JP2879975B2

JP2879975B2 - 微小管関連タンパク質タウに対するモノクローナル抗体、これらの抗体を分泌するハイブリドーマ、これらのモノクローナル抗体による抗原認識及びこれらの応用

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Publication number: JP2879975B2
Application number: JP6513790A
Authority: JP
Inventors: ファンデルメーレン，マルク; マーケン，マーク; ファンメヘレン，エーヘーン; ファン・デ・フォールデ，アンドレ
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Current assignee: Innojeneteikusu SA Nv
Priority date: 1992-12-14
Filing date: 1993-12-10
Publication date: 1999-04-05
Anticipated expiration: 2014-04-05
Also published as: DK0673418T3; WO1994013795A1; ATE165866T1; DE69318420T2; ES2118373T3; EP0673418B1; US5843779A; JPH08502898A; AU5809794A; EP0673418A1; DE69318420D1; AU690092B2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒト微小管関連タンパク質タウ（microtub
ule−associated protein tau）に対する新規なモノク
ローナル抗体、これらのモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマ、及びこれらのモノクローナル抗体によ
る抗原認識とこれらの応用に関する。本発明はまた、上
記モノクローナル抗体により認識される（タウタンパク
の）特定のエピトープに関連する脳疾患を診断する方法
にも関する。

アルツハイマー病（AD）は、最も一般的な型の成人発
症性の痴呆である。現在のところ、ADの生前診断のため
の生化学的試験は実用化されていない。従ってこの疾患
は、主として他の型の痴呆を除外することにより臨床的
に診断される。この病気は、神経炎性（老人性）局面と
神経原線維錯綜（neurofibrillary tangles）（NFT）の
存在により神経病理学的に特徴付けられる。

神経原線維錯綜は、対らせんフィラメント（paired h
elical filaments）（PHF）よりなり、PHFの主要なタン
パク成分は修飾された形態の微小管関連タンパク質タウ
であり（Brion et al.,1985;Greenberg and Davies,199
0:Lee et al.,1991）、これは正常な状況下では微小管
の会合と安定性を促進し（Weingarten et al.,1975;Bre
and Karsenti,1990）、ヒトを含む幾つかの種のニュー
ロンで合成され（Kosik et al.,1989）、そしてこれら
のニューロンの軸索の区画に豊富に存在する（Binder e
t al.,1985）。

このタンパクは、異なるアイソフォームのファミリー
として存在し、この内４〜６つのアイソフォームは正常
成人脳で見い出されるが、１つのアイソフォームだけは
胎児脳で検出される（Goedert et al.,1989）。これら
のアイソフォームの多様性は、単一の遺伝子から選択的
mRNAスプライシングにより生じる（Himmler,1989）。タ
ウタンパクの最も際だった特徴は、分子クローニングか
ら予測されるように、３回又は４回繰り返される、分子
のカルボキシ末端部分に現れる連続的な31又は32アミノ
酸のストレッチである。例えば、The EMBO Journal vo
l.8 no.2 pp.393−399,1989には、４回繰り返されたア
ミノ酸のストレッチを含む以下のアミノ酸配列を有する
ヒトタウタンパク質のアイソフォームが記載されてい
る：本明細書中では、上記のアミノ酸配列を有するヒトタ
ウタンパク質のアイソフォームをII型のヒトタウタンパ
クのアイソフォーム、上記配列のうち下線部の配列を除
いたアイソフォームをＩ型のヒトタウタンパクのアイソ
フォームという。他の多様性は、分子のNH₂末端部分の2
9又は58アミノ酸の長さの挿入により生じる（Goedert e
t al.,1989）。Goedert et al.,1989には、上記II型の
ヒトタウタンパクのアイソフォームの44位のLysと45位
のAlaとの間の間に以下の配列：が挿入されたアイソフォームが記載されている。

アルカリホスファターゼ処理後に観察される分子量の
見掛け上の増加により示されるように、異常にリン酸化
された64及び69kDaのタウの変異体は、神経原繊維錯綜
と老人斑を示す脳領域に限って検出されている（Flamen
t et al.,1989,1990）。４つの異なるキナーゼによるリ
ン酸化の部位は、タウのＣ末端微小管結合性半分に位置
づけられており、細菌で発現されたタウへのカルシウム
カルモジュリン依存性キナーゼの作用が、電気泳動での
移動度を低くするSer（405）のリン酸化をもたらすこと
が示され得る（Steiner et al.,1990）。PHT−タウと呼
ばれる、対らせんフィラメントに存在するタウは、異常
にリン酸化されている（Lee et al.,1991）。この異常
なリン酸化は、タウに構造（コンフォメーション）変化
を引き起こし、恐らく自己会合とPHFの形成をもたら
す。ADのPHF−タウは、幾つかの部位でリン酸化されて
おり、その１つがホスホセリン199及び／又は202であ
る。この部位は、AT8と呼ばれるmAbにより特異的に認識
される（Biernat et al.,1992）。従って、AT8はPHF−
タウの識別性マーカーである（Goedert et al.,199
2）。

ヒトタウに反応性を示す幾つかの抗体は、それらが神
経線維上に存在する非特異的リン酸化エピトープに対す
るものであり、後に正常な及び異常にリン酸化されたタ
ウと交差反応することが示された（Nukina et al.,198
7;Ksiezak−Reding et al.,1987）ため、又はこれらの
抗体が正常な及び異常にリン酸化されたタウ上の特異的
エピトープを認識する（Kosik et al.,1988）ため、報
告されてきた。非特異的エピトープに対するタウ抗体に
加えて、リン酸化されたタウエピトープに特異的な抗体
が記載されている（Mercken et al.,1992b）。

アルツハイマー病罹患の脳領域で、タウの全mRNAレベ
ルは僅かに変化しているだけである（Goedert et al.,1
988;Barton et al.,1990）が、全タウタンパクレベル
は、少なくとも６倍異なり得ることが示された（Khatoo
n et al.,1992）。これは、タウに対するポリクローナ
ル抗体（Flament and Delacourte,1990）と、充分に定
義されたエピトープに対するモノクローナル抗体とによ
り、明らかにされている。脳ホモジネートのサンドイッ
チ免疫測定法に、タウ分子のＮ末端のリン酸非依存性エ
ピトープを認識するAlz50モノクローナル抗体（Goedert
et al.,1991）を使用して、アルツハイマー病患者の脳
でタウのレベルが高くなっていることが示された（Ghan
bari et al.,1990;特許出願EP 444 856）。

プロナーゼ処理したPHFに対してつくられ、9.5kDa及
び12kDa断片と特異的反応性を有する「423」と命名され
た抗体も、アルツハイマー病のタウタンパクを測定する
のに使用された（特許出願WO 89/03993）。同様に、対
照の脳ホモジネートと比べて、アルツハイマー病の脳ホ
モジネートで、mAb423の免疫反応性の上昇が見い出され
た。

Merckenら（1992b）は、ホスファターゼ感受性エピト
ープに特異的である（AT8）か、又はウェスタンブロッ
トで正常タウと同様にPHF−タウと反応する（AT1、AT
4、AT6、AT9、AT11、AT12及びAT14）、一連のモノクロ
ーナル抗体を記載している。

更に、抗体タウ１（Wischik et al.,1988;Harrington
et al.,1990）も、脳ホモジネート中のタウを測定する
ために使用された。タウレベルがアルツハイマー病罹患
の脳の切片で特異的に測定されたあるケースにおいて、
タウレベルは、正常脳ホモジネートのレベルに比べて８
倍高かった（Khatoon et al.,1992）。

