UA124148C2

UA124148C2 - Антитіла, що розпізнають тау

Info

Publication number: UA124148C2
Application number: UAA201811548A
Authority: UA
Inventors: Робін Барбур; Робин Барбур; Філіп Джеймс Долан; Филип Джеймс Долан; Юе Лю; Светлана Александер; Марк Ренц
Original assignee: Протена Біосайенсіс Лімітед; Протена Биосайенсис Лимитед
Priority date: 2016-05-02
Filing date: 2017-05-02
Publication date: 2021-07-28
Also published as: KR102471787B1; EP3452508A1; US10889638B2; CU20180136A7; US11584791B2; MX2018013384A; IL262726B1; AU2017259038A1; CN109219615A; US20210130449A1; IL262726A; KR20190003647A; CU24537B1; CA3022515A1; CL2018003112A1; CO2018012986A2; JP2022169598A; ZA201808044B; US20230250161A1; WO2017191560A1

Abstract

Даний винахід стосується виділеного моноклонального антитіла, яке специфічно зв’язується з тау людини та містить три CDR важкого ланцюга, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (SEQ ID NO: 8, 9 і 10), і три CDR легкого ланцюга, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (SEQ ID NO: 12, 13 і 14); за умови, що положення H27 займає F або Y, H28 займає N або T, H29 займає I або F, H30 займає K або T, положення H51 займає I або V, положення H54 займає N або D, положення H60 займає D або A, H61 займає P або E, і H102 займає F або Y. Винахід також стосується способу лікування або здійснення профілактики захворювання, що викликане тау.

Description

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Дана заявка пов'язана з попередньою заявкою США Мо 62/330,789, що подана 2 травня 2016 року, яка повністю включена у даний документ за допомогою посилання для всіх цілей.

ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

Перелік послідовностей, що записаний у файлі 4971075ЕО І5Т Хі, становить 65 кілобайтів, був створений 2 травня 2017 року та включений у даний документ за допомогою посилання.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Тау являє собою добре відомий білок людини, який може існувати у фосфорильованих формах (див., наприклад, публікації Соєдеп, Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 85: 4051-4055 (1988);

Сюоєдет, ЕМВО 3. 8: 393- 399 (1989); І ее, Мешгоп 2: 1615-1624 (1989); Соєдепі, Мешгоп 3: 519-526 (1989); Апагеадів, Віоспетівігу 31: 10626-10633 (1992). Повідомлялося, що тау грає роль в стабілізації мікротрубочок, зокрема, в центральній нервовій системі. Сумарний тау (с-тау, тобто, фосфорильована та нефосфорильована форми) і фосфо-тау (ф-тау, тобто фосфорильований тау) вивільняється головним мозком у відповідь на нейрональне пошкодження та нейродегенерацію, і, як повідомлялося, підвищені рівні тау спостерігаються у СМР (спинномозковій рідині) пацієнтів, що страждають від хвороби Альцгеймера, у порівнянні із загальною популяцією (Часк еї а!., апсеї Мешгої! 9: 119-28 (2010)).

Тау є найважливішим компонентом нейрофібрилярних клубків, які разом із бляшками є характерною ознакою хвороби Альцгеймера. Клубки утворюють аномальні фібрили, які становлять 10 нм в діаметрі, що зустрічаються у парах і перевиваються спіральним чином з регулярною періодичністю 80 нм. Тау вв нейрофібрилярних клубках є аномально фосфорильованим (гіперфосфорильованим), причому фосфатні групи приєднані до специфічних сайтів она молекулі При хворобі Альцгеймера значна присутність нейрофібрилярних клубків спостерігається у шарі ІЇ нейронів енторинальної області кори, в областях САТ й областях опорної структури гіпокампа, мигдалеподібного тіла й у більше глибоких шарах (шари ПШ, М і поверхневий МІ) неокортексу. Також повідомлялося, що гіперфосфорильований тау перешкоджає збиранню мікротрубочок, що може викликати руйнування нейронної мережі.

Включення тау є частиною визначення невропатології декількох нейродегенеративних хвороб, включаючи хворобу Альцгеймера, лобово-скроневу лобарну дегенерацію, прогресуючий над'ядерний параліч і хворобу Піка.

КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ, ЩО ЗАЯВЛЯЄТЬСЯ

Згідно з одним аспектом у даному винаході запропоноване виділене моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з тау. Приклади таких антитіл зв'язуються з епітопом в межах залишків амінокислот 199-213 або 262-276 5БЕО ІО МО: З (відповідають залишкам амінокислот 257-271 або 320-334, відповідно, 5ЕО ІЮО МО: 1).

Деякі такі антитіла конкурують з антитілом 306 за зв'язування з тау людини. Деякі такі антитіла зв'язуються з тим самим епітопом на тау людини, що і 306.

Деякі антитіла містять три СОВ легкого ланцюга та три СОВА важкого ланцюга моноклонального антитіла 306, причому 306 являє собою антитіло миші, яке характеризується варіабельною областю важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка містить

ЗБО 10 МО: 7, і варіабельною областю легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка містить 5ЕО ІО МО: 11. У деяких антитілах три СОВА важкого ланцюга є такими, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (ФЕО ІЮО МО: 8, 9 і 10), і три

СОВ легкого ланцюга є такими, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (5ЕО

ІО МО: 12, 13 і 14).

Наприклад, антитіло може являти собою 306 або химерну, веновану або гуманізовану форму зазначеного антитіла. У деяких таких антитілах варіабельна область важкого ланцюга характеризується ідентичністю послідовності людини 28595. У деяких таких антитілах варіабельна область легкого ланцюга характеризується ідентичністю послідовності людини 285

Фо. У деяких таких антитілах кожна з варіабельної області важкого ланцюга та варіабельної області легкого ланцюга характеризується ідентичністю послідовності зародкової лінії людини 285 95.

У деяких таких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОВ важкого ланцюга, які є такими, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (5ЕО

ІО МО: 8, 9 ї 10), і три СОВ легкого ланцюга, які є такими, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (ЗЕО ІЮ МО: 12, 13 ї 14); за умови, що положення Н27 займає Е або

У, Н28 займає М або Т, Н29 займає І або Е, НЗО займає К або Т, положення Н5БІ1 займає І або М, положення Н54 займає М або 0, положення НбО займає О або А, НбЄ1 займає Р або Е, і НІ102 60 займає Е або У. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮО МО: 42. У деяких таких антитіах СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 58. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕСО ІО МО: 59. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 60. У деяких таких антитілах СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮО МО: 43. У деяких таких антитілах СОВ-

Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 61. У деяких таких антитілах

СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 62. У деяких таких антитілах СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 63. У деяких таких антитілах СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 64. У деяких таких антитілах СОВ-НЗ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 65.

У деяких таких антитілах антитіло являє собою гуманізоване антитіло. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 42, ії СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮО МО: 43. У деяких таких антитілах СОВ-

НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО І МО: 42, ії СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 61. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО 10 МО: 42, і СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 64. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 42, СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО 10 МО: 63, ії СОВ-НЗ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮО МО: 65. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 58, і СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО І

МО: 62. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить ХЕ

ІО МО: 59, і СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 63. У деяких таких антитілах СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 60, і СОВ-

Н2 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ХЕО ІО МО: 62.

Деякі антитіла являють собою гуманізоване або химерне антитіло 306, яке специфічно зв'язується з тау людини, причому 306 являє собою антитіло миші, яке характеризується зрілою варіабельною областю важкого ланцюга згідно з БЕО ІЮО МО: 7 і зрілою варіабельною областю легкого ланцюга згідно з 5ЕО ІЮ МО: 11. Деякі такі антитіла являють собою гуманізоване

Зо антитіло, що містить гуманізовану зрілу варіабельну область важкого ланцюга, яка містить три

СОВА важкого ланцюга 306, і гуманізовану зрілу варіабельну область легкого ланцюга, яка містить три СОВ легкого ланцюга 306. У деяких таких антитілах СОВ відповідають визначенню, яке вибране з групи, що складається з визначень згідно з Кеботом, Чотіа, зведеним визначенням Кебота/Чотіа, АБМ і контактним визначенням.

У деяких таких антитілах гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОВ важкого ланцюга 306 згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (5ЕО ІО МО: 8-10), і гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОВ легкого ланцюга 306 згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (5ЕО ІО МО: 12-14).

У деяких таких антитілах гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОВ важкого ланцюга 306 згідно з Кеботом (5ЕО ІЮ МО: 32, ХЕОІЮО МО: 9 і 5ЕО ІЮ МО: 10), і гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОВА легкого ланцюга 306 згідно з Кеботом (ЗЕО ІЮ МО: 12-14).

У деяких таких антитілах гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОВ важкого ланцюга 306 згідно з Чотіа (ЗЕО ІЮО МО: 33, 5ЕО ІЮО МО: 34 ї БЕО ІЮ МО: 10), ї гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОВ легкого ланцюга 306 згідно з Чотіа (ЗЕО І МО: 12-14).

У деяких таких антитілах гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОВ важкого ланцюга 306 згідно з АВМ (ЗЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 351 5ЕО ІЮ МО: 10),, гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОВ легкого ланцюга 306

БО згідно з АБМ (ЗЕО ІЮ МО: 12-14).

У деяких таких антитілах гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОВА важкого ланцюга 306 згідно з контактним визначенням (5ЕО І МО: 39-41), і гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОВ легкого ланцюга 306 згідно з контактним визначенням (5ЕО 10 МО: 36-38).

У деяких антитілах гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9095 ідентична будь-якій з ФЕО ІО МО: 15-19 і

ЗЕБЕО І МО: 46-57, і гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9095 ідентична будь-якій з 5ЕО ІО МО: 20-23, за винятком того, що положення НІ7 може являти собою Т або 5, і положення Н2О може являти бо собою І або У.

У деяких таких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НЗ8 займає НП, і НОЗ займає 5. У деяких таких антитілах положення

НЗ8В і НОЗ в області МН займають НК і 5, відповідно.

У деяких таких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НЗ8З займає НВ, Н4іЗ займає О, Н83 займає Т, і НУОЗ займає 5. У деяких таких антитілах положення НЗ8, Н4іЗ, Н83 та НОЗ в області МН займають В, О, Ті 5, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ12 займає У, Н24 займає А, Н4і8 займає І, Нб7 займає А, НВО займає І, Н81 займає ОС, і НО1 займає Е. У деяких антитілах положення НІ12, Н24, Н4ів8, Нб?7,

НВО, НВ і НО1 в області МН займають М, А, І, А, І, О і Е, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ1З займає НП, і Нбб займає К. У деяких антитілах положення НІ1З і

Нбе в області МН займають В і К, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н40 займає ВН, і Нв2а займає С. У деяких антитілах положення Н40 і Нв2а в області МН займають В і С, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н42 займає Е, і Н7б займає М. У деяких антитілах положення На42 і

Н?7ІвЄ в області МН займають Е і М, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н4і0 займає В, Н8в2а займає С, і Н8ЗЗ займає Т. У деяких антитілах положення Н40, Н8а2а і Н8ЗЗ в області МН займають В, С і Т, відповідно.

У деяких антитілах положення НІ1І2 в області МН займає У.

У деяких антитілах положення НВО в області МН займає Ї.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А, Н4і8 займає І, Нб7 займає А, НВО займає І, і НеО1 займає Е. У деяких антитілах положення Н24, Н4і8, Нб7, НВО і НО! в області МН займають А, І, А,

І ї Е, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н4іЗ займає ОС), і Н8В1 займає 0). У деяких антитілах положення НаЗ і

НВ! в області МН займають 0О і СО), відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А, і НО1 займає Е. У деяких антитілах положення НаІ2аА і

НО! в області МН займають А і Е, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІЗ займає ВН, НІ7 займає І, Н2г9 займає Е, Н4аг2 займає Е, Н4іЗ займає О, Нбі1 займає Е, Н7б займає М, НВО займає І, НВІ займає О. У деяких антитілах положення НІ13, НІ17, Н2г9, Н42, Н4З, НЄ, Н7б, НВО і Н81 в області МН займають В, І, Е, Е, О, Е,

М, І. ї СО, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А, Н28 займає Т, Н4і8 займає І, Н54 займає 0, НбО займає А, Нб7 займає А, НВО займає І, і НО1 займає КЕ. У деяких антитілах положення Н24, Н28,

Н4ів8, Н54, НбО, Не?7, НВО і НО1 в області МН займають А, Т, І, 0, А, А, І. і Е, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІО займає О, НІ7 займає І, Н24 займає А, Н28 займає Т, Н4і4З займає С, Н4і8 займає І, НбО займає А, Нб1 займає Е, НО1 займає Е, НІ108 займає Т, і Н109 займає Ї. У деяких антитілах положення НІ0, Н17, Н2г4, Н2г8, Н4і3, Н4ів8, НбО, Не, НеО1, НІОв і

НІ09 в області МН займають О,Ї, А, Т, ОО, І, А, Е, Е, Т ії, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ7 займає І, Н27 займає У, Н29 займає БЕ, і Нб1 займає Е. У деяких антитілах положення Н17, Н27, Н29 і НбО1 в області МН займають І, М, Е і Е, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н17 займає І, Н27 займає У, Н29 займає Е, Нб1 займає Е, Н7б займає М, і Нв2а займає 2. У деяких антитілах положення НІ17, Н27, Н2г9, НОТ, Н7б6 і Н8вга в області МН займають І, М, Е, Е, М і С, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н12 займає У, НІ17 займає І, Н24 займає А, Н4З займає О, Н4і8 займає І, Н8ВЗ займає Т, і НО1 займає РЕ. У деяких антитілах положення Н12, Н17, Н24, Н4Зз, На48, 60 Н8ЗЗ і НО1 в області УН займають М, І, А, О, І, Т, Е, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ12 займає У, Н24 займає А, Н4і8 займає І, Нб7 займає А, НВО займає І, Н83З займає Т, і НО1 займає РЕ. У деяких антитілах положення Н1І2, Н2г4, Н4в8, Нб?7, НВО,

Н8ЗЗ і НО1 в області УН займають М, А, І, А, ГІ, Т і Е, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ10 займає Е або 0, НІ12 займає К або У, НІ13 займає К або В, НІ? займає Т, І або 5, Н24 займає М або А, Н27 займає Е або У, Н28 займає М або Т, Н29 займає І або Е, НЗО займає К або Т, НЗ8 займає О або Н, Н40 займає А або В, Н42 займає С або Е, Н4З займає К або О, Н4і8 займає М або І, Н51 займає М або І, Н5З4 займає М або 0, НбО займає 0 або А, Нб1 займає Р або Е, Нбб займає В або К, Нб? займає М або А, Н7б займає 0 або М, НВО займає М або І, Н8В1 займає Е або О, Н8в2а займає 5 або С, Н8В3 займає Т або ЕН, НО1 займає У або Е, НОЗ займає А або 5, НІ102 займає Е або У, НІ108 займає Т або І, НІ109 займає Г! або У. У деяких антитілах положення Н1І2, НІ 3, НІ 7, Н24, НЗ8, Н42, Н4іЗ, Нав, Нбб, Нб7, Н7б, НВО, На1,

Н8ВЗ, НОТ і НОЗ в області МН займають М, Щ, І, А, В, Е, О,І,К, А, М, ГІ, О, Т, Е і 5, відповідно.

У деяких антитілах положення НЗ8, Н4і2, Н43, Н7б, Н8ЗЗ і НОЗ в області МН займають НВ, Е, О,

М, Т ії Є, відповідно. У деяких антитілах положення НІ1І2, НІ13, НІ17, Н24, НЗ8, Н4б, Н42, Н4ІЗ, Н48,

Нбвб, Не7, Н7б, НВО, НВ, Н82А, Н8З3, НОТ і НОЗ в області МН займають М, ПВ, І, А, В, В, Е, О, І, К,

А, М, ГГ, 0, С, Т, Е ії 5, відповідно. У деяких антитілах положення Н12, Н24, НЗ8, Н40, Н4З, На48,

Нб7, НВО, НВ, Н82А, Н8З3, НОЇ і НОЗ в області МН займають М, А, Б, Б, 0, І, А, 1,0, С, Т, Еї5, відповідно. У деяких антитілах положення Н12, Н24, Н28, НЗ8, Н4О, Н4З, Нав, Н54, НбО, Нб7,

НВО, НВ, Н82А, НЗ3, НОТ і НОЗ в області МН займають М, А, Т, В, НК, 00,1, 0, А, А, 1,00, 0, Т, Е і 5, відповідно.

У деяких антитілах положення НІ12, Н24, Н2г8, НЗ8, Н40, Н4ів8в, Н51, Н5б4, НбО, Нб7, НВО,

Н82А, Н8З3, НОТ і НОЗ в області УН займають М, А, Т, В, В, І, М, 0, А, А, ГЇ, С, Т, Е і 5, відповідно.

У деяких антитілах положення НІ12, Н2г4, Н2г8, НЗ8, Н40, Н4і8, Н54, НбО, Нб7, НВО, Н8В2А, Н8ЗВ3,

НО! ї НУОЗ в області МН займають МУ, А, Т, В, В, І, 0, А, А, І, С, Т, Е ї 5, відповідно. У деяких антитілах положення НІ 3, НІ17, Н24, Н2г9, НЗ8, Н40, Н42, Н4З, Н5Я4, Не, Н7б, НВО, НВ, Н82А,

Н8ВЗ, НОТ і НОЗ в області МН займають В, І, А, Е, В, В, Е, О, М, Е, М, І, О, С, Т, Е і 5, відповідно.

У деяких антитілах положення Н13, Н17, Н24, Н2г7, Н2г8, Н2г9, НЗО, НЗ8, На, Н42, На4ІЗ, НУО,

Ко) Н5Ба4, НбО, НЄ, Н7б, НВО, НОВІ, Н82А, Н8З3, НО і НОЗ в області МН займають НВ, ГІ, А, М, Т, Е, Т, В,

В,Е,О,М,0, А, Е, М, І, 0, С, Т, Е і 5, відповідно. У деяких антитілах положення НІ0, Н12, Н17,

Н2г4, Н2г8, НЗ8, Н4О, Н42, Н4З, Нав, Н5Я4, НбО, Не, Н7б, НВО, Н82А, На83, НО, НОЗ, Н108 ії НІ109 в області МН займають ОЮ, М, І, А, Т, В, Щ,Е, О.І, М, А, Е, М, ГІ, С, Т, Е, 5, Т ії, відповідно. У деяких антитілах положення НІ1О, Н12, Н17, Н24, Н2г8, НЗ8, Н4іб, Н4іЗ, Н4і8, Н51, Н54, НбО, Не,

Н8г2А, НЗ83, НОТ, НОЗ, НІ102, НІ108 і НІ109 в області МН займають О, М, 1, А, Т, В, А, 0, І, М, 0, А,

Е, С, Т, Е, 5, М, Т ії, відповідно.

У деяких антитілах положення НЗ8 і НОЗ в області МН займають В і 5, відповідно. У деяких антитілах положення НІ17, Н27, Н2г9, НЗ8, НЄ1, Н7б, Н8В2А і НОЗ в області УН займають І, М, Е,

В, Е, М, а ії 5, відповідно. У деяких антитілах положення Н17, Н27, Н2г8, Н2г9, НЗО, НЗ8, Н5О1,

Н5Б4, НбО, НОТ, Н7б, Н82А і НОЗ в області МН займають І, М, Т, Е, Т, В,М, 0, А, Е, М, С і 5, відповідно.

У деяких антитілах положення НІ12, НЗ8, Н40, Н4а8, Нбб, Нб7, Н7б6, НВО, Н82А, Н8ВЗ і НОЗ в області МН займають У, В, В, І, К, А, М, І, С, Т і 5, відповідно.

У деяких антитілах положення НІ12, НІ17, Н2г7, Н2г9, НЗ8, Н4аб, НЄ, НВО, Н8В2А, НВ ї НОЗ в області МН займають М, І, М, Е, В, Б, Е, ГІ, с, Т ії 5, відповідно. У деяких антитілах положення

НІ12, НІ17, Н27, Н2г8, Н2г9, НЗО, НЗ8, НІ, Н51, Н5Я4, НбО, НОЇ, НВО, Н8З2А, НВ і НОЗ в області УН займають М, І, М, Т, Е, Т, В, Щ,М,0, А, Е, І, с, Т і 5, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МІ займає амінокислота, як зазначено: І 36 займає І, І 37 займає Ї, і 1100 займає 2. У деяких антитілах

БО положення І З36,137 11100 в області МІ займають |, І і С, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МІ займає амінокислота, як зазначено: І 12 займає 5, і І 45 займає К. У деяких антитілах положення | 12 і 45 в області МІ займають 5 і К, відповідно.

У деяких антитілах щонайменше одне з наступних положень в області МІ займає амінокислота, як зазначено: І 2 являє собою У або І, І 7 являє собою 5 або Т, 112 являє собою Р або 5, 115 являє собою | або І, І 36 являє собою |, І 37 являє собою І, І 45 являє собою В або

К, І 60 являє собою 0 або 5, І 100 являє собою а. 00471 У деяких антитілах положення І 12,136,137,1451 1100 в області МІ займають 5, І, І,

К ї С, відповідно. У деяких антитілах положення І 36,137 11100 в області МІ займають І, і с, 60 відповідно. У деяких антитілах положення І 36,137,16011100 в області МІ займають І, 1,51,

відповідно. У деяких антитілах положення І2,17,112,115,136,137,14511100 в області МІ. займають І, Т, 5, І, І, К ї С, відповідно. У деяких антитілах положення І2,17,112,115, 1 36,

Ї37,14511100 в області МІ займають М, 5, Р, І, І, ГІ, В їі С, відповідно.

Деякі антитіла містять зрілу варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична будь-якій з 560 10 МО: 15-19, 46-57, і зрілу варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична будь-якій з «ЕО 10 МО: 20-23, за винятком того, що положення

НІ? може являти собою Т або 5, і положення Н2О може являти собою І або У. Деякі антитіла містять зрілу варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 98 95 ідентична будь-якій з БЕО ІЮ МО: 15-19, 46-57, і зрілу варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 98 95 ідентична будь-якій з 5ЕО ІО МО: 20-23, за винятком того, що положення НІ7 може являти собою Т або 5, і положення Н2гО може являти собою | абом.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність будь-якої з 5ЕО ІО МО: 15-19 ї 5ЕО ІО МО: 46-57, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮО МО: 20-23. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО

ІО МО: 15, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 15, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕСО ІО МО: 15, їі зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕСО ІЮО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 15, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 16, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область

Зо важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 16, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність БЕО

ІО МО: 16, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 16, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 17, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 17, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 17, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 17, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 18, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 18, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 18, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО І МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 18, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 19, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область 60 важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 19, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 19, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 19, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 46, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: 46, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність БЕО

ІО МО: 46, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 46, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 47, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 47, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 47, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 47, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 48, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область

Зо важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 48, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 48, їі зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 48, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 49, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО: 49, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 49, їі зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 49, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 50, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 50, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 50, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 50, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 51, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область 60 важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 51, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність БЕО

ІО МО: 51, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 51, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 52, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 52, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 52, ії зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 52, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 53, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 53, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 53, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 53, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 54, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область

Зо важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 54, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 54, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 54, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 55, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 55, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність БЕО

ІО МО: 55, ї зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО: 55, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 56, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 56, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 56, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 56, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО 10 МО: 57, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 20. У деяких антитілах зріла варіабельна область 60 важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 57, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 21. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЕС

ІО МО: 57, їі зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність

ЗЕБЕО ІО МО: 22. У деяких антитілах зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 57, і зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ФЕО ІЮО МО: 23.

Наприклад, антитіло може являти собою химерне антитіло. Наприклад, антитіло може являти собою веноване антитіло.

Антитіло може являти собою інтактне антитіло миші, химерне, веноване або гуманізоване антитіло або зв'язуючий фрагмент, одноланцюжковий Рар-фрагмент антитіла, Гар'?-фрагмент або одноланцюжковий Ем. Деякі з антитіл відносяться до ізотипу ЇДСІ людини, тоді як інші можуть відноситися до ізотипу ІД22 або Ідс4 людини. Деякі антитіла містять зрілу варіабельну область легкого ланцюга, що злита з константною областю легкого ланцюга, і зрілу варіабельну область важкого ланцюга, що злита з константною областю важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга деяких антитіл являє собою мутантну форму природної константної області важкого ланцюга людини, яка характеризується зниженим зв'язуванням з рецептором

Еєу у порівнянні з природною константною областю важкого ланцюга людини.

Деякі антитіла можуть містити щонайменше одну мутацію в константній області, таку як мутація, яка знижує фіксацію або активацію комплементу константною областю, наприклад, мутацію в одному або декількох з положень 241, 264, 265, 270, 296, 297, 318, 320, 322, 329 і 331 згідно з нумерацією Є. Деякі антитіла містять аланін у положеннях 318, 320 і 322. Деякі антитіла можуть бути щонайменше на 9595 мас/мас, чистими. Антитіло може бути кон'юговане з терапевтичним, цитотоксичним, цитостатичним, нейротрофічним або нейропротекторним засобом.

Згідно з іншим аспектом у даному винаході запропонована фармацевтична композиція, що містить будь-яке з антитіл, які розкриті у даному документі, і фармацевтично прийнятний носій.

Згідно з іншим аспектом у даному винаході запропонована нуклеїнова кислота, що кодує важкий ланцюг і/або легкий ланцюг будь-якого з антитіл, які розкриті у даному документі, рекомбінантний вектор експресії, що містить нуклеїнову кислоту, та клітина-хазяїн, яка

Зо трансформована рекомбінантним вектором експресії.

Згідно з ще одним аспектом у даному винаході запропоновані способи гуманізації будь-якого антитіла, яке відмінне від антитіла людини, що описане у даному документі, наприклад, антитіла 306 миші, причому 306 характеризується зрілою варіабельною областю важкого ланцюга згідно з ФЕО ІО МО: 7 і зрілою варіабельною областю легкого ланцюга згідно з 5ЕО ІЮ

МО: 11. Такі способи можуть включати в себе відбір одного або декількох акцепторних антитіл, синтез нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований важкий ланцюг, що містить СОВА важкого ланцюга миші, та нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований легкий ланцюг, що містить СОВА легкого ланцюга антитіла миші, й експресію нуклеїнових кислот у клітині-хазяїні для одержання гуманізованого антитіла.

Також запропоновані способи одержання антитіл, таких як гуманізоване, химерне або веноване антитіло, наприклад, гуманізована, химерна або венована форми 306. У таких способах клітини, що трансформовані нуклеїновими кислотами, які кодують важкий та легкий ланцюги антитіла, культивують так, щоб клітини секретували антитіло. Потім антитіло можна очистити з середовища для культури клітин.

Лінії клітин, що продукують будь-яке з антитіл, які розкриті у даному документі, можна одержати за допомогою введення у клітини вектора, що кодує важкий та легкий ланцюги антитіла, та маркера, що селектується, розмноження клітин в умовах для відбору клітин, що містять збільшену кількість копій вектора, виділення одиничних клітин з відібраних клітин; і створення банку клітин, що клоновані з одиничної клітини, яка відібрана на основі виходу антитіла.

Деякі клітини можна розмножити в селективних умовах і провести скринінг відносно ліній клітин, що природним чином експресують та секретують щонайменше 100 мг/л /109 клітин/24 години. З відібраних клітин можна виділити одиничні клітини. Потім клітини, що клоновані з одиничної клітини, можна використовувати для створення банку клітин. Одиничні клітини можна відібрати в залежності від бажаних властивостей, таких як вихід антитіла. Ілюстративні лінії клітин являють собою лінії клітин, що експресують 306.

У даному винаході також запропоновані способи інгібування або зниження агрегації тау в суб'єкта, який страждає від опосередкованого тау амілоїдозу або підданий ризику розвитку опосередкованого тау амілоїдозу, причому зазначені способи включають в себе введення бо суб'єкту ефективного режиму антитіла, що розкритий у даному документі, та за допомогою цього інгібування або зниження агрегації тау в суб'єкта. Ілюстративні антитіла включають гуманізовані версії 306.

Також запропоновані способи лікування або здійснення профілактики захворювання, що викликане тау, в суб'єкта, причому зазначені способи включають в себе введення ефективного режиму антитіла, що розкрите у даному документі, та за допомогою цього лікування або здійснення профілактики захворювання. Прикладами такого захворювання є хвороба

Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинна вікова таупатія, постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматична деменція або деменція боксерів, хвороба

Піка, хвороба Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скронева деменція, лобно- скронева лобарна дегенерація, хвороба аргірофільних зерен, глобулярна гліальна таупатія, аміотрофічний латеральний склероз/комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальна дегенерація (КБД), деменція з тільцям Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ему роду магіапі ої АІ27пєїтег дізеазе, ІВМАЮ) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП). У деяких способах захворювання, що викликане тау, являє собою хворобу Альцгеймера. У деяких способах пацієнт являє собою носія АроЕ4.

Також запропоновані способи зниження порушеної передачі тау, причому зазначені способи включають в себе введення ефективного режиму антитіла, що розкрите у даному документі, та за допомогою цього зниження передачі тау.

Також запропоновані способи індукції фагоцитозу тау, причому зазначені способи включають в себе введення ефективного режиму антитіла, що розкрите у даному документі, та за допомогою цього індукцію фагоцитозу тау.

Також запропоновані способи інгібування агрегації або накопичення тау, причому зазначені способи включають в себе введення ефективного режиму антитіла, що розкрите у даному документі, та за допомогою цього інгібування агрегації або накопичення тау.

Також запропоновані способи інгібування утворення клубків тау, причому зазначені способи включають в себе введення ефективного режиму антитіла, що розкрите у даному документі.

У даному винаході також запропонований спосіб виявлення відкладень тау-білка в суб'єкта, що страждає від або підданий ризику захворювання, яке пов'язане з агрегацією або накопиченням тау, причому зазначені способи включають в себе введення суб'єкту антитіла, що

Зо розкрите у даному документі, та виявлення антитіла, що зв'язалося з тау, в суб'єкта.

Прикладами такого захворювання є хвороба Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинна вікова таупатія, постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматична деменція або деменція боксерів, хвороба Піка, хвороба Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скронева деменція, лобно-скронева лобарна дегенерація, хвороба аргірофільних зерен, глобулярна гліальна таупатія, аміотрофічний латеральний склероз/ комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальна дегенерація (КБД), деменція з тільцями

Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ІВМАО) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП). Згідно з деякими варіантами реалізації антитіло вводять в організм суб'єкта за допомогою внутрішньовенної ін'єкції. Згідно з деякими варіантами реалізації антитіло вводять безпосередньо у головний мозок суб'єкта за допомогою внутрішньочерепної ін'єкції або за допомогою свердління отвору в черепі суб'єкта. Згідно з деякими варіантами реалізації антитіло є міченим. Згідно з деякими варіантами реалізації антитіло є міченим флюоресцентною міткою, парамагнітною міткою або радіоактивною міткою. Згідно з деякими варіантами реалізації радіоактивну мітку виявляють із застосуванням позитрон-емісійної томографії (ПЕТ) або однофотонної емісійної комп'ютерної томографії (ОФЕКТ).

У даному винаході також запропонований спосіб вимірювання ефективності лікування в суб'єкта, який отримує лікування захворювання, що пов'язане з агрегацією або накопиченням тау, причому зазначений спосіб включає в себе вимірювання першого рівня відкладень тау- білка в суб'єкта до лікування за допомогою введення суб'єкту антитіла, що розкрите у даному документі, та виявлення першої кількості антитіла, що зв'язалося з тау, в суб'єкта, введення суб'єкту лікування, вимірювання другого рівня відкладень тау-білка в суб'єкта після лікування за допомогою введення суб'єкту антитіла, та виявлення антитіла, що зв'язалося з тау, в суб'єкта, причому зниження рівня відкладень тау-білка свідчить про позитивну відповідь на лікування.

У даному винаході також запропонований спосіб вимірювання ефективності лікування в суб'єкта, який отримує лікування захворювання, що пов'язане з агрегацією або накопиченням тау, причому зазначений спосіб включає в себе вимірювання першого рівня відкладень тау- білка в суб'єкта до лікування за допомогою введення суб'єкту антитіла, що суб'єкта, введення суб'єкту лікування, вимірювання другого рівня відкладень тау-білка в суб'єкта після лікування за допомогою введення суб'єкту антитіла, та виявлення другої кількості антитіла, що зв'язалося з тау, в суб'єкта, причому відсутність зміни рівня відкладень тау-білка або незначне збільшення відкладень тау-білка свідчить про позитивну відповідь на лікування.

КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ

На фігурі 1 представлені результати експериментів, що сплановані для картування епітопу або епітопів, з якими зв'язується моноклональне антитіло 306 миші.

На фігурі 2 представлене вирівнювання варіабельних областей важкого ланцюга антитіла 306 миші та гуманізованих версій антитіла 306 (МНм!, МНм2, МНмМ1р, МНмМ1БАТ1 і МНуб5).

Консенсусна амінокислотна послідовність у варіабельних областях важкого ланцюга антитіла 306 миші та гуманізованих версіях антитіла 306 (МНмі, МНм2, МНм1р, МНМ1рАт1 ї МНм5) відмічена «Більшість». СОВ згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа представлені жирним шрифтом. Положення у варіабельних областях важкого ланцюга антитіла 306 миші й у гуманізованих версіях антитіла 306 (МНм1, МНм2, МНм1р, МНМ1рАТ11 ї МНм5), в яких залишки амінокислот відрізняються від послідовності "Більшість", заключені в рамку.

На фігурі З представлене вирівнювання варіабельних областей легкого ланцюга антитіла 306 миші та гуманізованих версій антитіла 306. Консенсусна амінокислотна послідовність між варіабельними областями легкого ланцюга антитіла 306 миші та відібраними гуманізованими антитілами 306 відмічена "Більшість". СОВ згідно з визначенням Кебота представлені жирним шрифтом. Положення у варіабельних областях легкого ланцюга антитіла 306 миші й у гуманізованих версіях антитіла 306, в яких залишки амінокислот відрізняються від послідовності "Більшість", заключенні в рамку.

На фігурах 4А і 48 представлено вирівнювання варіабельних областей важкого ланцюга антитіла 306 миші та гуманізованих версій антитіла 306 (МНм!, МНмМ1р6, МНМІБАЇ 1,

МНУТВБАТ18602, МНУТБАІЇ 186НЗ, УМНміс, МНута, МНмїє, МНмії, МНм2, МНуЗ3, МНуЗр, МНуЗс,

МУНу4, УНм4б, УНуас і УНу5). Консенсусна амінокислотна послідовність у варіабельних областях важкого ланцюга гуманізованих версій антитіла 306 (МНм1!, МНм1б, МНУТрАТ11, МНУТБАЇ 18622,

МНМУТБАТ 156НЗ, МНм'іс, МНм1д9, МНуте, МНМІТ, УНм2, УНуЗ, УНуЗб, УНиузс, УНм4, УНуа4аб, УНудс і

МНу5) відмічена "Більшість". СОВА згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа представлені жирним шрифтом. Положення у варіабельних областях важкого ланцюга гуманізованих версій антитіла 306 (МНм1, МНМтТЬ, МНУТрАТ1, МНУТБАЇ 18622, УНУТЬАЇ 186НЗ, УНміс, УНУТа, МНуте,

УНМмІ, МНм2, МНуЗ3, МНуЗЬ, МНузЗс, МНм4, МНу4р, МНу4с і УНу5), в яких залишки амінокислот відрізняються від послідовності «Більшість», заключені в рамку.

На фігурах 5А, 5В і 5С представлені результати скринінгових аналізів ЕГ ІА відібраних моноклональних антитіл миші проти тау.

На фігурі 6 представлена кінетика зв'язування відібраних моноклональних антитіл миші проти тау з рекомбінантним тау людини.

На фігурі 7 представлені результати функціональних блокуючих аналізів відібраних моноклональних антитіл миші проти тау.

На фігурі 8 представлені результати аналізів дезагрегації відібраних моноклональних антитіл миші проти тау.

На фігурі 9 представлені результати експериментів, які демонструють, що 306 і 5С28 імунним способом захоплюють тау з тканини, яка уражена хворобою Альцгеймера людини.

На фігурах 10А, 108 ї 10С представлені результати експериментів, що демонструють афінність гуманізованих варіантів 306 у відношенні тау.

КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

У ЗЕО ІО МО: 1 представлена амінокислотна послідовність ізоформи тау людини (бу/із5-Ргої

РІ1О6З36-8).

У ЗЕО І МО: 2 представлена амінокислотна послідовність ізоформи тау людини (бу/із5-Ргої

РІ1О636-7).

У ЗЕО І МО: З представлена амінокислотна послідовність ізоформи тау людини (бу/із5-Ргої

Р10636-6) (тау людини 4НОМ).

У ЗЕО І МО: 4 представлена амінокислотна послідовність ізоформи тау людини (бу/із5-Ргої

Р1О636-5).

У ЗЕО І МО: 5 представлена амінокислотна послідовність ізоформи тау людини (бу/із5-Ргої

Р1О636-4).

У ЗЕО І МО: 6 представлена амінокислотна послідовність ізоформи тау людини (бу/із5-Ргої

РІ1О6З6-2).

У 5ЕО ІО МО: 7 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга антитіла 306 миші.

У 5ЕО ІЮО МО: 8 представлена амінокислотна послідовність СОВ-НІ антитіла 306 миші 60 згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа.

У 5ЕО ІЮО МО: 9 представлена амінокислотна послідовність СОВ-Н2 антитіла 306 миші згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІО МО: 10 представлена амінокислотна послідовність СОВ-НЗ антитіла 306 миші згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІО МО: 11 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга антитіла 306 миші й антитіла бА10 миші.

У 5ЕО ІО МО: 12 представлена амінокислотна послідовність СОВ-І1 антитіла 306 миші й антитіла 6А10 миші згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІО МО: 13 представлена амінокислотна послідовність СОВ-1І2 антитіла 306 миші й антитіла бА10 миші згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІО МО: 14 представлена амінокислотна послідовність СОВ-І З антитіла 306 миші й антитіла 6А10 миші згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІЮО МО: 15 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзЗОбУНмІ1.

У 5ЕО ІО МО: 16 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбУНмаг.

У 5ЕО ІЮО МО: 17 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзЗОбУНм1р.

У 5ЕО ІЮО МО: 18 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пизОбМНУТБАТ1.

У 5ЕО ІЮО МО: 19 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пизОбУНм5.

У 5ЕО ІО МО: 20 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбМі мі.

У 5ЕО ІО МО: 21 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пизОбМміІ ма.

У 5ЕО ІО МО: 22 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбМмІ м3.

У 5ЕО ІО МО: 23 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області легкого

Зо ланцюга гуманізованого антитіла 306 пизОбМіІ м4.

У 5ЕО ІЮО МО: 24 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга акцептора з облік. Мо ВАСО1986.1.

У 5ЕО І МО: 25 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга акцептора з облік. Мо ІМТ Ж ІСНМІ-69-2701.

У 5ЕО І МО: 26 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга акцептора з облік. Мо ІМСТ Я ІКТ 701.

У 5ЕО ІО МО: 27 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга акцептора з облік. Мо ІМСТ Я ІШКМ2-30702

У 5ЕО ІО МО: 28 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга акцептора з облік. Мо ІМТ Я ІКОг"О1.

У 5ЕО ІО МО: 29 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга акцептора з облік. Мо АА209048.1.

У ЗЕО ІЮ МО: 30 представлена послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну область важкого ланцюга антитіла 306 миші.

У ЗЕО ІЮ МО: 31 представлена послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну область легкого ланцюга антитіла 306 миші.

У 5ЕО ІО МО: 32 представлена амінокислотна послідовність СОВ-НІ антитіла 306 миші згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІО МО: 33 представлена амінокислотна послідовність СОВ-НІ антитіла 306 миші згідно з Чотіа.

У 5ЕО ІО МО: 34 представлена амінокислотна послідовність СОВ-Н2 антитіла 306 миші згідно з Чотіа.

У 5ЕО ІО МО: 35 представлена амінокислотна послідовність СОВ-Н2 антитіла 306 миші згідно з АБМ.

У 5ЕО ІЮО МО: 36 представлена амінокислотна послідовність СОВ-І 1 антитіла 306 миші згідно з контактним визначенням.

У 5ЕО ІО МО: 37 представлена амінокислотна послідовність СОВ-12 антитіла 306 миші згідно з контактним визначенням.

У 5ЕО ІЮО МО: 38 представлена амінокислотна послідовність СОВ-І З антитіла 306 миші бо згідно з контактним визначенням.

У 5ЕО ІО МО: 39 представлена амінокислотна послідовність СОВ-НІ антитіла 306 миші згідно з контактним визначенням.

У 5ЕО ІО МО: 40 представлена амінокислотна послідовність СОВ-Н2 антитіла 306 миші згідно з контактним визначенням.

У 5ЕО ІО МО: 41 представлена амінокислотна послідовність СОВ-НЗ антитіла 306 миші згідно з контактним визначенням.

У 5ЕО ІЮО МО: 42 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-НІ1 гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗзОбУНи5, пиЗзО0б6УНми1БАНВбИг, пиЗОбМНмУБАЇ 1вбнЗ, пизОбУНмте і пиЗОбМУНм17) згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа.

У 5ЕО І МО: 43 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-Н2 гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗзЗОбУНУ5 і пизОбУНУТБАНВВНУЗ) згідно з Кеботом.

У ЗЕО ІО МО: 44 представлена консенсусна амінокислотна послідовність варіабельних областей важкого ланцюга 306 миші та відібраних гуманізованих антитіл 306 (УНм1, УНм2г,

МНМІ16, МНМІрАЇ 1 їі МНу5) (відмічена "Більшість" на фігурі 2).

У ЗЕО І МО: 45 представлена консенсусна амінокислотна послідовність між варіабельними областями легкого ланцюга 306 миші та відібраними гуманізованими антитілами 306 (відмічена «Більшість» на фігурі 3).

У 5ЕО І МО: 46 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзЗОбУНУТЬАЇ 1862.

У 5ЕО ІЮО МО: 47 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пизОбМУНУтТрБАЇ 186Н3.

У 5ЕО І МО: 48 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбУНмІ1с.

У 5ЕО І МО: 49 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбУНУта.

У 5ЕО І МО: 50 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзЗОбУНмт1е.

У 5ЕО ІО МО: 51 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбУНмІ1ї.

Ко) У 5ЕО ІО МО: 52 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пизОбМУНУЗ.

У 5ЕО ІЮО МО: 53 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбУНуЗзр.

У 5ЕО ІЮО МО: 54 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбМНузЗс.

У 5ЕО ІОЮ МО: 55 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пизОбУНма.

У 5ЕО ІОЮ МО: 56 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пизОбУНмар.

У 5ЕО ІОЮ МО: 57 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга гуманізованого антитіла 306 пиЗзОбУНмас.

У 5ЕО ІЮ МО: 58 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-НІ1 гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗОбМУнНІСс) згідно із зведеним визначенням Кебота-

Чотіа.

У 5ЕО ІЮ МО: 59 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-НІ1 гуманізованого антитіла 306 (одержане з пизОбУНмута, пи3О06МНуизЗс ії пиЗзОб6МУНмуас) згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа.

У 5ЕО І МО: 60 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-НІ1 гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗОбМНУЗр і пиЗзОбМНмар) згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа.

У 5ЕО І МО: 61 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-Н2 гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗзЗОбУНмтБАЇ 186.2) згідно з Кеботом.

У 5ЕО І МО: 62 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-Н2 гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗзОбМУНміс, пиЗзОбУНуиЗЬ ї пизОбУНмаб) згідно з

Кеботом.

У 5ЕО ІЮО МО: 63 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-Н2 гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗОбУНмтТа, пизО6мМНмії, пизОб6МУНузс ії пизОбУНмуас) згідно з Кеботом.

У 5ЕО І МО: 64 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-Н2 бо гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗзОбУНмтїе) згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІЮ МО: 65 представлена амінокислотна послідовність альтернативного СОВ-НЗ гуманізованого антитіла 306 (одержане з пиЗзОбУНм1) згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІЮ МО: 66 представлена амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга антитіла 6А10 миші.

У 5БЕО ІО МО: 67 представлена амінокислотна послідовність СОВ-НІ антитіла бА10 миші згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа.

У 5БЕО ІО МО: 68 представлена амінокислотна послідовність СОВ-Н2 антитіла бА10 миші згідно з Кеботом.

У 5БЕО ІО МО: 69 представлена амінокислотна послідовність СОВ-НЗ антитіла бА10 миші згідно з Кеботом.

У 5ЕО ІО МО: 70 представлена амінокислотна послідовність області МН антитіла миші (код раб 1сС89), яку використовували як структурну матрицю для гуманізації важкого ланцюга.

У ЗЕО ІО МО: 71 представлена консенсусна амінокислотна послідовність варіабельних областей важкого ланцюга відібраних гуманізованих антитіл 306 (МНм1, МНм1р, УНУТЬБАТ1,

МНУТВБАТ18в6022, МНУТБАТ1В6НЗ, МНміс, МНута, МНмте, МНмії, МНм2, МНму3, МНУЗЬ, МНуЗс,

МНу4, УНма4б, УНуас і УНум5) (на фігурах 4А і 48 відмічена "Більшість").

У 5ЕО ІО МО: 72 представлена амінокислотна послідовність важкого ланцюга химерного антитіла 306.

У ЗЕО ІО МО: 73 представлена амінокислотна послідовність легкого ланцюга химерного антитіла 306.

ВИЗНАЧЕННЯ

Моноклональні антитіла або інші біологічні молекули, зазвичай, представлені у виділеній формі. Це означає, що антитіло або інша біологічна молекула, зазвичай, є щонайменше на 5095 мас/мас, чистими від інтерферуючих білків й інших забруднюючих речовин, що утворюються у процесі їх одержання або очищення, але не виключає можливості, що моноклональне антитіло об'єднане з надлишком фармацевтично прийнятного носія або носіїв або іншого наповнювача, що призначений для полегшення застосування антитіла. Іноді моноклональні антитіла є щонайменше на 6095, 7095, 8095, 90905, 9595 або 9995 мас/мас, чистими від інтерферуючих білків і забруднюючих речовин, що утворюються у процесі одержання або очищення. Часто виділене

Зо моноклональне антитіло або інша біологічна молекула є домінуючим макромолекулярним компонентом, що залишається після його очищення.

Специфічне зв'язування антитіла з його антигеном-мішенню означає афінність й/або авідність, що становить щонайменше 105, 107, 108, 109, 1019, 1011 або 1012 М". Специфічне зв'язування є виявленим більше високим за величиною та розрізняним від неспецифічного зв'язування, що виникає з щонайменше однією неспорідненою мішенню. Специфічне зв'язування може бути наслідком утворення зв'язків між конкретними функціональними групами або конкретним просторовим укладанням (наприклад, за типом замка та ключа), тоді як неспецифічне зв'язування зазвичай є наслідком вандерваальсових сил. Однак специфічне зв'язування не обов'язково передбачає, що антитіло зв'язується з однією та тільки однією мішенню.

Основною структурною одиницею антитіла є тетрамер субодиниць. Кожний тетрамер містить дві ідентичні пари поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара містить один «легкий» (приблизно 25 кДа) й один «важкий» ланцюг (приблизно 50-70 кДа). Амінокінцева частина кожного ланцюга містить варіабельну область з приблизно 100-110 або більше амінокислот, що відповідають, головним чином, за розпізнавання антигена. Дана варіабельна область від самого початку експресується зв'язаною з відщеплюваним сигнальним пептидом. Варіабельну область без сигнального пептиду іноді називають зрілою варіабельною областю. Таким чином, наприклад, зріла варіабельна область легкого ланцюга означає варіабельну область легкого ланцюга без сигнального пептиду легкого ланцюга. Карбоксикінцева частина кожного ланцюга визначає константну область, що відповідає, головним чином, за ефекторну функцію.

Легкі ланцюги класифікують на каппа або лямбда. Важкі ланцюги, які класифікують на гамма, мю, альфа, дельта або епсилон, визначають ізотип антитіла як да, І9М, ІдА, ІдО і ЧЕ, відповідно. В межах легких і важких ланцюгів варіабельні та константні області зв'язані «)«- областю, що складається з 12 або більше амінокислот, при цьому важкий ланцюг також містить «О»-область, що складається приблизно з 10 або більше амінокислот. (Див., у загальних рисах, керівництво Рипдатепіа! Іттипоіоду, Раш, МУ., єд., 2па ед. Вамеп Ргев5, М.У., 1989, Сп. 7 (повністю включене за допомогою посилання для всіх ланцюгів)).

Варіабельна область легкого або важкого ланцюга імуноглобуліну (яку також називають у даному документі "варіабельний домен легкого ланцюга" ("домен МІ") або "варіабельний домен 60 важкого ланцюга" ("домен МН"), відповідно) складається з "каркасної" ділянки (МГатемоїк, ЕВ),

яка перемежовується трьома "ділянками, що визначають компліментарністьї або "СОВ" (сотріетепіайу деїептіпіпод гедіопв). Каркасні ділянки служать для вирівнювання СОВ з метою специфічного зв'язування з епітопом антигена. СОВ містять залишки амінокислот антитіла, що відповідають, головним чином, за зв'язування з антигеном. Від амінокінця до карбоксикінця як домени МІ, так і домени МН містять наступні каркасні (ЕЕ) ділянки та ділянки СОВА: ЕВІ, СОН,

ЕН2г, СОВ2, ЕВЗ, СОВЗ і ЕВ4. СО 1, 2 ї З домену МІ також називають у даному документі, відповідно, СОВ-І1, СОВ-12 і СОВ-13; СОВ 1, 2 ї З домену МН також називають у даному документі, відповідно, СОВ-НІ, СОВ-Н2 ії СОВ-НЗ.

Розподіл амінокислот до кожного з доменів МІ ії МН відбувається згідно з будь-яким загальноприйнятим визначенням СОВА. Загальноприйняті визначення включають визначення

Кебота (Караї, бЗедиєпсев ої Ргоїєїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві (Маїййопа! Іпзійшев ої Неай,

Веїпезаа, МО, 1987 апа 1991), визначення Чотіа (Споїпіа є. І е5кК, у. Мої. ВЬ. 196: 901-917, 1987;

Споїпіа єї аї, Мате 342: 878-883, 1989); зведене визначення СОВ Чотіа та Кебота, в якому

СОВ-НІ являє собою зведене визначення СОН Чотіа та Кебота; визначення АЬМ, що використовується у програмному забезпеченні для молекулярного моделювання антитіл

Оксфордського університету; і контактне визначення згідно з Мапйіп еї аї (ріоіпто.огу.иКк/абвв) (див. таблицю 1). Визначення згідно з Кеботом забезпечує широко використовувану систему нумерації (нумерацію Кебота), в якій відповідним залишкам між різними важкими ланцюгами або між різними легкими ланцюгами привласнюють однаковий номер. Коли кажуть, що антитіло містить СОВ згідно з конкретним визначенням СОЯ (наприклад, Кебота), дане визначення вказує на мінімальну кількість залишків СОВ, що присутні в антитілі (тобто СОВА згідно з

Кеботом). Це не виключає того, що також присутні інші залишки, які потрапляють під інше загальноприйняте визначення СОВ, але за межами зазначеного визначення. Наприклад, антитіло, що містить СОВ, які визначені згідно з Кеботом, включає, серед інших можливостей, антитіло, в якому СОВ містять залишки СОВ згідно з Кеботом і не містять інші залишки СОН, і антитіло, в якому СОВ НІ являє собою СОН НІ згідно із зведеним визначенням Чотіа-Кебота, а інші СОВ містять залишки СОВ згідно з Кеботом і не містять додаткові залишки СОВ на основі інших визначень.

Таблиця 1

Загальноприйняті визначення СОР із застосуванням нумерації Кебота

Зведене Контактне

Петля Кебот Чотіа визначення АРМ

Чотіа та Кебота визначення «СОВ-НІ згідно з Чотіа може закінчуватися на НЗ2, НЗЗ або НЗА4 (в залежності від довжини петлі).

Зо Це обумовлене тим, що схема нумерації Кебота розміщує вставки додаткових залишків у

З5А і 358, тоді як нумерація Чотіа розміщує їх у З1А і З1В. Якщо ні НЗ5А, ні НЗ5ОВ (нумерація

Кебота) не присутні, петля СОВ-НІ Чотіа закінчується на НЗ2. Якщо присутнє тільки НЗ5БА, дана петля закінчується на НЗЗ3. Якщо присутні як НЗ5А, так і НЗ5В, дана петля закінчується на НЗ4.

Термін "антитіло" включає інтактні антитіла та фрагменти, що їх зв'язують. Зазвичай, фрагменти конкурують з інтактним антитілом, з якого вони були одержані, за специфічне зв'язування з мішенню, включаючи окремі важкі ланцюги, легкі ланцюги Рар, Раб", Кара,

Кабр)с, баб, нанотіла та Ем. Фрагменти можна одержати за допомогою методик рекомбінантної

ДНК або за допомогою ферментативного або хімічного розподілу інтактних імуноглобулінів.

Термін «антитіло» також включає біспецифічне антитіло та/або гуманізоване антитіло.

Біспецифічне або біфункціональне антитіло являє собою штучне гібридне антитіло, яке містить дві різні пари важкого/легкого ланцюгів і два різних зв'язуючих сайти (див., наприклад, публікації зЗопавімііаії апа І асптапп, Сіїп. Ехр. Іттипої, 79: 315-321 (1990); КовівіІпу еї аї, 9. Іттипої, 148: 1547-53 (1992)). У деяких біспецифічних антитілах дві різні пари важкого/легкого ланцюгів містять пару важкого ланцюга/ легкого ланцюга гуманізованого 306 і пару важкого ланцюга/ легкого ланцюга, що специфічна відносно відмінного епітопу на тау, ніж такий, з яким зв'язується 306.

