CN111447951A

CN111447951A - 与tau特异性结合的结合分子

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Publication number: CN111447951A
Application number: CN201880078178.4A
Authority: CN
Inventors: C·A·阿佩特里; J·尤拉斯泽科; H·C·维文; R·詹森; B·B·西雷加尔
Original assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2020-07-24
Also published as: EP3720490A1; EA202091350A1; KR20200094177A; SG11202004904XA; US20200369754A1; CA3084098A1; AU2018380765A1; WO2019110571A1; JP2021505142A

Abstract

本发明涉及与微管相关蛋白tau特异性结合的结合分子和抗原结合片段。本发明还涉及使用所述结合分子或抗原结合片段的诊断、预防和治疗方法。

Description

与tau特异性结合的结合分子

技术领域

本发明涉及医学。本发明具体地涉及与tau特异性结合并且能够抑制tau种子扩散的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及使用抗tau结合分子的诊断、预防和治疗方法。

背景技术

痴呆是一种可以由许多进行性障碍引起的综合征，所述进行性障碍影响记忆、思维、行为和执行日常活动的能力。当今，世界上约有3600万人患有痴呆。到2030年患有痴呆的人数预计将增加一倍，而到2050年将增加到多于三倍，达到1.154亿人。阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆类型。目前，65岁及以上的人中有1/9的人(11％)并且85岁以上的人中有将近一半人患有阿尔茨海默病。根据阿尔茨海默病国际协会，目前护理这些患者的全球成本每年超过6000亿美元。这些成本甚至可能比疾病的流行率上升更快，特别是在发展中国家，随着更正规的社会保障制度的出现，而且收入增加导致更高的机会成本。

AD患者的脑具有丰富的两种异常结构，即淀粉样蛋白斑和细胞内神经原纤维缠结(NFT)。这在脑的某些区域中尤其如此，所述区域对于记忆是重要的。在大脑皮层和某些皮层下区域中还存在神经元和突触的显著损失。神经原纤维缠结和神经元损失都与疾病的持续时间和严重程度并行增加，并且已经显示神经原纤维负荷与认知衰退相关。

神经原纤维缠结是由微管相关蛋白tau的过度磷酸化且不溶性积累物组成的神经元内损伤。这些积累物不仅是AD的组织病理学特征，而且是许多其他神经变性疾病的组织病理学特征，AD和这些神经变性疾病统称为tau蛋白病变。tau蛋白病变包括，例如，阿尔茨海默病(AD)、皮克氏病(PiD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、以及额颞叶变性(FTLD)。在人tau蛋白病变中，病理以疾病特异性模式从一个脑区进展到另一个脑区，其潜在机制尚不清楚。

因此，tau病变参与许多tau蛋白病变并且可以是许多tau蛋白病变的起因。按其正常形式，tau是主要在神经元轴突中表达且结合微管并促进微管组装和稳定性的高度可溶性微管相关蛋白。tau蛋白含有许多潜在的磷酸化位点，并且已经显示这些位点中一些的经调节的磷酸化和去磷酸化会影响tau蛋白与微管蛋白的相互作用和细胞骨架功能。tau的过度磷酸化被认为导致微管解离，并使正常无序的高度可溶性蛋白组装成富含β片层的原纤维或tau聚集体(也称为成对螺旋纤丝(PHF))，其构成NFT并且可以在营养不良性神经突和细胞体内可视化。尽管tau纤维化的初始步骤非常不利，但一旦形成核，它们就会迅速吸收tau单体并转化为热力学稳定的聚集体。随后，这些聚集体可能经受断裂从而产生更多的原纤维末端，所述原纤维末端能够吸收tau单体并将其转化为新的原纤维。在最一般的情形中，此过程称为“接种”。在人和转基因小鼠模型中，tau病变的量与进行性神经元功能障碍、突触丧失和功能衰退相关。已经使用几种不同的小鼠模型分析了小鼠中针对tau的被动免疫和主动免疫，包括用于主动免疫的不同磷酸化tau肽和用于被动免疫疗法的抗tau抗体。用良好表征的抗tau抗体进行的被动免疫证实了在主动免疫研究中看到的结果，所述抗tau抗体与tau上的早期病理构象表位处的过度磷酸化tau蛋白的磷酸化Ser396和Ser404反应。用这些抗体处理的小鼠在tau病变上显示出显著减少(这是通过生化方法和组织学测量的)以及运动功能下降的显著延迟(这是在行为测试中评估的)(Boutajangout A等人,JNeurochem.[神经化学杂志]2011；118(4):658–667；Chai X等人J Biol Chem.[生物化学杂志]2011；286(39):34457–34467)。

目前，用于AD的最普遍的医学方法是提供对症疗法，即使在治疗数年后其也是无效的。用于AD的新治疗方法和策略需要超越症状的治疗，以防止认知衰退并抵抗疾病的基本病理过程。特别地，需要开发单独地或与其他AD靶向药物组合地干扰疾病的至少一些早期阶段的分子。此类分子将在AD和其他tau蛋白病变的早期诊断(其本身可改善治疗结果)、预防和治疗中提供新的有利的选择。

发明内容

本发明提供了新颖的结合分子(特别是人结合分子，例如人抗体或其抗原结合片段)，所述结合分子能够与tau单体和成对螺旋纤丝(PHF)特异性结合并且能够抑制tau聚集的扩散和/或介导tau聚集体被小胶质细胞摄取和降解。

在一个优选的实施例中，根据本发明的结合分子选自由以下组成的组：

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3；以及

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3。

在某些实施例中，所述结合分子能够在体外结合tau单体。

在某些实施例中，所述结合分子能够在体外抑制tau聚集的扩散。

在某些实施例中，所述结合分子能够在体外结合tau成对螺旋纤丝(PHF)并介导它们被小胶质细胞摄取。

在某些实施例中，所述结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:13、16和17组成的组的氨基酸序列，并且所述轻链可变区选自由SEQID NO:15和18组成的组。

在某些实施例中，根据本发明的结合分子选自由以下组成的组：

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区；以及

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区。

优选地，根据本发明的结合分子是人单克隆抗体或其抗原结合片段。

在某些实施例中，所述结合分子是人单克隆IgG抗体，优选IgG1抗体。

本发明还涉及免疫缀合物，所述免疫缀合物包含根据本发明的至少一种结合分子，并且还包含至少一种标签。

本发明的另一个方面涉及编码根据本发明的结合分子的核酸分子。

本发明的结合分子、免疫缀合物和/或核酸分子适合用作药物，优选地用于在诊断、预防和/或治疗tau蛋白病变(包括但不限于阿尔茨海默病(AD))中使用。

本发明还涉及根据本发明的结合分子的功能变体。

本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的结合分子和/或免疫缀合物以及药学上可接受的载剂或赋形剂。

附图说明

图1：通过生物膜层干涉技术(Octet)进行的亲和力评估。

图2：通过等温滴定量热法进行亲和力测量。

图3：CBTAU-28.1增强BV2细胞中tau聚集体的摄取，而CBTAU-27.1不增强所述摄取。

图4：CBTAU-28.1抗体耗竭AD脑匀浆中种子的能力。

定义

如本文所用，术语“结合分子”包括本领域中已知的所有免疫球蛋白类别和子类。结合分子可以根据其重链恒定结构域的氨基酸序列而分成五个主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

