한 투여될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다가 존재하는 경우, 사슬은 바람직하게는 단쇄 항체로서 연결된다. 수동 투여를 위한 항체는 예를 들어 펩타이드 면역원에 의해 치료된 환자의 혈청으로부터의 친화도 크로마토그래피에 의해 또한 제조될 수 있다.
DNA는 네이키드 형태로(즉, 콜로이드 또는 캡슐화 재료 없이) 전달될 수 있다. 대안적으로, 레트로바이러스 시스템(예를 들어, 문헌[Lawrie and Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993)] 참조); 아데노바이러스 벡터(예를 들어, 문헌[Bett et al, J. Virol. 67, 591 1 (1993)] 참조); 아데노 연관된 바이러스 벡터(예를 들어, 문헌[Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867(1994)] 참조), 백시니아 바이러스 및 조류 수두 바이러스를 포함하는 수두 패밀리로부터의 바이러스 벡터, 알파 바이러스 속으로부터의 바이러스 벡터, 예컨대 신드비스(Sindbis) 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스로부터 유래된 것(예를 들어, 문헌[Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519 (1996)] 참조), 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(US 5,643,576 참조) 및 랍도바이러스, 예컨대 수포성 구내염 바이러스(WO 96/34625 참조) 및 파필로마바이러스(Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995); Woo et al, WO 94/12629 및 Xiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (1996))를 포함하는 다수의 바이러스 벡터 시스템을 사용할 수 있다.
면역원을 코딩하는 DNA, 또는 이를 함유하는 벡터는 리포솜으로 패키징될 수 있다. 적합한 지질 및 관련된 유사체는 US 5,208,036, US 5,264,618, US 5,279,833 및 US 5,283,185에 의해 기재되어 있다. 벡터 및 면역원을 코딩하는 DNA는 또한 미립자 운반체에 흡착되거나 이와 연관될 수 있고, 이의 예는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체 및 폴리락타이드 및 폴리(락타이드-코-글라이콜라이드)를 포함한다(예를 들어, 문헌[McGee et al., J. Micro Encap. 1996] 참조).
H. 항체 스크리닝 검정
항체는 초기에 상기 기재된 바와 같은 의도된 결합 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다. 능동 면역원은 이러한 결합 특이성을 갖는 항체를 유도하는 역량에 대해 마찬가지로 스크리닝될 수 있다. 이러한 경우에, 능동 면역원은 실험실 동물을 면역화하기 위해 사용되고, 생성된 혈청은 적절한 결합 특이성에 대해 시험된다.
이후, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체는 세포 및 동물 모델에서 시험될 수 있다. 이러한 스크리닝에 사용된 세포는 우선적으로 뉴런 세포이다. 신경아세포종 세포가 타우의 4-반복 도메인에 의해 임의로 타우 병리학과 연관된 돌연변이에 의해 형질주입된, 타우 병리학의 세포 모델이 보고되어 있다(예를 들어, delta K280, 문헌[Khlistunova, Current Alzheimer Research 4, 544-546 (2007)] 참조). 또 다른 모델에서, 타우는 데옥시사이클린의 첨가에 의해 신경아세포종 N2a 세포주에서 유도된다. 세포 모델은 가용성 또는 응집된 상태에서 세포에 대한 타우의 독성, 타우 유전자 발현에 대한 스위칭 후에 타우 응집체의 외관, 다시 유전자 발현 오프를 스위칭한 후에 타우 응집체의 분해 및 타우 응집체의 형성의 저해 또는 이의 탈응집에서 항체의 효율을 연구할 수 있게 한다.
항체 또는 능동 면역원은 타우와 연관된 질환의 형질전환 동물 모델에서 또한 스크리닝될 수 있다. 이러한 형질전환 동물은 무엇보다도 타우 전이유전자(예를 들어, 임의의 인간 아이소폼) 및 임의로 인간 APP 전이유전자, 예컨대 타우를 인산화하는 키나제, ApoE, 프레세닐린 또는 알파 시누클레인을 포함할 수 있다. 이러한 형질전환 동물은 타우와 연관된 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 발생시키도록 배치된다.
예시적인 형질전환 동물은 마우스의 K3 라인이다(Itner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(41):15997-6002 (2008)). 이 마우스는 K 369 I 돌연변이(돌연변이는 픽병과 연관됨) 및 Thy 1.2 촉진자를 갖는 인간 타우 전이유전자를 갖는다. 이 모델은 신경퇴행, 운동 결핍 및 구심성 섬유의 퇴행 및 소뇌 과립 세포의 빠른 과정을 보여준다. 또 다른 예시적인 동물은 마우스의 JNPL3 라인이다. 이 마우스는 P301L 돌연변이(돌연변이는 전두측두엽 치매와 연관됨) 및 Thy 1.2 촉진자를 갖는 인간 타우 전이유전자를 갖는다(Taconic, Germantown, N.Y., Lewis, et al., Nat Genet. 25:402-405 (2000)). 이 마우스는 신경퇴행의 더 점진적인 과정을 갖는다. 마우스는 몇몇 뇌 영역 및 척수에서 신경섬유 매듭을 발생시킨다(본 명세서에 의해 그 전문이 참고로 포함됨). 이것은 매듭 발생의 결과를 연구하기 위한 및 이 응집체의 생성을 저해할 수 있는 스크리닝 치료에 대한 훌륭한 모델이다. 이 동물의 또 다른 이점은 병리학의 비교적 이른 발병이다. 동형접합성 라인에서, 타우 병리학과 연관된 행동 비정상은 적어도 3개월만큼 빨리 관찰될 수 있지만, 동물은 적어도 8개월령까지 비교적 건강하게 있는다. 즉, 8개월에, 동물은 보행하고, 자체 섭식하고, 치료 효과가 모니터링되게 허용하도록 충분히 잘 행동 업무를 수행할 수 있다. -AI wI KLH-PHF-1에 의한 6개월 내지 13개월 동안 이 마우스의 능동 면역화는 약 1,000의 역가를 생성시키고, 비처리된 대조군 마우스에 비해 더 적은 신경섬유 매듭, 덜한 pSer422 및 감소된 체중 감소를 보여주었다.
항체 또는 활성제의 활성은 전체 타우 또는 인산화된 타우의 양의 감소, 다른 병리학적 특징, 예컨대 Aβ의 아밀로이드 침착물의 감소, 및 저해 또는 지연 또는 행동 결핍을 포함하는 다양한 기준에 의해 평가될 수 있다. 능동 면역원은 혈청 중의 항체의 유도에 대해 또한 시험될 수 있다. 수동 및 능동 면역원 둘 다는 혈액 뇌 장벽을 거친 형질전환 동물의 뇌로의 항체의 통과에 대해 시험될 수 있다. 항체 또는 항체를 유도하는 단편은 천연으로 또는 유도를 통해 타우를 특징으로 하는 질환의 증상을 발생시키는 비인간 영장류에서 또한 시험될 수 있다. 항체 또는 활성제에 대한 시험은 보통, 항체 또는 활성제가 부재하다는 것을 제외하고(예를 들어, 비히클에 의해 대체됨), 병행 실험이 수행되는 대조군과 관련하여 수행된다. 이후, 시험 중인 항체 또는 활성제가 원인일 수 있는 징후 또는 증상 질환의 감소, 지연 또는 저해는 대조군에 비해 평가될 수 있다.
V. 치료에 수정 가능한 환자
신경섬유 매듭의 존재는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 및 진행성 핵상 마비(PSP)를 포함하는 몇몇 질환에서 발견된다. 본 섭생은 임의의 이들 질환의 치료 또는 예방에서 또한 사용될 수 있다. 신경학적 질환 및 병태와 타우 사이의 널리 퍼진 연관 때문에, 본 섭생은 신경학적 질환이 없는 개인에서 평균 값과 비교하여 (예를 들어, CSF 중의) 타우 또는 인산화된 타우의 증가된 수준을 보여주는 임의의 대상체의 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 본 섭생은 신경학적 질환과 연관된 타우에서 돌연변이를 갖는 개인에서 신경학적 질환의 치료 또는 예방에서 또한 사용될 수 있다. 본 방법은 특히 환자에서 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 특히 적합하다.
치료에 수정 가능한 환자는 질환의 위험에 있지만 증상을 나타내지 않는 개인, 및 증상을 현재 나타내는 환자를 포함한다. 질환의 위험에 있는 환자는 질환의 공지된 유전적 위험을 갖는 사람을 포함한다. 이러한 개인은 이 질환을 경험하는 친척을 갖는 사람, 및 위험이 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 결정되는 사람을 포함한다. 위험의 유전적 마커는 타우에서의 돌연변이, 예컨대 상기 기재된 것, 및 신경학적 질환과 연관된 다른 유전자에서의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이형접합체 및 훨씬 더 동형접합성 형태에서의 ApoE4 대립유전자는 알츠하이머병의 위험과 연관된다. 알츠하이머병의 위험의 다른 마커는 APP 유전자에서의 돌연변이, 특히 각각 Hardy 및 Swedish 돌연변이라 칭해지는 717번 위치 및 670번 및 671번 위치에서의 돌연변이, 프레세닐린 유전자에서의 돌연변이, PS1 및 PS2, AD의 가족 병력, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상동맥경화증이다. 알츠하이머병을 현재 겪는 개인은 특징적인 치매, 및 상기 기재된 위험 인자의 존재로부터 PET 영상화에 의해 인식될 것이다. 또한, 다수의 진단학적 시험은 AD를 갖는 개인을 확인하기 위해 이용 가능하다. 이것은 CSF 타우 또는 포스포-타우 및 Aβ42 수준의 측정을 포함한다. 증가된 타우 또는 포스포-타우 및 감소된 Aβ42 수준은 AD의 존재를 나타낸다. 파킨슨병과 연관된 몇몇 돌연변이, Ala30Pro 또는 Ala53, 또는 파킨슨병과 연관된 다른 유전자에서의 돌연변이, 예컨대 류신-농후 반복부 키나제, PARK8. 개인은 또한 DSM IV TR의 기준에 의해 상기 언급된 임의의 신경학적 질환에 의해 또한 진단될 수 있다.
무증상성 환자에서, 치료는 임의의 연령(예를 들어, 10세, 20세, 30세)에 시작할 수 있다. 그러나, 보통, 환자가 40세, 50세, 60세 또는 70세에 치료를 시작하는 것이 필요하지 않다. 치료는 통상적으로 시간의 기간에 걸쳐 다수의 투약량을 수반한다. 치료는 시간에 걸쳐 항체 수준을 평가함으로써 모니터링될 수 있다. 반응이 줄어들면, 부스터 투약량이 표시된다. 가능한 다운 증후군 환자의 경우에, 치료는 출생 직후 엄마에게 치료제를 투여함으로써 출산 전에 시작할 수 잇다.
I. 핵산
본 발명은 추가로 상기 기재된 임의의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산(예를 들어, 서열 번호 7, 11, 15-19 및 서열 번호 20 내지 23, 서열 번호 46 내지 57, 및 서열 번호 66)을 제공한다. 임의로, 이러한 핵산은 추가로 신호 펩타이드를 코딩하고, 불변 영역에 연결된 신호 펩타이드에 의해 발현될 수 있다. 핵산의 코딩 서열은 코딩 서열, 예컨대 촉진자, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 신호 등의 발현을 보장하도록 조절 서열에 의해 작동 가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 단리된 형태로 발생할 수 있거나, 하나 초과의 벡터로 클로닝될 수 있다. 핵산은 예를 들어 중첩하는 올리고뉴클레오타이드의 PCR 또는 솔리드 스테이트 합성에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 예를 들어 발현 벡터 내에 하나의 인접 핵산으로서 연결될 수 있거나, 별개여서 예를 들어 각각은 이의 자체의 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.