У деяких біспецифічних антитілах одна пара важкого ланцюга/ легкого ланцюга являє собою гуманізоване антитіло 306, як більше детально розкрито нижче, а інша пара важкого ланцюга/ легкого ланцюга одержана з антитіла, яке зв'язується з рецептором, який експресований на гематоенцефалічному бар'єрі, таким як інсуліновий рецептор, рецептор інсуліноподібного фактора зростання (ІФ3), лептиновий рецептор або ліпопротеїновий рецептор, або трансфериновий рецептор (Егідеп еї аї, Ргос. Маї! Асад. сі. ОБА 88: 4771-4775, 1991; Егідеп еї аі, Зсієпсе 259: 373 -377, 1993). Таке біспецифічне антитіло може переноситися крізь гематоенцефалічний бар'єр в результаті рецептор-опосередкованого трансцитозу. Поглинання біспецифічного антитіла головним мозком можна додатково посилити за допомогою конструювання біспецифічного антитіла з метою зниження його афінності до рецептора гематоенцефалічного бар'єра. Знижена афінність до рецептора призводила до більше широкого розподілу в головному мозку (див., наприклад, публікації Аймаї єї аї, осі. Тгапв. Меа. 3, 84га43з, 2011; Ми єї а, Зсі. Ткапв. Мед. 3, в4га44,, 2011).

Ілюстративні біспецифічні антитіла можуть також являти собою: (1) антитіло з подвійним варіабельним доменом (дпиа!-магіабіе-дотаїп апіїбоду, ОМО-І9д), в якому кожний легкий ланцюг і важкий ланцюг містить два варіабельних домени в тандемі через короткий пептидний зв'язок (Ми еї а), Сепегайоп апа СНагасієгігайоп ої а Юа! Магаріє Оотаїп Іттиподіориїїп. (0МО-1Ід М)

Моїесшіє, Іп: Апіїбоду Епдіпеегіпуд, Зргіпдег Вепіп Неїдеїрегд (2010));; (2) Тапдар (тандемне антитіло), яке являє собою злиття двох одноланцюжкових діатіл з одержанням тетравалентного біспецифічного антитіла, що містить два зв'язуючих сайта для кожного з антигенів-мішеней; (3) антитіло Пехіроду, яке являє собою комбінацію 5сЕм з діатілом з одержанням мультивалентної молекули; (4) так звану молекулу, що одержана методом "замку на причалі" (аоскК апа Іоск"), на основі "домену димеризації та докінгу" у протеїнкіназі А, яка при застосуванні з Гар дозволяє одержати тривалентний біспецифічний зв'язуючий білок, що складається з двох ідентичних Еар- фрагментів, що приєднані до відмінного Рар-фрагмента; або (5) так звану молекулу Бсогріоп, що містить, наприклад, два 5сЕм, що злиті з обома кінцями Ес-області людини. Приклади

Зо платформ, що придатні для одержання біспецифічних антитіл, включають ВІТЕ (Місготеїй), рРАВТ (Масгосбіепісз), Есар і Мара (Е-віаг), Ро-сконструйований ІдасіІ (Хепсої) або ЮОшоВоду (на основі заміни плеча Раб, СептаБб).

Термін «епітоп» означає сайт на антигені, з яким зв'язується антитіло. Епітоп може бути утворений із суміжних амінокислот або несуміжних амінокислот, які зблизилися в результаті третинного фолдингу одного або декількох білків. Епітопи, що утворені суміжними амінокислотами (також відомі як лінійні епітопи), зазвичай, стійкі до впливу денатуруючих розчинників, у той час як епітопи, що утворені в результаті третинного фолдингу (також відомі як конформаційні епітопи), зазвичай руйнуються при обробці денатуруючими розчинниками.

Епітоп, зазвичай, містить щонайменше З або більше, частіше не менше 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Способи визначення просторової конформації епітопів включають, наприклад, рентгенівську кристалографію та двовимірний ядерний магнітний резонанс. Див., наприклад, керівництво Ерйоре Марріпуд Ргоїосої!5, іп Меїйпоа5 іп МоїІесшіаг

Віоіоду, Мої. 66, СПепп Е. Моттів, Еа. (1996).

Антитіла, які розпізнають однакові або епітопи, що перекриваються, можна ідентифікувати за допомогою звичайного імунного аналізу, що виявляє здатність одного антитіла конкурувати зі зв'язуванням іншого антитіла з антигеном-мішенню. Епітоп антитіла може бути також визначений за допомогою рентгенівської кристалографії антитіла, що зв'язане зі своїм антигеном, для ідентифікації контактних залишків. Як альтернатива, два антитіла націлені на один і той самий епітоп, якщо всі мутації амінокислот в антигені, які зменшують або усувають зв'язування одного антитіла, також зменшують або усувають зв'язування іншого антитіла. Два антитіла націлені на епітопи, що перекриваються, якщо мутації деяких амінокислот, які зменшують або усувають зв'язування одного антитіла, зменшують або усувають зв'язування іншого антитіла.

Конкуренцію між антитілами визначають за допомогою аналізу, в якому досліджуване антитіло інгібує специфічне зв'язування еталонного антитіла з відомим антигеном (див., наприклад, публікацію дипуднапе еї аі, Сапсег МВез. 50 1495, 1990). Досліджуване антитіло конкурує з еталонним антитілом, якщо надлишок досліджуваного антитіла (наприклад, щонайменше 2-кратний, 5-кратний, 10-кратний, 20-кратний або 100-кратний) інгібує зв'язування еталонного антитіла щонайменше на 5095 за результатами вимірювання в аналізі конкурентного бо зв'язування. Деякі досліджувані антитіла інгібують зв'язування еталонних антитіл щонайменше на 7595, 9095 або 9995. Антитіла, які ідентифіковані за допомогою конкурентного аналізу (конкуруючі антитіла), включають антитіла, що зв'язуються з тим самим епітопом, що й еталонне антитіло, й антитіла, що зв'язуються з суміжним епітопом, який розташований досить проксимально по відношенню до епітопу, з яким зв'язується еталонне антитіло, для виникнення стеричного бар'єра.

Термін "фармацевтично прийнятний" означає, що носій, розріджувач, допоміжна речовина або допоміжний засіб є сумісним з іншими компонентами складу та не є по суті шкідливим відносно його реципієнта.

Термін "пацієнт" включає людину або інших суб'єктів-ссавців, що отримують профілактичне або терапевтичне лікування.

Індивідуум підданий збільшеному ризику розвитку захворювання, якщо суб'єкт характеризується щонайменше одним відомим фактором ризику (наприклад, генетичний, біохімічний, сімейний анамнез і вплив ситуаційних факторів), який піддає індивідуумів з даним фактором ризику статистично значимому більшому ризику розвитку захворювання у порівнянні з індивідуумами без фактора ризику.

Термін "біологічний зразок" означає зразок біологічного матеріалу у біологічному джерелі або такий, що одержується з біологічного джерела, наприклад, людини або суб'єкта-ссавця. Такі зразки можуть являти собою органи, органели, тканини, зрізи тканин, рідини організму, периферичну кров, плазму крові, сироватку крові, клітини, молекули, такі як білки та пептиди, і будь-які частини або комбінації, що одержані із зазначених зразків. Термін «біологічний зразок» може також охоплювати будь-який матеріал, що одержаний в результаті обробки зразка.

Одержаний матеріал може включати клітини або їх потомство. Обробка біологічного зразка може включати одну або декілька операцій з фільтрації, дистиляції, екстракції, концентрування, фіксації, інактивації інтерферуючих речовин і т.п.

Термін «контрольний зразок» означає біологічний зразок, який, як відомо або як підозрюють, не містить області, що уражені захворюванням, яке викликане тау, або який щонайменше, як відомо або як підозрюють, не містить області даного типу, що уражені захворюванням.

Контрольні зразки можна одержати від індивідуумів, що не страждають від захворювання, яке викликане тау. Як альтернатива, контрольні зразки можна одержати від пацієнтів, що страждають від захворювання, яке викликане тау. Такі зразки можна одержати одночасно з біологічним зразком, що, як вважають, містить захворювання, яке викликане тау, або в інший раз. Біологічний зразок і контрольний зразок можна одержати з однієї тканини. Переважно, контрольні зразки складаються з по суті або повністю нормальних, здорових областей, та їх можна застосовувати при порівнянні з біологічним зразком, який, як вважають, містить області, що уражені захворюванням, що викликане тау. Переважно, тканина у контрольному зразку відноситься до того самого типу, що і тканина у біологічному зразку. Переважно, клітини, що уражені захворюванням, яке викликане тау, що, як вважають, знаходяться у біологічному зразку, виникають з того самого типу клітин (наприклад, нейронів або глії), що і тип клітин у контрольному зразку.

Термін «захворювання» означає будь-який аномальний стан, який порушує фізіологічну функцію. Термін використовується у широкому сенсі, щоб охопити будь-яке порушення, нездоров'я, аномалію, патологію, хворобу, стан або синдром, при якому порушена фізіологічна функція, незалежно від природи етіології.

Термін "симптом" відноситься до суб'єктивного прояву захворювання, такого як змінена хода, що сприймається суб'єктом. "Ознака" відноситься до об'єктивного прояву захворювання, що спостерігається лікарем.

Термін "позитивна відповідь на лікування" означає більше сприятливу відповідь в індивідуального пацієнта або середню відповідь у популяції пацієнтів у порівнянні із середньою відповіддю у контрольній популяції, що не отримує лікування.

З метою класифікації амінокислотних замін на консервативні або неконсервативні, амінокислоти згруповані наступним чином: Група І (гідрофобні бічні ланцюги): теї, аїа, маї, Ієи,

Пе; Група ІІ (нейтральні гідрофільні бічні ланцюги): суз, 5ег, Ійг; Група ІІ (кислі бічні ланцюги): азр, діи; Група ІМ (основні бічні ланцюги): азп, адіп, Нів, Іувє, агу; Група М (залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга): діу, рго; Група МІ (ароматичні бічні ланцюги): ігр, Тут, рпе. Консервативні заміни включають заміни між амінокислотами одного класу. Неконсервативні заміни являють собою заміни амінокислот одного класу на амінокислоти іншого класу.

Відсоток ідентичності послідовностей визначають за допомогою послідовностей антитіл, що максимально вирівняні з використанням системи нумерації Кебота. Після вирівнювання, якщо область антитіла, що представляє інтерес (наприклад, повну зрілу варіабельну область важкого бо або легкого ланцюга) порівнюють з тією самою областю еталонного антитіла, відсоток ідентичності послідовностей між областями того, що представляє інтерес, й еталонного антитіла являє собою кількість положень, що зайняті однаковими амінокислотами, в областях як того, що представляє інтерес, так й еталонного антитіла, яка розділена на загальну кількість вирівняних положень двох областей, без підрахунку розривів, що помножена на 100 для перетворення у відсотки.

Композиції або способи, «що містять» або «що включають» один або декілька зазначених елементів, можуть містити або включати інші елементи, які конкретно не зазначені. Наприклад, композиція, яка «містить» або «включає» антитіло, може містити антитіло саме по собі або в комбінації з іншими компонентами.

Зазначення діапазону значень включає всі цілі значення всередині або в межах зазначеного діапазону та всі піддіапазони, що визначені цілими значеннями всередині діапазону.

Якщо зворотне не є очевидним з контексту, термін «приблизно» охоплює несуттєві варіації, такі як значення в межах стандартної похибки (наприклад, СПС -стандартної помилки середнього) від встановленої величини.

Статистична значимість означає р:0,05.

Форми однини включають згадки об'єктів у множині, якщо контекст однозначно не диктує зворотне. Наприклад, термін «сполука» або «щонайменше одна сполука» може включати множину сполук, у тому числі їх суміші.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

І. Загальна частина

У даному винаході запропоновані антитіла, які зв'язуються з тау. Деякі антитіла специфічно зв'язуються з епітопом в межах залишків 199-213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, ФЕО ІЮ МО: 1). Деякі антитіла зв'язуються з тау незалежно від статусу фосфорилювання. Деякі антитіла згідно з даним винаходом виступають для інгібування або відтермінування патологій, що зв'язані з тау, і пов'язаних погіршень симптомів. Незважаючи на те, що для реалізації даного винаходу на практиці розуміння механізму не є необхідним, зниження токсичності може виникнути в результаті фагоцитозу тау, що індукований антитілом, інгібування між- або внутрішньомолекулярної агрегації тау або зв'язування з іншими молекулами, за допомогою стабілізації нетоксично! конформації, за

Зо допомогою інгібування міжклітинної або внутрішньоклітинної передачі патогенної форми тау, за допомогою блокади фосфорилювання тау, за допомогою запобігання зв'язування тау з клітинами або за допомогою індукції протеолітичного розщеплення тау, крім інших механізмів.

Антитіла згідно з даним винаходом або засоби, які індукують такі антитіла, можна застосовувати в способах лікування або здійснення профілактики хвороби Альцгеймера й інших захворювань, що пов'язані з тау.

ІЇ. Молекули-мішені

Якщо з контексту не очевидно зворотне, зазначення на тау означає природну форму тау людини, включаючи всі ізоформи, незалежно від того, чи присутня посттрансляційна модифікація (наприклад, фосфорилювання, глікування або ацетилювання). Існує шість основних ізоформ (сплайс-варіантів) тау, що утворюються у головному мозку людини.

Найдовший з даних варіантів містить 441 амінокислоту, і в ньому відщеплений початковий залишок теї. Залишки нумерують відповідно до ізоформи 441. Таким чином, наприклад, згадка фосфорилювання у положенні 404 означає положення 404 ізоформи 441 або відповідне положення будь-якої іншої ізоформи при максимальному вирівнюванні з ізоформою 441.

Амінокислотні послідовності ізоформ і номери бази даних бу/із5-Ргої зазначені нижче.

візова (5ЕО ЇБ МО:

ІЙ 20 Ва з Бо «б

МАХРАОЕТЕУ МЕПНАСЕИСЇ пОВКрОпОУТ МиОрОБОПТО до КЕВЕ ОТ СТЕООБЕКВО 7а во за 325 1 ї2о

ВЕТЕПАКИТЕ ТОЕБУКАРІУ ОБСАРСКОЛА ДОВЕТЕТРЕС ТТАЕКАСІСО ТРЕБЕОЕЛАД

1 узо 150 ї65 У 165

НУТОДеМИК ВКОСТСЗОСК КАКОВОСКТК ТАТВАЕАВЕ СООМООАМАТЕ ХРАКРТРРАВЕ 135 209 215 з2а 235 319 теРассЕРРК шопвЕстдав серотроВдя ВТРІБРТретТ ДЕРЕКЕУАМУВ ТРРЕЄВЕЗАХ 25о 260 й а 230 оо

ЗВІСОТАРУВИ РООКМУКИКО ОБТЕМЕКНОР пОсИУСІВМК КІбіЗаУОоЗи сСоЗКОМІКВУ 319 320 335 349 350 зжо

РОСОДУЄСТУХ КРУБЕВКУТО. КОСЯБОМІНН КРОЧООУКУК ЯЕКОВЕКОНМ ОБКІЧВЦОМІ

Зо зво зо «о «10 320

ТНУРОССМИК ХЕТНЕОТЕВЕ МАКАКТОНОВ БІУТКОВУМЕ СОТЕРЕНОВМ УЗЕТОВІШМУ

430 446

ОаАРОБАТОМО БУЗАВЕАНО В війшаєят (аКО ІД ОЩОСІ 1 о КВ) з Зо -х

МАБЕРВОСКЕКУ МЕПНАЮТИНИЬ СОБКО ІХТ МНОБОБОСТО ДЕРЖКИРООТ РТЕрОЕКЕРа 75 во Зо 165 10 120

ЕБТБОДКЕТЕ ТАКАЖЕКАСТЄ ПТРОБЕРЕДА СНУТОДеМУЮХ КОКООТОЗОЮ ККАКОСВОСКТ ї38 740 ІЗ ї5о 5 ї8о

ХІДТЕВСЛАР РООКОСАМАТ ВІРВКТРЕАВ КТРРЯЕЦЮЕР КЗОПеШОЖВИ РОПРОТРШВЕ 189 308 218 82 20: 540

ЗЕЖЕРІЬРТРе ТЕКРККУЖУМ ЕРРРКЕРядА КОНЬОТАВОВ МРПЖНУКОК ТПВТЕНІКНО ї5О 250 272 Іво ї8о зо рРоспиУОТІМ ККіОБаМУЄТ КОСИКОМІКН УБОПОУВТУ УХЕМІЬВКУТ ЗМКСОМІОМІН 319 зв за 348 355 ЗБ пКрРОСОбУВУ КЗЕКІОКЕОК УОБКІСНЬОМ ІТКУРОБОМК КІВТНКСТЕА ЕМАКАХТОНО зт зна з5а 407 8193

АкІУЖКЕРУУ ЗШОТШЕВНЬЯ МУВЕТОВІОМ ТОЕРОСАТИВ ПЕУВАНОАКО Ді:

Віпелее ітау людини ЗОМ ПЕС тб МО 12 2 З «о вв. «о

МАЖХРвОХВКУ МЕЙНДОЖеЬ ОПБКрОСОУТ МЕОООЖЕОТО ДОТКОЮКАНІ ООТРЗШЕИВА

У О зи шо МО йо доиттодяме НЕВКОСтОоВр рККАКОАроК ТКІАТРИОДА РЕСОДЄОАМНА ТВІВАКТВРА 130 ту 53 тво тт 180

ВктТЕЕОБОЕЕ ЕЕ ков вЕдСстВ шрРОБЕОТЕВЕ вх КІТ еТАКЕЕКУДи УКТЕВКЗВиЕ уча 20 КО 235 840 дкавІОотТавУу БМК МуУки ІОСТЕМШКН ОРПОЗКУОІї ШКРІПЛІВМИУС ЯКСОБКОМІЮ по 350 Зо зво 250 зпо вУБОбайусІ тТУКРОПЬЗКУ ТаКОСОдІОМІ ВЕКРОошерую УКоВЕООтТКо пусакІваро 319 зе з35 зо з50 зво

МІН с кктІшЕ ТНК ТК КБИДКВИТИН ЗАІМУКНЕУ МОСТА ВНІ МУ ВОМТ Є зт зва

МУПЕРОБАТЬ ДрЕУЖАНЬйК ОСЬ віпЕав-5 БО ЇМО) 19 хо зо 40 ВИ во

МАБЕВОКРЕУ МЕВКАСТУСЬ ОПАКООЧСИТ МНОГОВСОТО АОЬКСЯРІОТ ЕТЕОСВЕКРО

ТВ йо ЗО М не 128

ЗЕТЕОСАКВБТВ ТАЕБПУТАВЬМ БПЕСАБОКОВА АСЕНТВБІБЕС ТТАКБАОІООВ ТеБОЕПЕВАО 10 145 150 150 17о іно нУутодЕМмУвк ЗК ТОНООК КАКОАрОоКтТк ІАТРЕПВАБЕ СОКОСАМАТВ ІРАКТЕРАРК 180 05 дів 820 334 з4й

ТРЕЕОСЕРРК БОПАЕОСХБОЕ ЗБВЄТРОВКБ КТЕБМЕТЕРТ ВЕРЕЖУАУУК ТРЕРКЗЕОВЗАК

258 260 за 80 зав 300

ЗКіотавУвМ врОЕМукнкХІ саТЕМОКНОВ зсОоКУустТУухк вБУПЬБКУТаК Со оМІННК з10 зго 330 зай З80 0 зво воссеУвУкЕ КО КоКуУй ЗКІСЖІКІТ МУВЗСОМЕКІ ЕТВКОУТЕВЕМ АКАКТОНОДЕ

Зо зво за0 800 419

ЗЖЖКВЕМУТО ІРБЕЕНОБМУ МВ РОСЗТИМУБ РОСА ТЕАЛЕ МЕЖ ОБАКОС

Рі0йЕЗ3Б-Я СВО ІВ ОМО: 5) и 28 зо зо ЗЕ о

МАЖРЕСЕРЕМ МЕПНАСТХОІ СПЕКООСсЖТ МНОПОКООТО ВИПЖЕВВІКЕ ВТЖОИБЕР 7 чо Зо 100 мо 120 шВІБОДКІТЕ ТАБАЕБАЦІО ПТЕЕТКОБАЖ ОНУТОАВМУЗ КЗКАБОТОВОО «КАКСАТСКУ

Ко 150 150 о йо 48 кІАТРАшедр РОЛКООДМаАтТ ВІРДЕТВВАе КТРРаВОВи? КВООКВОТаВ БодротеоБЕ 1:50 29 216 220 830 90

ЗВТРЕСЕТРЕ ТЕЕРККУВУУ ВТРРЕВВЕВА КЕВІОТАРУР МРОІМУКЕМ ХОБ'КМКВО зво вя0 ато тво 250 зоб вЕссеаскуртУут Кер тТе ков сВІНв КРОЮ ЗЕБКООККИОКУ СБК 310 32 з3а 340 35о зве тТнУвобОоМКК ТЕТИКВІТККЕ МАКАКТОнНсСА БІУЖКЕРВУУВ (УРЗРЕВЬОМ УБОТОВТОМУ зт зва

ОІД аАТЬвИ КУйАЗБАЖО

Рі0АЗа-Я (ВЕО ІРР ОМО: ві 12 20 за 49 50 5

МАЕРВОКТЕМ МЕПНАСТУЦЬ ПОВКРООЧУТ МКОСОКООТО АСІКАЕКАСІ ЗОТРАСЕРЕА

7 во за 150 110 123

АСНУТОМЛЕМУ ВКЕКІХТОВО ПЕКАКСАРОК ТКІАТРВОЛА ВРООКОСАМА ТЕІРАКТВРА

130 14 НЕ 162 їто 180 еКТврЕБОоЖеЕ РЕБОБВЕОХЕ БЕОЕКБОТЕОВ дВКТРЕВЕТЕ РТВББЕККУАУ УЕРТЕрКЕРЕБ 135 205 310 222 218 240 вкКЕБІДЮТАРУ БМРЮБМНУКЕ КХшЄТЕМОКН Ого шКУЮІМ хр виМи ЕОМ ХИ 253 250 ато 250 233 з0о

ВКвозоУЮУ КЗЖИКОВБЖИК МОПКІБЕСЕМ ТУРБО СОМИ КУКЕВКИТКА ЕМАКАКТОНО 310 з20 135 зав 350

АЕІУЖКВтУУ ЗЩОТБРАНЕЯ МУЗЕТОВІСМ УМО БАТІА ПЕУВАЗКВМС Щі,

Зазначення на тау включає відомі природні варіації, приблизно 30 з яких перераховані у базі даних бу/із5-Ргої, та їх пермутації, а також мутації, що пов'язані з патологіями тау, такими як деменція, хвороба Піка, над'ядерний параліч і т.д. (Див., наприклад, базу даних бмів5-Ргої і публікацію РоогКаї, єї а. Апп Меийгої. 43: 815-825 (1998)). Деякі приклади мутацій тау, що пронумеровані згідно з ізоформою 441, являють собою мутацію лізину на треонін в залишку амінокислоти 257 (К257Т), мутацію ізолейцину на валін у положенні амінокислоти 260 (1260); мутацію гліцину на валін у положенні амінокислоти 272 (с272М); мутацію аспарагіну на лізин у положенні амінокислоти 279 (М279К); мутацію аспарагіну на гістидин у положенні амінокислоти 296 (М296Н); мутацію проліну на серин у положенні амінокислоти 301 (РЗО15); мутацію проліну на лейцин у положенні амінокислоти 301 (РЗО1ТІ); мутацію гліцину на валін у положенні амінокислоти 303 (С2303М); мутацію серину на аспарагін у положенні 305 (5305М); мутацію гліцину на серин у положенні амінокислоти 335 (23355); мутацію валіну на метіонін у положенні 337 (М337М); мутацію глутамінової кислоти на валін у положенні 342 (ЕЗ42У); мутацію лізину на ізолейцин у положенні амінокислоти 369 (КЗ3691); мутацію гліцину на аргінін у положенні амінокислоти 389 (2389Н); і мутацію аргініну на триптофан у положенні амінокислоти 406 (!4ОбМ).

Тау може бути фосфорильованим за одним або декількома залишками амінокислот, включаючи тирозин у положеннях амінокислоти 18, 29, 97, 310 ії 394, серин у положеннях амінокислоти 184, 185, 198, 199, 202, 208, 214, 235, 237, 238, 262, 293, 324, 356, 396, 400, 404, 409, 412, 413 і 422; і треонін у положеннях амінокислоти 175, 181, 205, 212, 217,231 і 403.

Якщо з контексту не очевидно зворотне, зазначення на тау або їх фрагменти включає природні амінокислотні послідовності людини, включаючи їх ізоформи, мутанти й алельні варіанти.

І. Антитіла

А. Специфічність зв'язування та функціональні властивості

У даному винаході запропоновані антитіла, які зв'язуються з тау. Деякі антитіла специфічно зв'язуються з епітопом в межах залишків 199 - 213 тау-білла людини 4В8ОМ розміром 383 амінокислоти (5ЕО ІО МО: 3) (відповідають залишкам 257 - 271 5ЕО ІО МО: 1). Деякі антитіла специфічно зв'язуються з епітопом в межах залишків 262 - 276 тау-білюла людини АВОМ розміром 383 амінокислоти (ЗЕО ІЮ МО: 3) (відповідають залишкам 320 - 334 5ЕО ІО МО: 1).

Деякі антитіла зв'язуються з тау незалежно від статусу фосфорилювання. Деякі антитіла зв'язуються з епітопом, що не містить залишку, який підлягає фосфорилюванню. Дані антитіла можна одержати за допомогою імунізації поліпептидом тау, що очищений з природного джерела або експресований рекомбінантним способом. Можна провести скринінг антитіл відносно зв'язування з тау у нефосфорильованій формі, а також у формі, в якій один або декілька залишків, що піддаються фосфорилюванню, є фосфорильованими. Такі антитіла, переважно, зв'язуються з невідмітними афінностями або щонайменше в межах 1,5, 2 або З-кратної величини афінності з фосфорильованим тау у порівнянні з нефосфорильованим тау (тобто є «панспецифічними»). 306 являє собою приклад панспецифічного моноклонального антитіла. У даному винаході також запропоновані антитіла, що зв'язуються 3 тим самим епітопом, що і будь-яке з вищезгаданих антитіл, таким як, наприклад, епітоп 306. Також включені антитіла, що конкурують за зв'язування з тау з будь-яким з вищезгаданих антитіл, такі як, наприклад, конкуруючі з 306.

Вищезгадані антитіла можна одержати де помо за допомогою імунізації пептидом, що містить залишки 199-213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, ФЕО ІЮ МО: 1), або за допомогою імунізації повнорозмірним поліпептидом тау або його фрагментом, що містить такі залишки, та проведення скринінгу відносно специфічного зв'язування з пептидом, що містить такі залишки. Такі пептиди, переважно, приєднані до гетерологічної кон'югованої молекули, яка сприяє виклику відповіді у формі антитіл на пептид.

Приєднання може бути прямим або опосередкованим спейсерним пептидом або амінокислотами. Цистеїн використовують як спейсерну амінокислоту, оскільки його вільна ЗН- група полегшує приєднання молекули-носія. Також можна застосовувати полігліциновий лінкер (наприклад, 2-6 гліцинів) із залишком цистеїну між гліцинами та пептидом або без такого залишку. Молекула-носій виступає для забезпечення Т-клітинного епітопу, який сприяє виклику відповіді у формі антитіл на пептид. Загальноприйнято використовують деякі носії, зокрема, гемоціанін фісурели (КеупоЇє ІПтреї Нетосуапіп, КІН), овальбумін і бичачий сироватковий альбумін (БСА). До пептидного імуногена у процесі твердофазного пептидного синтезу можна додати пептидні спейсери. Носії, зазвичай, додають за допомогою хімічного перехресного зшивання. Деякі приклади хімічних перехресно-зшиваючих речовин, які можна застосовувати, включають складний ефір Крос-М-малеімідом-б-амінокапроїлу або складний ефір ш- малеімідобензоїл-М-гідроксисукциніміду (МВ) (див., наприклад, публікації Напом, Е. сі аї! .,

Апіїродієв: А І арогаюту Мапиаї, Соїд 5ргіпд Нагброг Іарогаїогу Ргезв, Соїй брііпуд Нагброг, МУ 1988; 5іпідадіїа єї а!., Маїиге, 336: 778-780 (1988); Спісл єї аї., У. Ехр. Мед., 178: 27-47 (1993);

Наттег еї аї!., Сеї! 74: 197-203 (1993); Раїк К. еї аї., Іттиподепеїїсв5, 39: 230-242 (199493; МО 98/23635; і БошПпмооа еї аї . 9). Іттипоіоду, 160: 3363-3373 (1998)). Носій та спейсер, у випадку наявності, можуть бути приєднані до будь-якого кінця імуногена.

Пептид з необов'язковим спейсером і носієм можна застосовувати для імунізації лабораторних тварин або В-клітин, як описано більше детально нижче. Можна досліджувати здатність супернатантів гібридоми зв'язуватися з одним або декількома пептидами, що містять залишки 199-213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, ФЕО ІЮ МО: 1), і/або з фосфорильованою та нефосфорильованою формами тау, такими як, наприклад, повнорозмірна ізоформа тау з положенням 404 у фосфорильованій формі. Пептид може бути приєднаний до носія або іншої мітки для полегшення скринінгового аналізу. У даному випадку носій або мітка, переважно, відмінні від комбінації молекули спейсера та носія, які застосовували для імунізації, для усунення антитіл, що специфічні відносно спейсера або носія замість пептиду тау. Можна застосовувати будь-яку з ізоформ тау.

У даному винаході запропоновані моноклональні антитіла, що зв'язуються з епітопами в 60 межах тау. Антитіло, що позначене 306, являє собою одне таке ілюстративне антитіло миші.

Якщо з контексту не очевидно зворотне, згадку про 306 слід розуміти як згадку про будь-яку з форми миші, химерної, венованої та гуманізованої форми даного антитіла. Антитіло було депоновано як |(ІНОМЕР ДЕПОНУВАННЯЇ). Дане антитіло специфічно зв'язується в межах залишків амінокислот 199 - 213 або 262 - 276 тау-білюа людини 4НОМ розміром 383 амінокислоти (5ЕО ІЮО МО: 3) (відповідають залишкам амінокислот 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, ФЕО ІЮО МО: 1). Дане антитіло також характеризується здатністю зв'язуватися як з фосфорильованим, так і з нефосфорильованим тау, як з непатологічною, так і з патологічною формами та конформаціями тау, та з неправильно згорнутими/агрегованими формами тау.

Антитіло, що позначено бАТ10, являє собою одне таке ілюстративне антитіло миші. Якщо з контексту не очевидно зворотне, згадку про бА10 слід розуміти як згадку про будь-яку з форми миші, химерної, венованої та гуманізованої форми даного антитіла. СОВ важкого ланцюга бА10 згідно із зведеного визначення Кебота/Чотіа позначені 5ЕО ІЮ МО: 67, 68 і 69, відповідно, і СОВА легкого ланцюга бА10 згідно з Кеботом позначені 5ЕО ІЮ МО: 12, 13 і 14, відповідно. бА10 миші характеризується ідентичністю послідовності МН 82,1905 й ідентичністю послідовності МІ 10095 з ланцюгом МН і ланцюгом МІ, відповідно, 306 миші.

Деякі антитіла згідно з даним винаходом зв'язуються з тим самим або епітопом, який перекривається, що й антитіло, що позначене 306. Послідовності зрілих варіабельних областей важкого та легкого ланцюгів даного антитіла позначені 5ЕО ІО МО: 7 ії 11, відповідно. Інші антитіла, що характеризуються такою специфічністю зв'язування, можна одержати за допомогою імунізації мишей тау або його частиною, що містить бажаний епітоп (наприклад, 199- 213 або 262 - 276 5ЕО І МО: 3, що відповідають залишкам 257 - 271 або 320 - 334, відповідно,

ЗЕО ІО МО: 1), і проведення скринінгу одержаних в результаті антитіл відносно зв'язування з тау, необов'язково в конкуренції з антитілом, що містить варіабельні області 306 миші (Ід каппа). Фрагменти тау, що містять бажаний епітоп, можуть бути приєднані до носія, який сприяє виклику відповіді у формі антитіл на фрагмент, і/або можуть бути об'єднані з ад'ювантом, який сприяє виклику такої відповіді. Можна провести скринінг таких антитіл відносно зв'язування, що відрізняється, з тау або його фрагментом у порівнянні з мутантами зазначених залишків.

Скринінг у порівнянні з такими мутантами більше точно визначає специфічність зв'язування, щоб забезпечити ідентифікацію антитіл, зв'язування яких інгібується за допомогою мутагенезу

Зо конкретних залишків й які, ймовірно, характеризуються однаковими функціональними властивостями 3 іншими ілюстративними антитілами. Мутації можуть являти собою систематичну заміну заміщенням аланіном (або серином, якщо аланін уже присутній) одного залишка за один раз або протягом більше тривалих інтервалів часу, на всьому протязі мішені або на всьому протязі її частини, в якій, як відомо, розташовується епітоп. Якщо один і той самий набір мутацій у значному ступені знижує зв'язування двох антитіл, два антитіла зв'язуються з одним епітопом.

Антитіла, які характеризуються специфічністю зв'язування вибраного антитіла миші (наприклад, 306), можна також одержати із застосуванням варіанта способу фагового дисплея.

Див. публікацію М/іпівєгї, МО 92/20791. Даний спосіб, зокрема, підходить для одержання антитіл людини. У даному способі варіабельну область важкого або легкого ланцюга вибраного антитіла миші використовують як вихідний матеріал. Якщо, наприклад, як вихідний матеріал вибирають варіабельну область легкого ланцюга, конструюють фагову бібліотеку, в якій члени експонують одну і ту саму варіабельну область легкого ланцюга (тобто вихідний матеріал миші) та різні варіабельні області важкого ланцюга. Варіабельні області важкого ланцюга можна, наприклад, одержати з бібліотеки реаранжованих варіабельних областей важких ланцюгів людини. Вибирають фаг, що демонструє потужне специфічне зв'язування з тау або його фрагментом (наприклад, щонайменше 108 і, переважно, щонайменше 109 М"). Потім варіабельні області важкого ланцюга з даного фага використовують як вихідний матеріал для конструювання наступної фагової бібліотеки. У даній бібліотеці кожний фаг експонує одну і ту саму варіабельну область важкого ланцюга (тобто область, що ідентифікована з першої бібліотеки дисплея) та різні варіабельні області легкого ланцюга. Варіабельні області легкого ланцюга можна одержати, наприклад, з бібліотеки реаранжованих варіабельних областей легкого ланцюга людини. Знову вибирають фаг, що демонструє потужне специфічне зв'язування з тау або його фрагментом. Антитіла, що одержані в результаті, зазвичай характеризуються однаковою або аналогічною епітопною специфічністю, що і вихідний матеріал миші.

СОВ важкого ланцюга 306 згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа позначені 5ЕО ІЮ

МО: 8, 9 і 10, відповідно, і СОВ легкого ланцюга 306 згідно з Кеботом позначені 5ЕО ІЮ МО: 12, 13 ї 14, відповідно.

У таблиці 2 представлені СОН 306 згідно з визначеннями Кебота, Чотіа, зведеним визначенням Кебота та Чотіа (також називають у даному документі "зведене визначення

Кебота/Чотіа"), АЬМ і контактним визначенням.

Таблиця 2

СОН 306 згідно з визначенням Кебота, Чотіа, зведеним визначенням

Чотіа та Кебота, АВМ і контактним визначенням рожноржеозеесдет ян | ШО

Кебот Чотіа визначення Чотіа АРМ ля визначення та Кебота

МО:12 МО: 12 МО: 12 ІО МО: 12 МО: 36

МО:13 МО: 13 МО: 13 ІО МО: 13 МО: 37

МО: 14 МО: 14 МО: 14 ІО МО: 14 МО: 38

ІО МО: 32 МО: 33 МО: 8 ЗЕОІО МО:8 ПО МО: 39

МО: 9 МО: 34 МО: 9 ІО МО: 35 МО: 40

ІО МО: 10 МО: 10 МО: 10 ІО МО: 10 ІО МО: 41

Інші антитіла можна одержати за допомогою мутагенезу кКДНК, що кодує важкий та легкий ланцюги ілюстративного антитіла, такого як 306. Моноклональні антитіла, які щонайменше на 7095, 8095, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичні 306 за амінокислотною послідовностю зрілих варіабельних областей важкого та/або легкого ланцюгів і зберігають їх функціональні властивості, й/або які відрізняються від відповідного антитіла невеликою кількістю функціонально несуттєвих замін амінокислот (наприклад, консервативних замін), делецій або вставок, також включені у даний винахід. Також включені моноклональні антитіла, що містять щонайменше один або всі шість СОВ згідно з будь-яким загальноприйнятим визначенням, але, переважно, згідно з Кеботом, які на 9095, 9595, 9995 або 10095 ідентичні відповідним СОВА 306.

У даному винаході також запропоновані антитіла, що містять деякі або всі (наприклад, 3, 4, 5 і 6) СОВ, що одержані повністю або по суті з 306. Такі антитіла можуть містити варіабельну область важкого ланцюга, яка містить щонайменше два, але зазвичай всі три СОВ, що одержані повністю або по суті з варіабельної області важкого ланцюга 306, і/або варіабельну область легкого ланцюга, яка містить щонайменше два, але зазвичай всі три СОВ, що одержані повністю або по суті з варіабельної області легкого ланцюга 306.

Антитіла можуть містити як важкий, так і легсий ланцюги. СОВА по суті одержаний з відповідного СОВ 306, коли він містить не більше 4, 3, 2 або 1 замін, вставок або делецій, за винятком того, що СОВ-На2 (при визначенні згідно з Кеботом) може містити не більше 6, 5, 4, 3,2 або 1 замін, вставок або делецій. Такі антитіла можуть характеризуватися ідентичністю щонайменше 7095, 8095, 9095, 9595, 96905, 9795, 9895 або 9995 з 306 амінокислотної послідовності зрілих варіабельних областей важкого та/або легкого ланцюгів і зберігати їх функціональні властивості, та/або можуть відрізнятися від 306 невеликою кількістю функціонально несуттєвих замін амінокислот (наприклад, консервативних замін), делецій або вставок.

Деякі антитіла, що ідентифіковані в таких аналізах, можуть зв'язуватися з мономерними,

Зо неправильно згорнутими, агрегованими, фосфорильованими або нефосфорильованими формами тау або іншими формами. Аналогічно, деякі антитіла є імунологічно реактивними відносно непатологічної та патологічної форми і конформацій тау.

В. Антитіла, які відмінні від антитіл людини

Одержання інших антитіл, які відмінні від антитіл людини, наприклад, миші, морської свинки, примата, кролика або щура, проти тау або його фрагмента (наприклад, залишків амінокислот 199 - 213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: 3) (відповідають залишкам амінокислот 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, 5ЕО ІЮО МО: 1) можна здійснити за допомогою, наприклад, імунізації тваринного тау або його фрагментом. Див. керівництво Напом/ 5 І апе, Апіїродієз, А І арогаюгу Мапиаї! (С5НР МУ, 1988) (включено за допомогою посилання для всіх цілей). Такий імуноген можна одержати з природного джерела, за допомогою пептидного синтезу або за допомогою рекомбінантної експресії. Необов'язково, імуноген можна вводити злитим з білком-носієм або в комплексі, що утворений іншим способом, з білком-носієм. Необов'язково, імуноген можна вводити з ад'ювантом. Можна застосовувати декілька типів ад'ювантів, як описано нижче. Для імунізації лабораторних тварин перважним є повний ад'ювант Фрейнда з подальшим використанням неповного ад'юванта. Для одержання поліклональних антитіл, зазвичай, застосовують кроликів або морських свинок. Для одержання моноклональних антитіл, зазвичай, застосовують мишей. Проводять скринінг антитіл відносно специфічного зв'язування з тау або з епітопом в межах тау (наприклад, епітопом, що містить один або декілька із залишків амінокислот 199 - 213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: 3) (відповідають залишкам амінокислот 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, 5ЕО ІЮ МО: 1). Такий скринінг можна здійснити за допомогою визначення зв'язування антитіла із сукупністю варіантів тау, таких як варіанти тау, що містять залишки амінокислот 199-213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам амінокислот 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, 560) ІО МО: 1), або мутації в межах даних залишків, і визначення того, які варіанти тау зв'язуються 3з антитілом. Зв'язування можна оцінити, наприклад, методом вестерн-блотингу, ЕАС5 або ЕП ІБА.

С. Гуманізовані антитіла

Гуманізоване антитіло являє собою генно-інженерне антитіло, в якому СОВ від «донорного» антитіла, яке відмінне від антитіла людини, переносять в «акцепторні» послідовності антитіла людини (див., наприклад, публікації СОцеєп, 05 5,530,101 і 5,585,089; М/іпієї, О5 5,225,539;

Сапег, 05 6,407,213; Адаїї 05 5,859,205; і Рооїє, 05 6,881,557). Послідовності акцепторного антитіла можуть являти собою, наприклад, зрілу послідовність антитіла людини, об'єднання таких послідовностей, консенсусну послідовність послідовностей антитіла людини або послідовність зародкової області. Таким чином, гуманізоване антитіло являє собою антитіло, що містить щонайменше три, чотири, п'ять або всі СОВ, що одержані повністю або по суті з донорного антитіла, та послідовності каркасної ділянки варіабельної області та константні області, у випадку присутності, які одержані повністю або по суті з послідовностей антитіла людини. Аналогічно, гуманізований важкий ланцюг містить щонайменше один, два та зазвичай всі три СОВ, що одержані повністю або по суті з важкого ланцюга донорного антитіла, та послідовність каркасної ділянки варіабельної області важкого ланцюга та константну область

Зо важкого ланцюга, у випадку присутності, які одержані по суті з послідовностей каркасної ділянки варіабельної області та константної області важкого ланцюга людини. Аналогічно, гуманізований легкий ланцюг містить щонайменше один, два та зазвичай всі три СОН, які одержані повністю або по суті з легкого ланцюга донорного антитіла, та послідовність каркасної ділянки варіабельної області легкого ланцюга та константну область легкого ланцюга, у випадку присутності, які одержні по суті з послідовностей каркасної ділянки варіабельної області та константної області легкого ланцюга людини. На відміну від нанотіл і АБ, гуманізоване антитіло містить гуманізований важкий ланцюг і гуманізований легкий ланцюг. СОВА в гуманізованому антитілі одержані по суті з відповідного СОВ в антитілі, яке відмінне від антитіла людини, коли щонайменше 8595, 9095, 9595 або 10095 відповідних залишків (згідно з будь-яким загальноприйнятим визначенням, але, переважно, що визначені згідно з Кеботом) є ідентичними між відповідними СОН. Послідовності каркасної ділянки варіабельної області ланцюга антитіла або константна область ланцюга антитіла одержані по суті з послідовності каркасної ділянки варіабельної області людини або константної області людини, відповідно, коли щонайменше 8595, 9095, 9595 або 10095 відповідних залишків, що визначені згідно з

Кеботом, є ідентичними. Для класифікації як гуманізованого відповідно до визначення гуманізованих антитіл згідно з міжнародними непатентованими назвами (МНН) Всесвітньої організації охорони здоров'я (ВООЗ) від 2014 р., антитіло повинне характеризуватися ідентичністю щонайменше 8595 з послідовностями антитіла зародкової лінії людини (тобто до соматичної гіпермутації). Змішані антитіла являють собою антитіла, в яких один ланцюг антитіла (наприклад, важкий ланцюг) відповідає граничному значенню, але інший ланцюг (наприклад, легкий ланцюг) не відповідає граничному значенню. Антитіло класифікують як химерне, якщо жодний з ланцюгів не відповідає граничному значенню, навіть якщо каркасні ділянки варіабельної області для обох ланцюгів були одержані по суті від людини з деякими зворотними мутаціями миші. Див. публікацію Чдопевз сеї аї!. (2016) Тне ІММ5 апа оців ої апііроду попргоргієїагу патев, тАбрз 8:1, 1-9, БОЇ: 10.1080/19420862.2015.1114320. Див. також публікацію "М НО-ЇММ: Іпгегптаїіопаї! попргоргієїагу патевз (ІММ) ог Біоіодіса! апа Біоїесппоіодіса! вибеіапсев (а гемівм/)" (інтернет) 2014. Доступна за адресою ПЕр/Лимли. м/по.іп/тедісіпев5/5егмісе5/Іпп/Віобем2014.раї), включена у даний документ за допомогою посилання. Щоб уникнути сумнівів термін "гуманізоване" у даному документі не обмежений бо визначенням гуманізованих антитіл згідно з МНН ВООЗ 2014 р. Деякі з гуманізованих антитіл,

що запропоновані у даному документі, характеризуються ідентичністю послідовності щонайменше 85 95 послідовностям зародкової лінії людини, і деякі з гуманізованих антитіл, що запропоновані у даному документі, характеризуються ідентичністю послідовності менше 85 90 послідовностям зародкової лінії людини. Деякі з важких ланцюгів гуманізованих антитіл, що запропоновані у даному документі, характеризуються ідентичністю послідовності від приблизно 60 95 до 100 95 з послідовностями зародкової лінії людини, такі як, наприклад, в діапазоні від приблизно 60 95 до 69 95, від 70 95 до 79 905, від 80 95 до 84 95 або від 85 95 до 89 95. Деякі важкі ланцюги не дотягують до визначення згідно з МНН ВООЗ 2014 р. і характеризуються, наприклад, ідентичністю послідовності приблизно 64 905, 65 90, 66 95,67 95, 68 95, 69 90, 70 90, 71 о, 72 905, 73 90, 74 90, 75 9, 76 9, 77 90, 78 9, 79 90, 80 96, 81 95 або 82 95, 83 95 або 84 95 з послідовностями зародкової лінії людини, тоді як інші важкі ланцюги відповідають визначенню згідно з МНН ВООЗ 2014 р. і характеризуються приблизно 85 95, 86 95, 87 9о, 88 95, 89 95 або більшою ідентичністю послідовності з послідовностями зародкової лінії людини. Деякі з легких ланцюгів гуманізованих антитіл, що запропоновані у даному документі, характеризуються ідентичністю послідовності від приблизно 60 95 до 100 95 з послідовностями зародкової лінії людини, такими як, наприклад, в діапазоні від приблизно 80 95 до 84 95 або від 85 95 до 89 905.

Деякі легкі ланцюги не дотягують до визначення згідно з МНН ВООЗ 2014 р. і характеризуються, наприклад, ідентичністю послідовності приблизно 81 95, 82 95, 83 95 або 84 95 з послідовностями зародкової лінії людини, тоді як інші легкі ланцюги відповідають визначенню згідно з МНН ВООЗ 2014 р. і характеризуються приблизно 85 95, 86 95, 87 905, 88 95, 89 95 або більшою ідентичністю послідовності з послідовностями зародкової лінії людини. Деякі гуманізовані антитіла, що запропоновані у даному документі, які є «химерними» відповідно до визначення згідно з МНН

ВООЗ 2014 р. містять важкі ланцюги з ідентичністю менше 85 95 з послідовностями зародкової лінії людини, що спарені з легкими ланцюгами, які характеризуються ідентичністю менше 85 95 з послідовностями зародкової лінії людини. Деякі гуманізовані антитіла, що запропоновані у даному документі, є «змішаними» відповідно до визначення згідно з МНН ВООЗ 2014 р. наприклад, містять важкий ланцюг з ідентичністю послідовності щонайменше 85 95 з послідовностями зародкової лінії людини, що спарена 3 легким ланцюгом, який характеризується ідентичністю послідовності менше 85 95 з послідовностями зародкової лінії людини, або навпаки. Деякі гуманізовані антитіла, що запропоновані у даному документі, відповідають визначенню «гуманізованого» антитіла згідно з МНН ВООЗ 2014 р. і містять важкий ланцюг з ідентичністю послідовності щонайменше 8595 з послідовностями зародкової лінії людини, що спарена з легким ланцюгом, який характеризується ідентичністю послідовності щонайменше 85 95 з послідовностями зародкової лінії людини. Додаткові гуманізовані антитіла згідно з даним винаходом відповідають визначенню «змішаних» антитіл згідно з МНН ВООЗ 2014 р. і включають антитіла, що містять зрілий важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮО МО: 15-19 ї 5ЕО ІО МО: 46-57, що спарена зі зрілим легким ланцюгом, який містить амінокислотну послідовність будь-якої з ФЕО ІЮ МО: 20-23.

Незважаючи на те, що гуманізовані антитіла часто містять всі шість СОВА (що визначені згідно з будь-яким загальноприйнятим визначенням, але, переважно, згідно з визначенням

Кебота) з антитіла миші, їх також можна одержати не з усіма СОВ (наприклад, щонайменше з 3, 4 або 5 СОВ) з антитіла миші (наприклад, Разсаїз еї аї., у). Іттипої. 169: 3076, 2002; Маідоз еї аї,

У. ої Мої. Віої, 320: 415-428, 2002; Імапаєвнпі єї аї., Мої Іттипої!. 36: 1079-1091, 1999; Татига еї аї.,

У. Іттипої, 164: 1432-1441, 2000).

У деяких антитілах тільки частина СОВ, а саме підгрупа залишків СОВ, що необхідні для зв'язування, які позначаються 508, необхідні для збереження зв'язування в гуманізованому антитілі. Залишки СОВ, що не здійснюють контакт з антигеном і не відносяться до 5ОВ, можна ідентифікувати на основі попередніх досліджень (наприклад, залишки НбО - Нб5 у СОВ Н2 часто не є необхідними), з областей СОВ згідно з Кеботом, що лежать за межами гіперваріабельних петель Чотіа (Споїпіа, 9. Мої. Віо!І. 196: 901, 1987), методом молекулярного моделювання й/або емпірично, або як описано у публікації Са0плаїевз еї аїЇ., Мої. Іттипо! 41: 863, 2004. У таких гуманізованих антитілах у положеннях, в яких відсутні один або декілька донорних залишків

СО або в яких пропущений весь донорний СОР, амінокислота, що займає положення, може являти собою амінокислоту, що займає відповідне положення (згідно з нумерацією Кебота) у послідовності акцепторного антитіла. Кількість таких замін акцептора амінокислотами донора у

СОВА для включення відображає баланс конкуруючих міркувань. Такі заміни є потенційно сприятливими для зниження кількості амінокислот миші в гуманізованому антитілі і, як наслідок, зниження потенційної імуногенності, та/або для відповідності визначенню «гуманізовані» антитіла згідно з МНН ВООЗ. Однак заміни можуть також викликати зміни афінності, та значного зниження афінності, переважно, уникають. Положення для заміни в межах СОВ й амінокислоти для заміщення також можна вибрати емпірично.

Послідовності акцепторного антитіла людини можна необов'язково вибрати серед множини відомих послідовностей антитіла людини для одержання високого ступеня ідентичності послідовності (наприклад, ідентичності 65 - 85 95) між каркасними ділянками варіабельної області акцепторної послідовності людини та відповідними каркасними ділянками варіабельної області ланцюга донорного антитіла.

Приклад акцепторної послідовності для важкого ланцюга являє собою зрілу варіабельну область важкого ланцюга людини з обліковим кодом МСВІ ВАСО 1986.1 (5ЕО ІО МО: 24).

Приклад акцепторної послідовності для важкого ланцюга являє собою зрілу варіабельну область важкого ланцюга людини з обліковим кодом МСВІ ІМОТ я аНМ1-69-2701 (5ЕО ІО МО: 25). Приклад акцепторної послідовності для важкого ланцюга являє собою зрілу варіабельну область важкого ланцюга людини з обліковим кодом МСВІ ІМТ Ж І2КОТ701 (5ЕО ІО МО: 26).

ІМОТ Ж ІСНМІ-69-2701 (5ЕО ІО МО: 25) характеризується канонічною формою СОВ-НІ їі Н2 важкого ланцюга 306 миші. ІМОаТ 2 І2НМ1-69-2701 (5ЕО ІЮ МО: 25) й ІМОТ й 12К.О1701 (5ЕО Ір

МО: 26) належать до підгрупи 1 важкого ланцюга людини. Приклад акцепторної послідовності для легкого ланцюга являє собою зрілу варіабельну область легкого ланцюга людини з обліковим кодом МОВІ ІМаТт Ж ІаКМ2-30702 (5ЕО ІЮ МО: 27). Приклад акцепторної послідовності для легкого ланцюга являє собою зрілу варіабельну область легкого ланцюга людини з обліковим кодом МСВІ ІМСТ 2 І12КО2701 (5ЕО ІЮ МО: 28). Приклад акцепторної послідовності для легкого ланцюга являє собою зрілу варіабельну область легкого ланцюга людини з обліковим кодом МОВІ АА209048.1 (5ЕО ІЮО МО: 29). ІМТ я ІаКМ2-30702 (5ЕО ІЮО МО: 27) характеризується тими самими канонічними класами для СОВ-І 1, СОВ-12 та І 3, що і 306 миші.

ІМСОТ Я 1аКМ2-30702 (5ЕО І МО: 27) й ІМТ Я ІШКО2"01 (5ЕО І МО: 28) належать до підгрупи 2 каппа людини.

Якщо вибирають більше однієї акцепторної послідовності антитіла людини, можна застосовувати об'єднання або гібрид даних акцепторів, й амінокислоти, що використовуються у різних положеннях у гуманізованих варіабельних областях легкого ланцюга та важкого ланцюга, можуть бути взяті з будь-якої з використовуваних послідовностей акцепторного антитіла людини. Наприклад, зрілі варіабельні області важкого ланцюга людини з обліковими кодами

МСВІ ІМаТтТ Ж ІБНМ1-69-2701 (5ЕО ІО МО: 25) і ВАСО1986.1 (5ЕО ІО МО: 24) застосовували як акцепторь! послідовності для гуманізації зрілої варіабельної області важкого ланцюга 306.

Приклади положень, в яких дані два акцептори відрізняються, включають положення НІ 7 (Т або

З) і Н2О (І або М). Гуманізовані версії варіабельної області важкого ланцюга 306 можуть містити будь-які амінокислоти у будь-якому з даних положень.

Певні амінокислоти з каркасних залишків варіабельної області людини можна вибрати для заміщення на основі їх можливого впливу на конформацію СОВА і/або зв'язування з антигеном.

Дослідження таких можливих впливів здійснюють за допомогою моделювання, вивчення характеристик амінокислот у конкретних розташуваннях або емпіричного спостереження за ефектами заміни або мутагенезу конкретних амінокислот.