脳脊髄液でアルツハイマー病を診断する最初の試みで
は、PHF−タウ特異的モノクローナル抗体AT8（Mercken
et al.,1992b）が使用された。しかし、PHFタウ抗原は
明らかにされ得なかった。

これまでのところ、タウの存在は、100倍濃縮脳脊髄
液（CSF）中に観察されたか（Wolozin and Davies,198
7）又はポリクローナル抗体を使用してCSF試料中に観察
された（Delacourte and Vermersch,1991）が、記載さ
れてきたどのモノクローナル抗体も、濃縮されていない
CSF中のタウの検出に成功していない。

従って、本発明の目的は、脳抽出物中及び濃縮されて
いない脳脊髄液中に存在する正常なタウ及び異常にリン
酸化されたタウを、確実かつ高感度に検出することを可
能にするモノクローナル抗体を提供することである。本
発明はまた、上記モノクローナル抗体を分泌するハイブ
リドーマを提供することをも目的とする。

更に本発明は、上記モノクローナル抗体により認識さ
れる、脳ホモジネート中又は脳脊髄液のような体液中に
存在するタウのエピトープを提供することを目的とす
る。

本発明は、タウタンパクが関与する脳疾患のインビト
ロ（試験管内）検出又は診断の方法を提供することを目
的とする。

本発明のモノクローナル抗体は、正常なヒトタウタン
パクと異常にリン酸化されたヒトタウタンパクの両者に
存在するエピトープと反応する、という事実により特徴
付けられる。このモノクローナル抗体は、正常なヒトタ
ウタンパク及び異常にリン酸化されたヒトタウタンパク
に属するエピトープ又は抗原と免疫学的複合体を形成す
る、という事実により更に特徴付けられる。本発明のモ
ノクローナル抗体はまた、ELISAにより測定すると、タ
ウタンパクと部分配列を共有する（Nukina et al.,198
7;Lewis et al.,1988）MAP−１、MAP−２及び神経線維
のような他のリン酸化タンパクとは免疫学的複合体を形
成しない、という事実により特徴付けられる。本発明の
モノクローナル抗体はまた、CSF中の、1.0pg/mlという
低濃度のヒトタウタンパクを検出し得、またタウタンパ
ク陰性CSF中への一定量のタウタンパクの添加において1
00％の回収率でタウタンパクを検出する（100％添加回
収）、という事実により特徴付けられる。

本発明のモノクローナル抗体はまた、CSFに基づくア
ルツハイマー病（AD）の診断、すなわちCSF中のタウと
修飾形態のタウを検出することを可能にする。これに関
連した問題は、この抗原がCSF中に非常に少量で存在
し、従って検出アッセイは非常に高感度でなければなら
ないことである。この問題は、本発明のモノクローナル
抗体を、触媒レポーター沈殿増幅法（catalysed report
er deposition amplification technique）（CARD、Bob
row et al.,1989）との組合せで使用して、より高感度
のタウ特異的CARD・ELISAにすることにより解決でき
る。或は、各々AT120エピトープとは異なるエピトープ
を認識する標識モノクローナル抗体の混合物又は組合せ
を、検出抗体として使用することもできる。

本発明のハイブリドーマAT120により分泌されるモノ
クローナル抗体により得られる結果は、タウレベルの上
昇が、ADだけでなく、ニューロンの死又は損傷が生じる
他の神経学的疾患でも見い出されることを示している。

「〜と免疫学的複合体を形成する」という表現は、本
発明のモノクローナル抗体が、以下の方法で言及される
下記の条件の１つの下で、上述の抗原と結合することを
意味する： −光学免疫顕微鏡法手術又は解剖（検死）で得られた脳組織試料を、４％
ホルマリン又はボウインの固定液（Bouin's fixative）
中に浸漬して固定し、切片化のためにパラフィンに包埋
する。3,3′−ジアミノベンジン四塩酸を発色のために
使用するアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体
法（Hsu et al.,1981）のような、形成される免疫複合
体を可視化する方法と結び付けて、本発明のモノクロー
ナル抗体を適用する。切片を、ハリス・ヘマトキシリン
染色（Harris haematoxylin stain）でカウンター染色
する。

−組織切片の免疫電子顕微鏡法手術又は解剖で得られた脳組織試料を、切片化前に、
包埋はせずに、ボウインの固定液又は10％緩衝化ホルマ
リン中で固定する（Vibratome）。全て当業者に公知の
標準的プロトコール（Brion et al.,1985）により、間
接免疫金法（indirect immunogold method）による免疫
染色に、本発明のモノクローナル抗体を使用し、その
後、切片を固定し、包埋し、電子顕微鏡法用に切片化す
る。

−免疫ブロット法免疫ブロットのために、記載されている（Lindwall a
nd Cole,1984）ようにタウを濃縮した分画を調製する。
典型的には、脳組織50gをハサミで小片に切り、テフロ
ンのプランジャーを取付けたポッター（Potter）ホモジ
ナイザーを用いて、緩衝液Ａ（20mM2−［Ｎ−モルホリ
ノ］エタンスルホン酸、80mM NaCl、2mM EDTA、0.1mM E
GTA、1mMβ−メルカプトエタノール、pH6.75）中で、1:
1（重量／体積）でホモジナイズする。このホモジネー
トを、４℃で150,000gで１時間遠心分離して、上清を沸
騰水中で５分間加熱し、氷上で10分間再び冷却する。こ
のスラリーを４℃で150,000gで２時間遠心分離して、上
清を集める。この熱安定性サイトゾル抽出物を、2.5％
過塩素酸に添加して、４℃で150,000gで１時間遠心分離
し、その後上清を3Mトリスで中和する。次に上清を水で
透析して、セントリプレップ濃縮器（Centriprep conce
ntrator）（アミコン社（Amicon）、ローザンヌ市、ス
イス）で濃縮する。

12％ゲル上で還元条件下で、SDS−ポリアクリルアミ
ド電気泳動を行う（Laemmli,1970）。電気泳動後、タン
パクを、固定してクマシー・ブリリアントブルーで染色
するか、又はニトロセルロースのシート［Hybond−C;ア
マーシャム（Amersham）社］もしくはイモビロン・フィ
ルター（Immobilon filters;ミリポア社）にトランスフ
ァーする（Towbin et al.,1979）。

トランスファー後、0.05％（v/v）ツイーン（Tween）
20を含有するPBS（ツイーン−PBS）にフィルターを前も
って浸し、次に５％（w/v）乾燥スキムミルクと10％（v
/v）ウシ新生児血清を含有するツイーン−PBS（ブロッ
キング緩衝液）中で１時間インキュベートする。次い
で、４℃で一晩、ブロッキング緩衝液で適宜希釈した本
発明のモノクローナル抗体でフィルターを処理する。

次に、フィルターをツイーン−PBS中で３回洗浄し
て、ブロッキング緩衝液で1/3000希釈した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgG（Dakopatts、デ
ンマーク）で、室温で1.5時間処理する。ツイーン−PBS
中で３回の洗浄の後、ブロッキング緩衝液で1/250希釈
した、ストレプトアビジン−ビオチン化西洋ワサビペル
オキシダーゼ複合体（アマーシャム社）を、室温で1.5
時間適用する。その後、フィルターを、ツイーン−PBS
で３回、PBSで１回洗浄する。次に、バックグラウンド
が発色するまで、0.05％（w/v）ジアミノベンジジンと
0.03％（v/v）過酸化水素を含有するPBS中で、フィルタ
ーをインキュベートする。

