CN116249712A - Tau结合化合物 - Google Patents

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H·Y·钟
J·霍尔特
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Abstract

本公开提供了抗tau抗体及其载体化(例如，载体化到AAV颗粒中)。还提供了使用抗tau抗体和/或AAV颗粒预防、治疗和/或诊断神经适应症的方法。

Description

TAU结合化合物
相关申请的引用
本申请要求2020年4月15日提交的美国临时专利申请第63/010261号和2021年3月18日提交的美国临时专利申请第63/162976号的申请日权益，上面提到的申请的整个内容(包括列表中的任何序列和附图)都通过引用并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用整体并入。创建于2021年4月13目的所述ASCII副本名称为135333_01920_2057_1308_SL.txt并且大小为714,773字节。
技术领域
本公开提出了tau结合化合物和包含tau结合化合物的腺相关病毒(AAV)颗粒。
背景技术
Tau蛋白病是一组以微管相关蛋白tau的功能障碍和/或聚集为特征的神经退行性疾病。Tau通常是已知基于其磷酸化程度与微管缔合的极易溶解的蛋白。Tau被视为细胞内运输过程的关键组分，尤其是在神经元细胞中，因为它们具有独特和扩展的结构。tau的过度磷酸化会阻抑其与微管的结合和微管组装活性。此外，tau的过度磷酸化使其易于错误折叠和聚集。在tau蛋白病中，tau变得过度磷酸化，错误折叠并聚集为成对螺旋丝(PHF)、扭带或直丝的神经原纤维缠结(NFT)。这些NFT在很大程度上被视为指示即将发生的神经元细胞死亡并且被认为会促成广泛的神经元细胞损失，导致多种行为和认知缺陷。
遗传定义的tau蛋白病是在证实tau基因中的突变会导致常染色体显性遗传tau蛋白病(称为与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17))时描述的。这提供了tau变化可导致脑部神经退行性变化的证据。这些分子被视为更成淀粉样的，意味着它们更有可能变得过度磷酸化并且更有可能聚集成NFT(Hutton，M.等人，1998，Nature 393(6686)：702-5)。
已经提出了几种方法用于治疗性干扰tau病理进展和防止后续的分子和细胞后果。考虑到NFT由过度磷酸化、错误折叠和聚集形式的tau组成，则在这些阶段的每个阶段的干扰都提供了可追求的目标。引入限制磷酸化、阻断错误折叠或防止聚集的试剂是有前景的策略。还有人提出引入抗tau抗体可防止tau病理的跨神经元扩散。
仍然需要用于tau蛋白病治疗、诊断和其他应用的抗tau抗体。本公开用本文所述的相关化合物和方法解决了这种需要。
发明内容
本公开至少部分涉及用于调节tau水平(例如tau的聚集和/或分布)和/或递送，例如载体化递送与tau结合的抗体(例如抗tau抗体，例如本文所述的抗tau抗体)的组合物和方法。在一些实施方案中，使用本文所述的抗tau抗体或包含编码抗tau抗体(例如本文所述的抗tau抗体)的病毒基因组的分离的(例如重组的)AAV颗粒来降低或抑制tau的水平(例如聚集或分布)。在一些实施方案中，使用本文所述的抗tau抗体或包含编码抗tau抗体(例如本文所述的抗tau抗体)的病毒基因组的分离的(例如重组的)AAV颗粒来增加tau的降解。此类抑制和/或降解可用于治疗与tau表达相关的病症和/或神经病症，诸如tau蛋白病。
因此，在一个方面，本公开提供了一种与tau结合的分离的(例如重组的)抗体，所述抗体包含：重链可变区(VH)，所述重链可变区包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的HC CDR序列中的任一者的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和/或重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个、两个或三个；和/或轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含表1、表6、表2A-2B、表4或表5的LC CDR序列中的任一者的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和/或轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个、两个或三个。
在另一个方面，本公开提供了一种与人tau结合的分离的(例如重组的)抗体，其中所述抗体结合与参考抗体结合相同或基本上相同的表位，所述参考抗体包含VH和VL，所述VH包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，所述VL包含轻链LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中：HCCDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：315、341、410、474、529和571的氨基酸序列；HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：314、341、410、1154、529和571的氨基酸序列；或HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：316、341、410、475、530和571的氨基酸序列。
在另一个方面，本公开提供了一种与人tau结合的分离的(例如重组的)抗体，其中所述抗体与参考抗体竞争结合，其中所述参考抗体包含VH和VL，所述VH包含HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3，所述VL包含轻链LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中：HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：315、341、410、474、529和571的氨基酸序列；HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：314、341、410、1154、529和571的氨基酸序列；或HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：316、341、410、475、530和571的氨基酸序列。
在再另一方面，本公开提供了一种分离的(例如重组的)抗体，所述抗体与人tau蛋白的包含根据SEQ ID NO：920编号的残基409-436的区域结合。在一些实施方案中，所述抗体包含VH，所述VH包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中：HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3分别包含SEQ ID NO：1180、341和410的氨基酸序列；HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3分别包含SEQ IDNO：1183、1184和410的氨基酸序列；或HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3分别包含SEQ ID NO：1186、1187和1167的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含VL，所述VL包含LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中：LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：1181、1182和571的氨基酸序列；LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：1185、1182和571的氨基酸序列；或LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO：1188、528和571的氨基酸序列。
在再另一方面，本公开提供了一种抗体，所述抗体例如直接或间接地与人tau蛋白的包含根据SEQ ID NO：920编号的残基32-49、55-76、159-194、185-200、219-247、381-426和/或409-436的区域结合。
在再另一方面，本公开提供了一种分离的(例如重组的)核酸，所述核酸编码本文所述的抗体，例如包含以下的抗体：VH，所述VH包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的HC CDR序列中的任一者的HC CDR1、HC CDR2和/或HC CDR3中的一个、两个或三个；和/或VL，所述VL包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的LC CDR序列中的任一者的LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的一个、两个或三个。
在再另一方面，本公开提供了一种病毒基因组，所述病毒基因组包含有效地连接到编码与tau结合的抗体(例如，本文所述的抗tau抗体)的核酸的启动子。在一些实施方案中，所述病毒基因组还包含内部末端重复(ITR)序列(例如本文所述的ITR区)、增强子(例如本文所述的增强子)、内含子区(例如本文所述的内含子区)和/或外显子区(例如本文所述的外显子区)、polyA信号区(例如本文所述的polyA信号序列)和/或所编码的miR结合位点。
在再另一方面，本公开提供了一种分离的(例如重组的)AAV颗粒，所述AAV颗粒包含衣壳蛋白和病毒基因组，所述病毒基因组包含编码与tau结合的抗体(例如本文所述的抗tau抗体)的核酸。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白包括AAV衣壳蛋白，例如野生型AAV衣壳蛋白或其功能变体。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白包括或选自AAV9衣壳蛋白(例如野生型AAV9衣壳蛋白)、VOY101衣壳蛋白、PHP.N衣壳蛋白或PHP.B衣壳蛋白或其功能变体。
在再另一方面，本公开提供了向受试者递送与tau结合的外源抗体分子(例如，本文所述的抗tau抗体分子)的方法。所述方法包括施用有效量的本文所述的一种AAV颗粒或多种AAV颗粒，所述AAV颗粒包含本文所述的病毒基因组。
在再另一方面，本公开提供了治疗患有或被诊断为患有神经病症、tau蛋白病和/或与tau表达相关的疾病的受试者的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的一种AAV颗粒或多种AAV颗粒，所述AAV颗粒包含本文所述的病毒基因组。
在一些实施方案中，本公开提供了一种抗体，所述抗体包含(1)重链可变结构域(VH)，其中所述VH包含：包含选自由SEQ ID NO：296-339组成的组的氨基酸序列或其片段的互补决定区(CDR)H1；包含选自由SEQ ID NO：340-391组成的组的氨基酸序列或其片段的CDRH2；和包含选自由SEQ ID NO：392-456组成的组的氨基酸序列或其片段的CDRH3；和(2)轻链可变结构域(VL)，其中所述VL包含：包含选自由SEQ ID NO：457-514组成的组的氨基酸序列或其片段的CDRL1；包含选自由SEQ ID NO：515-553组成的组的氨基酸序列或其片段的CDRL2；和包含选自由SEQ ID NO：554-600组成的组的氨基酸序列或其片段的CDRL3。所述抗体可包含一组可变结构域CDR氨基酸序列，其中所述可变结构域CDR氨基酸序列组选自表6。
所述VH可以包含：包含选自由SEQ ID NO：601-643组成的组的氨基酸序列或其片段的框架区(FR)H1；包含选自由SEQ ID NO：644-696组成的组的氨基酸序列或其片段的FRH2；包含选自由SEQ ID NO：697-766组成的组的氨基酸序列或其片段的FRH3；和包含选自由SEQ ID NO：767-775组成的组的氨基酸序列或其片段的FRH4。
所述VL可以包含：包含选自由SEQ ID NO：776-822组成的组的氨基酸序列或其片段的FRL1；包含选自由SEQ ID NO：823-857组成的组的氨基酸序列或其片段的FRL2；包含选自由SEQ ID NO：858-904组成的组的氨基酸序列或其片段的FRL3；和包含选自由SEQ IDNO：905-919组成的组的氨基酸序列或其片段的FRL4。
所述VH可以包含选自由SEQ ID NO：1-74组成的组的氨基酸序列；和/或由选自由SEQ ID NO：147-220组成的组的核酸序列编码的氨基酸序列。
所述VL可以包含选自由SEQ ID NO：75-146组成的组的氨基酸序列；和/或由选自由SEQ ID NO：221-295组成的组的核酸序列编码的氨基酸序列。
所述抗体可以包含选自表3的可变结构域对。
CDRH1可以包含选自由GFTFTRY(SEQ ID NO：314)、GYTFTIF(SEQ ID NO：315)和GYTFTRF(SEQ ID NO：316)组成的组的氨基酸序列。CDRH2可以包含NPNNGG(SEQ ID NO：341)的氨基酸序列。CDRH3可以包含GTGTGAMDY(SEQ ID NO：410)的氨基酸序列。
CDRL 1可以包含选自由RSSQSLVHNNGITYLY(SEQ ID NO：1154)、RSSQSLVHSNGITHLY(SEQ ID NO：474)和RSSQSLVHSNGNTHLY(SEQ ID NO：475)组成的组的氨基酸序列。CDRL2可以包含选自由RVSNRFS(SEQ ID NO：529)和RVSSRFS(SEQ ID NO：530)组成的组的氨基酸序列。CDRL3可以包含FQGTHVPRT(SEQ ID NO：571)的氨基酸序列。
CDRH1可以包含选自由GFSLSTSAM(SEQ ID NO：325)、GFSLNTSGM(SEQ ID NO：326)、GFSLSTSGM(SEQ ID NO：321)和GFSLSTFGM(SEQ ID NO：327)组成的组的氨基酸序列。CDRH2可以包含YWDDD(SEQ ID NO：362)的氨基酸序列。CDRH3可以包含选自由RRRGYGMDY(SEQ IDNO：435)、RVRGYGMDY(SEQ ID NO：437)、RVRYYAMDY(SEQ ID NO：438)、RKRSYGMDY(SEQ IDNO：440)、RSRRGNYDY(SEQ ID NO：421)和RGYYSNGNYFDY(SEQ ID NO：432)组成的组的氨基酸序列。
CDRL1可以包含选自由KASQSVSNDVA(SEQ ID NO：495)、KSSQSLLNSGNQKNYLA(SEQID NO：496)、KSSQSLLSSGNQKNYLA(SEQ ID NO：497)、KSSQSLLDSDGKTYLN(SEQ ID NO：484)和SASSSISSTYLH(SEQ ID NO：493)组成的组的氨基酸序列。CDRL2可以包含选自由YASNRCT(SEQ ID NO：540)、GTSTRES(SEQ ID NO：542)、GASTRES(SEQ ID NO：543)、LVSKLDS(SEQ IDNO：532)和RTSNLAS(SEQ ID NO：538)组成的组的氨基酸序列。CDRL3可以包含选自由QQDYRSPLT(SEQ ID NO：587)、QNDHSHPYT(SEQ ID NO：588)、WQGTHFPQT(SEQ ID NO：576)和QQGSSIPRYT(SEQ ID NO：585)组成的组的氨基酸序列。
本公开的抗体可包括选自由单克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、抗体模拟物、单链Fv(scFv)形式和抗体片段组成的组的形式。所述抗体可包括选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM组成的组的抗体类别。所述抗体可包括小鼠IgG，其中小鼠IgG包括选自由IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3组成的组的同种型。所述抗体可包括人IgG，其中人IgG包括选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的同种型。所述抗体可包含一个或多个人恒定结构域。所述一个或多个人恒定结构域可包括人IgG恒定结构域。所述抗体可包括人源化抗体。
本公开的抗体可与tau蛋白表位结合。tau蛋白表位可包括选自由SEQ ID NO：920-926组成的组的氨基酸序列或者可包括在所述氨基酸序列内。所述抗体可与选自AT100、AT120、PT3、C10.2、PT76、IPN002、6C5和UCB D中的一种或多种的抗体竞争与tau蛋白表位结合。tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基409-436。tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基413-430。与tau蛋白表位结合的抗体可表现出约0.1nM至约0.5nM的KD。tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基55-76、159-194、219-247和/或381-426。tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基57-72、175-191、223-238和/或383-400。tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基223-238。与tau蛋白表位结合的抗体可表现出约0.5nM至约5nM的KD。tau蛋白表位可包括由至少两种tau蛋白的复合物形成的区域。所述抗体可以以约0.01nM至约100nM的半数最大有效浓度(EC50)与富集的成对螺旋丝tau蛋白(ePHF)结合。所述抗体可不与非病理性tau结合。所述抗体可与病理性tau结合。所述抗体可以以约1nM至约30nM的半数最大抑制浓度(IC50)抑制tau聚集，如通过免疫耗竭测定所确定的。可用tau RD生物传感器细胞进行免疫耗竭测定。
在一些实施方案中，本公开提供了一种与第二抗体竞争与tau蛋白表位结合的抗体，其中所述tau蛋白表位包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基32-49、55-76、57-72、159-194、175-191、185-200、219-247、223-238、381-426、383-400、409-436和413-430中的一个或多个。tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基409-436和413-430中的一个或多个。第二抗体可包括选自由以下组成的组的可变结构域对：具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的VL；和具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VH和具有SEQID NO：95的氨基酸序列的VL。
本公开的抗体可包括缀合物。所述缀合物可包括治疗剂。所述缀合物可包括可检测标记。
在一些实施方案中，本公开提供了一种编码本文公开的抗体的构建体。
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过向受试者施用本文公开的抗体来治疗受试者的治疗性适应症的方法。所述治疗性适应症可以是神经适应症。所述神经适应症可以是神经退行性疾病、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性(FTLD)、额颞叶痴呆(FTD)、慢性创伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹(PSP)、唐氏综合征(Down’ssyndrome)、皮克病(Pick’sdisease)、皮质基底节变性(CBD)、皮质基底节综合征、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、朊病毒病、克雅二氏症(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、多系统萎缩、仅缠结性痴呆、中风或进行性皮质下胶质增生。
在一些实施方案中，本公开提供了通过使用本文公开的抗体在受试者中诊断治疗性适应症的方法。所述治疗性适应症可以包括神经适应症。所述神经适应症可以是神经退行性疾病、AD、FTDP-17、FTLD、FTD、CTE、PSP、唐氏综合征、皮克病、CBD、皮质基底节综合征、ALS、朊病毒病、CJD、多系统萎缩、仅缠结性痴呆、中风或进行性皮质下胶质增生。所述抗体可用于检测受试者组织中的病理性tau。受试者组织可以包括CNS组织。受试者组织可以是薄组织切片。薄组织切片可以是冷冻保存的组织切片。
在一些实施方案中，本公开的tau结合化合物或抗体可在腺相关病毒(AAV)病毒基因组中编码。在一些实施方案中，AAV病毒基因组可包含一种或多种编码本文所述的抗体或其片段的核酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组可包含选自SEQ ID NO：1035和1036的5′反向末端重复(ITR)序列区、选自1039-1050的启动子序列区、选自1134-1136的多聚腺苷酸化(polyA)序列区和选自SEQ ID NO：1037和1038的3’ITR。
在一些实施方案中，病毒基因组可包含选自SEQ ID NO：1051-1055的一个或多个外显子序列区、选自SEQ ID NO：1056-1070的一个或多个内含子序列区、选自SEQ ID NO：1071-1089的一个或多个信号序列区、选自SEQ ID NO：1127-1133的一个或多个标签序列区和/或选自SEQ ID NO：1137和1138的一个或多个填充序列区。
在一些实施方案中，病毒基因组可具有第一核酸序列和第二核酸序列，其中第一核酸序列编码VH且第二核酸序列编码VL。在一些实施方案中，病毒基因组编码具有选自SEQID NO：1-74的氨基酸序列的VH。在一些实施方案中，病毒基因组编码具有选自SEQ ID NO：75-146的氨基酸序列的VL。在一些实施方案中，病毒基因组编码选自表3所示配对的VH和VL对。