如在整个本发明中使用的，术语“抗原结合片段”意指完整结合分子(如抗体)的一部分。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、CDR、抗原结合位点、重链或轻链可变区、双抗体、三抗体、单链抗体分子(scFv)和由至少两种完整抗体或其片段形成的多特异性抗体或含有至少一个足以赋予抗原与(多)肽结合的免疫球蛋白片段的(多)肽等。抗原结合片段可以包含含有抗体氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个连续氨基酸残基的肽或多肽。抗原结合片段可以合成地或通过使完整免疫球蛋白酶促或化学切割而产生，或者它们可以通过重组DNA技术而基因工程化。生产方法在本领域是熟知的，并且描述在例如Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],编辑:E.Harlow和D,Lane(1988),Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约中，将其通过引用并入本文。抗体或其抗原结合片段可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，那么所述结合位点可以彼此相同或者它们可以是不同的。

免疫球蛋白轻链或重链可变区由被“抗原结合位点”间隔的“框架”区组成。使用如下的各种术语定义抗原结合位点：(i)互补决定区(CDR)是基于序列变异性的(Wu和Kabat JExp Med[实验医学杂志]132:211-50,1970)。通常，抗原结合位点在每个可变区具有三个CDR(在重链可变区(VH)中的HCDRl、HCDR2和HCDR3以及在轻链可变区(VL)中的LCDRl、LCDR2和LCDR3)(Kabat等人,Sequences of Proteins of lmmunological Interest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列],第5版Public Health Service[公共健康服务局],NationalInstitutes of Health[国立卫生研究院],马里兰州贝塞斯达,1991)。(ii)术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的如下区域，所述区域在结构上是高变的，如Chothia和Lesk(Chothia和Lesk J Mol Biol[分子生物学杂志]96:901-17,1987)所定义的。通常，抗原结合位点在每个VH(Hl、H2、H3)和VL(Ll、L2、L3)中具有三个高变区。Chothia和Lesk将结构保守的HV称为“典型结构”。编号系统以及CDR和HV的注释最近已由Abhinandan和Martin(Abhinandan和Martin Mol Immunol[分子免疫学]45:3832-9,2008)进行了修订。(iii)基于来自免疫球蛋白和T细胞受体的V结构域的比较，Lefranc(Lefranc等人Dev CampImmunol[发育和比较免疫学]27:55-77,2003)已经提出了形成抗原结合位点的区域的另一种定义。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www imgt_org)提供了这些区域的标准化编号和定义。Lefranc等人描述了CDR、HV和IMGT描述之间的对应关系。还可以基于特异性决定残基使用(SDRU)(Almagro J Mol Recognit[分子识别杂志]17:132-43,2004)来描述抗原结合位点，其中特异性决定残基(SDR)是指免疫球蛋白的直接参与抗原接触的氨基酸残基。

Kabat等人还定义了可变结构域序列的可适用于任何抗体的编号系统。本领域的普通技术人员可以将此“Kabat编号”系统明确地分配给任何可变结构域序列，无需依赖超出序列本身的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人,U.S.Dept.ofHealth and Human Services[美国卫生和公众服务部],“Sequence of Proteins ofImmunological Interest[免疫学上感兴趣的蛋白质序列]”(1983)所阐明的编号系统。除非另外说明，否则提及本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统的，然而Kabat编号系统是理论上的并且可以不等同地适用本发明的每种抗体。例如，取决于第一CDR的位置，以下CDR可以在任一方向上移位。

“框架”或“框架序列”是抗体的可变区内的除被定义为抗原结合位点序列的那些以外的剩余序列。因为抗原结合位点的精确定义可以通过如上所述的各种描述来确定，所以确切的框架序列取决于抗原结合位点的定义。

如本文所用，术语“单克隆抗体”(mAb)意指从基本上同质的抗体群体获得的抗体(或抗体片段)。单克隆抗体是高度特异性的，典型地针对单个抗原决定簇。

如本文所用，关于抗体与其结合配偶体(例如抗原)的相互作用，术语“特异性结合”或“特异性识别”意指相互作用取决于结合配偶体上具体氨基酸序列或结构(例如抗原决定簇或表位)的存在。换句话说，即使当结合配偶体存在于其他分子或生物体的混合物中时，抗体也优先地结合或识别所述结合配偶体。结合可以由共价或非共价相互作用或两者的组合介导。又换句话说，术语“特异性结合”或“特异性识别”意指抗体与抗原决定簇或表位具有特异性免疫反应性并且与其他抗原决定簇或表位不具有免疫反应性。与抗原(免疫)特异性结合的抗体能以较低亲和力与其他肽或多肽结合，如通过例如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、BIACORE或本领域已知的其他测定确定的。与抗原特异性结合的抗体或其片段可以与携带相同表位的相关抗原具有交叉反应性。优选地，与抗原特异性结合的抗体或其片段不与其他抗原交叉反应。

如本文所用，术语“表位”意指抗原的由抗体的CDR环接触的一部分。“结构表位”在抗原表面上包含约15-22个接触残基，并且涉及许多氨基酸残基，所述氨基酸残基与CDR上的统称为抗体的互补位的一大类残基接触。表位和互补位残基之间的直接接触是通过静电力(例如，氢键、盐桥、疏水表面的范德华力和形状互补性)建立的。界面还结合了有助于抗原-抗体相互作用的特异性和亲和力的水分子或其他辅因子。抗原-抗体复合物的结合能主要由表位-互补位界面中的一小子集的接触残基来介导。这些“能量残基”通常位于表位-互补位界面的中心并且构成功能性表位。界面外围的接触残基通常对结合能有很小的贡献；它们的替代物对抗原结合的影响通常很小。因此，表位的结合或功能活性涉及位于结构表位中央并由特异性决定CDR接触的一小部分能量残基。可以使用若干种方法(包括丙氨酸扫描诱变或通过用抗体解析抗原的晶体结构)来进行抗原蛋白上功能表位的分配。表位在性质上可以是线性的或者可以是非连续表位，例如构象表位，所述构象表位由抗原的非连续氨基酸而不是一系列线性氨基酸之间的空间关系形成。构象表位包括由抗原折叠产生的表位，其中来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸在3维空间中紧密接近。对于非连续表位，有可能获得比所谓的部分表位(例如分散在蛋白质序列的不同区域)具有降低的亲和力的一种或多种线性肽的结合(Cragg,M.S.(2011)Blood[血液]118(2):219–20)。

如本文所用，术语“亲和力”是指单独表位或部分表位与结合分子(例如，免疫球蛋白分子)的CDR的结合强度的度量；参见例如，Harlow等人,Antibodies:A LaboratoryManual[抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],第2版(1988)第27-28页。如本文所用，术语“亲合力”是指免疫球蛋白群体与抗原之间复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度；参见例如，Harlow第29-34页。亲合力与群体中的单独免疫球蛋白分子与特定表位的亲和力相关，并且还与免疫球蛋白和抗原的效价相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构(如聚合物)的抗原之间的相互作用将是高亲合力的相互作用。抗体对抗原的亲和力或亲合力可以使用任何合适的方法通过实验确定；参见例如，Berzofsky等人,“Antibody-AntigenInteractions[抗原-抗体相互作用]”在Fundamental Immunology[基础免疫学],Paul,W.E.编辑,Raven Press[雷文出版社]纽约州纽约(1984)；Kuby,Janis Immunology[免疫学],W.H.Freeman and Company[W.H.弗里曼公司]纽约州纽约(1992)以及本文描述的方法。用于测量抗体对抗原的亲和力的通用技术包括ELISA、RIA和表面等离子体共振。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH)下测量，测量的特定抗体-抗原相互作用的亲和力可能变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD、IC50)的测量优选地用抗体和抗原的标准化溶液和标准化缓冲液进行。