J. 접합된 항체
타우와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 접합된 항체는 타우의 존재의 검출; 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)로 진단된 환자를 치료하기 위해 사용된 치료제의 효율의 모니터링 및 평가; 타우의 응집의 저해 또는 감소; 타우 피브릴 형성의 저해 또는 감소; 타우 침착물의 감소 또는 청소; 타우의 비독성 형태의 안정화; 또는 환자에서의 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)의 치료 또는 이의 예방의 실행에서 유용하다. 예를 들어, 이러한 항체는 다른 치료학적 모이어티, 다른 단백질, 다른 항체, 및/또는 검출 가능한 라벨에 의해 접합될 수 있다. WO 03/057838; US 8,455,622를 참조한다. 이러한 치료학적 모이어티는 환자에서 원치 않는 병태 또는 질환, 예컨대 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 치료하거나, 싸우거나, 경감시키거나, 예방하거나, 개선하기 위해 사용될 수 있는 임의의 물질일 수 있다.
접합된 치료학적 모이어티는 세포독성 물질, 세포정지 물질, 신경영양 물질, 신경보호 물질, 방사선치료제, 면역조정제, 또는 항체의 활성을 촉진하거나 증대시키는 임의의 생물학적으로 활성인 물질을 포함할 수 있다. 세포독성 물질은 세포에 독성인 임의의 물질일 수 있다. 세포정지 물질은 세포 증식을 저해하는 임의의 물질일 수 있다. 신경영양 물질은 뉴런 유지, 성장 또는 분화를 촉진하는 화학 또는 단백질성 물질을 포함하는 임의의 물질일 수 있다. 신경보호 물질은 급성 공격 또는 퇴행성 과정으로부터 신경을 보호하는 화학 또는 단백질성 물질을 포함하는 물질일 수 있다. 면역조정제는 면역학적 반응을 자극하거나 이의 발생 또는 유지를 저해하는 임의의 물질일 수 있다. 방사선치료제는 방사선을 방출하는 임의의 분자 또는 화합물일 수 있다. 이러한 치료학적 모이어티가 타우-특이적 항체, 예컨대 본 명세서에 기재된 항체에 커플링되는 경우, 커플링된 치료학적 모이어티는 정상 세포에 비해 타우 관련된 질환 이환된 세포에 대해 특이적 친화도를 가질 것이다. 결과적으로, 접합된 항체의 투여는 둘러싼 정상의 건강한 조직에 최소 손상으로 암 세포를 직접적으로 표적화한다. 이것은 단독으로 투여되기에 너무 독성인 치료학적 모이어티에 특히 유용할 수 있다. 또한, 더 적은 분량의 치료학적 모이어티를 사용할 수 있다.
몇몇 이러한 항체는 면역독소로서 작용하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,194,594호를 참조한다. 예를 들어, 식물로부터 유래된 세포 독소인 리신은 항체에 대한 이작용성 시약 S-아세틸머캅토숙신산 무수물 및 리신에 대한 숙신이미딜 3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트를 사용함으로써 항체에 커플링될 수 있다. 문헌[Pietersz et al., Cancer Res. 48(16):4469-4476 (1998)]을 참조한다. 커플링은, 리신의 A-사슬의 독성 가능성도 항체의 활성도 손상시키지 않으면서, 리신의 B-사슬 결합 활성의 소실을 발생시킨다. 유사하게, 리보솜 어셈블리의 저해제인 사포린은 화학적으로 반전된 설프하이드릴기 사이에 이황화 결합을 통해 항체에 커플링될 수 있다. 문헌[Polito et al., Leukemia 18:1215-1222 (2004)]을 참조한다.
몇몇 이러한 항체는 방사성 동위원소에 연결될 수 있다. 방사성 동위원소의 예는 예를 들어 이트륨90(90Y), 인듐111(111In), 131I, 99mTc, 방사성은-111, 방사성은-199 및 비스무트213을 포함한다. 항체에 대한 방사성 동위원소의 연결은 종래의 이작용성 킬레이트에 의해 수행될 수 있다. 방사성은-111 및 방사성은-199 연결을 위해, 황계 링커를 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994)]을 참조한다. 은 방사성 동위원소의 연결은 아스코르브산에 의한 면역글로불린의 환원을 수반할 수 있다. 방사성 동위원소, 예컨대 111In 및 90Y에 대해, 이브리투모맙 티욱세탄은 사용될 수 있고, 각각 111In-이브리투모맙 티욱세탄 및 90Y-이브리투모맙 티욱세탄을 형성하도록 이러한 동위원소와 반응할 것이다. 문헌[Witzig, Cancer Chemother . Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001)]을 참조한다.
몇몇 이러한 항체는 다른 치료학적 모이어티에 연결될 수 있다. 이러한 치료학적 모이어티는 예를 들어 세포독성, 세포정지, 신경영양 또는 신경보호일 수 있다. 예를 들어, 항체는 독성 화학치료 약물, 예컨대 메이탄신, 겔다나마이신, 투뷸린 저해제, 예컨대 투뷸린 결합제(예를 들어, 아우리스타틴) 또는 소홈 결합제, 예컨대 칼리키아미신에 의해 접합될 수 있다. 다른 각각의 치료학적 모이어티는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)의 치료, 관리 또는 완화에 유용한 것으로 공지된 물질을 포함한다.
항체는 다른 단백질에 의해 또한 커플링될 수 있다. 예를 들어, 항체는 파이노머(Fynomer)에 의해 커플링될 수 있다. 파이노머는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 작은 결합 단백질(예를 들어, 7kDa)이다. 이것은 안정하고 가용성일 수 있고, 이것은 시스테인 잔기 및 이황화 결합이 결여될 수 있다. 파이노머는 항체와 동일한 친화도 및 특이성으로 표적 분자에 결합하도록 조작될 수 있다. 이것은 항체에 기초하여 다중특이적 융합 단백질을 생성하기에 적합하다. 예를 들어, 파이노머는 상이한 구성으로 이중특이적 및 삼중특이적 FynomAb를 생성하기 위해 항체의 N 말단 및/또는 C 말단에 융합될 수 있다. 파이노머는 FACS, Biacore, 및 최적 특성을 갖는 파이노머의 효율적인 선택을 가능하게 하는 세포 기반 검정을 이용하여 스크리닝 기술을 통해 파이노머 라이브러리를 사용하여 선택될 수 있다. 파이노머의 예는 문헌[Grabulovski et al., J. Biol . Chem . 282:3196-3204 (2007); Bertschinger et al., Protein Eng . Des. Sel . 20:57-68 (2007); Schlatter et al., MAbs . 4:497-508 (2011); Banner et al., Acta . Crystallogr . D. Biol . Crystallogr. 69(Pt6):1124-1137 (2013); 및 Brack et al., Mol . Cancer Ther . 13:2030-2039 (2014)]에 기재되어 있다.
본 명세서에 개시된 항체는 (예를 들어, 항체 이종접합체를 형성하기 위해) 하나 초과의 다른 항체에 또한 커플링되거나 접합될 수 있다. 이러한 다른 항체는 타우 내의 상이한 에피토프에 결합할 수 있거나, 상이한 표적 항원에 결합할 수 있다.
항체는 검출 가능한 라벨에 의해 또한 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 진단하기 위해, 및/또는 치료의 효율을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 갖거나 이에 감수성인 대상체에서, 또는 이러한 대상체로부터 얻은 적절한 생물학적 샘플에서 이러한 결정을 수행하기에 특히 유용하다. 항체에 커플링되거나 연결될 수 있는 대표적인 검출 가능한 라벨은 다양한 효소, 예컨대 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제; 보철 기, 예컨대 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴; 형광성 재료, 예컨대 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민, 다이클로로트라이아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 발광성 재료, 예컨대 루미놀; 생물발광성 재료, 예컨대 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿠오린; 방사성 재료, 예컨대 방사성은-111, 방사성은-199, 비스무트213, 요오드(131I, 125I, 123I, 121I,), 탄소(14C), 황(5S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In,), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 플루오린(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117Tin; 다양한 양성자 방출 단층촬영을 이용하는 양성자 방출 금속; 비방사성 상자성 금속 이온; 및 방사선 표지되거나 특이적 방사성 동위원소에 접합된 분자를 포함한다.
항체에 대한 방사성 동위원소의 연결은 종래의 이작용성 킬레이트에 의해 수행될 수 있다. 방사성은-111 및 방사성은-199 연결을 위해, 황계 링커를 사용할 수 있다. 문헌[Hazra et al., Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994)]을 참조한다. 은 방사성 동위원소의 연결은 아스코르브산에 의한 면역글로불린의 환원을 수반할 수 있다. 방사성 동위원소, 예컨대 111In 및 90Y에 대해, 이브리투모맙 티욱세탄은 사용될 수 있고, 각각 111In-이브리투모맙 티욱세탄 및 90Y-이브리투모맙 티욱세탄을 형성하도록 이러한 동위원소와 반응할 것이다. 문헌[Witzig, Cancer Chemother . Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001)]을 참조한다.
치료학적 모이어티, 다른 단백질, 다른 항체, 및/또는 검출 가능한 라벨은, 직접적으로 또는 간접적으로 중간체(예를 들어, 링커)를 통해, 본 발명의 항체에 커플링되거나 접합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); 및 Thorpe et al., Immunol . Rev., 62:119-58 (1982)]을 참조한다. 적합한 링커는 예를 들어 절단 가능한 및 절단 불가능한 링커를 포함한다. 특이적 프로테아제에 대한 노출 시 산성 또는 환원 조건 하에, 또는 다른 한정된 조건 하에 커플링된 치료학적 모이어티, 단백질, 항체, 및/또는 검출 가능한 라벨을 방출하는 상이한 링커를 사용할 수 있다.
VI. 약제학적 조성물 및 사용 방법
예방학적 분야에서, 항체 또는 항체를 유도하기 위한 물질 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 위험을 감소시키거나, 이의 중증도를 줄이거나, 이의 발병을 지연시키기에 효과적인 섭생(투여의 용량, 빈도 및 경로)으로 질환(예를 들어, 알츠하이머병)에 감수성이거나, 달리 이의 위험에 있는 환자에게 투여된다. 특히, 섭생은 바람직하게는 타우 또는 포스포-타우 및 뇌에서 이로부터 형성된 쌍 지은 필라멘트를 저해하거나 지연시키고/시키거나, 이의 독성 효과를 저해하거나 지연시키고/시키거나, 행동 결핍의 발생을 저해하거나 지연시키기에 효과적이다. 치료학적 분야에서, 항체 또는 항체를 유도하는 물질은 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 추가의 악화를 경감시키거나 적어도 저해하기에 효과적인 섭생(투여의 용량, 빈도 및 경로)으로 질환(예를 들어, 알츠하이머병)에 감수성이거나, 이미 이를 겪는 환자에게 투여된다. 특히, 섭생은 바람직하게는 타우, 포스포-타우, 또는 이로부터 형성된 쌍 지은 필라멘트의 수준, 연관된 독성 및/또는 행동 결핍의 추가의 증가를 감소시키거나 적어도 저해하기에 효과적이다.
섭생은 개별 치료된 환자가 본 발명의 방법에 의해 치료되지 않은 필적하는 환자의 대조군 집단에서의 평균 결과보다 더 양호한 결과를 달성하는 경우, 또는 p < 0.05 또는 0.01 또는 심지어 0.001 수준에서 제어된 임상 실험(예를 들어, II상, II/III상 또는 III상 실험)에서 대조군 환자에 대해 치료된 환자에서 더 양호한 결과가 입증되는 경우 치료학적으로 또는 예방학적으로 효과적이라고 생각된다.