在一些实施方案中，病毒基因组的第一核酸序列和第二核酸序列被一个或多个接头序列分开，其中所述接头序列可选自SEQ ID NO：1090-1126。
在一些实施方案中，病毒基因组包含选自SEQ ID NO：147-220的VH核酸序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含选自SEQ ID NO：221-295的VL核酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组可编码具有选自SEQ ID NO：296-600的氨基酸序列的一个或多个CDR序列。在一些实施方案中，病毒基因组可编码选自表6中概述的CDR组的一组CDR。在一些实施方案中，病毒基因组可编码选自表6中概述的CDR组对。
在一些实施方案中，病毒基因组可编码选自SEQ ID NO：601-919的一个或多个FR氨基酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组从5′至3′编码抗体重链、一个或多个接头序列和抗体轻链。在其他实施方案中，病毒基因组从5′至3′编码抗体轻链、一个或多个接头序列和抗体重链。
在一些实施方案中，本文所述的AAV病毒基因组可并入AAV颗粒中。
在一些实施方案中，所述AAV颗粒包含选自以下的AAV衣壳蛋白：VOY101、VOY201、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVP HP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、AAVPHP.N(PHP.N)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2变体、AAV2/3变体、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV9、AAV9 K449R、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVDJ、AAVDJ8、AAV2.BR1或AAV2G9衣壳蛋白或其功能变体。
在某些实施方案中，所述AAV颗粒包含VOY101衣壳。在一些实施方案中，VOY101衣壳氨基酸序列由SEQ ID NO：1023给出。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组还可包含编码miR结合位点的核苷酸序列，所述miR结合位点例如是调节，例如减少对应miRNA在其中表达的细胞或组织中由所述病毒基因组编码的有效载荷的表达的miR结合位点。
在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组还可包含所编码的miR结合位点的至少1-5个拷贝，例如至少1、2、3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，病毒基因组可包含至所编码的miR结合位点的少3个拷贝，任选地其中三个拷贝全部是针对相同的miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个或全部是针对不同的miR结合位点。
在一些实施方案中，病毒基因组还可包含编码miR122结合位点、miR183结合位点、miR-142-3p或其组合的核苷酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR122结合位点，其具有SEQ IDNO：1029的核苷酸序列或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQ ID NO：1029具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR183结合位点，其具有SEQ IDNO：1032的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQ ID NO：1032具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR-142-3p结合位点，其具有SEQID NO：1031的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQ ID NO：1031具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR结合位点的至少4个拷贝，任选地其中四个拷贝全部包含相同的miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个、三个或全部包含不同的miR结合位点。
在一些实施方案中，本文公开的AAV颗粒可以配制成药物组合物。
本公开提供了通过向受试者施用药物组合物在受试者中产生抗体的方法。
本公开还提供了通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物来预防或治疗受试者的tau蛋白病的方法。所述药物组合物可以通过任何施用途径施用，所述施用途径包括但不限于静脉内、肌内、脑实质内、脑室内、小脑延髓池内(ICM)、鞘内或其组合。
可通过本公开的方法和/或组合物治疗的tau蛋白病包括但不限于AD、FTDP-17、FTLD、FTD、CTE、PSP、唐氏综合征、皮克病、CBD、皮质基底节综合征、ALS、朊病毒病、CJD、多系统萎缩、仅缠结性痴呆和进行性皮质下胶质增生。
本领域的技术人员将认识到或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。此类等效方案旨在被以下列举的实施方案所涵盖。
列举的实施方案
E1.一种与人tau结合的分离的例如重组的抗体，其中所述抗体结合与参考抗体结合相同或基本上相同的表位，所述参考抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，所述轻链可变区(VL)包含轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，其中：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO：315、341、410、474、529和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：314、341、410、1154、529和571的氨基酸序列；或，
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：316、341、410、475、530和571的氨基酸序列。
E2.一种与人tau结合的分离的例如重组的抗体，其中所述抗体与参考抗体竞争结合，其中所述参考抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，所述轻链可变区(VL)包含轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，其中：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO：315、341、410、474、529和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：314、341、410、1154、529和571的氨基酸序列；或，
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：316、341、410、475、530和571的氨基酸序列。
E3.如实施方案E1或E2所述的抗体，其中所述参考抗体包含：
(i)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列的VL；
(ii)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列的VL；或，
(iii)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列的VL。
E4.如实施方案E1-E3中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合与所述参考抗体识别的表位重叠的表位。
E5.如实施方案E1-E4中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人tau蛋白的包含根据SEQ ID NO：920编号的残基409-436的区域结合。
E6.如实施方案E1-E5中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人tau蛋白的包含根据SEQ ID NO：920编号的残基413-430的区域结合。
E7.如实施方案E1-E6中任一项所述的抗体，所述抗体以约0.1至约10nM或约0.2-5nM的解离常数(KD)与tau蛋白结合。
E8.如实施方案E1-E7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含分别包含以下氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的至少一个、两个或三个：
(i)分别为SEQ ID NO：1180、341和410；
(ii)分别为SEQ ID NO：1183、1184和410；或
(iii)分别为SEQ ID NO：1186、1187和1167。
E9.如实施方案E1-E8中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含以下的LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的一个、两个或三个：
(i)分别为SEQ ID NO：1181、1182和571；
(ii)分别为SEQ ID NO：1185、1182和571；或，
(iii)分别为SEQ ID NO：1188、528和571。
E10.如实施方案E1-E9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO：315、341、410、474、529和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：1147、1148、410、474、529和571的氨基酸序列；或
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：1168、1169、1167、1170、528和571的氨基酸序列。
E11.如实施方案E1-E9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO：314、341、410、1154、529和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：1144、1145、410、1146、529和571的氨基酸序列；或
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：1165、1166、1167、473、528和571的氨基酸序列。
E12.如实施方案E1-E9中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO：316、341、410、475、530和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：1149、1150、410、475、530和571的氨基酸序列；或
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：1171、1166、1167、1172、528和571的氨基酸序列。
E13.如实施方案E1-E12中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
(i)VH，其包含SEQ ID NO：21-23的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)VL，其包含SEQ ID NO：93-95的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E14.一种分离的例如重组的抗体，所述抗体与人tau蛋白的包含根据SEQ ID NO：920编号的残基409-436的区域结合，并且其中所述抗体包含：
(i)VH，其包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，其中：
(a)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3分别包含SEQ ID NO：1180、341和410的氨基酸序列；
(b)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3分别包含SEQ ID NO：1183、1184和410的氨基酸序列；或
(c)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3分别包含SEQ ID NO：1186、1187和1167的氨基酸序列；以及
(ii)VL，其包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中：
(a)所述LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3分别包含SEQ ID NO：1181、1182和571的氨基酸序列；
(b)所述LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3分别包含SEQ ID NO：1185、1182和571的氨基酸序列；或，
(c)所述LC CDR1、LC CDR2、LC CDR3分别包含SEQ ID NO：1188、528和571的氨基酸序列。
E15.一种抗体，所述抗体例如直接或间接地与人tau蛋白的包含根据SEQ ID NO：920编号的残基32-49、55-76、159-194、185-200、219-247、381-426和/或409-436的区域结合。
E16.如实施方案E14或E15所述的抗体，所述抗体结合人tau蛋白的包含根据SEQID NO：920编号的残基55-76、159-194、219-247和/或381-426的区域。
E17.如实施方案E14或E15所述的抗体，所述抗体结合人tau蛋白的包含根据SEQID NO：920编号的残基57-72、175-191、223-238和/或383-400的区域。
E18.如实施方案E14或E15所述的抗体，所述抗体结合人tau蛋白的包含根据SEQID NO：920编号的残基223-238的区域。
E19.如实施方案E14-E17中任一项所述的抗体，所述抗体结合包含根据SEQ IDNO：920编号的残基55-76、159-194、219-247和381-426的构象表位。
E20.如实施方案E15-E19中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)VH，其包含分别包含SEQ ID NO：325、362和435的氨基酸序列的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3；和/或VL，其包含分别包含SEQ ID NO：495、540和587的氨基酸序列的LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3；
(ii)VH，其包含分别包含SEQ ID NO：1152、1153和435的氨基酸序列的HC CDR1、HCCDR2和HC CDR3；和/或VL，其包含分别包含SEQ ID NO：495、540和587的氨基酸序列的LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3；
(iii)VH，其包含分别包含SEQ ID NO：1173、1174和1175的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或VL，其包含分别包含SEQ ID NO：1176、1177和587的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
E21.如实施方案E14-E20中任一项所述的抗体，所述抗体以约0.1至约1nM的解离常数(KD)与tau蛋白结合。
E22.一种与tau结合的分离的例如重组的抗体，所述抗体包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的HC CDR序列中的任一者的HC CDR1、HC CDR2和/或HC CDR3中的一个、两个或三个；和/或
(ii)轻链可变区(VL)，其包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的LC CDR序列中的任一者的LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的一个、两个或三个。
E23.如实施方案E22所述的抗体，所述抗体包含VH，其包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5中的抗体中的任一者的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。
E24.如实施方案E22或E23所述的抗体，所述抗体包含VL，其包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5中的抗体中的任一者的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
E25.如实施方案E22-E24中任一项所述的抗体，所述抗体包含：VH，其包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5中的抗体中的任一者的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和VL，其包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5中的抗体中的所述任一者的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
E26.如实施方案E22-E25中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)分别包含SEQ ID NO：931或932、341和410的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或
(ii)分别包含SEQ ID NO：933或934、935或936和571的氨基酸序列的LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3。
E27.如实施方案E22-E26中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)分别包含SEQ ID NO：1180、341和410的氨基酸序列的HC DR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1181、1182和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；
(ii)分别包含SEQ ID NO：1183、1184和410的氨基酸序列的HC DR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1185、1182和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或
(iii)分别包含SEQ ID NO：1186、1187和1167的氨基酸序列的HC DR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1188、528和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。
E28.如实施方案E22-E27中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)分别包含SEQ ID NO：315、341和410的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：474、529和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；
(ii)分别包含SEQ ID NO：1147、1148和410的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：474、529和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或
(iii)分别包含SEQ ID NO：1168、1169和1167的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1170、528和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。
E29.如实施方案E22-E27中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)分别包含SEQ ID NO：314、341和410的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1154、529和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；
(ii)分别包含SEQ ID NO：1144、1145和410的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO1146、529和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或
(iii)分别包含SEQ ID NO：1165、1166和1167的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：473、528和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。