Наприклад, коли амінокислота відрізняється між каркасним залишком варіабельної області миші та вибраним каркасним залишком варіабельної області людини, каркасну амінокислоту людини можна замінити еквівалентною каркасною амінокислотою з антитіла миші, коли обгрунтовано очікують, що амінокислота: (1) нековалентно напряму зв'язується з антигеном; (2) прилягає до ділянки СОВ або в межах СОВ згідно з визначенням Чотіа, але не Кебота; (3) іншим способом взаємодіє з ділянкою СОВА (наприклад, знаходиться в межах приблизно 6 А від ділянки СОВ) (наприклад, що ідентифіковано за допомогою моделювання легкого або важкого ланцюга на розшифрованій структурі гомологічного відомого ланцюга імуноглобуліну); або (4) являє собою залишок, що бере участь у поверхні взаємодії МІ -МН.

У даному винаході запропоновані гуманізовані форми антитіла 306 миші, включаючи 17 ілюстративних гуманізованих зрілих варіабельних областей важкого ланцюга (пиЗзОбМНмІ (5ЕО

ІО МО: 15), пизОобУНмаг (ЗЕО ІЮ МО: 16), пизЗОбУНУТЬ (ЗЕО ІЮ МО: 17), пизОбУНУТЬА11 (5ЕО І

МО: 18), пиЗОбУНУ5 (5ЕБЕО 10 МО: 19), пиЗОбУНУТЬАТ18602 (5БО 10 МО: 46), пиЗзОбУНУТрАТ1В6НЗ (5ЕО ІО МО: 47), пизОбУНм1с (5ЕО ІЮ МО: 48), пизОбУНута (ЗЕО ІЮ МО: 49), пРиЗОбМНмте (5ЕО І МО: 50), пиЗОбУНмІ (5ЕО ІЮ МО: 51), пиЗзОбМНУЗ (5ЕО ІО МО: 52), пиЗОбУНУЗЬ (5ЕБЕО ІЮ МО: 53), пиЗОбМНуЗс (5ЕО ІО МО: 54), пиЗзОбМНма4 (5ЕО ІО МО: 55), пиЗО6УНм4Ь (5ЕО І МО: 56) ії пизобУНма4с (5ЕО ІО МО: 57)), і 4 ілюстративні гуманізовані зрілі варіабельні області легкого ланцюга (пиЗзОбМІ мі (ЗЕО 10 МО: 20), пизОбМІ м2 (З5ЕО ІЮ МО: 21, пиЗОбМІ УЗ (5ЕО ІО МО: 22) і пи ЗОбМІ м4 (5ЕО ІЮ МО: 23)).

Згідно з варіантом реалізації гуманізовані послідовності одержані із застосуванням двоетапного протоколу ПЛР, який дозволяє вводити декілька мутацій, делецій та вставок із застосуванням сайт-спрямованого мутагенезу ОцікСпапде (Мапод, МУ. апа Маїсоїт, В.А. (1999)

ВіоТесппіднев 26: 680-682).

Каркасні залишки з класів з (1) по (3) згідно з визначенням Ойеєп, 05 5,530,101 іноді як альтернатива називають канонічними та верньєрними залишками. Каркасні залишки, які допомагають визначити конформацію петлі СОН, іноді називають канонічними залишками (Споїніа 8 І евК, 9). Мої. Вісі. 196: 901-917 (1987); Тнпогпіоп а Мапіп, У. Мої. Віої. 263: 800-815 (1996)). Каркасні залишки, які підтримують конформацію антигензв'язуючої петлі та грають роль у тонкому налаштуванні відповідності антитіла антигену, іноді називають верньєрними залишками (Рооїе 8. М/іпіег, у. Мої. Віої. 224: 487-499 (1992)).

Інші каркасні залишки, які є кандидатами для заміни, являють собою залишки, що утворюють потенційний сайт глікозилювання. Ще одними кандидатами для заміни є акцепторні каркасні амінокислоти людини, які є незвичайними для імуноглобуліну людини у даному положенні. Дані амінокислоти можна замінити амінокислотами з еквівалентного положення донорного антитіла миші або з еквівалентного положення більше типових імуноглобулінів людини.

Інші каркасні залишки, які є кандидатами для заміни, являють собою М-кінцеві залишки глутаміну (0), які можна замінити глутаміновою кислотою (Е) для мінімізації можливості конверсії піроглутамату (М. Оіапа І ім, еї аї., 2011, 9. Віої. Снет., 286: 11211-11217). Конверсія глутамінової кислоти (Е) у піроглутамат (рЕ) відбувається більше повільно, ніж глутаміну (0). У зв'язку з втратою первинного аміну при конверсії глутаміну у рЕ антитіла стають більше кислими. В результаті неповної конверсії в антитілі виникає гетерогенність, яку можна спостерігати у вигляді множини піків із застосуванням аналітичних методів на основі заряду.

Відмінності у гетерогенності можуть свідчити про недостатній контроль процесу.

Ілюстративні гуманізовані антитіла являють собою гуманізовані форми 306 миші, що позначені Ни306.

Зо Антитіло 306 миші містить зрілі варіабельні області важкого та легкого ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, які містять 5ЕО 10 МО: 7 і 5ЕО ІО МО: 11, відповідно. У даному винаході запропоновані 17 ілюстративних гуманізованих зрілих варіабельних областей важкого ланцюга: пиЗзОобУНм, пизОобУнмаг, пиЗОбУНм, пиЗОбУНМБА1, пиЗзОбУНм5, пиЗОбМНУТЬАТ186с22, пиЗО6бМНУТрАТ1В6НЗУ, пиЗОбМНМтс, пиЗОбМНУтТа, пизОбУНмте, пиЗзОобУ Нм, пизОбУНуз, пизО6УНуЗЬ, пизОбМНузс, пизОбУНм4, пизОбМУНуаб ї пиЗзОбМУНм4с. У даному винаході також запропоновані ілюстративні зрілі варіабельні області легкого ланцюга людини: пиЗОбМІ мі, пиЗзОбМІ м2, пиЗОбМІ м і Мі мі. На фігурах 2 і З представлені вирівнювання варіабельної області важкого ланцюга та варіабельної області легкого ланцюга, відповідно, 306 миші та різних гуманізованих антитіл.

Через причини, такі як можливий вплив на конформацію СОР і/або зв'язування з антигеном, опосередкування взаємодії між важким і легким ланцюгами, взаємодія з константною областю, уявлення собою сайту для бажаної або небажаної посттрансляційної модифікації, уявлення собою незвичайного залишку для свого положення у послідовності варіабельної області людини і внаслідок цього - потенційно імуногенного, придбання потенціалу агрегації, та з інших причин наступні 30 каркасних положень варіабельної області стали вважали кандидатами для замін в 4 ілюстративних зрілих варіабельних областях легкого ланцюга людини та 17 ілюстративних зрілих варіабельних областях важкого ланцюга людини, що додатково зазначені у прикладах: 12 (М21), 177 (571), 112 (Р1Т25),115 (1151), 136 (ЕЗ6І), 37 (0371), 145 (845К), 160 (0605),1100 (0100С), НІ1О (ЕТО0), НІ12 (К12У), НІ1З (К138), НІ17 (1171), Н24 (У24А), НЗВ8 (О38Б), Н4О (А4ОВ),

На2 (042Е), Н4аЗ (К430), Н4і8 (М481), Нбб (86бК), Нб7 (У67А), Н7б6 (076М), НВО (М80), НВ1 (ЕВ1ІО), Нвга (582а-С), Н8ВФЗ (88371), НОТ (МО1Р), НОЗ (АЗ35), НІТО8 (11087) ї НІОЗ (М1091).

Наступні 9 положень СОВ варіабельної області стали вважати кандидатами для замін в 17 ілюстративних зрілих варіабельних областях важкого ланцюга людини, що додатково зазначені у прикладах: Н27 (Е27У), Н2г8 (М28Т), Н2г9 (І29Бг), НЗО (КЗОТ), Н51 (15ІМ), Н5Ь4 (М540), НбОо (О60А), НбЄЇ (РО1ТЕ) і НІ02 (Е102У). В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НІ згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ

МО: 42, ії СОВ-НЕ згідно з Кеботом містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 43. В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НІ згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 42, і СОВ-Н2 згідно з Кеботом 60 містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІО МО: 61. В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НІ згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 58, і СОВ-Н2 згідно з Кеботом містить амінокислотну послідовність, що містить хЕО ІО МО: 62. В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НІ згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО І

МО: 42, ії СОВ-НАЕ2 згідно з Кеботом містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 64, і СОВ-НЗ згідно з Кеботом містить амінокислотну последовність, що містить 5ЕО ІО МО: 65.

В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НІ згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 42, і СОВ-Н2 згідно з Кеботом містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО І МО: 64. В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НІ згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 59, і СОВ-Н2 згідно з Кеботом містить амінокислотну послідовність, що містить ФЕО ІО МО: 63. В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НІ згідно із зведеним визначенням Кебота-Чотіа містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО І

МО: 60, ї СОВ-НАа2 згідно з Кеботом містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 62.

Тут, як і в іншому місці, згаданий першим залишок являє собою залишок гуманізованого антитіла, що утворений за допомогою перенесення СОВА згідно з Кеботом або СОК згідно із зведеним визначенням Чотіа-Кебота у випадку СОВ-НІ в акцепторну каркасну ділянку людини, і згаданий другим залишок являє собою залишок, що розглянутий для заміни такого залишку.

Таким чином, в межах каркасних ділянок варіабельної області згаданий першим залишок являє собою залишок людини, а в межах СОВ згаданий першим залишок являє собою залишок миші.

Ілюстративні антитіла включають будь-які пермутації або комбінації ілюстративних зрілих варіабельних областей важкого та легкого ланцюгів МНмі/МЇміІ, МНм1///м2, МНм1/МіІм3,

МНМУ1/Мм4, МНу2г//. мі, МНу2г//їм2, МНуи2//І 83, МНм2//І м4, МНУМТ1Б/МІ мі, МНУТЬ/М м2, МНМ1Б/М м,

МНУТБ/Мм4, МНУТБА11/МЇмІ, МНМУ1БА11/Мм2, МНУТБА11/ИЇмУ3, МНМ1БА11/И/їм4, МНУБ/МІмІі,

МУМНУБ/МІ маг, МНмУБ/МІм3, МНУБ/Мі ма4, МНУТ1БА1186О2/МІ мі, МНУТБА1186Сс2/МІ мг,

МНУТВА118602/МЇм3, МНУТБА11НВбОг2/Мм4, МНМУ1БА1186НЗ/МІ МІ, 0 МНУ1БАТ11В6НЗ/МІ мг,

МНУТВБАТ11В6НЗ/МІ м3, МНУТЬБА11В6НЗ/МІ м4, МНміс/МїміІ, МНміс/мі м2, МНміс/мі м3, МНміс/мі мі,

УНуУтал/імі, МНнНУТаллім2, МНуУталмі м3, МНуталм ма, МНмїе/мімі, МНиїТе/МІм2, МНміє/мім3,

Ко) МНУТе/МІ м4, МНнМТ МІ мі, МНМТ МІ м2, МНУТ/М м3, МН МІ м4, МНуЗ/М мі, МНуЗ/М м2, МНУЗ/М м,

МНУЗ/МІм4, МНуУзЗр/МімІ, МНУЗБ/Мім2, МНуУЗБрБ/Уїм3, МУНузЗр/иІм4, МНуЗс/Мімі, МУНузс/мМі м2,

МНуЗс/МІм3, МНуЗс/МІм4, МНу4/МІмІ, МНму4//Ім2, МНу4//їм3, МНу4/МІм4, МУНу4р/МІмІі,

МНу4р/М м2, МНу4р/МІ м3, МНуи4Б/МІ м4, МНу4с/М мі, МНм4с/МІ м2, МНм4с/МІ УЗ або МНу4с/мі ма4.

У даному винаході запропоновані варіанти гуманізованого антитіла ЗО6б, в яких гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга демонструє щонайменше 9095, 9595, 9695, 9790, 9895 або 9995 ідентичності з пиЗОбМНМІ (5ЕО 10 МО: 15), пизОбМНмМ2 (5ЕБЕО ІО МО: 16), пиЗОбМНмтТЬ (ЗЕО І МО: 17), пиЗзЗОбУНУтТБАТ1 (5ЕО І МО: 18), пиЗОбУНм5 (ЗЕО ІЮО МО: 19), пиЗзОбуМНУТЬАТ186с2 (5ЕО І МО: 46), пиЗзОбУНУТЬАТІ1В6НЗ (5ЕО ІЮ МО: 47), пизОбУНмМс (ЗЕО ІЮ МО: 48), пиЗОбУНУТа (ЗЕО І МО: 49), пиЗзОбУНУте (5ЕО ІЮ МО: 50), пизЗОбМ Нм (5ЕО

ІО МО: 51), пизОбУНмУЗ (5ЕО І МО: 52), пиЗзОбУНУЗЬ (5ЕО ІЮ МО: 53), пиЗОбУНуЗс (ЗЕО І

МО: 54), пизОбУНмя4 (5ЕО ІО МО: 55), пизОбУНм4Б (5ЕО ІЮ МО: 56) ії пизОбУНу4с (5ЕО ІО МО: 57), і гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга демонструє щонайменше 9095, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 ідентичності з пиИЗОбМІ мі (ЗЕО 10 МО: 20), пиЗОбМІ м2 (ЗЕО І

МО: 21), пиЗзОбМІ м3 (5ЕО ІО МО: 22) і пиЗзОбМІ м4 (5ЕО ІО МО: 23). В деяких таких антитілах зберігається щонайменше 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 або всі 39 із зворотних мутацій або інших мутацій у БЕО ІО МО: 15-19, 5ЕО ІЮ МО: 20-23 ії БЕО І МО: 46-57.

В деяких гуманізованих антитілах 306 щонайменше одне з наступних положень в області

МН займає амінокислота, як зазначено: НЗ8 займає В, і Н9ОЗ займає 5. У деяких гуманізованих

БО антитілах 306 положення НЗ8 і НОЗ в області МН займають В і 5, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НЗ8В займає В, Н4З займає О, Н83 займає Т, і НеЗ займає 5. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НЗ8, Н4іЗ, Н8В3 і НОЗ в області МН займають Н, ОС, Т і 5, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: Н12 займає У, Н24 займає А, Н4і8 займає І, Нб7 займає

А, НВО займає Ї, НВІ займає О, і НУОї займає ЕР. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ12, Н24, Н4а8, Нб7, НВО, НаВ1 і НО1 в області МН займають М, А, І, А, Ї, ОО і Е, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НІ1З3 займає В, і Нбб займає К. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ3З і Нбе в області МН займають В і К, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: Н40 займає РН, і Нв2а займає С. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НЯ і Н8вага в області МН займають В і С, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: Н4і2 займає Е, і Н7б займає М. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення На2 і Н7Є в області МН займають Е і М, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: Н40 займає В, Н8в2а займає С, і Н8ЗЗ займає Т. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н4і0, Нв2а і Н8В3 в області МН займають В, а і т, відповідно.

В деяких гуманізованих антитілах 306 НІ12 в області МН займає У.

В деяких гуманізованих антитілах 306 НВО в області УН займає Ї.

МН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А, Н4і8 займає І, Нб7 займає А, НВО займає

І, ї Н91 займає РЕ. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н24, Н48, Нб7, НВО і НО1 в області МН займають А, |, А, І і Е, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: Н4іЗ займає 0, і Н8В1 займає 0. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НАаЗ і Н8В1 в області МН займають О і О, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А, і НО1 займає Е. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н2А4 і НО1 в області МН займають А і Е, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НІ13 займає Н, НІ7 займає І, Н29 займає ЕЕ, Н4і2 займає

Е, Н4З займає О, Нбї займає Е, Н7б займає М, НВО займає Ї, НВ займає О. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ3, Н17, Н2г9, Н4і2, Н4З3, НОТ, Н7б, НВО і Н81 в області

Ко) МН займають В, І, ЕР, Е, ОО, Е, М, І ї О, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А, Н2г8 займає Т, Н4і8 займає І, Н54 займає р, Нбо займає А, Нб7 займає А, НВО займає І, і НУО1 займає РЕ. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н24, Н2г8, Н4і8, Н54, НбО, Нб?7, НВО і НО1 в області МН займають А, Т, І, 0, А, А, ГГ. і Е, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НІ1О займає 0, НІ7 займає І, Н24 займає А, Н28 займає

Т, Н4іЗ займає О, Н48 займає І, НбО займає А, Нб1 займає Е, НО1 займає Е, НІО8 займає Т, і

НІОО9 займає Г. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ10, НІ17, Н24, Н2г8, Н4З, На48,

НбО, НОТ, НОТ, НІ108 їі НІ109 в області МН займають О,Г, А, Т, О, І, А, Е, Е, Т і Ї, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НІ7 займає І, Н27 займає У, Н29 займає ЕК, і НЄ1 займає

Е. У деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н17, Н27, Н29 і Нб1 в області МН займають

ІЇ, М, ЕЕ, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НІ7 займає І, Н27 займає У, Н29 займає Е, Нб1 займає

Е, Н76 займає М, і Н8в2а займає О.

В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н1І7, Н27, Н29, НЄ, Н7б і Н8ва2а в області

МН займають І, М, Е, Е, М і С, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НІ12 займає У, НІ7 займає ГІ, Н24 займає А, Н4іЗ займає

О, Н4і8 займає І, НВ3З займає Т, і Неї займає Б. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н12, НІ17, Н24, Н4З, Н4і8, НЗ83 ї НО1 в області МН займають М, ГІ, А, О, І, Т, Е, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НІ12 займає У, Н24 займає А, Н4і8 займає І, Нб7 займає

А, НВО займає І, НВФЗ займає Т, і НУОї1 займає Б. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ12, Н24, Н48, Нб7, НВО, Н83З і НО1 в області МН займають М, А, І, А, ЇЇ, Ті Е, відповідно.

МН займає амінокислота, як зазначено: НІ10 займає Е або 0, НІ12 займає К або У, Н13 займає К або В, НІ7 займає Т, І або 5, Н24 займає МУ або А, Н27 займає Е або У, Н28 займає М або Т, Н2г9 займає І або Е, НЗО займає К або Т, НЗ8 займає О або НВ, Н40 займає А або В, Н42 займає С або Е, Н4іЗ займає К або О, Н4і8 займає М або І, Н5У1 займає М або І, Н54 займає М або 0, НбО займає О або А, Нб1 займає Р або Е, Нбб займає В або К, Нб7 займає М або А, Н7бЄ займає 0 або М, НВО займає М або Її, Н8В1 займає Е або О, Нвга займає 5 або С, Н83 займає Т або В,

НеО1 займає ХУ або Е, НеЗ займає А або 5, НІО2 займає Е або У, НІ108 займає Т або І, НІ09 займає ГІ або У.

В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н12, НІ13, Н17, Н24, НЗ8, Н42, НаЗ, На48,

Нбб, Не, Н7б, НВО, НаВ1, НВ, НОЇ ї НОЗ в області МН займають М, В, І, А, В, Е, О.І, К, А, М, Г,

О, Т, Е ї 5, відповідно, як в пПиЗОбМУНмі1. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НЗ8,

Н42, НаЗ, Н7б, Н8ЗЗ і НОЗ в області МН займають Н, Е, О, М, Т і 5, відповідно, як в пИЗзЗОбМНм2. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н1І2, НІ13, НІ17, Н24, НЗ8, На, Н42, Наз, Нав,

Нбвб, Не7, Н7б, НВО, НВ, Н82А, Н8З3, НОТ і НОЗ в області МН займають М, Б, І, А, В, В, Е, О, І, К,

А, М, І, 0, с, Т, Е ї 5, відповідно, як в ПИЗОбМНмУ1р. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ12, Н24, НЗ8, Н40, Н4З, Н48, Нб7, НВО, НЗ8З1, Н82А, Н8З3, НО! ї НОЗ в області УН займають М, А, В, В, 0, І, А, 1, О, С, Т, Е і 5, відповідно, як в пиИЗОбМНмМ1БАЇ 1. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н1І2, Н2г4, Н2г8, НЗ8, Н40, Н4З, Н48, Н54, НбО, Нб7, НВО,

Н81, Н82А, Н8ВЗ, НО! і НОЗ в області УН займають М, А, Т, В, В, О.І, 0, А, А, І, 0, С, Т, Є і 5, відповідно, як в ПИЗОбУНм5. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н1І2, Н2г4, Н28,

НЗ8в, Н4О, Н48, Н51, Н5Я4, НбО, Не?7, НВО, Н8З2А, НВ, НОТ і НОЗ в області МН займають У, А, Т, В,

В, І, М, 0, А, А, Ї, С, Т, Е ї 5, відповідно, як в ПИЗОбМНмУ1БА1186с2. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ12, Н24, Н2г8, НЗ8, Н40, Н4і8, Н54, НбО, Нб7, НвО, Н8В2А, НЗ3, НО1 і

НеОЗ в області МН займають М, А,Т,,вВ,Її,0,А,А,ї,а, т, Її 5, відповідно, як в пиЗзО6УНУТЬАНВ6НЗ. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ13, НІ17, Н2г4, Н29,

НЗ8в, Н4О, Н42, Н4З, Н5Я4, НОТ, Н7б, НВО, НЯ, Н82А, Н8З3, НОТ і НОЗ в області МН займають В, Ї,

А, Б, В, А, Е, О, М, Е, М, І, 0, С, Т, Е і 5, відповідно, як в ПиЗОбУНмуїс. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ3, НІ17, Н24, Н2г7, Н2г8, Н2г9, НЗО, НЗ8, Н4О, Н42, На4З, Н51, Н54,

Ко) НбО, НЄ, Н7б, НВО, НВ1, Н8З2А, Н8З3, НОТ і НОЗ в області УН займають В, Г, А, М, Т, Е, Т, В, В, Е,

О,М,0, А, Е, М.І, 0, С, Т, Е і 5, відповідно, як в пИиИЗзЗОбЄМНум14. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ0, НІ12, НІ17, Н24, Н2г8, НЗ8, Н40, Н42, Н4З, Нав, Н54, НО, НЄ, Н7б, НВО,

Н82А, НВ, НОТ, НОЗ, НІ108 і НІ109 в області МН займають О, М, І, А, Т, В, Б, Е, О, І, М, А, Е, М, Г.,

С, Т, Р, 5, Т ії, відповідно, як в пПиЗОбУНуїе. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення

НІТО, НІ12, НІ17, Н24, Н2г8, НЗ8, Н4О, Н4З, Н48, Н51, Н54, НбО, Не, Н8З2А, НВ, НО, НОЗ, НІ102,

НІТО08 ї НІ09 в області МН займають 0, М, І, А, Т, В, Б, 0, І, М, О, А, Е, С, Т, Е, 5, М, Ті, відповідно, як в пИЗОбМНм1ї. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НЗ8 і НОЗ в області МН займають В і 5, відповідно, як в пИЗОбМУНУЗ. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ17, Н27, Н2г9, НЗ8, НЄ, Н7б, Н8В2А і НОЗ в області МН займають Г, М, Е, Б, Е, М, Сі 5, відповідно, як в ПИЗОбЄМНУЗЬ. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ17, Н27,

Нг8, Н2г9, НЗО, НЗ8, Н51, Н5Б4, НбО, НОТ, Н7б, НВ2А і НОЗ в області МН займають ї, М, Т, Е, Т, В,

М, 0, А, Е, М, а ї 5, відповідно, як в пиЗОбМНмуЗс. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ12, НЗ8, Н40, Н4в8, Нбб, Нб7, Н7б, НВО, Н8В2А, Н8ВЗ і НОЗ в області МН займають М,

В, В, І.К, А, М, ГІ, а, Т ї 5, відповідно, як в ПИЗОбУНм4. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення Н1І2, Н17, Н2г7, Н2г9, НЗ8, Н4іО, НЄ, НВО, Н8В2А, Н8ВЗ і НОЗ в області МН займають М,

І, М, Е, В, В, Е, І, а, Т ї 5, відповідно, як в ПИЗОбМУНу4р. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення НІ12, Н17, Н27, Н2г8, Н2г9, НЗО, НЗ8, НО, Н51, Н54, НО, Не, НВО, Н82А, Н8З3 і НОЗ в області МН займають М, Г, М, Т, Е, Т, В, ЩА, М,0, А, Е, І, С, Т і 5, відповідно, як в пиИЗОбМУНм4с.

В деяких гуманізованих антитілах 306 щонайменше одне з наступних положень в області МІ займає амінокислота, як зазначено: І 36 займає І, І 37 займає І, і 1100 займає с. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення І 36, І 37 й область І 100 займають ГІ, І і С, відповідно.

В деяких гуманізованих антитілах 306 щонайменше одне з наступних положень в області МІ. займає амінокислота, як зазначено: 12 займає 5, і 145 займає К. В деяких гуманізованих антитілах 1306 положення І 12 і І 45 в області МІ займають 5 і К, відповідно.

В деяких гуманізованих антитілах 306 щонайменше одне з наступних положень в області МІ займає амінокислота, як зазначено: І 2 являє собою МУ або І, І 7 являє собою 5 або Т, 112 являє собою Р або 5, 115 являє собою | або І, 136 являє собою І, І 37 являє собою І, 145 являє собою В або К, І 60 являє собою 0 або 5, 1100 являє собою а.

В деяких гуманізованих антитілах 306 положення /12,136,137,14511100 в області МІ. 60 займають 5,1, Її, К і С, відповідно, як в пиЗОбМіІ мі. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення І 36,137 11100 в області МІ займають Г, І і С, відповідно, як в ПиИЗОбМІ м2. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення І 36,137,16011100 в області МІ займають І, І, 51 а, відповідно, як в ПИЗОбМІ у3. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення І2,17,112, 115,

Ї36,137,145117100 в області МІ займають І, Т, 5, І, І, І, К ї С, відповідно, як в пиЗОбМІі м4. В деяких гуманізованих антитілах 306 положення І2,17,112,115,136,137,14511100 в області

МІ займають М, 5, Р, І, І, В ії С, відповідно.

В деяких гуманізованих антитілах 306 варіабельна область важкого ланцюга характеризується ідентичністю послідовності людини 2 8595. В деяких гуманізованих антитілах 306 варіабельна область легкого ланцюга характеризується ідентичністю послідовності людини 2 8595. В деяких гуманізованих антитілах 306 кожна з варіабельної області важкого ланцюга та варіабельної області легкого ланцюга характеризується ідентичністю послідовності зародкової лінії людини 2 8595. В деяких гуманізованих антитілах 306 три СОВ важкого ланцюга є такими, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (ФЕО ІО МО: 8, 9 ї 10), і три СОВ легкого ланцюга є такими, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (5ЕО ІЮ

МО: 12, 13 ї 14); за умови, що положення Н27 займає Е або У, Н28 займає М або Т, положення

Н2г9 займає І або Е, положення НЗО займає К або Т, положення Н5І1 займає І або М, положення

Н5О4 займає М або О, положення НбО займає О або А, положення Нб1 займає Р або ЕЕ, ії положення НІТ02 займає Е або У. В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НІ згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ

МО: 42, 5БЕО І МО: 58, 5ЕО ІЮ МО: 69 або 5ЕО ІО МО: 60. В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НаІ згідно з Кеботом містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО ІЮ МО: 43,

ЗЕО ІО МО: 61, 5ЕБО 10 МО: 62, 5БО ІЮ МО: 63 або 5ЕО ІО МО: 64. В деяких гуманізованих антитілах 306 СОВ-НЗ згідно з Кеботом містить амінокислотну послідовність, що містить 5ЕО 10

МО: 65.

Ділянки СОВ таких гуманізованих антитіл можуть бути ідентичними або по суті ідентичними ділянкам СОМ 306. Ділянки СОВ можна визначити згідно з будь-яким загальноприйнятим визначенням (наприклад, Чотіа або зведеним визначенням Чотіа та Кебота), але, переважно, вони визначені згідно з визначенням Кебота.

Каркасні положення варіабельних областей відповідають нумерації Кебота, якщо не зазначено зворотне. Інші такі варіанти, зазвичай, відрізняються від послідовностей ілюстративних важкого та легкого ланцюгів Ни306б невеликою кількістю (наприклад, зазвичай, не більше 1, 2, 3, 5, 10 або 15) заміщень, делецій або вставок. Такі відмінності зазвичай присутні в каркасній ділянці, але можуть також виникати в СОВ.

Можливість додаткової варіації у гуманізованих варіантах 306 полягає у додаткових зворотних мутаціях в каркасних ділянках варіабельної області. Множина каркасних залишків, які не здійснюють контакт з СОВА в гуманізованому МАТ (моноклональному антитілі), можуть містити заміни амінокислот з відповідних положень донорного МАТ миші або інших антитіл миші або людини, і навіть багато залишків, що потенційно здійснюють контакт з СОВ, також піддаються заміні. Навіть амінокислоти в межах СОВ можна замінити, наприклад, залишками, що виявлені у відповідному положенні акцепторної послідовності людини, що використана для забезпечення каркасних ділянок варіабельної області. Крім цього, можна застосовувати альтернативні акцепторні послідовності людини, наприклад, для важкого та/або легкого ланцюгів. Якщо застосовують різні акцепторні послідовності, одну або декілька із зворотних мутацій, що рекомендовані вище, можна не здійснювати, оскільки відповідні донорні й акцепторні залишки вже є однаковими без зворотних мутацій.

Переважно, заміни або зворотні мутації у гуманізованих варіантах 306 (будь то консервативні або ні) не мають істотного ефекту відносно афінності зв'язування або активності гуманізованого МАТ, тобто, відносно його здатності зв'язуватися з тау.

Гуманізовані антитіла 306 додатково характеризуються здатністю зв'язуватися як з фосфорильованим, так і з нефосфорильованим тау та неправильно згорнутими/ агрегованими формами тау. р. Химерні та веновані антитіла

У даному винаході також запропоновані химерна та венована форми антитіл, які відмінні від антитіл людини, зокрема, антитіл 306 згідно з прикладами.

Химерне антитіло являє собою антитіло, в якому зрілі варіабельні області легкого та важкого ланцюгів антитіла, яке відмінне від антитіла людини (наприклад, миші), об'єднані з константними областями легкого та важкого ланцюгів людини. Такі антитіла по суті або повністю зберігають специфічність зв'язування антитіла миші та складаються приблизно на дві третини з послідовності людини. Згідно з варіантом реалізації химерне антитіло 306 містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 72 і амінокислотну послідовність легкого ланцюга 5ЕО ІО МО: 73.

Веноване антитіло являє собою тип гуманізованого антитіла, який зберігає деякі та зазвичай всі з СОВ і деякі з каркасних залишків варіабельної області, які відмінні від залишків людини, антитіла, яке відмінне від антитіла людини, але в якому інші каркасні залишки варіабельної області, що можуть вносити внесок у В- або Т-клітинні епітопи, наприклад, експоновані залишки (Радіап, Мої. Іттипої. 28: 489, 1991), замінені залишками з відповідних положень послідовності антитіла людини. Результатом є антитіло, в якому СОВА одержаний повністю або по суті з антитіла, яке відмінне від антитіла людини, і каркасні ділянки варіабельної області антитіла, яке відмінне від антитіла людини, є більше подібними людині завдяки замінам. Веновані форми антитіла 306 включені у даний винахід.

Е. Антитіла людини

Антитіла людини проти тау або його фрагмента (наприклад, залишків амінокислот 199 - 213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: 3, що відповідають залишкам амінокислот 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, 5ЕО ІЮО МО: 1) запропоновані за допомогою множини методик, що описані нижче.

Деякі антитіла людини відібрані за допомогою конкурентних аналізів зв'язування, за допомогою способу фагового дисплея згідно з Му/іпієї, див. вище, або іншим способом, щоб дані антитіла характеризувалися тією самою епітопною специфічністю, що і конкретне антитіло миші, таке як одне з моноклональних антитіл миші, що описані у прикладах. Можна також провести скринінг антитіл людини відносно конкретної епітопної специфічності за допомогою застосування як антиген-мішені тільки фрагмента тау, такого як фрагмент тау, що містить виключно залишки амінокислот 199-213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам амінокислот 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, 5ЕО ІЮ МО: 1), і/або за допомогою проведення скринінгу антитіл проти сукупності варіантів тау, таких як варіанти тау, що містять різні мутації в межах залишків амінокислот 199-213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам амінокислот 257 -271 або 320 - 334, відповідно, ФЕО ІО МО: 1).

Способи одержання антитіл людини включають спосіб триоми згідно з публікаціями

Оеєзібега єї а!., Нубгідота 2: 361-367 (1983); Оєзірегу, патент США Мо 4,634,664; і Епдіетанп ес! аї, патент США 4,634,666, застосування трансгенних мишей, що містять гени імуноглобуліну людини (див., наприклад, публікації І опрегуд еї аі., МО93/12227 (1993); 05 5,877,397; 05 5,874,299; 05 5,814,318; 05 5,789,650; 05 5,770,429; 005 5,661,016; 05 5,633,425; 005 5,625,126; 5 5,569,825; 05 5,545,806; Меийибегдег, Маї. ВіоїесппоЇї. 14: 826 (1996); ії Киспепараїі, МО 91/10741 (1991)), способи фагового дисплея (див., наприклад, публікації Юоуег єї аії, МО 91/17271; МеСанепу еї а. УМО 92/01047; 005 5,877,218; 05 5,871,907; 05 5,858,657; 05 5,37,242; 05 5,733,743; і 05 5,565,332); і способи, що описані у публікації МО 2008/081008 (наприклад, імморталізація В-клітин пам'яті, що виділені від людини, наприклад, за допомогою

ВЕБ (вірусу Епштейна-Барр), проведення скринінгу відносно бажаних властивостей та клонування й експресія рекомбінантних форм).

Е. Вибір константної області

Варіабельні області важкого та легкого ланцюгів химерного, венованого або гуманізованого антитіл можна приєднати до щонайменше частини константної області людини. Вибір константної області залежить частково від того, чи є бажаними антитілозалежна опосередкована клітинами цитотоксичність, антитілозалежний клітинний фагоцитоз і/або комплементзалежна цитотоксичність. Наприклад, ізотипи Ідаі ї (ДЗ людини характеризуються комплементзалежною цитотоксичністю, а ізотипи ІдСс2 і дСб4 людини - не характеризуються нею. да ї ІЗ людини також викликають більше потужні опосередковані клітинами ефекторні функції, ніж дС2 і (39204 людини. Константні області легких ланцюгів можуть являти собою лямбда або каппа. Системи нумерації для константних областей включають нумерацію ЄЮ (ЕдеІтап, СМ еї аї., Ргос. Май). Асай. ОБА, 63, 78-85 (1969)), нумерацію Кебота (КаБбаї,

Зедиеєпсев ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві (Маїйопаї Іпзійшевз ої Неапй, Веїйпезаа, МО, 1991), унікальну нумерацію ІМСТ (І еїтапс М.-Р. еї аї., ІМаТ ипідие питбетгіпа ог іттиподіобиїййп апа т сеїЇ гесеріог сопвіапі дотаїпе5 апа Ід зирепатіїу С-ІїКе дотаїпнв5, Оєм. Сотр. Іттипої!., 29, 185-203 (2005) і нумерацію екзонів ІМСТ (І еїтапс, посилання вище).

Одна або декілька амінокислот на аміно- або карбоксильному кінці легкого та/або важкого ланцюга, такі як С-кінцевий лізин важкого ланцюга, можуть бути відсутні або можуть бути дериватизованими в частині молекул або в усіх молекулах. В константні області можуть бути внесені заміни для зниження або підвищення ефекторної функції, такої як опосередкована комплементом цитотоксичність або АЗКЦ (див., наприклад, публікації М/іпівг єї аІ., патент США

Мо. 5,624,821; Т5о вї аІ., патент США Мо. 5,834,597; і І агаг єї аї., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 103: 60 4005, 2006), або для збільшення періоду напівжиття в людини (див., наприклад, публікацію

Ніпогп еї аї!., 9. Віої. Спет. 279: 6213, 2004). Ілюстративні заміни включають сзіп у положенні 250 і/або І єи у положенні 428 (в даному абзаці для константної області використовується нумерація

Е) для збільшення періоду напівжиття антитіла. Заміна у будь-якому або всіх положеннях 234, 235, 236 і/або 237 знижує афінність відносно рецепторів Еєу, зокрема, рецептора ЕсуВІ (див., наприклад, 05 6,624,821). Заміну аланіну у положеннях 234, 235 і 237 ІЇДСІ людини можна застосовувати для зниження ефекторних функцій. Деякі антитіла містять заміну аланіну у положеннях 234, 235 і 237 ІдДСІ людини для зниження ефекторних функцій. Необов'язково, положення 234, 236 і/або 237 в Їд22 людини заміщені аланіном, а положення 235 - глутаміном (див., наприклад, публікацію О5 5,624,821). В деяких антитілах застосовують мутацію в одному або декількох з положень 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329 і 331 ІдДСІ людини згідно з нумерацією ЕЄО. В деяких антитілах застосовують мутацію в одному або декількох з положень 318, 320 і 322 ІдаІ людини згідно з нумерацією Є). В деяких антитілах положення 234 і/або 235 заміщені аланіном, і/або положення 329 заміщене гліцином. В деяких антитілах положення 234 і 235 заміщені аланіном. В деяких антитілах ізотип являє собою Ідс2 або ІдД24 людини.

Антитіла можна експресувати у вигляді тетрамерів, що містять два легких і два важких ланцюги, у вигляді окремих важких ланцюгів, легких ланцюгів, у вигляді Раб, Раб", Е (ар)2 і Гм або у вигляді одноланцюжкових антитіл, в яких зрілі варіабельні домени важкого та легкого ланцюгів з'єднані за допомогою спейсера.

Константні області людини демонструють алотипову варіацію й ізоалотипову варіацію між різними індивідуумами; це означає, що константні області в різних індивідуумів можуть відрізнятися в одному або декількох поліморфних положеннях. Ізоалотипи відрізняються від алотипів тим, що сироватка, яка розпізнає ізоалотип, зв'язується з неполіморфною областю одного або декількох інших ізотипів. Таким чином, наприклад, інша константна область важкого ланцюга одержана з СітЗ ІДС з С-кінцевим лізином або без нього. Згадка про константну область людини включає константну область з будь-яким природним алотипом або будь-якою пермутацією залишків, що займають положення у природних алотипів. а. Експресія рекомбінантних антитіл

Відома множина способів одержання химерних і гуманізованих антитіл із застосуванням лінії клітин, що експресує антитіла (наприклад, гібридоми). Наприклад, варіабельні області

Зо імуноглобуліну антитіл можна клонувати та секвенувати із застосуванням добре відомих способів. В одному способі варіабельну область МН важкого ланцюга клонують за допомогою

ЗТ-ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції із зворотньою транскрипцією) із застосуванням мРНК, що одержана з клітин гібридоми. Консенсусні праймери застосовують відносно лідерного пептиду області МН, що містить кодон ініціації трансляції як 5'-праймера та специфічний до константної області 49425 3'-праймер. Ілюстративні праймери описані у публікації патенту СІЛА 5 2005/0009150 автора 5спепк 6ї аї. (тут і далі «бспепкК»). Послідовності з множини незалежно одержаних клонів можна порівняти, щоб переконатися, що протягом ампліфікації не були введені зміни.

Послідовність області МН можна також визначити або підтвердити за допомогою секвенування фрагмента УН, що одержаний за допомогою методології 5'-ВАСЕ ЗТ-ПЛР і 3 д2р- специфічного праймера.

Варіабельну область Мі легкого ланцюга можна клонувати аналогічним способом. Згідно з одним підходом розробляють набір консенсусних праймерів для ампліфікації областей МІ із застосуванням 5'-праймера, що розроблений для гібридизації з областю Мі, який містить кодон ініціації трансляції, та 3-праймера, що специфічний до області СК, нижче за течією від з'єднуючої області М-)У. Згідно з другим підходом для клонування кДНК, що кодує МІ, застосовують методологію 5'-ВАСЕ ЗТ-ПЛР. Ілюстративні праймери описані у публікації 5спепк, посилання вище. Потім клоновані послідовності об'єднують з послідовностями, що кодують константні області людини (або інших видів, що відмінні від людини).

Згідно з одним підходом варіабельні області важкого та легкого ланцюгів переконструюють, щоб вони кодували сплайс-донорні послідовності нижче за течією від відповідних сполук МОУ або У), і клонують у вектор експресії ссавця, такий як РСОМУ-Ну! для важкого ланцюга та рРсМУ-

Мсі для легкого ланцюга. Дані вектори кодують константні області у! і СК людини у вигляді екзонних фрагментів нижче за течією від вбудованої касети варіабельної області. Після підтвердження послідовності клітини СНО можна котрансфікувати векторами експресії важкого ланцюга та легкого ланцюга для одержання химерних антитіл. Кондиціоноване середовище збирають через 48 годин після трансфекції й аналізують методом вестерн-блотингу відносно продукції антитіла або методом ЕГІ5ЗА відносно зв'язування з антигеном. Химерні антитіла є гуманізованими, як описано вище.

Химерні, веновані, гуманізовані антитіла й антитіла людини, зазвичай, одержують за допомогою рекомбінантної експресії. Рекомбінантні полінуклеотидні конструкції, зазвичай, містять послідовність контролю експресії що функціонально пов'язана з кодуючими послідовностями ланцюгів антитіла, включаючі зв'язані у природі або гетерологічні елементи контролю експресії, такі як промотор. Послідовності контролю експресії можуть являти собою системи промоторів у векторах, що здатні до трансформації або трансфекції еукаріотичних або прокаріотичних клітин-хазяїнів. Після того як вектор був вбудований у відповідного хазяїна, хазяїна підтримують в умовах, що підходять для високого рівня експресії нуклеотидних послідовностей та збирання й очищення перехресно-реактивних антитіл.

Дані вектори експресії, зазвичай, є реплікованими в організмах хазяїнів у вигляді епісом або складової частини хромосомної ДНК хазяїна. Зазвичай вектори експресії містять селективні маркери, наприклад, стійкість до ампіциліну або стійкість до гігроміцину, щоб забезпечити виявлення тих клітин, які були трансформовані бажаними послідовностями ДНК.

Е. соїї являє собою один із прокаріотичних хазяїнів, що придатні для експресії антитіл, зокрема, фрагментів антитіла. Мікроорганізми, такі як дріжджі, також придатні для експресії.

Засспаготусе5 являє собою дріжджового хазяїна з підходящими векторами, які за бажанням містять послідовності контролю експресії, точку початку реплікації, послідовності термінації та т.п. Типові промотори включають З3-фосфогліцераткіназу й інші гліколітичні ферменти.

Індуцибельні промотори дріжджів включають, серед інших, промотори з алкогольдегідрогенази, ізоцитохрому С і ферментів, що відповідають за утилізацію мальтози та галактози.

Клітини ссавців можна застосовувати для експресії нуклеотидних сегментів, що кодують імуноглобуліни або їх фрагменти. Див. керівництво М/іппаскег, Егот Сепев юю Сіопез, (МСН

Рибріїзнегз, МУ, 1987). Було розроблено множину підходящих ліній клітин-хазяїнів, що здатні секретувати інтактні гетерологічні білки, і такі лінії клітин-хазяїнів включають лінії клітин СНО, різні лінії клітин СОБ5, клітини Неї а, клітини НЕК293, І -клітини та мієломи, що не продукують антитіла, включаючи брг/0 і М50О. Клітини можуть бути відмінними від клітин людини. Вектори експресії для даних клітин можуть містити послідовності контролю експресії, такі як точка початку реплікації, промотор, енхансер (О!йееп еї аї., Іттипої. Вем. 89:49 (1986)), і необхідні інформаційні сайти процесингу, такі як сайти зв'язування рибосоми, сайти сплайсингу РНК,

Зо сайти поліаденілування та послідовності термінатора транскрипції. Послідовності контролю експресії можуть містити промотори, що одержані з ендогенних генів, цитомегаловірусу, 5М40, аденовірусу, бичачого папіломавірусу та т.п. Див. публікацію Со еї аї.,.). Іттипої. 148: 1149 (1992).

Як альтернатива, послідовності, що кодують антитіло, можна вбудувати у трансгени для введення в геном трансгенної тварини та наступної експресії в молоко трансгенної тварини (див., наприклад, патент США Мо 5,741,957; патент США Мо 5,304,489; і патент США Мо 5,849,992). Підходящі трансгени включають кодуючі послідовності для легкого та/або важкого ланцюгів, які функціонально пов'язані з промотором й енхансером із гена, специфічного до молочної залози, такого як казеїн або бета-лактоглобулін.

Вектори, що містять сегменти ДНК, які представляють інтерес, можна перенести у клітину- хазяїна способами, які залежать від типу клітинного хазяїна. Наприклад, для прокаріотичних клітин зазвичай застосовують трансфекцію на основі хлориду кальцію, у той час як для інших клітинних хазяїнів можна застосовувати обробку фосфатом кальцію, електропорацію, ліпофекцію, балістичну трансфекцію або трансфекцію на основі вірусів. Інші способи, що використовуються для трансформації клітин ссавців, включають в себе застосування полібрену, злиття протопластів, ліпосом, електропорацію та мікроін'єкцію. Для одержання трансгенних тварин трансгени можна мікроін'єктгувати в запліднені ооцити або можна вбудувати в геном ембріональних стовбурових клітин, й ядро таких клітин перенести в енуклейовані ооцити.

Після введення вектора або векторів, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіла, у клітинну культуру, можна провести скринінг пулів клітин відносно продуктивності зростання й якості продукту у безсироватковому середовищі. Потім пули клітин з високою продуктивністю можна піддати одноклітинному клонуванню на основі ЕАС5 для створення моноклональних ліній.

Можна застосовувати питомі продуктивності більше 50 пг або 100 пг на клітину в день, що відповідає титрам продукту більше 7,5 г/л культури. Антитіла, що продукуються одноклітинними клонами, також можна досліджувати відносно каламутності, фільтраційних властивостей методом ПААГ (електрофорезу у поліакриламідному гелі), ІЕФ (ізоелектричного фокусування), сканування в Уф-області, високоефективної ексклюзійної хроматографії (ВЕЕХ), вуглеводно- олігосахаридного картування, мас-спектрометрії й аналізу зв'язування, такого як ЕГІЗА або

Віасоге. Відібраний клон можна потім використовувати для створення банку клітин у множині бо флаконів і зберігати у замороженому вигляді для подальшого використання.

Після експресії антитіла можуть бути очищені відповідно до стандартних способів, що відомі у даній галузі технікию, включаючи захоплення білком А, очищення ВЕРХ, колоночну хроматографію, гель-електрофорез і т.п. (див., у загальних рисах, керівництво 5соревз, Ргоївїп

Ритпіїсайоп (Зргіпдег-Мепад, МУ, 1982)).

Можна застосовувати методології для комерційного одержання антитіл, включаючи оптимізацію кодона, відбір промоторів, відбір елементів транскрипції, відбір термінаторів, безсироваткове одноклітинне клонування, створення банків клітин, використання селективних маркерів для ампліфікації числа копій, термінатор СНТ або поліпшення титрів білків (див., наприклад, публікації О5 5,786,464; 005 6,114,148; 05 6,063,598; 05 7,569,339; Уу02004/050884;

Му02008/012142; М02008/012142; М/02005/019442; М/02008/107388; УУ02009/027471; ії 05 5,888,809).

ІМ. Активні імуногени

Засіб, що застосовується для активної імунізації, виступає для індукції у пацієнта тих самих типів антитіла, як описано вище стосовно до пасивної імунізації. Засоби, що застосовуються для активної імунізації, можуть відноситися до тих самих типів імуногенів, які застосовують для продукції моноклональних антитіл у лабораторних тварин, наприклад, пептид із З - 15, або 3-12, або 5-12, або 5-8 суміжних амінокислот з області тау, що відповідає залишкам 199 - 213 або 262 - 276 ЗЕО ІО МО: З (відповідають залишкам 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, ФЕО ІЮО МО: 1), такий як, наприклад, пептид, що містить залишки 199 - 213 або 262 - 276 5ЕО ІЮО МО: З (відповідають залишкам 257 - 271 або 320 -334, відповідно, «ЕС ІЮО МО: 1). Для індукції антитіл, що зв'язуються з тим самим або епітопом, який перекривається, що і 306, можна картувати специфічність епітопу для даних антитіл (наприклад, за допомогою дослідження зв'язування з серіями пептидів, які перекриваються, що охоплюють тау). Потім фрагмент тау, що складається з епітопу, або що містить епітоп, або який перекривається з епітопом, можна застосовувати як імуноген. Такі фрагменти, зазвичай, застосовують у нефосфорильованій формі.

Гетерологічний носій і ад'ювант у випадку використання можуть бути такими самими, які застосовували для одержання моноклонального антитіла, але можуть також бути вибраними для кращої фармацевтичної придатності з метою застосування в людини. Підходящі носії включають сироваткові альбуміни, гемоціанін фісурели, молекули імуноглобуліну, тироглобулін,

Зо овальбумін, правцевий анатоксин або анатоксин іншої патогенної бактерії, такий як дифтерійний анатоксин (наприклад, САМ197), анатоксин Е. соїї, холерний або Н. руйоїгї, або атенуйована похідна токсину. Т-клітинні епітопи також є підходящими молекулами-носіями.

Деякі кон'югати можуть бути утворені за допомогою зв'язування засобів згідно з даним винаходом з імуностимулюючою полімерною молекулою (наприклад, трипальмітоїл-8-гліцерин цистеїном (РатзСуз), маннаном (полімером маннози) або глюканом (В1-22 полімер)), цитокінами (наприклад, ІЛ-1, альфа- і В-пептидами І1Л-1, ІЛ-2, уУ-ІФН, ІЛ-10, ГМ-КоФ (гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором)) і хемокінами (наприклад,

МІР 1-о ії ВД, ї ВАМТЕ5). Імуногени можуть бути з'єднані з носіями за допомогою спейсерних амінокислот (наприклад, діу-діу) або без них. Додаткові носії включають вірусоподібні частинки.

Вірусоподібні частинки (ВПУ), що також звуться псевдовіріонами або частинками, що одержані з вірусів, являють собою суб'одиничні структури, що складаються з множини копій вірусного капсида та/або білка оболонки, що здатний до самозбирання іп мімо у ВПЧ певної сферичної симетрії. (Ром/ПШеїйї, єї аї., (2007) Рі о5 ОМЕ 2 (5): е415.) Як альтернатива, пептидні імуногени можна приєднати до щонайменше одного штучного Т-клітинного епітопу, що здатний до зв'язування з великою частиною молекул МНС Класу Ії, такого як універсальний ОВ-епітоп («РАЮОВЕ»). РАОВЕ, що описаний у публікаціях О5 5,736,142, МО 95/07707 й АІехапаег" У еї аї.,

Іттипйу, 1: 751-761 (1994). Активні імуногени можуть бути представлені у мультимерній формі, в якій множина копій імуногена та/або його носія представлені у вигляді однієї ковалентної молекули.

Фрагменти часто вводять з фармацевтично прийнятними ад'ювантами. Ад'ювант підвищує титр індукованих антитіл й/"або афінність зв'язування індукованих антитіл у порівнянні з ситуацією, коли пептид застосовують сам по собі. Множину ад'ювантів можна застосовувати у комбінації з імуногенним фрагментом тау для виклику імунної відповіді. Переважні ад'юванти збільшують внутрішню відповідь на імуноген, не викликаючи конформаційних змін в імуногені, які впливають на якісну форму відповіді. Переважні ад'юванти включають солі алюмінію, такі як гідроксид алюмінію та фосфат алюмінію, З Ое-О-ацильований монофосфорил-ліпід А (МРІ тм) (див. ЕВ 2220211 (ВІВІ ІттипоСНет Резеагсі Іпс., Гамільтон, Монтана, зараз частина Сотіха).

ЗійтШоп'"М 035 -21 являє собою тритерпеновий глікозид або сапонін, що виділений з кори дерева Опціазда Заропагіа Моїїпа, що росте у Південній Америці (див. публікацію Кепзвії єї аї., іп 60 Массіпе Оезідп: Тне Зирипії апа Адіимапі Арргоасі (ед5. Роуеї! 5 Мемлтап, Ріепит Ргев5, МУ,

1995); О05 5,057,540), (Адийа ВіоРнаптасешіса!5, Фрамінгем, Масачусетс; зараз Апіідепісв, Іпс.,

Нью-Йорк, Нью-Йорк). Інші ад'юванти являють собою емульсію «олія у воді» (такі як сквален або арахісова олія), необов'язково у комбінації з імуностимулюючими засобами, такими як монофосфорил-ліпід А (див. публікацію 5іоціє еї а), М. Епді. У. Мей. 336, 86-91 (1997), плюронікові полімери і вбиті мікобактерії. Ад'юванти Вірі являють собою емульсії «олія у воді».

Вірі містить метаболізовану олію (сквален), що емульгована з сольовим розчином, який містить

Тмееп 80. Вірі також містить очищені мікобактеріальні продукти, які діють як імуностимулюючі засоби, і бактеріальний монофосфорил-ліпід А. Іншим ад'ювантом є Сроа (МО 98/40100).

Ад'юванти можна вводити у вигляді компонентів терапевтичної композиції спільно з активним засобом або можна вводити окремо перед, під час або після введення терапевтичного засобу.

Також можна застосовувати аналоги природних фрагментів тау, які індукують антитіла проти тау. Наприклад, у таких пептидах одну або декілька, або всі І -амінокислоти можна замінити О- амінокислотами. Також можна змінити порядок амінокислот на протилежний напрямок (ретро- пептид). Необов'язково, пептид містить всі ЮО-амінокислоти у зворотному порядку (ретро- інверсований пептид). Пептиди й інші сполуки, які необов'язково характеризуються значною подібністю амінокислотній послідовності з пептидами тау, але, незважаючи на це, виступають як міметики пептидів тау й індукують аналогічну імунну відповідь. Також можна застосовувати антиїдіотипові антитіла проти моноклональних антитіл проти тау, як описано вище. Такі анти-їа антитіла імітують антиген і викликають утворення імунної відповіді проти нього (див. публікацію

Евзепійда! Іттипоіоау, Роїї єд., Віаскуєї! бсіепійіс Рибіїсайопв5, Раїо Ао, СА бій єд., Р. 181).