유효 용량은 많은 상이한 인자, 예컨대 투여의 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 ApoE 보균자인지, 환자가 인간 또는 동물인지, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방학적 또는 치료학적인지에 따라 변한다.
항체에 대한 예시적인 투약량 범위는 환자 체중의 약 0.01 내지 60㎎/㎏, 또는 약 0.1 내지 3㎎/㎏ 또는 0.15 내지 2㎎/㎏ 또는 0.15 내지 1.5㎎/㎏이다. 항체는 매일, 다른 날짜에, 주마다, 격주로, 달마다, 분기별로 또는 경험 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케줄에 따라 이러한 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 치료는 예를 들어 적어도 6개월의 연장된 기간에 걸친 다수의 투약량의 투여를 수반한다. 추가적인 예시적인 치료 섭생은 2주마다 1회 또는 1개월마다 1회 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 투여를 수반한다.
활성 투여에 대한 물질의 양은 인간 투여에 대해 환자마다 0.1 내지 500㎎ 및 더 보통 주사마다 1 내지 100 또는 1 내지 10㎎으로 변한다. 주사의 시기는 1일 1회로부터 1년 1회, 10년 1회로 상당히 변할 수 있다. 통상적인 섭생은 면역화, 이어서 6주 간격 또는 2개월과 같은 시간 간격에서의 부스터 주사로 이루어진다. 또 다른 섭생은 면역화, 이어서 1, 2 및 12개월 후의 부스터 주사로 이루어진다. 또 다른 섭생은 삶 동안 2개월마다 주사를 수반한다. 대안적으로, 부스터 주사는 면역 반응의 모니터링에 의해 표시된 바대로 불규칙적인 기준일 수 있다.
항체 또는 항체를 유도하기 위한 물질은 바람직하게는 말초 경로(즉, 투여된 또는 유도된 항체가 뇌에서의 의도된 부위에 도달하도록 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 것)를 통해 투여된다. 투여 경로는 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 비강내, 눈내 또는 근육내를 포함한다. 항체의 투여를 위한 바람직한 경로는 정맥내 및 피하이다. 능동 면역화를 위한 바람직한 경로는 피하 및 근육내이다. 주사의 이 유형은 팔 또는 다리 근육에서 가장 통상적으로 수행된다. 몇몇 방법에서, 물질은 침착물이 축적되는 특정한 조직에 직접적으로, 예를 들어 두개내 주사에 의해 주사된다.
비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 바람직하게는 무균이고, 실질적으로 등장성이고, GMP 조건 하에 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 제형(즉, 단일 투여를 위한 투약량)으로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 초과의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 제제화될 수 있다. 제제는 선택된 투여의 경로에 따라 달라진다. 주사를 위해, 항체는 수성 용액 중에, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거액 또는 생리학적 식염수 또는 (주사의 부위에서 불편함을 감소시키기 위한) 아세테이트 완충제 중에 제제화될 수 있다. 용액은 제제화제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 무균 발열원 비함유 물과의 구성을 위한 동결건조 형태일 수 있다.
본 섭생은 치료되는 질환의 치료 또는 예방에서 효과적인 또 다른 물질과 조합되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머병의 경우에, 본 섭생은 Aβ에 대한 면역치료제(WO/2000/072880), 콜린에스터라제 저해제 또는 메만틴 또는 파킨슨병의 경우에 알파 시누클레인에 대한 면역치료제(WO/2008/103472), 레보도파, 도파민 작용제, COMT 저해제, MAO-B 저해제, 아만타딘 또는 항콜린제와 조합될 수 있다.
항체는 추가의 악화의 발병을 지연시키거나 이의 중증도를 감소시키거나 이를 저해하고/하거나, 치료되는 장애의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 경감시키는 투약량, 투여의 경로 및 투여의 빈도를 의미하는 효과적인 섭생으로 투여된다. 환자가 이미 장애를 겪는 경우, 섭생은 치료학적으로 효과적인 섭생이라 칭해질 수 있다. 환자가 일반 집단에 비해 장애의 상승된 위험에 있지만, 아직 증상을 겪지 않는 경우, 섭생은 예방학적으로 효과적인 섭생이라 칭해질 수 있다. 몇몇 경우에, 치료학적 또는 예방학적 효율은 역사적 대조군에 대한 개별 환자에서 관찰되거나, 동일한 환자에서 과거 경험될 수 있다. 다른 경우에, 치료학적 또는 예방학적 효율은 비치료된 환자의 대조군 집단에 비해 치료된 환자의 집단에서 전임상 또는 임상 실험에서 입증될 수 있다.
항체에 대한 예시적인 투약량은 0.1 내지 60㎎/㎏(예를 들어, 0.5, 3, 10, 30 또는 60㎎/㎏), 또는 0.5 내지 5㎎/㎏(체중)(예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5㎎/㎏) 또는 고정된 투약량으로서 10 내지 4000㎎ 또는 10 내지 1500㎎이다. 투약량은 다른 인자 중에서 환자의 컨디션 및 있다면 이전의 치료에 대한 반응, 치료가 예방학적 또는 치료학적인지 및 장애가 급성 또는 만성인지에 따라 달라진다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 국소, 비강내 또는 근육내일 수 있다. 몇몇 항체는 정맥내 또는 피하 투여에 의해 전신 순환으로 투여될 수 있다. 정맥내 투여는 예를 들어 30분 내지 90분과 같은 기간에 걸쳐 점적주사에 의할 수 있다.
투여의 빈도는 다른 인자 중에서 순환 중인 항체의 반감기, 환자의 컨디션 및 투여의 경로에 따라 달라진다. 빈도는 환자의 컨디션 또는 치료되는 장애의 진행의 변화에 반응하여 매일, 주마다, 달마다, 분기별로 또는 불규칙적인 간격일 수 있다. 정맥내 투여를 위한 예시적인 빈도는 치료의 연속 과정에 걸쳐 주마다와 분기마다 사이이지만, 더한 또는 덜한 빈도 투약이 또한 가능하다. 피하 투여를 위해, 예시적인 투약 빈도는 매일 내지 개월마다이지만, 더한 또는 덜한 빈도 투약이 또한 가능하다.
투여되는 투약량의 수는 장애가 급성 또는 만성인지 및 치료에 대한 장애의 반응에 따라 달라진다. 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화를 위해, 1 용량 내지 10 용량이 대개 충분하다. 때때로, 임의로 분할된 형태의 단일 볼루스 용량은 급성 장애 또는 만성 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발에 대해 반복될 수 있다. 만성 장애의 경우, 항체는 적어도 1년, 5년 또는 10년, 또는 환자의 삶 동안 규칙적인 간격으로, 예를 들어 주마다, 격주로, 달마다, 분기별로, 6개월마다 투여될 수 있다.
A. 진단학 및 모니터링 방법
생체내 영상화, 진단학적 방법 및 면역치료의 최적화
본 발명은 환자에서 타우 단백질 침착물(예를 들어, 신경섬유 매듭 및 타우 포함)을 생체내 영상화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시약, 예컨대 타우에 결합하는 항체(예를 들어, 마우스, 인간화된, 키메라 또는 비니어드 3D6 항체)를 환자에게 투여하고, 이후 이것이 결합한 후 물질을 검출함으로써 작동한다. 서열 번호 3의 199번 내지 213번 또는 262번 내지 276번 아미노산 잔기(서열 번호 1의 각각 257번 내지 271번 또는 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응) 내의 타우의 에피토프에 결합하는 항체가 바람직하다. 몇몇 방법에서, 항체는 서열 번호 3의 199번 내지 213번 아미노산 잔기(서열 번호 1의 257번 내지 271번 아미노산 잔기에 상응) 내의 또는 서열 번호 3의 262번 내지 276번 아미노산(서열 번호 1의 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응) 내의 에피토프에 결합한다. 투여된 항체에 대한 청소 반응은 Fab와 같은 전장 불변 영역이 결여된 항체 단편을 사용함으로써 회피되거나 감소될 수 있다. 몇몇 방법에서, 동일한 항체는 치료 및 진단 시약 둘 다로서 작용할 수 있다.
진단 시약은 환자의 몸으로 정맥내 주사에 의해, 또는 두개내 주사에 의해 또는 두개골을 통해 홀을 드릴링함으로써 뇌에 직접적으로 투여될 수 있다. 시약의 투약량은 치료 방법에 대해서 동일한 범위 내이어야 한다. 통상적으로, 시약은 표지되지만, 몇몇 방법에서, 타우에 대한 친화도를 갖는 1차 시약은 비표지되고, 2차 표지 물질은 1차 시약에 결합하도록 사용된다. 라벨의 선택은 검출의 수단에 따라 달라진다. 예를 들어, 형광성 라벨은 광학 검출에 적합하다. 상자성 라벨의 사용은 수술 중재 없이 단층촬영 검출에 적합하다. 방사성 라벨은 양성자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)을 이용하여 또한 검출될 수 있다.
타우 단백질 침착물의 생체내 영상화의 방법은 타우병증, 예컨대 알츠하이머병, 전측두엽 변성, 진행성 핵상 마비 및 픽병, 또는 이러한 질환에 대한 감수성을 진단하거나, 이들의 진단을 확인하기 위해 유용하다. 예를 들어, 상기 방법은 치매의 증상을 제시하는 환자에서 사용될 수 있다. 환자가 비정상 신경섬유 매듭을 갖는 경우, 환자는 아마도 알츠하이머병을 겪는다. 대안적으로, 환자가 비정상 타우 포함을 갖는 경우, 포함의 위치에 따라, 환자는 전측두엽 변성을 겪을 수 있다. 상기 방법은 무증상성 환자에서 또한 이용될 수 있다. 비정상 타우 단백질 침착물의 존재는 미래의 증상성 질환의 감수성을 나타낸다. 상기 방법은 타우 관련된 질환으로 이전에 진단된 환자에서 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하기에 또한 유용하다.
진단은 상응하는 기준치 값에 표지된 유전좌위의 수, 크기 및/또는 강도를 비교함으로써 수행될 수 있다. 기준치 값은 이환된 개인의 집단에서 평균 수준을 나타낼 수 있다. 기준치 값은 동일한 환자에서 결정된 이전의 수준을 또한 나타낼 수 있다. 예를 들어, 기준치 값은 타우 면역치료 치료를 시작하기 전에 환자에서 결정될 수 있고, 측정된 값은 이후 기준치 값과 비교될 수 있다. 기준치에 대한 값의 감소는 치료에 대한 양성 반응을 신호화한다.
몇몇 환자에서, 타우병증의 진단은 PET 스캔을 수행함으로써 도와질 수 있다. PET 스캔은 예를 들어 종래의 PET 영상화기 및 보조제 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 스캔은 통상적으로 일반적으로 타우 단백질 침착물과 연관된 것으로 공지된 뇌의 하나 초과의 영역 및 있다면 아주 적은 침착물이 대조군으로서 작용하도록 일반적으로 존재하는 하나 초과의 영역을 포함한다.
PET 스캔에서 검출된 신호는 다차원 영상으로 표시될 수 있다. 다차원 영상은 뇌에 걸친 단면을 나타내는 2차원, 3차원 뇌를 나타내는 3차원 또는 시간에 걸쳐 3차원 뇌의 변화를 나타내는 4차원일 수 있다. 색상 스케일은 상이한 양의 라벨 및 추론에 의해, 검출된 타우 단백질 침착물을 나타내는 상이한 색상과 사용된다. 스캔의 결과는 또한 숫자로 제시될 수 있고, 숫자는 검출된 라벨의 양 및 결과적으로 타우 단백질 침착물의 양에 관한 것이다. 특정한 타우병증(예를 들어, 알츠하이머병)에 대한 침착물과 연관된 것으로 공지된 뇌의 영역에 존재하는 라벨은, 이전의 영역 내의 침착물의 정도를 나타내는 비율을 제공하기 위해, 침착물과 연관되지 않은 것으로 공지된 영역에 존재하는 라벨과 비교될 수 있다. 동일한 방사선 표지된 리간드의 경우, 이러한 비율은 상이한 환자 사이의 타우 단백질 침착물의 필적하는 측정치 및 이의 변화를 제공한다.