E30.如实施方案E22-E27中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)分别包含SEQ ID NO：316、341和410的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：475、530和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；
(ii)分别包含SEQ ID NO：1149、1150和410的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：475、1151和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或
(iii)分别包含SEQ ID NO：1171、1166和1167的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1172、528和571的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。
E31.如实施方案E22-E27中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)分别包含SEQ ID NO：325、362和435的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：495、540和587的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；
(ii)分别包含SEQ ID NO：1152、1153和435的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：495、540和587的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或
(iii)分别包含SEQ ID NO：1173、1174和1175的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1176、1177和587的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
E32.如实施方案E22-E27中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)分别包含SEQ ID NO：304、347和400的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：464、523和562的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；
(ii)分别包含SEQ ID NO：1142、1143和400的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：464、523和562的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或
(iii)分别包含SEQ ID NO：1160、1161和1162的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1163、1164和562的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
E33.如实施方案E22-E27中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)分别包含SEQ ID NO：299、343和395的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：460、518和557的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；
(ii)分别包含SEQ ID NO：1140、1141和395的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：460、518和557的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3；或
(iii)分别包含SEQ ID NO：1155、1156和1157的氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3；和/或分别包含SEQ ID NO：1158、1159和557的氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。
E34.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)重链框架区1(FRH1)、重链框架区2(FRH2)、重链框架区3(FRH3)和/或重链框架区4(FRH4)中的一个、两个、三个或全部，所述重链框架区包含表7或表4中提供的所述抗体的重链框架区中的任一者的氨基序列；或
(ii)重链框架区1(FRH1)、重链框架区2(FRH2)、重链框架区3(FRH3)和/或重链框架区4(FRH4)中的一个、两个、三个或全部，所述重链框架区包含相对于表7或表4中提供的所述抗体的重链框架区中的任一者的氨基酸序列，具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列。
E35.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)包含SEQ ID NO：603的氨基酸序列的FRH1、包含SEQ ID NO：664的氨基酸序列的FRH2、包含SEQ ID NO：718的氨基酸序列的FRH3和/或包含SEQ ID NO：771的氨基酸序列的FRH4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：603、664、718和/或771的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列；
(ii)包含SEQ ID NO：619的氨基酸序列的FRH1、包含SEQ ID NO：663的氨基酸序列的FRH2、包含SEQ ID NO：717的氨基酸序列的FRH3和/或包含SEQ ID NO：771的氨基酸序列的FRH4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：619、663、717和/或771的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列；
(iii)包含SEQ ID NO：603的氨基酸序列的FRH1、包含SEQ ID NO：665的氨基酸序列的FRH2、包含SEQ ID NO：719的氨基酸序列的FRH3和/或包含SEQ ID NO：771的氨基酸序列的FRH4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：603、665、719和/或771的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列；
(iv)包含SEQ ID NO：633的氨基酸序列的FRH1、包含SEQ ID NO：682的氨基酸序列的FRH2、包含SEQ ID NO：745的氨基酸序列的FRH3和/或包含SEQ ID NO：771的氨基酸序列的FRH4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：663、682、745和/或771的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列。
(v)包含SEQ ID NO：608的氨基酸序列的FRH1、包含SEQ ID NO：652的氨基酸序列的FRH2、包含SEQ ID NO：705的氨基酸序列的FRH3和/或包含SEQ ID NO：767的氨基酸序列的FRH4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：608、652、705和/或767的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列；或，
(vi)包含SEQ ID NO：604的氨基酸序列的FRH1、包含SEQ ID NO：647的氨基酸序列的FRH2、包含SEQ ID NO：700的氨基酸序列的FRH3和/或包含SEQ ID NO：770的氨基酸序列的FRH4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：604、647、700和/或770的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列。
E36.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)轻链框架区1(FRL1)、轻链框架区2(FRL2)、轻链框架区3(FRL3)和/或轻链框架区4(FRL4)中的一个、两个、三个或全部，所述轻链框架区包含表7或表4中提供的所述抗体的轻链框架区中的任一者的氨基序列；或
(ii)轻链框架区1(FRL1)、轻链框架区2(FRL2)、轻链框架区3(FRL3)和/或轻链框架区4(FRL4)中的一个、两个、三个或全部，所述轻链框架区包含相对于表7或表4中提供的所述抗体的轻链框架区中的任一者的氨基酸序列，具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列。
E37.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)包含SEQ ID NO：793的氨基酸序列的FRL1、包含SEQ ID NO：836的氨基酸序列的FRL2、包含SEQ ID NO：874的氨基酸序列的FRL3和/或包含SEQ ID NO：910的氨基酸序列的FRL4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：793、836、874和/或910的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列；
(ii)包含SEQ ID NO：1178的氨基酸序列的FRL1、包含SEQ ID NO：831的氨基酸序列的FRL2、包含SEQ ID NO：1179的氨基酸序列的FRL3和/或包含SEQ ID NO：906的氨基酸序列的FRL4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：1178、831、1179和/或906的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列；
(iii)包含SEQ ID NO：787的氨基酸序列的FRL1、包含SEQ ID NO：831的氨基酸序列的FRL2、包含SEQ ID NO：870的氨基酸序列的FRL3和/或包含SEQ ID NO：906的氨基酸序列的FRL4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：787、831、870和/或906的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列；或
(iv)包含SEQ ID NO：807的氨基酸序列的FRL1、包含SEQ ID NO：830的氨基酸序列的FRL2、包含SEQ ID NO：888的氨基酸序列的FRL3和/或包含SEQ ID NO：908的氨基酸序列的FRL4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：807、830、888和/或908的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列。
(v)包含SEQ ID NO：783的氨基酸序列的FRL1、包含SEQ ID NO：830的氨基酸序列的FRL2、包含SEQ ID NO：866的氨基酸序列的FRL3和/或包含SEQ ID NO：906的氨基酸序列的FRL4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：783、830、866和/或906的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列；或，
(vi)包含SEQ ID NO：779的氨基酸序列的FRL1、包含SEQ ID NO：825的氨基酸序列的FRL2、包含SEQ ID NO：861的氨基酸序列的FRL3和/或包含SEQ ID NO：908的氨基酸序列的FRL4中的一个、两个、三个或全部；或相对于SEQ ID NO：779、825、861和/或908的氨基酸序列中的每一个具有至少一个、两个或三个但不超过四个修饰例如取代的氨基酸序列。
E38.如实施方案E22-E37中任一项所述的抗体，所述抗体包含VH，其包含：
(i)表3或表4中提供的任何VH的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)对表3或表4中提供的任何VH的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
(iii)由表3或表4中提供的任何VH的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
E39.如实施方案E22-E38中任一项所述的抗体，所述抗体包含VH，其包含：
(i)SEQ ID NO：4、9、21-23或51的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)对SEQ ID NO：4、9、21-23或51的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或，
(iii)由SEQ ID NO：150、155、167-169或197的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
E40.如前述实施方案中任一项所述的分离的抗体，所述抗体包含VH，其从N端至C端包含：
(i)包含表7中抗体的任何FRH1的氨基酸序列的FRH1；
(ii)包含表6或表5中所述抗体的HC CDR1的氨基酸序列的HC CDR1；
(iii)包含表7或表4中所述抗体的FRH2的氨基酸序列的FRH2；
(iv)包含表6或表5中所述抗体的HC CDR2的氨基酸序列的HC CDR2；
(v)包含表7或表4中所述抗体的FRH3的氨基酸序列的FRH3；
(vi)包含表6或表5中所述抗体的HC CDR3的氨基酸序列的HC CDR3；和
(vii)包含表7或表4中所述抗体的FRH4的氨基酸序列的FRH4。
E41.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含VH，其从N端至C端包含FRH1、HC CDR1、FRH2、HC CDR2、FRH3、HC CDR3和FRH4，其中：
(i)所述FRH1、HC CDR1、FRH2、HC CDR2、FRH3、HC CDR3、FRH4分别包含SEQ ID NO：603、315、664、341、718、410和771的氨基酸序列；
(ii)所述FRH1、HC CDR1、FRH2、HC CDR2、FRH3、HC CDR3、FRH4分别包含SEQ ID NO：619、314、663、341、717、410和771的氨基酸序列；
(iii)所述FRH1、HC CDR1、FRH2、HC CDR2、FRH3、HC CDR3、FRH4分别包含SEQ IDNO：603、316、665、341、719、410和771的氨基酸序列；
(vi)所述FRH1、HC CDR1、FRH2、HC CDR2、FRH3、HC CDR3、FRH4分别包含SEQ ID NO：663、325、682、362、745、435和771的氨基酸序列。
(v)所述FRH1、HC CDR1、FRH2、HC CDR2、FRH3、HCDR3、FRH4分别包含SEQ ID NO：608、304、652、347、705、400和767的氨基酸序列；或，
(vi)所述FRH1、HC CDR1、FRH2、HC CDR2、FRH3、HC CDR3、FRH4分别包含SEQ ID NO：604、299、647、343、700、395和770的氨基酸序列。
E42.如实施方案E22-E41中任一项所述的抗体，其中编码所述VH的核苷酸序列包含表3或表4中提供的任何VH的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
E43.如实施方案E22-E42中任一项所述的抗体，其中编码所述VH的核苷酸序列包含SEQ ID NO：150、155、167-169或197的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
E44.如实施方案E22-E43中任一项所述的抗体，所述抗体包含VL，其包含：
(i)表3或表4中提供的任何VL的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)对表3或表4中提供的任何VL的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
(iii)由表3或表4中提供的任何VL的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
E45.如实施方案E22-E44中任一项所述的抗体，所述抗体包含VL，其包含：
(i)SEQ ID NO：78、83、93-95或122的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)对SEQ ID NO：78、83、93-95或122的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
(iii)由SEQ ID NO：224、229、241-243或270的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
E46.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含VL，其从N端至C端包含：
(i)包含表7或表4中抗体的任何FRL1的氨基酸序列的FRL1；
(ii)包含表6或表5中所述抗体的LC CDR1的氨基酸序列的LC CDR1：
(iii)包含表7或表4中所述抗体的FRL2的氨基酸序列的FRL2；
(iv)包含表6或表5中所述抗体的LC CDR2的氨基酸序列的LC CDR2；
(v)包含表7或表4中所述抗体的FRL3的氨基酸序列的FRL3；
(vi)包含表6或表5中所述抗体的LC CDR3的氨基酸序列的LC CDR3；和
(vii)包含表7或表4中所述抗体的FRL4的氨基酸序列的FRL4。
E47.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含VL，其从N端至C端包含FRL1、LC CDR1、FRL2、LC CDR2、FRL3、LC CDR3和FRL4，其中：
(i)所述FRL1、LC CDR1、FRL2、LC CDR2、FRL3、LC CDR3、FRL4分别包含SEQ ID NO：793、474、836、529、874、571和910的氨基酸序列；
(ii)所述FRL1、LC CDR1、FRL2、LC CDR2、FRL3、LC CDR3、FRL4分别包含SEQ ID NO：1178、1154、831、529、1179、571和906的氨基酸序列；
(iii)所述FRL1、LC CDR1、FRL2、LC CDR2、FRL3、LC CDR3、FRL4分别包含SEQ IDNO：787、475、831、530、870、571和906的氨基酸序列；
(iv)所述FRL1、LC CDR1、FRL2、LC CDR2、FRL3、LC CDR3、FRL4分别包含SEQ ID NO：807、495、830、540、888、587和908的氨基酸序列。
(v)所述FRL1、LC CDR1、FRL2、LC CDR2、FRL3、LC CDR3、FRL4分别包含SEQ ID NO：SEQ ID NO：783、464、830、523、866、562和906的氨基酸序列；或，
(vi)所述FRL1、LC CDR1、FRL2、LC CDR2、FRL3、LC CDR3、FRL4分别包含SEQ ID NO：779、460、825、518、861、557和908的氨基酸序列。
E48.如实施方案E22-E47中任一项所述的抗体，其中编码所述VL的核苷酸序列包含表3或表4中提供的任何VL的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
E49.如实施方案E22-E48中任一项所述的抗体，其中编码所述VL的核苷酸序列包含SEQ ID NO：224、229、241-243或270的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
E50.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)VH，其包含：
(a)表3或表4中提供的任何VH的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(b)对表3或表4中提供的任何VH的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
(c)由表3或表4中提供的任何VH的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；和
(ii)VL，其包含：
(a)表3或表4中提供的任何VL的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(b)对表3或表4中提供的任何VL的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；或
(c)由表3或表4中提供的任何VL的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