Пептиди (ї, необов'язково, носій, що злитий з пептидом) також можна вводити у формі нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, й експресувати у пацієнті іп 5йи. Сегмент нуклеїнової кислоти, що кодує імуноген, зазвичай, приєднаний до регуляторних елементів, таких як промотор й енхансер, які забезпечують експресію сегмента ДНК у призначених клітинах- мішенях пацієнта. Для експресії в клітинах крові, що є бажаним для індукції імунної відповіді, елементи промотора й енхансера з генів легкого або важкого ланцюгів імуноглобуліну або основного негайно-раннього промотора й енхансера ЦМВ (цитомегаловірусу) є підходящими для прямої експресії. Зв'язані регуляторні елементи та кодуючі послідовності часто клонують у векторі. Антитіла також можна вводити у формі нуклеїнових кислот, що кодують важкий та/або

Зо легкий ланцюги антитіла. Якщо присутній як важкий, так і легкий ланцюги, ланцюги переважно з'єднують у вигляді одноланцюжкового антитіла. Антитіла для пасивного введення можна також одержати, наприклад, за допомогою афінної хроматографії з сироватки пацієнтів, які отримували пептидні імуногени.

ДНК можна доставити в «оголеній» формі (тобто без колоїдних або інкапсулюючих матеріалів). Як альтернатива, можна застосовувати декілька систем вірусних векторів, включаючи ретровірусні системи (див., наприклад, публікацію Іамліє апа Титіп, Сиг. Оріп.

Сепеї. Оємепіор. 3, 102-109 (1993)); аденовірусні вектори (див., наприклад, публікацію Вей еї аї.,

У. Мігої. 67, 591 1 (1993)); аденоасоційовані вірусні вектори (див., наприклад, публікацію 7пои єї а. У. Ехр. Мей. 179, 1867 (1994)), вірусні вектори з сімейства покс, включаючи вірус вісповакцини та поксвіруси птахів, вірусні вектори з роду альфа-вірусів, такі як такі, що одержані з вірусів Сіндбіс і вірусу лісу Семліки (див., наприклад, публікацію ЮибепзекКу еї аї., у. Мікої. 70, 508-519 (1996)), вірус венесуельського енцефаліту коней (див. 05 5,643,576) і рабдовіруси, такі як вірус везикулярного стоматиту (див. МО 96/34625) і папіломавіруси (ОнНе еєї аі!., Нитап Сепе

ТНнегару 6, 325-333 (1995); М/со еї а!І., МО 94/12629 і Хіао 8 Вгапазта, Мисієїс Асідз. Вев5. 24, 2630-2622 (1996)).

ДНК, що кодує імуноген, або вектор, що містить ДНК, можна упаковувати в ліпосоми.

Підходящі ліпіди та споріднені аналоги описані у публікаціях 05 5,208,036, 05 5,264,618, 5 5,279,833 ії 05 5,283,185. Вектори та ДНК, що кодує імуноген, можна також нанести на носії у формі частинок або зв'язати з такими носіями, приклади яких включають полімери на основі поліметилметакрилату та полілактиди, а також полі(лактид-ко-гліколід) (див., наприклад, публікацію Месеєвє евї аї., у). Місто Епсар. 1996).

Н. Скринінгові аналізи антитіл

Можна спочатку провести скринінг антитіл відносно призначеної специфічності зв'язування, як описано вище. Аналогічним способом можна провести скринінг активних імуногенів відносно здатності індукувати антитіла з такою специфічністю зв'язування. У даному випадку активний імуноген застосовують для імунізації лабораторних тварин, і сироватку, що одержана в результаті, досліджують відносно відповідної специфічності зв'язування.

Потім антитіла, які характеризуються бажаною специфічністю зв'язування, можна досліджувати на клітинних моделях і моделях на тваринах. Клітини, які застосовують для такого бо скринінгу, переважно, являють собою нейронні клітини. Повідомлялося про клітинну модель патології тау, в якій клітини нейробластоми трансфікували доменом чотирьох повторів тау, необов'язково з мутацією, що пов'язана з патологією тау (наприклад, дельта К280, див. публікацію КНіївішипома, Ситепі АІ2иеітег Везєатгси 4, 544-546 (2007)) В іншій моделі тау індукують в лінії клітин нейробластоми М2а за допомогою додавання доксицикліну. Клітинні моделі дозволяють вивчити токсичність тау відносно клітин у розчинному або агрегованому стані, виникнення агрегатів тау після включення експресії гена тау, розчинення агрегатів тау знову після виключення експресії гена й ефективність антитіл при інгібуванні утворення агрегатів тау або їх дезагрегації.

Також можна проводити скринінг антитіл або активних імуногенів на моделях захворювань, що пов'язані з тау, на трансгенних тваринах. Такі трансгенні тварини можуть містити трансгени тау (наприклад, будь-яку з ізоформ людини) та необов'язково трансген АРР людини, серед інших, такий як кіназа, яка фосфорилює тау, АроЕ, пресенілін або альфа-синуклеїн. Такі трансгенні тварини схильні до розвитку щонайменше однієї ознаки або симптому захворювання, що пов'язаний з тау.

Ілюстративна трансгенна тварина являє собою лінію мишей КЗ (ПНпег еї аї., Ргос. Маї!. Асад.

Зсі. ОБА 105 (41): 15997-6002 (2008)). Дані миші містять трансген тау людини з мутацією К 369 І (мутація пов'язана з хворобою Піка) та промотор Тпу 1.2. Дана модель демонструє швидкий перебіг нейродегенерації, руховий дефект і дегенерацію аферентних волокон і гранулярних клітин мозочка. Інша ілюстративна тварина являє собою лінію мишей УМРІ 3. Дані миші містять трансген тау людини з мутацією РЗОТІ (мутація пов'язана з лобно-скроневою деменцією) та промотор ТНу 1.2 (Тасопіс, Септапіомп, М.У., І ем/ів, еї аї!., Маї Сепеї. 25: 402-405 (2000)). Дані миші характеризуються більше ступінчастим перебігом нейродегенерації. У мишей розвиваються нейрофібрилярні клубки в декількох областях головного мозку та спинного мозку, публікація повністю включена за допомогою посилання. Дана модель являє собою чудову модель для дослідження наслідків розвитку клубків і для скринінгової терапії, яка може інгібувати утворення даних агрегатів. Іншою перевагою даних тварин є відносно рання маніфестація патології. У гомозиготній лінії можна спостерігати поведінкові аномалії, що пов'язані з патологією тау, щонайменше вже у З місяці, але тварини залишаються відносно здоровими щонайменше до віку 8 місяців. Іншими словами, у 8 місяців тварини пересуваються, харчуються та можуть виконувати поведінкові завдання досить добре для забезпечення моніторингу ефектів лікування. Активна імунізація даних мишей протягом 6-13 місяців за допомогою АЇ м! КІ Н-РНЕ-1 дозволяла одержати титри приблизно 1000 і продемонструвала більше рідкі нейрофібрилярні клубки, менше роег422 і зменшене зниження ваги у порівнянні з контрольними мишами, які не отримували лікування.

Активність антитіл або активних засобів можна оцінити за допомогою різних критеріїв, включаючи зниження кількості сумарного тау або фосфорильованого тау, зниження інших патологічних характеристик, таких як відкладення амілоїду АВ, й інгібування або відтермінування поведінкового дефіциту. Активні імуногени також можна досліджувати відносно індукції антитіл в сироватці. Як пасивні, так й активні імуногени можна досліджувати відносно проходження антитіл крізь гематоенцефалічний бар'єр у головний мозок трансгенної тварини.

Антитіла або фрагменти, що індукують антитіло, можна також досліджувати на приматах, що відмінні від людини, в яких природним шляхом або в результаті індукції розвиваються симптоми захворювань, які характеризуються тау. Дослідження відносно антитіла або активного засобу зазвичай проводять у поєднанні з контролем, в якому проводять паралельний експеримент, за винятком того, що антитіло або активний засіб відсутній (наприклад, замінені наповнювачем).

Потім зниження, відтермінування або інгібування ознак або симптомів захворювання, що викликається антитілом або активним засобом, дослідження якого проводять, можна оцінити у порівнянні з контролем.

У. Пацієнти, що піддаються лікуванню

Присутність нейрофібрилярних клубків була виявлена при декількох захворюваннях, включаючи хворобу Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинну вікову таупатію, постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматичну деменцію або деменцію боксерів, хворобу Піка, хворобу Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скроневу деменцію, лобно-скроневу лобарну дегенерацію, хворобу аргірофільних зерен, глобулярну гліальну таупатію, аміотрофічний латеральний склероз/ комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико- базальну дегенерацію (КБД), деменцію з тільцями Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (/ВМАЮ) і прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП). Режими згідно з даним винаходом можна також застосовувати при лікуванні або профілактики будь-якого з даних захворювань. Через причини широко поширеної асоціації між неврологічними захворюваннями бо та станами і тау режими згідно з даним винаходом можна застосовувати при лікуванні або профілактиці у будь-якого суб'єкта, в якого спостерігаються підвищені рівні тау або фосфорильованого тау (наприклад, в СМР), у порівнянні з середнім значенням в індивідуумів без неврологічних захворювань. Режими згідно з даним винаходом можна також застосовувати при лікуванні або профілактиці неврологічного захворювання в індивідуумів, що містять мутацію в тау, яка пов'язана з неврологічним захворюванням. Способи згідно з даним винаходом є особливо підходящими для лікування або профілактики хвороби Альцгеймера, й особливо у пацієнтів.

Пацієнти, що піддаються лікуванню, включають індивідуумів, які піддані ризику розвитку захворювання, але в яких не спостерігаються симптоми, а також пацієнтів, у яких на сьогоднішній день спостерігаються симптоми. Пацієнти, що піддані ризику розвитку захворювання, включають таких, які піддані відомого генетичного ризику розвитку захворювання. Такі індивідууми включають таких, родичі яких страждали від даного захворювання, і таких, ризик яких був визначений в результаті аналізу генетичних або біохімічних маркерів. Генетичні маркери ризику включають мутації в тау, такі як мутації, що обговорювалися вище, а також мутації в інших генах, що поєднані з неврологічним захворюванням. Наприклад, алель АроЕЯ4 у гетерозиготній, а ще більше у гомозиготній формі пов'язаний з ризиком розвитку хвороби Альцгеймера. Інші маркери ризику хвороби

Альцгеймера включають мутації в гені АРР, зокрема, мутації у положенні 717 і положеннях 670 і 671, які називають мутаціями Нагау та бугедізі, відповідно, мутації в генах пресеніліну, РО і

РБ2, сімейний анамнез ХА (хвороби Альцгеймера), гіперхолестеринемію або атеросклероз.

Індивідуумів, які на сьогоднішній день страждають від хвороби Альцгеймера, можна розпізнати за допомогою візуалізації ПЕТ, на основі характерної деменції, а також присутності факторів ризику, що описані вище. Крім цього, для ідентифікації індивідуумів, які страждають від ХА, доступна множина діагностичних тестів. Дані тести включати вимірювання рівнів тау або фосфо-тау й АВ42 в СМР. Підвищені рівні тау або фосфо-тау та знижені рівні АВ42 свідчать про присутність ХА. Деякі мутації пов'язані з хворобою Паркінсона. З хворобою Паркінсона пов'язані

АіазоРго або АІа53 або мутації в інших генах, таких як кіназа з повторами РАВК8, що багаті лейцином. Будь-яке з неврологічних захворювань, що згадані вище, можна також діагностувати в індивідуумів на основі критеріїв О5М ІМ ТА (Оіадповіїс апа еїаїївіса! Мапиа! ої Мепіаї!

Зо Рівогаегв5, Топ еайоп, їехі гемібвіоп, Діагностичне та статистичне керівництво з психічних розладів, четверта редакція, переглянута).

У безсимптомних пацієнтів лікування можна починати у будь-якому віці (наприклад, 10, 20, 30). Однак зазвичай необов'язково починати лікування до тих пір, поки пацієнт не досягне віку 40, 50, 60 або 70 років. Лікування, зазвичай, передбачає декілька доз протягом періоду часу.

Лікування можна контролювати за допомогою оцінки рівнів антитіла протягом часу. Якщо відповідь знижується, показана бустер-доза. У випадку потенційних пацієнтів з синдромом

Дауна лікування можна почати до народження за допомогою введення терапевтичного засобу матері або відразу після народження.

Ї. Нуклеїнові кислоти

У даному винаході також запропоновані нуклеїнові кислоти, що кодують будь-який з важкого та легкого ланцюгів, що описані вище (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 7, 11, 15-19 і 5ЕО ІЮ МО: 20-23,

ЗЕО Ір МО: 46-57 ії 5ЕО ІЮО МО: 66). Необов'язково, такі нуклеїнові кислоти також кодують сигнальний пептид, і їх можна експресувати з сигнальним пептидом, що приєднаний до константної області. Кодуючі послідовності нуклеїнових кислот можуть бути функціонально пов'язані з регуляторними послідовностями для забезпечення експресії кодуючих послідовностей, таких як промотор, енхансер, сайт зв'язування рибосоми, сигнал термінації транскрипції та т.п. Нуклеїнові кислоти, що кодують важкий та легкий ланцюги, можуть існувати у виділеній формі або їх можна клонувати в одному або декількох векторах. Нуклеїнові кислоти можна синтезувати за допомогою, наприклад, твердофазного синтезу або ПЛР з олігонуклеотидами, що перекриваються. Нуклеїнові кислоти, що кодують важкий та легкий ланцюги, можна з'єднати у вигляді однієї безперервної нуклеїнової кислоти, наприклад, у векторі експресії, або такі нуклеїнові кислоти можуть бути окремими, наприклад, кожну з них клонують у свій власний вектор експресії.

У. Кон'юговані антитіла

Кон'юговані антитіла, які специфічно зв'язуються 3 антигенами, такими як тау, є підходящими для визначення присутності тау; контролю й оцінки ефективності терапевтичних засобів, що застосовуються для лікування пацієнтів, у яких була діагностована хвороба

Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинна вікова таупатія, постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматична деменція або деменція боксерів, хвороба 60 Піка, хвороба Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скронева деменція, лобно-

скронева лобарна дегенерація, хвороба аргірофільних зерен, глобулярна гліальна таупатія, аміотрофічний латеральний склероз/ комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальна дегенерація (КБД), деменція з тільцями Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ІІВУАВД) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП); для інгібування або зниження агрегації тау; інгібування або зниження утворення волокон тау; зниження або усунення відкладень тау; стабілізації нетоксичних конформацій тау; або лікування або здійснення профілактики хвороби

Альцгеймера, синдрому Дауна, легкого когнітивного порушення, первинної вікової таупатії, постенцефалітичного паркінсонізму, посттравматичної деменції або деменції боксерів, хвороби

Піка, хвороби Німана-Піка типу С, над'ядерного паралічу, лобно-скроневої деменції, лобно- скроневої лобарної дегенерації, хвороби аргірофільних зерен, глобулярної гліальної таупатії, аміотрофічного латерального склерозу/ комплексу паркінсонізм-деменція Гуам, кортико- базальної дегенерації (КБД), деменції з тільцями Леві, варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМАБВ) або прогресуючого над'ядерного паралічу (ПНП) у пацієнта. Наприклад, такі антитіла можна кон'югувати з іншими терапевтичними агентами, іншими білками, іншими антитілами та/або мітками, що виявляються. Див. публікації УМО 03/057838; 05 8,455,622. Такі терапевтичні агенти можуть являти собою будь-який засіб, який можна застосовувати для лікування, боротьби, полегшення, запобігання або поліпшення небажаного стану або захворювання у пацієнта, такого як хвороба Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинна вікова таупатія, постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматична деменція або деменція боксерів, хвороба Піка, хвороба Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скронева деменція, лобно-скронева лобарна дегенерація, хвороба аргірофільних зерен, глобулярна гліальна таупатія, аміотрофічний латеральний склероз/ комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальна дегенерація (КБД), деменція з тільцями

Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ІВМАО) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП).

Кон'юговані терапевтичні агенти можуть включати цитотоксичні засоби, цитостатичні засоби, нейротрофічні засоби, нейропротекторні засоби, радіотерапевтичні засоби, імуномоделюючі засоби або будь-які біологічно активні засоби, які полегшують або посилюють активність антитіла. Цитотоксичний засіб може являти собою будь-який засіб, який є токсичним відносно

Зо клітини. Цитостатичний засіб може являти собою будь-який засіб, який інгібує проліферацію клітин. Нейротрофічний засіб може являти собою будь-який засіб, включаючі хімічні або білкові засоби, який стимулює збереження, зростання або диференціацію нейронів.

Нейропротекторний засіб може являти собою засіб, включаючі хімічні або білкові засоби, який захищає нейрони від гострого інсульту або дегенеративних процесів. Імуномодулятор може являти собою будь-який засіб, який стимулює або інгібує розвиток або підтримання імунологічної відповіді. Радіотерапевтичний засіб може являти собою будь-яку молекулу або сполуку, яка випускає випромінювання. Якщо такі терапевтичні агенти з'єднані зі специфічним антитілом проти тау, таким як антитіла, що описані у даному документі, приєднані терапевтичні агенти будуть мати специфічну афінність відносно клітин, що уражені захворюванням, яке викликане тау, у порівнянні з нормальними клітинами. Як наслідок, введення кон'югованих антитіл безпосередньо націлюється на клітини раку з мінмальним пошкодженням навколишньої нормальної здорової тканини. Даний підхід може бути особливо підходящим для терапевтичних агентів, які є занадто токсичними, щоб їх можна було вводити самі по собі. Крім цього, можна застосовувати більше низькі кількості терапевтичних агентів.

Деякі такі антитіла можна модифікувати, щоб вони діяли як імунотоксини. Див., наприклад, патент США Мо 5,194,594. Наприклад, рицин, клітинний токсин, що одержаний з рослин, можна об'єднати З антитілами із застосуванням біфункціональних реактивів 5- ацетилмеркаптобурштинового ангідриду для антитіла та сукцинімідил 3-(2- піридилдитіо)упропіонату для рицину. Див. публікацію Рієїег57 єї аі!., Сапсег Вев. 48 (16): 4469- 4476 (1998). Об'єднання призводить до втрати зв'язуючої активності В-ланцюга рицину, при цьому не порушуючи ні токсичний потенціал А-ланцюга рицину, ні активність антитіла.

Аналогічно, сапорин, інгібітор збирання рибосом, можна приєднати до антитіл за допомогою дисульфідного зв'язку між сульфгідрильними групами, що введені хімічним способом. Див. публікацію Роїйно єї аї, еиКкетіа 18: 1215-1222 (2004).

Деякі такі антитіла можна приєднати до радіоактивних ізотопів. Приклади радіоактивних ізотопів включають, наприклад, ітрійто (903), індій!""! (1111й), І, тТс, радіоактивне срібло-111, радіоактивне срібло-199 і бісмут-!3. Приєднання радіоактивних ізотопів до антитіл можна здійснити за допомогою загальноприйнятих біфункціональних хелатів. Для приєднання радіоактивного срібла-111 і радіоактивного срібла-199 можна застосовувати лінкери на основі бо сірки. Див. публікацію Нага єї аї, Сеї! Віорпуз. 24-25: 1-7 (1994). Приєднання радіоактивних ізотопів срібла може включати відновлення імуноглобуліну аскорбіновою кислотою. Для радіоактивних ізотопів, таких як 1111й ї 90У, можна застосовувати ібритутомаб тіуксетан, який буде вступати в реакцію з такими ізотопами з утворенням 111 ПІп-ібритутомабу тіуксетану та 90У- іоритутомабу тіуксетану, відповідно. Див. публікацію УМйгід, Сапсег СпетоїНег. РНаптасої!., 48 зи,ррі 1: 591-595 (2001).

Деякі такі антитіла можна приєднати до інших терапевтичних агентів. Такі терапевтичні агенти можуть бути, наприклад, цитотоксичними, цитостатичними, нейротрофічними або нейропротекторними. Наприклад, антитіла можна кон'юговати З токсичними хіміотерапевтичними лікарськими препаратами, такими як майтансин, гелданаміцин, інгібітори тубуліну, такі як засоби, що зв'язують тубулін (наприклад, ауристатини), або засоби, що зв'язуються з малою борозною, такі як каліхеаміцин. Інші типові терапевтичні агенти включають засоби, які, як відомо, є підходящими для лікування, ведення або полегшення хвороби

Піка, хвороби Німана-Піка типу С, над'ядерного паралічу, лобно-скроневої деменції, лобно- скроневої лобарної дегенерації, хвороби аргірофільних зерен, глобулярної гліальної таупатії, аміотрофічного латерального склерозу/ комплексу паркінсонізм-деменція Гуам, кортико- базальної дегенерації (КБД), деменції з тільцями Леві, варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМАБ) або прогресуючого над'ядерного паралічу (ПНП).

Антитіла також можна об'єднати з іншими білками. Наприклад, антитіла можна об'єднати з фіномерами. Фіномери являють собою невеликі білки, що зв'язуються, (наприклад, розміром 7 кДа), що одержані з домену уп 5НЗ людини. Фіномери можуть бути стабільними та розчинними, і в них можуть бути відсутні залишки цистеїну та дисульфідні зв'язки. Фіномери можуть бути сконструйовані так, щоб зв'язуватися з молекулами-мішенями з тією самою афінністю та специфічністю, що й антитіла Вони є підходящими для створення мультиспецифічних злитих білків на основі антитіл. Наприклад, фіномери можуть бути злитими з М-термінальним і/або С-термінальним кінцями антитіл для створення бі- та триспецифічних

ЕупотАБ з різною архітектурою. Фіномери можна вибрати із застосуванням бібліотек фіномерів за допомогою методик скринінгу із застосуванням ЕГАС5, Віасоге й аналізів на клітинах, які

Зо дозволяють провести ефективний відбір фіномерів з оптимальними властивостями. Приклади фіномерів розкриті у публікаціях Старшіому5кі еї аї., У. Віої. Спет. 282:3196-3204 (2007);

Вепізспіпдег евї аї., Ргоївіїп Епа. Оев. 5еї. 20:57-68 (2007); 5спіІанНег єї а)І., МАБ5. 4:497-508 (2011);

Ваппег єї а!., Асіа. СтувІіАтТтодг. 0. Віої. СтувіАтТодг. 69(РІЄ):І 124-1137 (2013); і Вгаск еї а!., Мо).

Сапсег Тнег. 13:2030-2039 (2014).

Антитіла, що розкриті у даному документі, можна також об'єднати або кон'югувати з одним або декількома іншими антитілами (наприклад, з утворенням гетерокон'югатів антитіл). Такі інші антитіла можуть зв'язуватися з відмінними епітопами в межах тау або можуть зв'язуватися з відмінним антигеном-мішенню.

Антитіла можна також об'єднати з міткою, що виявляється. Такі антитіла можна застосовувати, наприклад, для діагностики хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна, легкого когнітивного порушення, первинної вікової таупатії, постенцефалітичного паркінсонізму, посттравматичної деменції або деменції боксерів, хвороби Піка, хвороби Німана-Піка типу С, над'ядерного паралічу, лобно-скроневої деменції, лобно-скроневої лобарної дегенерації, хвороби аргірофільних зерен, глобулярної гліальної таупатії, аміотрофічного латерального склерозу/ комплексу паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальної дегенерації (КБД), деменції з тільцями Леві, варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ІВМАЮ) або прогресуючого над'ядерного паралічу (ПНП), і/або для оцінки ефективності лікування. Такі антитіла є особливо підходящими для здійснення такого визначення у суб'єктів, які страждають від або схильні до хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна, легких когнітивних порушень, первинної вікової таупатії, постенцефалітичного паркінсонізму, посттравматичної деменції або деменції боксерів, хвороби

Піка, хвороби Німана-Піка типу С, над'ядерного паралічу, лобно-скроневої деменції, лобно- скроневої лобарної дегенерації, хвороби аргірофільних зерен, глобулярної гліальної таупатії, аміотрофічного латерального склерозу/ комплексу паркінсонізм-деменція Гуам, кортико- базальної дегенерації (КБД), деменції з тільцями Леві, варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМАЮ) або прогресуючого над'ядерного паралічу (ПНП), або у відповідних біологічних зразках, що одержані від таких суб'єктів. Типові мітки, що виявляються, які можна об'єднати з антитілом або приєднати до антитіла, включають різні ферменти, такі як пероксидаза хрону, лужна фосфатаза, бета-галактозидаза або ацетилхолінестераза; простетичні групи, такі як стрептавідин/біотин й авідин/біотин; флуоресцентні матеріали, такі як бо умбеліферон, флуоресцеїн, флуоресцеїну ізотіоціанат, родамін, дихлортриазиніламін флуоресцеїн, дансил хлорид або фікоеритрин; люмінесцентні матеріали, такі як люмінол; біолюмінесцентні матеріали, такі як люцифераза, люциферин й екворин; радіоактивні матеріали, такі як радіоактивне срібло-111, радіоактивне срібло-199, бісмут2"З, йод (1, 1251, 129, 1211), вуглець (7С), сірка (25), тритій (ЗН), індій (95Іп, "Зи, П2Ій, 77 п,), технецій (Тс), талій (2), галій (98(За, 5/ЄЗа), паладій (9зрРа), молібден (Мо), ксенон (33Хе), фтор (С8Р), 35т, 77 и, 159034, 9рт, 10) а, 175ур, 166Но, з0у, 175с, 186Де, 188Де, 12руг, 15ВН, 97Ви, б8(Зе, 57Со, 557п, 855, зар, 15з(3а, 59уУр, Ст, Мп, Бе, "З5п і Тіп; позитронно-активні метали із застосуванням різних варіантів позитронно-емісійної томографії; нерадіосактивні парамагнітні іони металів; і молекули, які є радіоактивно міченими або кон'югованими зі специфічними радіоактивними ізотопами.

Приєднання радіоактивних ізотопів до антитіл можна здійснити за допомогою загальноприйнятих біфункціональних хелатів. Для приєднання радіоактивного срібла-111 і радіоактивного срібла-199 можна застосовувати лінкери на основі сірки. Див. публікацію Налгта еї а!., Сеї! Віорпуз. 24-25: 1-7 (1994). Приєднання радіоактивних ізотопів срібла може включати відновлення імуноглобуліну аскорбіновою кислотою. Для радіоактивних ізотопів, таких як Шіп і 90У, можна застосовувати ібритутомаб тіуксетан, який буде вступати в реакцію з такими ізотопами з утворенням ПпПп-ібритутомабу тіуксетану та 90У-ібритутомабу тіуксетану, відповідно. Див. публікацію У/йгід, Сапсег СпетоїНег. Рпаптасої., 4851йррі 1: 591-595(2001).

Терапевтичні агенти, інші білки, інші антитіла та/або мітки, що виявляються, можуть бути об'єднані або кон'юговані прямо або опосередковано із застосуванням посередника (наприклад, лінкера) з антитілом згідно з даним винаходом. Див., наприклад, публікації Агпоп 6ї аї., "Мопосіопа! Апііродієв Рог Іттипоїагдеїїпуд ОЇ Опов Іп Сапсег ТПнегару," іп Мопосіопа! Апіїродієв

Апа Сапсег Тнегару, ВеїзвієїЇй єї аї. (ед5.), рр. 243-56 (АІап В. І і55, Іпс. 1985); НеїЇвігот еї аї., "Апіїбодієз Гог Огид Оеєїїмегу," іп Сопітоїєй Огид ОеєїЇїмегу (2па Еа.), Вобіпзоп еї аї. (єдв.), рр. 623- 53 (Магсеї! ОеккКег", Іпс. 1987); Тпогре, "Апіїроду Сатпіет5 ОГ Суюїохіс Адепів Іп Сапсег Тнегару: А

Вемієму," іп Мопосіопа! Апіїродієв 84: Віоіодіса! Апа Сіїпіса! Арріїсайоп5, РіпсНега еї аї. (едв.), рр. 475-506 (1985); "Апаїувзів5, Незиїйїв, Апа Ешиге Ргозресіїме ОЇ Тпе ТНегареціїс Ове ОЇ РНадіоіабеїєа

Апіїроду Іп Сапсег Тнегару," іп Мопосіопа! Апіїбодіез Рог Сапсег Оеїесіюп Апа Тнегару, Ваідм/іп еї ап (єд5.), рр. 303-16 (Асадетіс Ргез5 1985); і Погре єї ап, Іттипої. Нехм., 62:119-58 (1982).

Підходящі лінкери включають, наприклад, лінкери, що відщеплюються та не відщеплюються.

Зо Можна застосовувати різні лінкери, які вивільняють приєднані терапевтичні агенти, білки, антитіла та/або мітки, що виявляються, у кислих або відновлюючих умовах, при впливі специфічних протеаз або за інших певних умов.

МІ. Фармацевтичні композиції та способи застосування

При профілактичних варіантах застосування антитіло або засіб для індукції антитіла або фармацевтичну композицію, що містить зазначені антитіло або засіб, вводять пацієнту, що схильний або іншим способом підданий ризику розвитку захворювання (наприклад, хвороби

Альцгеймера), в режимі (дозі, частоті та шляху введення), що ефективний для зниження ризику, зменшення тяжкості або відтермінування маніфестації щонайменше однієї ознаки або симптому захворювання. Зокрема, режим, переважно, є ефективним для інгібування або відтермінування тау або фосфо-тау та спарених волокон, що утворені з них, у головному мозку, й/або інгібування або відтермінування їх токсичних ефектів, й/або інгібування/або відтермінування розвитку поведінкового дефіциту. При терапевтичних варіантах застосування антитіло або засіб для індукції антитіла вводять пацієнту, що схильний до захворювання або вже страждає від захворювання (наприклад, хвороби Альцгеймера), в режимі (дозі, частоті та шляху введення), що ефективний для полегшення або щонайменше інгібування подальшого погіршення щонайменше однієї ознаки або симптому захворювання. Зокрема, режим, переважно, є ефективним для зниження або щонайменше інгібування подальшого підвищення рівнів тау, фосфо-тау або спарених волокон, що утворені з них, пов'язаної токсичності та/або поведінкового дефіциту.

Режим вважають терапевтично або профілактично ефективним, якщо індивідуальний пацієнт, що отримує лікування, досягає більше сприятливого результату, ніж середній результат у контрольній популяції порівнянних пацієнтів, що не отримували лікування способами згідно з даним винаходом, або якщо у пацієнтів, що отримували лікування, спостерігається більше сприятливий результат у порівнянні з контрольними пацієнтами у контрольованому клінічному дослідженні (наприклад, у дослідженні фази ІІ, фази ПЛІ! або фази Ії) при рівні р-0,05 або 0,01, або навіть 0,001.

Ефективні дози варіюють в залежності від множини різних факторів, таких як способи введення, сайт-мішень, фізіологічний стан пацієнта, чи являє собою пацієнт носія АроЕ, чи являє собою пацієнт людину або тварину, інші лікарські препарати, що вводяться, чи є бо лікування профілактичним або терапевтичним.

Ілюстративні діапазони доз для антитіл становлять від приблизно 0,01 до 60 мг/кг, або від приблизно 0,1 до З мг/кг, або 0,15 - 2 мг/кг, або 0,15 - 1,5 мг/кг маси тіла пацієнта. Антитіло можна вводити у таких дозах щодня, через день, щотижня, один раз на два тижні, один раз на місяць, один раз на три місяці або згідно з будь-яким іншим розкладом, що визначений за допомогою емпіричного аналізу. Ілюстративне лікування передбачає введення в декількох дозах протягом тривалого періоду часу, наприклад, щонайменше шести місяців. Додаткові ілюстративні режими лікування передбачають введення один раз на два тижні, або один раз на місяць, або один раз на З - 6 місяців.

Кількість засобу для активного введення варіює від 0,1 - 500 мкг на пацієнта та, більше часто, від 1-100 або 1-10 мкг на ін'єкцію для введення людині. Час між введенням ін'єкцій може варіювати у значному ступені від одного разу на день до одного разу на рік, до одного разу на десять років. Типовий режим складається з імунізації з подальшими бустер-ін'єкціями через інтервали часу, такі як інтервали 6 тижнів або два місяці. Інший режим складається з імунізації з подальшими бустер-ін'єкціями через 1, 2 і 12 місяців. Інший режим передбачає ін'єкцію один раз на два місяці протягом життя. Як альтернатива, бустер-ін'єкції можна вводити нерегулярно, як показано на основі моніторингу імунної відповіді.

Антитіла або засоби для індукції антитіл, переважно, вводять периферичним шляхом (тобто одиниця, в якій вводять або яка індукує антитіло, перетинає гематоенцефалічний бар'єр для досягнення призначеної ділянки у головному мозку). Шляхи введення включають місцевий, внутрішньовенний, пероральний, підшкірний, внутрішньоартеріальний, внутрішньочерепний, інтратекальний, інтраперитонеальний, інтраназальний, внутрішньоочний або внутрішньом'язовий. Переважними шляхами введення антитіл є внутрішньовенний та підшкірний. Переважними шляхами для активної імунізації є підшкірний та внутрішньом'язовий.

Даний тип ін'єкції найчастіше здійснюють у м'язи плеча або ноги. У деяких способах засоби ін'єктують безпосередньо у конкретну тканину, в якій накопичилися відкладення, наприклад, за допомогою внутрішньочерепної ін'єкції.

Фармацевтичні композиції для парентерального введення, переважно, є стерильними та по суті ізотонічними, і їх виробляють в умовах СМР (Соод тапиїасіигіпу ргасіїсе5, належної виробничої практики). Фармацевтичні композиції можуть бути запропоновані в одиничній

Зо дозованій формі (тобто дозі для одноразового введення). Фармацевтичні композиції можна приготувати в склад із застосуванням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв, розріджувачів, допоміжних речовин або допоміжних засобів. Склад залежить від вибраного шляху введення. Даля ін'єкції антитіла можна приготувати в склад у водних розчинах, переважно, у фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенкса, розчин Рінгера або фізіологічний сольовий розчин або ацетатний буфер (для зниження неприємних відчуттів у ділянці ін'єкції).

Розчин може містити допоміжні речовини, такі як суспендуючі, стабілізуючі та/або диспергуючі засоби. Як альтернатива, антитіла можуть перебувати у ліофілізованій формі для відновлення перед застосуванням підходящим наповнювачем, наприклад, стерильною апірогенною водою.

Режими згідно з даним винаходом можна вводити у комбінації з іншим засобом, що ефективний при лікуванні або профілактиці захворювання, лікування якого проводять.

Наприклад, у випадку хвороби Альцгеймера режими згідно з даним винаходом можна поєднувати з імунотерапією проти АВ (М/0/2000/072880), інгібіторами холінестерази або мемантином, або у випадку хвороби Паркінсона - з імунотерапією проти альфа-синуклеїну

МО/2008/103472, леводопою, агоністами дофаміну, інгібіторами СОМТ, інгібіторами МАО-В, амантадином або антихолінергічними засобами.

Антитіла вводять в ефективному режимі, що означає дозу, шлях введення та частоту введення, які відтерміновують маніфестацію, зменшують тяжкість, інгібують подальше погіршення та/або полегшують щонайменше одну ознаку або симптом порушення, лікування якого проводять. Якщо пацієнт вже страждає від порушення, режим можуть називати терапевтично ефективним режимом. Якщо пацієнт підданий підвищеному ризику розвитку порушення у порівнянні із загальною популяцією, але доки не відчуває симптомів, режим можуть називати профілактично ефективним режимом. У деяких випадках терапевтичну або профілактичну ефективність можна продемонструвати в індивідуального пацієнта у порівнянні з історичними контролями або минулим досвідом того самого пацієнта. В інших випадках терапевтичну або профілактичну ефективність можна продемонструвати у доклінічному або клінічному дослідженні на популяції пацієнтів, що отримують лікування, у порівнянні з контрольною популяцією пацієнтів, що не отримують лікування.

Ілюстративні дози антитіла становлять 0,1 - 60 мг/кг (наприклад, 0,5, 3, 10, 30 або 60 мг/кг), або 0,5 - 5 мг/кг маси тіла (наприклад, 0,5, 1, 2, 3, 4 або 5 мг/кг), або 10 - 4000 мг або 10 - 1500 60 мг у вигляді фіксованої дози. Доза залежить від стану пацієнта та відповіді на попереднє лікування, у випадку його наявності, від того, чи є лікування профілактичним або терапевтичним, і від того, чи є порушення гострим або хронічним, крім інших факторів.

Введення може бути парентеральним, внутрішньовенним, пероральним, підшкірним, внутрішньоартеріальним, внутрішньочерепним, інтратекальним, інтраперитонеальним, місцевим, інтраназальним або внутрішньом'язовим. Деякі антитіла можна вводити у системний кровообіг за допомогою внутрішньовенного або підшкірного введення. Внутрішньовенне введення можна здійснювати, наприклад, за допомогою інфузії протягом періоду часу, такого як 30-90 хв.

Частота введення залежить від періоду напівжиття антитіла у судинному руслі, стану пацієнта та шляху введення, крім інших факторів. Частота може являти собою введення щодня, щотижня, один раз на місяць, один раз на три місяці або введення з нерегулярними інтервалами у відповідь на змінення стану пацієнта або прогресування порушення, лікування якого проводять. Ілюстративна частота для внутрішньовенного введення становить від введення щотижня до одного разу на три місяці протягом безперервного курсу лікування, не дивлячись на те, що також можливе більше або менше часте введення доз. Для підшкірного введення ілюстративна частота введення доз становить від введення щодня до одного разу на місяць, незважаючи на те, що також можливе більше або менше часте введення доз.

Кількість доз, що вводяться, залежить від того, чи є порушення гострим або хронічним, і від відповіді порушення на лікування. У випадку гострих порушень або гострих загострень хронічного порушення часто достатніми є від 1 до 10 доз. Іноді одна болюсна доза, що необов'язково розділена, є достатньою у випадку гострого порушення або гострого загострення хронічного порушення. Лікування можна повторювати у випадку повторної появи гострого порушення або гострого загострення. У випадку хронічних порушень антитіло можна вводити з регулярними інтервалами, наприклад, щотижня, один раз на два тижні, один раз на місяць, один раз на три місяці, один раз на шість місяців протягом щонайменше 1, 5 або 10 років, або протягом життя пацієнта.

А. Способи діагностики та моніторингу

Способи візуалізації, діагностики іп мімо й оптимізації імунотерапії

У даному винаході запропоновані способи візуалізації відкладень тау-білка (наприклад,

Зо нейрофібрилярних клубків і включень тау) у пацієнта іп мімо. Способи здійснюють за допомогою введення реактиву, такого як антитіло, яке зв'язується з тау (наприклад, антитіло 306 миші, гуманізоване, химерне або веноване антитіло 306), пацієнту, а потім за допомогою виявлення засобу після його зв'язування. Антитіла, які зв'язуються з епітопом тау в межах залишків амінокислот 199 - 213 або 262 - 276 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам амінокислот 257 - 271 або 320 - 334, відповідно, 5ЕО ІО МО: 1), є переважними. У деяких способах антитіло зв'язується з епітопом в межах залишків амінокислот 199 - 213 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам амінокислот 257-271 ЗЕО ІЮ МО: 1) або в межах амінокислот 262 - 276 5ЕО ІО МО: З (відповідають залишкам амінокислот 320 - 334 5ЕО ІЮ МО: 1). Клірингової відповіді на введені антитіла можна уникнути або її можна знизити із застосуванням фрагментів антитіла, в яких відсутня повнорозмірна константна область, таких як Бар. У деяких способах одне і те саме антитіло може виступати як реактив як для лікування, так і для діагностики.

Діагностичні реактиви можна вводити за допомогою внутрішньовенної ін'єкції в організм пацієнта або безпосередньо у головний мозок за допомогою внутрішньочерепної ін'єкції або за допомогою свердління отвору в черепі. Доза реактиву повинна знаходитися в тих самих діапазонах, як і для способів лікування. Зазвичай, реактив є міченим, незважаючи на те, що у деяких способах первинний реактив з афінністю відносно тау є неміченим, і для зв'язування з первинним реактивом застосовують вторинний засіб мічення. Вибір мітки залежить від способів виявлення. Наприклад, флуоресцентна мітка є підходящою для оптичного виявлення.

Застосування парамагнітних міток є підходящим для томографічного виявлення без хірургічного втручання. Радіоактивні мітки можна також виявити із застосуванням позитронно-емісійної томографії (ПЕТ) або однофотонної емісійної комп'ютерної томографії (ОФЕКТ).

Способи візуалізації відкладень тау-білка іп мімо є підходящими для діагностики або підтвердження діагнозу таупатії, такої як хвороба Альцгеймера, лобово-скронева лобарна дегенерація, прогресуючий над'ядерний параліч і хвороба Піка, або схильності до такого захворювання. Наприклад, способи можна застосовувати відносно пацієнта, в якого спостерігаються симптоми деменції. Якщо у пацієнта присутні аномальні нейрофібрилярні клубки, тоді пацієнт, ймовірно, страждає від хвороби Альцгеймера. Як альтернатива, якщо у пацієнта присутні аномальні включення тау, тоді, в залежності від розташування включень, пацієнт може страждати від лобно-скроневої лобарної дегенерації. Способи можна також бо застосовувати відносно безсимптомних пацієнтів. Присутність відкладень аномального тау-

білка свідчить про схильність до подальшого симптоматичного захворювання. Способи також є підходящими для моніторингу прогресування захворювання та/або відповіді на лікування у пацієнтів, у яких раніше було діагностовано захворювання, що викликане тау.

Діагностику можна здійснювати за допомогою порівняння кількості, розміру й/або інтенсивності міченого локусу з відповідними вихідними значеннями. Вихідні значення можуть являти собою середні рівні у популяції індивідуумів, що не страждають від захворювання.

Вихідні значення можуть також являти собою попередні рівні, що визначені у того самого пацієнта. Наприклад, вихідні значення можна визначити у пацієнта до початку лікування імунотерапією тау, а після цього виміряні значення порівняти з вихідними значеннями.

Зниження значень у порівнянні з вихідним рівнем свідчить про позитивну відповідь на лікування.

У деяких пацієнтів діагностику таупатії можна полегшити за допомогою здійснення сканування ПЕТ. Сканування ПЕТ можна здійснити із застосуванням, наприклад, загальноприйнятого апарата для візуалізації ПЕТ і допоміжного обладнання. Сканування, зазвичай, охоплює одну або декілька областей головного мозку, які, як відомо, зазвичай зв'язані з відкладеннями тау-білка, й одну або декілька областей, в яких, зазвичай, присутня невелика кількість, у випадку наявності, відкладень, й які виступають як контролі.

Сигнал, що виявлений при скануванні ПЕТ, можна представити у вигляді багатовимірного зображення. Багатовимірне зображення може бути представлене у двох вимірах, що являють собою поперечний переріз головного мозку, у трьох вимірах, що являють собою тривимірний головний мозок, або у чотирьох вимірах, що являють собою змінення у тривимірному головному мозку протягом часу. Можна застосовувати колориметричну шкалу з різними кольорами, що вказують на різні кількості мітки, і логічно виведене виявлене відкладення тау-білка. Результати сканування можна також представити у числовому виразі з цифрами, що відносяться до виявленої кількості мітки, і, як наслідок, кількості відкладень тау-білка. Мітку, що присутня в області головного мозку, яка, як відомо, пов'язана з відкладеннями у випадку конкретної таупатії (наприклад, хвороби Альцгеймера), можна порівняти з міткою, що присутня в області, яка, як відомо, не пов'язана з відкладеннями, для отримання співвідношення, що свідчить про ступінь відкладень у першій області. Для одного і того самого радіоактивно міченого ліганду такі співвідношення забезпечують порівнянний показник відкладень тау-білка та його змін між

Зо різними пацієнтами.

У деяких способах сканування ПЕТ проводять одночасно або у ході того самого візиту пацієнта, що і сканування МРТ |(магнітно-резонансної томографії) або КТ (комп'ютерної томографії). Сканування МРТ або КТ дозволяє отримати більше інформації про анатомічні деталі головного мозку, ніж сканування ПЕТ. Однак зображення від сканування ПЕТ можна накласти на зображення від сканування МРТ або КТ, щоб більше точно вказати розташування ліганду ПЕТ і логічно виведених відкладень тау у порівнянні з анатомічними структурами у головному мозку. Деякі прилади можуть здійснювати як сканування ПЕТ, так і сканування МРТ або КТ без змінення положення пацієнта між скануванням, що полегшує накладення зображень.

Підходящі ліганди ПЕТ включають антитіла, що мічені радіоактивною міткою, згідно з даним винаходом (наприклад, антитіло 306 миші, гуманізоване, химерне або веноване антитіло 306).

Використовуваний радіоактивний ізотоп може являти собою, наприклад, С", М'ЯЗ, 05, Е"8 або 23, Інтервал між введенням ліганду ПЕТ і здійсненням сканування може залежати від ліганду

ПЕТ і, зокрема, його швидкості поглинання та кліренсу у головний мозок, а також періоду напівжиття його радіоактивної мітки.

Сканування ПЕТ можна також здійснювати як профілактичну міру у безсимптомних пацієнтів або пацієнтів, у яких спостерігаються симптоми легкого когнітивного порушення, але яким ще не був поставлений діагноз таупатії, які, однак, піддані підвищеному ризику розвитку таупатії. У випадку безсимптомних пацієнтів сканування є особливо підходящим для індивідуумів, які, як вважають, піддані підвищеному ризику розвитку таупатії у зв'язку з сімейним анамнезом, генетичними або біохімічними факторами ризику або зрілим віком. До профілактичного сканування можна приступати, наприклад, у пацієнтів у віці від 45 до 75 років. У деяких пацієнтів перше сканування проводять у віці 50 років.

Профілактичне сканування можна здійснювати з інтервалами, наприклад, від шести місяців до десяти років, переважно, 1 - 5 років. У деяких пацієнтів профілактичне сканування проводять щорічно. Якщо сканування ПЕТ, що проведене як профілактична міра, свідчить про аномально високі рівні відкладень тау-білка, можна починати застосування імунотерапії та проводити наступні сканування ПЕТ, як для пацієнтів, у яких була діагностована таупатія. Якщо сканування

ПЕТ, що проведене як профілактична міра, свідчить про рівні відкладень тау-білка в межах норми, можна проводити наступні сканування ПЕТ з інтервалами від шести місяців до десяти бо років, переважно, 1 - 5 років, як і раніше, або у відповідь на появу ознак і симптомів таупатії або легкого когнітивного порушення. За допомогою поєднання профілактичного сканування з введенням спрямованої на тау імунотерапії, якщо та коли були виявлені відкладення тау-білка вище нормального рівня, рівні відкладень тау-білка можна знизити до нормальних рівнів або близько до них, або щонайменше інгібувати їх підвищення у подальшому, і пацієнт може залишатися вільним від таупатії протягом більше тривалого періоду часу, ніж у випадку, якщо він не отримує профілактичне сканування та спрямовану на тау імунотерапію (наприклад, щонайменше 5, 10, 15 або 20 років, або протягом решти життя пацієнта).

Нормальні рівні відкладень тау-білка можна визначити на основі кількості нейрофібрилярних клубків або включень тау у головному мозку репрезентативного зразка від індивідуумів у загальній популяції, в яких не була діагностована конкретна таупатія (наприклад, хвороба

Альцгеймера) й які, як вважають, не піддані підвищеному ризику розвитку такого захворювання (наприклад, репрезентативний зразок індивідуумів у віці до 50 років, що не страждають від захворювання). Як альтернатива, нормальний рівень можна визначити в індивідуального пацієнта, якщо сигнал ПЕТ відповідно до способів згідно з даним винаходом в області головного мозку, в якій, як відомо, розвиваються відкладення тау-білка, не відрізняється (в межах точності вимірювання) від сигналу з області головного мозку, в якій, як відомо, такі відкладення у нормі не розвиваються. Підвищений рівень в індивідуума можна визначити за допомогою порівняння з нормальними рівнями (наприклад, за межами середнього значення та варіації стандартного відхилення) або просто на основі підвищеного сигналу за межами похибки експерименту в області головного мозку, що пов'язана з відкладеннями тау-білка, у порівнянні з областю, яка, як відомо, не пов'язана з відкладеннями. З метою порівняння рівнів відкладень тау-білка в індивідуума та популяції відкладення тау-білка, переважно, повинні бути визначені в одній і тій самій області або областях головного мозку, причому дані області включають щонайменше одну область, в якій, як відомо, утворюються відкладення тау-білка, що пов'язані з конкретною таупатією (наприклад, хворобою Альцгеймера). Пацієнт, у якого спостерігається підвищений рівень відкладень тау-білка, є кандидатом для початку імунотерапії.

Після початку імунотерапії зниження рівня відкладень тау-білка можна спочатку спостерігати як свідчення того, що лікування виробляє бажаний ефект. Зниження, що спостерігається, може знаходитися, наприклад, в діапазоні 1 - 100 б, 1 - 50 95 або 1 - 25 95 від вихідного значення.

Такі ефекти можна вимірювати в одній або декількох областях головного мозку, в яких, як відомо, утворюються відкладення, або можна вимірювати з середніх значень таких областей.

Сумарний ефект лікування можна наближено обчислити за допомогою додавання відсотка зниження у порівнянні з вихідним рівнем до підвищення відкладень тау-білка, яке в іншому випадку відбудеться у середнього пацієнта, що не отримав лікування.

Збереження відкладень тау-білюка на приблизно постійному рівні або навіть незначне збільшення відкладень тау-білка може також свідчити про відповідь на лікування, нехай навіть і субоптимальну відповідь. Такі відповіді можна порівняти з тимчасовою динамікою рівнів відкладень тау-білка у пацієнтів з конкретною таупатією (наприклад, хворобою Альцгеймера), які не отримують лікування, для визначення того, чи виробляє імунотерапія ефект відносно інгібування подальшого підвищення відкладень тау-білка.

Моніторинг змін відкладень тау-білка дозволяє відкоригувати імунотерапію або інший режим лікування у відповідь на лікування. Моніторинг ПЕТ забезпечує вказівку на природу та ступінь відповіді на лікування. Потім можна визначити, чи потрібно коригувати лікування, й у випадку необхідності лікування можна відкоригувати у відповідь на моніторинг ПЕТ. Таким чином, моніторинг ПЕТ дозволяє відкоригувати імунотерапію, що спрямована на тау, або інший режим лікування до того, як інші біомаркери, МРТ або когнітивні показники продемонстрували відповіді, що виявляються. Значна зміна означає, що порівняння значення параметра після лікування у порівнянні з вихідним рівнем забезпечує деякий доказ, що лікування призвело або не призвело до сприятливого ефекту. У деяких випадках зміна значень параметра у пацієнта сама по собі забезпечує доказ, що лікування призвело або не призвело до сприятливого ефекту. В інших випадках зміну значень, у випадку наявності, у пацієнта порівнюють зі зміною значень, у випадку наявності, в репрезентативній контрольній популяції пацієнтів, які не отримували імунотерапію. Різниця між відповіддю конкретного пацієнта та нормальною відповіддю контрольного пацієнта (наприклад, середнє значення плюс дисперсія стандартного відхилення) може також забезпечити доказ, що режим імунотерапії досяг сприятливого ефекту для пацієнта або не досяг його.

У деяких пацієнтів моніторинг свідчить про зниження, що виявляється, відкладень тау-білка, але даний рівень відкладень тау-білка залишається вище нормального. Для таких пацієнтів, якщо неприйнятні побічні ефекти відсутні, режим лікування можна продовжити без змін або навіть із збільшенням частоти введення та/або дози, якщо лікування вже не проводять при максимальній рекомендованій дозі.

Якщо моніторинг свідчить про рівні відкладень тау-білка у пацієнта, які вже були знижені до нормальних рівнів або знаходяться поблизу від нормальних рівнів відкладень тау-білка, режим імунотерапії можна відкоригувати з такого для індукції (тобто який знижує рівень відкладень тау- білка) до такого для збереження (тобто який підтримує відкладення тау-білка на приблизно постійному рівні). На такий режим можна впливати за допомогою зниження дози та/або частоти введення імунотерапії.

В інших пацієнтів моніторинг може свідчити, що імунотерапія характеризується деяким сприятливим ефектом, але субоптимальним ефектом. Оптимальний ефект можна визначити як відсоток зниження рівня відкладень тау-білка в межах верхньої половини або квартиля зміни відкладень тау-білка (що виміряний або розрахований для всього головного мозку або його репрезентативної області або областей, в яких, як відомо, утворюються відкладення тау-білка), що спостерігається у репрезентативному зразку від пацієнтів, що страждають від таупатії, які отримують імунотерапію у дану часову точку після початку терапії. Пацієнта, який зазнає менше зниження, або пацієнта, відкладення тау-білка в якого залишаються постійними або навіть підвищуються, але у меншому ступені, ніж очікується за відсутності імунотерапії (наприклад, як виміряно у контрольній групі пацієнтів, яким не вводять імунотерапію), можна класифікувати як такого, що демонструє позитивну, але субоптимальну відповідь. Таким пацієнтам можна необов'язково відкоригувати режим, при цьому збільшуючи дозу та/або частоту введення засобу.

У деяких пацієнтів відкладення тау-білюєа можуть підвищуватися в аналогічному або більшому ступені у порівнянні з відкладеннями тау у пацієнтів, які не отримують імунотерапію.

Якщо таке підвищення триває протягом періоду часу, такого як 18 місяців або 2 роки, навіть після будь-якого підвищення частоти або дози засобу, імунотерапію можна за необхідності припинити на користь інших варіантів лікування.

Вищезазначений опис діагностики, моніторингу та коригування лікування таупатій, головним чином, сфокусований на застосуванні сканування ПЕТ. Однак для здійснення таких способів можна застосовувати будь-яку іншу методику для візуалізації та/"або вимірювання відкладень тау-білка, яка підходить для застосування з антитілами проти тау згідно з даним винаходом (наприклад, антитілом миші, гуманізованим, химерним або венованим антитілом 306), замість сканування ПЕТ.

Також запропоновані способи виявлення імунної відповіді проти тау у пацієнта, що страждає від або схильний до захворювань, що пов'язані з тау. Способи можна застосовувати для моніторингу перебігу терапевтичного та профілактичного лікування засобами, що запропоновані у даному документі. Профіль антитіла після пасивної імунізації, зазвичай, демонструє швидкий пік концентрації антитіла з наступним експоненційним спадом. За відсутності наступної дози спад досягне рівнів до початку лікування протягом періоду часу тривалістю від днів до місяця в залежності від періоду напівжиття антитіла, яке вводиться. Наприклад, період напівжиття деяких антитіл людини становить близько 20 днів.