モノクローナル抗体と抗原との間での免疫学的複合体
の形成は、上述の正確な条件に制限されず、抗体と抗原
の結合の免疫化学的特性を尊重する全ての方法が、免疫
学的複合体の同様な形成を生みだすことは、明らかなは
ずである。

ヒト正常タウは、全てのニューロンの樹状突起ドメイ
ン（somatodendritic domain）に特異的に発現する、分
子量58〜64kDaの範囲の少なくとも６つのタウタンパク
の集合（クラス）である（Papasozomenos and Binder,1
987）。更に、アルツハイマー病又はダウン症候群の変
性した皮質のニューロンで生じ、その電気泳動の低い移
動度が異常なリン酸化に帰される、アルツハイマー（錯
綜）特異的タウの形態が記載されている（Flament et a
l.,1989;Delacourte et al.,1990）。

本発明の有利な実施態様によると、モノクローナル抗
体は、神経学的疾患に罹患した患者の大脳皮質から単離
された脳ホモジネートから得られるヒトタウタンパクで
ある、上述のタウの全ての形態と免疫学的複合体を形成
する。

「脳ホモジネート」とタウタンパクは、LindwallとCo
leの方法（1984）のような標準的な方法により当業者は
得ることができる。

有利な実施態様によると、本発明のモノクローナル抗
体は、 −ヒトタウタンパクの下記のアミノ酸配列内に位置する
エピトープ： −又は、それ自体配列番号１に示されるタウタンパク領
域に位置するエピトープと複合体を形成するモノクロー
ナル抗体と免疫学的複合体を形成することのできる他の
あらゆるペプチドと、免疫学的複合体を形成する。

配列番号１に示される配列は、以下本明細書では、本
発明の「エピトープ」を含有するものとして示される。
このアミノ酸配列は、ヒトタウ40の番号付けを使用し
て、ヒトタウのアミノ酸155〜221にわたる（Goedert et
al.,1989）。

それ自体上述のペプチドと複合体を形成するモノクロ
ーナル抗体と免疫学的複合体を形成することのできるペ
プチドは、「変異体ペプチド」として定義される。

本発明の好ましいモノクローナル抗体は、ECACC（Eur
opean Collection of Animal Cell Cultures,Vaccine R
esearch and Production Laboratory,Public Health an
d Laboratory Service（PHLS）,Centre for Applied Mi
crobiology and Research,Proton Down,GB−Salisbury,
Wiltshire SP4 0JG）に、1992年10月８日に第92100853
番として寄託したハイブリドーマにより分泌される。

以下本明細書では、このハイブリドーマは「ハイブリ
ドーマAT120」と呼ぶ、そしてその分泌されるモノクロ
ーナル抗体は「モノクローナル抗体AT120」として呼
ぶ。

本発明はまた、本発明によるモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマ、特にECACCに1992年10月８日に
第92100853番として寄託したハイブリドーマに関する。

上述のモノクローナル抗体は、これらのモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマの獲得と単離を含む方
法により得られる。

ハイブリドーマを得るための方法は、 −ECACCに1992年10月８日に第92100853番として寄託し
たハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体
のような本発明のモノクローナル抗体により認識される
抗原を用いて、予めインビボ（生体内）免疫した動物
（例えばマウス又はラット）の脾臓細胞、又は予めイン
ビトロ（試験管内）免疫したそのような動物の脾臓細胞
から出発して； −ハイブリドーマ形成条件下で、上記免疫細胞と骨髄腫
細胞とを融合させて；そして −上述の抗原のエピトープを特異的に認識し、正常タウ
又はタウタンパクの異常にリン酸化された形態、或は本
発明のモノクローナル抗体により認識されるタウのエピ
トープを含むペプチドと、免疫学的複合体を形成するモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択する
ことを包含する。

対応するモノクローナル抗体を産生させるための方法
は、 −上述のように選択したハイブリドーマを適切な培地中
で培養し；そして −その選択したハイブリドーマにより分泌されるモノク
ローナル抗体を回収すること；又はその代わりに −選択したハイブリドーマをマウスの腹腔に移植し、そ
のマウスに腹水が産生された時； −上記腹水から形成されたモノクローナル抗体を回収す
ることを包含する。

本発明のモノクローナル抗体は、例えば中空糸又はマ
イクロカプセルを使用した固定化細胞の培養のような、
或は、例えばエアリフト・リアクター又は撹拌バイオリ
アクターを使用した均一な懸濁液中での細胞の培養のよ
うな、インビトロの従来法により調製することができ
る。

本発明はまた、アルツハイマー病の患者から得られた
ヒト大脳皮質から単離したヒト脳ホモジネートから得ら
れ、本発明のモノクローナル抗体と免疫学的複合体を形
成する、ペプチド（抗原）に関する。

本発明はまた、本発明のいずれかのモノクローナル抗
体と免疫学的複合体を形成し、そして −配列番号１に示される配列の部分により、含有される
か又は構成され； −上記で定義された変異体ペプチドの配列を含有するか
又はその配列により構成される、ペプチド（抗原）に関する。

変異体ペプチドは、モノクローナル抗体と免疫学的複
合体を形成することのできるペプチドであり、そしてモ
ノクローナル抗体自体は配列番号１に示されるタウタン
パク領域に位置するエピトープと複合体を形成すること
を想起すべきである。

本発明はまた、 −配列番号１に示される配列を含有するか、又は −上記で定義された変異体ペプチドの配列を含有する、約100アミノ酸のポリペプチド（抗原）に関する。

本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を生成す
る上述のペプチドに関する。

本発明はまた、アルツハイマー病もしくは正常ヒトタ
ウタンパクに関する何らかの脳疾患を有する患者の脳、
脳脊髄液又は血清中に含有され、本発明のモノクローナ
ル抗体と免疫学的複合体を形成する、ペプチド（抗原）
に関する。

本発明はまた、アルツハイマー病又はPHFもしくは異
常にリン酸化されたヒトタウタンパクに関係する何らか
の脳疾患を有する患者の脳、脳脊髄液又は血清中に含有
され、本発明のモノクローナル抗体と免疫学的複合体を
形成する、ペプチド（抗原）に関する。

本発明のペプチドを調製するための方法は、好ましく
はＣ末端アミノ酸から出発して、必要な順に連続するア
ミノアシルを、又は予め形成されて適切な順に幾つかの
アミノアシル残基を既に含有する断片とアミノアシルと
を、又はその代わりにこの方法で予め調製された幾つか
の断片を、連続的に２つ１組でカップリングさせるが、
この時、ペプチド合成で公知の方法等々により、特にカ
ルボキシル基の活性化後、正常にペプチド結合形成に関
わるべき一方のアミノ基ともう一方のカルボキシル基
（又はその逆）以外の、これらのアミノアシル又は断片
の全ての反応性基を前もって保護するよう注意を払うこ
とが理解され、これをＮ末端アミノ酸まで段階的に進行
させることにより特徴付けられる。

ヒト大脳皮質から出発して当業者に公知の方法（Lind
wall and Cole,1984）により調製され得る本発明の抗原
は、上述のような本発明のモノクローナル抗体、有利に
はECACCに1992年10月８日に第92100853番として寄託し
たハイブリドーマAT120により分泌されるモノクローナ
ル抗体と、免疫学的複合体を形成する能力により特徴付
けられる。