E51.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含表3和表4中提供的抗体的任何VH的氨基酸序列，和表3或表4中提供的所述抗体的VL的氨基酸序列。
E52.如实施方案E22-E28和E34-E51中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)VH，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)VL，其包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E53.如实施方案E22-E27、E29和E34-E51中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)VH，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)VL，其包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E54.如实施方案E22-E27、E30和E34-E51中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)VH，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)VL，其包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E55.如实施方案E22-E27、E31和E44-E51中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)VH，其包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)VL，其包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E56.如实施方案E22-E27、E32和E44-E51中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)VH，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)VL，其包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E57.如实施方案E22-E27和E33-E51中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)VH，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和
(ii)VL，其包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E58.如前述实施方案中任一项所述的抗体，其中编码所述抗体的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO：150的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列，和/或SEQ ID NO：224的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；
(ii)SEQ ID NO：155的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或SEQ ID NO：229的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；
(iii)SEQ ID NO：167的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或SEQ ID NO：241的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；
(iv)SEQ IDNO：168的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或SEQ ID NO：242的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；
(v)SEQ ID NO：169的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或SEQ ID NO：243的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；或
(vi)SEQ ID NO：197的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或SEQ ID NO：270的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
E59.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体是全长抗体、双特异性抗体、Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv片段(scFv)。
E60.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含选自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4、鼠IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG2c和鼠IgG3的重链恒定区；和/或选自κ或λ轻链恒定区的轻链恒定区。
E61.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含：重链恒定区，所述重链恒定区包含表X中提供的重链恒定区的氨基酸或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或轻链恒定区，所述轻链恒定区包含表X中提供的轻链恒定区的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E62.如前述实施方案中任一项所述的抗体，其中编码所述重链恒定区的所述核苷酸序列包含表X中提供的重链恒定区的氨基酸或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列，和/或编码所述轻链恒定区的所述核苷酸序列包含表X中提供的轻链恒定区的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
E63.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)包含表3或表4中提供的任何VH的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的VH，和包含表X中提供的重链恒定区的氨基酸序列的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链恒定区；和/或
(ii)包含表3或表4中提供的任何VL的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的VL，和包含表X中提供的轻链恒定区的氨基酸序列的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链恒定区。
E64.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体包含：
(i)包含SEQ ID NO：4、9、21-23或51的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的VH，和包含表X中提供的重链恒定区的氨基酸序列的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的重链恒定区；和/或
(ii)包含SEQ ID NO：78、83、93-95或122的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的VL，和包含表X中提供的轻链恒定区的氨基酸序列的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链恒定区。
E65.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体结合tau蛋白的C端，例如根据SEQ ID NO：920编号的残基409-436。
E66.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体结合tau蛋白的微管结合结构域。
E67.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体结合tau蛋白的富脯氨酸结构域。
E68.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体以小于约120nM的解离常数(KD)(例如，通过Octet测量的，例如，如实施例8中所述)与tau蛋白结合。
E69.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体以约0.1nM至约0.5nM的KD与tau蛋白结合。
E70.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体能够以约0.5nM至约5nM的KD与tau蛋白结合。
E71.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体能够以约5nM至约30nM的KD与tau蛋白结合。
E72.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体结合包含至少一个、两个、三个或更多个磷酸化残基，例如根据SEQ ID NO：920编号的残基T212、T217、S396、S404、S409或其组合的tau蛋白。
E73.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体例如以约0.01nM至约100nM的半数最大有效浓度(EC50)结合富集的成对螺旋丝tau蛋白(ePHF)。
E74.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体减少例如抑制tau的聚集。
E75.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体以约1nM至约30nM的半数最大抑制浓度(IC50)抑制tau的聚集，例如，通过免疫耗竭测定(例如用tauRD生物传感器细胞)测量的，例如如实施例6中所述。
E76.如前述实施方案中任一项所述的抗体，所述抗体结合包含由至少两种tau蛋白的复合物例如tau二聚体形成的区域的表位。
E77.一种抗体，所述抗体与如前述实施方案中任一项所述的抗体竞争与tau结合。
E78.一种抗体，所述抗体与同如前述实施方案中任一项所述的抗体的表位相同的表位、基本上相同的表位，或与如前述实施方案中任一项所述的抗体的表位重叠的表位结合。
E79.一种编码如前述实施方案中任一项所述的抗体的分离的例如重组的核酸。
E80.一种编码与tau结合的抗体的分离的例如重组的核酸，其中所述抗体包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5中抗体的HC CDR1、HCCDR2和/或HC CDR3中的至少一个、两个或三个；和/或
(ii)轻链可变区(VL)，其包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5中所述抗体的LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个或三个。
E81.如实施方案E80所述的核酸，其中：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO：315、341、410、474、529和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：314、341、410、1154、529和571的氨基酸序列；
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：316、341、410、475、530和571的氨基酸序列；
(iv)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：325、362、435、495、540和587的氨基酸序列；
(v)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO：304、347、400、464、523和562的氨基酸序列；或，
(vi)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO：299、343、395、460、518和557的氨基酸序列。
E82.如实施方案E80所述的核酸，其中所述抗体包含：
(i)VH，其包含表3或表4中提供的任何VH的氨基酸序列，与表3或表4中提供的任何VH具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或对表3或表4中提供的任何VH的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；和/或
(ii)VL，其包含表3或表4中提供的任何VL的氨基酸序列，与表3或表4中提供的任何VL具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或对表3或表4中提供的任何VL的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。
E83.如实施方案E80-E82中任一项所述的核酸，其中所述抗体包含：
(i)VH，其包含SEQ ID NO：4、9、21-23或51的氨基酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或对SEQ ID NO：4、9、21-23或51的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；和/或
(ii)VL，其包含SEQ ID NO：78、83、93-95或122的氨基酸序列或与之具有70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或对SEQ ID NO：78、83、93-95或122的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。
E84.如实施方案E80-E83中任一项所述的核酸，其中所述抗体包含：
(i)重链恒定区，其包含表X中提供的重链恒定区的氨基酸，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)轻链恒定区，其包含表X中提供的轻链恒定区的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
E85.如实施方案E80-E84中任一项所述的核酸，所述核酸包含：
(i)表3或表4中提供的任何VH的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或
(ii)表3或表4中提供的任何VL的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
E86.如实施方案E80-E85中任一项所述的核酸，所述核酸包含：
(i)SEQ ID NO：150、155、167-169或197的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或
(ii)SEQ ID NO：224、229、241-243或270的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
E87.如实施方案E79-E86中任一项所述的分离的核酸序列，其中编码所述重链可变区和/或所述轻链可变区的所述核酸序列是密码子优化的。
E88.一种由如实施方案E79-E87中任一项所述的核酸编码的分离的例如重组的抗体。
E89.一种载体，所述载体包含如实施方案E79-E87中任一项所述的核酸，或编码如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体的核酸。
E90.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如实施方案E79-E87中任一项所述的核酸，编码如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体的核酸，或如实施方案E89所述的载体(例如，表达载体)。
E91.如实施方案E90所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是昆虫细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞。
E92.一种产生抗体的方法，所述方法包括在适于基因表达的条件下培养如实施方案E90或E91所述的宿主细胞。
E93.一种编码有效载荷的分离的核酸，其中所编码的有效载荷包含如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体。
E94.如实施方案E93所述的核酸，所述核酸还编码信号序列，任选地，其中编码所述信号序列的所述核苷酸序列包含表14中列出的信号序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
E95.如实施方案E93-E94中任一项所述的核酸，所述核酸还编码第二信号序列，任选地，其中编码所述信号序列的所述核苷酸序列包含表14中列出的信号序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
E96.如实施方案E93-E95中任一项所述的核酸，其中：
(i)编码所述信号序列的核苷酸序列相对于编码所述VH的所述核苷酸序列位于5′；和/或
(ii)编码所述信号序列的核苷酸序列相对于编码所述VL的所述核苷酸序列位于5′。
E97.如实施方案E93-E96中任一项所述的核酸，其中所编码的VH和VL的序列是直接连接的，例如没有接头。
E98.如实施方案E93-E97中任一项所述的核酸，其中所编码的VH和VL的序列是经由接头连接的。
E99.如实施方案E98所述的核酸，其中所述接头包含表15中提供的接头序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
E100.如实施方案E93-E99中任一项所述的核酸，其中所编码的有效载荷是全长抗体、双特异性抗体、Fab、F(ab′)2、Fv、单链Fv片段(scFv)、单结构域抗体或骆驼抗体。
E101.一种病毒基因组，所述病毒基因组包含有效地连接至编码包含如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体的有效载荷的所述核酸的启动子。
E102.如实施方案E101所述的病毒基因组，其中所述启动子：
(i)选自人延伸因子1α-亚基(EF1α)、巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)或泛素C(UBC)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板源性生长因子B链(PDGF-β)、细胞间粘附分子2(ICAM-2)、突触蛋白(Syn)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻链(NFL)或重链(NFH)、β-球蛋白微基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)或其片段，例如其截短物或功能变体；和/或
(ii)包含表11中提供的启动子序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％同一性的核苷酸序列。
E103.如实施方案E101-E102中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含增强子，任选地，其中所述增强子是CMV立即早期(CMVie)增强子。
E104.如实施方案E101-E103中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含多聚腺苷酸化(polyA)信号区。
E105.如实施方案E104中任一项所述的病毒基因组，其中所述polyA信号区包含SEQ ID NO：1134-1136中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％同一性的核苷酸序列。
E106.如实施方案E101-E105中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含反向末端重复(ITR)序列。
E107.如实施方案E106所述的病毒基因组，其中：
(i)所述ITR序列相对于所编码的有效载荷位于5′；和/或
(ii)所述ITR序列相对于所编码的有效载荷位于3′。
E108.如实施方案E101-E107中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组包含相对于所编码的有效载荷位于5′的ITR序列和相对于所编码的有效载荷位于3′的ITR序列。
E109.如实施方案E101-E108中任一项所述的病毒基因组，其中所述ITR序列包含SEQ ID NO：1035-1038中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的核苷酸序列。
E110.如实施方案E101-E109中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含内含子区。
E111.如实施方案E110所述的病毒基因组，其中所述内含子区包含表13中列出的内含子区中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％同一性的核苷酸序列。
E112.如实施方案E101-E111中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组包含至少一个、两个或三个内含子区。