术语“多核苷酸”旨在涵盖单数核酸以及复数核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，如在肽核酸(PNA)中所发现的)。术语“核酸分子”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经从其天然环境中去除的核酸分子，即DNA或RNA。例如，出于本发明的目的，编码包含于载体中的抗体的重组多核苷酸被视为是分离的。

在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包括可操作地与一个或多个编码区相关联的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。可操作相关联是针对基因产物(例如，多肽)的编码区按如下这种方式与一个或多个调控序列相关联，所述方式使得基因产物的表达处于一个或多个调控序列的影响或控制之下。因此，启动子区将可操作地与编码多肽的核酸相关联，只要启动子能够实现所述核酸的转录。启动子可以是只在预定细胞中引导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，其他转录控制元件(例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号)也可以可操作地与多核苷酸相关联以便引导细胞特异性转录。本文披露了合适的启动子和其他转录控制区。

如本文所用，术语“治疗(treat或treatment)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施，其中目的是预防或减慢(减轻)不希望的生理变化或障碍，如帕金森综合征或阿尔茨海默病的发展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病的程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意指存活期相较于未接受治疗时的预期存活期延长。需要治疗的那些包括已患有病症或障碍的那些以及易于患上病症或障碍的那些或要预防病症或障碍的表现的那些。如本文所用，“药物”是用于治疗不期望的生理变化或障碍的药剂。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指希望诊断、预后、预防或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者(例如，人类患者)。

具体实施方式

在第一方面，本发明提供了结合分子(例如抗体和/或其抗原结合片段)，所述结合分子能够与tau特异性结合并且能够抑制tau聚集的扩散和/或介导tau聚集体被小胶质细胞摄取和降解，其中所述结合分子选自由以下组成的组：

在某些实施例中，所述结合分子能够在体外结合tau单体。

根据本发明，提供了新颖的结合分子，所述结合分子以非常高的亲和力特异性结合tau并且能够抑制PHF样聚集体的繁殖。在某些实施例中，所述结合分子能够结合tau PHF并且经Fc介导的机制促进它们被小胶质细胞摄取。

在某些实施例中，所述结合分子以250nM或更少(优选100nM或更少)的亲和力特异性结合tau。

tau是一种丰富的中枢和外周神经系统蛋白，具有多种熟知的同种型。在人中枢神经系统(CNS)中，由于可变剪接，存在大小为352至441的六种主要tau同种型(Hanger等人Trends Mol Med[分子医学趋势]15:112-9,2009)。这些同种型彼此的不同之处在于经调节包含0、1或2个N末端酸性插入片段(0N、1N或2N)和3或4个串联排列的微管结合重复序列(3R或4R)，并且被称为ON3R、1N3R、2N3R、ON4R、1N4R和2N4R。如本文所用，重组tau是指SEQ IDNO:9的tau同种型。tau蛋白能以高的量例如在大肠杆菌、杆状病毒、哺乳动物或无细胞系统中重组表达。可以使用标准方法(例如Barghorn等人2005,Meth Mol Biol[分子生物学方法]35-51)或如实例1中所述的重组表达和纯化重组tau。

在一个实施例中，本发明的结合分子(例如抗体或其抗原结合片)特异性结合SEQID NO:20或SEQ ID NO:21的非磷酸化的tau肽。

在某些实施例中，本发明的结合分子或其抗原结合片段特异性结合tau的N-末端插入区域。

在某些实施例中，所述结合分子或其抗原结合片段特异性结合包含tau蛋白的氨基酸残基42-103的表位。

在某些实施例中，所述结合分子或其抗原结合片段特异性结合包含tau蛋白的氨基酸残基52-71的表位。

在某些实施例中，所述tau蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。

tau结合微管并调节货物通过细胞的运输，这是可以通过在79个潜在丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点中的许多处发生的tau磷酸化来调节的过程。在脑发育期间，tau是高度磷酸化的。在成人期，磷酸化的程度下降。一些磷酸化位点位于tau的微管结合结构域内，并且已经显示，tau磷酸化的增加负向调节微管的结合。例如，位于微管结合基序内或邻近处的Ser262和Ser396在异常成对螺旋纤丝(PHF)的tau蛋白中是过度磷酸化的，所述异常成对螺旋纤丝是AD患者脑中的神经原纤维缠结(NFT)的主要组分。

如本文所用，术语“成对螺旋纤丝-tau”或“PHF-tau”是指熟知的tau聚集体，所述tau聚集体构成了称为神经原纤维缠结(NFT)的病理性结构，其初次通过痴呆患者的脑中的阿尔茨海默症进行了描述。还在许多称为tau蛋白病变的其他疾病中发现了它们的存在。因此，可以观察到tau的聚集体是例如阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆、核上性麻痹、皮克氏病、嗜银颗粒病(AGD)、皮质基底节变性、FTDP-17、帕金森病、拳击员痴呆中的神经原纤维缠结(NFT)的主要成分(综述于Gendron和Petrucelli,Mol.Neurodegener.[分子神经变性]4:13(2009))。

术语“神经原纤维缠结”(NFT)是指如下病理性结构，其初次通过痴呆患者的脑中的阿尔茨海默症进行了描述。NFT由过度磷酸化的tau蛋白的有序排列的成对螺旋纤丝组成，最常被称为阿尔茨海默氏病的主要标志物。

生理tau蛋白使神经元中的微管稳定化。病理性磷酸化导致异常的tau定位和聚集，这导致微管的去稳定和受损的细胞运输。聚集的tau在体外是神经毒性的(Khlistunova等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]281(2006),1205-1214)。然而，确切的神经毒性种类仍然不清楚，它们导致神经元死亡的一种或多种机制也仍然不清楚。

根据本发明，提供了新颖的结合分子，所述结合分子能够与tau特异性结合并且能够抑制tau聚集体的扩散和/或介导它们被小胶质细胞摄取和降解。因此，本发明的结合分子可以用作预防tau病变形成的可能的治疗剂，作为评估患上AD的风险的生物标志物和/或作为用于捕获评估患上AD的风险的生物标志物的试剂。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子(如单克隆抗体)，或者结合分子可以是其抗原结合片段，包括但不限于重链和轻链可变区、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双抗体、三抗体、四抗体和含有至少一个足以赋予与tau的特异性抗原结合的免疫球蛋白片段的(多)肽。

在一个优选的实施例中，本发明的结合分子是人单克隆抗体和/或其抗原结合片段。结合分子还可以是纳米抗体、α体、亲和体、FN3结构域支架和基于(人)重复蛋白(如Adnectin、Anticalin、Darpin、Centyrin等)中的结构域的其他支架或包含表位结合序列的其他支架。

本发明还涉及包含根据本发明的至少一种结合分子以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在又另一方面，本发明提供了免疫缀合物，即包含至少一种如本文所定义的结合分子并且还包含至少一种标签的分子。一种或多种标签可以通过共价键合与人结合分子直接连接/缀合。可替代地，一种或多种标签可以通过一种或多种连接化合物与结合分子连接/缀合。将标签与结合分子缀合的技术是熟练的技术人员所熟知的。本发明的免疫缀合物的标签可以是治疗剂，但是它们也可以是可检测的部分/药剂。适合于治疗和/或预防的标签可以是毒素或其功能部分、抗生素、酶、增强吞噬作用或免疫刺激的其他结合分子。包含可检测的药剂的免疫缀合物可以在诊断上用于例如评估受试者是否处于患上AD的过程中。可检测的部分/药剂包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。用于标记结合分子以用于检测和/或分析和/或诊断目的的标签取决于特定的检测/分析/诊断技术和/或使用的方法，例如尤其是(组织)样品的免疫组织化学染色、流式细胞术检测、扫描激光细胞计数检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如，吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。用于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法的合适标记在熟练的技术人员的能力范围内。