У деяких способах вимірювання антитіла проти тау на вихідному рівні в суб'єкта проводять до введення, друге вимірювання проводять незабаром після цього для визначення пікового рівня антитіла, й одне або декілька наступних вимірювань проводять через інтервали часу для моніторингу зниження рівнів антитіла. Коли рівень антитіла знизився до вихідного рівня або заздалегідь визначеного відсотка піка, що менший вихідного рівня (наприклад, 5095, 2595 або 1095), проводять введення наступної дози антитіла. У деяких способах пікові або наступні виміряні рівні, які менші фонового рівня, порівнюють з еталонними рівнями, що раніше визначені, щоб скласти сприятливий режим профілактичного або терапевтичного лікування для інших суб'єктів. Якщо виміряний рівень антитіла є у значному ступені меншим, ніж еталонний рівень (наприклад, меншим, ніж середнє значення мінус одне або, переважно, два стандартних відхилення від еталонного значення у популяції суб'єктів, що отримують користь від лікування), показане введення додаткової дози антитіла.

Також запропоновані способи виявлення тау в суб'єкта, наприклад, за допомогою вимірювання тау в зразку від суб'єкта або за допомогою візуалізації тау в суб'єкта іп мімо. Такі способи є підходящими для діагностики або підтвердження діагнозу захворювань, що пов'язані з тау, або схильності до зазначених захворювань. Способи можна також застосовувати відносно безсимптомних суб'єктів. Присутність тау свідчить про схильність до майбутнього симптоматичного захворювання. Способи також є підходящими для моніторингу прогресування захворювання та/або відповіді на лікування в суб'єктів, у яких раніше була діагностована бо хвороба Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинна вікова таупатія,

постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматична деменція або деменція боксерів, хвороба

Піка, хвороба Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скронева деменція, лобно- скронева лобарна дегенерація, хвороба аргірофільних зерен, глобулярна гліальна таупатія, аміотрофічний латеральний склероз/ комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальна дегенерація (КБД), деменція з тільцями Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ІІВМУАВЮ) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП).

Можна здійснити контакт біологічних зразків, які отримані від суб'єкта, що страждає, як підозрюють, що страждає, або підданий ризику розвитку хвороби Альцгеймера, синдрому

Дауна, легкого когнітивного порушення, первинної вікової таупатії, постенцефалітичного паркінсонізму, посттравматичної деменції або деменції боксерів, хвороби Піка, хвороби

Німанна-Піка типу С, над'ядерного паралічу, лобно-скроневої деменції, лобно-скроневої лобарної дегенерації, хвороби аргірофільних зерен, глобулярної гліальної таупатії, аміотрофічного латерального склерозу/ комплексу паркінсонізм-деменція Гуам, кортико- базальної дегенерації (КБД), деменції з тільцями Леві, варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І/ВМАЮ) або прогресуючого над'ядерного паралічу (ПНП), з антитілами, що розкриті у даному документі, для оцінки присутності тау. Наприклад, рівні тау в таких суб'єктів можна порівняти з такими, що присутні в здорових суб'єктів. Як альтернатива, рівні тау в таких суб'єктів, які отримують лікування захворювання, можна порівняти з такими суб'єктами, які не отримували лікування хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна, легкого когнітивного порушення, первинної вікової таупатії, постенцефалітичного паркінсонізму, посттравматичної деменції або деменції боксерів, хвороби Піка, хвороби Німана-Піка типу С, над'ядерного паралічу, лобно- скроневої деменції, лобно-скроневої лобарної дегенерації, хвороби аргірофільних зерен, глобулярної гліальної таупатії, аміотрофічного латерального склерозу/ комплексу паркінсонізм- деменція Гуам, кортико-базальної дегенерації (КБД), деменції з тільцями Леві, варіанта хвороби

Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМАБ) або прогресуючого над'ядерного паралічу (ПНП). Деякі такі дослідження включають біопсію тканини, що отримана від таких суб'єктів. Аналізи ЕГІБА можуть також бути підходящими способами, наприклад, для оцінки тау в рідких зразках.

МІЇ. Набори

У даному винаході також запропоновані набори (наприклад, контейнери), що містять

Зо антитіла, які розкриті у даному документі, та супутні матеріали, такі як інструкції із застосування (наприклад, листок-вкладиш). Інструкції із застосування можуть містити, наприклад, інструкції з введення антитіла та необов'язково одного або декількох додаткових засобів. Контейнери антитіл можуть являти собою дози на один прийом, упаковки великого об'єму (наприклад, багатодозові упаковки), або дози, що менші, ніж доза на один прийом.

Листок-вкладиш означає інструкції які зазвичай вкладають в комерційні упаковки терапевтичних продуктів й які містять інформацію відносно показань, застосування, дози, введення, протипоказань та/або застережень відносно застосування таких терапевтичних продуктів.

Набори можуть також містити другий контейнер, що містить фармацевтично прийнятний буфер, такий як бактеріостатична вода для ін'єкцій (расієгіовіаїс маїег ог іпіесіоп, ВМУРІ), фосфатно-буферний сольовий розчин, розчин Рінгера та розчин глюкози. Набори можуть також містити інші матеріали, що бажані з комерційної точки зору та точки зору споживача, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки та шприци.

МІ. Інші варіанти застосування

Антитіла можна застосовувати для виявлення тау або його фрагментів у контексті клінічної діагностики або лікування, або в дослідженнях. Наприклад, антитіла можна застосовувати для виявлення присутності тау у біологічному зразку як свідчення того, що біологічний зразок містить відкладення тау. Зв'язування антитіл з біологічним зразком можна порівняти зі зв'язуванням антитіл з контрольним зразком. Контрольний зразок і біологічний зразок можуть містити клітини, які походять з однієї тканини. Контрольні зразки та біологічні зразки можна отримати від одного індивідуума або різних індивідуумів одночасно або у різні періоди часу. За необхідності, декілька біологічних зразків і декілька контрольних зразків оцінюють у різні періоди часу для захисту від випадкової варіації незалежно від відмінностей між зразками. Потім можна провести пряме порівняння між біологічним зразком або зразками та контрольним зразком або зразками для визначення того, збільшено, знижено або є аналогічним зв'язування антитіла (тобто присутність тау) з біологічним зразком або зразками у порівнянні зі зв'язуванням антитіла з контрольним зразком або зразками. Збільшене зв'язування антитіла з біологічним зразком або зразками у порівнянні з контрольним зразком або зразками свідчить про присутність тау у біологічному зразку або зразках. У деяких випадках збільшене зв'язування антитіла є бо статистично значущим. Необов'язково, зв'язування антитіла з біологічним зразком щонайменше в 1,5 рази, 2 рази, З рази, 4 рази, 5 разів, 10 разів, 20 разів або 100 разів вище, ніж зв'язування антитіла з контрольним зразком.

Крім цього, антитіла можна застосовувати для виявлення присутності тау у біологічному зразку для моніторингу й оцінки ефективності терапевтичного засобу, який застосовують для лікування пацієнта, в якого була діагностована хвороба Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинна вікова таупатія, постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматична деменція або деменція боксерів, хвороба Піка, хвороба Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скронева деменція, лобно-скронева лобарна дегенерація, хвороба аргірофільних зерен, глобулярна гліальна таупатія, аміотрофічний латеральний склероз/ комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальна дегенерація (КБД), деменція з тільцями

Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ІВМАО) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП). Біологічний зразок від пацієнта, в якого була діагностована хвороба

Піка, хвороба Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скронева деменція, лобно- скронева лобарна дегенерація, хвороба аргірофільних зерен, глобулярна гліальна таупатія, аміотрофічний латеральний склероз/комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальна дегенерація (КБД), деменція з тільцями Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (ІВМУАВД) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП), оцінюють для встановлення вихідного рівня зв'язування антитіл із зразком (тобто вихідного рівня присутності тау в зразку) до початку терапії терапевтичним засобом. У деяких випадках декілька біологічних зразків від пацієнта оцінюють у різні періоди часу для встановлення як вихідного рівня, так і показника випадкової варіації, що не залежить від лікування. Потім терапевтичний засіб вводять в режимі. Режим може включати декілька введень засобів протягом періоду часу. Необов'язково, зв'язування антитіл (тобто присутність тау) оцінюють у різні періоди часу в декількох біологічних зразках від пацієнта як для встановлення показника випадкової варіації, так і для демонстрації тенденції відповіді на імунотерапію. Потім порівнюють різні оцінки зв'язування антитіла з біологічними зразками. Якщо проводять тільки дві оцінки, можна провести пряме порівняння між двома оцінками для визначення того, збільшено, знижено або залишається аналогічним зв'язування

Зо антитіла (тобто присутність тау) між двома оцінками. Якщо проводять більше двох вимірювань, виміри можна проаналізувати у часовій динаміці, починаючи від моменту до лікування терапевтичним засобом і продовжуючи протягом курсу терапії. У випадку пацієнтів, у яких знизилося зв'язування антитіла з біологічними зразками (тобто присутність тау), буде зроблений висновок, що терапевтичний засіб був ефективним при лікуванні хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна, легкого когнітивного порушення, первинної вікової таупатії, постенцефалітичного паркінсонізму, посттравматичної деменції або деменції боксерів, хвороби

Піка, хвороби Німана-Піка типу С, над'ядерного паралічу, лобно-скроневої деменції, лобно- скроневої лобарної дегенерації, хвороби аргірофільних зерен, глобулярної гліальної таупатії, аміотрофічного латерального склерозу/комплексу паркінсонізм-деменція Гуам, кортико- базальної дегенерації (КБД), деменції з тільцями Леві, варіанта хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМАБ) або прогресуючого над'ядерного паралічу (ПНП) у пацієнта. Зниження зв'язування антитіла може бути статистично значущим. Необов'язково, зв'язування знижується щонайменше на 1 зо, 2 то, З то, 4 Зо, 5 Зо, 10 то, 15 то, 20 то, Зо то, 40 то, 50 то, 6о0 то, 70 то, 80 то, 90 95 або 100 95. Оцінку зв'язування антитіла можна проводити у поєднанні з оцінкою інших ознак і симптомів хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна, легкого когнітивного порушення, первинної вікової таупатії, постенцефалітичного паркінсонізму, посттравматичної деменції або деменції боксерів, хвороби Піка, хвороби Німана-Піка типу С, над'ядерного паралічу, лобно- скроневої деменції, лобно-скроневої лобарної дегенерації, хвороби аргірофільних зерен, глобулярної гліальної таупатії, аміотрофічного латерального склерозу/комплексу паркінсонізм- деменція Гуам, кортико-базальної дегенерації (КБД), деменції з тільцями Леві, варіанта хвороби

Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМАБ) або прогресуючого над'ядерного паралічу (ПНП).

Антитіла можна також застосовувати як дослідні реактиви для лабораторного дослідження при виявленні тау або його фрагментів. У таких варіантах застосування антитіла можна помітити флуоресцентними молекулами, спін-міченими молекулами, ферментами або радіоактивними ізотопами, і можна запропонувати у формі набору з усіма необхідними реактивами для проведення аналізу виявлення. Антитіла можна також застосовувати для очищення тау або партнерів зв'язування тау, наприклад, методом афінної хроматографії.

Всі патенти, веб-сайти, інші публікації, облікові номери та т.п., посилання на які містяться вище або нижче, повністю включені за допомогою посилання для всіх цілей у тому самому 60 ступені, як якби кожний з даних документів був конкретно й індивідуально зазначений як включений за допомогою посилання. Якщо різні версії послідовності пов'язані з обліковим номером у різний час, то мається на увазі версія, що пов'язана з обліковим номером на дійсну дату подання даної заявки. Дійсна дата подання заявки означає більше ранню з дійсної дати подання або дати подання пріоритетної заявки, що посилається на обліковий номер, якщо це може бути застосовано. Аналогічно, якщо різні версії публікації, веб-сайту або т.п. опубліковані у різний час, то мається на увазі версія, що опублікована самою останньою на дійсну дату подання заявки, якщо не зазначено інше. Будь-яка ознака, стадія, елемент, варіант реалізації або аспект даного винаходу можна застосовувати у комбінації з будь-яким іншим, якщо спеціально не зазначено зворотне. Незважаючи на те, що даний винахід описаний досить докладно за допомогою ілюстрації та прикладу з метою ясності та розуміння, буде очевидно, що деякі зміни та модифікації можуть бути зроблені в межах обсягу прикладеної формули винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1. Ідентифікація моноклональних антитіл проти тау

Моноклональні антитіла проти тау одержували наступним чином. Імунізації проводили із застосуванням або рекомбінантного тау людини розміром 383 ак, амінокислот (4ВОМ), з приєднанням Нів-мітки на М-кінці, що містить мутацію РЗО15 Гмуноген АЇ, або рекомбінантного тау людини розміром 383 ак. (4ВОМ), що містить мутацію РЗО15, в якому була відсутня М- кінцева Ніб-мітка (імуноген ВІ. Імуногени емульгували в ад'юванті ВІВІ.

Самок мишей Ваїр/с у віці п'ять тижнів імунізували інтраперитонеальним способом по 25 мкг імуногена А на день 0 і по 10 мкг імуногена А на кожний з днів 7, 14, 21, 27, 34, 48, 55 і 62.

Мишей імунізували по 10 мкг імуногена В на дні 76 і 90. У дні 43 і 98 у мишей відбирали кров і титрували проти імуногена А; в день 101 тваринам з найвищими титрами вводили бустер- ін'єкцію за допомогою кінцевої імунізації 50 мкг імуногена В, який доставляли Уг інтраперитонеальним способом і 752 внутрішньовенним способом. Проводили скринінг злитих гібридів за допомогою ЕГІЗБА проти обох імуногенів, й у позитивних тварин з найвищим сигналом проводили картування епітопів (див. приклад 2). 306 вступало в реакцію з пептидами, що відповідають залишками амінокислот 199 - 213 5ЕО ІО МО: З і залишкам амінокислот 262 - 276 ЗЕО І МО: З (згідно з нумерацією найдовшої в ЦНС ізоформи тау, це відповідає залишкам амінокислот 257 - 271 5ЕО ІЮ МО: 1 і залишкам амінокислот 320 - 334 5ЕО ІО МО: 1).

Приклад 2. Картування епітопу антитіла 306

Для картування антитіла 306 миші застосовували діапазон біотинільованих пептидів, які перекриваються, що охоплюють весь тау-білок людини 4ВОМ розміром 383 а.к. Додаткові пептиди застосовували для моделювання потенційних посттрансляційних модифікацій С- і М- термінальних кінців білка.

Біотинільовані пептиди приєднували до окремих лунок планшета для БЕЇїЇ5А, що сенсибілізований стрептавідином. Планшет блокували й обробляли 306 миші з подальшою інкубацією з антитілом, що кон'юговано з пероксидазою хрону, проти імуноглобулінів миші.

Після ретельного промивання на планшет наносили ОРО і дозволяли реакції розвинутися.

Зчитування на планшетах проводили при поглинанні 450 нм. Віднімання фона проводили з використанням значень поглинання з лунок, що не містять первинне антитіло, і поріг для позитивного зв'язування встановлювали на рівні 0,2 одиниці поглинання.

Позитивне зв'язування було виявлено для пептиду, що охоплює залишки амінокислот 199- 213 (ЗЕО ІО МО: 3) і залишки амінокислот 262 - 276 (5ЕО ІЮ МО: 3). Із застосуванням нумерації повнорозмірного тау-білка людини 4В2М (441 амінокислот) дані пептиди відповідають залишкам амінокислот 257 - 271 (5ЕО ІО МО: 1) і 320 - 334 (5ЕО ІО МО: 1). (фігура 1)

Приклад 3. Дизайн гуманізованих антитіл 306

Вихідною точкою або донорним антитілом для гуманізації було антитіло 306 миші.

Амінокислотна послідовність варіабельної області важкого ланцюга зрілого т306 представлена у вигляді ФЕО ІЮ МО: 7. Амінокислотна послідовність варіабельної області легкого ланцюга зрілого т306б представлена у вигляді 5ЕО ІЮ МО: 11. Амінокислотні послідовності СОВІ, СОН? і

СОВАЗ важкого ланцюга згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа представлені у вигляді

ЗЕО ІО МО: 8-10, відповідно. Амінокислотні послідовності СОНІ, СОВ2 ії СОВЗ легкого ланцюга згідно з Кеботом представлені у вигляді 5ЕСО ІО МО: 12-14, відповідно. Скрізь застосовують нумерацію Кебота.

Варіабельна область каппа (УК) 306 належить до підгрупи 2 миші згідно з Кеботом, яка відповідає підгрупі 2 людини згідно з Кеботом, і варіабельна область важкого ланцюга (Ми) належить до підгрупи 2с миші згідно з Кеботом, яка відповідає підгрупі 7 людини згідно з

Кеботом ІКабвбаї ЕА, евї а!., (1991), Зедиепсевз ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї Іпіегеві, Бій Еайіоп. МІН 60 Рибіїсайоп Мо. 91-3242). СОВ-11 згідно з Чотіа з 16 залишків належить до канонічного класу 4,

СОВ-1І2 згідно з Чотіа з 7 залишків - класу 1, СОВ-І З згідно з Чотіа з 9 залишків - класу 1 у МК

ІМапіп А.С, апа Тпотюп ..М. (1996) 9. Мої. Віої. 263: 800-15. |Мапіп в Тпогпіоп, 19961. СОВ-НІ згідно з Чотіа з 10 залишків належить класу 1, СОВ-Н2 згідно з Чотіа з 17 залишків - класу 2

ІЇМапіп 4 Трогпіоп, 19961Ї. СОВ-НЗ не містить канонічних класів. Проводили пошук серед послідовностей білків у базі даних РОВ (Оезпрапавє М, еї аї!., (2005) Мисівїс Асіаз Вев. 33: О233- 71 для знаходження структур, які будуть забезпечувати приблизну структурну модель 306. Для побудови Ем моделі 306 використовували структуру зв'язування антитіла з епітопом, який приймає участь у зміні конформації з РгРС на РгРБбс (код раб 1289; 5ЕО ІЮ МО: 70) І(Капуо, 2.Е., еї аІ. (1999). 9У.Мої..ВіоІ. 293: 855-863), з роздільною здатністю 2,0 А. Вона зберігає ту саму канонічну структуру для петель, як і 306. Згідно з правилом гуманізації антитіла МНН 2015 р.

МШопев5, Т.0., Еї аї, (2016), Те ІММ5 апа оші5 ої апіроду попргорієїагу пате5. тАрз5 (пер//ах.дої.ога/10.1080/19420862.2015.1114320))| пошук у базі даних ІМЕТ дозволив вибрати підходящі каркасні ділянки зародкової лінії людини, в які переносили СОВ миші.

Для УК був вибраний легкий ланцюг каппа людини з ІМС ТЯ КМ2-30702 (послідовність МН зародкової лінії людини) й ІМС ТЯСКО2г"О1 (послідовність У) зародкової лінії людини). ІМЕТ й

ІакКМ2-30702 характеризується тими самими канонічними класами для СОВ-І1, СОВ-І2 і13, що і 306 миші. ІМСТЯКМ2-30702 й ІМЕОТЯСКО2г701 належать до підгрупи 2 каппа людини. Також застосовували акцептор МІ людини АА209048.1. Для МП був вибраний важкий ланцюг людини з

ІМЕТЯМаНМ 1-69-2701 (послідовність МН зародкової лінії людини) й ІМИатЯнакш"оО1 (послідовність М) зародкової лінії людини), обидва з яких належать до підгрупи 1 важкого ланцюга людини. ІМСТЯСНМ 1-69-2701 характеризується канонічною формою СОВ-НІ і Н2 306 миші. Для дизайну 1 і 2 також застосовували МН акцептор МН людини ВАСО 1986.1 з пошуку ненадлишкових послідовностей білків у базі даних МСВІ (згідно з попереднім правилом гуманізації МНН).

Згідно з правилом гуманізації антитіла МНН 2015 р. Юопез, Т.О., єї аї, (2016), Те ІММ5 апа оців ої апібоду попргоргієїагу патев5. тАбв5 (пир:/ах.адоїі.ога/10.1080/19420862.2015.1114320) пошук у базі даних ІМСТ дозволив вибрати підходящі каркасні ділянки зародкової лінії людини, в які можна перенести СОВА миші. Варіанти послідовностей важкого та легкого ланцюгів, які одержали в результаті процесу гуманізації антитіла, потім вирівнювали з послідовностями

Зо зародкової лінії людини із застосуванням інструмента ІМСТ Юотаїп СарАЇїїдп для оцінки ступеня гуманізації важкого та легкого ланцюгів, як викладено у керівництвах комітету МНН ВООЗ. (М/НО-ІММ: Іпгегпаййопаї! попргоргієїагу патез (ІММ) тог Біоіодіса! апа ріоїесппоіодіса! взирвіапсев5 (а гемівму) (інтернет) 2014. Доступно за адресою пЕрулимли мо. іпутеадісіпев5/5егмісе5/Іпп/ВіоНем2014. раї) Залишки замінювали для вирівнювання з відповідною послідовністю зародкової лінії людини, коли це можливо, для посилення ступеня гуманізації.

Конструювали 17 варіантів гуманізованої варіабельної області важкого ланцюга та 4 варіанти гуманізованої варіабельної області легкого ланцюга, що містять різні пермутації замін пиЗОбМНМІ (5ЕО ІЮ МО: 15); пизОбМНмМ2 (5ЕБО 10 МО: 16); пиЗзОбУНМУТЬ (ЗЕО ІО МО: 17); пиЗОбМНМУтрАТ1 (5ЕО ОО МО: 18); пиЗОбУНм5 (ЗЕО І МО: 19); пизОбМНиУит1рБАтТ1186с2 (ЗЕО Ір

МО: 46); пиЗзОбУНУТрАТ1В6НЗ (ЗЕО ІО МО: 47); пиЗ3О6бМНміс (5ЕО ІЮ МО: 48); пизОбУНУТа (ЗЕО І МО: 49); пизОбУНмте (ЗЕО ІЮ МО: 50); пиЗОбУНМ (ЗЕО І МО: 51); пиЗзОбУНУЗ (5ЕО

ІО МО: 52); пизОбУНУЗЬ (5ЕО ІЮ МО: 53); пиЗзОбУНуЗс (5ЕО І МО: 54); пизОбУНма (5ЕО І

МО: 55); пиЗзЗОбУНм46 (ЗЕО ІО МО: 56); і пизОбМНу4с (5ЕО ІО МО: 57); ії пизОбМІ мі, пизОбМІ мг, пиЗОбМІ МУЗ ї пиЗОбМІ ма (5ЕО ІО МО: 20-23, відповідно) (таблиці З ї 4). Ілюстративні дизайни гуманізованих МК і МИ із зворотними мутаціями й іншими мутаціями на основі відібраних каркасних областей людини представлені в таблицях З і 4, відповідно. Заштриховані сірим області в таблицях З і 4 відмічають СОВ згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа. ФЕО ІЮ

МО: 15-19, 5ЕО І МО: 20-23, 5ЕО І МО: 46-57 містять зворотні мутації й інші мутації, як показано в таблиці 5. Амінокислоти у положеннях в пиЗзОбУНм1, пизОбМНм2, пизОобУНм6, пиЗОбМНУтТЬАТ1, пиЗОбУНми5, пиЗзОбМНУТвБАТ1в6с2, пиЗОбМНУТЬАТ1В6НЗІ, пиЗОбУНмс, пизОо6УНУТа, пизОбМНмте, пизОбМуНміт, пизОбУНмз, пиЗзОбУНУЗЬ, пи3О06МНузс, пизОбуУнНМа, пиЗзОбУНуагЬ ії пизОбУНуас перераховані в таблиці 6. Амінокислоти у положеннях в пиЗОбМІ мі, пиЗОбМі мг, пиЗОбМІ УЗ ії пиЗОбМіІ м4 перераховані в таблиці 7. Відсоток ступеня гуманізації для гуманізованих ланцюгів МН пиЗзОбМНмМ!, пиЗзОбМНмМ2, пиЗОбМНУтТЬ, пиЗОбМНУТЬБА11, пиЗОбМНУ5, пиЗОб6МНУТрАТ186с02, пиЗОбМНУТЬБАТ1В6НЗ, пиЗОбМНМіс, пиЗзОбУНТа, пи3О06УНмте, пизОобМНмії, пизОбМНуЗ, пиЗзОб6бУНуУЗЬ, пи3О6МНузЗс, пизОбУНма4, пиЗзОбУНма і пиЗОбМНмЯ4с (5ЕО 10 МО: 15-19, 46-57 відповідно) і гуманізованих ланцюгів МІ пиЗОбМІі мі, пиЗОбМІ мг, пиЗзОбМІ мЗ ї пиЗзОбМіІ ма (5ЕО ІЮ МО: 20-23, відповідно) представлений в таблиці 8. (516)

Таблиця З

Т- т хо хв

СІ я тн ще ж в оО |о 27 оо я |бвОа о і сі 55 сіті ва вве | ш в |дів

Фу о бУ| | - юю 5 ЗЕ ЕВ а 55 вв 5 бів 5 65

Ф є|ва |З е|О|дЗ|Ід Ов в 99 ||| 52| 50259

Е вія | | вІіш|--|ч о|4-|іа 514 а 5 сізо |з хх |в в|о|дс|ліо|в|ва|ве|2|с|- вівса ше |-За|сіо вісів вІіс|о о|8|Іо боб б|9|о

Ве бо |ошіоО шо шіЗішів в шішішіо шісвішіші| | ш

БІ БО |збішів|Ф|-| дю БІБ Фо оо|Ф|шів| ов | о -| о | 0 || тро | рес «е|ІІІ||е| || о а | Бі з а ЗІ Ім ЗІ З|Ію| ||| З| Ес с|с 0 527 || 5 5|5| 5| х | х | х | х | х |) х | 5| 5| 5| 5| 5) 5 о || х ІІТ в ж 8 |В я я 52 БЕ 5 55 БЕ 5 55 ж 55

Ух Ге) с з СЕ що Іс свв вівідввІвівівіадв|дІдв|дввдвввіввівіа ) | С ІЩЕ ||| ||| |) т-тІ ші себбсісІсІісІсіІсІісісісіссіІіссісІісісіссіс 1 |1|Р7 ЕЇїЕ | (ЕЇЕЇЕЕЕ Е ЕЕ ДЕ ДЕ ЕЕ ЧЕ (Е ЧЕ (Е (Е 2|2гіт мМ Її мм мм мм мм мМ мМ м мМ ММ зі|Зз|Р Фо | (оо (90|9|90о0о(|о(о(Ф(оФ(о(0о( 00 4|4|Рт -ї- ЇЇ 1.1 ее 22 ее его 5І|Б5|ІР7 ом Її мм ммМ м мм мм мМ мм мМ мМ 6б|б6іР Фо | (оо (90|9|100оо(|о(оо(оо(0о(Ф0с(с 7 |7|Рн 55 | |5151|51|51|5 5 5 |5 |5 |5 |5 |5 |5 |5 5 5 (5 8|8|Р сі | |(сіс(іс(ісуріс а с ус ус (сус ус (с (с (с (сс 9|9|РИ АЇА | ЦАЦАЦАЦАЦААА А ЦАЦАЦАЦА А ЦАЦАЦАЦА ло|чо|є (ЕЕ | |ЕЇЕЇЕЕЕ Е ЕЕ ДЕ ДЕ (ССО (Е ЧЕ ДЕ ДЕ (Е (Е

Еш ЕШи ся шк кл ни Б Бл Бл кл Кн Кл УЖ БУХ БУЖИ КУЖ БІ БІ БИ БУХ КІ КІ БІ 2|12|ігн мік | (мік мм мм мік ік мМ мік ік ік М УМ з|ї3|ІРн в|К | |вік (вік ік Кк к(в(ву ку кук ук ку ку куку 714|14|Рй РІР, | |РІРІРІРІР Р Р |Р |Р |Р Р Р Р Р Р Р Р л5|ї15|ІРн сіб | |(сіс(іс(ісурс а с ус ус (сус ус (с (с (с (сс 16|16|Р7 ДАТА | ТАЦАЦАЦА АГА А А ЦАЦАЦАЦАЦА ЦАЦАЦАЦА 17|17|ІРн -Ії |! 1.5 (тт тт ее ет тт 8ії8ігн міМ Її мм мм мм мм ММ ММ ММ УМ л9|ч19|ієн кІіК | ікікік ік ік Кк ку ку ку ку ку ку Кк ку ку кукі 2го|2го|Їгн 40 | ММ 0 01 1 п 01 о п оп 2гі|2г1|іРн 515 | |515|51|51|5 5 5 |5 |5 |5 |5 |5 |5 |5 5 5 (5 2г2|2г2|лн сс | |к/|с(іс(ісуіс с сс |с (сус сс |с сс 2г3з|2гз3|ілн кІіК | ікікік ік ік Кк ку кк ку ку кк ку к кукі 24|24|гт АЇМ | ТАМ ЦАЦАЦААА ЦАЦАЦАЦТАЦМ М М М ММ 2г5|25|Ри 515 | |515|5|51|5 5 5 |5 |5 |5 |5 |5 |5 |5 5 5 (5 26 |26|ги сі | |(сіс(іс(ісурс а с ус ус (сус (с (с (с (с (сс 27 |27 | ЇМ | (ЕЕ (є (є (Є є є (е ЇМ (ЕЕ Ге (г М ЇМ (г ММ 28|28|ги міт | |мім(ім (іму т туімут ут ут ум м т м му 29 |29|Ри | | 001010 01 1 п е6 є ОП де де ГІ ее |30|є7 кіт | |кікікік(ік к ку куту ку ку ку куток куті 31131100

В-НІ воші НИМИ Мам ам ами аа аа

В-НІ

Бош ИМНИ Мам ам аа ьаь аа ай

В-НІ 3434 |СО0 ши щи м и м нн м и М о М ж М о М о М п М ПК М о М р М КН М НН М КН НИ ВА

В-НІ со 35 в НН нінінінінін|інін|нін|ін ін нінінінін со зовн 1 со зовн 1 з6І36іР2 |мім 1 ДМ М М М М м Їм ТМ ТМ ТМ Їм м ТМ ТМ м ТМ МО

НЕГА ЕТ і КИ Сл НИ БУЛО БУЛО БУОНИ БУЖНИ КОНІ КРОНИ КУОНИ БУОНИ КУОННИ БУОНИ КУЯНИ БУЗННИ КУТИ БУЛИ КУЛІ БУЖНІ ВУЗІ з8/І38 2 |ВІО у |вувувуА ву АВ АВ в |В ВВ В. 391392 (ФО / (00909 уо(о(о(о (ооо 9999 401402 |НА ДАЦА (В (В (в (8 (в (В (А (8 (А ЦА СА ЦА (В (В (В ман |РІР РР РР РР РР |Р Р |Р Р Р |Р |Р РР. 424212 |(ЕЇ | Ц|ЕЦЕЦЕ |(с|с|с|с ЦЕ (ЕЕ (с |с (с |с |(с 43432 |0ЇїК Її 009909 ок |к (о (о о Ок (Кк Кк ко 444412 |б|с | |бу6уо ус |с ус |с|с |с/|с |с/|с с |с сс 45452 1. 71 01 0Аі 1-11 1-1 1. 12 1. 12 1. ТТ ТА 1. ТЦ 4646 іР2 ІДЕЇ | (|ЕЦЕЦЕЦЕ ЦЕ ЕЦЕЦЕ ЕЕ ЕЕ Е ЕЦЧЕ ЕЕ тата ММ 17 ДМ ММ ТМ Гм ТММ Гм ТММ Гм ТМ ТМ ТМ ТММ ТМ ТМ ТМ аві4в8ін2 ІМ 71 Подм по о дмум т о умум му, ум ум со бе / 555 сівівівюювювв сю со рили м ре рр рн р рр рр вм | ТЕ 5252 ІвНгІрІр у |оуо/уо о/р /о/р/о оуоуруроур со

БА 53 |В Но зві Її ЇЇ 1 11111111 сі Її ГГ 11717111 со 53 | 54 В-Н2|Е|Е Е|ЇЕ|Е|Е) ЕЕ) ЕЕ ДЕ ЕЕ Е ЕЕ (Е (ЕЕ со соче | ою в р рев юю со ее | 6 ооо свв юю сю 56/57 АНгІОЇЕ |у |у (оо ооо рус ват | ГГ м | У вію со соетіянар | ооо Ас ААА вс А рр внаиє | ее ее де де де де ее ее дере в2гІ63ІєЗ |КІК 7 кукукукукукукукукукуікуік куікукукуку 6364 РЗ || 71 6 ЕЕ (Є Є (Є Є ЕЕ (Е Є ЕЕ ДЕ ДЕ ДЕ ДЕ 64653 |0О / (00909909 (ода оо 99 65/66/РЗ |с|0 / |0у|0|со|со|с|с |с ус ус ус |с са |с ус ус с 66/67 З |КІА у кКувукув ву ув уяву увук вв 67683 ІАЇМ / ТАМ ЦАЦАЦАЦАЦАЦМ М м ММ М МТА 68/69 З ТІ 71 |7тітуітутуітутуітут ті ті туту 6917013 ПО 7 0700 опо 7о|7ієз (тії 1 тт т тт рт т рт т т т т т

71|72|еЗ ІАТА ТА ЦАЦАЦА А А А А ДА А ТА ТА ТА ТА ТА ТА ЦА 72|73|иЗ |0|о її ооо уро оо (оо ооо о ооо ур 73741 З |тІТ 71 тутутутутутуітутітіт тт т утут 74175123 |5|5 | |515)|5)|5 1555 |5 |5 |5 |5 |5 5 |5 |5 5 |5 7517613 |5|Іт | |у тут тут ото уд 76|77|єЗ |МІО у |мумумуо ооо ум ум ум оо ум ум умо ур 7/|781єз |тІтї 71 тут ут ут тт т рт т т т то ут 781793 (АГА / ЦТАЦАЦАЦА А А А А А А А А А А А А ЦА тав МІ ТО Дю воІ81ієЗ (ІМ 7 му. А А А.А г. 1. ГТ. м мм іму. Т.Г ві|82іРЗ ЗЕ | |О9ЕЦО|О|ОЕЦЕЦО|О|Е ЕЕ ЕЕ ЦЕ ЕЕ. вгі8з3ієЗ (І. 7 100 1Аі 107.01) 1. 12 1. 12 1 1. 01. 1. 1. ТЕ 82АІ84 РІЗ |0|5 / |5|5|0|0|о|с |с|с |с/|с |с/|5 с |с|с сс 828вІі85 З |5|5 / |5)|5)|5)|5|5)|5|5|5 |5 |5 |5 |5 5 |5 |5 |5 |5 в2сіввієЗ 0.1. 7 1едле ле ЛА 171-414 1-4 1-1. 12 1. 1 1. 1. 1 83187 РЗ |ТІА її |7тітуітуітуітутуітутуітутуітів в в т утурпту 8488 З |5І5 / Б'БІБ БВ |5В В |5|5|5 555 БВ 8589 З ІДЕЇ | Ц|ЕЦЕЦЕЦЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЕЕ ЦЕ ЕЕ 86/90 РЗ |0|О у |у ооо |у оо оо о ооо ур 8791 ієЗ ті 7 тітуітутуітут тут іт т тт т о отут 88/92 РІЗ АГА ЦТА А ЦА А А А А А ДА ДА ТА ТА СА ТА ТА ТА ЦА

ВЕЕЛЕЕН Ех КЛ КЛИН НИ КУЛІ БУЛО КУЛІ БУЛИ КУЖНИ БУЖНИ КУОНИ БУЗНИ КУОНИ БУЖНИ КУОНИ БУЗНИ КУТИ КУЛІ КУЛІ КУЯНІ БУЛИ вот МІ 1 ДИ 1953 ІМ 71 ЄМ Є є є ЕЕ ЕЕ ТЕ 82196 РІЗ |С|С А |С|сС|с|с |с |с |с |с |с |с |с |с (с |с |с с с зіва ОТ Е со візі ЧНО со лові 11 со рі 1 со зреві 1 со зві 11 со те ІТ 100 я ТП 100 в

М УМИИ и НИ ШК ЕН НН НА НИ Я АХ НИ НИ НИ В НА БАБКИ Б с

БУМ НИ и НИ НК НН НИ А НИ Я НИ НИ НИ НИ НА НА БАБКИ БЖ о

БМ ЕМО НЕ НО НО НИ А НИ Я НИ НИ НИ НИ НА НА БАБКИ Б

Е

ВН НИ и НО НК НО НО НИ А НИ НИ НИ НИ НИ НИ НА НА БАБКИ Б

Е

МНЕ и НЕ ШК ЕН В НИ НА НИ Я НИ НИ НИ НИ НА НА БАБКИ Б а

БУМ А и НИК НК НН НН НИ НО НИ НУ АХ АХ НИ АХ АХ У Б БИ Б

Н

"ООДДДДДДЕЕТ юю ГГ 100

ВЗН М Но НИ НА МИ НА НИ НИ А КУ А НИ НКИ А КИ А НИ БА (ФВ)

СОС сеи сни сНИСЯ СЯ СЯ Сися СЯ СЯ сися СЯ сися СЯ сисися яма! (ер ке керує ре хе є юр созовІга ММ ТММ М ТМ ТМ ТМ ТММ ми ЛУ ТМ ТМ ТМ М Гм ЛУ ММ со4109|Р4 (б! 0 |суо0 оо |су|ау|о о ус у|су|со|сос|сос о (с сло5ллоЇєа (ОЇ ло (оо оо о 19 до оо оо оо 49 о обі ІРа4 (б! 6 |в обо |су|ау|о оса у|с |в | о (с ло7л12|га (т! т тут тт т тт т тот т тот тт совіяізІРа (т! 7- ее. 7. ее, ле ле т т Пе ее 1 его лооплі4|ла ЇЇ мМ УМ М МУ У М ММ ЕМ ММ М ММ орл5|га (т! т тут тт ут ут ут ут отут тут ірлієіїла МГ мМ мМ М МУЛУ М ММ У УМ М ММ ММ 217 |г4 |86| 5 |5|5 55151515 515 |5 |5 |5 5 5 15 5 |5 лзрлв|Ра |5| 5 5515/5115 )|5)|5 5 )|5 )|5 |5 |5 |5 |5 5 5 |5

Таблиця 4

Облік. Мо Облік. Мо

З |з (|Р М ЇМ Її їм 7 1М! 7 ХУ 4 |4|Р ІМ мМ Її ім м! м'м' |5|РИ Її Її Її 717 1710177 017 г 6 |6|Рл о (0 Її 7 190 0109! 0 7 |7 | Її 5 ЩщЩщБМ Її Ів 1/8! 77 |в Її 8 | 8 (| Р |Р ЇЇ 77777 7 ІРР? (Р ОЇР 99 (|РИ Її 0 Її 7- 1-7 ло фло ІТ 5 щБ« ЇЇ (Б 5 | |5Ї 2 щ Ж |в |З лі лів 0 01 /Г7117177777117-Г777777171є 72 |л2|Ри 5 |Р Її 77777715 17 (Р? Р 5 С 713 (із |Р М ЇМ Її М 7 МГ ХУ 714 |л4|Р т (7 Її 17777 17171111 тт 215 (15 І ОО 01 ГГ 716 |л16|Рй (6 (6 Її 77777 1а777 11 0186Ї 7 а а 717 |п7|ІРн до (0 Її 7777 19077171 0юЇ 7 о 8 |в |Р |Р ЇЇ 77777777 16 1 (Р? (РОЇ, 719 |л9|Рй ТА ФА ЇЇ 77777 ТА 0 ФАЇ 7 ФА СА З: |20|РИ |5 |5 ЇЇ (5 | |5Ї! 55 21 |21іР ОО 01111111 22 |22|РИ |5 |5 ЇЇ (З ІЗ (5! 55 23 |2з3|РиИ |С |сС ЇЇ 77777777 1с 7 17 |1с! 777 (сс 24 | га |СОНЇК Кк Кк Кок 1

ЕЕ 1-81 яв 22221

Сов- «ее 31186

ЗОНИ СИНИ НИ ЕНН НО: ПОН СТИ СН

ЗАЧ ЗОНИ НОЯ ЧОН НУ ННЯ ЧО ЗА

ЗНО СОНЯ НОЯ ЧОН НУ НОЯ ЧНО ЗА

Сов- ре 1 Р 16

ЗОНИ СЛИНИ НИ СН НО ПОН СТИ СН

Сов-

ЕІ СЯ сі І НИ ННЯ Я ОП п Б НОЯ

Сов- ер 316166

ОСІ СЛИНИ НН СН НС НОЯ СТИ СЛ о СЗНИ СЛИНИ НО СН НС ВОНО СЯ ЗНННЯ оо СНИ ННЯ СОН ВО НОЯ СЯ СЯ дО СОНЯ ННЯ СЛ 3 СОНЯ НАХ НОЯ

За НО ЧИНИ ННЯ ЧОН У У УНН НО ПНЯ

С НО СЛИНИ ОНИ СЛИНИ СТАННЯ НАХ НЯ з |4|н2 | М Її м ІМмММм

З |42|л2 | | Її 77 - ШЕ ЇЇ 37 |43|н2 | 10 Її 77777711 ш-- ЇЇ з |44|н2 | 0 | 9 99 39 |45|л2 | | | в ВІЇ | Її 40 |46|22 | |. | 777777 Р 1РІРІР | ЇЇ ам |4|н2 | |в | сб |(всбіб 42 |48|н2 | 0 | 9 9940 ЇЇ аз |49|н2 | |5 | 8 585 | ЇЇ 44 |50|н2 | |Р. 7 | 77777 Р 1РІРІР | ЇЇ 45 |5Б|н2 | |В Ї7777771171кК ІВІВїК Її Її 46 |52|н2 | | | в вів | ЇЇ 4 |53|н2 Її | Її 77777711 6 Її ГГ 48 |54|н2 Її 1111 11111111 п11г 49 |55|ЇН2 | | | їм ММ Ії

Сов- «1 Є 1

Сов- рю

Сов- ее 176666

Сов- ее 1

Сов- ее юю 112

БА

Ссов-

ПСО сьа нн СИНИ ННЯ СТАННЯ С С СНИ Но НАННЯ

С НО СИНИ ПОН СН ТС СНИ Но НАННЯ 57 63|іЗ | 16 | 4 (вс 58 в64|іЗ ЇЇ М ЇМ МММ ї1г 59 65|З | Р. 77717171 РІ (РІРІР 11/11.) 60 66|гЗ 077777 77771717 06 рр 177 17. 61 1 67|єЗ ІА 77 я (ВВІВ 17 ваг 68|РЗ Р 7 77777171 є ЕЕ 1711 63 69|РЗ | 5 МГ | ( 58 |88І5 64 70|иЗ 16 | 4 (вс ( 65 7|інЗ | 5 | 8 |88І5 | / 66 72|нЗ | 16 | 4 (вс 67 73|нЗ | 15 | ("6/8 18815 1717 1. 68 74|іЗ 16 | с (вс ( 69 75|2З3 Ії 7 07 07 1 70 176123 0907777 77717171 06 ррір 171

Я 773 1 ЕЕ 7771111 є ЕЕ 7 72 7т8|нЗ 7 1711 11111111 тт 1 73 79|ЕЗ 7 12111171 617 74 8013 7 Ко 11111111 ко дк 1 75 813 Її 11111111 76 | 82|З 71577711 77171718 5815 1711711 77 |83|З А | 777777 я ввів 7 78 84|іЗ 7 М 11111111 МММ 1г 79 | 85123 | ЗЕ | ЕЕ (ЗЕЕЕ | 2 щ оз 80 86|гЗ | ДА 7777 | 777777 ДА ФААА | С .у 81 187|єЗ | ЗЕ | ЕЕ (ЕЕ || щ "У/ Б) 82 88|гЗ | 60777777 71717171 06 ррір 177 17. 83 89|РЗ М Ї111717171171М МММ 1г 84 90|гЗ | б | 4 (вс 85 913 7 М 7 Ї11111711171М МММ 1г 86 92|РЗ М 11111171 ММ 1 г 87 93|З ЇЇ 11111711 ДМ 1 88 94|иЗ с 77171711 0с1111 |ссіс 7 1771

Ссов-

НСЯС ан СН НИНІ СЛИНИ ССС Но НАННЯ

Ссов-

ІЗ

Ссов-

НСС сан НН НИНІ ННІ С С сни Но НАННЯ

Ссов-

Псла нн сон НОЯ СНИ С С сли Но НАННЯ

Ссов-

ПСО сан СИНИ НИНІ СТАННЯ СС СНИ Но НАННЯ

Ссов-

ПС Стани СНИ ННЯ САНЯ С с Сни но НАННЯ

Ссов-

ПСИ Стса нн СН НИНІ СНИ СС СНИ Но НАННЯ

Ссов- ее ШО

Ссов- ет

Ссов-

ССО сьа ни ПОН ННЯ ПОЛЯ М о Но Но НОЯ

СсОоВв-

ВСУ етія НИ ПИ НИКИ КОНЯ НН АННИ НИ НААН

СсОоВв- є! в 11111111

СсОоВв-

ВС етія НІ ПИ НОЯ КОНЯ НН АННИ НИ НААН

СсОоВв- вве хх М 1 в | 0 98 |104|1Р4 | 17777771 є (ЕЕ ЇЇ 77 99 |105|1Р4 | (7777/6776 (біді 1 |! 777 ло |ловб|ілЯ | 17777711 с | 6 |в 4 лот 1о7|Я | 17777777 (601 | 6 |в 4 лог |лов|іЯ. | ї77777777171717171717711111111т 07177777 тот лоз (лое|Я. | 777777171717171717171717711111717111к кі! ік 77 кїк ло4 | ло|я | 11111111 лоб (ті |іЯє | 17777717171717171717171771717171717171717171 1 ФЕЇ ДЕ длЕ ДЕ лоб | л1а|іня |. 17111111 оба лІ3|РЯ | ОО ї17777777717171717171771111117111к кі! ік дкїк 107 | п4|бя | /ї777777777171717177777717171717171177771117 в! я Ів |в

Таблиця 5

Зворотні мутації й інші мутації МН, МІ. для гуманізованого 306

Зміни у порівнянні із залишками

Екзон акцепторної послідовності Мн або акцепторної каркасної ділянки (або

Варіант Мн або Мі М СОР) (на основі СОВ згідно із й зведеним визначенням

Кебота/Чотіа)

НиЗОбУН Обліковий код МСВІ ІМТ ІС6щ13М1-69-| Н12, НІ13, Н17, Н24, НЗ8, Н42, На, (ЗЕОІОМО-15) 2701 (ЗЕО (10 МО: 25); Обліковий код|Н4і8, Нбб, Нб7, Н7б, НВО, НВ81, На83,

І МОВІ Мат танго (ЗЕ (ПО МО: 26 Не, неЗ

НиЗОобУНУу? Обліковий код МОВІ Мет танм1-69- (ЗЕОІОМО-16) 2701 (ЗЕО (10 МО: 25); Обліковий код|НЗ8, Н42, Н4З, Н7б, Н8г3, НОЗ

І МОВІ Мат танго (ЗЕ (ПО МО: 26

НиЗОбУНМЬ Обліковий код МСВІ ІМТ ІС6Ж/3М1-69-| Н12, НІ13, Н17, Н2г4, НЗ8, Н4О, Н42, (ЗЕОІОМО-17) 2701 (ЗЕО (10 МО: 25); Обліковий код| Н4З, Н4в8, Нбб, Нб7, Н7б, НВО, На1,

І МОВІ Мат танго (ЗЕ (ПО МО: 26 Н8г2А, Н83, НО, НОоЗ

НиЗОбУНМЬАЙ |Обліковий код МОВІ ІМОТЯ І6НМТ-697 2, Нд, НЗВ8, НО, НАЗ, НАВ, НОТ, (5ЕСІОМО:18) 12001 (ЗЕ (О МО: 25); Обліковий код НВО, нав, НВгА, НВ, НОЇ, НОЗ

І МОВІ Мат танго (ЗЕ (ПО МО: 26 ' ' ' ' '

НиЗОбУНУБ Обліковий код МСВІ ІМТ ІС6п/3М1-69-| Н12, Н2г4, Н2г8, НЗ8, Н4б, Н4З, Нав, (ЗЕОІОМО-19) 2701 (ЗЕО (10 МО: 25); Обліковий кодіН54, НбО, Нб7, НВО, НВ1, Н82А,

І МОВІ Мат танго (ЗЕ (ПО МО: 26 Н83, НО1, НОЗ

Ни Обліковий код МСВІ ІМСИТЖ 1СНМ1-69-| Н12, Н2г4, Н2г8, НЗ8, Н4б, Н4в8, НО,

ЗОбМНМІБАїІВбагІ12701 (5ЕО (10 МО: 25); Обліковий кодіН54, НбО, Нб7, НВО, Н8В2А, НВ3,

ЗЕО ОО МО:46) | МОВІ Мат ану (БЕ (10 МО: 26 Не, нНеЗ

Ни Обліковий код МСВІ ІМИаТЯ НМТ -69-

ЗО6УНМЬАТВОНІ| 201 (5ЕО (0 МО: 25); Обліковий код ло" Пе ОА Не Неї но

ЗЕО ІО МО:47) | МСВІ ІМОТЯ ІЯНУО1Т701 (5ЕО (10 МО: 26 ' ' ' ' ' '

НиЗОбУНМе Обліковий код МСВІ ІМТ ІС6М1-69-| НІ13, Н17, Н2г4, Н2г9, НЗ8, На, Не2, (5ЕО 10 МО:48) 2701 (ЗЕО (10 МО: 25); Обліковий кодіН43, Н5Ь4, НбІ, Н7б, НВО, На,

-0- НІЗ, Ні7, Н2а4, Н27, Н2В, Н2о, НЗО,

Низобунма 0 (Обліковий код МОВІ ІМОТЯ ІЗНМТ-691,38, на, Н42, НАЗ, Н51, Н5БА, НВО, (ФЕО 10 мо49) |2 01 (ЗБО (0 МО: 25); Обліковий кодінвї нНуб, НВО, НВІ, НВгА, Н8З 9) Мовимете вної (ЗБОЮ Мов) Но " НВЗ, -0- НІ, НІ2, НІ7, Н24, Н2В, НЗВ, Но,

НизОовУНМе У (вЕО Ко МО: 25). Обліковий тод Н42, НаЗ, НАВ, Н5БА, НВО, Нет, НУ, (ВЕОІО МОВО) СВІ Мет СНО (ЗБО (0 МО. ов) Нео, НВгА, НВ83, НОЇ, НОЗ, НІО8,

Обліковий код МСВІ ІМОТ ІСНМ1-69- 10, На, НІ7, Н24, Н28, НЗВ, НО,

НиЗовУНМі о (БО (О МО. 25) Обліковий код 13, 48, НБІ, НБА, НВО, НОМ, (ВЕОТО МОВІ) СВІ Мет СНО (БО (0 МО ов) нега, Н83, Неї, НеЗ, НІО2, НІО8,

Обліковий код МСВІ ІМОатТЯ ІС;фМ1-69- (ЗБОЮ Мово) 201 (ЗЕО (0 МО: 25); Обліковий код НЗ8, НОЗ 92) | МСВІИ Мета сно (ЗО (10 МО: 26

Низобунузь (Обліковий код МОВІ ІМОТЯ ІЗНМ1-691,447 Но, ного, НЗ8, Неї, НТВ, (5ЕО 10 МО:53) 2701 (ЗЕО (10 МО: 25); Обліковий код НегА. НОЗ 93) | МСВІИ Мета сно (ЗО (10 МО: 26

НиЗОбУНУЗс У (вЕО Ко МО: 25). Обліковий тод НІ7, Н27, Н28, Н29, НЗО, НІВ, Н51, (ВЕЛО МОВИ) |У сти сн РО Мов НА, НВО, НЕТ, НТ, НВ2А, НОЗ

НизовУНмЯ Обліковий код МОВІ ІМСТЯ ІСНМ1-69- 42 Нзв, наО, Нав, Неб, Нет, Нв, (ЗЕО1ІОМО:55) 2701 (ЗЕО (10 МО: 25); Обліковий код НВО НегА. Н83. НОЗ

МСВІ ІМСТа ІОНУТО1 (ЗЕО (10 МО: 26 , НВЗ,

Низобунуль (Обліковий код МОВІ ІМОТЯ ІЗНМ1-691,12 НІ7, Н27, Н2о, НЗВ8, НА, НОЇ, (010 МО:56) 2701 (ЗЕО (10 МО: 25); Обліковий код НВО НегА. Н8З. НОЗ 96) | СВІ Мета сно (ЗО (10 МО: 26 , НВЗ, позОбунояс Обліковий код. МОВІ ІМСТЯ ІЄНМ1-69ЧН2, НІ7, Н27, Н2В, Н2о, НЗО, НЗВ, (ЗЕОІО МОБ) 0201 (БО (0 МО: 25); Обліковий кодіНЯО, НБІ, НБА, НЕО, НЕТ, НВО, 97) | МСвВІИ Мета сно (ЗО (10 МО: 26) | НВгА, Н8З, НОЗ

Обліковий код МСВІ ІМСТЯСКМ2-30702

І МОо. (ЗБОЇ (БО (0 МО: 27); Обліковий код МСВІ112, 136, 137,145,1100

ІМСТЯСКО2"О1 (ЗЕО (10 МО: 28

Обліковий код МСВІ ІМСТЯСКМ2-30702

ВИНИ (ЗБОЇ (БО (0 МО: 27); Обліковий код МОВІ 36, 137,1100

ІМСТЯСКО2"О1 (ЗЕО (10 МО: 28

Обліковий код МСВІ ІМСТЯСКМ2-30702

Мо (ЗБОЇ (БО (0 МО: 27); Обліковий код МСВІ 136, 137,160,1100

ІМСТЯСКО2"О1 (ЗЕО (10 МО: 28

Обліковий код МСВІ ІМСТЯСКМ2-30702

МО (ЗБОЇ (БО (0 МО: 27); Обліковий код МОВІ 12, 17,112,115,136,137,145,1100

ІМСТЯСКО2"О1 (ЗЕО (10 МО: 28

Таблиця 6

Нумерація Кебота залишків каркасної ділянки (або СОР) (на основі СОВ згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа) для зворотних мутацій та інших мутацій у важких ланцюгах гуманізованих антитіл 306 858 щ2 во | ви Ів "Е| Б аІі5ір хх |||: 089

В|5 55 Во |І3|5|5|5|5| 5 5| 5 5 | 5 | 5 щі Ж тІтІт|5Іт ЗІЗ ші що шт (я В хх | |і в ее ох в в спосо оо (со) о Ге 5 Ге 5 ть) ть) ть) щ-15З ть) ть) ть) ть) ть) ть) ть) ть) ть) ть) ть) ть) с | 5-8 тіт|т|Ттіт т гтгіІгтІтг|Іт|Іт|ІтІ т | т| т | т | г

НМ ІЕ | (ОО О(Е О|О|СОЕ |(Е|О|О Е|Е|ЕЕ (ЕЕ (Е Е негАЗз | |б в (5 бісів |(сіс|с сіс|5|с |с | |в ос назв | (тітітотітітт (гтітуітотуітівів |в т от пт ни М | ІЄЕ( М ЕЕ (гіЕ (є Є Є ЕЕ ММ ММ М м ніог. Ін (є Е (Є є (є (бє (є (є є є (М є (є г (є Фе є нов 0 т - 0. - 0-1. се т т ее 02 0 0 - ноя! ЇМ ГЕ мМімМмМ М мММ мМімім ЕМ М ММ М м

Таблиця 7

Нумерація Кебота каркасних залишків (на основі СОВ згідно із зведеним визначенням

Кебота/Чотіа) для зворотних мутацій та інших мутацій в легких ланцюгах гуманізованих антитіл 306 танцю (Легкий зоб

Залишок ІМСТЯСКУО- ланцюг) миші НизОбМІмі| НизОбМмІ ма. ІНизОбМІ м3| НизОбМІ м4 3002 Іматяакуг"ої а МСГ ММ пед ИМЯ ПНЯ ПЕ А КОНЯ ПЕ ЗОН Бк кон ще Р ЇЇ 77777718 |в Р Р 8 ще ї- Ї777777777171171171 01111111 36 1Е Її 0 7-77 37 19 Її 01 71-7777171-7771- 45 |В Її 77777777 Ко 6їко в в 9 їК- во 00 Її 77777777 0ро 607 01111151 р; -щоо | (0 |в | в б гів «

Таблиця 8

Відсоток ступеня гуманізації важкого та легкого ланцюгів гуманізованих антитіл 306

Положення, в яких канонічні, верн'єрні залишки або залишки поверхні взаємодії відрізняються між акцепторними послідовностями миші та людини, є кандидатами для заміни.