E113.如实施方案E101-E112中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含外显子区。
E114.如实施方案E113所述的病毒基因组，其中所述外显子区包含表12中的外显子序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％同一性的核苷酸序列。
E115.如实施方案E101-E114中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组包含至少一个、两个或三个外显子区。
E116.如实施方案E101-E115中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含Kozak序列，任选地，其中所述Kozak序列包含GCCGCCACCATG(SEQ ID NO：1079)或GAGGAGCCACC(SEQ ID NO：1089)的核苷酸序列。
E117.如实施方案E101-E116中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含编码miR结合位点的核苷酸序列，所述miR结合位点例如是调节，例如减少所述对应miRNA在其中表达的细胞或组织中由所述病毒基因组编码的所述有效载荷的表达的miR结合位点。
E118.如实施方案E117所述的病毒基因组，所述病毒基因组包含所编码的miR结合位点的至少1-5个拷贝，例如至少1、2、3、4或5个拷贝。
E119.如实施方案E117-E118中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组包含所编码的miR结合位点的至少3个拷贝，任选地，其中三个拷贝全部包含相同的miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个或全部包含不同的miR结合位点。
E120.如实施方案E117-E119中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组包含所编码的miR结合位点的至少4个拷贝，任选地，其中四个拷贝全部包含相同的miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个、三个或全部包含不同的miR结合位点。
E121.如实施方案E117-E120中任一项所述的病毒基因组，其中所编码的miR结合位点包含miR122结合位点、miR183结合位点、miR-142-3p或其组合，任选地，其中：
(i)所编码的miR122结合位点包含SEQ ID NO：1029的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQ ID NO：1029具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列；
(ii)所编码的miR183结合位点包含SEQ ID NO：1032的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQ ID NO：1032具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列；和/或
(iii)所编码的miR-142-3p结合位点包含SEQ ID NO：1031的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQ ID NO：1031具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列。
E122.如实施方案E101-E121中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组是单链的。
E123.如实施方案E101-E122中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含编码Rep蛋白例如非结构蛋白的核苷酸序列，其中所述Rep蛋白包含Rep78蛋白、Rep68、Rep52蛋白和/或Rep40蛋白。
E124.如实施方案E123所述的病毒基因组，其中所述Rep78蛋白、所述Rep68蛋白、所述Rep52蛋白和/或所述Rep40蛋白由至少一个Rep基因编码。
E125.如实施方案E101-E124中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含编码衣壳蛋白例如结构蛋白的核酸序列，其中所述衣壳蛋白包含VP1多肽、VP2多肽和/或VP3多肽。
E126.如实施方案E125所述的病毒基因组，其中所述VP1多肽、所述VP2多肽和/或所述VP3多肽由至少一个Cap基因编码。
E127.一种载体，所述载体包含实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组。
E128.一种分离的例如重组的AAV颗粒，所述AAV颗粒包含：
(i)衣壳蛋白，和
(ii)如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的核酸，或如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组。
E129.如实施方案E128所述的分离的AAV颗粒，其中：
(i)所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1003的氨基酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
(ii)所述衣壳蛋白包含对SEQ ID NO：1003的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；
(iii)所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO：1011的氨基酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
(iv)所述衣壳蛋白包含对SEQ ID NO：1011的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；
(v)所述衣壳蛋白包含由SEQ ID NO：1002的核苷酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码的氨基酸序列；和/或
(vi)编码所述衣壳蛋白的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1002的核苷酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。
E130.如实施方案E128或E129所述的分离的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含：
(i)根据SEQ ID NO：1003编号的位置K449处的氨基酸取代，例如K449R取代；
(ii)包含TLAVPFK(SEQ ID NO：1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地，其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO：1003编号的参考序列紧接在位置588之后存在；
(iii)根据SEQ ID NO：1003编号的位置587处的除“A”以外的氨基酸和/或位置588处的除“Q”以外的氨基酸；和/或
(iv)根据SEQ ID NO：1003编号的A587D和/或Q588G的氨基酸取代。
E131.如实施方案E128-E130中任一项所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含(i)根据SEQ ID NO：1003编号的K449R的氨基酸取代；和(ii)包含TLAVPFK(SEQ ID NO：1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地，其中所述插入片段紧接在SEQ ID NO：1003的位置588之后存在。
E132.如实施方案E128-E130中任一项所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含(i)根据SEQ ID NO：1003编号的K449R的氨基酸取代；(ii)包含TLAVPFK(SEQ ID NO：1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地，其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO：1003编号的参考序列，紧接在位置588之后存在；和(iii)根据SEQ ID NO：1003编号的A587D和Q588G的氨基酸取代。
E133.如实施方案E128-E130中任一项所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含(i)包含TLAVPFK(SEQ ID NO：1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地，其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO：1003编号的参考序列紧接在位置588之后存在；和(ii)根据SEQ ID NO：1003编号的A587D和Q588G的氨基酸取代。
E134.如实施方案E128-E133中任一项所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含表9中列出的衣壳蛋白中的任一者或其功能变体。
E135.如实施方案E128-E134中任一项所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含VOY101、VOY201、AAVPHP.B(PHP.B)、AAV PHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH 1.1-32、AAV TH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPH P.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AA VPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、AAVPHP.N(PHP.N)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2变体、AAV2/3变体、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV9、AAV9 K449R、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVDJ、AAVDJ8或AAV2G9衣壳蛋白或其功能变体。
E136.如实施方案E128-E135中任一项所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含VOY101衣壳蛋白。
E137.如实施方案E136所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含：
(i)SEQ ID NO：1023的氨基酸序列或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列；
(ii)相对于SEQ ID NO：1023的氨基酸序列包含至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰例如取代的氨基酸序列；或，
(iii)由SEQ ID NO：1022的核苷酸序列或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
E138.如实施方案E136或E137所述的AAV颗粒，其中编码所述衣壳蛋白的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1022的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
E139.如实施方案E128-E138中任一项所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含：
(i)VP1多肽、VP2多肽、VP3多肽或其组合；
(ii)对应于SEQ ID NO：1023的位置138-743例如VP2的氨基酸序列，或与之具有至少80％(例如至少约85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列；
(iii)对应于SEQ ID NO：1023的位置203-743例如VP3的氨基酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列；和/或
(iv)对应于SEQ ID NO：1023的位置1-743例如VP1的氨基酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。
E140.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的核酸、如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组或如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒，任选地，其中所述宿主细胞是昆虫细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞。
E141.一种核酸，所述核酸编码如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组和适于所述病毒基因组在细胞例如细菌细胞中复制的骨架区(例如，其中所述骨架区包含细菌复制起点和选择标记中的一种或两种)。
E142.一种制备病毒基因组的方法，所述方法包括：
(i)提供包含如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组的核酸分子；并且
(ii)从所述骨架区切除所述病毒基因组，例如通过裂解在所述病毒基因组的上游和下游的所述核酸分子。
E143.一种制备分离的例如重组的AAV颗粒的方法，所述方法包括
(i)提供如实施方案E140所述的包含所述病毒基因组的宿主细胞；并且
(ii)在适于将所述病毒基因组包封在衣壳蛋白例如VOY101衣壳蛋白中的条件下孵育所述宿主细胞；
从而制备所述分离的AAV颗粒。
E144.如实施方案E143所述的方法，所述方法还包括在步骤(i)之前将包含所述病毒基因组的第一核酸分子引入所述宿主细胞中。
E145.如实施方案E143或E144所述的方法，其中所述宿主细胞包含编码衣壳蛋白例如VOY101衣壳蛋白的第二核酸。
E146.如实施方案E143-E144中任一项所述的方法，其中在所述第一核酸分子之前、同时或之后将所述第二核酸分子引入所述宿主细胞中。
E147.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体，如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒，或包含如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒，或如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的分离的核酸，和药学上可接受的赋形剂。
E148.一种将与tau结合的外源抗体递送至受试者的方法，所述方法包括施用有效量的如实施方案S1所述的药物组合物、如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒例如多种AAV颗粒，或包含如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒例如多种AAV颗粒，或如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的分离的核酸。
E149.如实施方案E148所述的方法，其中所述受试者患有、已被诊断患有与tau表达相关的疾病或处于患与tau表达相关的疾病的风险中。
E150.如实施方案E148或E149所述的方法，其中所述受试者患有、已被诊断患有神经病症例如神经退行性病症，或处于患神经病症例如神经退行性病症的风险中。
E151.如实施方案E148、E149或E150所述的方法，其中所述受试者患有、已被诊断患有与tau蛋白病或处于患tau蛋白病的风险中。
E152.一种治疗患有或被诊断患有与tau表达相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案E147所述的药物组合物、如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒例如多种AAV颗粒，或包含如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒例如多种AAV颗粒，或如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的分离的核酸。
E153.一种治疗患有或被诊断患有神经病症例如神经退行性病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案E147所述的药物组合物、如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒例如多种AAV颗粒，或包含如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒例如多种AAV颗粒，或如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的分离的核酸。
E154.一种治疗患有或被诊断患有tau蛋白病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案E147所述的药物组合物、如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒例如多种AAV颗粒，或包含如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒例如多种AAV颗粒，或如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的分离的核酸。
E155.如实施方案E152-E154中任一项所述的方法，其中所述与Tau表达相关的疾病、所述神经病症或所述tau蛋白病包括AD、FTDP-17、FTLD、FTD、CTE、PSP、唐氏综合征、皮克病、CBD、皮质基底节综合征、ALS、朊病毒病、CJD、多系统萎缩、仅缠结性痴呆或进行性皮质下胶质增生。
E156.如实施方案E152-E155中任一项所述的方法，其中治疗包括预防所述受试者中所述疾病的进展。
E157.如实施方案E152-E156中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
E158.如实施方案E152-E157中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒经静脉内、肌内、经由脑实质内施用、脑室内、经由小脑延髓池内(ICM)注射、鞘内、经由聚焦超声(FUS)例如联合微泡静脉内施用(FUS-MB)或MRI引导的FUS联合静脉内施用来向所述受试者施用。
E159.如实施方案E152-E158中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒经静脉内施用于所述受试者。
E160.如实施方案E152-E158中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒经由小脑延髓池内注射(ICM)施用于所述受试者。
E161.如实施方案E152-E160中任一项所述的方法，所述方法还包括评价，例如测量受试者中，例如所述受试者的细胞或组织中生成的抗体的水平。
E162.如实施方案E152-E161中任一项所述的方法，其中所述施用引起在所述受试者中，例如在所述受试者的细胞或组织中生成0.001ug/mL至100mg/mL的抗体。
E163.如实施方案E162所述的方法，其中所述细胞是神经元细胞。
E164.如实施方案E162所述的方法，其中所述组织是中枢神经系统组织，例如脑组织。
E165.如实施方案E152-E164中任一项所述的方法，所述方法还包括进行血液测试、成像测试、CNS样品活检或水性脑脊髓液活检。
E166.如实施方案E161-E165中任一项所述的方法，其中在用所述AAV颗粒例如所述多种AAV颗粒处理之前、期间或之后测量抗体水平。
E167.如实施方案E152-E166中任一项所述的方法，其中所述受试者的抗体水平高于参考水平，例如尚未接受治疗，例如尚未施用所述AAV颗粒或所述多种AAV颗粒的受试者。
E168.如实施方案E152-E167中任一项所述的方法，其中所述多种AAV颗粒以约1x106VG/mL至约1x1016VG/mL或约0.0001mg/kg至约100mg/kg的剂量施用。
E169.如实施方案E152-E168中任一项所述的方法，所述方法还包括施用适于治疗或预防与tau表达相关的病症、神经病症例如神经退行性病症的附加治疗剂和/或疗法。
E170.如实施方案E169所述的方法，其中所述附加治疗剂和/或疗法包括胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐(donepezil)、卡巴拉汀(rivastigmine)和/或加兰他敏(galantamine))、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂(例如，美金刚)、抗精神病药、抗焦虑药、抗惊厥剂、多巴胺激动剂(例如，普拉克索(pramipexole)、罗匹尼罗(ropinirole)、罗替戈汀(rotigotine)和/或阿扑吗啡(apomorphine))、MAO B抑制剂(例如，司来吉兰(selegiline)、雷沙吉兰(rasagiline)和/或沙芬酰胺(safinamide))、儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂(恩他卡朋(entacapone)、奥匹卡朋(opicapone)和/或托卡朋(tolcapone))、抗胆碱能药(例如，苯托品(benztropine)和/或苯海索(trihexyphenidyl))、金刚烷胺、卡比多巴-左旋多巴(carbidopa-levodopa)、脑深部模拟(DBS)或其组合。