本发明的另一个方面是提供编码根据本发明的至少一种结合分子、功能变体或免疫缀合物的核酸分子。此类核酸分子可以用作克隆目的的中间体，例如在如上所述的亲和力成熟过程中。在一个优选的实施例中，分离或纯化核酸分子。熟练的技术人员应理解，这些核酸分子的功能变体也旨在是本发明的一部分。功能变体是可以使用标准遗传密码来直接翻译以提供与翻译自亲本核酸分子的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。

本发明的另一个方面是提供包含根据本发明的一种或多种核酸分子的多核苷酸(例如载体)。载体可以源自诸如尤其是F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等质粒；粘粒；诸如λ、似λ、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T-even、T-odd、T2、T4、T7等噬菌体；植物病毒。载体可以用于克隆和/或表达本发明的结合分子，甚至可以用于基因治疗目的。包含可操作地连接到一种或多种表达调节核酸分子的根据本发明的一种或多种核酸分子的载体也包括在本发明中。载体的选择取决于所遵循的重组方法和所用的宿主。通过尤其是磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂质体转染或电穿孔可以将载体引入宿主细胞中。载体可以是自主复制的，或者可以与它们已经整合到其中的染色体一起复制。优选地，载体含有一种或多种选择性标志物。标志物的选择可以取决于所选择的宿主细胞，尽管这对本发明不是重要的，如本领域技术人员所熟知的。它们包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、吉欧霉素(zeocin)、来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、来自小鼠的二氢叶酸还原酶基因(dhfr)。包含可操作地连接到编码可以用于分离人结合分子的蛋白质或肽的一种或多种核酸分子的编码如上所述的人结合分子的一种或多种核酸分子的载体也包括在本发明中。这些蛋白质或肽包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、金属结合聚组氨酸、绿色荧光蛋白、萤光素酶和β-半乳糖苷酶。

含有上述载体的一个或多个拷贝的宿主是本发明的一个另外的方面。优选地，宿主是宿主细胞。宿主细胞包括但不限于哺乳动物、植物、昆虫、真菌或细菌来源的细胞。细菌细胞包括但不限于来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌(如埃希氏菌属(如大肠杆菌)和假单胞菌属的几种物种)的细胞。在真菌细胞组中，优选地使用酵母细胞。在酵母中的表达可以通过使用酵母菌株(例如尤其是毕赤酵母、酿酒酵母和多形汉逊酵母)来实现。此外，诸如来自果蝇属和Sf9的细胞等昆虫细胞可以用作宿主细胞。除此以外，宿主细胞可以是植物细胞，例如尤其是来自作物植物(如林业植物)的细胞、或来自提供食物和原料的植物(如谷类植物或药用植物)的细胞、或来自观赏植物的细胞、或来自花鳞茎作物的细胞。转化的(转基因)植物或植物细胞是通过已知方法产生的，例如农杆菌介导的基因转移、叶盘转化、通过聚乙二醇诱导的DNA转移的原生质体转化、电穿孔、超声处理、显微注射或基因枪基因转移。另外，合适的表达系统可以是杆状病毒系统。使用哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、NSO细胞或Bowes黑素瘤细胞)的表达系统在本发明中是优选的。哺乳动物细胞提供具有与哺乳动物来源的天然分子最相似的翻译后修饰的表达的蛋白质。由于本发明涉及可能必须向人施用的分子，特别优选的是完全的人类表达系统。因此，甚至更优选地，宿主细胞是人类细胞。人类细胞的实例尤其是HeLa、911、AT1080、A549、293和HEK293T细胞。在优选的实施例中，人类生产细胞包含以可表达形式编码腺病毒E1区的核酸序列的至少一个功能部分。在甚至更优选的实施例中，所述宿主细胞源自人视网膜并且用包含腺病毒E1序列的核酸永生化，如于1996年2月29日保存在英国威尔特郡SP4 OJG索尔兹伯里CAMR欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)的911细胞或细胞系，编号为96022940并以商标PER.

销售(PER.C6是库赛尔荷兰公司(Crucell Holland B.V.)的注册商标)。出于本申请的目的，“PER.C6细胞”是指以编号96022940保存的细胞或祖先、上游或下游的传代以及来自保存细胞的祖先的后代、以及任何前述的衍生物。重组蛋白在宿主细胞中的产生可以根据本领域熟知的方法进行。在WO00/63403中已经描述了以商标PER.

销售的细胞作为感兴趣蛋白质的生产平台的用途，将其披露通过引用以其全文并入本文。

产生根据本发明的结合分子的方法是本发明的一个另外的方面。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：a)在有助于表达结合分子的条件下培养根据本发明的宿主，和b)任选地，回收表达的结合分子。表达的结合分子可以从无细胞提取物中回收，但是优选地从培养基中回收它们。上述生产方法也可以用于制备本发明的结合分子和/或免疫缀合物的功能变体。从无细胞提取物或培养基中回收蛋白质(如结合分子)的方法是本领域技术人员所熟知的。通过上述方法可获得的结合分子、功能变体和/或免疫缀合物也是本发明的一部分。

可替代地，居于在宿主(如宿主细胞)中表达之后，本发明的结合分子和免疫缀合物可以通过常规肽合成器合成产生，或者使用源自根据本发明的DNA分子的RNA核酸在无细胞翻译系统中产生。如通过上述合成生产方法或无细胞翻译系统可获得的结合分子和免疫缀合物也是本发明的一部分。

在又另一方面，本发明提供了包含根据本发明的至少一种结合分子(优选地人单克隆抗体)、其至少一种功能变体、根据本发明的至少一种免疫缀合物和/或其组合的组合物。除此之外，组合物尤其可以包含稳定分子，如白蛋白或聚乙二醇或盐。优选地，所用的盐是保留结合分子的所需生物活性并且不产生任何不期望的毒理学作用的盐。如果需要，可以将本发明的人结合分子包被在材料中或材料上以保护它们免受酸或其他可能使结合分子失活的天然或非天然条件的作用。

在又另一方面，本发明提供了包含如本发明所定义的至少一种核酸分子的组合物。组合物可以包含水溶液，如含有盐(例如，NaCl或如上所述的盐)、洗涤剂(例如，SDS)和/或其他合适组分的水溶液。

此外，本发明涉及包含本发明的至少一种结合分子(如人单克隆抗体)(或其功能片段或变体)、根据本发明的至少一种免疫缀合物、根据本发明的至少一种组合物或其组合的药物组合物。本发明的药物组合物还包含至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂。药学上可接受的赋形剂和载剂是熟练的技术人员所熟知的。

在某些实施例中，药物组合物包含至少一种其他预防剂和/或治疗剂。此类药剂可以是结合分子、小分子、有机或无机化合物、酶、多核苷酸序列等。这些可以与本发明的结合分子组合使用。本文“组合”意指以分开的配制品形式同时或以一种单一组合配制品形式，或以分开的配制品形式以任何顺序根据一种依序施用方案。