Приклади канонічних/ взаємодіючих з СОВА залишків включають залишки згідно з Кеботом Н24,

Н27, Н2г9, НЗ4, НЗ8 і Нб7 в таблицях З і 4. Приклади залишків поверхні взаємодії/ залишків упаковки (МН -- МІ) включають залишки згідно з Кеботом Н40, Н4іЗ3, Н48, НО1, НОЗ, 136, 198 і

Ї100 в таблицях З і 4.

Основи для вибору положень, що зазначені в таблиці 4 у варіабельній області легкого ланцюга як кандидати для заміни, є наступними.

О100сі являє собою мутацію залишку, який здійснює контакт із залишком поверхні взаємодії. ЕЗбІ і МВ9М/ являють собою мутації залишку поверхні взаємодії. М2І являє собою мутацію частоти/ вирівнювання із зародковою лінією. 57Т являє собою мутацію залишку, який аналогічний 5, і може характеризуватися аналогічною імуногенністю. Рі25 являє собою мутацію в спробі посилення контакту з Е105. І 15І являє собою мутацію до залишку, який аналогічний І.

В45К являє собою мутацію до залишку, який аналогічний А. 605 являє собою мутацію до 5, оскільки О являє собою прогнозований сайт розщеплення протеазою.

Основи для вибору положень, що зазначені в таблиці З у варіабельній області важкого ланцюга як кандидати для заміни, є наступними.

М24А являє собою мутацію канонічного залишку НОСОВІ. Мб67А являє собою мутацію залишку, який здійснює контакт із НСЮОНВ2. ОЗ8А являє собою мутацію канонічного/ взаємодіючого з СОВ залишку. А4ОВ, К43О0) і М48І являють собою мутації залишків, які здійснюють контакт із залишками поверхні взаємодії. М91Е і АЗЗ35 являють собою мутації залишків поверхні взаємодії. КІ2У, М80Ї і ЕВТО являють собою зворотні мутації на основі частоти або мутації для вирівнювання із зародковою лінією. 582асі являє собою мутацію для дослідження збільшеного зв'язування.

З у залишку НІ17 згідно з Кеботом в пиЗОбУНми2 був одержаний з акцептора МН людини, облік. Мо ВАСО 1986.1.

М у залишку Н2О згідно з Кеботом в пиЗОбУНм1 і пиЗОбУНмаг були одержані з акцептора УН людини, облік. Мо ВАСО1986.1. М у залишку Н102 згідно з Кеботом в пиЗзОбУНмІ1ї був одержаний із структурної матриці МН Мих (РОВЯТСНО Н; 5ЕО ІО МО: 70) і з моноклонального антитіла миші 6А10 проти тау.

Гуманізовані послідовності були одержані із застосуванням двоетапного протоколу ПЛР, який дозволяє вводити декілька мутацій, делецій та вставок із застосуванням сайт- спрямованого мутагенезу ОцікСпапде (Мапо, М. апа Маїсоїт, В.А. (1999) ВіоТеснпіднез 26: 680- 682).

Дизайни на основі даних каркасних областей людини були наступними:

ВАРІАБЕЛЬНА ОБЛАСТЬ КАППА пиЗОбМІ мі (ЗЕО ІЮ МО: 20):

ОМУММТО5РІ 5І ЗМІ ОРАБІЗСКЗЗОБІ ЇЇ ОБООКТУ ММ ОВРООЗРКАГІМІ М

ЗК озамМмРОовЕЗзазазатОвТІкІЗАМЕАЕОМа У УС ОСТНЕРУТРОаСаИткіІ ЕІКА пиЗОбМІ м2(ЗЕОІОМО:21):

Коо) ОМУММТО5РІ 5І РУТ ан ОРАБІЗСКЗЗОБІ ЇЇ ОБООКТУ ММ ОВРООЗРАВИ МІ 5 коБ5амУРОовВЕЗаБЗаЗаТОЕТІ КІЗАМЕАЕОМаУМУСМУОСТНЕРУТРОССИТткКІ ЕІКА пиЗОбМ мЗ (ЗЕО ІЮ МО: 22):

ОМУММТО5РІ 5І РУТ ан ОРАБІЗСКЗЗОБІ ЇЇ ОБООКТУ ММ ОВРООЗРАВИ МІ 5 кОоБамУРЗАЕЗзаЗавзатовЕтіКІЗВМЕАЕОМаУУУСУМОСТНЕРУТРСаСОИткіІ ЕІКА пиЗОбМІ м4 (5ЕО ІЮ МО: 24):

РІММТОТРІ 5І 5МТІБОРАБІЗСКОЗЗОБИ ОоБСОИакКТтУІ ММ ОКРООБРКАИМІ 5 коБ5амУРОовВЕЗаБЗаЗаТОЕТІКІЗАМЕАЕО Ма У УСМОСТНЕРУТРаСсаИткі ЕІКА

ВАРІАБЕЛЬНУ ВАЖКУ пиЗОбУНмІ (ЗЕО ІЮ МО: 15):

ЕМО МОБЕАЕУМУАРОАЇ УКУЗСКАЗСЕМІКОМ МІ НУУВОАРЕОИЇ ЕУММЛОУМІОРЕ

МартуУМОРКЕОСКАТІТАОТЗТМТАМІ ОЇ 551 ТЗЕОТАМУЕСЗТІ ОР ОСТІ МТУ пиЗзОбУНмаг (ЗЕО ІЮ МО: 16):

ЕМО МОБ АЕУККРОАБУКУЗСКУВИИЄМІКОММІ НУУАОАРЕОСІ ЕУУМОУУОР

ЕМаВЮТУМОРКЕРОСАМТІТАОТЗТМТАМУМЕЇ 551 ТЗЕОТАМУМСЗТІ ОРМСОСТІ МТУ55 пиЗОбМУНмтЬ (5ЕО ІЮ МО: 17):

ЕМО МОБСАЕМУВРОАЇ УКІЗСКАЗСОЕМІКОУ МІ НУУВОВРЕОаГ ЕУММІСУМІОРЕМ

СОТММОРКЕОСКАТІТАОТОТМТАМІ ОЇ! 51 Т5ЕОТАМУЕСЗТІ ОБМУС,СОСТІ МТУ55 пиЗОбУНМрАЇ 1 (5ЕО ІО МО: 18):

ЕМОЇ МОБАЕУУКРОаАТУКІЗВСКАБСОЕМІКОУ МІ НУУВОВРИОаССІ ЕММІСУМОРЕМ арТтуУМОРКЕОСВАТІТАОТЗТОТАМІ ОЇ Я5І Т5ЕОТАМУЕСЗТІ ОЕМ ОСТІ МТУ пиЗОбУНм5 (ЗЕО ІО МО: 19):

ЕМОЇ МОБЕАЕУМУКРОАТУКІЗСКАБОЕТІКО УМ НУУВОВРИОаГ ЕМІСУМОРЕО

СОТММАРКЕРОСВАТІТАОТЗТОТАМІ ОЇ! 51 Т5ЕОТАМУЕСЗТІ ОБМУС,СОСТІ МТУ55 пиЗОбУНМ БА 186а2 (5ЕО 10 МО: 46):

ЕМОЇ МОБЕАЕМУКРОАТУКІЗСКАБЗОЕТІКО УМ НУУВОВРИаКаї ЕУЛЛОУММОРЕ рартуУмМАРКЕРОСВАТІТАОТЗТОТАМІ ЕІ 5 Т5ЕОТАМУЕСЗТІ ОРМУСОСТІ МТУ55 пиЗОбМУНМ БА 186НЗ (5ЕО І МО: 47):

ЕМОЇ МОБЕАЕУМУКРОАТУКІЗСКАБОЕТІКО УМ НУУВОВРИаКаї ЕУМЛОУМЛОРЕО

СОТММАРКЕРОСВАТІТАОТ5ТОТАМІ ЕІ 51 Т5ЕОТАММЕСЗТІ ОРУСОСТІ МТУ бо пиЗОбМНмс (5ЕО ІО МО: 48): бо

ЕМОЇ МОБСАЕУКАРОАЇ УКІЗСКАЗСЕМЕКО УМ НУУВОВРЕОСІ ЕУ/МСОСУМОРЕ

МартуУМрЕКЕРОаАМТІТАОТЗТМТАМІ ОЇ 51 Т5ЕОТАММЕСЗТІ ОРУСОСТІ МТУ55 пиЗО6УНУТа(ЗЕОІОМО:49):

ЕМО МОБСАЕУКАРОАЇ УКІЗСКАБОаМ ТЕТОММІ НУУМАВОВРЕОСІ ЕМ МОМ МОР

ЕВИОЮТУУАЕКЕРОСЕАМТІТАОТЗТМТАМІ ОЇ 51 Т5ЕОТАММЕС5ТІ ОР МУСОСТІ МТУ пиЗОбМНмте (З5ЕО ІО МО: 50:

ЕМОЇ МОБИАОУУКРОАЇ УКІЗСКАЗСОЕТІКОУМІ НИ УВОВРЕОСІЇ ЕУММІСУМІОРЕМ

СОТММАЕКРОСАМТІТАОТОТМТАМІ ві 51 Т5ЕОТАУМЕСЗТІ ОБМУ,аОСсТТ тУ55 пиЗОбУНмМ І (ЗЕО І МО: 51):

ЕМО МОБИАВУУКРОАЇ УКІЗСКАЗИОЕТІКО УМ НУМВОВРОСС ЕМ МОРЕ рартуУмМАЕКРОСаВАМТІТАОТЗТОТАУМЕЇГ а5І ТЗЕОТАММЕС5ТІ ОМУуСОСТТІ ТУ55 пиЗОбУНУЗ (ЗЕО ІО МО: 52):

ЕМОЇ МОБЕАЕУККРОАТУКІЗСКУЗСОЕМІКОУ МІ НУУВОАРОКа! ЕМ МСУМІОРЕ

МартуУМОРКЕеОСАМТІТАОТЗТОТАММЕЇ 551 А5ЕОТАУУУСЗТІ ОРУСОСТІ МТУ пиЗОбУНУЗЬ (ЗЕО ІО МО: 53):

ЕМО МОБСАЕМККРОАЇ УКІЗСКУЗИаУМЕКОУМІ НУМАВОАРИаКагЕМУМИУОР

ЕМаОТУМрЕКРОСВАМТІТАОТЗТМТАУМЕГ БІ ВЗЕОТАМУМСЗТІ ОР СОСТІ МТУ 5 пиЗО6МНуЗс (5ЕО ІО МО: 54):

ЕМО МОБСАЕУККРОАЇ УКІЗСКУЗаМУТЕТОММІ НИУУВОАРОКаТг ЕМУМОамМ МОР

ЕВИОЮТУМАЕКЕРОСЕАМТІТАОТЗТМТАММЕГ Са5І ВЗЕОТАМУУСЗТІ ОР СОСТІ МТУ 5 пиЗОбУНма (5ЕО ІО МО: 55):

ЕМО МОБАЕУМУКРОАТУКІЗСКУЗСОСЕМІКОУМІ НУУВОВРИаКаИТїгЕУМІСУМОРЕМ

СОТММОРКЕОСКАТІТАОТ5ТМТАМІ ЕІ 51 Т5ЕОТАМУУСЗТІ ОРМУСОСТІ МТУ55 пиЗО6УНмлЬ (5ЕО ІО МО: 56):

ЕМОЇ МОБСАЕМУКРОАЇ УКІЗСКУЗИаУМЕКОУМІ НУУМВОВРИаКа ЕУМауор

ЕМаВЮТУМрЕКРОСВАМТІТАОТЗТОТАМІ ЕІ Я5І Т5ЕОТАМУМСЗТІ ОБУ СОСТІ МТУ55 пиЗО6МНуас (5ЕО ІО МО: 57):

ЕМОЇ МОБОАЕМУКРОАЇ УКІЗСКУЗаМУТЕТОММІ НИУВОВРИаКаИгЕМУМаУММОР

ЕВИОЮТУМАЕКЕРОСЕАМТІТАОТЗТОТАМІ ЕІ! Я5І Т5ЕОТАМУМОСЗ ТІ ОБМУС,СОСТІ МТУ

Зо Приклад 4. Моноклональні антитіла миші зв'язуються з тау в аналізах ЕГІЗА

Способи: Непрямий ЕЇІБА: 9б-лункові полістирольні планшети сенсибілізували захоплюючими антитілами проти бхХНІі5 (фігура 5А) або поліклональними антитілами проти тау (Оако Ме АОО24, фігура 58), що суспендовані в їх ФБР, протягом 2 год при К.т. (кімнатній температурі) або 16 год при температурі 40. Нанесений матеріал видаляли, і планшети блокували протягом 1 години 195 БСА в їхФБР з подальшою інкубацією з рекомбінантним тау людини з полігістидиновою міткою на М-кінці білка (фігура 5А) або без неї (фігура 58). Після промивання планшети інкубували із зазначеними антитілами, промивали й інкубували з кон'югованим з ПХ (пероксидазою хрону) вторинним антитілом кози проти імуноглобулінів миші.

Реакцію у планшетах запускали додаванням ТМВ, і А450 вимірювали за допомогою спектрофотометра для читання планшетів.

Сендвіч-ЕГ ІБА: 9б-лункові полістирольні планшети сенсибілізували антитілами проти імуноглобулінів миші в їх ФБР протягом 2 год при К.т. або 16 год при температурі 40.

Нанесений матеріал видаляли, і планшети блокували протягом 1 години 1 95 БСА в 1хФБР.

Потім планшет інкубували із зазначеними антитілами в ідентичних концентраціях, що розведені в 0,195 БСА в їхФБР. Планшети послідовно обробляли тау людини, поліклональними антитілами кролика проти тау (ЮШако Мо АОО24) та кон'югованим з ПХ антитілом кози проти імуноглобулінів кролика, всі з яких були розведені в 0,195 БСА у ФБР, з промивками між кожним етапом. Додавали стрептавідин-ПХ, реакцію у планшетах запускали додаванням ТМВ, і А450 вимірювали за допомогою спектрофотометра для читання планшетів. Див. фігуру 5С.

Результати: Панель антитіл, що продуковані гібридомою, аналізували відносно зв'язування з тау за допомогою декількох різних форматів ЕГІЗА. Виявлення тау підтверджували із застосуванням непрямого формату, із застосуванням тау-білка, що іммобілізований за допомогою його полігістидинової мітки, яка злита з М-кінцем, (фігура 5А). Також підтверджували зв'язування з нативним неміченим білком (фігура 58). Для оцінки афінності різних антитіл у розчині використовували формат сендвіч-ЕГІЗА, в якому досліджувані антитіла гібридами застосовували як захоплюючі реактиви (фігура 5С).

Приклад 5. Афінність моноклональних антитіл миші відносно тау

Способи: аналіз методом ППР (поверхневого плазмонного резонансу) проводили із застосуванням приладу Віасоге Т200 для визначення кінетики зв'язування бо антитіл миші з рекомбінантним тау людини. Для підготовки поверхні сенсора антитіло проти імуноглобулінів миші (СЕ І Те 5сієпсев) іммобілізували на сенсорний датчик СМ5 за допомогою амінного поєднання, й антитіло захоплювали на рівні, який забезпечував максимальне зв'язування 50 О.В. (одиниць відповіді). Над захопленим лігандом пропускали різні концентрації рекомбінантного тау, що варіюють від 10 - 0,14 нМ, при швидкості потоку 50 мкл/хв. у буфері для аналізу (НВ5 «ж 0,05 95 Р-20, 1 мг/мл БСА) протягом 180 сек. асоціації та 900 сек. дисоціації.

Дані співвідносили двічі як до нерелевантного сенсора, що не містить ліганд антитіла, так і до концентрації аналіту 0 нМ для обліку дисоціації ліганду від захоплюючої молекули. Потім дані аналізували із застосуванням глобальної підгонки 11.

Результати: Декілька антитіл миші були вибрані в групі аналізів ЕГІБА на основі їх характеристик, та їх афінності зв'язування оцінювали методом ППР. Антитіла досліджували у паралельних групах, та їх швидкості асоціації та дисоціації зв'язування порівнювали з вибраним антитілом із найвищими зв'язуючими властивостями з рекомбінантним тау людини. Найвищу афінність зв'язування спостерігали для клону антитіла 306. Афінності зв'язування представлені на фігурі 6.

Приклад 6. Моноклональні антитіла миші запобігають зв'язуванню тау людини з поверхнею імморталізованних нейронних клітин

Способи: Інгібування зв'язування тау з клітинами нейробластоми В103 за допомогою моноклональних антитіл проти тау 1. Клітини В103 ресуспендували у ФБР в концентрації 5 х 105 клітин/мл. У планшет М5О

Нідпй Віпа висіювали по 50 мкл суспензії клітин на лунку. Одержували концентрацію 25К клітин/лунку. Планшет накривали, і дозволяли клітинам приєднатися при температурі 37 "С, 5 Фо

Со», протягом 2 год. 2. Після приєднання клітин з лунок видаляли ФБР за допомогою перевертання планшета й акуратного постукування для видалення надлишку буфера. У кожну лунку додавали 50 мкл 395

Блокатора А М50 у ФБР або іншого підходящого блокуючого буфера й інкубували планшет при

К.т. протягом 1 години без струшування.

З. Протягом етапу блокування планшета спільно інкубували тау й антитіла проти тау наступним чином: а. Починали з антитіла проти тау в концентрації 2 мг/мл і готували серійні розведення у

ФБР, у співвідношенні 1:2, для 7 додаткових розведень. р. Розводили тау у ФБР до концентрації 20 нМ. Концентрація тау в кожній лунці була постійною. с Перемішували тау й антитіло проти тау в співвідношенні 1:1 до кінцевої концентрації тау 10 нМ і початкової концентрації антитіла проти тау 1 мг/мл. й. Інкубували суміш протягом приблизно 1 год при к.т. при струшуванні (600 об./хв.). 4. Після блокування планшета, етап 2, з лунок видаляли блокуючий буфер за допомогою перевертання планшета й акуратного постукування та двічі промивали планшет ФБР. із застосуванням багатоканальної піпетки. Переконувалися, що надлишок буфера був повністю видалений. Перед додаванням комплексів тау: антитіло проти тау охолоджували висіяні клітини до температури 4 "С. 5. До висіяних клітин додавали 50 мкл охолодженого комплексу, етап 3, й інкубували на льоду протягом 30 хвилин. 6. Двічі промивали планшет охолодженим ФБР, як описано раніше. 7. Додавали 50 мкл 1685.5016ЕО-ТАСюю на лунку для виявлення тау, що зв'язаний з поверхнею клітин. Інкубували на льоду протягом 30 хвилин. 8. Знову двічі промивали планшет охолодженим ФБР, як описано раніше. 9. Додавали 150 мкл на лунку їх буфера для зчитування Т без поверхнево-активної речовини (що розведена в НгО) та негайно проводили зчитування на приладі МБО 5ЕСТОН М 600. Уникали утворення бульбашок при додаванні буфера для зчитування. 10. Фіксували сигнали М5О залежно від концентрації антитіла проти тау.

Досліджувані антитіла являли собою антитіла проти тау 306, 1627, ЗНО, 405 і 508 й ізотиповий контроль.

Результати:

Зниження сигналу З!иМоТад проти тау, що спостерігалося при збільшенні концентрації досліджуваного антитіла, свідчить про функціональне блокування зв'язування тау з поверхнями нейронних клітин. У випадку ізотипового контролю, 1607 або ЗНО блокування не спостерігалося. Кількості, що збільшуються, функціональної блокуючої активності спостерігали у випадку 405, 528 і 306. 306 продемонструвало найбільше глибоку блокуючу активність серед досліджених антитіл. Див. фігуру 7. бо Приклад 7. Активність дезагрегації

Способи: Агрегація рекомбінантного тау. Очищений рекомбінантний тау з М-кінцевою міткою бхХНі5 поєднували з еквімолярними кількостями низькомолекулярного гепарину у їІхФБР (рН 7,4) й інкубували при температурі 37 "С протягом 96 год на шейкері-гойдалці. Агрегацію зразка підтверджували за допомогою зв'язування з тіофлавіном Т.

Інкубація з антитілами. Антитіла інкубували з агрегованим рекомбінантним тау в зазначених молярних співвідношеннях, інкубували при температурі 37 "С протягом 96 год без обертання або погойдування. По закінченні експерименту вимірювали агрегацію за допомогою інкубації зразків 3 25 ММ тіофлавіном ТТ і вимірювання флуоресценції, яка випускається, (збудження/випускання 450/482). З сигналів віднімали фон зразків буфера.

Результати: Як показано на фігурі 8, 306, переважно, деасемблює інтактні волокна тау.

Молярні співвідношення, що варіюють, 306 (трикутники), ізотиповий контроль (кола) та 16037 (квадрати) інкубували з амілоїд-вмісними волокнами тау протягом 96 годин. По закінченні даного періоду часу оцінювали ступінь агрегації за допомогою зв'язування з тіофлавіном Т. 306, переважно, знижує сигнал тіофлавіну Т, що присутній в зразку, у порівнянні як з антитілом ізотипового контролю, так і з 16237, антитілом проти тау, яке зв'язується з відмінною областю тау.

Приклад 8. 306 і 528 імунним способом захоплюють тау з тканини людини, що уражена захворюванням.

Способи: Фракції білка, що розчинені у висококонцентрованому сольовому розчині, готували в концентрації 1 мг/мл. Для кожної імунопреципітації використовували 200 мкг зразка. 10 мкг зазначеного антитіла (ізотиповий контроль, 306 або антитіло проти тау 5О8) додавали до препаратів зразка у висококонцентрованому сольовому розчині й інкубували протягом 2 год. Потім до сумішей додавали магнітні намистини з білком С й інкубували ще протягом години для захоплення комплексів антитіло/(антиген. Зразки ретельно промивали їХФБР, і намистини кип'ятили у відновлюючому/денатуруючому буфері для зразка для вивільнення захоплених білків. Зразки, що одержані в результаті, поділяли методом ПААГ-ДСН (електрофорезу у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) і проводили вестерн- блотинг із застосуванням поліклонального антитіла проти тау (бако, МеАОО024). 04091 Результати: Як показано на фігурі 9, 306 і 528 імунопреципітували тау з тканини, що

Зо уражена хворобою Альцгеймера. Фракції, що розчинні у висококонцентрованому сольовому розчині, утворювали імунопреципітат із зазначеним антитілом, і їх виявляли за допомогою поліклонального антитіла проти тау, що спрямоване проти окремої області молекули тау із зв'язуючих сайтів для 306 й антитіла А проти тау. 306 надійно захоплював тау з даної фракції.

Зразки на вході (зразок, що розчинений у висококонцентрованому сольовому розчині) представлені справа.

Приклад 9. Імуногістохімічне дослідження імунореактивності 306

Кору головного мозку лобно-скроневої області отримували від пацієнтів, що не страждають від нейродегенеративного захворювання, або страждають від хвороби Альцгеймера, що підтверджували в ході посмертної оцінки. Імуногістохімічне дослідження проводили на кріозрізах, які злегка фіксовані ацетоном, товщиною 10 мкм, що закріплені на склі. Всі етапи фарбування проводили за допомогою автоматичного пристрою для фарбування І віса ВОМО Ах із застосуванням витратних матеріалів І еіса. Форму 306 миші або людини інкубували зі зрізами тканини з подальшим додаванням відповідних виду вторинних антитіл, що кон'юговані з полімером ПХ. Для запобігання неспецифічного зв'язування ендогенних імуноглобулінів при застосуванні гуманізованих антитіл на тканині людини антитіла перед інкубацією з тканиною нековалентно мітили кон'югованим з біотином моновалентним Рар-фрагментом проти імуноглобулінів людини іп мійго. Тканину, що мічена комплексом первинне антитіло - Рар- фрагмент з біотином, потім ампліфікували із застосуванням системи ампліфікації авідин-біотин (Месіог Іаброгайогіех, Бурлінгейм, Каліфорнія). Фарбування візуалізували за допомогою хромогена ЮАВ, який викликав утворення осаду коричневого кольору. Негативний контроль полягав у здійсненні всієї імуногістохімічної процедури на прилеглих зрізах з антитілом Їдс ізотипового контролю.

Досліджувані антитіла являли собою СОб миші, химерне 306 (яке містило УН і МІ з антитіла миші з константними областями людини, важкий ланцюг 5ЕО ІО МО: 72 і легкий ланцюг 5ЕО 10

МО: 73) і гуманізований варіант ПИЗОбМНм5/ пиЗОбМІ маг.

Фарбування, яке проводили з антитілом миші, химерною та гуманізованою формами 306, якісно порівнювали й оцінювали відносно стійкості й інтенсивності фарбування, а також локалізації імунореактивності. Інтенсивність фарбування була аналогічною для химерної та гуманізованої форм 306 і демонструвала аналогічний характер локалізації порівнянно з формою антитіла миші. Тау був виявлений у нейрофібрилярних клубках, волокнах, нитках нейропіля та в дегенеруючих аксонах. Також спостерігалося помітне соматичне фарбування.

Приклад 10. Афінність гуманізованих варіантів відносно тау

Способи. Непрямий ЕЇГ І5А. 96-лункові полістирольні планшети сенсибілізували рекомбінантним тау людини, що суспендований в іхФБР, протягом 2 год при

К.т. або 16 год при температурі 40. Нанесений матеріал видаляли, і планшети блокували протягом 1 год 195 БСА в їх ФБР. У планшети додавали зазначені антитіла в концентрації 1 мкг/мл в 0,195 БСА в їх ФБР протягом 1 години з наступним промиванням, і додавали кон'юговане з ПХ антитіло кози проти імуноглобулінів людини. Реакцію у планшетах запускали додаванням ТМВ, і А450 вимірювали за допомогою спектрофотометра для читання планшетів.

Сендвіч-ЕГІЗА 9б-лункові полістирольні планшети сенсибілізували антитілами проти імуноглобулінів людини в їх ФБР протягом 2 год при К.т. або 16 год при температурі 40.

Нанесений матеріал видаляли, і планшети блокували протягом 1 години 1 95 БСА в їх ФБР. У планшети додавали зазначені антитіла у варіюючих концентраціях, як зазначено, що розведені в 0,1 95 БСА в їх ФБР, протягом 1 год з наступним промиванням, і додавали біотинільований рекомбінантний тау людини, що розведений в 0,1 95 БСА в їх ФБР. Після промивання додавали стрептавідин-ПХ, реакцію у планшетах запускали додаванням ТМВ, і А4-50 вимірювали за допомогою спектрофотометра для читання планшетів.

Аналіз методом ППР проводили із застосуванням приладу Віасоге Т200 для визначення кінетики зв'язування Н306-МНми5-12 з рекомбінантним тау людини. Для підготовки поверхні сенсора на сенсорний датчик СМ5 іммобілізували антитіло проти імуноглобулінів людини (СЕ

Ійе бсіеєпсе5) за допомогою амінного поєднання, і пиЗзОбМНми5/ пиЗОбМІ м2 захоплювали на рівні, який забезпечує максимальне зв'язування 50 О.В. Над захопленим лігандом пропускали різні концентрації рекомбінантного тау, що варіюють від 10 - 0,14 нМ, при швидкості потоку 50 мкл/хв. у буфері для аналізу (НВ5 -- 0,05 95 Р-20, 1 мг/мл БСА) протягом 180 сек. для асоціації та 900 сек. для дисоціації. Дані співвідносили двічі як до нерелевантного сенсора, що не містить ліганд антитіла, так і до концентрації аналіту 0 нМ для обліку дисоціації ліганду від захоплюючої молекули. Потім дані аналізували із застосуванням глобальної підгонки 1:1.

Досліджувані антитіла являли собою химерне 306 (що містить області МН і МІ миші з

Зо константними областями людини; 5ЕО ІЮО МО: 72 (важкий ланцюг) і 5ЕО ІО МО: 73 (легкий ланцюг), і гуманізовані варіанти (пиЗзОбМНмуит1р/пизОбМІ ма, / пиЗзОбМНміс/пизОбМІ маг, пизО6УНУута/лизобмі ма, пизОобМНм е/пизОбМІ мг, пизО06МНУтИпиЗОбМІ м2, пизобМНуиг/пизОбМІ м2, пизОбМНуз/пизОбМІ мг, пи306МНузр/пизОбМІ м2, пизОбМНуЗс/пизО6МІ м2, пизОб6МНуми4/пизОбМІ мг, пи3з06МНм4р/пизОбМІ м2, пизОобМНум4с/пизО6МІ м2, пизОб6МНуи5/пизЗОбМІ мг, пиЗзОбУНУТЬВбА! лиЗОбМІ мг, пизОбУНУТЬВвАЇ ІВбС2/пиЗОбМІ м2, пизОбУНУТЬВбА 1В6НгІ/ пиЗОбМІ маг).

Фігура 10А: Декілька послідовностей-кандидатів із гуманізації 306 досліджували методом

ЕПІЗА для порівняння зв'язування з рекомбінантним тау людини. Значення поглинання порівнювали та нормували до значення для химерного 306, яке містило МН і МІ. з антитіла миші. Декілька послідовностей-кандидатів характеризувалися аналогічним зв'язуванням порівняно з химерним антитілом, причому пиЗОбМНм5/ пиЗзОбМІ м2 демонстрували найвищу реакційну здатність.

Фігура 108: Зв'язування пиЗОбМУНм5/ пиЗзОбМІ м2 порівнювали з химерним 306 за допомогою кривої концентрації в сендвіч-Е/ГІЗА при застосуванні як реактиви для захоплення тау химерного 306 і пиЗОбУНм5/ пиЗзОбМІ М2. Обидва антитіла демонстрували аналогічні криві зв'язування, що свідчить про аналогічну афінність.

Фігура 10С: Афінність пиЗОбМНм5/ пизОбМІм2 визначали за допомогою аналізу методом

ППР. Варіюючі концентрації рекомбінантного тау пропускали над іммобілізованим антитілом, і сенсограми, що одержані в результаті, аналізували із застосуванням глобальної підгонки 1:21.

Представлені кінетика афінності, швидкість асоціації та дисоціації, які були вельми сприятливо порівнянними зі значеннями 306 миші.

Перелік послідовностей

РІ10636-8(5ЕОІОМО:1)

МАЕРВОЕРЕУМЕОНАСТМУОГ СрАКООСаИамТмМнОрОєартрАсІКЕБРГОТРТЕ равЕЕРИЕЗЕТЗОАКОЗТРТАЕОМТАРІ МОЕСАРИКОАААОРНТЕІРЕСТТАЕЕАСІСОТРБО

ГЕСЕАДЯНУТОАНнМУЗКЗКОСТаЗООККАКСАрИКкКтТКкКІАТРАЙААРРИИОКООАМАТА

ІРАКТРРАРКТРРОБСЕРРКЗИаЮВЗауЗОРавРИатРазАЗАТРОЇ РТРРТВЕРККМАМУВТР

РКЗ5РБЗБЗАКЗА ОТАРУРМРОЇ КМУКЗКІСЗТЕМІ КНОРССЕКМОПМККІ ПІ 5ММОКО (510) а5КОМІКНУРОСИавзМОІМУКРМУВІ БКУТЗКОСИавбБІ ССМІННКРОСС,ОМЕМКЗЕКІ ЕКО

МОБКІСБІ ОМІТНУРаСОИМККІЕТНКІ ТЕВЕМАКАКТОНОАЕІМУКЗ РУМБаОЮТтТ5РВАНІ 5

МУБЗТавІОММО5РОЇ АТІ АРЕМ5АБІ АКОСІ.

Р1І10636-7 (5ЕО І МО: 2)

МАЕРВОЕРЕММЕВНАСЄТУ,аІ ИЮДВКРрОСО,МТМНОрОгСОТОрАСІ КЕЗРІ ОТРТЕ рРОБЕЕРОЗЕТОЗОАКОЗТРТАЕАЕЕАСІСОТРОЇ ЕСЕАДЯНУТОААМУЗКУКОСТавроккК

АКОаАВаКкКтТКкКІАТРАФААРРИОКОаОАМАТВІРАКТРРАРКТРРОБСОЕРРКЗИаСНБЗИахВоРа 5РатРаИаЗВА5ЗВТРОЇ РТРРТВЕРККМАМУВТРРКУЗРУБАКОЗВІ ОТАРМРМРОЇ КМУКОЗКІСВ

ТЕМІ КНОРОСОКМОПМККІ ОЇ БММОЗКСОаЗКОМІКНУРОСОа ЗМО МУКРМУВІ КУТОК

СОБІ аОМІННКРПССИОМЕМКОЕКІ ОЕКОВМО5КІСБІ ОМІТНУРИССОМККІЕТНКІ ТЕВЕ

МАКАКТОНОАЕІМУКОРУМЗаОТтТ5РЕНІ 5МУЗЗТОБІОММО5РОЇ АТІ АОЕМ5АБІ АКО СІ.

Р10636-6 (тау людини 4ВОМ) (ЕС ІО МО: 3)

МАЕРВОЕРЕММЕВНАСЄТУ,вІ ЮОВКРрОСО,МТМНОрОгСОТОАСІ КАЕЕАХСІСОТ

РЗІ ЕРЕААДЯНМТОААМУЗКУКОСТаЗООККАКСАВОКТКІАТРАСААРРИОКООАМА

ТВІРАКТРРАРКТРРОБСЕРРКЗХаВА!ЗауУ5БРаБРИаТРОЗАЗАТРОЇ РТРРТВЕРККМАУУА

ТРРКУ5РОБАКЗВІ ОТАРУРМРОЇ КМУКЗКІЯСЗТЕМІ КНОРОСИаИкмМОпМкКкКІ І ММК

СсаБКОМІКНУРСИаВМОМУКРМОЇ БКУТ5КСОаБІ аМІННКРОССОМЕМКОЕКІ ОЕКОВ

МОБКІСБІ ОМІТНУРаСОИМККІЕТНКІ ТЕВЕМАКАКТОНОАЕІМУКЗРУМБаОЮТтТ5РВАНІ 5

МУБЗТавІОММО5РОЇ АТІ АРЕМ5АБІ АКОСІ.

Р1І10636-5 (5ЕО І МО: 4)

МАЕРВОЕРЕММЕВНАСЄТУ,аІ ИЮДВКРрОСО,МТМНОрОгСОТОрАСІ КЕЗРІ ОТРТЕ рРОаБЕЕРОБЗЕТООАКОТРТАЕОМТАРІ МОЕСАРОКОАААОРНТЕІРЕСТТАЕЕАСІСОТР5

ГЕОЕАДЯНМТОААМУЗКЗКратавроккКАКОСАВИаКкКТтТКкКІАТРАВААРРООКОаОАМАТА

ІРАКТРРАРКТРРОБИЕРРКЗа ОНЗаУ5БРаБРИаИТРОБНАЗАТРБОІ РТРРТВЕРККМАММУВТР

РКЗ5РОБАКОАІ ОТАРУРМРОЇ КМУКОКІЯЗТЕМІ КНОРОСИакКМОМУкКРМУВІ КУТОК

С25І ОМІННКРОССОМЕМКВЕКІ ОРЕКОВМО5КІСБІ ОМІТНУРОСОМККІЕТНКІ ТЕВЕМ

АКАКТОНОаАЕІМУКОЗРУУБаЮтТ5РАНІ 5БМУ5ЗТ,авІОММО5РОЇ АТІ АРЕМ5АБІ АКОС І.

Р1І10636-4 (5ЕО І МО: 5)

МАЕРВОЕРЕММЕВНАСЄТУ,аІ ИЮДВКРрОСО,МТМНОрОгСОТОрАСІ КЕЗРІ ОТРТЕ рРОБЕЕРОЗЕТОЗОАКОЗТРТАЕАЕЕАСІСОТРОЇ ЕСЕАДЯНУТОААМУЗКЗКроаСТа,азрокКкК

АКОаАраКкКтТКкКІАТРАФААРРИОКОаОАМАТВІРАКТРРАРКТРРОБСОЕРРКЗИаСНБЗИахоРа 5РатРаИаЗА5ЗАТРОЇ РТРРТВЕРККМАМУВТРРКУЗРУБАКОЗВІ ОТАРМРМРОЇ КМУКОКІС

ТЕМ КНОРОСИакКМОІМУкКРМОІ БКУТВКСИаБІ СМІННКРИаСИОМЕМКОЕКІ ОЕКОНМО

ЗКІСБІ ОМІТНУРОСОМККІЕТНКІ ТЕВЕМАКАКТОНОаАЕІМУКОРУМЗОаОТ5РАНІ 5ММ 5ЗБТОа5БІОММО5РОЇ АТІ АСЕМБАБІ АКОСІ.

Р10636-2(5ЕОІОМО:6)

ТВІРАКТРРАРКТРРОБСЕРРКЗХаВА!ЗауУ5БРаБРИаТРОЗАЗАТРБОІ РТРРТВЕРККМАМУВА

ТРРКБРБОБАКОЗНІ ОТАРУРМРОЇ КМУКЗКІСЗТЕМІ КНОРОСИаКМОМУКРМУВІ 5КМТ5

КСабві ОМІННКРаССИОМЕМКОВЕКІ ОЕКОВМО5КІСБІ ОМІТНУРИСОМККІЕТНКІ ТЕН

ЕМАКАКТОНОаАЕІУУКВРУМБИаОЮТтТ5РАНІ БММ55ТОа5ІОММО5РОЇ АТІ АСЕМ5АБІ АК ОСІ.

ЗЕО ІЮ МО: 7; амінокислотна послідовність МН 306 миші:

ЕМО! ООБОАОІ УАРОАЇ УКІ БСКАБОЕМІКОУМІ НИУМВОВРЕОСІЇ ЕММІОУМІОРЕ

МартуУМОРКЕОСКАТІТАОТО5МТАМІ ОЇ 51 ТЗЕОТАМУЄС5ТІ ОРМСОСТТІ ТУ55

ЗЕО ІЮ МО: 8; НСОВІ згідно з Кеботом/Чотіа:

СЕМІКОУМІ Н

ЗЕО ІЮ МО: 9; НСОВА згідно з Кеботом:

МОРЕМаВТУМОРКЕеОС

ЗЕО ІЮ МО: 10; НСОВЗ згідно з Кеботом:

Гог

ЗЕО ІЮ МО: 11; амінокислотна послідовність МІ 306 миші:

ОМУМТОТРІ ТІ 6МТІБОРАБІБСКОЗОВИ ОБрОакКТмУІ ММ ОВРИОБРКАГІМІ 5

КГ О5БаМРОВЕТавзаватовЕТтІ КІЗАМЕАЕОІ ЧУ СМОСТНЕРУТРССИТКІ БІКА

ЗЕО ІЮ МО: 12; І СОВІ1 миші згідно з Кеботом: кБзОоБИ рерактмі м

ЗЕО ІЮ МО: 13; І СОВ2 миші згідно з Кеботом:

ГМ5КІ 05

ЗЕО ІЮ МО: 14; І СОВЗ миші згідно з Кеботом:

МОСТНЕРУТ бо ЗЕОІЮМО:15;пиЗО6МНм1:

ЕМО МОБСАЕМУАРОАІ УКУЗСКАБОЕМІКОММІ НУМАОАРЕОСІ ЕУММІСУМІОРЕ

МартуУМОРКЕОСКАТІТАОТЗТМТАМІ ОЇ 551 ТЗЕОТАМУЕСЗТІ ОР ОСТІ МТУ

ЗЕОІОМО:16пиЗзОбУНмг:

ЕМО МОБСАЕУККРОАБУКУВСКУВИаєМІКОММІ НУМАОАРЕОСІ ЕУУМОУМО Р

ЕМООЮТУМОРКЕРОСАМТІТАОТОТМТАУМЕЇ 55І Т5ЕОТАМУМС5ТІ ОРМСОСТІ МТУ55

ЗЕОІЮОМО:17; пизОб6МНм1б:

ЕМО! МОБСОАЕМУАВРОАЇ УКІЗСКАБОЕМІКОМ МІ НУУМВОАРЕОСІ ЕМЛОУМОРЕМ

СОТММОРКЕОСКАТІТАОТОТМТАМІ ОЇ! 51 Т5ЕОТАМУЕСЗТІ ОБМУС,СОСТІ МТУ55

ЗЕО І МО: 18; пиЗзОбМНмрАЇ 1:

ЕМО МОБСАЕМУКРОАТУКІЗБСКАБО ЕМІКОМ МІ НУУМАВОВА РСОСІ ЕУМІСУМІОРЕМ

СОТММОРКЕОСВАТІТАОТЗТОТАМІ ОЇ БІ Т5ЕОТАММЕС5ТІ ОРУСОСТІ МТУ

ЗЕОСІОМО:19пиЗзОбУНм:

ЕМО МОБСАЕМУКРОАТУКІЗБСКАБОЕТІКОУМІ НУУВОВРООСІ ЕМОУМЛОРЕО

СОТММАРКЕРОСВАТІТАОТЗТОТАМІ ОЇ! 51 Т5ЕОТАМУЕСЗТІ ОБМУС,СОСТІ МТУ55

ЗЕО І МО: 20; пиЗОбМі мі:

ЗКІ О5БОМРОВЕЗОа5аватовтІі КІЗАМЕАЕОМОУУУСМОСТНЕРУТРОСИТКІ БІКА

ЗЕО І МО: 21; пиЗзОбМІ ме:

ОМУММТО5РІ 5І РУТ ан ОРАБІЗСКЗЗОБІ ЇЇ ОБООКТУ ММ ОВРООЗРАВИ МІ 5

КГОБаУРОВЕЗавБаватО ТІ КІЗВУЕАЕОМаОУУУСМОсСТНнНЕРУТРОСОИТКІ БІКА

ЗЕО І МО: 22; пиЗОбМІ м:

КГОБаУРБЗАВЕЗа5БабБаИаТОвЕТІ КІЗАМЕАЕОМаОУУУСМОСТНЕРУТРОаСОИТКІ БІКВА

ЗЕО І МО: 23; пиЗОбМіІ ма:

РІММТОТРІ 5І 5МТІБОРАБІЗСКОЗЗОБИ ОоБСОИакКТтУІ ММ ОКРООБРКАИМІ 5

КГОБаУРОВЕЗавБаватО ТІ КІЗВМЕАЕОМаОУУУСУОСТНЕРУТЕРСаСТтКІ БІКА

ЗЕО ІО МО: 24; варіабельна область важкого ланцюга акцептора, облік. Мо ВАСО1986.1

ОМОГ ОО5БСАЕУККРИаБЗЗУКУЗСКАВОИССТЕРавзМУАІЗМУУВОАРООСІ ЕМУМаВІ РІЇ.

СІАТУАОКЕРОСАМТІТАОКОЗТЗТАМУМОІ 551 ВБЕОТАУУУСАВОИКОаЕРЕСМОУМСОЮС,Т ТУТУБ

Зо ЗЕО ІО МО: 25; варіабельна область важкого ланцюга акцептора, облік Мо ІМС ТЯЖІСНМ 1-69- 2701

ЕМО МОБСАЕУККРОАТУКІБСКУБО У ТЕТОМУМНУМООСАРОаКОагЕМУМИІ МОР

ЕОСЕТІМАЕКРОСАМТІТАОТОТОТАМУМЕЇ 55І АБЕОТАМУМСАТ

ЗЕО І МО: 26; варіабельна область важкого ланцюга акцептора, облік Ме ІМ ТЯСКУО1

ОонУсОаТтІ МТУ

ЗЕО ІЮО МО: 27; варіабельна область легкого ланцюга акцептора, облік Мо ІМСТЯСКМ2- 30702, облік. Мо ІМСТЯСКМ2-30702

ОМУМТО5РІ 5І РУТ аЧкОРАБІЗСНЗБЗОВІ УНБрИаТмМТМІ МУгООВРООЗРАВІИ МКУ

МАрБамРОВЕЗаБаватовтІі КІЗАМЕАЕОМОУУУСМОаТтТНнМР

ЗЕО ІО МО: 28; варіабельна область легкого ланцюга акцептора, облік. Мо ІМС КО2г"О1

УТРООСТКІ БІК

ЗЕО ІО МО: 29; варіабельна область легкого ланцюга акцептора, облік. Мо АА209048.1

ОМУМТО5РІ 5І ТМТІ аОРАБІЗСАНЗБЗОБІ УУБрИТмтмІ МУБгООВРООБЗБРАВИМАМ

ЗНМУОБаМРОВЕЗабзаватОо ТІ кІЗВМЕАЕОМОУУУСМОСТУМ РІ ТРИОСТКІ БІК

ЗЕО ІО МО: 30; послідовність нуклеїнової кислоти МН 306 миші: слаесттоаастаса,асАаатотассастАсстатавасассАа,аваса7ассттАат

САДСТТатоСтТасСсАддастстаасСТТСААСАТТАААСАСТАСТАТТТИаСАСТОССЯТ сдапСАсСАасасстаААсАа,саасстацвАаатааАтавАТасАТТаАТоСтТаАпААТОа астТаАТАСТаТАТАТаАСССаААаттоСАасасСААаасССАСТАТААСАаСАСАСАСА

ТоСтТоСААТАСАСССТАССТОаСАа,аСсТосасАаасстаАСАТтоТОаАаа,ааАСАСсТаССатТо тТАТТСТаТтТстТАСССТТаАСТТОТОСОсааССААааСАССАСТСОТСАСАаТтсСтТоОСтТСА

ЗЕО ІО МО: 31; послідовність нуклеїнової кислоти МІ. 306 миші: вАТатТтатаАТаАСССАСаАСТОСАСТСАСТІ Та ТСсОасСТТАССАТТаСАСААССА аССТоСАТСТСТТаСААаТСААдаТСАаАасстоТТАВАТАСТаАТацпАААсСАСАТАТ 5 ТтаААТТОИатТтаттТАСсАпАа,сасСсАа,аасСАаТСТССАААдаСасстТААТСТАТСТОСТО

ТоТАААСТОСаСАСТОТацпСАаТтоССтТаАСАватТсАСстТасСАаа,атавАТСАвацпАСАаА

ТТТСАСАСТОаААААТСАаСАспСАатТасасасСтаАасаАтта,ас,саАаТТТАТТАТТОаСТОа всСААДСИТАСАСАТТТТОоСатТАСАССЯТТсСССсАСаваспОаАССАдасСтТацпАААТАААдАС ат

ЗЕО ІЮ МО: 32; СОВ-НІ миші згідно з Кеботом бо рим н

ЗЕО ІЮ МО: З 3; СОВ-НІ миші згідно з Чотіа

СЕМІКОУ

ЗЕО ІЮ МО: 34; СОВ-Н2 миші згідно з Чотіа

ОРЕМОЮ

ЗЕО ІЮ МО: 35; СОВ-Н2 миші згідно з АЬМ

МОРЕМИаОТМ

ЗЕО ІЮ МО: 36; СОВ-11 миші згідно з контактним визначенням

КТМІ МУ.

ЗЕО ІЮ МО: 37; СОВ-12 миші згідно з контактним визначенням

ВИМ МК о

ЗЕО ІЮ МО: 38; СОВ-Ї З миші згідно з контактним визначенням

МОСТНЕРУ

ЗЕО ІЮ МО: 39; СОВ-НІ миші згідно з контактним визначенням

КоУМІ Н

ЗЕО ІЮ МО: 40; СОВ-Н2 миші згідно з контактним визначенням

МИСУ ОРЕМИОТМ

ЗЕО ІЮ МО: 41; СОВ-НЗ миші згідно з контактним визначенням 5

ЗЕО ІО МО: 42; Альтернативний СОВ-НІ згідно з Кеботом-Чотіа

СЕТІКОУМІ Н

ЗЕО ІО МО: 43; Альтернативний СОВ-НЕ2 згідно з Кеботом

МОРЕВИаОТУМАРКЕРОС

ЗЕО І МО: 44; консенсусна амінокислотна послідовність МН з фігури 2

ЕМОЇ МОБИАЕММУХРОАЇ УКІЗСКАБИЕЄМІКО УМ НМИМВОВРЕОСІ ЕММІСОУМОРЕМ аОТУМОРКЕОСХАТІТАОТ5ТМТАМІ ОЇ а5І Т5ЕОТАМУЕС5ТІ ОМ СООСТІ МТУ55

ЗЕО ІО МО: 45; консенсусна амінокислотна послідовність МІ.

ОМУМТО5РІ 5І 5МТІ ЧФООРАБІЗСКО5ОБІ І ОБООКТУ ММ ОВРООБРКАТ МІ М

ЗКІ О5аМРОВНЕБававзато вт КІЗАМЕАЕОМОМУУ СМ ОСТНЕРУТРаСОИТтКІ ЕІКА

ЗЕО ІЮО МО: 46; пиЗзОбМНмМ1БАЇ 18622:

ЕМОЇ МОБІАЕММКРОАТУКІЗСКАБОЕТІКОУМІ НИМВОВРОаКаї ЕУМОУМ МОРЕ рартууУАРКЕРОСВАТІТАОТОТОТАМІ ЕІ 51 Т2ЕОТАМУЕС5ТІ ОРМООСТІ МТМ55

ЗЕО ІЮ МО: 47; пиЗзОбМНмМ1БАЇ 186НЗ:

ЕМОЇ МОБИАЕМУМКРОАТУКІЗСКАБОЕТІКОУМІ НИМВОВРИаКаИЇ ЕММІСУМОРЕО

СОТУМАРКЕОСВАТІТАОТ5ТОТАМІ ЕІ Я5І ТЗЕОТАМУЄС5ТІ ОБР СаОСТІ МТУ55

ЗЕО ІЮ МО: 48; пиЗОбУНМм с:

ЕМОЇ МОБСАЕМКАРОАЇ УКІЗСКАБИЄМЕКОСУМІ НИУКОАРЕОСІ ЕМ МОИУМІО РЕ

МартуУМрЕКЕРОСАМТІТАОТОТМТАМІ ОЇ 51 ТЗЕОТАМУЕС5ТІ ОРМСаОСТІ МТУ55

ЗЕОІОМО 49;пизО6УНута:

ЕМОЇ МОБОАЕМКАРОАЇ УКІЗСКАЗБОУТЕТОУМІ НИМАВОВРЕОСІ ЕМУМОУМ МОР

ЕВОаОТУУАЕКЕРОСВАМТІТАОТОТМТАМІ ОЇ а5І Т5ЕОТАМУЕС5ТІ ОРМУСОСТІ МТ М55

ЗЕО ІЮ МО: 50; пиЗОбУНмв:

ЕМОЇ МОБОАОМУКРОАЇ УКІЗСКАЗОаЕТІКО УМІ НИ УКОВРЕОСІ ЕММІСУМОРЕМ

СОТУМАЕКЕРОСВАМТІТАОТ5ОТМТАМІ ві 251 Т5ЕОТАМУБС5ТІ ОРЛМС,ОСТТІ ТУ55

ЗЕОІОМО:51;пиЗОб6МНм1:

ЕМОЇ МОБОАОМУКРОАЇ УКІЗСКАБОЕТІКО УМ НИМВОВРООСІЇ ЕМО МОРЕ рартуУАЕКЕРОСАМТІТАОТОЗТОТАУМЕЇ 51 ТЗЕОТАМУБС5ТІ СОУ ,ОСТТІ ТУ55

ЗЕО ІЮ МО: 52; пиЗзОбМУНуЗ:

ЕМОЇ МОБИАЕУККРОАТУКІЗСКУЗОЕМІКОУМІ НМУМАВОАРОаКИЇ ЕМ МОУМІОРЕ

МартуУМОРКЕОСАМТІТАОТЗТОТАУМЕЇ 55І ВБЕОТАМУУС5ТІ ОБМС,ОСТІ МТУ55

БО ЗЕО ІЮ МО: 53; пизОбУНуЗр:

ЕМОЇ МОБОАЕМККРОАЇ УКІЗСКУБауУМЕКОУМІ НУМАКОАРОаКаїі ЕММОУМОР

ЕМаОТУМОЕКЕРОСВАМТІТАОТОТМТАММЕЇ а5БІ ВЗЕОТАМУУМС5ТІ ОЕМ СОСТІ МТУ 5

ЗЕО ІЮ МО: 54; пиЗОбМУНузЗс:

ЕМОЇ МОБСОАЕМККРОАЇ УКІЗСКУБаУТЕТОМУІ НИУВОАРОаКаИа ЕМ МОУ МОР

ЕВООТУУАЕКЕРОСВАМТІТАОТОТМТАММЕЇ С5І ВЗЕОТАМУУС5ТІ ОР СОСТІ МТМ5 5

ЗЕО ІЮ МО: 55; пизОбМУ Ну:

ЕМОЇ МОБІАЕМУМКРОАТУКІЗСКУВО ЕМІКОУ МІ НМИМВОВРОКИЇ ЕМЛОУМІОРЕМ аОТУМОРКЕОСКАТІТАОТ5ТМТАМІ БІ Я5І ТЗЕОТАМУМОС5ТІ ОР СаОСТІ МТУ55

ЗЕО ІЮ МО: 56; пизОбУ Нуар:

ЕМОЇ МОБЕАЕММКРОАЇ УКІЗСКУБауУМЕКОУМІ НУМКОНРОаКаї ЕМ МОУЛО Р

ЕМаОВТУМОЕКЕРОСОВМТІТАОТОТОТАМІ ЕІ Я5І ТЗЕОТАМУМСБТІ ОПОРУ СОСТІ МТУ55

ЗЕО ІЮ МО: 57; пиЗОбУНмуа4с:

ЕМОЇ МОБИАЕММКРОАЇ МКІЗСКУБачУТЕТтОУМІ НИУМВОВРОаКаї ЕМ МОУМОР

ЕВОаОТУУАЕКЕРОСВАМТІТАОТОТОТАМІ ЕІ Я5І ТЗЕОТАМУУМСБТІ ОРМУСОСТІ МТУ55

ЗЕО ІЮ МО: 58; Альтернативний СОВ-НІ згідно з Кеботом-Чотіа (одержаний з пиЗзОбМНІС).