E171.如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的核酸、如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组、如实施方案E147所述的药物组合物或如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒，其用于制造药物。
E172.如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的核酸、如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组、如实施方案E147所述的药物组合物或如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒，其用于治疗与tau表达相关的疾病。
E173.如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的核酸、如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组、如实施方案E147所述的药物组合物或如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒，其用于治疗神经病症例如神经退行性病症。
E174.如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的核酸、如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组、如实施方案E147所述的药物组合物或如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒，其用于治疗tau蛋白病。
E175.有效量的如实施方案E1-E78和E88中任一项所述的抗体、如实施方案E79-E87和E93-E100中任一项所述的核酸、如实施方案E101-E126中任一项所述的病毒基因组、如实施方案E147所述的药物组合物或如实施方案E128-E139中任一项所述的AAV颗粒在制造用于治疗受试者的与tau表达相关的疾病、神经病症(例如神经退行性病症)或tau蛋白病的药物中的用途。
附图说明
图1A-1B示出了所选抗体V0004、V0009、V0022、V0023、V0024和V0052的可变轻链或VL(图1A)和可变重链或VH(图1B)区的比对，其中根据Kabat编号系统突出显示了CDR序列。Kabat编号系统下的对应框架区序列，包括FRH1-FRH4和FRL1-FRL4，由CDR区的边界限定。
图2A-2B示出了所选抗体V0004、V0009、V0022、V0023、V0024和V0052的可变轻链(图2A)和可变重链(图2B)的比对，其中根据Chothia编号系统突出显示了CDR序列。由CDR区的边界限定Chothia编号系统下的对应框架区序列，包括FRH1-FRH4和FRL1-FRL4。
图3A-3B示出了所选抗体V0004、V0009、V0022、V0023、V0024和V0052的可变轻链(图3A)和可变重链(图3B)的比对，其中根据IMGT编号系统突出显示了CDR序列。由CDR区的边界限定IMGT编号系统下的对应框架区序列，包括FRH1-FRH4和FRL1-FRL4。
具体实施方式
I.组合物
在一些实施方案中，本公开提供了与人微管相关蛋白tau相互作用的组合物。此类组合物可以是结合tau蛋白表位的抗体，本文称为“抗tau抗体”。在一类称为tau蛋白病的神经退行性疾病中发现tau的功能障碍和/或聚集。Tau过度磷酸化导致聚集并阻抑tau依赖性微管组装。在tau蛋白病中，tau聚集物形成在神经原纤维缠结(NFT)中发现的成对螺旋丝(PHF)。这些聚集物导致神经元损失和认知下降。本公开的抗tau抗体可用于治疗和/或诊断tau蛋白病，以及本文所述的其他应用。
抗体
在一些实施方案中，本公开的化合物(例如，抗tau抗体)和组合物包括抗体或其片段。在一些实施方案中，本文所述的抗体结合tau。例如，抗体与tau上的表位，例如确认表位、磷酸化表位或线性表位，例如如本文所述。
如本文所用，术语“抗体”以最广泛的含义提及并且具体地涵盖各种实施方案，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如由至少两种完整抗体形成的双特异性抗体)、单链Fv(scFv)形式和抗体片段(诸如Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv等)，只要它们表现出所需的功能或生物活性。抗体主要是基于氨基酸的分子，但也可包括一种或多种修饰(包括但不限于添加糖部分、荧光部分、化学标签等)。
本公开的抗体(包括其抗原结合片段)可包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、双链抗体、线性抗体、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab’)2片段、Fv片段、由Fab表达文库产生的片段、可变结构域、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如本发明抗体的抗Id抗体)、细胞内制备的抗体(即胞内抗体)、密码子优化的抗体、scFv片段、串联scFv抗体、双特异性T细胞接合物、mAb2抗体，嵌合抗原受体(CAR)、四价双特异性抗体、生物合成抗体、天然抗体、微型化抗体、单抗体(unibody)、大抗体(maxibody)和以上任一者的表位结合片段。
在一些实施方案中，抗体包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列。抗体可包括例如全长成熟抗体和抗体的抗原结合片段。例如，抗体可包括重(H)链可变结构域序列(本文缩写为VH)和轻(L)链可变结构域序列(本文缩写为VL)。在另一个示例中，抗体包括两个重(H)链可变结构域序列和两个轻(L)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点，诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(例如scFv)、单可变结构域抗体、双链抗体(Dab)(二价和双特异性)及可以通过修饰全抗体而产生的嵌合(例如人源化)抗体或使用重组DNA技术从头合成的那些抗体。这些功能抗体片段保留了与它们的相应抗原或受体选择性结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何抗体类别，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，以及来自任何抗体亚类(例如，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3)。本公开的抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体也可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或体外生成的抗体。抗体可具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体还可以具有选自例如κ或λ的轻链。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含其功能片段或变体。抗体的恒定区可以改变，例如突变，以修改抗体的特性(例如增加或减少以下的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数目、效应细胞功能或补体功能)。
如本文所用，术语“抗体片段”是指完整抗体或其融合蛋白的一部分，在一些情况下该部分包括至少一个抗原结合区。抗原结合片段的示例包括：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单条臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的双链抗体(dAb)片段；(vi)骆驼或骆驼化可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)；和(viii)单结构域抗体。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且可以针对实用性以与完整抗体相同的方式来筛选片段。抗体片段也可并入单结构域抗体、大抗体、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体、v-NAR和双scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology 23：1126-1136，2005)。”在一些实施方案中，木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点。还产生了残留“Fc”片段，其名称反映了它容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合点并且仍能够交联抗原的F(ab’)2片段。本公开的抗体可以包括这些片段中的一种或多种，并且可以例如通过酶促消化完整抗体或通过重组表达而生成。
在一些实施方案中，抗体可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。示例包括但不限于重链抗体、天然无轻链的抗体、源自常规4-链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除源自抗体的那些以外的单结构域支架。单结构域抗体可以是本领域的任何抗体，或未来的任何单结构域抗体。单结构域抗体可源自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。根据本发明的另一方面，单结构域抗体是称为无轻链的重链抗体的天然存在的单结构域抗体。此类单结构域抗体公开于例如WO 9404678中。为清楚起见，这种源自天然无轻链的重链抗体的可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其区别于四链免疫球蛋白的常规VH。此类VHH分子可以源自骆驼科物种中，例如在骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和原驼中产生的抗体。除骆驼科以外的其他物种可以产生天然无轻链的重链抗体；此类VHH在本发明的范围内。
“天然抗体”通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。编码抗体重链和轻链的基因是已知的，并且已经很好地表征和描述了构成每条链的片段(Matsuda，F.等人，1998.The Journal ofExperimentalMedicine.188(11)；2151-62和Li，A.等人，2004.Blood.103(12：4602-9，其各自的内容通过引用整体并入本文)。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫连键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，后面是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
如本文所用，术语“可变结构域”是指在抗体重链和轻链两者上发现的特异性抗体结构域，其在抗体之间的序列差异很大，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。在一些实施方案中，本文所述的抗体的VH区和VL区可细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，散布有保守性更高，称为骨架区(FR)的区域。
如本文所用，术语“高变区”是指可变结构域内包含负责抗原结合的氨基酸残基的区域。高变区内存在的氨基酸决定互补决定区(CDR)的结构，互补决定区(CDR)成为抗体的抗原结合位点的一部分。
如本文所用，术语“CDR”是指包括与其靶抗原或表位互补的结构的抗体区域。CDR区通常赋予抗原特异性和结合亲和力。可变结构域的不与抗原相互作用的其他部分各自称为“框架区”(FR)。抗原结合位点(也称为抗原结合位点或互补位)包括与特定抗原相互作用所必需的氨基酸残基。构成抗原结合位点的确切残基可以通过CDR分析来确定。
如本文所用，术语“CDR分析”是指用于确定哪些抗体可变结构域残基构成CDR的任何方法。框架区和CDR的范围已经通过许多方法精确限定(参见Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.DepartmentofHealth and Human Services，NIH公开号91-3242；Chothia，C.等人(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；及Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。通常参见，例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody VariableDomains.在：Antibody Engineering Lab Manual中(编辑：Duebel，S.和Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。CDR分析可通过与结合抗原的共结晶法进行。在一些实施方案中，CDR分析可包括基于与其他抗体的比较的计算评估(Strohl，W.R.TherapeuticAntibody Engineering.Woodhead Publishing，Philadelphia PA.2012.第3章第47-54页，其内容通过引用整体并入本文)。CDR分析和/或精确的氨基酸序列边界可包括使用编号方案，包括但不限于由Kabat[Wu，T.T.等人，1970，JEM，132(2)：211-50and Johnson，G.等人，2000，Nucleic Acids Res.28(1)：214-8，其各自的内容通过引用整体并入本文]、Chothia[Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196，901(1987)，Chothia等人，Nature 342，877(1989)，和Al-Lazikani，B.等人，1997，J.Mol.Biol.273(4)：927-48，其各自的内容通过引用整体并入本文]、Lefranc(Lefranc，M.P.等人，2005，Immunome Res.1：3)和Honegger(Honegger，A.和Pluckthun，A.2001.J.Mol.Biol.309(3)：657-70，其内容通过引用整体并入本文)教授的那些编号方案。在一些实施方案中，根据Chothia编号方案定义的CDR有时也称为高变环。
例如，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变区(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
根据Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。
通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。
对于本发明的某些抗体，基于Kabat、Chothia和IMGT编号系统的等同CDR序列和框架区序列可以至少基于本文描述的表和序列容易地获得，所述表和序列提供了分别基于Kabat、Chothia和IMGT编号系统的等同CDR区的SEQ ID NO：。还参见图1A-3B。
一般而言，VH结构域和VL结构域各具有三个CDR。按照沿可变结构域多肽从N端到C端移动时出现的顺序，VL CDR在本文中称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。按照沿可变结构域多肽从N端到C端移动时出现的顺序，VH CDR在本文中称为CDRH1、CDRH2和CDRH3。每个CDR都具有有利的规范结构，CDRH3除外，其包括在抗体之间的序列和长度上高度可变的氨基酸序列，从而在抗原结合结构域中产生多种三维结构(Nikoloudis，D.等人，2014.PeerJ.2：e456)。在一些情况下，可以在一组相关抗体中对CDRH3进行分析以评估抗体多样性。确定CDR序列的各种方法是本领域已知的，并且可以应用于已知的抗体序列(Strohl，W.R.TherapeuticAntibody Engineering.Woodhead Publishing，Philadelphia PA.2012.第3章第47-54页，其内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，VH结构域和VL结构域各自具有位于CDR区之前、之后和之间的四个框架区(FR)。VH框架区在本文中称为FRH1、FRH2、FRH3和FRH4，VL框架区在本文中称为FRL1、FRL2、FRL3和FRL4。在一些实施方案中，在VH结构域上，FR和CDR从N端到C端的顺序为FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FR H4。在一些实施方案中，在VL结构域上，FR和CDR从N端到C端的顺序为FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4。
在一些实施方案中，本公开的抗体的抗原结合结构域是抗体的包含决定簇的部分，所述决定簇形成与tau多肽或其表位结合的界面。关于蛋白质(或蛋白质模拟物)，抗原结合位点通常包括形成与tau多肽结合的界面的一个或多个环(具有至少四个氨基酸或氨基酸模拟物)。通常，抗体的抗原结合位点包括至少一个或两个CDR和/或高变环，或更通常地包括至少三个、四个、五个或六个CDR和/或高变环。
在还有其他实施方案中，抗体具有重链恒定区，选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的人重链恒定区，或IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3的鼠重链恒定区。在另一个实施方案中，抗体具有选自例如κ或λ的(例如鼠或人)轻链恒定区的轻链恒定区。
恒定区可以改变，例如突变，以修改抗体的特性(例如增加或减少以下的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数目、效应细胞功能和/或补体功能)。在一些实施方案中，抗体具有：效应子功能；并且可以固定补体。在其他实施方案中，抗体不募集效应细胞；或固定补体。在其他实施方案中，抗体结合Fc受体的能力降低或不能结合Fc受体。例如，它是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如，它具有诱变或缺失的Fc受体结合区。
改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。通过用不同的残基置换抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基，可以产生功能改变，例如对效应子配体(诸如细胞上的FcR)或补体的C1组分的亲和力改变的抗体(参见例如EP 388,151 A1、美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，其全部内容特此通过引用并入)。可以描述相似类型的改变，如果将其应用于鼠科动物或其他物种的免疫球蛋白，将减少或消除这些功能。
如本文所用，术语“Fv”是指包括抗体上形成完整抗原结合位点所需的最小片段的抗体片段。这些区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。Fv片段可通过蛋白水解裂解生成，但在很大程度上是不稳定的。用于生成稳定的Fv片段的重组方法是本领域已知的，通常通过在轻链可变结构域和重链可变结构域之间插入柔性接头(以形成单链Fv(scFv)]或通过在重链可变结构域和轻链可变结构域之间引入二硫桥(Strohl，W.R.Therapeutic Antibody Engineering.Woodhead Publishing，Philadelphia PA.2012.第3章第46-47页，其内容通过引用整体并入本文)。
来自任何脊椎动物物种抗体“轻链”可基于其恒定结构域的氨基酸序列分配为两种明显不同的类型(称为κ和λ)中的一种。取决于它们重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体可以分配为不同的类别。
如本文所用，术语“单链Fv”或“scFv”是指VH和VL抗体结构域的融合蛋白，其中这些结构域通过柔性肽接头连接在一起形成单多肽链。在一些实施方案中，Fv多肽接头使scFv能够形成抗原结合所需的结构。在一些实施方案中，scFv连同噬菌体展示、酵母展示或其他展示方法一起利用，其中它们可以与表面成员(例如噬菌体外壳蛋白)联合表达并用于鉴定针对给定抗原的高亲和力肽。在一些实施方案中，本公开的抗体制备为scFvFc抗体。术语“scFvFc”是指包括一个或多个scFv与抗体Fc结构域的融合体的抗体形式。
术语“嵌合抗体”是指具有源自两种或更多种来源的部分的抗体。嵌合抗体可以包括源自不同物种的部分。例如，嵌合抗体可以包括具有小鼠可变结构域和人恒定结构域的抗体。嵌合抗体的其他示例和用于产生它们的方法包括在以下描述的那些中的任一者：Morrison，S.L.，Transfectomas provide novel chimericantibodies.Science.1985Sep20；229(4719)：1202-7；Gillies，S.D.等人，High-levelexpression ofchimeric antibodies using adapted cDNA variable regioncassettes.JImmunolMethods.1989年12月20日；125(1-2)：191-202.；和美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816,397，其各自的内容通过引用整体并入本文。