在某些实施例中，结合分子用于在抑制和/或防止tau蛋白聚集中使用。

在某些实施例中，结合分子用作药物，并且优选地用于在神经变性疾病(如AD)的诊断、治疗和/或预防性治疗中使用。因此，本发明的结合分子或其片段可以用于治疗、减轻或预防患有涉及脑内tau的积累或病理性tau或tau聚集的神经变性疾病的患者(如患有AD以及任何其他tau蛋白病变或tau可能过表达的其他tau相关病理的患者)的症状。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但是本发明的结合分子可以通过减少或消除病理性tau或tau聚集并且因此减少或消除脑中PHF-tau的量来发挥它们的有益作用。本发明的结合分子可以用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的实例包括哺乳动物，如人、啮齿类动物、狗、猫和家畜。

本发明的另一个实施例是用于抑制和/或预防tau蛋白聚集的扩散的方法。

本发明的另一个实施例是治疗或减轻患者的涉及tau聚集的神经变性疾病的症状的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的结合分子持续足以治疗或减轻神经变性疾病的症状的时间。在任何以上实施例中，涉及tau聚集的神经变性疾病是tau蛋白病变。如本文所用，“tau蛋白病变”包括涉及tau在脑内的病理性聚集的任何神经变性疾病。除了家族性和散发性AD之外，其他示例性tau蛋白病变是与17号染色体连锁的额颞痴呆伴帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、皮克氏病、进行性皮层下神经胶质增生、仅缠结痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、嗜银颗粒痴呆、肌萎缩性侧索硬化、帕金森综合征-痴呆复合征、唐氏综合征、吉斯特曼-斯召斯列疾病(Gerstmann-StrausslerScheinker disease)、哈-斯二氏病(Hallervorden-Spatz disease)、包涵体肌炎、克-雅二氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、多系统萎缩、C型尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease type C)、朊病毒蛋白大脑淀粉样血管病、亚急性硬化性全脑炎、强直性肌营养不良、具有神经原纤维缠结的非guanamian运动神经元疾病、脑炎后帕金森综合征以及慢性创伤性脑病(如拳击手痴呆(拳击病))。(Morris等人Neuron[神经元]70:410-26,2011)。

tau蛋白病变相关的行为表型包括认知损害、早期人格改变和去抑制、情感淡漠、意志缺失、缄默、失用症、持续言语、刻板动作/行为、口部过度活动(hyperorality)、无组织化、无法计划或组织连续任务、自私/冷漠、反社会性状、缺乏同情、迟疑不决、具有频繁错语错误但相对保守的理解的语法错乱言语、受损的理解和字词寻找缺陷、慢性进行性步态不稳、反步症(retropulsion)、冷淡、频繁跌倒、非左旋多巴响应轴向刚度、核上注视麻痹、方形急跳、缓慢垂直扫视、假延髓性麻痹、肢体失用、肌张力障碍、皮层感觉丧失以及震颤。

适于治疗的患者包括有AD或其他tau蛋白病变风险的无症状个体以及目前显示症状的患者。适于治疗的患者包括具有已知的AD遗传风险(如AD的家族史或基因组中存在遗传风险因子)的个体。示例性风险因子是淀粉样前体蛋白(APP)中、特别是在位置717以及位置670和671处的突变(分别为哈迪(Hardy)突变和瑞典(Swedish)突变)。其他风险因子是早老素基因(PS1和PS2)以及ApoE4中的突变、高胆固醇血症或动脉粥样硬化家族史。通过上述风险因子的存在，可以从特征性痴呆中识别目前患有AD的个体。此外，多种诊断测试可用于识别患有AD的个体。这些包括测量脑脊液tau和Aβ42水平。升高的tau和降低的AΒ42水平表示存在AD。还可以通过AD和相关疾病协会标准来诊断患有AD的个体。

本发明的抗tau结合分子适合作为用于治疗或预防神经变性疾病的治疗剂和预防剂，所述神经变性疾病涉及tau的积累和/或tau的病理性聚集，如AD或其他tau蛋白病变或tau相关疾病。在无症状患者中，治疗可以在任何年龄开始(例如，在约10、15、20、25、30岁)。然而，通常，直到患者达到约40、50、60或70岁之前无需开始治疗。在一段时间内治疗通常需要多个剂量。可以通过随时间测定抗体或活化的T细胞或B细胞对治疗剂的反应来监测治疗。如果反应下降，指示加强剂量。

在预防性应用中，向易患或原本有AD或涉及tau的其他疾病的风险的患者以足以消除或降低所述风险、减轻所述疾病(包括疾病、在所述疾病的发展期间存在的其并发症和中间病理性表型的生物化学的、组织学的和/或行为的症状)的严重程度或延迟其发作的量施用药物组合物或药物。在治疗性应用中，向怀疑患有或已经患有这种疾病的患者以足以减少、抑制或延缓任何所述疾病的症状(生物化学的、组织学的和/或行为的)的量施用组合物或药物。施用治疗剂可以减少或消除尚未患上特征性阿尔茨海默病变的患者的轻度认知损害。将适于完成治疗性或预防性治疗的量定义为治疗有效剂量或预防有效剂量。在预防和治疗两种方案中，组合物或药物通常以几个剂量施用直到达到足够的免疫应答。

本发明的抗tau结合分子或其片段可以与有效治疗相关神经变性疾病的其他药剂组合施用。在AD的情况下，本发明的抗体可以与减少或防止淀粉样蛋白β(Aβ)沉积的药剂组合施用。PHF-tau和Aβ病变可能是协同的。因此，同时靶向PHF-tau和Aβ相关病变的清除的组合疗法可能比单独靶向每种清除更有效。

在帕金森病和相关的神经变性疾病的情况下，对a-突触核蛋白的清晰聚集形式的免疫调节也是一种新兴的疗法。同时靶向tau和α-突触核蛋白的清除的组合疗法可能比单独靶向任一种蛋白更有效。在本发明的方法中，结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)在治疗或改善tau蛋白病变的症状中的“治疗有效量”可以通过标准研究技术确定。例如，可以通过将药剂施用至本领域熟知的相关动物模型来确定抗体的剂量。

此外，体外测定可以任选地用于帮助确定最佳剂量范围。基于对若干因素的考虑，本领域技术人员可以确定(例如，通过临床试验)具体有效剂量的选择。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及熟练的技术人员已知的其他因素。配制品中待采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病的严重程度，并且应当根据执业医师的判断和每名患者的情况来决定。可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推出有效剂量。用于治疗性使用本发明的结合分子的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适途径。这些结合分子的药物组合物可用于肠胃外施用，例如皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或颅内，或者它们可以施用到脑或脊柱的脑脊液中。

能以单剂量方案或作为多剂量方案给予治疗，其中治疗的主要过程可以有1-10个单独剂量，随后以维持和/或强化反应所需的后续时间间隔给予其他剂量，例如在1-4个月时给予第二剂量，并且若需要的话，在数月后给予一个或多个后续剂量。合适的治疗方案的实例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或足以引起预期减轻疾病症状或减轻疾病严重程度的所希望的反应的其他方案。因此，用于肌内注射的本发明的药物组合物可以被制备成含有1ml无菌缓冲水以及约1ng至约100mg、约50ng至约30mg或约5mg至约25mg之间的本发明的抗体。类似地，用于静脉内输注的本发明的药物组合物可以被制备成含有250ml无菌林格氏溶液以及约1mg至约30mg或约5mg至约25mg的本发明的抗体。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法是熟知的，并且更详细地描述于例如“Remington's Pharmaceutical Science[雷明顿药物科学]”,第15版,MackPublishing Company[麦克出版公司],宾夕法尼亚州伊斯顿中。