本発明の抗原は、有利にはアルツハイマー病、ダウン
症候群、ピック病、亜急性硬化性汎脳炎（SSPE）又は正
常タウもしくは異常にリン酸化されたタウタンパクが関
係する他の神経学的疾患を有する患者の脳、脳脊髄液又
は血清に含有される；この抗原は、本発明のモノクロー
ナル抗体との免疫学的反応を引き起こす。

本発明はまた、タウタンパクが関係する脳疾患、即ち
アルツハイマー病のインビトロ検出又は診断のための方
法に関し、そしてこの方法は、 −タウタンパクを含有するNFTの調製物、或は、アルツ
ハイマー病又はタウタンパクもしくは異常にリン酸化さ
れたタウタンパクが関係する他の何らかの疾患を有して
いた患者から単離したタウタンパクを含有する界面活性
剤抽出した脳ホモジネートを、抗原−抗体複合体を生成
するのに好適な条件下で、本発明のモノクローナル抗体
と接触させて；そして −上記複合体から抗原を分離して、精製された形態で、
求める抗原を回収することを包含する。

タウの調製は、lindwallとCole（1984）の方法により
行うことができる。

有利には、使用するモノクローナル抗体は、樹脂のよ
うな好適な支持体上に固定化された状態にある。抗原の
検出方法は、下記のとおり行うことができる： −脳組織又は脳脊髄液から出発する当業者に公知の抽出
方法（Iqbal et al.,1984;Greenberg and Davies,199
0）の結果として得られるタンパク質とポリペプチドを
含有する上清を、免疫学的複合体の形成を可能にするよ
うな条件下で、上記モノクローナル抗体と接触させて； −形成された固定化抗体−抗原複合体を洗浄し； −抗原−抗体複合体を解離させることができる溶液（例
えば、3Mチオシアン化カリウム、2.5M塩化マグネシウ
ム、0.2Mクエン酸塩−クエン酸、pH3.5、又は0.1M酢
酸）でこの複合体を処理し；そして； −精製された形態で抗原を回収する。

例えばアルツハイマー病のような、タウタンパク及び
異常にリン酸化されたタウタンパクが関係する脳疾患
の、本発明のインビトロ検出又は診断方法は、 −タウタンパクもしくはPHFが関係する神経学的疾患
（特にアルツハイマー病）を疑われる患者からの、脳モ
ジネート又は脳脊髄液又は血清の試料を、抗原−抗体複
合体を生成するのに好適なインビトロ条件下で、本発明
のモノクローナル抗体と接触させて；そして −上記脳ホモジネート又は脳脊髄液又は血清の試料への
上記抗体の免疫学的結合を検出することを含む。

免疫学的に結合したモノクローナル抗体の検出は、従
来法により行うことができる。有利には、本発明のモノ
クローナル抗体は、それ自体、後で例示するように、マ
ーカー、又はマーカーと直接もしくは間接カップリング
するための基を有している。また、ポリクローナル抗血
清を使用することもでき、これは、本発明の抗原を動物
（好ましくはウサギ）に注射し、上記抗原が結合してい
るカラムに上記ポリクローナル抗体を通す免疫親和性精
製により抗血清を回収し、そして上記ポリクローナル抗
体を従来法により溶出することにより作られるポリクロ
ーナル抗血清である。

検出は、本発明のエピトープを含む標識ペプチドと
の、抗原の競合的結合によっても行うことができる。

PHF及び／又は正常タウタンパクが関係する脳疾患
（例えばアルツハイマー病）の本発明のインビトロ検出
又は診断方法の、特に有利な実施態様は、 −正常もしくは異常にリン酸化されたタウタンパクが関
係する神経学的疾患（特にアルツハイマー病）を疑われ
る患者から単離した濃縮されていない脳脊髄液試料を、
抗原−抗体複合体を生成するのに好適な条件下で、イン
ビトロ条件下で本発明のモノクローナル抗体と接触させ
て；そして −上記脳脊髄液試料への上記抗体の免疫学的結合を、好
ましくは触媒レポーター診断増強（catalysed reporter
diagnosis enhancement）（CARD）法を適用する、サン
ドイッチELISA法により検出する工程を包含する。

本発明はまた、下記の疾患のいずれかのインビトロ診
断のためのキットに関する：アルツハイマー病、ダウン
症候群、ピック病、亜急性硬化性汎脳炎（SSPE）、及び
正常タウタンパクもしくは異常にリン酸化されたタウタ
ンパクが関係する他の神経変性疾患。このようなキット
は、 −本発明のモノクローナル抗体をその上につけるための
少なくとも１つのマイクロプレート；本発明のエピトープを含有する標識ペプチドと、好ま
しくは配列番号１に示されるペプチド配列で並ぶペプチ
ドとできる限り一緒に、インビトロ診断すべき試料を含
有する調製物； −２次抗体であって、これは、＊正常もしくは異常にリン酸化されたタウタンパクの別
のエピトープ、又は本発明のいずれかのペプチドの別の
エピトープであって、本発明のエピトープとは異なるエ
ピトープを認識するモノクローナル抗体であることがで
き、或は＊正常もしくは異常にリン酸化されたタウタンパク、又
は本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体であっ
て、本発明のエピトープとは全て異なるエピトープと免
疫学的複合体を形成するポリクローナル抗体であり、好
ましくは固定化タウタンパクを使用する免疫親和性クロ
マトグラフィーにより精製されているポリクローナル抗
体であることができる、 −上記２次抗体との特異的標識付け又はカップリングの
ためのマーカー； −一方では本発明のモノクローナル抗体と試験試料と
の、他方では接合２次抗体とマーカーとの、免疫学的反
応を行うための適切な緩衝液を含有する。

上述の標識ペプチドは、当業者に公知の任意の方法に
よって標識されたペプチドであってよい。更に、標識付
けとカップリングに特異的なマーカーは、当業者に公知
の任意のマーカーであってよい。

本発明はまた、探索される抗原に関して、競合用量法
で使用されるキットのために、本発明の抗原［この発明
の抗原は（探索される抗原の定量測定のための）標準物
質又は競合物質である］をも含有する、上述のキットに
関する。

図面の簡単な説明第１図モノクローナル抗体Tau−１（Binder et al.,198
5）、AT8（Mercken et al.,1992b）及びAT120を使用し
た、正常タウ又はPHF−タウのウェスタンブロット検
出。レーン１、３及び5:GreenbergとDavies（1990）の
方法により単離したPHF−タウ。レーン２、４及び6:Mer
ckenら（1992b）の方法による正常の親和性精製したヒ
トタウ。レーン7:分子量マーカー。

レーン１と２はAT8を使用して、レーン３と４はAT120
を使用して、そしてレーン５と６はTau−１モノクロー
ナル抗体を使用して発色させた。

第2A図及び第2B図免疫化学によるタウタンパクの検出。

第2A図：アルツハイマー病の患者の海馬からの切片。
倍率212x。

第2B図：錯綜（tangles）の多いアルツハイマー病の
患者の別の海馬からの切片。倍率212x。

第３図増幅した（CARD）AT120サンドイッチELISAを使用し
た、タウ陰性CSFプールに添加した正常（○）及びPHFタ
ウ（■）の力価方法。全ての希釈物は２重測定し、デー
タは光学密度（OD）単位として表した。