术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括在同一多肽链中与轻链可变结构域VL连接的重链可变结构域VH。通过使用太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双链抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中有更全面的描述，其各自的内容通过引用整体并入本文。
术语“胞内抗体”是指未从其产生的细胞中分泌，而是靶向一种或多种胞内蛋白的抗体形式。胞内抗体可用于影响多种细胞过程，包括但不限于细胞内运输、转录、翻译、代谢过程、增殖信号传导和细胞分裂。在一些实施方案中，本发明的方法可包括基于胞内抗体的疗法。在一些此类实施方案中，本文公开的可变结构域序列和/或CDR序列可以并入一个或多个构建体中用于基于胞内抗体的疗法。在一些情况下，本发明的胞内抗体可以靶向一种或多种糖化细胞内蛋白，或者可以调节一种或多种糖化细胞内蛋白与替代蛋白之间的相互作用。
如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工受体，其经工程化以在免疫效应细胞的表面上表达，导致此类免疫效应细胞特异性靶向表达以高亲和力与人工受体结合的实体的细胞。CAR可以设计成包括抗体、抗体可变结构域和/或抗体CDR的一个或多个区段，使得当此类CAR在免疫效应细胞上表达时，免疫效应细胞结合并清除被CAR的抗体部分识别的任何细胞。在一些情况下，CAR设计成特异性结合癌细胞，导致癌细胞的免疫调节清除。
本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的细胞(或克隆)群体获得的抗体，即，除在产生单克隆抗体期间可出现的可能变体之外(此类变体通常以少量存在)，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。
修饰语“单克隆”表明抗体的特性是由基本上同源的抗体群体获得的，并且不应理解为需要通过任何特定方法产生抗体。
在一些实施方案中，抗体包含其中可变区或其一部分(例如CDR)是在非人生物体(例如大鼠或小鼠)中生成的抗体的氨基酸序列。包括嵌合抗体、CDR移植抗体和人源化抗体在内的抗体在本发明范围内。包含在非人生物体例如大鼠或小鼠中生成，然后例如在可变框架区或恒定区中进行修饰以降低在人中的抗原性的抗体序列的抗体在本发明范围内。
本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而所述一条或多条链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的对应序列相同或同源。
本公开的抗体可以来自任何动物来源，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物和昆虫。哺乳动物抗体可以是例如人、鼠(例如小鼠或大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、牛或马来源的。
在一些实施方案中，本公开的抗体可以是抗体模拟物。术语“抗体模拟物”是指模拟抗体的功能或作用并且与它们的分子靶标特异性地并且以高亲和力结合的任何分子。在一些实施方案中，抗体模拟物可以是，设计成并入纤连蛋白III型结构域(Fn3)作为蛋白质支架的单体(monobody)(US 6,673,901；US 6,348,584)。在一些实施方案中，抗体模拟物可以是本领域已知的那些，包括但不限于亲和体(affibody)分子、affitin、anticalin、avimer、DARPin、Fynomer和Kunitz及结构域肽。在其他实施方案中，抗体模拟物可包括一个或多个非肽区。
如本文所用，术语“抗体变体”是指在结构、序列和/或功能上类似于抗体，但在其氨基酸序列、组成或结构上与另一抗体或天然抗体相比包括一些差异的生物分子。
多特异性抗体
在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体分子，例如，该抗体包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同的蛋白质(或多聚体蛋白的亚基))上。在一些实施方案中，第一表位和第二表位重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位不重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白的不同亚基))上。在一些实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。在一些实施方案中，抗tau抗体是多特异性抗体。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一些实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原(例如，相同的蛋白质(或多聚体蛋白的亚基))上。在一些实施方案中，第一表位和第二表位重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位不重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原(例如不同的蛋白质(或多聚体蛋白的不同亚基))上。在一些实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一些实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段和对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。在一些实施方案中，抗tau抗体是双特异性抗体。
在一些实施方案中，本公开的抗体的序列可以由使用本领域已知的方案产生的双特异性抗体或异二聚体抗体生成；包括但不限于例如，在例如US5731168中描述的“旋钮入孔”方法；如例如WO 09/089004、WO 06/106905和WO 2010/129304中描述的静电转向Fc配对；如例如WO 07/110205中描述的链交换工程化结构域(SEED)异二聚体形成；如例如WO08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中描述的Fab臂交换；双抗体缀合物，例如使用具有胺反应性基团和巯基反应性基团的异双功能试剂通过抗体交联生成双特异性结构，如例如US4433059中所述；双特异性抗体决定簇，其通过将来自不同抗体的半抗体(重链-轻链对或Fab)通过两条重链之间的二硫键的还原和氧化循环重组而生成，如例如US 4444878中所述；三功能抗体，例如通过磺酰基反应性基团交联的三个Fab′片段，如例如US5273743中所述；生物合成结合蛋白，例如通过C端尾，优选通过二硫化物或胺反应性化学交联进行交联的一对scFV，如例如US5534254中所述；双功能抗体，例如通过已经置换恒定结构域的亮氨酸拉链(例如c-fos和c-jun)二聚化的具有不同结合特异性的Fab片段，如例如US5582996中所述；双特异性和寡特异性单价和低价受体，例如通过一个抗体的CH1区和另一个抗体的VH区之间的多肽间隔区连接的两个抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区，通常具有相关的轻链，如例如US5591828中所述；双特异性DNA-抗体缀合物，例如通过双链DNA碎片交联抗体或Fab片段，如例如US5635602中所述；双特异性融合蛋白，例如含有两个在它们之间具有亲水性螺旋肽接头的scFv和完整恒定区的表达构建体，如例如US5637481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如具有带Ig重链可变区的结合区的第一结构域和带Ig轻链可变区的结合区的第二结构域的多肽二聚体，通常称为双链抗体(也公开了更高级的结构，产生双特异性、三特异性或四特异性分子，如例如US5837242中所述；具有连接的VL链和VH链的微型抗体构建体，VL链和VH链进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区，微型抗体构建体可以二聚化以形成双特异性/多价分子，如例如US5837821中所述；以任一取向用短的肽接头(例如，5或10个氨基酸)或根本没有接头连接的VH和VL结构域，其可以形成二聚体以形成双特异性双链抗体；三聚体和四聚体，如例如US5844094中所述；通过肽连键与C端的可交联基团连接的VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的链段，其进一步与VL结构域缔合以形成一系列FV(或scFv)，如例如US5864019中所述；以及具有通过肽接头连接的VH和VL结构域的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双链抗体型形式形成例如同型二价、异型二价、三价和四价结构，如例如US5869620中所述。
抗体开发
根据本公开的抗体可以使用本领域中的标准方法开发。两种一抗制备技术是免疫接种和抗体展示技术。在任一情况下，基于对特定靶标或表位的亲和力从更大的候选物库中鉴定所需抗体。免疫应答的特征在于生物体的细胞、组织和/或器官对外来实体的存在的反应。此类免疫应答通常导致生物体产生一种或多种针对外来实体(例如抗原或抗原的一部分)的抗体。
抗原
抗体可以例如使用任何天然存在的或合成的抗原来开发(例如，通过免疫接种)或选择(例如，从候选库中选择)。如本文所用，“抗原”是在生物体中诱导或引起免疫应答的实体并且也可以指抗体结合配偶体。免疫应答的特征在于生物体的细胞、组织和/或器官对外来实体的存在的反应。此类免疫应答通常导致生物体产生一种或多种针对外来实体的抗体。在一些实施方案中，抗原包括tau蛋白。
如本文所用，术语“tau蛋白”是指包括微管相关蛋白tau或其肽片段的蛋白或蛋白复合物。Tau蛋白可包括富集的成对螺旋丝tau蛋白(ePHF)，也称为“肌氨酰不溶性tau”或其片段。tau蛋白可包括一个或多个磷酸化残基。此类磷酸化残基可以对应于与疾病相关的tau蛋白(本文也称为“病理性tau”)。
免疫接种
在一些实施方案中，可以通过用感兴趣的抗原为宿主免疫接种来制备抗体。可以用抗原性蛋白为宿主动物(例如，小鼠、兔、山羊或美洲驼)免疫接种以引发与抗原特异性结合的淋巴细胞。可以收集淋巴细胞并使其与永生化细胞系融合以生成杂交瘤，可以将杂交瘤在合适的培养基中培养以促进生长(例如，参见Kohler，G.等人，Continuous culturesof fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature.1975Aug 7；256(5517)：495-7，其内容通过引用整体并入本文)。可替代地，淋巴细胞可以在体外免疫接种。
可以使用合适的融合剂(例如，聚乙二醇)将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(例如，参见Goding，J.W.，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice.Academic Press.1986；59-1031，其内容通过引用整体并入本文)。永生化细胞系可以是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、兔、牛或人来源的骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，所述培养基通常包括一种或多种抑制未融合细胞的生长或存活的物质。例如，可以使用缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)的亲本细胞，并且可以为所得杂交瘤细胞的培养基补充次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)以防止HGPRT缺陷(未融合)细胞的生长。
永生化细胞系的期望特性可以包括但不限于有效融合，支持所选产生抗体的细胞的高水平抗体表达，以及对未融合的细胞抑制培养基(例如HAT培养基)的敏感性。在一些实施方案中，永生化细胞系是鼠骨髓瘤细胞系。此类细胞系可以例如从索尔克研究所细胞分配中心(San Diego，CA)或美国模式培养物保藏中心(Manassas，VA)获得。人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系也可用于产生人单克隆抗体(例如，参见Kozbor，D.等人，A humanhybrid myeloma for production of human monoclonal antibodies.J Immunol.1984年12月；133(6)：3001-5and Brodeur，B.等人，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications.Marcel Dekker，Inc.，New York.1987；33：51-63，其各自的内容通过引用整体并入本文)。
可以测定杂交瘤细胞培养基中具有所需结合特异性的单克隆抗体的存在。测定可以包括但不限于免疫沉淀测定、体外结合测定、放射免疫测定(RIA)、表面等离振子共振(SPR)测定和/或酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一些实施方案中，单克隆抗体的结合特异性可以通过Scatchard分析确定(Munson，P.J.等人，Ligand：a versatile computerizedapproach for characterization of ligand-binding systems.Anal Biochem.1980年9月1日；107(1)：220-39，其内容通过引用整体并入本文)。
可以分析培养的杂交瘤所产生的抗体以确定对靶抗原的结合特异性。一旦鉴定了具有期望特征的抗体，就可以通过有限稀释程序亚克隆对应的杂交瘤并通过标准方法使其生长。杂交瘤产生的抗体可以使用标准的免疫球蛋白纯化程序分离和纯化，例如蛋白A-琼脂糖，羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法。可替代地，杂交瘤细胞可以作为腹水在哺乳动物体内生长。在一些实施方案中，抗体可以直接从免疫宿主的血清中分离。
在一些实施方案中，可以制备通过免疫接种生成的重组型式的抗体。此类抗体可以使用来自所选杂交瘤的基因组抗体序列制备。杂交瘤基因组抗体序列可以通过从产生抗体的杂交瘤细胞中提取RNA分子并通过逆转录酶聚合酶链式反应(PCR)产生cDNA而获得。PCR可用于使用对抗体重链和轻链具有特异性的引物扩增cDNA。然后可以将PCR产物亚克隆到质粒中用于序列分析。可以通过将所得抗体序列插入表达载体中而产生抗体。一些重组抗体可以使用合成的核酸构建体来制备，所述合成的核酸构建体编码与从分离的杂交瘤抗体获得的氨基酸序列对应的氨基酸序列。
抗体展示
在一些实施方案中，可以使用抗体展示技术来开发抗体。“展示技术”是指用于以一种形式表达基于氨基酸的候选化合物的系统和方法，在该形式中，基于氨基酸的候选化合物与编码它们的核酸连接并且可接近靶标或配体。在大多数系统中，候选化合物在宿主衣壳或细胞的表面表达，然而，存在一些无宿主的系统(例如，核糖体展示)。展示技术可用于生成展示“文库”，其包括多组候选化合物文库成员。具有抗体(或其变体或片段)作为文库成员的展示文库在本文中称为“抗体展示文库”。可以通过使用抗体展示文库筛选靶抗原来设计、选择或优化抗体。抗体展示文库可包括数百万至数十亿的成员，每个成员表达独特的抗体结构域。展示的抗体片段可以是scFv抗体片段，其是通过柔性接头连接的VH和VL抗体结构域的融合蛋白。展示文库可以包括在可变结构域框架区和CDR之间具有不同水平的多样性的抗体片段。展示文库抗体片段CDR可以包括独特的可变环长度和/或序列。从展示文库选择获得的抗体可变结构域或CDR可以直接并入到用于产生重组抗体的抗体序列中，或者突变并用于通过体外亲和力成熟进一步优化。
抗体展示文库可包括抗体噬菌体展示文库。抗体噬菌体展示文库利用噬菌体病毒颗粒作为宿主，具有数百万至数十亿的成员，每个成员表达独特的抗体结构域。此类文库可以提供丰富多样的来源，所述来源可以用于选择潜在地数百种对一种或多种感兴趣的抗原具有不同亲和力水平的抗体片段(McCafferty等人，1990.Nature.348：552-4；Edwards，B.M.等人，2003.JMB.334：103-18；Schofield，D.等人，2007.Genome Biol.8，R254和Pershad，K.等人，2010.Protein Engineering Design and Selection.23：279-88；各自的内容通过引用整体并入本文)。展示的抗体片段可以是scFv抗体片段。噬菌体展示文库成员可表达为与病毒外壳蛋白(例如病毒pIII外壳蛋白的N端)连接的融合蛋白。VL链可以单独表达以与周质中的VH链组装，之后复合物并入病毒外壳中。沉淀的文库成员可从结合的噬菌体中进行测序以获得编码所需抗体结构域的cDNA。
在一些实施方案中，可以使用酵母表面展示技术生成抗体展示文库。抗体酵母展示文库由具有表面展示的抗体或抗体片段的酵母细胞组成。抗体酵母展示文库可以包括在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞表面上表达的抗体可变结构域。酵母展示文库可以通过将感兴趣的抗体片段展示为与酵母表面蛋白(例如Aga2p蛋白)的融合蛋白来开发。展示对特定靶标具有亲和力的抗体或抗体片段的酵母细胞可根据标准方法分离。此类方法可以包括但不限于磁分离和流式细胞术。
重组合成
可以使用重组DNA技术和相关方法制备本公开的抗体。可以制备编码抗体的构建体(例如，DNA表达质粒)并用于合成完整抗体或其部分。在一些实施方案中，编码本公开的抗体可变结构域的DNA序列可以插入编码其他抗体结构域的表达载体(例如哺乳动物表达载体)中并用于制备具有插入的可变结构域的抗体。编码抗体可变结构域的DNA序列可以插入具有启动子/增强子元件和/或编码免疫球蛋白信号序列的上游表达载体区的下游。编码抗体可变结构域的DNA序列可以插入编码免疫球蛋白恒定结构域的下游表达载体区的上游。所编码的恒定结构域可以来自任何类别(例如，IgG、IgA、IgD、IgE和IgM)或物种(例如，人、小鼠、兔、大鼠和非人灵长类动物)。在一些实施方案中，所编码的恒定结构域编码人IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)恒定结构域。在一些实施方案中，所编码的恒定结构域编码小鼠IgG(例如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3)恒定结构域。
编码本公开的抗体的表达载体可用于转染细胞以产生抗体。此类细胞可以是哺乳动物细胞。可以制备有抗体表达载体稳定转染的细胞系并用于建立稳定的细胞系。可以扩增产生抗体的细胞系以表达抗体，抗体可从细胞培养基中分离或纯化。
抗体表征
在一些实施方案中，可基于不同特征来鉴定、选择或排除本公开的抗体。此类特征可以包括但不限于物理和功能特征。物理特征可包括抗体结构的特征[例如，氨基酸序列或残基；二级、三级或四级蛋白质结构；翻译后修饰(例如糖基化)；化学键和稳定性]。功能特征可以包括但不限于抗体亲和力(即，针对特异性表位和/或抗原)和抗体活性(例如，抗体活化或抑制靶标、过程或途径的能力)。
抗体结合和亲和力
在一些实施方案中，可以基于对特定表位和/或抗原的结合和/或亲和力水平来鉴定、选择或排除本公开的抗体。可以用不同的抗原形式评估抗体结合和/或亲和力水平。在一些实施方案中，可以在体外(例如，通过ELISA)测试抗体对不同抗原形式的亲和力。可以使用脑部样品或级分进行抗tau抗体体外测试。此类样品或级分可以从患有AD的受试者(例如，人AD患者)获得。在一些实施方案中，脑部样品或级分是从非人受试者获得。此类非人受试者可以包括在AD疾病模型研究中使用的非人动物(例如小鼠、大鼠和灵长类动物)。在一些实施方案中，用于抗体亲和力测试的脑部样品或级分可以源自TG4510/P301S小鼠品系。可以将抗体亲和力与缺乏正在分析对其的亲和力的特定抗原的对照样品进行比较。在一些实施方案中，用于抗tau抗体测试的对照样品可以包括来自非患病人受试者的脑部样品或级分。在一些实施方案中，来自野生型和/或Tau敲除小鼠品系的脑部样品或级分可用作对照样品。
可以使用重组或分离的蛋白抗原(例如，通过ELISA)进行体外亲和力测试。例如，重组或分离的ePHF可用于抗tau抗体亲和力测试。在一些实施方案中，当通过ELISA评估时，本公开的抗tau抗体对于与ePHF的结合可表现出约0.01nM至约100nM的半数最大有效浓度(EC50)。在一些实施方案中，表现出的EC50可以小于约50nM、小于约20nM、小于约10nM或小于约1nM。在一些实施方案中，当通过ELISA评估时，本公开的抗tau抗体对于与表8中列出的抗原中的任一者或包括所述抗原中的任一者或包括在所述抗原中的任一者内的表位(包括但不限于构象表位)的结合可表现出约0.01nM至约100nM的EC50。在一些实施方案中，表现出的EC50可以小于约50nM、小于约20nM、小于约10nM或小于约1nM。
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体与病理性tau结合，但不与非病理性tau结合。此类抗体在本文中可以称为对tau的病理形式具有“选择性”。在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体与tau缠结结合。
在一些实施方案中，抗体亲和力分析可用于鉴定、选择或排除多特异性抗体。如本文所用，术语“多特异性抗体”是指对一个以上的表位或抗原具有亲和力的抗体。在一些实施方案中，可以基于对识别的每个表位或抗原的相对亲和力来鉴定、选择或排除多特异性抗体。例如，可以基于对一个表位或抗原的亲和力高于多特异性抗体对其展示出亲和力的第二表位或抗原的亲和力来选择多特异性抗体进行使用或进一步开发。