СЕМЕКОУМІ Н

ЗЕО ІО МО: 59; Альтернативний СОВ-НІ згідно з Кеботом-Чотіа (одержаний з пиЗзОбУНмта, пиЗОбмУНУЗс і пизОбУНмуас).

СУТЕТОМУМІ Н

ЗЕО ІЮ МО: 60; Альтернативний СОВ-НІ згідно з Кеботом-Чотіа (одержаний з пизЗОбУНуУЗЬ і пиЗОбУ Ну)

СУМЕКОУМІ Н

ЗЕО 10 МО: 61; Альтернативний СОВ-Н2 згідно з Кеботом (одержаний з пиЗзОб6УНУТЬАНВбО).

ММОРЕВИОТМУАРКЕРОС

ЗЕО Ір МО: 62, Альтернативний СОВ-Н2 згідно з Кеботом (одержаний з пиЗзОбМУНміс, пиЗОбУНУЗЬ і пизобУНма4б).

МОРЕМаВСТУМОЕКРОС

ЗЕО Ір МО: 63; Альтернативний СОВ-Н2 згідно з Кеботом, одержаний з пиЗОбМУНмта, пизОобМНмі т, пизОбУНуЗс і пизОбУНуа4с.

ММОРЕВООТМУАЕКРОС

ЗЕО ІЮ МО: 64; Альтернативний СОВ-Н2 згідно з Кеботом (одержаний з пиЗзОбУНм16).

МОРЕМаОЮТУММАЕКРОС

ЗЕО ІЮ МО: 65; Альтернативний СОВ-НЗ згідно з Кеботом (одержаний з пиЗзОбУНм11)

Ох

ЗЕО ІЮ МО: 66; варіабельна область важкого ланцюга антитіла бА10 миші.

ЕМО! ООБОАЕЇ МАБОАБМУКІ БСТАБИЇ МІКОУМІНМИУКОВАВРЕОСІ ЕММСУМОРЕМ

РОТЕМАРКЕОСВАТІ ТТОТ55МТАМІ ОЇ 551 Т5ЕОТАУУУСТРІ ВО УУСОСТОМТУ55

Зо ЗЕО ІЮ МО: 67; СОВ-НІ антитіла 6А10 миші згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа. аЇвімкОоммІн

ЗЕО ІЮ МО: 68; СОВ-Н2 антитіла 6А10 миші згідно з Кеботом.

МОРЕМООТЕМАРКЕОС

ЗЕО ІЮ МО: 69; СОВ-НЗ антитіла 6А10 миші згідно з Кеботом

Ох

ЗЕО І МО: 70; структурна матриця МН Мих (РОВЯТСВО Н)

КУКІ ООБОАЕЇ УНЗ5ОАБМУКІ БСТАБИ ЕМІКОУ МОМ УКОАРЕОСІ ЕММІСУМІОРЕМ

СМ5ЕМАРАРОСКАТМТАОЮТІ 5МТАМІ ОЇ 551 Т5ЕОТАММУСМАРІ НОУУУ/СОСТТІ ТУ5 5

ЗЕО І МО: 71; консенсусна амінокислотна послідовність МН з фігур 4А і 48

ЕМОЇ МОБЕАЕММКРОАЇ МКІЗСКАБОЕЄМІКОУМІ НИМ ВОВРИаОСІ ЕММІСУМОРЕМ

СОТУМОРКЕОСВАМТІТАОТОТМТАМІ ЕІ Я5І Т5ЕОТАМУЕСБТІ ОР СОСТІ МТМ55

ЗЕО І МО: 72; важкий ланцюг химерного антитіла 306

ЕМО! ООБОАОІ МАРОАЇ МКІ БСКАБОЕМІКОУМІ НМИУМВОВРЕОСІЇ ЕММІОУМІОРЕ

МартуУМОРКЕОСКАТІТАОТ55МТАМІ ОЇ С5І Т5ЕОТАМУЕС5ТІ ОРУСОСТТІ ТУ55А

ЗТКОРОМЕРІ АРОБКОТЗИааТтТААГасі МКЩОМЕРЕРУТУБУУМЗОИаАІ ТЗаУНТЕРАМІ О5550

Ї М5І 55ММТУРБББІ ато т МмІСМУМНКРОЬМТКМОККМЕРКЗСОКТНТСРРСРАРЕ СР

ЗМЕГЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСМУМОМЗНЕОРЕУМКЕММИ УМО МЕМНМАКТКРАЕЕОУ

МЗТУАММ5МІ ТМ НОМ Ма КЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКООРАЕРОММУТІ РРО

ЕЕМТКМОМ5БІ ТСІ МКОЕУРБОІАМЕМЖМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ О5БОСОБЕРІ М5КІТМОК

БО ЗАУМОСОММЕБСОУМНЕАЇІ НЯНУТОКОІ 5І РОК

ЗЕО І МО: 73; легкий ланцюг химерного антитіла 306

ОМУМТОТРІ ТІ 6МТІБОРАБІБСКОЗОВИ ОБООКТМ МУ ОВРООБРКВА МІ 5

КГ О5БаМРОВЕТазавЗато ТІ КІЗАМЕАЕОІ ЧОУУУСМОСТНЕРУТРИ,СИткКІ ЕСАТМА

АРБЗМЕІЕРРБЗОЕОЇ КЗатАЗУМСИЇ ММЕМРВЕАКМОУМКМОМА! ОБОМЗОЕЗУТЕООБКО

ЗТУ5І 55ТІ ТІ ЗКАОМЕКНКММАСЕМТНОСІ 55РУТКЗЕМНОЕС пЕРЕЛК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «102 Реоїйапа Бівесюепсев МН.

Вагош, Кор

Оса, Во (М.

Ци, уча

Аіехатіює, БЗчейапа

Меп, Мат «120» Антитіпа, що розпізнають тау кі» ВУХ еаЯИОо «150» уухагзЗ3о,во «1512 80154050 «10» 73 «10» Раївпіп ворсюв 5.5 «102 1 «йіїх 441 «ей» РЕТ «13» Нопте заріяпя «1

Ме Аа Со то Акта Сів СНО Ре Зі Уві Мей сід Авр Ніз Адд СЯу ії ни о 15

ТВЕТуг Оу во У Ар Аго був Авр о Зіп Оу су Тут ТНг Меї Мі 28 25 За

(о Аз ОМ СНУ Аво 1г Авю дів ЗУ беи був ОВК Кто ву (Ма т рез Тек чЬ дав СУ За ЗВОІц Ро СНУ Бе ОО ТВ ден що 5 во

Авр Ага ув ви Ту Рг Тіт Аз о Ав» уві Те Аа Рнх цею Усі то 75 БІВ

Авр Оу Аа Кто у уз СМ ва Аа АВ ЗВ ев НІВ ТОЮ 85 що 5

Небо Со СЛУ Тег тку Ач сни Аа у Не іх Авро тн Ето 103 ток о

Бегіец ів Аз Су А: АНОХ НВ Усі ТВт Зі Аа Аг Ме мі 5 8 325

Зеагіув бегіув АЗИ ОМ ТВ Оу Бех Азрв Ав ух сув Ага Гуз Су 130 135 140

Ав АВ СУ уз Тиг уз Пе Ав Пе бю Абу СПУ Ав Аза Бо Ро 195 50 155 353

Су в бух Су (3Ів Ав Ав Ав Тл Ага пе то Аве ув ТК ЕТО ве ни 175

Ето Лів Рез ув Пн то Бгто бег Зек СУ СИ го Різ і ув Заг оїу 180 85 о

Авр АТО Зет МУ Туг Зо Зен Роз у Зекічо м Та Рез СЯу бе

ОК ОЗ 25

Ага Зег Аа т то Бег іев ббо Тк Рі бто ТИ Аг Сі Его ув

210 дій 20 їуз Ма! Аз Уа ув Ага Ту Руо Бо сук Бег Рго Зег щен Аа Гуз 225 ЗО 235 ет

БегАгріви С ТВ Ав Рі ма! Рез Ме то Ар ен ув Ап Уа ай 50 255 ув Заг ув Не су Бег Те ОЇ Авпівц ув Нів ЗВ Рто СУ Су 280 255 о сЯу ув Уві суп Ме Це Авпіувіувіви Аврівц Заг Авл Уві Ср

Бегіуз Сук (Му Заг ух АвБр Ав Пе ув Нів Уві ето (Му Су Оу щаО ча ЗО

Загуді ен і У Туггуз Ро Уві Авріви зЗегі ув уві тн Зег 305 Зо 315 ЗО

Ку Сув СТУ Заг Ме СТУ Авліи Не Міз із Сук то Су Ну ЄМчу ій 325 і 335

Уві с Уві ув Зег Зі) уві ан Авр Ре ув Авр Ап мя ій За ув Не У Бегі ви Авр Ав Пе ТВ Нів Уві Рго Су Су Му Ал з 350 За5

ЇуБіух Пе З тні Нє ув ви Тег вна Ага Си Ав дів ув АВ 370 375 ЗВО ув ТнгАвр Ні СбЯу Ав ім Пе Уві Тугі уз Зег Рго Уві Уві Зег

З85 зво 395 300

КАВИ Ти СЕ РекАна Нівіво Зег азп уві Бег бмн чну Бег

Це Авр Ме! Ма Авробаг Ро ій бен Ав ТИг бе Аа Ар ВІ Ма ак БУ 50

ЗегаАв Зегієц А ув іп ОК бу «й «Й ЯТЕ «віх БИТ «фі». МНето варни ек

Ме АЮ сн Река ОТ і Рв в та МегОв бер НІВ Аа Оу р: 5 30 35

ТвбТук ОК і ец Сх Або Аг Гу Азо сіру ЗМ Туг ТАК Ме ЕН то 25 Зо сне АврошвВІ СВУ Ар ТР Авр Ав Су би був СЮ Бе Ето Цец

ЗВ 4 45

МА Тв бе твесТЬ Авра у Бек ОБ сли Ргоу Закони ТВ Бег о о во

Ар АВ У Заи ГвгбтОо Ге АВ ОВ АВ Си Ар сим Ве СМ й5 7О 75 що

ВО Те Рто Бегбген У Авр ОВ Аів Аква Ту Мів Ома ТР ОМА Ав

Ав Ме ув Бегіуз Бегі ух АБВАМУ ТМ м в АБО АВ уз УЗ ке що те

Аа ув ЗУ А Авр СУ Гуз ТНгі ув На Аа Те Ро Агу СТУ Ада 15 150 195

Маю биому СЯ Гу су З АВ Ал Ана т пу му це Ро А 130 135 за зуб ти аз чо Ав Різ ую тег то Бгто Зак Бек У З Кта Ето 155 155 316о

Ту бе озу Ар Аву Бе СУ Тут баг Ба Ето У Зак Ре іх Те 755 179 175

Рг у Зен Ага Заг Ага тн Бгто Зег тем ро ТВ чо Рг пе Лід 180 185 198

Ме Роз уз уз ма Ав уві ма Аг ТВ Ро го ха Мет Ро ще 135 200 2-5

Зег Аа ув Заг Ак ви Ой Те Ав Ру мві Ріо Ме сто Ар ем 210 215 ио уклав ма і ув ув Це СПУ Зах ТНК ОН Авт (ем ме Нів ій 228 230 235 о

Бтоспу Чу СУ ув і Са Пе Пе деп був ув б ец Аво во є тай 250 258

Авп уд см ер сув Сую СУ ЗЕ ух бр Ап Ме тя Ні Уві бо

ВО Сп т

СПУ Ну Су Бет Ум ОН Не Уві Тугіуз то Ук Авр і ви Баг уз ків 25 КЕта

Ма) ТебЗегіг ух бує СНУ ЗГТ ец У Ав а Ні Ні ук Ро СУ у Ом Зі Ма о уві Був Бен і і ха Геу Дер ме Су Авр Ач

Ок Зо З15 ЗВО

Ма Зі Зегух Б СЛУ ет ен Ажр Ави Нео тк Ніз Ма) Бех су

ЗВ ЗО 35 су пу дал жа Ку Не Си ТЕН мів уз Си ее Не Аг о Аво

Ав уз Ав ух ТЕ АВо Ні СНу Аве са Не У Туг ув Чет Ро

УщЕ Уві бек кх Ахо Те Зег тО А НІВ о Зк Аем мВ бере

Зо 37 зо

ТНгу ве Пе АБО МЕС УВІ Аво Бе Ро СО Сей Аа ТВ; Без Аа

Зо ке З95 дю

Ав Ош Уві Баг Ав бегі во А уз Сп у Бен «05 о «ох З «ші» ЗНЗ «ах РЕЖ

«13» Ното зарієпе «МЮе З мег А ами Ро Аля Сп СВ на у Ма Маг ові Ар НІВ Ага СМу 1 З 10 15

Те туг ОХ ви Су вро Аго Був Авр си Су Сну Туг Тв Мей чів 23 25 30

С Авреіє Спа Су Аер Ті Аво Ага у Се уз Абе іо АЧа

Су пеу Аво пе гео Багі ви ОБ Авр о Ав А сну ів Маї о

Ти Ава Аеу Мей ма Бегіує вег ув АвріМУ ТНЕСМу Бег Аво 88 то 75 о

Авріукі ук А ув СУ Аа Авр Оу ув ТП був Не Аза вч Ро

ВЕ во 95

Агу пу лів Аа Ро Рг сім ів був СЯ 1 Ав Ав Лів Те Аг 1095 105 мо

Не Ру Аа був Ту Бгто Ро Кіа Ро ую ТВе Ро Рто Заг Зег Оу 115 120 155

Се Рто гої уз Баг у Авр Аго Зег СПУ Туг Зег Заг то Сну бег 130 135 зо

Ро Ну Тв рто же Ага Бег А ТВ го ен беч то Те Ро 185 15 155 18 го Тиг АГ І РКО Гузіув УВА УВІ Ма АГ ПЕ тої ув 188 5 75 его бег Зег Аіз ув бет Ата во СИ ТІ Аа Ро) чаї то Мей 150 185 150

Різ Арі еріув Ап Уві був Бег був Пе СУ Бе тов Ап ей

Ов ДОВ

Був НЕ ть СУ СНУ Су ух Уві бів Ме Ме Ап і уві ув Бей о 215 2

Азрізу Зег Ав Ма ОТ бегі ув СУ СНУ БОГ Гу Ав АЖ Пе ув 275 «30 ша яЯЙ

Нв Ущ мяз су ЗУ СУ Ве МН Нм пе а тут буд Ето Ма Аж вай 250 255 бец бе гув Уві ТВг Заг Був Су МУ Баг ем Су ли Пе Не ВН 260 вів та ув Р ою єму СНУ ОВ Ма ів Уві ув Заг Си Гуз Мав Авро РНе

Був Авр Ану уві Се Явг ух Пе Оу щег ев Авр Аби Пе Бе НН 250 255 ЗО

Уві то бу СК су Ап ув ув На СНИ ТВЕН ув Ме ТЕ РВЕ 305 Зо ЗІ5 ЗкО каз Ас Ар бу Ав ув Те Ав ні У АВ пе ма ух

Зк 30 За

Муз его узі Ма Заг Су Аво Те Заг то 2 Ні ви З АВл

За 45 ЗО

Уві Засбе тн су За Це Авр Меї Уа Ар Бе Рахів бе Ав 355 ЗО ща

ТНгГеи Ав Авр ін ді Зег Аа Зегіви Аа ук Спів у щей

ЗО 475 ЗВО «ій» 4 «ії» 410 «й» ВИТ «13 Нето зарепе «цю» 4

Ма Аа Сбю Рг Агов ВІ Ра с Ма! Мегоіч Аво Ні Ав Су 1 5 10 18

ТВЕР тус Оу Ге у Авр Ага Був Аво Сп Оу Сіу Тут ТЕ Ме Нів о -3 ЗО іп Авр Зіп Си СПУ Аво ТНг Авр Аа Сту бе був СТИ баг Рго ву зо 45 сів Тег Тег Ар Су Бег ой Си Рео- сту бегоу Ту Заг що 55 Бо

Аво Ага ув Зег ТВЕР Рто Тит Аа Сни Авр Уві Тр Аа Ето бе ма 70 75 ВО

Авр ОВ Сіу Дів Рез СУ уз СЯ Ав Ана Ав Сів Рго Ні ПН Су ще 90 95

Де рт СВІ СОУ ТВА ТВ АВ СТЬ СНИ АБУ Но Оу Ав ТНК Ро що 105 16

Бегієт Со Аве З АБЕА Су Бе Має ТК СИВ Абз Аєу МЕ Уві т 155 тив

Зегіув Зег с ує Ар СПУ Тіт Оу Зах АвроАнр Був ув АВ ув у 16 140

Ав АБО Сі чув Пгі ув Ма Дів Тр со Аг СНУ АВ АВ ЕТО тю 145 150 Моя 1650

СВ Цеєсу «3 Аа Ав Ав ОТ Ат Не Рго Аа Гуз ТНг бо 165 370 З то ма то ув ТП бу ую Зак бек СНУ Сн то то бух Вих пу 180 185 155

Аво Агар загсу Гуг бек Ето сну Бе бо СК ТЄ бо у бог 155 00 еоЕ

Ага ЗегАву Пе то зе фец чо тм у без ПУ Ага В бе ув а 215 гео мух чагАтв Уві Ма Аг Пі Вго Ра ух Бех Ро Заг Бех АГ УВ 525 230 З 540 дес Агар ес ТВ АнеРкюо мя! Кто Меї Рго Авр і ец і ув Авп ма!

НО доз

Гук бен ув Пет ев ТК Он Ав дав був Мі Сни то СЯМХ СУ

БО 255 ато

СУ ув Уві пев ом! Тугьуз бо У АЗИ ев дегі ув УВІ ТНг

БЗегіув Су Су бег Це Су Ал Ве Ні Ні ув Ро слу Му у й жа З

Сі УВІ ОЕМ Ві у Без ув а АЗо бле бу Аво Ат ма си

ОВ Зо ЗІ5 ко я Гуз Не Сх Бегіви Аво Ав Не Тит ів Ма! то СВу у Ию

Кен 35

АзтГув ув і и Ти Не уз бе ТК РЕ АТО СЬ Авп да Сук зо за5 зво

Аа ув Ту Аво Ніз СТУ Аа ОВ Це ма) ТУ ув Заг Ето Маг Май дексу АВ ТВ Бег Рех Аг мів ес Зег Ап Уві Зв Заг Те Сну 370 375 ЗВО хе Це Анр Ме Уві Аюр Бек Ето Сп ве Ав Тім сви ія Або СОЮ зва З 395 ЗО ма щог Аа Заг ів Аа був в СВУ рев

Сн УНН «0 5 «ім ЗВ «й» РТ жі» Ното варів

«кі» У

МегАвВ ОЮ РО АТМ ВИ РО МО В Месоїь Аво і Аа СК 1 5 10 15

Фін ту у аа слу АБО АС КУ берозн у СИМ тус Теле вне

Ме Аярв С СНУ Авр Тигр Ачо Абах3ру Бец руб ВІ Я Ра ев

За 35 35 сте ето т СН Ар су Зо 5 І Рг Су Зебено ТВУ бог 5

АвроА був Бе т Рез Те АНЕОВІ Ав ой СНО Аа му Це СУ 5 73 75 о

Ав Твг го Ху ке о Аво СНО Айва Аба СНУ Ні Ма ТО Аа

Ас Мер Узі Зегіуз Зегіуз Авр Су ТК Оу Зег Азо ар уз ув то 105 о

Аве ує СУ Ага Авр У ух Ти ув Ве Ма Пи Ро виз Ву Дів

Кк хо 125

Аа Р Рез у Сни ув СУ СВЙ АВ Ав Ав ПАТО Ве го ча ню 138 340 ув Теги те Ав Рто ув Тк Бгто РО Бех Бет СВу Сі Сто Бо 145 155 155 155

Муз бес Спу АвБр АТО За ОМ Тут Заг Заг чому Мегрто ОМ ТЕ 185 о 18

Ро Зіу Зег Аг Заг Ага ТП Ро бег ви Ро Тв Ро бо ТОг Аг 180 155 150

Сі тої уз ув ха А мВ Ме Ат Тк Ріо Реої ув Зег бо Заг 155 я 05

Зег Аа (ув Заг Ак без бій Тог Аа то ма! то Ме бто Авр ви 210 15 гео

Кув Авп уві Сув Заг був Це Су Бег Тг ОщАвв ев ув Нів й 528 250 ЗЕ ач

Бгто ЗУ СПУ ту ув Максі Ше уві тугі ух Ріо Уві Аяр еп г тав 25 во

Кув Уві ТВ Зегі ув Суз СІ Заг Ге У Аяп Не Нів Ні Су Рг 280 255 270

Су Су Су і Мабсчо Маг ує Бекон ув ви Ав ема | ув Ар у що НЕ

Ага Уві Сіл Зег був Пе СПУ Заг (ви Ар Ави Це Тк Мі ма Ро 290 295 400 су Зіу СЛУ Ав ув ув Пе Спи Те Ні уз во Тег Ре Ат Сів

З о 15 ЗО

Аза Ай ув Абя Суз Тк Ар Ні СНУ Ав бін Пе ві Тут ух зе 32 ЗО 335

Рахав) ее слу Аве ТВ Бак РО Ак Ні Цец ЗегАЗи Ма Бе 385 За

Заг Тигсну Бех Не АвроМеї Уві Ав)» Зег То З без дів Ті ви

Ма Аврец Магда Заг ви Ав ух СВУ ви 373 37 КВ «10» 5 «іі» ВА «рі» РЕК кі Мото звІнепе «300 В

Ме Ав СЯц то Ат МА и Бе ми мя Мао Авр мів лів Сну

З р 15 15

ТВ Тук Оу ез ЗУ АБО Аго Муз Ар іа у Му Туг Те Меї нів 0 755 30 і Авроа Зь ЗУ Авр Так Авр Аа су Бе був Ав и сно Ав

БІ 5

Су Не СІ Ар Те Рго дет цей СНИ Авр 0 Ав Ав СМу мів Уа! 5 ща

ТАг сна Ав Ага Ме Уві Зегі ув Баг ув Авр у Тит сНу З Ар

Авр узі ув Аа Суз Су Ав Ар сту ув ТВ ув Не лід ТК а ва що 5

Аг су Аів Ада Рго Рг У со ув СУ СІВ Аа Авп Ав пк а 1 185 о

На бнз Аа ує ТНт бо Ріо АБ рто і у ТПВ Ро хо баг баг (чу тай 125

Ро Кіт ув Баг СПУ Авр Ага бе оіу Бу его Ро Оу Заг

ТО 135 їЮ

Ето Су Тит Ро СУ бег Ага ет Аг Те Ето бег ія го Те ЕТО 145 ї5о0 55 тво

Рез Те Ат ів ет і ув ув Ма! Ав ма Уві Аг Те Р то | ув 155 150 175

ЗегРто Бег бег Ав ух Бе Аг беи сни Ту Арго ув Рго Ма!

АВ 185 КБ а Авоіаеці ув Ав Уа гу дегі уз Не Сну бек Того Ав Сей 195 200 ОВ іа На На то СУ У Му ув Уа на Пе Має Тує ух Ро Уді я 15 я

Авріви Бегбув Майї Бег Кук сув КУ щег ре Су Ави Не МВ сей ЗО 545 ай

На ув РО Ву МУ КМУ СМА У ВІ У ув Баг С уві во Ар

Кін ув Аво Ак Уві СМ ен бує Не МУ бегі во Ав Ави Не ТВ о 2655 о

Нв м ее му СПУ МУ Ав сухі у Не СО ТВ Ні ув де Тв 278 280 285

Рае Аго СТЕ Ака Дів Був Авіа ув Тв Авро ів СУ Ага Со Не Мі 290 ке) ЗО

Тут ув БегРтю Уа Уві Зет СПУ Авр Те Зо Его Аг Нв і вч Зег 505 а зів ЗО

Аап ма! Бе Заг ТК Оу Бе пе яв Мет уві Авр Заг то сл Ген 325 ЗО 335

А ТВг СКев Ав дво Спи Уві Баг Аа бе во Ар бух СНО У бе

ЗО 245 35 «м «Рі 12 «ах РЕ «3» Штучна посліденність «ви «реа» бинмтезована «до» 7 ств мві бій ва Зв Сни Заг СУ ліз Авр уви Ма! Ага то Су Ада

З 5 10 15 без ущі ук іец брухту А ее у пе Ави Бе ув Авр Тут

Туга вн Тр Уві Агро Ага Ро у З СНУ ен 6 Тео Пе

З ча 45 сну Ттр ів АБО вус Авп у Авро ТТ ві Тут Аве Рез і ув Ро 50 55 во

ІА СУ ув Аз тн о Тк Ав Аво Ті Зег бе Аза Те Ав Тут 7 Тт8 о

Себіпіво Су вет мец ТВ бе ів Азр ТВ Аа Уа тує Кунк бух 85 по в5

Заг ті во АБО Ре гру мох 1 Тео тн Уві Ве беї ще о о «ий В ії» 30 «12» РТ киі3» Цігучна послідовність «фе «ий» Симтезована «ще В

СУ РП Аво Пе уч Авр Туг Туга МВ

З й 10 кві З «ів 17 «14» Штучна паслідовністіех «ех ке сдинтеввана «МИ» 8

Тур Пе Аве УВІ Ави СМУ Аво Тпт У ТУ Авр бго ук БНе ій

Я 5 то їв «в й «ах о

НЕ

«1 «ії» 115

«йо» РК каї3» Штучна послідовнідть «ух «Ши» СинуІваОована «ах 1

Авр ма ма Ме тк сю Те Буре Тебе бе МВ Те Це У

З 5 19 та

Зі Ро Ав ет Це Зегсує ув Меггі бЧегі ва и Авр бег а 25 Зо

АБО у Те тугі во Аа Тр во во ОВ Ага Рто Су сій Заг

Ро ув Аг цеи Не тут це Уві бат ев ви Ар Бег су Уві Р що 55 «о дер тя тн сМму тк іу Зо Ох ТигАзо РВе тн во був Пе 05 70 75 а

ЗегАго мав сі Ав Зі Аврієм У Уві Тугб Ту отв Пр се Оу 85 90 95

Тв нів Рне бо Тує ТНЕ Вре сі; Си сну ТВРі ув ев Пе був 100 105 о

Ав «ід» 15 «їх 6 «ох РТ ке Штучна посвідовністе «кеш» «вий» синтезована «НЮя 15

Кув бет м Сни Зегіецієи Авроег Авр у Сук тг Тукі енд Ав 1 5 10 їв «а» 15 «1

«123 РКТ «Я» Штучна послідовність «РЦх «ве Синезована «00» 13 зец ма бегіувіви Авр'Заг 1 В ка» 18 «1» З «ей» РЕТ «Ка» Штучна послідоаністе кра» «везе Слхинтезована «40025 а

Тер спа у т Ні Рва то УТА ї 5

«оз У сеї» 119 кад» РКТ «Ах Штучна послідовність «ре «раЗ» бивтезовава сн Уві о Кей ув сти Бегспу лісо Ма Маг Акрето су діа

Я ни То 15 вита! кув Уві Заг Сув'їуз Ма Заг СТУ Ре Ал Не ув Дер Ту? 4 5 ЗО

Тугбец нів Тер ма Ага о Арк его І а СУ фаз о Тер йе

Зо 45 45

СВУ Тер Не Авр то Су Авл Ву Ачр о По уві) Туг Авр Рез ук ВВ 50 си Сім уз Аба ТВ Не Ті лів Авр пе бер ТРАВИ ТОК Ав Туг

55 70 75 во

Бей бівіси БегЗегіви Пре ет СНе Або ТВ Аа Уві Тут пе Сув ще о ни

БегтТВйг Се Аво Кер Оу іа у тт Ма ТЕ уУВ бег Заг 100 то5 то «шій 168 «ев» 15 «хі» РЕК «3» Цінучна послідовність «2202 «аа» Сбинтезована «ах 16

ОБЕМеароци ем ма сни ее су Аа а маг гух був Рі Су дів і 5 16 15

БеєМагіує Уві Зег Сувіув ма Зеєсіу пе Ап Пе) ув Аво Тут

Тугецз Ні То уаі Ак дів Ада Ро Зо сій ЗУ ев С Тр Меї

За 40 З5 су тр пе Авр Кто СВ АБО СНУ АБО ГГ Уа Тут Авр Ро ух Ва 5О сі У Аг Уві тат Пе ТВ Ав Авр ТВ Зег ГВт Аво Тиг Аа Тут 655 70 75 ВО

Магоцо без зе ерген Ту Бег З Авр ТВг Аа Уді Тут Тут Сув 835 по 5 ес сег Авр.епе тру бів ну Пк це Уві Тег Уві Бе бе 109 105 о «о 1 «11» 415 «й» РТ че» Цітучна послідовність «ох «йкат Синтезована

«40025 17 сви УВО ви Уві бій Зеб єму ЛЯ ВІ Уві Ма! Аг Р СПУ АВ 1 5 10 15 че і у Пе сег ув Був АВ Бе (ЗУ Ва Ап Не ує Авр отут

Тука мів Тер Майї Авх Зв Аго Рто в ЗМУ бем Сі Та Пе

З БІ 45

СНУ Те Не бар ЕТО СНИ Ави Ну Авр Тбх УВі Тут дер нзі ув Бра 50

СИ Зі; був Дів тне це ТВ А АБО ТУ ет ТВ Ав ТВЕ АЮ Тут

БЕ Та 75 Во

Сас іп бе ку Зегіви Ти Заг спц Ако ТВ Ав Ві Тук На ув 55 50 95

Заг ТР бе Авр ре Тер. ів СНУ Тег ред уві Ти Уві Зег бог то чай то

«цик В «ЩІ ТЕ «12» РТ «2135 Штучна послідовність» «Во0х «Ра3» Спнтезована кам 18 ся ма оц без Уві Мо Заг Сім Афе Си Ма Уві ув Рез Му Аа

Я В 16 15

ТВ; Уві ув Це бег Су ув Аа бег 3іу Ре Ав Пе уз Авро тут о хо 30

Туга Ні Тр ма Аг ій Ат то су Спи СПУ ден Сів Тер Не

Зв 30 45 ск Тео Пе Авро бо Сни Авп у Авро ТР Ма Тут Ар Рто Гу рве

В) Не ща спа су Ага Ма Те Пе Трг Ага Або Ті Бек ТВ Авро ТВ Аа Тут

05 то 75 що во сій ео Су Зегіхи ПН бе сп) Авр ПВ Айва Уві Ту Рі був

Зег Тбг ен Аво РБе Ттрому Сни Сну Твг Гео ма Тв Уві Бег баг 100 105 о «и» ЇВ «11 15 кої ВНТ «жі1З» Штучне послідовність «ех хойЯ» Смитеазована «ай» 18 іш ма! біо бе Мао Зегоу Ав сни магма! був Рез СМУ Аа 1 5 то 15

ТВ Ма! був Не Бен Суб ув Ага ет Су Ре Тв Пе ув Авр Туг

Туг сво Ні Ттр Уві Аго суп Аго го Су іп у бе 9 Тер Це

ФУ Тр Пе мер Ро Січ Аве СУ Авро тт Ма Тує Дів Ро ув РВе

ЗО 55 Во

ОА чу А Ага Тр Пе Тег АМа АВОо Твг Бег ТВеАвр ТвВг Аа Тут йо 73 75 що

Меч сп еп су Зо део Тре Заг і Авр Те Ав ма! Тут Ве був 85 Ва 95

ВегтТигіев Або пе Тр Оу Сі СПУ ТВі су маг тіж тає бе вет то 105 на «1» г «ві» 13 «1» РЕ «ий» Штучна послідовність «ад» «аа» Синтазована «8005 50

Ар уа М! Мет Те сна Бе Рг дво Бегбецн зе уві Тегі ви су

З 5 18 15

Сп Бгто Аве ет Не Зег ув | ув дегЗегсіл бегіец іє Авр Ен а 5 зо

Дер'М ув Ти Тугі вада То і сю еп бів Аг Єко Су іх Ве 55 40 45

Рію уз Аг і ен Не тугі ен Ма! Зег був ец Авр зе Сім Ма! Ріо

Ба во во Аг не бегну БегсчУ ЗаксСну ТНг Аво Рпє ТВгіеи ув Пе 70 75 ВО

ЗегАт май ін А Ом Авр Уві Се МВ Туг ТукСув Тр бій Оу вк о 95 тні РВе Р Ту ТВ Вве спу ЗУ Су ТР Гуз бен Сн Не був то 105 115

Ага кої» 21 «іх ІЗ «пір» ВИТ «2152 Штучна поспідовність ки» «жа бинтезювиана «щюв 21

Авр Ма! Ма Ме тргоій Бегето цей Бегідви Ро Уа ТВ во Су 1 5 10 15

Сів рго Ліва Бег Не Зег Сув був Зег Бег бій Заг іец ед Ар Зег

Кв) Кі) Зо

Ар єчу Сув Те тує Мей Ави Тр ен і ви С Ат Рео і Суп Зег

ЗВ за 45 то А АТ іа па туге ді зегіув бе Аво ег ОуУ Маг Ріо дар Аг Не Заг сну Зегоу Заг СТУ ТВ Авр РНе Тл во ув Не ба 7 75 5

ЗегАга Уансни А Сів Авр Уві Су Ук Тук ТугСув То п Су

В5 о 95

Тв нів бво Бо тує Те Ре сіу Су Сім Ти ув беи СЯ Не ув 100 105 1

Аг «Нв й «и» З «ой РКЕТ «шій» Штучна послідовність айв я «аа» сСинтезована «0» Я

Ав» Ма! Уві Меї Те СЯп бе Ріо ви Загін го Май ТНгі виз СУ 1 В то 15

«Ма то Аа Бе ЗвеСувіув Бе: Зег СИ бегівц ви Ар Бег що 25 30 аву ув Пи Тугіву Аби Трівц фе і Аго го Су Са баг а Я то Агар Ато бео Пе Туг бен уві Бе буя без Аво Бег Оу Уді Ро що 5 о

ЗегАг не Ваг Оу бе Су Заг Му ТВ Ар ве Твг ви суз Пе 70 75 що

Вег Ат Уві Ос аа сь Аво Ма оуУ ді Тут Туг ув То В у 5 що ча

ТвенНів Рвае го Тут ВЕ РНе СНУ СПУ ЧУ ТР ув ов і Пе ув що т05 те

Ат 0» 3 «Ві 315

«їй» РК «13» Штучна послідовність «тео» «ве сСинтезована «00» 25

Аарпе уд Ме тео Те РІЗіви Бегі и зе Уві Ти Не сну

І 5 1 18 сів Ро лід ет Не Зег Су був За Заг Зегіви дез Авр Бег 23 а 50 дару ув т туге Аа тт бен ен п ув Раз іх СН БОГ 35 30 45 тю гузАтоа Сец Не туге МЕ Зегі уві во Ар Зег су мУаі Ро 5

Авр Ага Ріпа Зег СНУ Заг пу Заг Оу ТЕГ Авр Ра ТНгіец ув Це 05 та 75 во

Бег Ага Ма сь Аа Або Маг Су чаї Ту Ту Су То Сіл СУ до За 95 тТвгнів рве Рго Тук Тк ене сіу «Ну Су Те ув ев 30 Пе ув 120 105 о

З

«БО» 24 «Щ11х В «122 РЕТ ха18» Ното варієпе «М» ра іп уві ій ей о сій Бе Су Ав СНО Уві дув ув Ро СПУ баг

З 5 10 15

Забув був Уа ет Сувіув А бе іх Су Тр Ре сну ЗегТуг а В КВ;

Аа пе его Ма! Ако Ста Ав Рто Сім суп СНУ Гей Си тр Меї

З5 «а ча

СПУ Ага Пе це Рго Пе ес пу Не Аа Тр Туг Ав Сіл був Ра 5О 55 59 сип Оу Аго Ма! вт Пе Те Ага Аво був Заг Ті За Тит АфеТУг 55 то 75 що

МегАвр Се Заг мері во Ага зак СПО АВр ТИ АВ У Ту Ту сух 35 во 95

Аа АгО СМ ув Су СИ пе со СУ Ме Авр ма! Ттріму іп у 300 10 119

ТВгТіе Уві Тв Уві бек Заг «й» а «ві» 98 «М РЕТ «-евійе Мюто зарієпе ка» г

Со Уа бітів Уві 1 Зегсну Ав З МВ бує | ух Рго Су Аа

А В ла 15

ТВ УВЕ ГУБ Не Зелісув Був МБО СУ Тут Пи еле ТВ Авр Туг о Ки Зо

ТусМегмів То У оі с АВ то См Був СНУ ер Во тт Меї у ме Маг Авр то СО Авр СПУ БО ТВ Не Тут Ав чув ЕВю 5О 55 о о СУ Аг Уа тре не Тв Ав Ар ТР Зег ТВг Або ти Аа тує 7 78 во

Меггі сви Зег Зевс Аг Ве ін Ар ПОКРА Має Тут Тут був 85 80 95

А ТНг хи У8

«112 15 «ій» ВВТ «152 Мото варі «00» об

Са НІВ То у іп У ТАг ен Уві г Уві Бегег

І З 16 «10» 97 «їз 100 «вв ЕТ «ід» Ното варю «00» 97

Авр Уа уві МеСТНЕ Сі Зег чо во Зег ви Рі Уді Пе пу і 5 10 15

С Кто Аа же Не ег ув Аг Зег бе ой Зегрво Ма Ні бег 28 Зо

Аврєу Ав Те Тукуец Ав Тто ве сі п Ат то СУ ОНР Ос

55 чо 48

Ро Аг Ага ей Пе тугі ув Уа Заг Ап дару АВО Зег су Марко

У ца

Аво Але Бог су зет Му Заг сх ТВгАвр ве Пт оец дув пе 655 7 т5 Зо

Зег Аг УВІ Спи А ОН Ар уд СМУ У Тут Тук Су Ме сна Су

ЕБіу що а

Ті нія то чо ню «10» У8 «жів ЧЕ «ід» РНТ «13» Мото заріене «Об» ов

Ту Твена Ас Му Тгіує і еи с Це ув 1 5 10

«9102 75 «ф115 19 «вій» КТ «іа Номо варі «ЦЮ» 5

Авр уві Мас Ме ТВг опо ет то бе Зегвбец вт мя ТВ Се су 1 5 10 15 су о Ай ще а дає був Ар Зебра тує ог то а зо

АВОо СЯУ Аа п туге Ав тр Не п ій Ав Рез Оу сій бег

Рг Аг Ага бе Не Туг Аг уві дет Нів Пр Авро обе Му Уді Ро 50

АзрАЩЕНа вет іу Бе Су Бе су ТВ Авр Ве тні еи ув Пе б 70 75 що

БегАт Уа с А ОВ Авроуві СНУ Ма! Гук Тут Сує Май СН Су не за я

Ті тує Те го ви Тв пе ОВ (ЗІ Му ТР Сук ем СЮ Не бує з 5 ло «віх ЗДО «ей» ДНЕ «ЮЛЯ» Штучна послідовність «М «шеа Сдиитезована «що» ЗО звозновве кредеве зо ас видно сажа ядювацно БО мсішсзавоа спецесі свасанйаза яасалан шщевошом дзодсвоаой з15о однасвдю досдацію дача мною «дао сюов сна 18а басссдавої юказоцева дуєсаєвав аваусвовов світа шШововсає ай оїщелосісю зовасстщає аюївадцуве вощорою! щенню вооспуве ЗО псівудаєє дадосассво юїсвово сід з «Ех З кі» 338

«12» ДНК «13» Штучна послідовність «ий» «рий» Слинтезовава «00» запою дасосадає юсасісао Новжоце сезнддася зорадесює 5 аецоса звісзаціюв паоюсіюва заоювВу фааадисвів шщовачоЗ тео почнасва зоссвцдоеса пісбоввао соссіваї відів азасцає 180 івовоюс сіуасавой сасюосво одавадова свв асічавате кад зусадаціючу зоазсіюзадаа кдд пече одевауфіає всачносо З00 івсасецйсс пзпосовуає сао газявоої ЗІЗ «ЕТО» 32 сої 5 «125 РВТ «іа йнузна послідовнють «жо «беЗж ЄСинтезована «400» 38

Ав ТУуг тугі ви На

З 5 «ай З «р» 7 «ов РКТ «13» Штучна поспідоианість куаО» хек» Синтезована «4005 33 у Ре Ава Де уз Ар Тук 1 5 «00» З «В» 5 «вій» РКТ иа» Штучна постдовність «вий «й бинтазования

«00» 34

Авр Ето Сн Ав НУ АВ

Б к«еїж да «11» 10 «12» КТ «ІЗ» Штучна послідовність рух чи» Сбинтезована «М» 35

Тер Не Авр Рго Січ Аза Су Авр ТР МВ 1 5 10 «0» 36 «їх 7 «вій» РТ «132 Штучна послідовність

«вих «вра» бинтезована хай» Я

Гу ТВг тугі ец Аа тТто Це 1 5 «102 37 «11» 16 «1» ВТ «їх Штучна послідовність «Й «32 Синтезована «БО»

Агівц Це тугі єв МВі Вегі ув ев Ар ї Но но) «ВТО» ЗВ «рії» В

«122. РАТ «ій Штучна послідсеність «ев» «бе» Синтезованиа «ОП» 38

Те ія С ТвеНів ве Ро Тут у З «10» За ке 6 «ій РКТ «й» Штучна послідовність «0? «иа» Синтювована кщйх 38

Гук Аво Тут Туг без Нів 1 5

«фі» 40 «й 18 «ій» РЕТ «ій» Штучна поспідовність кВ «ро» Смитезована «02 480

Тер не Сіу Тер Ве Аар Ро Зі Ази Оу Або Тв Уа! 1 5 10 «й «Ті» 4 «ій РТ ки13» Штучна послідовність «ваЦе «ий» Синтезована «400» 81 щег Тг Бей АЗо «Ше 45 каті» о «ій РТ «13» Штучна послідовність «20» «ей» бинтозована «300» 43 су Рне Твг Пе 95 Авр Туг Тут уеу нів 1 5 то «Ох я «о» 17 «12 РК хиі3» Штучна послідовність сих «23» Синтезована

«цю» 43

Ттр Пе Аза Р СВ Авр СТУ Авро Те ма! Туг Аа Рго Сув Рпе- ста 1 З 10 15

Оу «жах 88 «в й «їй» РК «гі» Штучна послідовність «ой» «рез» Симтеюванв «Ох «Ко1» МІС КЕАТОКЕ ккаа (133433) «веЗ» Хва схе аво ув «ах

«ввів МБО БЕАТОКЕ свеш» (65767 «ЖИ» Хав ув ВО А до» 44 св ма! сетей Уві Оз бек сх Ав іч Маі Маі Хаз Рто СВу Ма

НІ Кк 13 15

Мао маг буз Ла Заг Сузі ув Аа Бег СУ Не Два Пе ув Авре Тут

Тугеа Ні Тр Уві Ага СИ Аг ето Спи Зі Оу сей о Тр Не

З5 40 45

ЗК Тр пе Ар бо спи Ав У АвротвЕ май Тут Ар Ро суб не 5О а 5 пп Оу Хаг Ана ТВ Не Тег Аа Аво пт бег ТК Ав пт Аа Тут 655 7 7 8 меи бів сео Су Баг ви ТП бег сів Аво Сг Аа мві Ту Ре Суб ва що чо

Заг тв без Азр Ра тросу Дій Му ТВгіез Ма тн ма бе бе 105 НІ й. «ето» 45 «фії 113 ев» РКК «кіз» Штучна уюєвідовність «них «вай» Синтезавана «ВО» 45

Ар Уві Уві МегтТвк сни баг Рто Сец Зег Ге Зег Уа! ТНг бе Оу

Й В 15 15

Зій Ро Лів Зег Не Ме Сузіув Зег ще сій легіеніви йар Зеї ай За

АВр МУ ПЕ бугбем Ава Тер Бен бе) біб Абу ето сту бів Вег

ЗЕ 40 «5

Роуз Атщієцйе тугі ви ма! Зегі ув ев Ар оЗс Оу Уві га 5О 55 во дер Агу Ріпа Бег у бетг Оу Зег у Тг Авр. Рне ТНт Сави був Пе 70 75 ВО

Хна А уві За Ага ЗВ Аво ма у ма! гуг ТУ ук То у

В що 95

Тег нів Ре го Тут ВЕ Рнейзу су сну Тр ув бе Спо Пе ув чо 105 о

АВ

«Не 45 «11 1 «й РТ «13» Штучна послідовність «их «жах Синтезованиа «а» В сти Уві Сів бе Уві Зегсцу Ав о магма Су уз Су Аа 1 5 10 15

ТВРМа ув Це баг ув був Аа мет ЗУ Бе ТВ Пе ув Абр Тує

КО 25 Зо

Тубрец нів то Уві Абу ів Аг Рг сну був Му во 1 Тр Не

З за 45

СМ Тр Уві Аво Рго ОН Аво ім Аво Тв Ма! Тує Ав го був пе

Во

СН ОЇУ Аг Аа т Пе тв АВ Аво ток бБег Пт Авр ПЕ Ав тут

БІ 79 та В івц сін во СПУ Мет б ец Тв бе С Ав ТУ Аа я Тут ЄНе (ув

Вагт о Або Ре Тр Ну СОУ ТВі во уві Те Ма) Зег бог че ще 116 «ід «рії 112 ків ВК «а» Штучна посвідОовніють сер «щи» Сияимтехована «я у св магів бео Уві біл бег Оу Аа Сі ма! масу го Су Аїд

З 5 то 5

ТогбУдерух це Зх Су ув Аз Баг у Бл ТВ Не ув Авротуг 275 ЗО

Тугуец Ні Тр ма Ав Си Ат Ето СНУ Дух СУ Со Зо Те Пе

СНУ Тр) Не Аво го Сн Азо сіж Аво Тв Уа ту Аз Різ уз ве су АгрАЗа ТВ Не Ту Ар Аво ТЕЗ и Ажо Пе Ав Ту ів ів су Вега Пи БегОї; йав ТВ Ар Уві туї Ре Су шести егАероеве Тр чу п Оу тпгіео Уві Тпе Уві бог Заг зо то Не «10» 48 «різ 41 «ТЕ РК «ві» Штучна послідовність кеша» слмтаезована «ах 4

СМ Ма сій мем У ів бе бу Аза сми У ув Ану о Му АВ 1 гя 10 15 іївеи увіїув Бе Заг ув ув АВ Заг Оу РОБ Аза лег ує Аво Туг

29 75 Зо

Туббен Ні тв Маг Аг Ой Ага то ОВ З Му Сео С То Мей

ЗО Б 45

СУ Пр пе Або Бо ім Ап СНУ Ахо п Уві ТУг Ар Он ув Не

Бо 5 во

Орспи Ага ма! ТВ Чат АВ Аяр Ту ЗЕ ТА Або Трг Аа Тут то ТВ ща зе св ви З бе цем Те Вес оди Авр Тег АВ МВ ТУ ве бує 85 50 25

Заг ген Азр Ба То Су Сів у Твг без Ма! Те Ма! бегбоОеї о чк то «105 49 «і 15 «вів РЕТ ее тучна послідовні «ркИйх «дим сСинтевицна «400» 43

Мч У ОН еш ман сни ен СТУ Ав СНИ Уві ув Апу Кто (МУ Ав

З 5 і. 15

Сен УВІ ув Не ще був ув Аза Зег Су Тук Тр ее тре Авро тує а КЗ

Тусеч мів тр Ма Аг Зі Аг Руб Сн Си у ви З то Ме!

З 40 45

СИМ тів Уві Аво Ро СНО Авросну Аво тр ма Туг Ав ЗО уз Ре 5О 55 о

Сип Су Ак Уві Тег Не те Авв Аво ТвеЗег Тег Аво ТВ Аа Гук

Бе о 75 50

Сей Бій се ОХ ме Тр Бетсі Аво пгт Аа Уа Тут РреоуВ ве 0 35

Заг ТВ Гей Аво ке Тез Су Сі Оу ТНг бе ма ПУ Уві бег де зо щО5 110 «це ВО «фії» Та «Жах РВТ ках Штучна поблідовність «ех «ко» Синтязавана -ео» 5

Су УДО ви Уа ОЙ де су Ав Аво магма уз Кто СУ ДіЗ 1 5 19 15 еп Ук ув Не Суж ув Ав Заг суУ МВо тн Не уз Ав туї

Тугбе ми Тв Уві Ато (й Абу то Се сп у без С Тто Це

СНУ Тр Не Ахо Рез чи Ав СТУ Авр Пн Уві Туг Ав бує РНе сп Оу А Уві Тебе Тег Аа дао пе Зе Тег Ав НАВ ТУ б5 7о 75 ЕВ

Гео сив рво СМУ Бек Бена ТВг Бе о Ар о те Ага Уа тує РЕНО Сух

Зег Пи ів Авр ема Пров ом гу пе Те ТВ Уві Бе ЗО о 105 о «ій В «іх Ла «рідх РЕШТ «йІ1Зх Цітучна поюгдевВнить «ЕТО» «ЖеЗ» Синтезована

«НюЮе 5 сни мав ем шов Зег СУ Ав Аво Ма Маг ув Ртю Ну Ка

З 5 то 15

Гва ув ма Не Баг Су ув Аа Заг Оу ав ТЛ Не ув Авротуг

ЗО

Тусец чв То Уа Акооів Ак Рех сту сю СУ цей спи Тр не

За 30 ві

СЛУ Тр Уві Аво то С Авр СПУ Аво Тне уві Тук Ав Но ув Ве 50 ща що

От ЗУ Ага Мі тт Не Ту Ар Ар ТгЗеє ТР Аво ТВКИМа Тут 55 70 75 Во

Маг уец Сну хебце тину дея сти Азр ГАГА Уві Ту Рле ув 85 що ща

ЗегП ес Ар Бут Тер су Сів у ТВЕ ТВ Бе ТАк Ві Бе ех т о «10 59 «й» ку» РКТ «ей» |тучна послідовність «двЦх край» Синтезована

«М ви (Си Уа Зв бо Уві о Зег оу Аа Спи Уві гук ув Ро У Ав 1 5 то 15

Тіма ув Не Заг Сув ув Ма! Зег сну ре Ази Не був Ар Тут що 275 Зо

ТУР Кар Ні Тер ма! ДІВ ІЗ Дів бо Су ув СТУ Бен За Тр Меї

Б 35

СУ Тер Не Ав» Ро (Зо Ах СПу Авротйг Ма! Тук Авр Ріо ув "Не 90 55 во

Фа Му Ав узі Пк Не тв Аа Аво ТВ Заг ТВ Авр Тк АЧа Тут а Я) 7 во

Мен ец бегЗегіви Ага Зег Со Азр Те Ага уві Ту Ту був 85 о 55 щасті ед Аве Не треоіу і СЛУ Тит ец Уві Ту мя! бе Зеє 190 таЗ чо «10» 5 «дії З «ие РВТ «йіЗ» Штучна послідовність «шкиіх «ряйх синІвЗоВВНа с» 5

Ов Ма Сп бе МВ сно Заг ОМ АБО УВГ ук ув Рез СМу дів

З х 16 15

Геи уві уз ЦО Зег Сухі ув Уві бег сну Туг АБ ББеїук Ар тує а ха Зо

Тир цео Нів Те Уа Аа сни іа бо Оу ув Му мви бю тт Ме!