本发明的结合分子可以被冻干以用于储存，并且在使用前在合适的载剂中重构。已经显示此技术对于抗体和其他蛋白质制剂是有效的，并且可以使用本领域已知的冻干和重构技术。

在某些实施例中，结合分子可以用于诊断受试者的AD或其他tau蛋白病变的方法中。此方法涉及在受试者中使用诊断试剂(如本发明的抗体或其片段)检测tau的存在。通过使生物样品与诊断抗体试剂接触并检测诊断抗体试剂与来自受试者的样品中PHF-tau的结合，可以在来自受试者的生物样品(例如，血液、尿液、脑脊髓液)中检测到tau。用于进行检测的测定包括熟知的方法，如ELISA、免疫组织化学、蛋白质印迹法或体内成像。

可以通过将来自受试者的样品中或受试者中标记的tau、tau积累、tau聚集体和/或神经原纤维缠结的数量、大小和/或强度与相应的基线值进行比较来进行诊断。所述基线值可以表示未患病个体群体中的平均水平。基线值还可以表示在同一受试者中确定的先前水平。

上述诊断方法还可以用于通过在治疗之前、期间或之后检测受试者体内tau的存在来监测受试者对疗法的反应。相对于基线的值的变化表示对治疗的反应。当病理性tau从脑中清除时，值也可以在生物流体中暂时改变。

本发明还涉及用于进行上述诊断和监测方法的试剂盒。通常，此类试剂盒含有诊断试剂(如本发明的结合分子)和任选地可检测的标记。诊断性结合分子(例如抗体)本身可以含有可检测的标记(例如，荧光分子、生物素等)，所述可检测的标记可直接检测或可通过二次反应(例如，与链霉亲和素反应)检测。可替代地，可以使用含有可检测的标记的第二试剂，其中所述第二试剂对第一抗体具有结合特异性。在适于测量生物样品中的tau的诊断试剂盒中，可以提供预先结合到固相(如结合到微量滴定皿的孔)的试剂盒的抗体。

在实例中进一步说明了本发明，所述实例不旨在以任何方式限制本发明。

实例实例1

蛋白质表达和纯化

如下在大肠杆菌BL21(DE3)细菌菌株中表达含有N末端插入物和所有四个微管结合基序的人tau的最长同种型huTau441(SEQ ID NO:19)：将10L 2YT肉汤培养物在37℃孵育至OD600＝1.0的密度。添加IPTG至1mM并且将培养物再孵育3小时。通过离心收获细菌细胞并且将其重悬于PBS中以洗去剩余的上清液。离心后，将沉淀储存在-80℃直至纯化。

将沉淀重悬于5ml/g沉淀裂解缓冲液[Bugbuster mastermix，默克-密理博公司(Merck-Millipore))加不含蛋白酶抑制剂的完全纯EDTA(Complete Ultra EDTA)(罗氏公司(Roche))和额外500U的Benzonase(默克-密理博公司)中。在室温下30分钟后，将裂解物在70℃进行60min的热处理。通过离心除去沉淀的材料，并且可溶性tau蛋白通过NiSepharose Excel(通用电气公司(GE))柱、随后是C-Tag(生命技术公司(LifeTechnologies))亲和色谱法分离，并且通过Superdex 200柱(Akta Avant 25，通用电气公司)凝胶过滤。将来自含有蛋白质的每个级分的等分试样进行SDS-PAGE，并保留具有最少量污染物质(高于或低于单体tau的条带)的级分用于实验目的。在所有情况下，如通过SEC-MALS评估的，制剂含有>95％单体tau蛋白。

实例2

CBTAU-28.1变体的制备

先前，已鉴定了抗体CBTAU-28.1(如WO 2015/197823中所述)。

根据本发明，使用基于合理结构的方法和/或随机诱变策略制备了新的和改良的变体。

通过将重链(VH)和轻链(VL)可变区克隆到含野生型IgG恒定区的单个表达载体中来构建人IgG1抗体。在人胚肾293衍生的Expi293FTM细胞(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))中瞬时转染编码对应于人抗tau mAb的序列的质粒，并且在转染后7天，通过MabSelect SuRe(通用医疗集团(GE Healthcare))Protein A亲和色谱从培养基中纯化表达的抗体。将IgG用100mM柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5，其立即经缓冲液交换成PBS(pH 7.4))从柱(使用自装填Sephadex G-25柱(通用医疗集团))洗脱。每种抗体均通过SDS page和尺寸排阻色谱法结合多角度光散射(SEC-MALS)进行质量控制，并通过Octet生物膜层干涉技术进一步证实了其与同源tau肽的反应性。

实例3

基于Octet生物膜层干涉技术，野生型(WT)和CBTAU-28.1变体与其相应的同源tau肽A6940(SEQ ID NO:20)的缔合和解离曲线。

tau肽A6940的氨基酸序列是：

₄₂GLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKSTPTAEDVTAPLVDEGAPGKQAA AQPHTEIPEGTTA₁₀₃(SEQ ID NO:20)。将所述肽经由生物素与链霉亲和素生物传感器结合。缔合(0-600s)在传感器浸入含有CBTAU-28.1变体(100nM)的溶液中后进行，而解离(600-1200s)在含有蛋白络合物的传感器移至动力学缓冲液后进行。通过在PBS中稀释10倍10X‘Pall ForteBio的动力学缓冲液’而获得用于这些实验的缓冲液。通过在波长(nm)中出现较大移位和/或较慢的解离动力学证实亲和力的改善。

结果示出于图1中。可以看出，本发明的新结合分子显示出与tau肽(SEQ ID NO:20)的结合特性改善。这通过缔合时较大的波长移位以及较慢的解离动力学来表现，所述较大的波长移位指示在稳态条件下更高比例的抗体分子与tau结合，而所述较慢的解离动力学指示新结合分子与tau的结合持续更长的时间。

实例4

通过等温滴定量热法(ITC)进行亲和力测量

使用Microcal Auto-iTC200等温滴定量热计(马尔文公司(Malvern))确定新颖抗体的亲和力。将tau和CBTAU-28.1变体透析至pH 7.4的PBS中，以确保完美的缓冲液匹配条件。用200μM PBS中的CBTAU-28.1储备液递增地滴定20μM的tau蛋白(肽)，并在每次注射后评估焓的变化。使用Microcal PEAQ-ITC分析软件(马尔文公司)根据一组位点模型拟合数据。

用野生型(左小图)或亲和力优化的S32R[VL]；E35K[VL](右小图)CBTAU-28.1变体滴定包含残基42-103的tau肽A6940(SEQ ID NO:20)。结果示出于图2中。每次注射后焓的变化显示为IgG/tau摩尔比(·)的函数。连续线表示数据与“一组结合位点”模型的拟合。由拟合产生的平衡解离常数(Kd)显示在每个小图的右下角。如通过ITC估计的，其他亲和力改善的变体(未显示)的亲和力是：

CBTAU-28.1(I50M[VH]；Y52W[VH]；S103W[VH]；S32R[VL]；E35K[VL])：67±11nM

CBTAU-28.1(I50M[VH]；Y52W[VH]；S103F[VH]；S32R[VL]；E35K[VL])：63±12nM

CBTAU-28.1(I50M[VH]；Y52W[VH]；S103W[VH]；Y31W[VL]；N99H[VL])：57±7nM

CBTAU-28.1(I50M[VH]；Y52W[VH]；S103F[VH]；Y31W[VL]；N99H[VL])：45±5nM

ITC测量表明，新结合分子以非常高的亲和力结合tau，这意味着在给定时间可以有更多的抗体分子与tau形成络合物。

实例5

介导tau聚集体被小胶质细胞摄取重组tau聚集体标签

按照制造商的说明，用

Green STP Ester(英杰公司(Invitrogen))共价标记聚集的重组2N4R tau(rTau)(SEQ ID NO:19)。简而言之，通过在20,800rcf下离心30分钟来旋转分离rTau聚集体，并且然后将其重悬于0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5，最终浓度为2mg/ml)中。每摩尔蛋白质添加十摩尔染料，并将混合物在室温下避光孵育45分钟。使用由0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5)平衡的PD10柱(通用医疗集团)去除未缀合的染料。按照制造商的说明，通过BCA分析(赛默科技公司(Thermo Scientific))评估被标记的rtau聚集体的蛋白质含量。