몇몇 방법에서, PET 스캔은 MRI 또는 CAT 스캔과 동일한 환자 방문에서 또는 이와 동시에 수행된다. MRI 또는 CAT 스캔은 PET 스캔보다 뇌의 더 해부학적 상세내용을 제공한다. 그러나, PET 스캔으로부터의 영상은 MRI 또는 CAT 스캔 영상에서 더 정확히 중첩될 수 있어서, 뇌에서의 해부학적 구조에 대해 PET 리간드 및 추론에 의해 타우 침착물의 위치를 나타낸다. 몇몇 기계는 영상의 중첩을 수월하게 하는 스캔 사이에 환자 변경 위치 없이 PET 스캐닝 및 MRI 또는 CAT 스캐닝 둘 다를 수행할 수 있다.
적합한 PET 리간드는 본 발명의 방사선 표지된 항체(예를 들어, 마우스, 인간화된, 키메라 또는 비니어드 3D6 항체)를 포함한다. 사용된 방사성 동위원소는 예를 들어 C11, N13, O15, F18 또는 I123일 수 있다. PET 리간드를 투여하는 것과 스캔을 수행하는 것 사이의 간격은 PET 리간드 및 특히 뇌로의 흡수 및 청소의 이의 속도, 및 이의 방사선 라벨의 반감기에 따라 달라질 수 있다.
PET 스캔은 무증상성 환자에서 또는 경증 인지 장애의 증상을 갖지만, 타우병증으로 아직 진단되지 않지만, 타우병증을 발생시킬 상승된 위험에 있는 환자에서 예방학적 측정치로서 또한 수행될 수 있다. 무증상성 환자의 경우, 스캔은 가족 병력, 유전적 또는 생화학적 위험 인자, 또는 성숙 나이 때문에 타우병증의 상승된 위험에 있는 것으로 생각되는 개인에 대해 특히 유용하다. 예방학적 스캔은 예를 들어 45세 내지 75세의 환자에서 시작할 수 있다. 몇몇 환자에서, 제1 스캔은 50세에 수행된다.
예방학적 스캔은 예를 들어 6개월 내지 10년, 바람직하게는 1년 내지 5년의 간격으로 수행될 수 있다. 몇몇 환자에서, 예방학적 스캔은 매년 수행된다. 예방학적 조치로서 수행된 PET 스캔이 타우 단백질 침착물의 비정상적으로 높은 수준을 나타내는 경우, 면역치료는 시작될 수 있고, 후속하는 PET 스캔은 타우병증으로 진단된 환자에서처럼 수행될 수 있다. 예방학적 조치로서 수행된 PET 스캔이 정상 수준 내의 타우 단백질 침착물의 수준을 나타내는 경우, 추가의 PET 스캔은 전에처럼 또는 타우병증 또는 경증 인지 장애의 징후 및 증상의 출현에 반응하여 6개월 내지 10년, 바람직하게는 1년 내지 5년의 간격으로 수행될 수 있다. 타우 단백질 침착물의 상기 정상 수준이 검출되는 경우 또는 검출될 때 예방학적 스캔을 타우 지시된 면역치료의 투여와 조합함으로써, 타우 단백질 침착물의 수준은 정상 수준으로 감소하거나 이에 가까워지거나, 더 증가하는 것이 저해될 수 있고, 환자는 예방학적 스캔 및 타우 지시된 면역치료를 받지 않는 경우보다 더 긴 기간(예를 들어, 적어도 5년, 10년, 15년 또는 20년, 또는 환자의 삶의 나머지 동안) 동안 타우병증 없이 남을 수 있다.
타우 단백질 침착물의 정상 수준은 특정한 타우병증(예를 들어, 알츠하이머병)으로 진단되지 않고, 이러한 질환을 발생시킬 상승된 위험에 있는 것으로 생각되지 않는 일반 집단에서의 개인의 대표적인 샘플(예를 들어, 50세 미만의 질환무 개인의 대표적인 샘플)의 뇌에서 신경섬유 매듭의 양 또는 타우 포함에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 타우 단백질 침착물이 발생하는 것으로 공지된 뇌의 영역에서의 본 방법에 따른 PET 신호가 이러한 침착물이 보통 발생하지 않는 것으로 공지된 뇌의 영역으로부터의 신호로부터 (측정의 정확성 내에) 상이하지 않는 경우, 정상 수준은 개인 환자에서 인식될 수 있다. 개인에서의 상승된 수준은 (예를 들어, 표준 편차의 평균 및 변동 밖의) 정상 수준에 대한 비교에 의해 또는 단순히 침착물과 연관된 것으로 공지되지 않은 영역과 비교하여 타우 단백질 침착물과 연관된 뇌의 영역에서의 실험 오차를 넘은 상승된 신호로부터 인식될 수 있다. 개인 및 집단에서의 타우 단백질 침착물의 수준을 비교할 목적으로, 타우 단백질 침착물은 바람직하게는 뇌의 동일한 영역(들)에서 결정되어야 하고, 이 영역은 특정한 타우병증(예를 들어, 알츠하이머병)과 연관된 타우 단백질 침착물이 형성하는 것으로 공지된 적어도 하나의 영역을 포함한다. 타우 단백질 침착물의 상승한 수준을 갖는 환자는 면역치료를 시작하는 것에 대한 후보이다.
면역치료를 시작한 후, 타우 단백질 침착물의 수준의 감소는 치료가 원하는 효과를 갖는다는 표시로서 처음에 보일 수 있다. 관찰된 감소는 예를 들어 기준치 값의 1% 내지 100%, 1% 내지 50% 또는 1% 내지 25%의 범위일 수 있다. 이러한 효과는 침착물이 형성하는 것으로 공지된 뇌의 하나 초과의 영역에서 측정될 수 있거나, 이러한 영역의 평균으로부터 측정될 수 있다. 치료의 전체 효과는, 달리 평균 비치료된 환자에서 발생하는, 타우 단백질 침착물에서의 증가로 기준치에 대한 백분율 감소를 추가함으로써 근사치화될 수 있다.
타우 단백질 침착물에서의 대략 일정한 수준 또는 심지어 작은 증가에서의 타우 단백질 침착물의 유지는 또한 준최적 반응에도 불구하고 치료에 대한 반응의 표시일 수 있다. 이러한 반응은, 면역치료가 타우 단백질 침착물의 추가의 증가를 저해하는 데 있어서 효과를 갖는지를 결정하기 위해, 치료를 받지 않는 특정한 타우병증(예를 들어, 알츠하이머병)을 갖는 환자에서 타우 단백질 침착물의 수준의 시간 경과와 비교될 수 있다.
타우 단백질 침착물에서의 변경의 모니터링은 치료에 반응하여 면역치료 또는 다른 치료 섭생의 조정을 허용한다. PET 모니터링은 치료에 대한 반응의 성질 및 정도의 표시를 제공한다. 이후, 치료를 조정할지에 결정이 이루어질 수 있고, 원하는 경우 치료는 PET 모니터링에 반응하여 조정될 수 있다. 따라서, PET 모니터링은 다른 바이오마커, MRI 또는 인지 측정치가 검출 가능하게 반응하기 전에 타우 지시된 면역치료 또는 다른 치료 섭생이 조정되게 한다. 상당한 변경은 기준에 대한 치료 후 매개변수의 값의 비교가 치료가 유리한 효과를 발생시키거나 발생시키지 않는다는 약간의 증거를 제공한다는 것을 의미한다. 몇몇 경우에, 환자에서의 매개변수의 값의 변경은 자체가 치료가 유리한 효과를 발생시키거나 발생시키지 않는다는 증거를 제공한다. 다른 경우에, 환자에서의, 있다면 값의 변경은 면역치료를 받지 않은 환자의 대표적인 대조군 집단에서의, 있다면, 값의 변경과 비교된다. 대조군 환자에서의 정상 반응으로부터 특정한 환자에서의 반응의 차이(예를 들어, 표준 편차의 평균과 변동)는 또한 면역치료 섭생이 환자에서의 유리한 효과를 달성하거나 달성하지 않는다는 증거를 제공할 수 있다.
몇몇 환자에서, 모니터링은 타우 단백질 침착물에서의 검출 가능한 감소를 나타내지만, 타우 단백질 침착물의 그 수준은 정상보다 높게 있다. 이러한 환자에서, 허용 가능한 부작용이 있는 경우, 치료 섭생은, 이미 최대 추천된 용량에 있지 않더라도, 투여의 빈도 및/또는 용량이거나 심지어 증가되면서 계속될 수 있다.
모니터링이 환자에서의 타우 단백질 침착물의 수준이 타우 단백질 침착물의 정상 또는 거의 정상인 수준으로 이미 감소한다는 것을 나타내는 경우, 면역치료 섭생은 유도의 것(즉, 타우 단백질 침착물의 수준을 감소시키는)으로부터 유지의 것(즉, 대략 일정한 수준에서 타우 단백질 침착물을 유지시키는)으로 조정될 수 있다. 이러한 섭생은 면역치료를 투여하는 것의 용량 및 또는 빈도를 감소시킴으로써 영향을 받을 수 있다.
다른 환자에서, 모니터링은 면역치료가 약간의 유리한 효과, 그러나 준최적 효과를 갖는다는 것을 나타낼 수 있다. 최적 효과는 치료를 시작한 후 소정의 시점에 면역치료를 겪은 타우병증 환자의 대표적인 샘플이 경험하는 (타우 단백질 침착물이 형성한다고 공지된 전체 뇌 또는 이의 대표적인 영역(들)에 걸쳐 측정되거나 계산된) 타우 단백질 침착물에서의 변화의 상부 절반 또는 사분위수 내의 타우 단백질 침착물의 수준에서의 백분율 감소로 정의될 수 있다. 더 작은 감소를 경험하는 환자 또는 타우 단백질 침착물이 일정하게 있거나, (예를 들어, 면역치료가 투여되지 않은 환자의 대조군 그룹으로부터 추론된 바와 같은) 면역치료의 부재 하에 예상된 것보다 더 적은 정도이지만 심지어 증가하는 환자는 양성이지만 준최적 반응을 경험하는 것으로 분류될 수 있다. 이러한 환자는 임의로 물질의 투여의 용량 및 또는 빈도가 증가하는 섭생의 조정으로 처리될 수 있다.
몇몇 환자에서, 타우 단백질 침착물은 면역치료를 받지 않는 환자에서 타우 침착물에서 유사하거나 더 높은 방식으로 증가할 수 있다. 이러한 증가가 18개월 또는 2년과 같은 시간의 기간에 걸쳐 지속하는 경우, 물질의 빈도 또는 용량에서의 임의의 증가 후에도, 면역치료는 원해지는 경우 다른 치료를 위하여 중단될 수 있다.
타우병증에 대한 치료를 진단하고, 모니터링하고, 조정하기 위한 이전 설명은 PET 스캔을 이용하는 것에 주로 초점을 둔다. 그러나, 본 발명의 타우 항체(예를 들어, 마우스, 인간화된, 키메라 또는 비니어드 3D6 항체)의 사용에 수정 가능한 타우 단백질 침착물을 가시화하고/하거나 측정하기 위한 임의의 다른 기법은 이러한 방법을 수행하기 위해 PET 스캔 대신에 사용될 수 있다.