第４図実施例Ｖに示されるように構築し、実施例Ｉに示され
るようにAT120で染色した、幾つかの欠失突然変異体の
ウェスタンブロット。突然変異体は、下記のアミノ酸
（AA）を含む；レーン１、全長のタウ34（Goedert et a
l.,1989）；レーン２、タウ34のAA₁₅₄までのアミノ末
端；レーン３、タウ34のAA₁₅₅からカルボキシ末端；レ
ーン４、タウ34のAA₂₄₂までのアミノ末端；レーン５、
タウ34のAA₂₂₁までのアミノ末端；レーン６、タウ34のA
A₂₂₂からカルボキシ末端。

第５図モノクローナル抗体HT7、BT2、AT8のエピトープ認識
部位を、１文字アミノ酸コードで示す本発明のエピトー
プ（配列番号１）上に描いてある。エピトープは四角で
囲まれている。星印「＊」は、AT8エピトープ認識がセ
リン残基202のリン酸化を要することを表す。

実施例実施例I:モノクローナル抗体AT120（IgG1、サブタイ
プ：カッパ）の調製 1.免疫のための抗原の調製 GreenbergとDavies（1990）の変法により、PHF−タウ
を部分精製した。組織学的に診断の確定したアルツハイ
マー患者から、主に前頭皮質及び側頭皮質からの灰白質
よりなる死後組織を得た。このアルツハイマー灰白質脳
試料（５〜10g）を、テフロン／ガラスのポッターＳ（P
otter S）（ブラウン社、ドイツ）ホモジナイザー中
で、10倍量の冷緩衝液Ｈ（10mMトリス/1mM EGTA/0.8M N
aCl/10％蔗糖、pH7.4）と一緒にホモジナイズした。こ
のホモジネートを、60Ti MSEローター中で、４℃で20
分間、27,000×ｇで遠心分離した後、ペレットを除去
し、上清を１％（重量／体積）Ｎ−ラウロシルサルコシ
ン及び１％（体積／体積）２−メルカプトエタノールに
調整し、37℃で2.5時間、ミキサー（Swelab、スエーデ
ン）で回転させながらインキュベートした。上清混合物
を、20℃で35分間、108,000×ｇで遠心分離した。PHF−
タウを含有するペレットをPBSで穏やかに洗浄し、最後
に同じ緩衝液1mlに懸濁した。

10％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動と、続いてポリクローナルウサギ抗ヒト正常
タウ抗血清での免疫ブロッティングを使用するウェスタ
ン・ブロットにより、この抗原調製物を評価した（Merc
ken et al.,1992b）。

2.免疫のプロトコール及び融合手順完全フロイント・アジュバント中の部分精製PHF−タ
ウ100μｇの皮下投与によりBa1b/cマウスをプライミン
グ（初回抗原投与）し、その後３週間間隔で不完全フロ
イント・アジュバント中の同一抗原100μｇの腹腔内投
与により３回追加免疫を行った。融合前の第３日及び第
２日には、生理食塩水中のPHF−タウ100μｇでマウスに
追加免疫を行った。

ＫhlerとMilstein（1975）の変法を使用して、PEG4
000を用いて、マウス脾臓細胞をSP2/0骨髄腫細胞と融合
させた。

前もってフィーダー層としてマウス腹腔マクロファー
ジーを播いた96ウェルプレート上に、4.5×10⁴脾臓細胞
／ウェルの密度に、融合実験の細胞を懸濁した。12日
後、以下第３節で検討するように正常タウ又はPHF−タ
ウに特異的なサンドイッチELISAで抗タウ抗体産生につ
いてこれらのウェルをスクリーニングした。

ハイブリドーマの増殖は、20％ウシ胎児血清、ピルビ
ン酸ナトリウム（1mM）、Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニ
シリン（100U/ml）、ストレプトマイシン（100mg/m
l）、及び非必須アミノ酸を補完したダルベッコ改変イ
ーグル培地（TMEM）中で行った。全ての材料は、ギブコ
社（Gibco）（Paisley、英国）から購入した。細胞は、
加湿CO₂−空気インキュベーター中でインキュベートし
た。

3.抗体スクリーニングのためのサンドイッチELISA 抗タウモノクローナル抗体の検出のために使用したス
クリーニングELISAは、コーティング相に親和性精製し
たポリクローナルウサギ抗ヒトタウ抗体（Mercken et a
l.,1992a）を用いるサンドイッチELISA系であった。こ
のために、臭化シアン活性化セファロース（ファルマシ
アLKB社、スエーデン）を使用する免疫親和性カラムの
調製に、Merckenら（1992a）に記載されたとおりに調製
した精製ヒト正常タウを使用した。親和性結合抗タウ分
画は、pH2.5の0.1Mクエン酸緩衝化溶液を用いてこのカ
ラムから溶出した。中和後、抗タウ含有分画をプールし
て、コーティング緩衝液（10mMトリス、10mM NaCl、10m
M NaN₃、pH8.5）中で、高結合マイクロタイタープレー
ト［ヌンク（Nunc）、ギブコ社、Paisley社、英国］上
に４℃で一晩コーティングした（１μg/ml）。非特異結
合を減少させるためにPBS中の10％飽和カゼイン125μｌ
で30分間オーバーコーティングした後、プレートを、適
切に希釈したPHF−タウ調製物100μｌと一緒に37℃で60
分間インキュベートした。PBS−0.05％ツイーン20（v/
v）でこのプレートを３回洗浄し；ハイブリドーマ上清1
00μｌを添加して、37℃で１時間インキュベーションを
続けた。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス
血清（Dakopatts、Glostrup、デンマーク）を用いて、
結合したモノクローナル抗体を検出した。全ての試薬
は、10％カゼインを含むPBSで希釈した。最後の洗浄
後、ペルオキシダーゼの基質として、pH4.3の100mMクエ
ン酸、100mMリン酸水素二ナトリウム中の0.42mM 3,5,
3′,5′−テトラメチルベンジジン、0.003％H₂O₂（v/
v）100μｌを添加した。2MH₂SO₄溶液50μｌで反応を停
止した。450nmでタイターテク・マルチスキャン（Titer
tek Multiscan）（Flow laboratories,Eflab,Oy、フィ
ンランド）で吸光度を読んだ。

ELISAにおける正常タウとのモノクローナル抗体の交
差反応性を、PHF−タウの代わりに親和性精製した正常
タウを抗原として使用したことを除いてスクリーニング
アッセイと同一のサンドイッチELISAで試験した。

陽性ハイブリドーマ培養物の最初の選択では、ウェル
の視診によると、大部分の陽性培養物は、当初混合クロ
ーンからなっていた（ウェル当り３〜４クローン）。こ
れらの陽性培養物を任意にAT1からAT24と呼んだ（これ
らのハイブリドーマ培養物の幾つか、即ちAT1からAT14
は、Mercken et al.,1992bに記載されたものである）。
この最初のスクリーニングの後、当業者に周知の技法で
ある限定希釈法によりハイブリドーマ培養物をサブクロ
ーニングして、最終的に均一なイディオタイプの抗体を
分泌する純粋なハイブリドーマクローンを得た。ELIS
A、ウェスタンブロック及び免疫組織化学における正常
及びPHF−タウに対する反応性パターンの点から、そし
て脳脊髄液の希釈されていない試料に存在するタウタン
パクに対する親和性により神経学的疾患を診断する能力
の点から、これらの純粋なハイブリドーマクローンを更
に試験した。これらの判断基準に基づき、モノクローナ
ル抗体AT120を選択して、更に下記の実施例に示したよ
うに特徴付けを行った。

4.抗体のクラス及びサブクラスの決定 Inno−LIA（Innogenetics、Ghent、ベルギー）によ
り、抗体のクラス及びサブクラスを決定した。本発明の
抗体AT120は、IgG1、カッパサブタイプであるらしいこ
とが判った。