重组tau摄取测定

在补充有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中培养BV-2细胞。将培养物保持在37℃、5％CO2的潮湿气氛中。

为了产生免疫络合物，将250nM聚集的rTau(用pHrodo绿色染料共价标记)与CBTAU-28.1(本发明的野生型和新的结合分子)或CBTAU-27.1(如WO2015/197823中所述)以及S27_dY；T100I突变体(如共同未决的申请EP 17163425.6中所述)在无血清培养基中的连续稀释液(6-150nM)一起孵育。还用野生型和高亲和力突变体形式的CBTAU-28.1和CBTAU-27.1两者的300nM Fab片段产生tau免疫络合物。在每个实验中，包括小鼠IgG1同种型对照以及仅与聚集的rTau一起孵育的细胞。

将免疫络合物在4℃孵育过夜，并且在第二天将其于37℃、5％CO2下施用于BV2细胞2小时。孵育后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA收集细胞20分钟，从而同时去除结合到细胞外膜的tau，将所述细胞以400rcf离心以去除培养基，用PBS洗涤两次，并重悬于流式细胞术缓冲液(PBS 1x加0.5％BSA和2mM EDTA)中。用Canto II流式细胞仪(BD公司)门控分析细胞中活的单个细胞群体，如正向和侧向散射曲线所鉴定的。每个实验一式两份进行。

如图3所示，CBTAU-28.1(A)促进了BV2细胞中rTau的摄取，而CBTAU-27.1(B)不促进所述摄取。由于CBTAU-28.1Fab片段不增加tau摄取(数据未显示)，所述摄取由Fc介导。

CBTAU-28.1野生型(WT)和本发明的新结合分子的滴定曲线清楚地表明，如特定抗体浓度(A)的较高荧光水平所反映的，本发明的抗体可以比WT抗体在更高的程度上介导BV2细胞摄取tau(A)。对于CBTAU-27.1，滴定曲线进一步证实了此抗体对tau摄取不存在任何作用(B)。MFI的增加倍数与仅BV2细胞进行比较。

结果表明，本发明的新颖的结合分子可以结合tau聚集体，并且所述络合物可以经由Fc介导的机制以剂量依赖性方式被小胶质细胞摄取。新的结合分子的摄取效率要高得多。另一方面，CBTAU-27.1变体不能结合tau聚集体，因此无法介导PHF被小胶质细胞摄取。

实例6

CBTAU-28.1抗体耗竭AD脑匀浆中种子的能力

含有tau种子的匀浆是从冷冻保存的人AD脑组织中产生的。在免疫耗竭测定中，将种子与测试抗体一起孵育，并用蛋白G Dynabeads从溶液中去除。测试了耗竭的上清液(称为“免疫耗竭级分”)在含有发色团K18的HEK293细胞中的剩余接种能力，并通过流式细胞术进行分析。

FRET生物传感器细胞是稳定表达K18/P301S-CFP和K18/P301S-YFP的HEK细胞，并以96孔板形式铺板。通过将免疫耗竭级分与Lipofectamine2000预混合来将所述级分转染到细胞中以增加测定窗口，并将所述免疫耗竭级分在受体FRET生物传感器细胞上孵育2天，然后将所述细胞进行胰蛋白酶化，并通过流式细胞术对FRET阳性细胞的百分比进行定量。仅当K18报告蛋白形式聚集体并且因此CFP和YFP紧密接近时，才可以测量FRET信号。当激发CFP时，能量转移到YFP，导致YFP荧光发射(Holmes等人,2014,PNAS[美国国家科学院院刊]111,E4376-E4385)

种子：

从生物库(纽卡斯尔脑组织资源(Newcastle Brain Tissue Resource))获得冷冻保存的脑组织。将冷冻的脑组织用杜恩斯(Dounce)匀浆器在1000rpm下在均质化缓冲液(10mM Tris(吉博科公司(Gibco)，目录号15567-027)、pH7.4的150mM NaCl(吉博科公司，目录号24740-011)、过滤器：0,22μm+Complete迷你不含EDTA的蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche)，目录号11 836 170 001)中均质化10次，以获得10％w/v匀浆。将匀浆在4℃以27.000xg离心10min，并将上清液以等分试样形式在-80℃储存，直至可在免疫耗竭测定中用作种子。

测定程序：

在PBS(西格玛公司(Sigma)，目录号D8537)中制备660nM抗体稀释液，以获得下述抗体-种子-珠混合物中的最终300nM浓度。将种子在PBS中稀释1.3倍，以实现在300nM抗体浓度下完全耗竭，并保持合适的接种窗口。将抗体和种子稀释液以1:1的比率在96孔PCR板(赛默科技公司AB-0600)中混合并孵育，直至进行珠洗涤。

向96孔PCR板(赛默科技公司AB-0600)中每孔添加121.5μl蛋白G DynaBeads悬浮液(生命技术公司(Life Technologies)；目录号10004D)，并通过用磁体(生命技术公司；目录号123.31D)下拉珠而洗涤两次，从而能够将缓冲液从珠中去除，并将珠重悬于含0.01％Tween20(西格玛公司，目录号P1379)的PBS中。完全除去洗涤缓冲液，并将10μl含0.1％Tween20的PBS添加至每个孔的珠中，并且每孔添加90μl 1:1抗体-种子混合物。抗体-种子-珠混合物应含有0.01％Tween20，以防止珠粘附到PCR板的塑料上。

将抗体-种子-珠混合物在4℃、以5rpm旋转孵育过夜。第二天，通过以3000rpm离心约20秒将缩合物从盖上去除。通过用磁体下拉珠将免疫耗竭级分从珠分离，并转移至新的96孔PCR板以在-80℃储存，直至在FRET生物传感器细胞上测试其剩余接种能力。如上所述将珠洗涤两次，并在-20℃干燥保存在PCR板中。每种条件一式两份进行测试。

将免疫耗竭级分反向转染到FRET生物传感器细胞中：向96孔板(聚D赖氨酸预涂覆的μclear板)中每孔添加10μl免疫耗竭级分；葛莱娜第一生化有限公司(Greiner Bio-one)，目录号655946)。添加在Opti-MEM(吉博科公司(Gibco)，目录号11058-021)中稀释40次的10μl Lipofectamine 2000(英杰公司，目录号11668-027)，并将此混合物在板中孵育10分钟。向补充有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(Biowest公司，目录号S1810-500)和1％青链霉素(Penstrep)(西格玛公司P4333)的130μl DMEM、高葡萄糖、GlutaMAXTM补充剂、丙酮酸盐(吉博科公司，目录号31966-021)中每孔添加55.000FRET生物传感器细胞。在37℃孵育2天后，将细胞用PBS(西格玛公司，目录号D8537)洗涤两次，然后在37℃用50μl/孔的0.05％胰蛋白酶/EDTA(吉博科公司，目录号25300-054)将它们分离5min。通过反复上下吸移将细胞重悬，并用显微镜目视检查单个细胞。将30μl/孔的FACS缓冲液(汉克斯平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution)(西格玛公司，目录号H8264))、1mM EDTA(英杰公司，目录号15575-038)、1％FBS(Biowest公司，目录号S1810-500)添加到已加入50μl细胞悬液的聚丙烯圆底板(MW384；科斯塔公司(Costar)，目录号3657)中。通过流式细胞术分析细胞的FRET阳性。