За 40 аа

Ту Ттр Не Ар ето СО Ап у Авр Те ув тут Азо Сп ув Ве ов Яу Ар ТІ Не ТП АВ Авр ТВежеє ТВ Аве Те А Ту та 75 Во

МЕС ен у Бе і еиолту Зах Спи Аво Ту Ав МВ Ту? Туг од

ЗБ що о ще Тед Ар Ре Тр У біля У Твгеи Маг Тв мВ Заг бег 100 їв то кім Ва кЕіїМ 2 «ія РТ ка» Штучна гпірлідовніють «тах ках Сивнтезовина

«щух 54 са Уві сій ев Уві Заг у Аа со Уві був і ує то Му Ав 1 5 10 15

Капу ув Не бег сбувіув ма Зо тм т Не Тед туг

Кв; Кі КВ

Тугівн Ні По УЗВАР ОВ А РН ОВУ Був у ев си Тер Ме 35 ЗО 45

СНУ Тр Уві Ав Бе сни Ахр у Ле Те Уа! Тут Ав сн ук Не 50 сі су Аго Маг Че Те Аа Аво Ті бег ТВ АВА ТВ А тує мМевсин із СУ Бет еу Ага его Аво ТИ АрОчЕН Тут ТУ ув що 90 55

Заг іви Ав ве Пр ому ЗіБ Му Гбгіео ма ім Уві бЗегОег о ТОБ ко «Як ВЕ «ії 112 «ій РЕТ «13 Штучна посудовність «дах «ге» Сдінтезована

«00» 55

Ми асп і ви Уві ів бек су Ав с ма м ув Ре чу Ав 1 5 15 15

ТУ уз НЕ бн Сувіме ма Зех Чу Ве Ави Це ух Азо Тут

КО о Кв

Тукрен НІ Тр ме Ат в Ав то Зх Був Му Бе о Тр Пе

СУ го Не дво тон Авп Чу Авр я Ма! Тут Авр го ук Рне. а 55 що сп СУ був Афек ТЕН Не ТВ Аа Аво ТВе Бе Тег Ави ТВ Аа Тут

Ве 70 75 до іви оц ец су Бесіди Пи Баг ОВ Ар Аа Ма! Туг Ту ув

ВЕ ВО що

Бебі йгіеи Ако впе то СНУ Ор СУ т іяо ма! г ма ви мех ню 305 и; «Ех 5 ее КУ «аз РТ яиіЗа Штучна побпідовність «оо» «ва» шинтезована

-щюх 55 їх Уа оз іец уві Снп лег СТУ дів Со ма! Уві ух их Му лі 1 їх 10 15

Гез ма ув пес сувіув Уа! Безу ТугАВа Не І ув Аво Туг

Туббе нів то УА ОВ А Ви спу був Су Сео о ту М чо а

СУ Те» Пе Авр Рем ЗЕ Ави СУ Ар т Уа тує Авр Со ув Ле

ОВУ АР Уві Ве Ве РВЕ Аа Ар ін Бе Нео Те Аа тує то 75 о

Ге Сів рем сим жнає дей Тв жег о Аве Те Ав ман Тут Тує Сув 85 що 5 бегТнгіви АБО Не Тр Оу бо му Тк рец уві т мні де Баг «10 5 «ан 419 «123 РІ «кій Шнучна послідовність «деух «Фа» бинтезнвана

«00» 5 с май в ец жа ЗегснуУу лю: У Уві Су Ето Су Ав 1 й 10 15 ів ман ув Пе Бегббувічв уві ет су Тут ТВгРЛЄ ТВг Аяр Туг

Туга Мі Тер Уві Ал ЯНВ Аго Ресноцу був НУ ео Би Ттр МеЇ з 0 55

Оу тр уанАВе оо сь Авр'ЄЇуУ Авротае ма Туг АВ З ух Не ща оо

СИП У Аг Уві ТВ це Те Аа Аво Те Бег ТИР Аве Тім АВ ТУ

Ве ТО т5 що

Се і ев У Бек бе ТЕ его Аво ТВ Ав Уві Туг Туг Сує

Ве що Зо

Заг ТЕ Гец Ажо Бе То СУ СНИ СУ ТУ де Уві Тв: Ма! Бе бег 153 105 то «іх а «й» ТО «182 РАТ «аї3» Штучна пастідовність «йду

«йо» Свнтезована «щЮ» 58

Ох ВЕ дана іма Аво Тут Гук їв МІВ «у» 58 «вії» ЛО «й РН ка» щтучна послідовність «ве «виах Синнаована «ОО» 50

СУ Туг Пе Ре Те Авр Тут Туг ме Ні 4 5 КІВІ «Ох бо «Ії» 10 «иа Р «13 Штучна послідевністах

«в «рай» Синтезована «ОО» 50

Су Тут Аа ене ув Ар Туг Тут б ец МВ 1 5 10 «1йх В «аз 17 «ів» РКТ «13» Штучна песуудовність «во «ве» Синтезована «ароОх й

Та МасАвоа чо З вар СУ лавр пе мі Гуг АВ чо уз Ре

І З т 15

«и» ка Ту ча РКТ «13» Цнучна пеюндовність «ай» «рев» СаНІЗОВаНя ке 5

Тто Не Авр Рахів Аа СУ Аво тт уві ТубАвр спи ув пе Сп 1 5 15 15 сх ах ВЗ «нії» 47 «12» РТ «йі13к Штучна вослідовність «кед» кеиаз Синтезована ках 65

То Уві АвроЄто О5 Авр іу Авр Та ВЕ Тут АйеоНо бує КНе іп 4 Б рІЄ 15 су ко» 8 «11 17 «й1Я ВНТ «ф15х Штучна послідовність «ТРИх «ей» СинтЗовави «Хе 3

Те вв Аво Рез Зо Ап Оу Аво Тег Мая! Туг Ар сни ув ве А су

«2102 5 -ецюв ОВ

ПОС кое 85 «їх Я «роз РТ «вій» Штучна посліевнть «дО «иа» Сбинтязовани «ще б

Спи Уві сип ен бій ів бегоу Ма Ста без ма ато Зег Су Аа

К 5 ХВ Ну

ЗегуУді г узієв бе сує Ти Аіз Баг ЗУ Ген Ап Пе Гуз Авр Тут о ка Зо

Ту пе Мі Тр ма ув Су Аг Р МН ча СУ бе Ттр Пе

З «о у

СУ Тр Не АВ КО ОВУ вл АЗр.Аво Тео ТУГА ТО ув ре щ 55 ВО

(ів У Ага АВ тк ен пе Твг Аво Те ес ще Ази ГАГА Гут в та їх що

Семи От Се Зегсваг іє Тег ше со АвОо ТКА ма Бут Тут Сув що 95

Ті ро без бер ТУ Те ЗУ и су Пе бер Уві Ті а его 109 105 то «310 8 «рії 1 «18 РКТ «13» Штучна поспідовність чен «ий» Синтезована «ах бу

Су ген Ав Пвіух Авр Гуг Тук Ме нів і 5 ча «ше 88 вії їй кое» ЕТ «Та» Штучна послідовністів

«ие хииа» сСинтазована сенше В

Тв Пе Аве Бо и Авп Аво Авр ТО Туб Аа Ріо ув ЕНе Сів ї 5 Не 15 у «і» Б «О5 ВЗ їхюЮ хи» 70 «ії» 13 «1» РЕТ киїй» МНотезарепе «БЮ то їх Уві ув ем Суп Сп загсу АВ ОО ер У Аго бег СУ Ав

З 5 15 15

Бебув уві ви Заг су ТЕ Аа Заг сну ре Ав Пе ув БО Туг щі ж Зо

ТугЦе сла Го У р ув ОВ Аго Бто а А СУ Бево сну тер Не

За БЕ 35

СПУ тр Не Дао Бо 6 А СНУ Депо Заг ОНИ Туг ча то Ав Ре

Ва ЩО

Сл пу Гу АВ тн Мей Тег Аа Аво Пт бер бе Ави Я Ада туї

ЩО 70 75 о

Квп сів ен ебвгОег ів Тк бе йо Пе Ама ча Тує Ту Суб

Авп. АВ Авр ви Ніж АБО Тує Бор У З СНУ ТК Те бер ТНК ВІ ню ї05 но сг щег ка «1» 18 ках РЕ «кій» МШнучна послідовність «ой» хааЗ» Синтезиана

«аю т

С Усна бас Ма СИ Зеаєоу ліз о Уа ма ув ето СНУ Ай

З З ІНН 15

Мее Уві ув бе Зевс ув Су Ав Заг Му Рпе Ави Че ув Авр Туг о йо 30

ТУ ва Міз Тер Уа Аг сн Ага Ре му СНИ СНУ Ге Тр Не що а 5

СУ гр не Аво Ето СНИ Ав СПУ Аяо ТВг УВІ Туг Аво Різ ув Не 5О 55 що а У Аг Ма! тв пе Тв АВ Аво Те Бег ТВР Ави Ті Аа Ту 76 75 8 за бш ів іубегіви Ти его Ав Тіт Дів Ма туге сСув заг Тнгівоу Аа Ве тр СПУ Сів СУ Тк г ец Уві ТР Уві Зег ет «вій» т75 кі» ща «ей» РТ «ій» Штучна послідовність кешу» «та» сСинтєзована

«вам т в мага май си єп Зег у Ав Ар ем Ма) Абу то ОБ АТЗ 1 Б то 15 бер ма! бувією Зег ов ув Ав Зег СУ Ре Аво це бух Авр Туг

Тугіва Ні Тв о Аг З Аг Рто Сум Сі Лу ев ОВ Тер Не 35 Б 5

СМ Ттр Пе Авро Рез о Ана СУ Аве ТВ У Гук Ав бо і уз Ве 518 58 що

СИ У уча ТВ Не ТВе Ада Авр оте хе Заг Ав ТВЕ АВ Тут

Ба ТО та 3: ме ій без у Зеє Це ТВежег сло дар Тв Аж Увр тує Не дув

БВ я ч5

Бебі зо Авр Ре То Сну Спа у Ті пе ей те ув баг Во ї10о 5 3

Ав Зеактвгкіув сну Риз бе Уві Вина різі оц АВ Р баг бек ув 115 ї12о 1575

Зак праг СУ Ов Те Аа Діві ва су Сув ви М ув Ахв Ту 135 0

Евер сш то Уа тн Уві Заг тр Ави Бег Ох Аа ец ТВе Кег 145 150 155 то

Сну чаї Нв те спе рт АВ У ец бю бе бес об іом тує де т85 170 175

Бе багет ча У п Уві тт Бегоег зер ец оту ТНЕСИВ ТЕ 180 та5 95

Туга уч Ака ма Ав Нівіув т зе А Пн бує УМ Ав ув

Був Масть Ро Був Заг Суз Анр ув ТЕН Мі ТВ бує то то Суд 18 218 ехо то Аа их СПО бе бе СНУ ЗУ Ріо дає ча РБе ви Ве Ро го еВ 230 2-5 40

Був тот уз Ар Гу дао Ме пе бесАт т ето сш Уві Те сСув

БО За ма уві ма! Ар ма ве ів Сн Аво бто сю Уві ув Ве Ахи Ттр

Хей 255 273

Ту УВЕ АВ СУ Ма ОВУ Уа НіЗ Ав Ав ув ТВт ув Рез Ага СО са Оп Тука зе Тут Ага Уві Уві бег Ма! дес Те хе 290 285 00

Ніні Авро Тр ви Ав Оу Був СП Тут був Сув був Уві Зег Ав

Зб й Б 32 буз Ав б ец би АВ Ро Пе Чо ув Тег Пе бан ув Аа ув у

ЗВ ЗО 335 с ето Ав сп ета сів Маг Тує Те бер то го Зег Ав Спи СИ

ЗО ща ЗО

МЕМ ТЕ Суз Ап Зп Уві Зб бен те Сухі ем ма) був Су Ве Туг 55 ЗВО ЗВ го бег Аво це Ав Ме СПИ Ттв Сн Зех ака У 3 го Спи Авої з7а 375 ЗО

Авп Тут ув Те тв Ре Рг Ма беи Авробег Авр Оу Заг Ве Не

ЗВ ЗО 95 405

Кео Тубене ув ен ТВ УЗ Ар ув дег Ага Ттр НА Ор СТУ Ав що 5

Уа Рів Зег Су Зк Мві Ме Мі Січ Ар е Нів ав МН Тує ТНг яко ай 430 іп іухзаєіви Заг іец зе Рто У ув 435 440 «ЕН З «211» Ф1З «іх» РТ хай» Штучна послідовність «дО «мий» Шивтезозана «ню 73

Авр Уві Уа Мей тм Сі Гвг ето дао ВГ во Зег Уві тт На пу і В 1 15 см то Аа бе Пе багсувіув Бег ег Сі Зегіец і ве Ар яв ке 5 за

Авр ому Тр ТУгіви Аа Пів ев СОВА ето СУ С ЗО 35 Б «5 чо узА тів Це Тугоец уві бегі ув ец Або бекону Уа то 5 дерАЩене Пе сну Бег іх его ТВ АБр РО ТЕ ем ув Нев

БО то та о

БегАг Уві Бі АВ ОЮ Арі чу Уві Тут Туг був Проза щу 85 ЗО З

Тегі ре го туї ТВг Ре В ЗУ СУ ТВггув ен Со не і ув ще 5 В

Ат Тс Уа Ав Аква бо же Маг епе Не ре Без Рг Заг Ар Со

Св бесі ув Зег Ну ТАг Аа Зет Уві Уві Суві вою ем Ази Ав Ве о 135 150

Тубрю Аг СЯ Аа ув Ма іо Ттр був У Ар Ави Аа ев З 145 чо 155 150

Бе Сім два Заг й ОЮ Заг ма Тв СНИ С Аве Баг і ув Авр. Бог 1655 150 175

Тнг Тут Зег ви Бек Бег Тег во Твгієц Зегі ув Лів Авр ТУ

180 та5 50 і уєне тує ві Тут Аа Схв іь Уві Тек СНО сту Де его 95 ФО ОВ го ма! Ті ув Заг Ре Ап АгУ У ІІ ув вже 218

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Виділене моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з тау людини, яке містить три СО важкого ланцюга, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (ЗЕО ІЮ МО: 8, 91 10), і три СОЕВ легкого ланцюга, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (ЗЕО ІЮ МО: 12, 13 і 14); за умови, що положення Н27 займає Е або У, Н28 займає М або Т, Н2г9 займає І або Е, НЗО займає К або Т, положення Н5І займає І або У, положення Н5БА займає М або 0, положення НбО займає О або А, Нб1 займає Р або Е і Н102 займає Е або У.

2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що зазначені три СОК важкого ланцюга є такими, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (ЗЕО ІЮ МО: 8, 9 і 10), і зазначені три СОК легкого ланцюга є такими, як визначено згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа (ЗЕО ІО МО: 12, 13 ї 14).

3. Антитіло за п. 1, яке являє собою мишачу або химерну, веновану або гуманізовану форму зазначеного антитіла.

4. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 42.

5. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 58.

6. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 59.

7. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 60.

8. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 43.

9. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 61.

10. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, Ко) яка містить БЕО ІЮО МО: 62.

11. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить БЕО ІЮО МО: 63.

12. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить БЕО ІЮО МО: 64.

13. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що СОВ-НЗ містить амінокислотну послідовність, яка містить БЕО ІЮО МО: 65.

14. Антитіло за будь-яким із попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло являє собою гуманізоване антитіло.

15. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить ЗЕО ІЮ МО: 42, ії СОК-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 43.

16. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮО МО: 42, ії СОК-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 61.

17. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮО МО: 42, ії СОК-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІЮ МО: 64.

18. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить 5ЕО ІЮ МО: 42, СОК-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка БО містить зЕО ІЮ МО: 63, ії СОК-НЗ містить амінокислотну послідовність, яка містить 5хЕО ІЮ МО:

65.

19. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить ЗЕО ІЮО МО: 58, і СОК-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить БЕО ІЮ МО: 62.

20. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить зЕО ІО МО: 59, і СОК-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить БЕО ІЮ МО: 63.

21. Гуманізоване антитіло за п. 14, яке відрізняється тим, що СОВ-НІ1 містить амінокислотну послідовність, яка містить ЗЕО ІО МО: 60, ії СОК-Н2 містить амінокислотну послідовність, яка містить БЕО ІЮ МО: 62.

22. Антитіло за п. 3, яке являє собою гуманізоване або химерне антитіло.

23. Гуманізоване антитіло за п. 22, яке відрізняється тим, що зазначена гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОК важкого ланцюга з 5ЕО ІЮ МО: 8-10 згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа, і зазначена гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОК легкого ланцюга з 5ЕБЕО ІЮ МО: 12-14 згідно із зведеним визначенням Кебота/Чотіа.

24. Гуманізоване антитіло за п. 22, яке відрізняється тим, що зазначена гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОК важкого ланцюга з 5БЕО ІЮ МО: 32, 5ЕО ІО МО: 9 ї ЗЕО ІО МО: 10 згідно з Кеботом, і зазначена гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОК легкого ланцюга з 5ЕО ІЮ МО: 12-14 згідно з Кеботом.

25. Гуманізоване антитіло за п. 22, яке відрізняється тим, що зазначена гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОК важкого ланцюга з 5БЕО ІЮ МО: 33, 5ЕО ІО МО: 34 ії ЗЕО ІЮО МО: 10 згідно з Чотіа, і зазначена гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОК легкого ланцюга з 5БЕО ІЮ МО: 12-14 згідно з Чотіа.

26. Гуманізоване антитіло за п. 22, яке відрізняється тим, що зазначена гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОК важкого ланцюга з 5ЕО ІЮО МО: 8, ЗЕО ІО МО: 35 ї 5БЕО ІО МО: 10 згідно з АБМ, і зазначена гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОК легкого ланцюга з БЕО ІЮ МО: 12-14 згідно з АБМ.

27. Гуманізоване антитіло за п. 22, яке відрізняється тим, що зазначена гуманізована зріла варіабельна область важкого ланцюга містить три СОК важкого ланцюга з ЗЕО ІЮ МО: 39-41 Зо згідно з контактним визначенням, і зазначена гуманізована зріла варіабельна область легкого ланцюга містить три СОК легкого ланцюга з БЕО ІЮ МО: 36-38 згідно з контактним визначенням.

28. Гуманізоване антитіло за будь-яким із пп. 15-27, яке містить гуманізовану зрілу варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична будь-якій з зЗЕО ІЮ МО: 15-19 і ЗЕО ІОЮ МО: 46-57, і гуманізовану зрілу варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична будь-якій з БЗЕО ІЮ МО: 20-23, за винятком того, що положення Н17 являє собою Т або 5, і положення Н2гО являє собою І або М.

29. Гуманізоване антитіло за п. 28, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: НЗ8 займає Е і НУОЗ займає 5.

30. Гуманізоване антитіло за п. 28, за умови, що положення НЗВ8 і НОЗ в області МН займають К і 5, відповідно.

31. Гуманізоване антитіло за п. 28, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НЗ8 займає ЕЕ, Н4іЗ займає ОО, Н8вЗ займає Т і Н9УЗ займає 5.

32. Гуманізоване антитіло за п. 31, за умови, що положення НЗ8, Н4іЗ, Н8ВЗ і НОЗ в області МН займають К, ОС, Т і 5, відповідно.

33. Гуманізоване антитіло за п. 31, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ12 займає У, Н24 займає А, Н48 займає І, Нб7 займає А, НВО займає І, Н8В1 займає 0 і НО1 займає БК.

34. Гуманізоване антитіло за п. 33, за умови, що положення Н1І2, Н2г4, Нав, Нб7, НВО, НВ! ї НО1 в області МН займають М, А, І, А, ГО і Е, відповідно.

35. Гуманізоване антитіло за п. 33, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: НІ13З займає Е і Нбб займає К.

36. Гуманізоване антитіло за п. 33, за умови, що положення НІ1З і Нбб в області МН займають К і К, відповідно.

37. Гуманізоване антитіло за п. 33, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: Н40 займає Е і Н8в2а займає 0.

38. Гуманізоване антитіло за п. 37, за умови, що положення НЯ і Н8вага в області МН займають К і С, відповідно.

39. Гуманізоване антитіло за п. 31, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: Н42 займає Е і Н7бЄ займає М.

40. Гуманізоване антитіло за п. 39, за умови, що положення Н42 і Н7Є в області МН займають ЕЕ і М, відповідно.

41. Гуманізоване антитіло за п. 29, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н40 займає ЕЕ, Н8в2а займає с і НВЗ3 займає Т.

42. Гуманізоване антитіло за п. 41, за умови, що положення Н40, Нвага і Н8В3 в області МН займають К, с і Т, відповідно.

43. Гуманізоване антитіло за п. 42, яке відрізняється тим, що НІ12 в області МН займає У.

44. Гуманізоване антитіло за п. 43, яке відрізняється тим, що НВО в області УН займає І.

45. Гуманізоване антитіло за п. 44, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А, Н4і8 займає І, Нб7 займає А, НВО займає І. і НО1 займає Б.

46. Гуманізоване антитіло за п. 45, за умови, що положення Н24, Н4і8, Нб7, НВО і НО!1 в області МН займають А, І, А, І. і Е, відповідно.

47. Гуманізоване антитіло за п. 44, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: Н4іЗ займає О і НВ1 займає 0.

48. Гуманізоване антитіло за п. 47, за умови, що положення На4З і Н8В1 в області МН займають О і С), відповідно.

49. Гуманізоване антитіло за п. 41, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А і НО1 займає ЕК.

50. Гуманізоване антитіло за п. 49, за умови, що положення Н2а4 і НО1 в області МН займають А і Е, відповідно.

51. Гуманізоване антитіло за п. 49, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ1ІЗ3 займає Е, НІ17 займає ГІ, Н2г9 займає Е, Н42 займає Е, Н4іЗ займає О, Нб1 займає Е, Н7б займає М, НВО займає І, Н8В1 займає о.

52. Гуманізоване антитіло за п. 51, за умови, що положення Н1І3, Н17, Н2г9, Н42, НаЗ, Не, Н7б, Ко) НВО і Н8З1 в області МН займають БЕ, Г, Е,Е, ОО, Е, М, І. і 0, відповідно.

53. Гуманізоване антитіло за п. 43, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: Н24 займає А, Н28 займає Т, Н4в займає І, Н54 займає 0, НбО займає А, Нб7 займає А, НВО займає ГІ. і НО1 займає РЕ.

54. Гуманізоване антитіло за п. 53, за умови, що положення Н24, Н2г8, Н4і8, Н54, НбО, Нб?7, НВО і НО! в області МН займають А, Т, 1,0, А, А, Г. і Е, відповідно.

55. Гуманізоване антитіло за п. 43, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ10 займає 0, НІ17 займає ГІ, Н2г4 займає А, Н28 займає Т, Н4іаЗ займає СО, Н48 займає І, НбО займає А, НбЄ1 займає Е, НО1 займає Е, НІ1О8 займає Т і НІ109 займає Г..

56. Гуманізоване антитіло за п. 55, за умови, що положення НІ0, Н17, Н2г4, Н2г8, Н4іЗз, Н4а8, НбО, НОТ, НОТ, НІ108 і НІ109 в області МН займають О,!, А, Т, О, І, А, Е, Е, Т ії, відповідно.

57. Гуманізоване антитіло за п. 44, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: Н17 займає ГІ, Н27 займає У, Н2г9 займає Е і НбЄ1 займає Е.

58. Гуманізоване антитіло за п. 57, за умови, що положення Н17, Н27, Н29 і Нб1 в області МН займають Г, У, Е і Е, відповідно.

59. Гуманізоване антитіло за п. 29, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: Н17 займає ГІ, Н27 займає У, Н2г9 займає Е, НбЄ1 займає Е, Н7б займає М і Нв2а займає 0.

60. Гуманізоване антитіло за п. 59, за умови, що положення НІ17, Н27, Н2г9, НЄ, Н7б і Н8вга в області МН займають І, М, Е, Е, М і С, відповідно.

61. Гуманізоване антитіло за п. 29, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області УН займає амінокислота, як зазначено: Н12 займає М, НІ17 займає ГІ, Н2г4 займає А, Н4іЗ займає СО, Н48 займає І, Н8ЗЗ займає Т і НО1 займає КЕ.

62. Гуманізоване антитіло за п. 61, за умови, що положення Н1І2, Н17, Н24, Н4З, На4а8, Н8З3 і НО1 в області МН займають М, Ї, А, с, І, Т, Е, відповідно.

63. Гуманізоване антитіло за п. 29, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ12 займає У, Н24 займає А, Н48 займає І, Нб7 займає А, НВО займає Г,, Н83З займає Т і НО1 займає РЕ.

64. Гуманізоване антитіло за п. 63, за умови, що положення Н1І2, Н24, Н4і8, Нб7, НВО, Н8З3 і НО1 в області МН займають М, А, І, А, Г.,, Т і Е, відповідно.

65. Гуманізоване антитіло за п. 28, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МН займає амінокислота, як зазначено: НІ1ІО займає Е або 0, НІ12 займає К або М, НІ13 займає К або Е, НІ17 займає Т, І або 5, Н24 займає М або А, Н27 займає Е або У, Н28 займає М або Т, Н29 займає І або Е, НЗО займає К або Т, НЗ8 займає О або ГЕ, Н4аб0 займає А або Р, Н42 займає С або Е, Н4іЗ займає К або СО, Н48 займає М або І, Н51 займає М або І, Н54А займає М або О, НбО займає 0 або А, Нб1 займає Р або Е, Нбб займає Е або К, Нб7 займає У або А, Н7бЄ займає О або М, НВО займає М або ГІ, НВ1 займає Е або 0, Нв2а займає 5 або б, Не8ВЗ займає Т або Е, НО1 займає У або Е, НОЗ займає А або 5, НІ102 займає Е або У, НІО8 займає Т або І, НІ109 займає ГІ. або М.

66. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н1І2, НІ13, НІ17, Н24, НЗ8, Н42, НАЗ, Н4ів, нНеб, нНб7, Н7б, НВО, НВ, НЗ3, НОТ і НОЗ в області МН займають М, Е, І, А, Б, Е, О, І, К, А, М, С, 0, Т, Е ї 5, відповідно.

67. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення НЗ8, Н42, Н4ІЗ, Н7б, Н8ВЗ і НОЗ в області МН займають Р, Е, с, М, Т і 5, відповідно.

68. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н1І2, НІ13, НІ17, Н24, НЗ8, Н40, Н42, НаЗз, Н4і8, Нбб, Нб7, Н7б, НВО, НВ, Н82А, НЗ3, НОТ ї НОЗ в області МН займають М, Е, Г., А, Е, В, Е,О,І,К, А, М, І, 0, 0, Т, Е і 5, відповідно.

69. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення НІ12, Н24, НЗ8, Н40, Н4З, На4і8, Нб7, НВО, НВ1, Н82А, Н8З3, НО! ї НУОЗ в області МН займають М, А, Б, Б, 0, І, А, С, 0, о, Т, Б і 5, відповідно.

70. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н12, Н24, Н2г8, НЗ8, Н40, НаЗ, На48, Н5Ба4, НбО, Нб7, НВО, НВ, Н82А, Н8ВЗ, НО і НОЗ в області МН займають М, А, Т, Б, Б, 0,1, 0, А, А,

М.О, 0, ТТ, Е і 5, відповідно.

71. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н12, Н2г4, Н2г8, НЗ8, Н40, Нав, НО, Н5Ба4, НбО, Нб7, НВО, Н82А, Н8З3, НО і НОЗ в області МН займають М, А, Т, БЕ, Б, І, М,О, А, А, Го, Т, Е ї 5, відповідно.

72. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н12, Н2г4, Н2г8, НЗ8, Н40, Н48, Н54, Зо НбО, Нб7, НВО, Н8В2А, НВЗ, НО і НОЗ в області МН займають М, А, Т, БЕ, Б.І, 0, А, А, о, Т, Гі, відповідно.

73. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н1І3, Н17, Н2г4, Н2г9, НЗ8, Н4О, Н42, Н4іЗ, Н5Я4, НОТ, Н7б, НВО, НВ, Н82А, НВ, НОТ і НОЗ в області МН займають РЕ, Г., А, Е, В, В, Е, о, М, Е, М, С, 0, 0, Т, Е і 5, відповідно.

74. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н1І3, Н17, Н2г4, Н27, Н28, Н2г9, НЗО, НЗ8, Н4О, Н42, Н4З, Н51, Н54, НбО, НЄ, Н7б, НВО, НВЗ1, Н82А, Н8В3, НОЇ їі НОЗ в області МН займають К,Г, А, М, Т, Е, Т, К,К,Е, ОО, М,О, А, Е, М, І, 0, О, Т, Е і 5, відповідно.

75. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н1І0, Н12, Н17, Н24, Н28, НЗ8, НО, Н42, наз, Нав, Н5Б4, НбО, Нб1, Н7б6, НВО, Н8В2А, Н8З3, НО, НОЗ, НІ108 їі НІ109 в області МН займають О, М, І, А, Т, БЕ, Б, Е, ОО, І, М, А, Е, М, Г.,, с, Т, Е, 5, Т і Ї,, відповідно.

76. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н1І0, Н12, Н17, Н24, Н28, НЗ8, НО, Н4іЗ, Н48, НО, Н54, НбО, НЄ, Н8В2А, Н8В3, НО, НОЗ, НІ102, Н108 і НІ109 в області МН займають Б,М,С,А, Т, БЕ, Б, 0,1, М, 0, А,Е, б, Т, Е, 5, М, Т і Ї., відповідно.

71. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення НЗ8 і НОЗ в області МН займають К і 5, відповідно.

78. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н17, Н2г7, Н2г9, НЗ8, НЄ, Н7б, НВ2А і НОЗ в області МН займають |, М, Е, Е, Е, М, с і 5, відповідно.

79. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н17, Н2г7, Н2г8, Н2г9, НЗО, НЗ8, Н51, Н5Б4, НбО, НОТ, Н7б, Н82А і НОЗ в області МН займають Г, М, Т, Є, Т, Б, М, 0, А, Е, М, сі 5, відповідно.

80. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н12, НЗ8, Н40, Н4ів8, Нбб, Нб7, Н7б, НВО, Н8З2А, Н8ЗЗ і НОЗ в області МН займають М, Б, Б, І.К, А, М, І, с, Т і 5, відповідно.

81. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н1І2, Н17, Н27, Н2г9, НЗ8, Н40, НЄ, НВО, Н82А, Н8ЗЗ і НОЗ в області МН займають М, І, М, Е, Б, Е, Е, Г, с, Т і 5, відповідно.

82. Гуманізоване антитіло за п. 65, за умови, що положення Н12, Н17, Н27, Н2г8, Н2г9, НЗО, НЗ8, НЯ, НОТ, Н5БЯ4, НбО, НЄ, НВО, Н8З2А, Н8В3 і НОЗ в області МН займають М,І, М, Т, Е, Т, Б, Б, М, о, А, ЕЕ, 0, Т і 5, відповідно.

83. Гуманізоване антитіло за п. 28, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МІ. займає амінокислота, як зазначено: І 36 займає!, 137 займає! і1100 60 займає 0.

84. Гуманізоване антитіло за п. 83, за умови, що положення /36,137 і 1100 в області МІ. займають Г., І. і С, відповідно.

85. Гуманізоване антитіло за п. 83, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МІ. займає амінокислота, як зазначено: І 12 займає 5 і І 45 займає К.

86. Гуманізоване антитіло за п. 85, за умови, що положення | 12 і І 45 в області МІ займають 5 і К, відповідно.

87. Гуманізоване антитіло за п. 28, яке відрізняється тим, що щонайменше одне з наступних положень в області МІ. займає амінокислота, як зазначено: 1/2 являє собою М або І, 17 являє собою 5 або Т, 112 являє собою Р або 5, 115 являє собою І або І, 136 являє собою Ї, 1 37 являє собою І, 1 45 являє собою РЕ або К, І 60 являє собою 0 або 5, 1100 являє собою 0.

88. Гуманізоване антитіло за п. 87, за умови, що положення І 12,1 36,137,14511100 в області

МІ. займають 5, І, ГГ, К і С, відповідно.

89. Гуманізоване антитіло за п. 87, за умови, що положення /36,137 і 1100 в області М займають Г., І. і С, відповідно.

90. Гуманізоване антитіло за п. 87, за умови, що положення І 36,137,16011100 в області МІ. займають Г., І, 5 і б, відповідно.

91. Гуманізоване антитіло за п. 87, за умови, що положення І2,17,112,115,136,137,1451і1100 в області МІ. займають І, Т, 5, І, ЇЇ, Кі С, відповідно.

92. Гуманізоване антитіло за п. 87, за умови, що положення І2,17,112,115,136,137,14511100 в області МІ. займають М, 5, Р,ГІ, |, І, Е і С, відповідно.

93. Гуманізоване антитіло за п. 28, яке містить зрілу варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 15-19 ї 5ЕО ІЮ МО: 46-57, і зрілу варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична будь-якій з зЗЕО ІЮ МО: 20-23, за винятком того, що положення Н17 може являти собою Т або 5, і положення Н2О може являти собою І або У.

94. Гуманізоване антитіло за п. 93, яке містить зрілу варіабельну область важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 98 95 ідентична будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 15-19 ї 5ЕО ІЮ МО: 46-57, і зрілу варіабельну область легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 98 95 ідентична будь-якій з зЗЕО ІЮ МО: 20-23, за винятком того, що положення Н17 може являти собою Т або 5, і положення Н2О може являти собою І або У.

95. Гуманізоване антитіло за п. 94, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність будь-якої з 5ЕО ІЮ МО: 15-19 і 5ЕО ІО МО: 46-57, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність будь-якої з зЗЕО ІЮ МО: 20-23.

96. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 15, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

97. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 15, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

98. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 15, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

99. Гуманізоватне антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:15, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

100. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:16, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

101. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:16, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 21.

102. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:16, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 22.

103. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:16, і зазначена зріла 60 варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 23.

104. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:17, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

105. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 17, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

106. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 17, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

107. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 17, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

108. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 18, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

109. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 18, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

110. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 18, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

111. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 18, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

112. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

113. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і зазначена зріла Зо варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

114. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

115. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

116. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 46, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

117. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 46, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 21.

118. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 46, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 22.

119. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 46, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 23.

120. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 47, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 20.

121. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 47, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 21.

122. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 47, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

123. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 47, і зазначена зріла 60 варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

124. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 48, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

125. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ХЕ ІЮ МО: 48, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

126. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 48, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

127. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 48, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

128. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 49, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

129. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 49, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

130. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 49, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

131. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 49, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

132. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 50, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

133. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 50, і зазначена зріла Зо варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

134. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 50, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

135. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 50, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 23.

136. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 51, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 20.

137. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 51, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 21.

138. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 51, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 22.

139. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 51, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

140. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 52, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

141. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 52, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

142. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність хЕО ІЮО МО: 52, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

143. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 52, і зазначена зріла 60 варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

144. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 53, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

145. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 53, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

146. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 53, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

147. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 53, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

148. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 54, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

149. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО:54, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

150. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 54, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

151. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 54, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

152. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 55, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 20.

153. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 55, і зазначена зріла Зо варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 21.

154. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 55, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ХЕ ІЮ МО: 22.

155. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 55, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 23.

156. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 56, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 20.

157. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 56, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

158. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 56, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

159. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ МО: 56, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

160. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 57, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 20.

161. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 57, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21.

162. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 57, і зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 22.

163. Гуманізоване антитіло за п. 95, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 57, і зазначена зріла 60 варіабельна область легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23.

164. Антитіло за будь-яким із пп. 1-3, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло є химерним антитілом.

165. Антитіло за будь-яким із пп. 1-3, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло є венованим антитілом.

166. Антитіло за будь-яким із пп. 1-165, яке є інтактним антитілом.

167. Антитіло за будь-яким із пп. 1-165, яке є зв'язуючим фрагментом.

168. Антитіло за п. 167, яке відрізняється тим, що зазначений зв'язуючий фрагмент являє собою одноланцюжкове антитіло, Раб або Е(аб)2-фрагмент.

169. Антитіло за будь-яким із пп. 1-165, яке є Рар-фрагментом або одноланцюжковим Ем.

170. Антитіло за будь-яким із пп. 1-166, яке відрізняється тим, що зазначений ізотип являє собой ІДС1 людини.

171. Гуманізоване антитіло за будь-яким із пп. 22-163 і 165, яке відрізняється тим, що зазначена зріла варіабельна область легкого ланцюга злита з константною областю легкого ланцюга, та зазначена зріла варіабельна область важкого ланцюга злита з константною областю важкого ланцюга.

172. Гуманізоване антитіло за п. 171, яке відрізняється тим, що зазначена константна область важкого ланцюга являє собою мутантну форму природної константної області важкого ланцюга людини, яка характеризується зниженим зв'язуванням з рецептором Есу у порівнянні з природною константною областю важкого ланцюга людини.

173. Гуманізоване антитіло за п. 171 або 172, яке відрізняється тим, що зазначена константна область важкого ланцюга належить до ізотипу Ідс1.

174. Антитіло за будь-яким із пп. 171-173, яке характеризується щонайменше однією мутацією в константній області.

175. Антитіло за п. 174, яке відрізняється тим, що зазначена мутація знижує фіксацію або активацію комплементу константною областю.

176. Антитіло за п. 175, яке містить мутацію в одному або декількох із положень 241, 264, 265, 270, 296, 297, 318, 320, 322, 329 і 331 згідно з нумерацією Є).

177. Антитіло за п. 176, яке містить аланін у положеннях 318, 320 і 322.

178. Антитіло за будь-яким із пп. 1-166, яке відрізняється тим, що зазначений ізотип належить до ізотипу Їд2 або Ідш4 людини.

179. Антитіло за будь-яким із пп. 1-178, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло є щонайменше на 95 95 мас./мас. чистим.

180. Антитіло за будь-яким із попереднім пунктом, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло кон'юговане з терапевтичним, цитотоксичним, цитостатичним, нейротрофічним або нейропротекторним засобом.

181. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло, як визначено у будь-якому з пп. 1-180, і фармацевтично прийнятний носій.

182. Нуклеїнова кислота, яка кодує важкий ланцюг і/або легкий ланцюг антитіла, як описано у будь-якому з пп. 1-180.

183. Спосіб гуманізації антитіла миші, причому зазначений спосіб включає: (а) відбір однієї або декількох послідовностей акцепторного антитіла; (5) ідентифікацію залишків амінокислот антитіла миші, які слід зберегти; (с) синтез нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований важкий ланцюг, що містить СОК важкого ланцюга антитіла миші, та нуклеїнової кислоти, яка кодує гуманізований легкий ланцюг, що містить СОК легкого ланцюга антитіла миші; й (4) експресію зазначених нуклеїнових кислот у клітині-хазяїні для одержання гуманізованого антитіла; причому зазначене антитіло миші характеризується зрілою варіабельною областю важкого ланцюга згідно з ЗЕО ІЮО МО: 7 і зрілою варіабельною областю легкого ланцюга згідно з ЗЕО ІЮ МО: 11.

184. Спосіб лікування або здійснення профілактики захворювання, що викликане тау, в суб'єкта, причому зазначений спосіб включає в себе введення ефективного режиму антитіла як визначено у будь-якому з пп. 1-180 і за допомогою цього лікування або здійснення профілактики зазначеного захворювання.

185. Спосіб за п. 184, який відрізняється тим, що зазначене захворювання, яке викликане тау, являє собою хворобу Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинну вікову таупатію, постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматичну деменцію або деменцію боксерів, хворобу Піка, хворобу Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скроневу деменцію, лобно-скроневу лобарну дегенерацію, хворобу аргірофільних зерен, глобулярну бо гліальну таупатію, аміотрофічний латеральний склероз/комплекс паркінсонізм-деменція Гуам,

кортико-базальну дегенерацію (КБД), деменцію з тільцями Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМАб) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНП).

186. Спосіб за п. 184, який відрізняється тим, що зазначене захворювання, яке викликане тау, являє собою хворобу Альцгеймера.

187. Спосіб за п. 184, який відрізняється тим, що зазначений пацієнт являє собою носія АроЕ4.

188. Спосіб виявлення відкладень тау-білка в суб'єкта, що страждає від або підданий ризику розвитку захворювання, яке пов'язане з агрегацією або накопиченням тау, причому зазначений спосіб включає введення зазначеному суб'єкту антитіла, як визначено у будь-якому з пп. 1-180, і виявлення антитіла, що зв'язалося з тау, в зазначеного суб'єкта.

189. Спосіб за п. 188, який відрізняється тим, що зазначене захворювання, яке пов'язане з агрегацією або накопиченням тау, являє собою хворобу Альцгеймера, синдром Дауна, легке когнітивне порушення, первинну вікову таупатію, постенцефалітичний паркінсонізм, посттравматичну деменцію або деменцію боксерів, хворобу Піка, хворобу Німана-Піка типу С, над'ядерний параліч, лобно-скроневу деменцію, лобно-скроневу лобарну дегенерацію, хворобу аргірофільних зерен, глобулярну гліальну таупатію, аміотрофічний латеральний склероз/комплекс паркінсонізм-деменція Гуам, кортико-базальну дегенерацію (КБД), деменцію з тільцями Леві, варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (І ВМАЮ) або прогресуючий над'ядерний параліч (ПНО).

190. Спосіб за п. 188, який відрізняється тим, що зазначене антитіло вводять за допомогою внутрішньовенної ін'єкції в організм суб'єкта.

191. Спосіб за п. 188, який відрізняється тим, що зазначене антитіло вводять безпосередньо у головний мозок суб'єкта за допомогою внутрішньочерепної ін'єкції або за допомогою свердління отвору в черепі суб'єкта.

192. Спосіб за п. 188, який відрізняється тим, що зазначене антитіло є міченим.

193. Спосіб за п. 192, який відрізняється тим, що зазначене антитіло є міченим флуоресцентною міткою, парамагнітною міткою або радіоактивною міткою.

194. Спосіб за п. 193, який відрізняється тим, що зазначену радіоактивну мітку виявляють із застосуванням позитронно-емісійної томографії (ПЕТ) або однофотонної емісійної комп'ютерної томографії (ОФЕКТ). не їі т: ж х як ; З шин

Фіг. 1

Карбжекония У Зрулетікнцх ЕЛІТ КВОАІАКУ ЛИ КАК МКМ КОМ ще хї ха аа ща АЖ У ДК КК ДА МЖК ДЖ АЖ ЖК ИЙ юю т Кф ит Тра ЗЕМУК НЕ хм КЕКАМЕОКК ЦКУ КК КВОТ КК КМ Трвук БМК УНК и и Я Би НУК КОХ УКХ А КК ЕМ ККУ К КК КУ НК ВЕ Буха а ноМи КОМІ а ДГКАХОУК КОВКИ КН ТК оо ПЗВ У МІ як р ПОН ШУКІ С КАЛНЕМЕВОУХ МНК Х ШКЕЕКК КВЕСТ о півак ККУ ВУ НН З о Не а КЕ КК З ЯК о ВН СЕК КЗМНУУ ТУЮ 7 7 їй З Крминхиу о и В ин ва и щем ще й жжжаижіуа аніж нжнюютююні жін житя нині жі фе жкі жі у жатк фан нні жін фя ЕВ ТЕ Як Б МН пл ри нан на вивів пон овв і АВ АЗИ ВК маси МІМУСІІ ма УНК ТАК ІПТ УУИИ КК Ж МК ООЖЕу ЗМ Я. Іди ДЕННЯ о в Ріх о ВЖУ ТВ ОВО Ми ВЕ ПТУ КК ВТ АМКУ МАМ Ж рв Ви ОБО ТЕ 3 Білою ВМ ПУСКИАТУ ТІ АТХ ЕК М НЕОН вине 3 ЯКО ХВ ОМ Що поажасолі і МУКАХ ВУ ТУТ Ка У ни Х1О. У ЩО ЗЕ Бас ПАПЕХНУТІХ ЗЕУТВУК Р ТИНИ КАК У У КВТ ЗО ВВХ М ЖОВ Таз ПЗВ Й

Фіг. 2 І в Бирупноказнхе У Борчнтть ПОУМТВ ІТИ ПК КО ВИК ВИК ГТК и а а п м а а ще щи : її ТЗ БУ жк т-6- Вимк ЛПУ ті ІА УВАЗІ Ра ВОТ ЕВ У єї ра печі мЕУ минув СОВКИ А КН З АНІ Бі ВЛ ПИ АНЯ АКТ СКЕВ ВХ Ка ЕМВ еВ ом АННИ г дяк Но и и М ОА Крак БЗЕНУЮ БК Бод о о а ОН їх - та тіж пох о Кілок ВТМ ВЕН и и о в КК СО СНО У Кілвцасте ЕКОЗЦУФВВК КОМИ ВУ ТО І ВК ВИТ У ОКУ ВІК На ХО Я: Я» щ м ме ро тих дїк г. зкаж - чех Ух У тх ае ТАМ Блок ЛНУ Ї МНН осстзнзлокинртнитиотиннуинкнеямчитиих неви ериніинаннаннх Біл ВЗЕКУЄТ КІСОК ЕМАВНЕ ТК ТОМ КАК КС КУМ КК 12 ОБЖО ЗЮ ЖО:З К вижуєиз МІЛЕНА ІА ЖИ ЕК аКи ІЛ ВВ З ВО:2Е пе б ПО Оу сенс аж їй чеше Тілеж ВУД Т Ха КІДКЕУС ВОК ККИ МВВ КАК КІТ ОНЕУ ккх 33 ВВ ЗЮ КО Біди БЛЕМ КІЛДУМИМУс ВІТ КУКА КИ ОТУТ юки лки 113 ВЕЖ ЗОМ ОТ М КОЖ М Вл ККД В. зем когіки 113 З З виг Шло ВІ УТ хі ККУ ОКУ ВІТ ЕВ АШИ ХХ ОВК КОМІ ЖІ 13 8БО ЛЕ КО:

ІГ. . Муученнуважна МЕ Бинт» ОК Я В о и КК СК ОН Я ше ню дою тк днини оф кю хе фо м м Кіл тити тя їй ща ЗІ «Фа ВІ Ера ВОЖНЕК НУЄ он НН НКУ Бізон ВУЄ ИМ ЕМВ КВК КС КАВСКНККО КВТ ЕМОКМН МКМ ОО Брек ВІН Е НЯ ВАЛ Ка ЕК о ЗК Ж т Я КВ о о УК КК ВВ ІМК ВлаМяХЕКУКОМКИЯ Мих У МКК тих ут. АД ин Кк Тнлов КСО НУТ МНИХ ПеФЮНКУ ВЕК ТЕСТОВА не НВК 55 їмдех ВІДМ УТА ІВ УФВ КЕКВ У ВЕК К ВВ Ку ДИН НЕ ім ВЕК На КЕ ПАКУЮМЕНОХИА ПОКДНОКМООУКНКХ КОВЕЕЮООСММЮВМ 5 Тим ЗЕ КУСОК ФАК ВО КО КТ НАУ КОМ КХ СЕ уже зу пік АК ук ие М вом мет ми ож Кен ПОЕМ МІЯЦ В БУДИ МИ ЖМУХ ВЕЛО ЄНИ хаВЕУВОЮ ХІНЖУ КУМ КК МІН ОВ Еоок ВЕУ МУ о о и о сит БК ЕКО, па в о я я хо шин ВОКАЛУ ОК о КВК А КК НК В СКК У КИ ХК НОрАХ УК пон ки ВАК АН КК Ки и КОМ аск КОТУ КРОКУ АВМ ТИМКО КВУ КН КМ КВ ОК ЕКО ВІКУ КУПА АННА ВУК ПОКИ К У ВИ В С КК ЖеЧОКИАЖУКиО поча о оо а МУ Пі ВЗ НЯ МУКА ЗВУК Ії ВОММОЄКМІКО ТАНКУ зу ЗРК АБН КН и Кок БАМИ БООІАОВООАКУКЕ ОККО КВ ки КЕКВ КХНКВИ 5 ЗККУК ММК КТЄВ чи ми кими ки ух Се ОК КИ ДАЕ щем ву різак ЗТ КУТОПИВ КУМ В КУКИ о ВОК ОВ ВК МОБ ПАДАВ КО ОН асо Арон АВ Де сода хх Візи КІТ Млія ЕДАСВМАХМУ УК АВК КИ АНУ КВН КО МНН

Фіг. 4Д г.

Кевашеую ПРОТЕ ВКЕ АК ТАТ М КТК ЕК КАК ТКСЕ КТК ха В жа нн в і ох ся ск ЕЗ за та зі: ми МУК ЦХІ оо я о пе ов В п око ок й шик КЗБУАКНЯЬ ІЕЕ ШК ТИТА раки е У ВК 10 ЗО КОЗИ ВХ ія КК НУК ВОЗІВ ТІТКА ТЕЛА ВІКНІ Ат ЗК ХИЖІ пн і імені. МУКИ КОВКА КО НОМ КВ ВМО ии ТХ2 ОВО ХЕ ЖИ ЗЕ М Вк мя ми лики Он НО вт и УК зУкни и зи БЕ щи -к шк ких ПМ у МАХОВІ ВЕК М ВО ЩЕ ЯКИХ п МИ о ЕК КТК КАК ВІВАТ МК ВТК ТВ 212 СВБ ККУ кю ММК УК ву рот ки ее ВИ ИН сени мам ї в ше НН БУК ТІТКА ВАТИКАН КЕ 2 ВКФ ХВ ЯКЕ шен ПТУ КОН УМОВАХ НІ КИ ВАК В ОККО РИТИ 21. ВБШ ХВ ОН ЯВ пк емя НКМЗ ЕККИОКК УТІМ АТ АМ Е В КАКНин длл ЕВ ОІВ ВЕ Мвт парі КРУЛИВЯК ОВУ ТІМ КАТЕ КК ТУ В ТАК еВЕ зло ВЕф уж Км ді тіхок аЗуКТУтх Пози и в НН НИ Бриж МКУ, ІК ТЕЕВ КТ ТВ АВК МКК ТАХ КАМЕНІ ЗХ ВЖИ ТИ МО: щшузех ПЛЕНУМ и канав. п шою дак ану ня що пок ув о а и в НН пк ацеУункк КЕН КК ВТК ТАК КАК КОКО ХВ ЗБЕ Ж МОЯ Бикух ВЛЕАТУТИНЯ КЖ ВКМ КОНТ КАК я КОМ; ЕК ОВК 15 ЩЕ хе МУ 5 Кіжук ВЗККУЮНАЬ пУТОМКУ ЕКО АВМ МВВ и Ким ІК ЗЕ ЖК ВМ ЗЕ Ніж ВЗЕКУМИВсЬ: ТУКА АКІ КЕН КА КЕ ТКУ ЗАХ ошК Ме ВІ Бихек ВАТНИХ ПТУ ЕК Нет Кит ЗАЖ ВО МУК

Фіг. 4 а зу Мопрамив КІЛ А Н вееуї ї в ЗЕ: е Ка як зі ЩЕ: КЗ ж Ж в І КІ Ж Ж ще Ку х Ж Ж Я ще І Ж хх зд щ ЖК ВОК : КЕ: Ж Ж Я її з як я Ж Ж | з ХХ Ж 1 я Ж Ж Ух ою БОМ КК дм М що Щі В 3 ОМ Кк х ов а о де ою я фіг. 5А

ІГ. о «А Керн ПЕДА ско МміреННи Та Я В В « В ВВ Я Бе Ед кВ В В В х т Ж В В В я щи В й Ж В ях х В и ОД и і в ОД ВИ шо нн З В КО НО

Фіг. 58

І. . щ плеч льн Я ЖК. руна укових щ З я БЕК я : т Я я з з Ж я Як х хт4 5 5 Я ті Е Я Зх Я Б з Є х Я ЕЕКну Е: В І Я їх з - в Я пі З Я Я н БОКУ є с Е шлю УК Ух М М о НК А о хо о МК

Фіг. 5

НГ. тод 1 М Ен і им ЗБ ержді і В НН Н Н 1 ї ї А а М ІЧ: ОО: БЕК БК АВ. ТОЩО ж нки НО Н їх З деки Її ах ух с РОСВЯК : УЖ НЕ О НХЖК ОО. п а пк а ПВ Тов Її зум | Зхухаї чаї ТОЖ З ЗЕМ КНУ ВУ: укл у ВАХ ин ень пен 85 3 ЗХ рою: ОВО под а п : ї гм Ї наш: Н чих ши сив я т і Ж ЩЕ Я и в ово 1 а шота ЯВ а в м п В ПЕ ТЕ ЕВАКА

Фіг. 6

ІГ. о зон но пн мо о нова п конання Мети вну кури м Ер тет КЕ фен Вік ик о и ВКА ни т, й петля орні ПА КИЖТЮВИЙ КОВІ БІТИ ото: лов де ис те урні а и А ДЕННЕ со В МЕ НИ от НЕ БІО сіл еВ ІІТ КОТРИХ ОО ПРИ ЦІ НН ВН ріллі НИШНУ нн Зоо У пот жиуи и Не Н ї НН Пух, РОБІТ: 41 12211 НУ що РІ 1 ОБЕІИ ЗТ 13 НКУ шо 11171 на ЧЕННЯ ач НЕ НУ КЕ ІІ Не : ж ІТ ОТОЖ: НКУ що ФРІ : В ОННИ ЕТ А; У в І 1 гли : НЯ ГОЛОВІ ПІВ як-і.--- ДЕД шк ОБ ТИ Бо ут КОХ КЕ я 11:11 : ау ОО ТО яні АК МН дня иа ве А вк ць С КВ НН Ве Нана НД В У р у ВНЗ ШТ ЛІД. ІТК Ки Уран зд нн нн и ек нн нн нний РОБ НАННЯ І НЕ НИ ої 1 ЕЖІ ее НИНІ ТЛ УТ ТК Ж МИМО ВІРІ Колот : їі ГО тлу тт тт у Пи в ВЕНА ТОБ яІТІ : 1 ВІ ПРИН» здо ВИК. ІМ: : гот І: ННЯ Н ТЕ В п а вп В М В ЗН ще У Мих КИШКИ ПММ

Фіг. 7 т КЕЖщея Ж с дк ж

2. ЖК зрджютетттнкюск А ККУ кують А М ТОСЖЕ йрнитх ях риса Ж ЗК ке МО Н пе х Мох Е щи земне ЕЕТМИКОВНІЇ комор» МОМ охо ще С ТХЖКЩК ек сюккккк ЗВ ра : ща пллнчня ЩЕ Кк пе ж 7 ж еру ой ЩО ОБЖ ще БУ : Й аеро ухтя я р мерерт ут ження, З те щИ Міст сук кт; хіх ДАНИХ МОСКВІ НУТ

Фіг. 8 Ще хо я вч -к х ж кл в С ОУЗНСЗ ще ССЗ й о у п Кх 2 КО ще У С » НН Ко ж ко Ше А ох ом кН не ША Я ОК ОК КО зд СН ПН КК и м ПЕЖО ЕК ХО СВ ПИКА КК ФА КК МОМ КК й ДЕ ЗО МК КК ЛОЖОК ОК ШЕ ЖріУ трі уче х умо що М 0 СУКИ; ПЕВНЕ КЗ не ШЕ й ПО У С 0 ВЕТО М Жак ПН й ПОЕМ пр, о о Я Пов У ВО пт КЕ ФАКСИ КЕ ПИШНЕ ЕК Я ПОКИ ОКХ ПЕК ОО у В я я Її У

Фіг. З