実施例II:ELISA及びウェスタンブロットによる病理学的
タウ及び正常タウの検出 1.AT120を使用するELISAによる正常タウの検出無血清ハイブリドーマAT120の調整培地（コンディシ
ョンドメディウム）から得られたプロテインＧ精製モノ
クローナル抗体AT120を、ELISAプレート上にコーティン
グして、Mercken et al.（1992a）に記載されたよう
に、PBS及び10％カゼインの溶液中に調製した、親和性
精製したヒト正常タウの異なる希釈物と反応させた。

正常タウの純度をSDS−PAGEで測定した。420A/Hアミ
ノ酸アナライザー（Applied Biosystems B.V.、Maarsse
n、オランダ）で、メーカーの指示に従いタウ試料を分
析すると、このタンパクは予想されたアミノ酸組成を示
した。アミノ酸組成から、そして標準ペプチドとの比較
により、正常タウの濃度を測定した。

タウ及びPHF−タウ陰性CSFに添加した異なる濃度のタ
ウを用いてELISAプレートを室温で１時間インキュベー
トした後、プレートを洗浄して、0.2μg/mlのビオチン
化BT2とHT7（各々AT120エピトープとは異なる正常タウ
上に存在するエピトープを認識する）と共にインキュベ
ートした。洗浄後、実施例Ｉで詳述したように、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Jackso
n）と発色剤で、複合体化したビオチン化抗体を測定し
た。結果を第Ｉ表と第３図に示す。

2.AT120を使用するウェスタンブロットによる病理学的
タウ及び正常タウの検出精製した正常ヒトタウとPHF−タウを、10％SDS−ポリ
アクリルアミドゲルにのせて、Laemmli（1970）に従っ
て変性条件下で泳動した。SDS−PAGE後、冷却しながら5
5Vで120分間、10mM NaHCO₃、3mM Na₂CO₃、pH9.9中で、
ニトロセルロース（Hybond−Ｃ、アマーシャム社、Brus
sels、ベルジー）へのトランスファーを行った。ブロッ
ティング後、ニトロセルロースをリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）で平衡化して、ブロット緩衝液［５％（w/v）乾
燥スキムミルク及び10％（v/v）ウシ新生児血清を補完
したPBS］でタンパク結合部位をフロッキングした。ブ
ロットしたタンパクを、１次抗体としてAT120を一緒に
４℃で一晩インキュベートした。PBS−0.05％ツイーン2
0（v/v）で３回の洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ
標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン（Dakopatts、Glo
strup、デンマーク）を1/3000の希釈率で使用して、室
温で90分間インキュベートした。全ての抗血清は、ブロ
ット緩衝液で希釈した。次に、PBS/ツイーン中でブロッ
トを３回洗浄し、基質溶液［PBS、0.05％（w/v）3,3′
−ジアミノベンジジン、0.03％（v/v）H₂O₂］で発色さ
せ、その後H₂O中で反応を停止した。第１図に示した結
果は、AT120抗体が全てのタウのアイソフォームを認識
することを示している。それと対照的に、Tau−１抗体
（Binder et al.,1985）は正常タウとのみ反応し、AT8
抗体（Mercken et al.,1992b）はPHF−タウとだけ反応
する。

AT120、AT8及びTau−1mAbを、PHF−タウ抗原上のウェ
スタンブロット及びELISAによるそれらのエピトープの
ホスファターゼ感受性について試験した。PHF−タウと
のAT120抗体の反応性は、ELISA（データは示さない）又
はウェスタンブロット（データは示さない）で、ホスフ
ァターゼ処理に感受性ではなかった。AT8の反応性は、E
LISAにおけるPHF−タウ抗原のアルカリホスファターゼ
処理後、ほぼ完全に消失した。以前に記載されている
（Binder et al.,1985）のように、PHF−タウの脱リン
酸化によりTau−１の免疫反応性は強化された。

実施例III:免疫組織化学によるタウの検出数人のアルツハイマー患者及び患者と年齢を合わせた
対照の新皮質、海馬、小脳、脳橋、及び脊髄からのホル
マリン固定脳組織のパラフィン切片と、対照の１人から
の末梢神経の切片を調製した。

アルツハイマー患者及び患者と年齢を合わせた対照の
脳からのクリオスタット切片も調製した。各々Dakopatt
s社（デンマーク）とアマーシャム社（英国）の試薬を
使用して、ペルオキシダーゼー抗ペルオキシダーゼ（PA
P）法（Steinberger et al.,1970）又はアビジン−ビオ
チン複合体（ABC）法（Hsu et al.,1981）を用いて、組
織を免疫染色した。

簡単に述べると、１％ウシ血清アルブミン（BSA）を
含有するトリス緩衝生理食塩水（TBS）で1:25に希釈し
た正常ブタ血清（Dakopatts、X901）を用いて非特異的
相互作用をブロッキングした後、切片を、TBS/BSAで適
切に希釈したAT120 １次抗体と一緒に一晩インキュベ
ートした。次に、２次抗体及びペルオキシダーゼ複合体
を各30分間、間にTBS中ですすいで、適用した。3,3′−
ジアミノベンジジン四塩酸（ジグマ社）で発色させた。
切片を、ハリス・ヘマトキシリンでカウンター染色し、
脱水し、カバーグラスをかけ、光学顕微鏡下で観察し
た。

AT120が、多くのNFT、局面のジストロフィーの軸索
（neurites）の染色と、分散した神経網（神経網の糸）
の染色を生じたことが、第2A図と第2B図により明白に示
された。

実施例IV:脳脊髄液試料中のタウの検出脳脊髄液試料患者からのCSF試料は、アントワープ大学病院（Unive
rsity Hospital of Antwerp）の神経学科で集めた。ル
ーチンの診断目的で行った腰椎穿刺により、全ての試料
を得た。CSF試料は、少量に分注して、使用するまで−7
5℃で凍結保存した。

患者を異なる３群に分けた:Mc Khannら（1984）の方
法に従ってADの可能性があると診断された27人の患者、
神経根障害のため腰椎穿刺を受けた精神的に健常な対照
患者、及び他の神経学的疾患（other neurological des
eases、OND）に罹患している患者。OND群は、アデノ白
質萎縮症（adenoleukodystrophy）、前頭葉変性、小脳
萎縮、オリーブ橋小脳萎縮、及び筋萎縮性側索硬化症の
ような神経変性疾患の患者を含む、炎症性、血管性、及
び他の疾患を含んでいた。各患者について年齢、性別及
び診断を記した。

AT120アッセイ無血清調整倍地からプロテインＧカラムクロマトグラ
フィーにより精製したAT120モノクローナル抗体を、コ
ーティング緩衝液中３μg/ml（10mMトリス、10mM NaC
l、10mM NaN₃、pH8.5）で、高結合マイクロタイタープ
レート［ヌンク（Nunc）、ギブコ社、Paisley、英国］
上に、４℃で一晩コーティングした。非特異的結合を減
少させるためにPBS中の10％飽和カゼイン150μｌで30分
間オーバーコーティングした後、CSF25μｌと、５％ツ
イーン20、10％飽和カゼインを含むPBS中に0.2μg/mlの
ビチオン化BT₂及び同量のHT7を含有するコンジュゲート
混合物75μｌと一緒に、このプレートをインキュベート
した。プレートを室温で一晩放置して、洗浄後、室温で
30分間、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ja
ckson）（1/15000）を添加した。