如图4所示，CBTAU-28.1能够以剂量依赖性方式从AD脑耗竭PHF，如在此实验中使用的抗体最高浓度下接种效率降至约60％所反映的。另外，亲和力改善的CBTAU-28.1分子显示出显著更高的PHF耗竭效力。这通过更强的剂量依赖性作用反映，并且还通过在实验中使用的最高抗体浓度下接种效率降至初始接种效率的10％-30％这一事实反映。这些观察结果显示出，这些抗体在高浓度下中和来自AD脑的PHF种子的能力增强。

序列：

重链可变区WT CBTAU 28.1(SEQ ID NO:13)：

轻链可变区WT TBTAU 28.1(SEQ ID NO:14)：

重链可变区S32R[VL]；E35K[VL](SEQ ID NO:13)：

轻链可变区S32R[VL]；E35K[VL](SEQ ID NO:15)

重链可变区I50M[VH]；Y52W[VH]；S103W[VH]；S32R[VL]；E35K[VL](SEQ ID NO: 16)：

轻链可变区I50M[VH]；Y52W[VH]；S103W[VH]；S32R[VL]；E35K[VL](SEQ ID NO: 15)：

重链可变区I50M[VH]；Y52W[VH]；S103F[VH]；S32R[VL]；E35K[VL](SEQ ID NO: 17)：

轻链可变区I50M[VH]；Y52W[VH]；S103F[VH]；S32R[VL]；E35K[VL](SEQ ID NO: 15)：

重链可变区I50M[VH]；Y52W[VH]；S103W[VH]；Y31W[VL]；N99H[VL](SEQ ID NO: 16)：

轻链可变区I50M[VH]；Y52W[VH]；S103W[VH]；Y31W[VL]；N99H[VL](SEQ ID NO: 18)：

重链可变区I50M[VH]；Y52W[VH]；S103F[VH]；Y31W[VL]；N99H[VL](SEQ ID NO: 17)：

轻链可变区I50M[VH]；Y52W[VH]；S103F[VH]；Y31W[VL]；N99H[VL](SEQ ID NO: 18)：

Tau蛋白2N4R(SEQ ID NO:19)：

Tau肽A6940(SEQ ID NO 20)：

Tau肽A7731(SEQ ID NO:21)：

序列表

<110> 扬森疫苗与预防公司

<120> 与tau特异性结合的结合分子

<130> 0305 EP P00 PRI

<160> 21

<170> PatentIn3.5版

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBTAU 28.1 HC CDR1

<400> 1

Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBTAU28.1 HC CDR2

<400> 2

Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBTAU28.1 HC CDR3

<400> 3

Ala Arg Val Gly Arg Pro Ser Lys Gly Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBTAU LC CDR1

<400> 4

Gln Thr Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Glu Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBTAU28.1 LC CDR2

<400> 5

Trp Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBTAU 28.1 LC CDR3

<400> 6

Gln Gln Tyr Tyr Asn Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> S32R[VL];E35K[VL]_LC CDR1

<400> 7

Gln Thr Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Lys Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I50M[VH];Y52W[VH];S103W[VH];S32R[VL];E35K[VL]_HC CDR2

<400> 8

Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr

1 5

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I50M[VH];Y52W[VH];S103W[VH];S32R[VL];E35K[VL]_HC CDR3

<400> 9

Ala Arg Val Gly Arg Pro Trp Lys Gly Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I50M[VH];Y52W[VH];S103F[VH];S32R[VL];E35K[VL]_HC CDR3

<400> 10

Ala Arg Val Gly Arg Pro Phe Lys Gly Gly Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I50M[VH];Y52W[VH];S103W[VH];Y31W[VL];N99H[VL]_LC CDR1

<400> 11

Gln Thr Leu Leu Trp Ser Ser Asn Glu Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> I50M[VH];Y52W[VH];S103W[VH];Y31W[VL];N99H[VL]_LC CDR3

<400> 12

Gln Gln Tyr Tyr His Ser Pro Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBTAU 28.1 HC VARIABLE REGION

<400> 13

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Pro Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Arg Pro Ser Lys Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBTAU 28.1 LC VARIABLE REGION

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Glu Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Pro Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 15

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区 S32R[VL];E35K[VL]

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Arg

20 25 30

Ser Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Pro Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Asn Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 16

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

I50M[VH];Y52W[VH];S103W[VH];S32R[VL];E35K[VL]

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Pro Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Arg Pro Trp Lys Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

I50M[VH];Y52W[VH];S103F[VH];S32R[VL];E35K[VL]

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile Trp Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Pro Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Gly Arg Pro Phe Lys Gly Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

I50M[VH];Y52W[VH];S103W[VH];Y31W[VL];N99H[VL]

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Thr Leu Leu Trp Ser

20 25 30

Ser Asn Glu Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Pro Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 19

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TAU蛋白2N4R

<400> 19

Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly

1 5 10 15

Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His

20 25 30

Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu

35 40 45

Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser

50 55 60

Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val

65 70 75 80

Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu

85 90 95

Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro

100 105 110

Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val

115 120 125

Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly

130 135 140

Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro

145 150 155 160

Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro

165 170 175

Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser

195 200 205

Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys

210 215 220

Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys

225 230 235 240

Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val

245 250 255

Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln

275 280 285

Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly

290 295 300

Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser

305 310 315 320

Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln

325 330 335

Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser

340 345 350

Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn

355 360 365

Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala

370 375 380

Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser

385 390 395 400

Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser

405 410 415

Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val

420 425 430

Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu

435 440

<210> 20

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TAU肽A6940

<400> 20

Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu

1 5 10 15

Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu

20 25 30

Asp Val Thr Ala Pro Leu Val Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala

35 40 45

Ala Ala Gln Pro His Thr Glu Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala

50 55 60

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TAU肽A7731

<400> 21

Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys

1 5 10 15

Ser Thr Pro Thr

20

Claims

1.一种能够与tau特异性结合的结合分子，所述结合分子选自由以下组成的组：

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQID NO:2的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR3；

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3；以及

结合分子，所述结合分子包含：含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链CDR1、含有SEQID NO:8的氨基酸序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR3、含有SEQID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR2、以及含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:13、16和17组成的组的氨基酸序列，并且所述轻链可变区选自由SEQ ID NO:15和18组成的组。

3.根据权利要求1或2所述的结合分子，其中所述结合分子选自由以下组成的组：

4.一种结合分子，所述结合分子免疫特异性地与根据权利要求1、2或3所述的结合分子竞争结合tau。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的结合分子，其中所述结合分子是人单克隆抗体或其抗原结合片段。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的结合分子，用于在抑制tau蛋白聚集体的扩散和/或介导tau聚集体被小胶质细胞摄取和降解中使用。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的结合分子，用作药物，优选地用于在诊断、预防和/或治疗涉及tau的病理性聚集的神经变性疾病中使用。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的结合分子，用于根据权利要求6或7所述的使用，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病。

9.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含至少一种根据权利要求1-8中任一项所述的结合分子并且还包含至少一种标签。

10.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1-8中任一项所述的结合分子。

11.一种载体，所述载体包含根据权利要求10所述的核酸分子。

12.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的结合分子和/或根据权利要求9所述的免疫缀合物、以及药学上可接受的载剂或赋形剂。