타우와 연관된 질환을 겪거나 이에 감수성인 환자에서 타우에 대한 면역 반응을 검출하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 본 명세서에 제공된 물질에 의한 치료학적 및 예방학적 치료의 과정을 모니터링하기 위해 사용된다. 수동 면역화 후 항체 프로필은 통상적으로 항체 농도에서의 즉각적인 피크, 이어서 지수 감퇴를 보여준다. 추가의 용량 없이, 감퇴는 투여된 항체의 반감기에 따라 수일 내지 수개월의 기간 내에 전치료 수준에 접근한다. 예를 들어, 몇몇 인간 항체의 반감기는 20일의 차수이다.
몇몇 방법에서, 대상체에서의 타우에 대한 항체의 기준치 측정은 투여 전에 이루어지고, 제2 측정은 피크 항체 수준을 결정하도록 이후 곧 이루어지고, 하나 초과의 추가의 측정은 항체 수준의 감퇴를 모니터링하도록 간격으로 이루어진다. 항체의 수준이 기준치 또는 기준치보다 낮은 피크의 미리 결정된 백분율(예를 들어, 50%, 25% 또는 10%)로 감소할 때, 항체의 추가의 용량의 투여가 투여된다. 몇몇 방법에서, 피크 또는 배경보다 낮은 후속하는 측정된 수준은 다른 대상체에서의 유리한 예방학적 또는 치료학적 치료 섭생을 구성하도록 이전에 결정된 기준 수준과 비교된다. 측정된 항체 수준이 기준 수준보다 상당히 적은(예를 들어, 치료로부터 이익을 얻는 대상체의 집단에서의 기준 값의 1 또는 바람직하게는 2의 표준 편차를 뺀 평균보다 적은) 경우, 항체의 추가적인 용량의 투여는 표시된다.
예를 들어, 대상체로부터의 샘플에서 타우를 측정함으로써 또는 대상체에서의 타우의 생체내 영상화에 의해 대상체에서 타우를 검출하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법은 타우와 연관된 질환의 진단, 또는 이에 대한 감수성을 진단하거나 확인하는 데 유용하다. 상기 방법은 또한 무증상성 대상체에서 사용될 수 있다. 타우의 존재는 미래의 증상성 질환에 대한 감수성을 나타낸다. 상기 방법은 또한 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)에 의해 이전에 진단된 대상체에서의 질환 진행 및/또는 치료에 대한 반응을 모니터링하기에 유용하다.
알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 갖거나, 이를 갖는 것으로 의심되거나 이를 가질 위험에 있는 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플은 타우의 존재를 평가하기 위해 본 명세서에 개시된 항체와 접촉될 수 있다. 예를 들어, 이러한 대상체에서의 타우의 수준은 건강한 대상체에 존재하는 것과 비교될 수 있다. 대안적으로, 질환에 대한 치료를 받는 이러한 대상체에서의 타우의 수준은 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)에 의해 치료되지 않는 대상체의 것과 비교될 수 있다. 몇몇 이러한 시험은 이러한 대상체로부터 얻은 조직의 생검을 수반한다. ELISA 검정은 또한 예를 들어 유체 샘플에서 타우를 측정하기 위한 유용한 방법일 수 있다.
VII. 키트
본 발명은 본 명세서에 개시된 항체 및 관련 자료, 예컨대 사용에 대한 지시(예를 들어, 패키지 인서트)를 포함하는 키트(예를 들어, 용기)를 추가로 제공한다. 사용에 대한 지시는 예를 들어 항체의 투여에 대한 지시 및 임의로 하나 초과의 추가적인 물질을 함유할 수 있다. 항체의 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 용량 패키지), 또는 아단위 용량일 수 있다.
패키지 인서트는 적응증, 사용, 투약량, 투여, 이러한 치료학적 생성물의 사용에 관한 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료학적 제품의 상업용 패키지에 습관적으로 포함된 지시를 의미한다.
키트는 약제학적으로 허용 가능한 완충제, 예컨대 정균성 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 또한 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 침 및 주사기를 포함하는 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 재료를 또한 포함할 수 있다.
VIII. 다른 용도
항체는 임상 진단 또는 치료의 맥락에서 또는 조사에서 타우 또는 이의 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 생물학적 샘플이 타우 침착물을 포함한다는 표시로서 생물학적 샘플에서 타우의 존재를 검출하도록 사용될 수 있다. 생물학적 샘플에 대한 항체의 결합은 대조군 샘플에 대한 항체의 결합과 비교될 수 있다. 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 조직 기원의 세포를 포함할 수 있다. 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 개인 또는 상이한 개인으로부터 동일한 경우에 또는 상이한 경우에 얻어질 수 있다. 원하는 경우, 다수의 생물학적 샘플 및 다수의 대조군 샘플은 샘플 사이의 차이와 독립적으로 랜덤 변동에 대해 보호하도록 다수의 경우에 평가된다. 생물학적 샘플(들)에 대한 항체 결합(즉, 타우의 존재)이 대조군 샘플(들)에 대한 항체 결합에 비해 증가하거나 감소하거나 동일한지를 결정하기 위해 생물학적 샘플(들)과 대조군 샘플(들) 사이에 직접적인 비교가 이후 이루어질 수 있다. 대조군 샘플(들)에 비해 생물학적 샘플(들)에 대한 항체의 증가된 결합은 생물학적 샘플(들)에서의 타우의 존재를 나타낸다. 몇몇 경우에, 증가된 항체 결합은 통계학적으로 유의미하다. 임의로, 생물학적 샘플에 대한 항체 결합은 대조군 샘플에 대한 항체 결합보다 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 더 높다.
또한, 항체는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)로 진단된 환자를 치료하기 위해 사용되는 치료제의 효율을 모니터링하고 평가하도록 생물학적 샘플에서 타우의 존재를 검출하도록 사용될 수 있다. 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)로 진단된 환자로부터의 생물학적 샘플은 치료제에 의해 치료를 시작하기 전에 샘플에 대한 항체의 결합에 대한 기준치(즉, 샘플에서의 타우의 존재 하에 기준치)를 확립하도록 평가된다. 몇몇 경우에, 환자로부터의 복수의 생물학적 샘플은 기준치 및 치료와 독립적인 랜덤 변동의 측정치 둘 다를 확립하도록 다수의 경우에 평가된다. 이후, 치료제는 섭생으로 투여된다. 섭생은 일정 기간에 걸쳐 물질의 다수의 투여를 포함할 수 있다. 임의로, 항체의 결합(즉, 타우의 존재)은 랜덤 변동의 측정치를 확립하면서 면역치료에 대한 반응에서의 경향을 보여주도록 환자로부터의 다수의 생물학적 샘플에서 다수의 경우에 평가된다. 생물학적 샘플에 대한 항체 결합의 다양한 평가는 이후 비교된다. 오직 2개의 평가가 이루어지는 경우, 항체 결합(즉, 타우의 존재)이 2개의 평가 사이에 증가하거나, 감소하거나, 동일하게 있는지를 결정하기 위한 2의 평가 사이에 직접적인 비교가 이루어질 수 있다. 2 이상의 측정이 이루어지는 경우, 측정은 치료제에 의한 치료 전에 시작하여 그리고 치료의 과정을 거쳐 진행하여 시간 과정으로 분석될 수 있다. 생물학적 샘플에 대한 항체 결합이 감소하는 환자(즉, 타우의 존재)에서, 치료제는 환자에서 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)를 치료하는 데 효과적인 것으로 결론지어질 수 있다. 항체 결합의 감소는 통계학적으로 유의미할 수 있다. 임의로, 결합은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%로 감소한다. 항체 결합의 평가는 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환, 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(CBD), 루이소체 치매, 알츠하이머병의 루이소체 변이체(LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(PSP)의 다른 징후 및 증상을 평가하는 것과 연관되어 이루어질 수 있다.
항체는 타우 또는 이의 단편의 검출에서 실험실 조사를 위해 조사 시약으로서 또한 사용될 수 있다. 이러한 용도에서, 항체는 형광성 분자, 스핀 표지된 분자, 효소 또는 방사성 동위원소에 의해 표지될 수 있고, 검출 검정을 수행하기 위해 모든 필요한 시약과 함께 키트의 형태로 제공될 수 있다. 항체는 예를 들어 친화도 크로마토그래피에 의해 타우 또는 타우의 결합 파트너를 정제하도록 또한 사용될 수 있다.
상기 및 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 공보, 수탁 번호 등은, 각각의 개별 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 이렇게 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로, 모든 목적을 위해 그 전문이 참고로 포함된다. 서열의 상이한 버전이 상이한 때에 수탁 번호와 연관되는 경우, 본 출원의 유효 출원일에 수탁 번호와 연관된 버전이 의도된다. 유효 출원일은 적용 가능한 경우 실제 출원일 또는 수탁 번호를 칭하는 우선권 출원의 출원일 중 이른 것을 의미한다. 마찬가지로, 상이한 때에 공보, 웹사이트 등의 상이한 버전이 공개되는 경우, 출원의 유효 출원일에 가장 최근에 공개된 버전이 달리 표시되지 않는 한 의도된다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 부재, 실시형태 또는 양태는 구체적으로 달리 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명이 명확성 및 이해의 목적을 위해 예시 및 예로 약간 자세히 기재되어 있지만, 소정의 변경 및 변형이 첨부된 청구항의 범위 내에 실행될 수 있다는 것이 명확할 것이다.
실시예
실시예 1. 타우 단일클론 항체의 확인
타우에 대한 단일클론 항체는 하기와 같이 생성되었다. 면역화는 P301S 돌연변이를 함유하는 재조합 N 말단으로 His 태그화된 383 a.a. 인간 타우(4R0N)[면역원 A] 또는 N 말단 His-태그가 결여된 P301S 돌연변이를 함유하는 재조합 383 a.a. 인간 타우(4R0N)[면역원 B]에 의해 수행되었다. 면역원을 RIBI 애쥬번트 중에 유화시켰다.
5주령 암컷 Balb/c 마우스를 0일에 25㎍의 면역원 A, 및 각각 7일, 14일, 21일, 27일, 34일, 48일, 55일 및 62일에 10㎍의 면역원 A에 의해 복강내로 면역화하였다. 마우스를 76일 및 90일에 10㎍의 면역원 B에 의해 면역화하였다. 43일 및 98일에, 마우스를 사혈시키고, 면역원 A에 대해 역가측정하고; 101일에, 가장 높은 역가를 갖는 동물을 복강내로 ½ 및 정맥내로 ½ 전달된 50㎍의 면역원 B의 말단 면역화에 의해 부스팅하였다. 융합된 하이브리도마를 면역원 둘 다에 대해 ELISA를 통해 스크리닝하고, 가장 높은 신호를 갖는 포지티브는 에피토프 맵핑하였다(실시예 2 참조). 3D6은 서열 번호 3의 199번 내지 213번 아미노산 잔기 및 서열 번호 3의 262번 내지 276번 아미노산 잔기에 상응하는 펩타이드에 반응하였다. (타우의 가장 긴 CNS 아이소폼의 넘버링에 따라, 이것은 서열 번호 1의 257번 내지 271번 아미노산 잔기 및 서열 번호 1의 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응한다).
실시예 2. 항체 3D6의 에피토프 맵핑
쥣과 3D6 항체를 맵핑하기 위해 전체 383aa 4R0N 인간 타우 단백질에 걸친 중첩하는 바이오티닐화된 펩타이드의 범위를 사용하였다. 단백질의 C 및 N 말단 끝의 가능한 전사 후 변형을 모델링하기 위해 추가적인 펩타이드를 사용하였다.