更に洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質として、0.
42mM 3,5,3′,5′−テトラメチルベンジジン、0.003％
H₂O₂（v/v）を含む100mMクエン酸、100mMリン酸水素二
ナトリウム、pH4.3を、100μｌ添加した。2M H₂SO₄溶液
50μｌで反応を停止した。450nmでタイターテク・マル
チスキャン（Titertek Multiscan）（Flow Laboratorie
s,Eflab,Oy、フィンランド）で吸光度を読んだ。

CSF試料からAT120を用いて得られた吸光度値を、既知
量の親和性精製した正常ヒトタウから作成した標準曲線
と比較し、この比較により結果をpgタウ/mlとして表す
ことができた。

これらの結果の概要を第II表にまとめ、ここに患者の
同定（ID）、診断、年齢、及びpg/ml CSFで表したタウ
値をリストした。これらの結果から、種々の神経学的疾
患に罹患した患者群（OND;平均値:26.4pg/ml）に比較し
て、対照患者のレベルが実質的に低い（平均:16.4pg/m
l）ことは明白である。アルツハイマー病の患者につい
ては、対照やOND試料よりも平均値は明らかに上昇して
いる（アルツハイマー患者の平均:50.8pg/ml）。

27pg/mlのカットオフレベルを採用する場合、対照試
験の８％が陽性であり、一方、OND群とアルツハイマー
群のこの値は各々27％と80％である。

第II表：対照患者、アルツハイマー患者（AD）及び他の
神経学的疾患（OND）により、及び年齢コホートにより
群分けした、AT120のELISAで測定した平均タウレベル。

略語:SSPE:亜急性硬化性汎脳炎、GBS:キラン−バレー症
候群、TC:髄膜結核、MS:多発性硬化症、PNP:多発性神経
障害、CVA:脳血管アミロイド症、ALS:筋萎縮性側索硬化
症、TIA:一過性脳虚血発作、OPCA:オリーブ橋小脳萎縮
症、COLD:慢性閉塞性肺疾患。

実施例V:AT120エピトープの定義 AT120はタウの全てのアイソフォームと等しく反応す
る（Goedert et al.,1989）ため、欠失マッピングのた
めに最小の組換えタウの形態を使用した。これに、欠失
の構築のため２つの部位、即ちヒトタウ34配列の155位
のSac II部位と220位のSma I部位を使用した（Goedert
et al.,1989）。最小のタウのオープン・リーディング
・フレームがマウス腫瘍壊死因子の25アミノ酸に融合し
ているmTNF−融合ベクターmpTNF（MPH）（Innogenetic
s、Ghent、ベルギー）を、Apa I−Sac IIで切断し、T₄D
NAポリメラーゼで平滑化して繋いだ。非突然変異体のバ
ックグラウンドを減少させるために、繋いだ物質をSac
IIとApa Iで切断した後、混合物をMC1061 pc I587中
に形質転換した［Casadaban ＆ Cohen,（1980）］。制
限消化と、抗タウ抗体との反応性により、選択した各ク
ローンを更に特徴付けした。

Xma I制限部位にフレーム・シフト突然変異を挿入す
るために、同一のマウスTNF融合タウベクターを使用し
た。ベクターをSma Iで切断し、T₄DNAポリメラーゼで平
滑化して、非突然変異体のバックグラウンドを減少させ
るために、繋いだ混合物を形質転換前にSma Iで再処理
した。各突然変異体の反応性パターンを、ウェスタンブ
ロットにより、AT120モノクローナル抗体で調べた。こ
れにより、第一近似として、アミノ酸155〜221の65アミ
ノ酸の領域にAT120のエピトープを局在化することがで
きた（第４図）。しかし、この領域には他の２つの抗
体、BT2（Mercken et al.,1992a）とHT7（Mercken、博
士論文）も反応性を示すため、これらのモノクローナル
抗体とAT120との間に競合結合が観察されないことを証
明する必要があった。

従って、これらの各抗体を用いて競合ELISAを行っ
た。このため、親和性精製したウサギ抗ヒトタウポリク
ローナル抗体を、コーティング緩衝液（10mMトリス、pH
8.6、10mM NaCl、10mM NaN₃）中で40℃で一晩コーティ
ングして、PBS中の0.1％カゼインでブロッキングした
後、37℃で１時間、純粋なPHF−タウ100μl/ウエルを添
加した。洗浄後、10μg/mlの濃度でAT8、BT2又はAT120
の非標識モノクローナル抗体のいずれか50μｌを添加し
て、37℃で30分間インキュベーションを続けた。次に、
ビオチン化モノクローナル抗体50μｌを添加した。実施
例IIに記載したタウのサンドイッチELISAで最大0D値の5
0％を与えるよう前もって設定した濃度で、これらの各
ビオチン化抗体を使用した。続いて37℃で１時間のイン
キュベーションの後、プレートを、実施例IIに記載した
ように更に処理した。

N.D.は吸光度が測定されなかったことを表す。

第III表に示した結果は、モノクローナル抗体AT120に
認識されるエピトープはモノクローナル抗体BT2及びAT8
に認識されるエピトープとは異なることを明白に示す。
これらの各モノクローナル抗体と一緒に、本発明のエピ
トープから誘導した配列を有する合成ノナペプチドを固
定化した固相をインキュベートし、続いて実施例Ｉの第
３節のように複合体を可視化することにより得られた、
これらの各々の反応性パターンに基づいて、AT120に認
識されるエピトープは他の各モノクローナル抗体のもの
とは異なることを確認した（第IV表及び第５図）。

第IV表固相結合ノナペプチドとのモノクローナル抗
体BT2、HT7及びAT120の反応性。

このノナペプチドは、１文字アミノ酸コードで表す。

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urol 22:521−526. 配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名:Innogenetics sa. （Ｂ）通り:Industriepark−Zwijnaarde 7,box 4 （Ｃ）市：ゲント（Ｅ）国：ベルギー（Ｆ）郵便番号（ZIP）:B−9052 （Ｇ）電話:00 32 9 241 07 11 （Ｈ）ファクシミリ:00 32 9 241 07 99 （ii）発明の名称：微小管関連タンパク質タウに対する
モノクローナル抗体、これらの抗体を分泌するハイブリ
ドーマ、これらのモノクローナル抗体による抗原認識及
びこれらの応用（iii）配列の数:3 （iv）コンピュータ読取り形態：（Ａ）媒質タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換機（Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Versio
n ＃1.25（EPO）（２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:67アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:9アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:9アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号3:

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ファンメヘレン，エーヘーンベルギー国、ベー―9810 ナザレット― エケ、テン・エデストラート 101 (72)発明者ファン・デ・フォールデ，アンドレベルギー国、ベー―9160 ローケレン、フレンストラート 22 (56)参考文献ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ, ８［２］（1989）ｐ393−399 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】それ自体ヒト大脳皮質から単離される脳ホ
モジネートから得られるタウタンパクである、ヒト正常
タウタンパク及び異常にリン酸化されたタウタンパクに
属する抗原のエピトープと免疫学的複合体を形成するモ
ノクローナル抗体であって、 −ELISAにより測定すると、タウタンパクと部分配列を
共有するMAP−１、MAP−２及び神経線維のような他のリ
ン酸化されたタンパクとは免疫学的複合体を形成せず、 −脳脊髄液（CSF）中の、1.0pg/mlという低濃度のヒト
正常タウタンパク及び異常にリン酸化されたタウタンパ
クを検出し、そして −タウタンパク陰性CSF中への一定量のタウタンパクの
添加に際し、100％の回収率で上記タウタンパクを検出
する、という事実により特徴付けられる、モノクローナル抗
体。
【請求項２】請求項１記載のモノクローナル抗体であっ
て、 −ヒトタウタンパクの下記のアミノ酸配列内に位置する
エピトープ：と免疫学的複合体を形成するという事実により特徴付け
られる、モノクローナル抗体。
【請求項３】ECACCに1992年10月８日に第92100853番と
して寄託されたハイブリドーマにより分泌される、請求
項１又は２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項記載のモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマであって、更に
詳しくはECACCに1992年10月８日に第92100853番として
寄託されたハイブリドーマ。
【請求項５】それ自体ヒト大脳皮質又はアルツハイマー
病の患者から得られる大脳皮質から単離される脳ホモジ
ネートから得られうるペプチドであって、請求項１〜３
のいずれか１項記載のモノクローナル抗体と免疫学的複
合体を形成するペプチドであって、Ｉ型及びII型のヒト
タウタンパクのアイソフォームでも、Ｉ型及びII型のヒ
トタウタンパクのアイソフォームのアミノ酸配列の44位
のLysと45位のAlaの間に以下の挿入物：を有するものでもない、ペプチド。
【請求項６】請求項１〜３のいずれか１項記載のモノク
ローナル抗体のいずれかと免疫学的複合体を形成するペ
プチドであって、 −配列番号１に示される配列の部分を含有するか、又は
該配列の部分により構成され、 −請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗
体と免疫学的複合体を形成し、該モノクローナル抗体自
体は配列番号１に示されるタウタンパク領域に位置する
エピトープと複合体を形成し、 −Ｉ型及びII型のヒトタウタンパクのアイソフォームで
も、Ｉ型及びII型のヒトタウタンパクのアイソフォーム
のアミノ酸配列の44位のLysと45のAlaの間に以下の挿入
物：を有するものでもない、ペプチド。
【請求項７】約100アミノ酸のペプチドであって、 −配列番号１に示される配列を含有し、 −配列番号１に示される配列内のペプチドと複合体を形
成する請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナ
ル抗体と免疫学的複合体を形成するペプチドの配列を含
有する、ペプチド。
【請求項８】免疫により、請求項１〜３のいずれか１項
記載のモノクローナル抗体を生成する、請求項５〜７の
いずれか１項記載のペプチド。
【請求項９】アルツハイマー病又はPHFもしくは正常タ
ウタンパクが関係する脳疾患を有する患者の脳、脳脊髄
液又は血清中に含有されるペプチドであり、請求項１〜
３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体と免疫学的
複合体を形成するペプチドであって、Ｉ型及びII型のヒ
トタウタンパクのアイソフォームでも、Ｉ型及びII型の
ヒトタウタンパクのアイソフォームのアミノ酸配列の44
位のLysと45位のAlaの間に以下の挿入物：を有するものでもない、ペプチド。
【請求項１０】請求項１〜３のいずれか１項記載のモノ
クローナル抗体を分泌する、請求項３記載のハイブリド
ーマを入手及び単離する方法であって、 −ECACCに1992年10月８日に第92100853番として寄託さ
れたモノクローナル抗体により認識される抗原を用い
て、予めインビボ免疫した動物の脾臓細胞、又は予めイ
ンビトロ免疫した動物の脾臓細胞から出発して； −ハイブリドーマ形成条件下で、上記免疫細胞を骨髄腫
細胞と融合させて；そして −請求項５〜８のいずれか１項記載の抗原のエピトープ
を特異的に認識し、上記エピトープと免疫学的複合体を
形成するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
を選択することを包含することを特徴とする方法。
【請求項１１】請求項１〜３のいずれか１項記載のモノ
クローナル抗体を製造する方法であって、 −請求項４記載の選択したハイブリドーマを適切な培地
中で培養し；そして −上記選択したハイブリドーマにより分泌されるモノク
ローナル抗体を回収すること；又はその代わりに −請求項４記載の選択したハイブリドーマをマウスの腹
腔に移植し、上記動物により腹水が産生された時、上記
腹水から形成されたモノクローナル抗体を回収することを包含する方法。
【請求項１２】アルツハイマー病のような、PHF−タウ
と正常タウタンパクの両方又は一方が関係する脳疾患の
インビトロ検出方法であって、 −アルツハイマー病又はタウタンパクもしくは異常にリ
ン酸化されたタウタンパクが関係する他の何らかの疾患
の患者から単離した界面活性剤抽出した脳ホモジネート
又はNFTの調製物を、抗原−抗体複合体を生じるのに好
適な条件下で、請求項１〜３のいずれか１項記載のモノ
クローナル抗体と接触させて；そして −上記複合体から抗原を分離して、精製された形態で、
求める抗原を回収することを包含する方法。
【請求項１３】アルツハイマー病のような、異常にリン
酸化されたタウタンパクが関係する脳疾患のインビトロ
検出方法であって、 −タウタンパクもしくはPHFが関係する神経学的疾患、
特にアルツハイマー病を疑われる患者からの脳ホモジネ
ート又は脳脊髄液又は血清の試料を、抗原−抗体複合体
を生じるのに好適な条件下で、インビトロ条件下で請求
項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗体と接
触させて；そして −上記脳ホモジネート又は脳脊髄液又は血清の試料への
上記抗体の免疫学的結合を検出することを含む方法。
【請求項１４】アルツハイマー病のような、PHF及び／
又は正常タウタンパクが関係する脳疾患のインビトロ検
出方法であって、 −正常もしくは異常にリン酸化されたタウタンパクが関
係する神経学的疾患、特にアルツハイマー病を疑われる
患者から単離した濃縮されていない脳脊髄液試料を、抗
原−抗体複合体を生じるのに好適な条件下で、インビト
ロ条件下で請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクロ
ーナル抗体と接触させて；そして −上記脳脊髄液試料への上記抗体の免疫学的結合を、好
ましくは触媒レポーター診断増強（CARD）法を適用す
る、サンドイッチELISA法により検出する工程を包含す
る方法。
【請求項１５】以下の疾患：アルツハイマー病、ダウン
症候群、ピック病、SSPE、及び正常タウタンパク質もし
くは異常にリン酸化されたタウタンパク質又は対らせん
フィラメントが関連する他の神経学的疾患：の一つをイ
ンビトロで診断するためのキットであって、 −請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル抗
体 −二次抗体であって、該抗体は、正常タウのエピトープ、もしくは異常にリン酸化された
タウタンパクのエピトープ、又は請求項５〜９のいずれ
か１項記載のいずれかのペプチドのエピトープであっ
て、請求項１〜３のいずれか１項記載のモノクローナル
抗体と免疫学的複合体を形成するエピトープとは異なる
エピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、正常タウ、もしくは異常にリン酸化されたタウ、又は請
求項５〜９のいずれか１項記載の任意のペプチドを認識
するポリクローナル抗体であって、請求項１〜３のいず
れか１項記載のモノクローナル抗体と免疫学的複合体を
形成するエピトープとは全て異なるエピトープと免疫複
合体を形成するポリクローナル抗体である −該二次抗体の特異的標識付けもしくはカップリングの
いずれかのためのマーカー −一方では、本発明のモノクローナル抗体と試験試料と
の、他方では、結合した該二次抗体と該マーカーとの免
疫学的反応を行うための緩衝液を包含することを特徴とするキット。