바이오티닐화된 펩타이드는 스트렙타비딘 코팅된 ELISA 플레이트의 별개의 웰에 결합하였다. 플레이트를 쥣과 3D6에 의해 차단하고 처리한 후, 겨자무과산화효소 접합된 항-마우스 항체와 항온처리하였다. 완전한 세척 후, OPD를 플레이트에 적용하고 전개되게 하였다. 플레이트를 450㎚ 흡광도에서 판독하였다. 배경 공제를 1차 항체를 함유하지 않는 웰로부터의 흡광도 값에 의해 수행하고, 양성 결합에 대한 한계치를 0.2 흡광도 단위로 설정하였다.
양성 결합은 (서열 번호 3의) 199번 내지 213번 아미노산 잔기 및 (서열 번호 3의) 262번 내지 276번 아미노산 잔기에 걸친 펩타이드에 대해서 검출되었다. 전장 4R2N 인간 타우 단백질(441 아미노산)의 넘버링을 이용하여, 이 펩타이드는 (서열 번호 1의) 257번 내지 271번 아미노산 잔기 및 (서열 번호 1의) 320번 내지 334번 아미노산 잔기에 상응한다. (도 1)
실시예 3. 인간화된 3D6 항체의 설계
인간화를 위한 출발점 또는 도너 항체는 마우스 항체 3D6이었다. 성숙 m3D6의 중쇄 가변 아미노산 서열은 서열 번호 7로서 제공된다. 성숙 m3D6의 경쇄 가변 아미노산 서열은 서열 번호 11로서 제공된다. 중쇄 카밧/쵸티아 컴포지트 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열 번호 8 내지 10으로서 제공된다. 경쇄 카밧 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열 번호 12 내지 14로서 제공된다. 카밧 넘버링은 이에 걸쳐 사용된다.
3D6의 가변 카파(Vk)는 인간 카밧 하위그룹 2에 상응하는 마우스 카밧 하위그룹 2에 속하고, 가변 중쇄(Vh)는 인간 카밧 하위그룹 1에 상응하는 마우스 카밧 하위그룹 2c에 속한다[Kabat E.A., et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242]. Vk에서 16개의 잔기 쵸티아 CDR-L1은 전형적 클래스 4에 속하고, 7개의 잔기 쵸티아 CDR-L2는 클래스 1에 속하고, 9개의 잔기 쵸티아 CDR-L3은 클래스 1에 속한다[Martin A.C, and Thornton J.M. (1996) J. Mol. Biol. 263:800-15. [Martin & Thornton, 1996]. 10개의 잔기 쵸티아 CDR-H1은 클래스 1에 속하고, 17개의 잔기 쵸티아 CDR-H2는 클래스 2에 속한다[Martin & Thornton, 1996]]. CDR-H3은 전형적 클래스를 갖지 않는다. 3D6의 개략적인 구조 모델을 제공하는, 구조를 발견하기 위해 PDB 데이터베이스[Deshpande N, et al., (2005) Nucleic Acids Res. 33: D233-7.]에서 단백질 서열에 걸쳐 조사가 이루어졌다. 3D6의 Fv 모델을 구축하기 위해, 2.0A의 해상도로 PrPSc로의 PrPC의 형태 변경에 참여하는 에피토프에 결합하는 항체의 구조(pdb 코드 1CR9; 서열 번호 70) [Kanyo , Z.F ., et al. (1999). J.Mol..Biol. 293: 855-863]가 사용되었다. 이것은 루프에 대한 3D6과 동일한 전형적 구조를 보유하였다. 2015 INN 항체 인간화 규칙[Jones,T.D., et al, (2016), The INNs and outs of antibody nonproprietary names. mAbs (http://dx.doi.org/10.1080/19420862.2015.1114320)]에 따라, IMGT 데이터베이스의 조사는 쥣과 CDR을 그래프팅하기 위한 적합한 인간 생식선 프레임워크의 선택을 허용하였다. Vk에 대해, IMGT#IGKV2-30*02(인간 생식선 VH 서열) 및 IMGT#IGKJ2*01(인간 생식선 VJ 서열)을 갖는 인간 카파 경쇄를 선택하였다. IMGT#IGKV2-30*02는 CDR-L1, CDR-L2 및 L3에 대해 마우스 3D6와 동일한 전형적 클래스를 갖는다. IMGT#IGKV2-30*02 및 IMGT#IGKJ2*01은 인간 카파 하위그룹 2에 속한다. 인간 VL 억셉터 AAZ09048.1은 또한 적용되었다. Vh에 대해, 인간 경쇄 하위그룹 1에 둘 다 속하는, IMGT# IGHV1-69-2*01(인간 생식선 VH 서열) 및 IMGT#IGKJ1*01(인간 생식선 VJ 서열)을 갖는 인간 중쇄를 선택하였다. IMGT# IGHV1-69-2*01은 마우스 3D6 CDR-H1 및 H2의 전형적 형태를 공유한다. VH 설계 1 및 2에 대해, NCBI로부터의 비중복 단백질 서열 데이터베이스의 조사로부터의 인간 VH 억셉터 BAC01986.1을 (이전의 INN 인간화 규칙에 따라) 또한 적용하였다.
2015 INN 항체 인간화 규칙[Jones,T.D.,et al, (2016), The INNs and outs of antibody nonproprietary names. mAbs (http://dx.doi.org/10.1080/19420862.2015.1114320)]에 따라, IMGT 데이터베이스의 조사는 쥣과 CDR을 그래프팅하기 위한 적합한 인간 생식선 프레임워크의 선택을 허용하였다. 항체 인간화 과정으로부터 생긴 중쇄 및 경쇄 변이체 서열은 WHO INN 위원회 가이드라인에 의해 나타난 바대로 중쇄 및 경쇄의 인간성을 평가하기 위해 IMGT 도메인 GapAlign 도구를 이용하여 인간 생식선 서열로 추가로 정렬되었다. (WHO-INN: 생물학적 및 생명공학 물질에 대한 국제 일반명(INN) (리뷰) (인터넷) 2014. (http://www. who.int/medicines/services/inn/BioRev2014.pdf)로부터 이용 가능). 잔기는, 가능한 경우, 인간성을 증대시키기 위해 상응하는 인간 생식선 서열과 정렬하도록 변했다.
치환 hu3D6VHv1(서열 번호 15); hu3D6VHv2(서열 번호 16);, hu3D6VHv1b(서열 번호 17); hu3D6VHv1bA11(서열 번호 18); hu3D6VHv5(서열 번호 19); hu3D6VHv1bA11B6G2(서열 번호 46); hu3D6VHv1bA11B6H3(서열 번호 47); hu3D6VHv1c(서열 번호 48); hu3D6VHv1d(서열 번호 49); hu3D6VHv1e(서열 번호 50); hu3D6VHv1f(서열 번호 51); hu3D6VHv3(서열 번호 52); hu3D6VHv3b(서열 번호 53); hu3D6VHv3c(서열 번호 54); hu3D6VHv4(서열 번호 55); hu3D6VHv4b(서열 번호 56); 및 hu3D6VHv4c(서열 번호 57); 및 hu3D6VLv1, hu3D6VLv2, hu3D6VLv3 및 hu3D6VLv4(각각 서열 번호 20 내지 23)(표 3 및 표 4)의 상이한 순열을 함유하는 17개의 인간화된 중쇄 가변 영역 변이체 및 4개의 인간화된 경쇄 가변 영역 변이체를 작제하였다. 선택된 인간 프레임워크에 기초한 역돌연변이 및 다른 돌연변이를 갖는, 예시적인 인간화된 Vk 및 Vh 설계는 각각 표 3 및 표 4에 기재되어 있다. 표 3 및 표 4에서의 회색 음영 영역은 카밧/쵸티아 컴포지트에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 나타낸다. 서열 번호 15 내지 19, 서열 번호 20 내지 23, 서열 번호 46 내지 57은 표 5에 기재된 바와 같은 역돌연변이 및 다른 돌연변이를 함유한다. hu3D6VHv1, hu3D6VHv2, hu3D6VHv1b, hu3D6VHv1bA11, hu3D6VHv5, hu3D6VHv1bA11B6G2, hu3D6VHv1bA11B6H3, hu3D6VHv1c, hu3D6VHv1d, hu3D6VHv1e, hu3D6VHv1f, hu3D6VHv3, hu3D6VHv3b, hu3D6VHv3c, hu3D6VHv4, hu3D6VHv4b 및 hu3D6VHv4c에서의 위치에서의 아미노산은 표 6에 기재되어 있다. hu3D6VLv1, hu3D6VLv2, hu3D6VLv3 및 hu3D6VLv4에서의 위치에서의 아미노산은 표 7에 기재되어 있다. 인간화된 VH 사슬 hu3D6VHv1, hu3D6VHv2, hu3D6VHv1b, hu3D6VHv1bA11, hu3D6VHv5, hu3D6VHv1bA11B6G2, hu3D6VHv1bA11B6H3, hu3D6VHv1c, hu3D6VHv1d, hu3D6VHv1e, hu3D6VHv1f, hu3D6VHv3, hu3D6VHv3b, hu3D6VHv3c, hu3D6VHv4, hu3D6VHv4b 및 hu3D6VHv4c(각각 서열 번호 15 내지 19, 46 내지 57) 및 인간화된 VL 사슬 hu3D6VLv1, hu3D6VLv2, hu3D6VLv3 및 hu3D6VLv4(각각 서열 번호 20 내지 23)에 대한 인간성 백분율은 표 8에 기재되어 있다.
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전형적, 비니어 또는 인터페이스 잔기가 마우스 및 인간 억셉터 서열 사이에 다른 위치는 치환에 대한 후보이다. 전형적/CDR 상호작용 잔기의 예는 표 3 및 표 4에서 카밧 잔기 H24, H27, H29, H34, H38 및 H67을 포함한다. 인터페이스/패킹(VH+VL) 잔기의 예는 표 3 및 표 4에서 카밧 잔기 H40, H43, H48, H91, H93, L36, L98 및 L100을 포함한다.
치환에 대한 후보로서 경쇄 가변 영역에서 표 4에 표시된 위치의 선택을 위한 근거는 하기와 같다.
Q100G는 인터페이스 잔기를 접촉시키는 잔기의 돌연변이이다. F36L 및 M89W는 인터페이스 잔기의 돌연변이이다. V2I는 돌연변이를 정렬시키는 빈도/생식선이다. S7T는 S와 유사한 잔기의 돌연변이이고, 유사한 면역원성을 가질 수 있다. P12S는 E105와의 접촉을 증가시키도록 try에 대한 돌연변이이다. L15I는 L과 유사한 잔기에 대한 돌연변이이다. R45K는 R과 유사한 잔기에 대한 돌연변이이다. D60S는 D가 표시된 프로테아제 절단 부위이므로 S에 대한 돌연변이이다.
치환에 대한 후보로서 중쇄 가변 영역에서 표 3에 표시된 위치의 선택을 위한 근거는 하기와 같다.
V24A는 HCDR1 전형적 잔기의 돌연변이이다. V67A는 HCDR2를 접촉시키는 잔기의 돌연변이이다. Q38R은 전형적/CDR 상호작용 잔기의 돌연변이이다. A40R, K43Q 및 M48I는 인터페이스 잔기를 접촉시키는 잔기의 돌연변이이다. Y91F 및 A93S는 인터페이스 잔기의 돌연변이이다. K12V, M80L 및 E81Q는 돌연변이를 정렬시키는 역돌연변이 또는 생식선에 기초한 빈도이다. S82aG는 증가된 결합에 대한 시험에 대한 돌연변이이다.
hu3D6VHv2에서의 카밧 잔기 H17에서의 S는 인간 VH 억셉터 수탁 번호 BAC01986.1로부터 획득되었다.
hu3D6VHv1 및 hu3D6VHv2에서의 카밧 잔기 H20에서의 V는 인간 VH 억셉터 수탁 번호 BAC01986.1로부터 획득되었다. hu3D6VHv1f에서의 카밧 잔기 H102에서의 Y는 Mus VH 구조 주형(PDB#1CR9_H; 서열 번호 70) 및 마우스 항-타우 단일클론 항체 6A10으로부터 획득되었다.
QuikChange 부위 지정 돌연변이유발 [Wang, W. and Malcolm, B.A. (1999) BioTechniques 26:680-682)을 이용하여 다수의 돌연변이, 결실, 및 삽입의 도입을 허용하는 2단계 PCR 프로토콜을 이용하여 인간화된 서열을 생성한다.
인간 프레임워크에 기초한 설계는 하기와 같다:
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Figure 112018118554412-pct00030
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실시예 4. 마우스 단일클론 항체는 ELISA 검정에서 타우에 결합한다
방법: 간접 ELISA: 96웰 폴리스타이렌 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 1xPBS 중에 현탁된 포획 항체 항-6xHis(도 5a) 또는 다중클론 항-타우(Dako #A0024, 도 5b)에 의해 코팅하였다. 코팅을 제거하고, 플레이트를 1xPBS 중의 1% BSA에 의해 1시간 동안 차단한 후, 단백질의 N 말단에서 폴리히스티딘 태그의 존재(도 5a) 또는 부재(도 5b) 하에 인간 재조합 타우와 항온처리하였다. 세척 후, 플레이트를 표시된 항체와 항온처리하고, 세척하고, HRP 접합된 염소 항-마우스 2차 항체와 항온처리하였다. 플레이트를 TMB에 의해 전개시키고, A450을 플레이트 판독기에 의해 측정하였다.
샌드위치 ELISA: 96웰 폴리스타이렌 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 1xPBS 중의 항-마우스 항체에 의해 코팅하였다. 코팅을 제거하고, 플레이트를 1xPBS 중의 1% BSA에 의해 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 다음에 동일한 농도에서 표시된 항체와 항온처리하고, 1xPBS 중의 0.1% BSA 중에 희석하였다. 플레이트를 인간 타우, 다중클론 토끼 항-타우(Dako #A0024) 및 HRP 접합된 염소 항-토끼 항체에 의해 연속하여 처리하고(모두 PBS 중의 0.1% BSA 중에 희석됨), 세척은 각각의 단계 사이에 발생했다. 스트렙타비딘-HRP를 첨가하고, 플레이트를 TMB에 의해 전개시키고, A450을 플레이트 판독기에 의해 측정하였다. 도 5c를 참조한다.
결과: 다수의 상이한 ELISA 포맷을 통해 타우에 대한 결합에 대해 하이브리도마 생산된 항체의 패널을 평가하였다. 타우의 검출은 이의 N 말단으로 융합된 폴리히스티딘 태그에 의해 부동화된 타우 단백질을 사용하여 간접 포맷을 이용하여 확인되었다(도 5a). 네이티브 비태그화된 단백질에 대한 결합이 또한 확인되었다(도 5b). 다양한 항체의 용액 친화도를 평가하기 위해, 시험된 하이브리도마 항체가 포획 시약으로서 사용되는 샌드위치 ELISA 포맷을 이용하였다(도 5c).
실시예 5. 타우에 대한 마우스 단일클론 항체의 친화도
방법: 재조합 인간 타우에 대한 쥣과 항체의 결합 동역학을 결정하기 위해 Biacore T200을 이용하여 SPR 분석을 수행하였다. 센서 표면을 제조하기 위해, 항-마우스 항체(GE Life Sciences)를 아민 커플링을 통해 센서 칩 CM5에서 부동화하고, 항체를 50 RU의 최대 결합을 보장하는 수준에서 포획하였다. 10 내지 0.14nM의 범위의 재조합 타우의 다양한 농도를 180초 회합 및 900초 분해에 대해 실행 완충제(HBS + 0.05% P-20, 1㎎/㎖ BSA) 중에 50㎕/분의 유속으로 포획된 리간드 위로 통과시켰다. 데이터는, 포획 모이어티로부터 리간드의 분해를 설명하기 위해, 항체 리간드를 함유하지 않는 비관련 센서 및 0nM 분석물질 농도 둘 다에 이중 참조되었다. 이후, 전반적인 1:1 피트를 이용하여 데이터를 분석하였다.
결과: ELISA 검정의 배터리에서의 성능에 기초하여 다수의 쥣과 항체를 선택하고, SPR을 통해 이의 결합 친화도를 평가하였다. 항체를 병행 세트에서 시험하고, 이의 결합 회합 및 분해 속도를 재조합 인간 타우에 대한 가장 높은 결합을 선택하기 위해 비교하였다. 가장 높은 결합 친화도는 항체 클론 3D6에 의해 관찰되었다. 결합 친화도는 도 6에 도시되어 있다.
실시예 6. 마우스 단일클론 항체는 불멸화된 뉴런 세포의 표면에 대한 인간 타우의 결합을 방지한다
방법: 항-타우 단일클론 항체에 의한 B103 신경아세포종 세포에 대한 타우 결합의 저해
1. 5x105개의 세포/㎖로 PBS 중에 B103 세포를 재현탁시킨다. MSD 고결합 플레이트에서 웰마다 50㎕의 세포 현탁액을 플레이팅한다. 이것은 25K 세포/웰을 생성시킨다. 플레이트를 커버하고, 세포가 2시간 동안 37℃, 5% CO2에서 부착되게 한다.
2. 세포 부착 후, 플레이트를 뒤집고 약하게 두들겨서 과량의 완충제를 제거함으로써 웰로부터 PBS를 제거한다. 각각의 웰에 PBS 또는 다른 적합한 차단 완충제 중의 50㎕의 3% MSD 차단제 A를 첨가하고, 진탕 없이 1시간 동안 실온에서 플레이트를 항온처리한다.
3. 플레이트 차단 단계 동안, 타우 및 항-타우 항체를 하기와 같이 동시배양한다:
a. 7회의 추가적인 희석 동안 2㎎/㎖에서 항-타우 항체에 의해 시작하고, PBS(1:2) 중에 연속 희석한다.
b. PBS 중에 20nM으로 타우를 희석한다. 타우 농도는 각각의 웰에서 일정할 것이다.
c. 10nM의 최종 타우 농도 및 1㎎/㎖의 항-타우의 출발 농도에 대해 타우 및 항-타우 항체를 혼합한다.
d. 진탕(600rpm)하면서 실온에서 대략 1시간 동안 혼합물을 항온처리한다.
4. 플레이트 차단, 단계 2 후, 플레이트를 뒤집고 약하게 두들김으로써 웰로부터 차단 완충제를 제거하고, 다중채널 피펫을 사용하여 PBS에 의해 플레이트를 2회 세척한다. 과량의 완충제가 완전히 제거되도록 보장한다. 타우:항-타우 복합체를 첨가하기 전에 플레이팅된 세포를 4℃로 냉각시킨다.
5. 50㎕의 냉각된 복합체(단계 3)를 플레이팅된 세포에 첨가하고, 30분 동안 얼음에서 항온처리한다.
6. 이전에 기재된 바대로 차가운 PBS에 의해 플레이트를 2회 세척한다.
7. 세포 표면 결합된 타우의 검출을 위해 웰당 50㎕의 16B5.SULFO-TAG를 첨가한다. 얼음에서 30분 동안 항온처리한다.
8. 이전에 기재된 바대로 다시 차가운 PBS에 의해 플레이트를 2회 세척한다.
9. 웰당 계면활성제 없이(H2O 중에 희석된) 150㎕의 1X Read 완충제 T를 첨가하고, MSD SECTOR(상표명) 600 장비에서 바로 판독한다. 판독 완충제를 첨가할 때 버블을 도입하는 것을 피한다.
10. 항-타우의 농도에 대해 MSD 신호를 보고한다.
시험된 항체는 항-타우 항체 3D6, 16G7, 3H9, 4C5, 및 5G8 및 아이소타입 대조군이었다.
결과:
증가하는 시험 항체에 의해 발생하는 감소하는 SulfoTag 항-타우 신호는 뉴런 세포 표면에 대한 타우의 결합의 기능적 차단을 나타낸다. 아이소타입 대조군, 16G7 또는 3H9에 의해 차단이 관찰되지 않았다. 기능적 차단 활성의 증가하는 양이 4C5, 5G8 및 3D6에 의해 관찰되었다. 3D6은 시험된 항체의 가장 깊은 차단 활성을 입증하였다. 도 7을 참조한다.
실시예 7. 분해 활성
방법: 재조합 타우의 응집 - N 말단 6xHis 태그를 갖는 정제된 재조합 타우를 1xPBS(pH 7.4) 중에 등몰량의 저분자량 헤파린과 조합하고, 누테이터(nutator)에서 37℃에서 96시간 동안 항온처리하였다. 샘플의 응집은 티오플라빈 T에 대한 결합에 의해 확인되었다.
항체에 의한 항온처리 - 항체를 표시된 몰비에서 응집된 재조합 타우와 항온처리하고, 회전 또는 장동 없이 37℃에서 96시간 동안 항온처리하였다. 실험의 종료 시, 샘플을 25mM 티오플라빈 T와 항온처리하고, 방출된 형광(450/482 ex/em)을 측정함으로써 응집을 측정하였다. 신호는 완충제 샘플로 공제된 배경이었다.
결과: 도 8에 도시된 바대로, 3D6는 온전한 타우 피브릴을 우선적으로 디어셈블링한다. 다양한 몰비의 3D6(삼각형), 아이소타입 대조군(원형) 및 16G7(사각형)을 아밀로이드 함유 타우 피브릴과 96시간 동안 항온처리하였다. 이 기간의 종료 시, 티오플라빈 T에 대한 결합에 의해 응집의 정도를 평가하였다. 3D6은 아이소타입 대조군 항체 및 타우의 상이한 영역에 결합하는 항-타우 항체인 16G7 둘 다와 비교하여 샘플에 존재하는 티오플라빈 T를 우선적으로 감소시킨다.
실시예 8. 인간 질환 조직으로부터의 3D6 및 5G8 면역포획 타우.
방법: 고염 가용성 단백질 분획을 1㎎/㎖로 제조하였다. 각각의 면역침전을 위해, 200㎍의 샘플을 사용하였다. 10㎍의 표시된 항체(아이소타입 대조군, 3D6 또는 항-타우 항체 5G8)를 고염 샘플 제제에 첨가하고, 2시간 동안 항온처리하였다. 이후, 단백질 G 자기 비드를 혼합물에 첨가하고, 추가의 시간 동안 항온처리하여 항체/항원 복합체를 포획하였다. 샘플을 1xPBS에 의해 완전히 세척하고, 비드를 환원/변성 샘플 완충제 중에 비등시켜 포획된 단백질을 방출시켰다. 생성된 샘플을 SDS-PAGE에 의해 해상하고, 다중클론 항-타우 항체(Dako, #A0024)를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다.
결과: 도 9에 도시된 바대로, 3D6 및 5G8은 알츠하이머병 조직으로부터 타우를 면역침전시켰다. 고염 가용성 분획을 표시된 항체에 의해 면역침전시키고, 3D6에 대한 결합 부위로부터 타우 분자의 별개의 영역에 지향된 다중클론 항-타우 항체 및 타우 항체 A에 의해 검출하였다. 3D6은 이 분획으로부터 타우를 단단히 포획하였다. 유입(고염 가용성 샘플)은 오른쪽에 도시되어 있다.
실시예 9. 3D6의 면역조직화학 면역반응성
신경퇴행성 질환을 갖지 않거나 사후 평가 시 확인된 알츠하이머병을 갖는 환자로부터 전두측두 피질을 얻었다. 약하게 아세톤 고정된 10㎛ 슬라이드 탑재된 동결절편에서 면역조직화학을 수행하였다. Leica 소비재를 사용하여 Leica BOND Rx 자동염색기를 사용하여 모든 염색 단계를 수행하였다. 3D6의 쥣과 또는 인간 형태를 조직 절편과 항온처리한 후, HRP 중합체에 접합된 종-적절한 2차 항체를 첨가하였다. 인간 조직에서 인간화된 항체를 사용할 때 내인성 면역글로불린의 비특이적 결합을 방지하도록, 항체를 조직에서 항온처리 전에 시험관내 바이오틴 접합된 항-인간 1가 Fab 단편에 의해 비공유로 표지하였다. 아비딘-바이오틴 증폭 시스템(Vector Laboratories(캘리포니아주 벌링게임))을 사용하여 1차 항체-바이오틴 Fab 단편 복합체에 의해 표지된 조직을 추가로 증폭시켰다. 갈색 침착물을 생성시킨 DAB 색소원에 의해 염색을 가시화하였다. 음성 대조군은 IgG 아이소타입 대조군 항체를 갖는 인접한 절편에서 전체 면역조직화학 절차를 수행하는 것으로 이루어진다.
시험된 항체는 쥣과 CD6, 키메라 3D6(인간 불변 영역을 갖는 쥣과 항체로부터의 VH 및 VL, 중쇄 서열 번호 72 및 경쇄 서열 번호 73을 함유) 및 인간화된 변이체 hu3D6VHv5/hu3D6VLv2이었다.
3D6의 쥣과, 키메라 및 인간화된 형태에 의해 수행된 염색을 염색의 강도 및 강렬함, 및 면역반응성의 국재화에 대해 정성적으로 비교하고 평가하였다. 염색의 강도는 3D6의 키메라 및 인간화된 형태에 대해 유사하고, 항체의 쥣과 형태와 비교하여 유사한 국재화 패턴을 나타냈다. 타우는 신경섬유 매듭, 피브릴, 신경망 트레드 및 퇴화하는 액손에서 검출되었다. 또한 주목할만한 약간의 염색이 검출되었다.
실시예 10. 타우에 대한 인간화된 변이체의 친화도
방법: 간접 ELISA 96웰 폴리스타이렌 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 1xPBS 중에 현탁된 인간 재조합 타우에 의해 코팅하였다. 코팅을 제거하고, 플레이트를 1xPBS 중의 1% BSA에 의해 1시간 동안 차단하였다. 1xPBS 중의 0.1% BSA 중의 1㎍/㎖의 표시된 항체를 1시간 동안 플레이트에 첨가한 후 세척하고, HRP 접합된 염소 항-인간 항체를 첨가하였다. 플레이트를 TMB에 의해 전개시키고, A450을 플레이트 판독기에 의해 측정하였다.
샌드위치 ELISA 96웰 폴리스타이렌 플레이트를 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 16시간 동안 1xPBS 중의 항-인간 항체에 의해 코팅하였다. 코팅을 제거하고, 플레이트를 1xPBS 중의 1% BSA에 의해 1시간 동안 차단하였다. 1xPBS 중의 0.1% BSA 중에 희석된 표시된 바와 같은 다양한 농도의 표시된 항체를 1시간 동안 플레이트에 첨가한 후 세척하고, 1xPBS 중의 0.1% BSA 중에 희석된 바이오티닐화된 재조합 인간 타우를 첨가하였다. 세척 후, 스트렙타비딘-HRP를 첨가하고, 플레이트를 TMB에 의해 전개시키고, A450을 플레이트 판독기에 의해 측정하였다.
재조합 인간 타우에 대한 h3D6-VHv5-L2의 결합 동역학을 결정하기 위해 Biacore T200을 사용하여 SPR 분석을 수행하였다. 센서 표면을 제조하기 위해, 항-인간 항체(GE Life Sciences)를 아민 커플링을 통해 센서 칩 CM5에서 부동화하고, hu3D6VHv5/hu3D6VLv2를 50 RU의 최대 결합을 보장하는 수준에서 포획하였다. 10 내지 0.14nM의 범위의 재조합 타우의 다양한 농도를 180초 회합 및 900초 분해에 대해 실행 완충제(HBS + 0.05% P-20, 1㎎/㎖ BSA) 중에 50㎕/분의 유속으로 포획된 리간드 위로 통과시켰다. 데이터는, 포획 모이어티로부터 리간드의 분해를 설명하기 위해, 항체 리간드를 함유하지 않는 비관련 센서 및 0nM 분석물질 농도 둘 다에 이중 참조되었다. 이후, 전반적인 1:1 피트를 이용하여 데이터를 분석하였다.
시험된 항체는 키메라 3D6(인간 불변 영역을 갖는 쥣과 VH 및 VL 영역; 서열 번호 72(중쇄) 및 서열 번호 73(경쇄) 및 인간화된 변이체(hu3D6VHv1b/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv1c/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv1d/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv1e/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv1f/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv2/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv3/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv3b/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv3c/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv4/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv4b/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv4c/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv5/hu3D6VLv2, hu3D6VHv1bB6A11/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv1bB6A11B6G2/ hu3D6VLv2, hu3D6VHv1bB6A11B6H2/ hu3D6VLv2 포함)였다.
도 10a: 재조합 인간 타우에 대한 결합을 비교하기 위해 ELISA를 통해 3D6의 인간화로부터의 다수의 후보 서열을 시험하였다. 흡광도 값을 비교하고, 쥣과 항체로부터의 VH 및 VL을 함유하는 키메라-3D6에 대한 값에 전형적화하였다. 다수의 후보 서열은 키메라 항체와 비교할 때 유사한 결합을 갖고, hu3D6VHv5/hu3D6VLv2는 가장 높은 반응성을 나타낸다.
도 10b: hu3D6VHv5/hu3D6VLv2의 결합을 샌드위치 ELISA에서 농도 곡선을 통해 키메라-3D6과 비교하고, 키메라-3D6 및 hu3D6VHv5/hu3D6VLv2를 타우 포획 시약으로서 사용하였다. 항체 둘 다는 유사한 결합 곡선을 나타내어서, 유사한 친화도를 나타낸다.
도 10c: hu3D6VHv5/hu3D6VLv2의 친화도를 SPR 분석에 의해 결정하였다. 다양한 농도의 재조합 타우를 부동화된 항체 위로 유동시키고, 전반적인 1:1 피트를 이용하여 생성된 센소그램을 분석하였다. 동역학 친화도, 회합 및 분해 속도는 여기 도시되어 있고, 쥣과 3D6 값과 매우 양호하게 비교한다.
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SEQUENCE LISTING <110> Prothena Biosciences Ltd. <120> Antibodies Recognizing Tau <130> WO2017/191560 <140> PCT/IB2017/052544 <141> 2017-05-02 <150> US 62/330,789 <151> 2016-05-02 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro 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Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 49 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Val Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Val Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 50 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 51 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Val Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Val Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 52 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 53 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Val Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Val Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Gly Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 55 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 56 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 57 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Val Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Val Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 58 Gly Phe Asn Phe Lys Asp Tyr Tyr Leu His 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 59 Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Leu His 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 60 Gly Tyr Asn Phe Lys Asp Tyr Tyr Leu His 1 5 10 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 61 Trp Val Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Val Tyr Ala Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 62 Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Asp Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 63 Trp Val Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Val Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 64 Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Ala Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 65 <400> 65 000 <210> 66 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 66 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Leu Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Asp Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 67 Gly Leu Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 68 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 68 Trp Ile Asp Pro Glu Asn Asp Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 69 <400> 69 000 <210> 70 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Lys Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Ser Glu Tyr Ala Pro Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Leu Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Asn Ala Asp Leu His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 71 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 71 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 72 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 72 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Val Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Thr Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 73 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized <400> 73 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (215)

  1. 인간 타우에 결합하는 단리된 단일클론 항체로서,
    서열 번호 8, 9 및 10의 3개의 중쇄 CDR 및 서열 번호 12, 13 및 14의 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 11의 성숙 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 7의 성숙 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  3. 제1항에 있어서, 키메라, 비니어드(veneered) 또는 인간화된 항체인, 항체.
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  11. 인간 타우에 결합하는 단리된 단일클론 항체로서, 상기 항체는 서열 번호 17, 18, 19, 46, 47, 50 및 55의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간화된 항체인, 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 성숙 중쇄 가변 영역은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖고, 상기 성숙 경쇄 가변 영역은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는, 항체.
  13. 제1항 내지 제3항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 온전한 항체인, 항체.
  14. 제1항 내지 제3항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단편인, 항체.
  15. 제1항 내지 제3항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 불변 영역에 융합된 성숙 경쇄 가변 영역과 중쇄 불변 영역에 융합된 성숙 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 천연 인간 중쇄 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 상기 천연 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이체 형태인, 항체.
  17. 제15항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 아이소타입인, 항체.
  18. 제15항에 있어서, 상기 아이소타입은 인간 IgG2 또는 IgG4 아이소타입인, 항체.
  19. 제1항 내지 제3항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산.
  20. 제19항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  21. 제20항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  22. 마우스 항체를 인간화하는 방법으로서,
    (a) 하나 이상의 억셉터(acceptor) 항체 서열을 선택하는 단계;
    (b) 보유되는 마우스 항체의 아미노산 잔기를 확인하는 단계;
    (c) 상기 마우스 항체의 중쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 코딩하는 핵산 및 상기 마우스 항체의 경쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 경쇄를 코딩하는 핵산을 합성하는 단계; 및
    (d) 숙주 세포에서 상기 핵산을 발현시켜 인간화된 항체를 생산하는 단계를 포함하되;
    상기 마우스 항체는 서열 번호 7의 성숙 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 11의 성숙 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는, 방법.
  23. 인간화된, 키메라 또는 비니어드 항체를 생산하는 방법으로서,
    (a) 세포가 항체를 분비하도록 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산에 의해 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 세포 배양 배지로부터 상기 항체를 정제하는 단계를 포함하되;
    상기 항체는 제3항의 항체인, 방법.
  24. 인간화된, 키메라 또는 비니어드 항체를 생산하는 세포주를 제조하는 방법으로서,
    (a) 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터 및 선택 가능한 마커를 세포에 도입하는 단계;
    (b) 상기 벡터의 증가된 카피수를 갖는 세포를 선택하기 위한 조건 하에 상기 세포를 증식시키는 단계;
    (c) 선택된 세포로부터 단일 세포를 단리시키는 단계; 및
    (d) 항체의 수율에 기초하여 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹(banking)하는 단계를 포함하되;
    상기 항체는 제3항의 항체인, 방법.
  25. 타우-관련 질환인, 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환(argyrophilic grain disease), 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration: CBD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 알츠하이머병의 루이소체 변이체(Lewy body variant of Alzheimer disease: LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy: PSP)를 가진 환자에서 타우의 응집을 저해 또는 저감시키기 위한, 제1항 내지 제3항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 타우-관련 질환인, 알츠하이머병, 다운 증후군, 경증 인지 장애, 원발성 연령 관련 타우병증, 뇌염후 파킨슨증, 외상후 치매 또는 권투선수 치매, 픽병, C형 니만-픽병, 핵상 마비, 전두측두엽 치매, 전측두엽 변성, 은친화성 병변 질환(argyrophilic grain disease), 구상 신경교 치매, 근위축성 축삭증후군/괌의 파킨슨병 치매 복합, 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration: CBD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 알츠하이머병의 루이소체 변이체(Lewy body variant of Alzheimer disease: LBVAD) 또는 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy: PSP)를 치료 또는 예방하기 위한, 제1항 내지 제3항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 타우-관련 질환은 알츠하이머병인, 약제학적 조성물.
  28. 제3항에 있어서, 인간화된 항체인, 항체.
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