在一些实施方案中，可以测试抗tau抗体与其他抗tau抗体的竞争。可以进行此类测试以提供关于抗体所识别的特定表位的信息，并且可以得到与竞争抗体相比与表位亲和力水平相关的信息。在一些实施方案中，在抗体结合和/或亲和力分析中使用的抗tau抗体可包括抗tau抗体PT3，如美国专利号9,371,376中所述；抗tau抗体C10.2，如美国专利号10,196,439中所述(其中称为抗体“C1-2”)；抗tau抗体IPN002，如美国专利号10,040,847中所述；抗tau抗体AT8(ThermoFisher，Waltham，MA)；抗tau抗体AT100(ThermoFisher，Waltham，MA)；抗tau抗体AT120，如美国专利号5,843,779中所述；或抗tau抗体PT76，如Vandermeeren，M.等人，J Alzheimers Dis.2018；65(1)：265-281所述。
抗体活性
在一些实施方案中，本公开的抗体可基于它们促进或降低某种活性的能力来鉴定、选择或排除。可以使用分析测定评估抗体活性。可以选择或设计此类测定以基于此类抗体活性对抗体进行检测、筛选、测量和/或分级。
抗tau抗体的特征可在于抑制tau聚集的能力。抑制可基于对tau聚集的物理破坏或者可基于tau蛋白的抗tau抗体依赖性耗竭(免疫耗竭)。基于tau聚集抑制的表征可使用一种或多种tau聚集测定来评估。在一些实施方案中，抗tau抗体可以通过tau接种测定来表征。Tau接种测定通常牵涉tau聚集的体外引发和所测试的候选化合物对聚集抑制的评估。可以使用Tau聚集生物传感器细胞进行tau接种测定。Tau聚集生物传感器细胞响应于tau聚集而产生可检测信号(例如荧光信号)。Tau聚集生物传感器细胞可与重组或分离的tau或与来自高tau脑组织或流体的样品一起培养(以促进tau聚集)并用或不用候选化合物处理以评估tau聚集抑制。在一些实施方案中，抗tau抗体可用于从培养基中耗竭tau，之后与生物传感器细胞一起孵育。可将耗竭培养基的聚集水平与非耗竭培养基的聚集水平进行比较以评估抗tau抗体抑制功能。Tau聚集生物传感器细胞可包括但不限于tau RD生物传感器细胞。在一些实施方案中，可以使用表达人tau的神经元。
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可以约1nM至约30nM的半数最大抑制浓度(IC50)抑制tau聚集，如通过免疫耗竭测定(例如，使用tau RD生物传感器细胞)所确定的。
抗体结构和变异
本公开的抗体可作为完整多肽、多个多肽或多肽片段存在，所述多肽可独立地由一个或多个核酸、多个核酸、核酸片段或前述任一种的变体编码。
如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然氨基酸残基)的聚合物。如本文所用，该术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。使用术语“肽”可以指小于约50个氨基酸的多肽。肽可以是至少约2、3、4个或至少5个氨基酸残基长。本公开的多肽可包括基因产物、天然存在的多肽、合成的多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段或前述的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或者可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。多肽还可以包括单链或多链多肽，多链多肽可以是缔合的或连接的。多肽可以包括氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
术语“多肽变体”是指其氨基酸序列不同于天然或参考序列的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。一般地，变体将与天然或参考序列具有至少约50％的同一性(同源性)，优选地，它们将与天然或参考序列具有至少约80％，更优选至少约90％同一性(同源)。
在一些实施方案中，提供了“变体模拟物”。如本文所用，术语“变体模拟物”是含有一个或多个将会模拟活化序列的氨基酸的模拟物。例如，谷氨酸可以用作磷酸化苏氨酸和/或磷酸化丝氨酸的模拟物。可替代地，变体模拟物可引起去活化或产生含有模拟物的失活产物，例如苯丙氨酸可充当酪氨酸的失活取代；或丙氨酸可充当丝氨酸的失活取代。
术语“氨基酸序列变体”是指与天然或起始序列相比在其氨基酸序列中具有一些差异的分子。氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。“天然”或“起始”序列不应与野生型序列混淆。如本文所用，天然或起始序列是指可以与之进行比较的原始分子的相对术语。“天然”或“起始”序列或分子可以表示野生型(在自然界发现的序列)，不一定是野生型序列。
一般地，变体与天然序列相比将具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％的序列同一性。
应用于氨基酸序列时，“同源物”意指与第二物种的第二序列具有实质同一性的其他物种的对应序列。
“类似物”意在包括因一个或多个氨基酸改变，例如氨基酸残基的取代、添加或缺失而不同，仍然保持亲本多肽的特性的多肽变体。
本公开考虑了本文提出的抗体的变体和衍生物。这些包括取代、插入、缺失和共价变体和衍生物。例如，序列标签或氨基酸，诸如一个或多个赖氨酸，可以添加到抗体肽序列(例如，在N端或C端)。序列标签可用于肽的纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解性或允许生物素化。可替代地，位于肽或多肽的氨基酸序列的羧基端和氨基端区域的氨基酸残基可以任选地缺失，从而提供截短序列。某些氨基酸(例如，C端或N端残基)可替代地根据序列的用途而缺失，例如，作为可溶的或连接至固体支持物的较大序列的一部分的序列的表达。
“取代变体”在指多肽时是在天然或起始序列中去除至少一个氨基酸残基并且在它所处的相同位置处插入不同氨基酸的那些。取代可以是单个的，其中分子中仅一个氨基酸被取代，或者它们可以是多个的，其中在同一分子中两个或更多个氨基酸被取代。
如本文所用，术语“保守性氨基酸取代”是指通常存在于序列中的氨基酸被具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代。保守性取代的示例包括用非极性(疏水性)残基诸如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸取代另一个非极性残基。同样，保守性取代的示例包括用一个极性(亲水性)残基取代另一个极性(亲水性)残基，诸如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间和甘氨酸与丝氨酸之间的取代。另外，用一个碱性残基诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代另一个碱性残基，或用一个酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个酸性残基是保守性取代的其他示例。非保守性取代的示例包括用非极性(疏水性)氨基酸残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸取代极性(亲水性)残基诸如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸和/或用极性残基取代非极性残基。
“插入变体”在指多肽时是紧邻天然或起始序列中特定位置处的氨基酸插入一个或多个的氨基酸的那些变体。“紧邻”氨基酸意指与氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团连接。
“缺失变体”在指多肽时是在天然或起始氨基酸序列中去除一个或多个氨基酸的那些变体。一般地，缺失变体将在分子的特定区域中缺失一个或多个氨基酸。
如本文所用，术语“衍生物”与术语“变体”同义使用，并且是指相对于参考分子或起始分子以任何方式修饰或改变的分子。在一些实施方案中，衍生物包括已经用有机蛋白质或非蛋白质衍生剂以及翻译后修饰进行修饰的天然或起始多肽。共价修饰传统上是通过使多肽的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，或通过利用在所选重组宿主细胞中起作用的翻译后修饰的机制而引入的。所得共价衍生物可用于针对鉴定对生物活性重要的残基的程序，用于免疫测定，或用于制备用于免疫亲和纯化的抗体。
某些翻译后修饰是重组宿主细胞对表达的多肽的作用结果。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基经常在翻译后脱酰胺基成为对应的谷氨酰和天冬氨酰残基。可替代地，这些残基在温和酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一种形式均可存在于根据本公开使用的多肽中。
其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86页(1983))。
共价衍生物特别包括其中多肽与非蛋白质聚合物共价键合的融合分子。非蛋白质聚合物可包括亲水性合成聚合物，即在自然界中未发现的聚合物。然而，在自然界中存在并通过重组或体外方法产生的聚合物是有用的，从自然界分离的聚合物也是有用的。亲水性聚乙烯基聚合物可包括聚乙烯醇和/或聚乙烯吡咯烷酮。特别有用的是聚乙烯基亚烷基醚，诸如聚乙二醇和聚丙二醇。多肽可以以美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337中阐述的方式连接至各种非蛋白质聚合物，诸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯；每个专利的内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，当指多肽时，术语“环”是指肽或多肽的结构特征，其逆转肽或多肽的主链方向并且包括四个或更多个氨基酸残基。Oliva等人已经鉴定了至少5类多肽环(J.MolBiol 266(4)：814-830；1997，其内容通过引用整体并入本文)。
如本文所用，当指多肽时，术语“半环”是指所鉴定的环的一部分，该部分具有其来源的环的至少一半数目的氨基酸残基。应当理解，环可能不总是含有偶数个氨基酸残基。因此，在环含有或被鉴定为包括奇数个氨基酸的那些情况下，奇数环的半环将包括环的整数部分或下一个整数部分(环的氨基酸数/2+/-0.5个氨基酸)。例如，被鉴定为7个氨基酸的环的环可以产生3个氨基酸或4个氨基酸的半环(7/2＝3.5+/-0.5是3或4)。
如本文所用，当指多肽时，术语“结构域”是指具有一个或多个可鉴定的结构和/或功能特征或特性(例如结合能力)，例如充当蛋白质-蛋白质相互作用的位点的多肽基序。
如本文所用，当指多肽时，术语“位点”与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义。位点表示多肽上可在多肽内进行修饰、操纵、改变、衍生或改变的位置。
如本文所用，术语“末端”当指多肽时，是指肽或多肽的端部。此类端部不仅限于肽或多肽的第一个或最后一个位点，而且可以在末端区域包括附加氨基酸。本公开的基于多肽的分子可表征为具有N端(由具有游离氨基的氨基酸封端)和C端(由具有游离羧基的氨基酸封端)。本公开的蛋白质在一些情况下由通过二硫键或通过非共价力结合在一起的多个多肽链(多聚体、寡聚体)组成。这些种类的蛋白质将具有多个N端和C端。可替代地，可以修饰多肽的末端，使其在可能的情况下以非基于多肽的部分诸如有机缀合物开始或结束。
抗体修饰
可以修饰抗体以获得具有一种或多种改变的特性的变体。此类特性可包括或涉及抗体结构、功能、亲和力、特异性、蛋白质折叠、稳定性、制造、表达和/或免疫原性(即，正用此类抗体治疗的受试者中的免疫反应)。在一些实施方案中，抗体片段或变体可用于修饰另一抗体或者可并入合成抗体中。
抗体修饰可包括氨基酸序列修饰。此类修饰可包括但不限于氨基酸缺失、添加和/或取代。可以通过氨基酸序列分析获知修饰。此类分析可包括不同抗体或抗体变体之间氨基酸序列的比对。可以比较两种或更多种抗体以鉴定适于修饰的残基或区域。比较的抗体可以包括与相同表位结合的那些抗体。比较的抗体可以与相同蛋白质或靶标的不同表位(单独的或重叠的)结合(例如，以鉴定赋予对特定表位的特异性的残基或区域)。比较可以包括轻链和/或重链序列变异分析、CDR序列变异分析、种系序列分析和/或框架序列分析。从此类分析获得的信息可用于鉴定在与相同或不同表位结合的抗体中保守或可变的氨基酸残基、氨基酸区段、氨基酸侧链、CDR长度和/或其他特征或特性。
在一些实施方案中，上述抗tau抗体的修饰型式可通过添加、缺失或取代一个或多个CDR氨基酸残基来制备。
在一些实施方案中，抗tau抗体可通过与相似靶标结合的抗体的氨基酸序列比对进行修饰，并基于比对序列的分析制备具有一个或多个氨基酸缺失、取代或插入的修饰抗体。
本公开包括CDR区序列的氨基酸共有序列，其显示可被修饰的特定氨基酸(在方括号中示出)或抗体氨基酸序列中可更通常缺失或取代的氨基酸残基位置(使用变量“X”示出)，例如如表1A或表Z中所述。
可以出现在抗体的相同VH和/或VL序列中的相关CDR序列一起分组在同一行中。例如，本发明的抗体可包含CDRH1-CDRH3和CDRL1-CDRL3中的每一个，其中所述CDRH1-CDRH3和CDRL1-CDRL3分别由SEQ ID NO：928、930、409、472、525和570表示。
另外，在表5中，例如，表格标题下方每个奇数行和紧接其下的偶数行是相关的(如果是不相同的)共有序列(例如，SEQ ID NO：927和928是相关的，SEQ ID NO：933和934是相关的)。考虑到本发明的抗体可包含CDRH1-CDRH3和CDRL1-CDRL3中的每一个，其中所述CDRH1-CDRH3和CDRL1-CDRL3中的每一个可独立地由两个相关共有序列中的一个表示。例如，本发明的抗体可包含CDRH1-CDRH3和CDRL1-CDRL3中的每一个，其中所述CDRH1-CDRH3和CDRL1-CDRL3分别由SEQ ID NO：931、341、410、934、935和571表示。
此外，在每个X位置或Xi位置(其中i＝1、2、3，...)的氨基酸可以是任何天然存在的氨基酸，或者可以是在每个共有序列X/Xi位置中指定的氨基酸的选定子集。考虑到在每个X或Xi位置列举的特定氨基酸中的任何一个或多个可以作为X或Xi位置的容许值被消除。例如，在SEQ ID NO：947中，X4可以是任何残基，诸如T、S、A、V、I或L。在一些实施方案中，X4为T、L或V；或S、A或V等。
表5 cDR共有序列
Figure BDA0003992935460000851
Figure BDA0003992935460000861
/>
Figure BDA0003992935460000871
Figure BDA0003992935460000881
/>
Figure BDA0003992935460000891
Figure BDA0003992935460000901
/>
Figure BDA0003992935460000911
Figure BDA0003992935460000921
Figure BDA0003992935460000931
*在上表中，括号中的“-”表示可以不存在残基。
表1：示例性抗tau抗体V0022、V0023和V0024的共有CDR
Figure BDA0003992935460000941
/>
Figure BDA0003992935460000951
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可包括：包括氨基酸序列GYTFTS[Y/N](SEQ ID NO：927)的CDRH1，或包括氨基酸序列GYTFTSX(SEQ ID NO：928)的CDRH1，其中X可为任意氨基酸，例如X为Y/F/N/Q；包括氨基酸序列NPNNS[D/E](SEQ ID NO：929)的CDRH2，或包括氨基酸序列NPNNSX(SEQ ID NO：930)的CDRH2，其中X可以是任意氨基酸，例如具有带负电荷的侧链的氨基酸；和包括氨基酸序列ANYYGGSQFAY(SEQ ID NO：409)的CDRH3；包括氨基酸序列RSSQSLVHSNGKTYLH(SEQ ID NO：472)的CDRL1；包括氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO：525)的CDRL2；和/或包括氨基酸序列SQSTHVPFT(SEQ ID NO：570)的CDRL3。
在一些实施方案中，抗tau抗体包括：包括氨基酸序列G[F/Y]TFT[R/I][Y/F](SEQID NO：931)的CDRH1，或包括氨基酸序列G-X1-TFT-X2-X3(SEQ ID NO：932)的CDRH1，其中X1、X2和X3中的每一个可以是任意氨基酸，例如X1和/或X3可以是具有疏水性和/或芳香族侧链的氨基酸，诸如F或Y，和/或X2可以是带正电荷的残基(诸如R、K、H)或具有脂族侧链的残基(诸如A、V、I或L)；包括氨基酸序列NPNNGG(SEQ ID NO：341)的CDRH2；包括氨基酸序列GTGTGAMDY(SEQ ID NO：410)的CDRH3；包括氨基酸序列RSSQSLVH[N/S]NG[I/N]T[H/Y]LY(SEQ ID NO：933)的CDRL1，或包括氨基酸序列RSSQSLVH-X1-NG-X2-T-X3-LY(SEQ ID NO：934)的CDRL1，其中X1、X2和X3可以是任意氨基酸，例如X1是Q/N/S/T和/或X2是A/V/I/L/Q/N和/或X3是H/R/K/Y/F；包括氨基酸序列RVS[N/S]RFS(SEQ ID NO：935)的CDRL2，或包括氨基酸序列RVSXRFS(SEQ ID NO：936)的CDRL2，其中X可以是任意氨基酸，例如X是Q/N/S/T；和/或包括氨基酸序列FQGTHVPRT(SEQ ID NO：571)的CDRL3。
在一些实施方案中，抗tau抗体包括：包括氨基酸序列G[F/Y]TFT[R/I/D][Y/F](SEQ ID NO：937)的CDRH1，或包括氨基酸序列G-X1-TFT-X2-X3(SEQ ID NO：938)的CDRH1，其中X1、X2和X3可以是任意氨基酸，例如X1和X3各自独立地为F/Y和/或X2为任意残基(诸如R/K/H/D/E/G/A/I/L/V)；包括氨基酸序列NPNNG[G/E](SEQ ID NO：939)的CDRH2，或包括氨基酸序列NPNNGX(SEQ ID NO：940)的CDRH2，其中X可以是任意氨基酸，例如E/D/G/A/V/I/L；包括氨基酸序列G[T/R]G[T/M]G[不存在/Y][不存在/Y]A[M/L]DY(SEQ ID NO：941)的CDRH3，或包括氨基酸序列G-X1-G-X2-G-X3-X4-A-X5-DY(SEQ ID NO：942)的CDRH3，其中X1-X5中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X3和/或X4可以不存在，例如X1是S/T/R/K/H和/或X2是S/T/V/L/A/I/M和/或X3和X4各自独立地是Y/F/不存在的和/或X5是A/V/I/L/M；包括氨基酸序列[R/G][S/A]S[Q/E][S/N][L/V][V/Y][H/G][S/A/N][N/T/L][G/N][I/N/不存在][T/不存在][H/Y/不存在][L/不存在][Y/不存在](SEQ ID NO：943)的CDRL1，或包括氨基酸序列X1-X2-S-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO：944)的CDRL1，其中X1-X15可以是任意氨基酸和/或其中X11、X12、X13、X14和/或X15可以不存在，例如X1是R/K/H/G/A/V/I/L和/或X2是S/T/A/V/I/L和/或X3是Q/N/E/D和/或X4是S/T/N/Q和/或X5是L/V/A/I和/或X6是A/V/I/L/Y/F和/或X7是H/R/K/G/A和/或X8是S/T/A/V/I/L/N/Q和/或X9是N/Q/A/I/L/V/M/S/T和/或X10是G/A/N/Q和/或X11是Q/N/A/V/I/L/不存在的和/或X12是T/S/不存在的和/或X13是H/R/K/Y/F/不存在的和/或X14是A/V/I/L/不存在的和/或X15是Y/F/不存在的；具有约3至约7个氨基酸，具有氨基酸序列[R/G][V/A][S/T][N/T/S][R/L][F/A][S/D](SEQ ID NO：945)的CDR L2共有序列，或包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：946)的CDRL2，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7可以是任意氨基酸，例如X1是R/K/H/G/A和/或X2是V/A/I/L和/或X3是S/T和/或X4是N/Q/T/S和/或X5是R/K/H/A/V/I/L和/或X6是F/Y/A/V/I/L/G和/或X7是S/T/D/E；和/或包括氨基酸序列[F/Q][G/N][G/V][T/L][H/T][V/I]P[R/W]T(SEQ ID NO：947)的CDRL3，或包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-P-X7-T(SEQ ID NO：948)的CDRL3，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7可以是任意氨基酸，例如，X1是F/Y/Q/N和/或X2是G/A/Q/N和/或X3是G/A/V/I/L和/或X4是T/S/A/V/I/L和/或X5是H/R/K/T/S和/或X6是V/I/A/L和/或X7是R/K/H/W/F/Y。
在一些实施方案中，抗tau抗体包括：包括氨基酸序列GY[S/T]FT[D/E]Y(SEQ IDNO：949)的CDRH1，或包括氨基酸序列GY-X1-FT-X2-Y(SEQ ID NO：950)的CDRH1，其中X1和X2可以是任意氨基酸，例如X1是S/T和/或X2是D/E/S/T；包括氨基酸序列[F/Y]PG[S/R][D/G][S/N](SEQ ID NO：951)的CDRH2，或包括氨基酸序列X1-PG-X2-X3-X4(SEQ ID NO：952)的CDRH2，其中X1-X4可以是任意氨基酸，例如X1是F/Y和/或X2是S/T/R/K/H和/或X3是D/E/G/A和/或X4是S/T/N/Q；包括氨基酸序列P[T/A][V/I/Y][V/Y][A/S][R/K]DYAM[D/E]Y(SEQ IDNO：953)的CDRH3，或包括氨基酸序列P-X1-X2-X3-X4-X5-DYAM-X6-Y(SEQ ID NO：954)的CDRH3，其中X1-X6可以是任意氨基酸，例如X1是T/S/A/V/I/L和/或X2是V/I；A/L/Y/F和/或X3是V/I/A/L/Y/F和/或X4是A/V/I/L/S/T和/或X5是R/K/H和/或X6是D/E；包括氨基酸序列RSSQSIV[Y/H][S/R/T]NGNTYLE(SEQ ID NO：955)的CDRL 1，或包括氨基酸序列RSSQSIV-X1-X2-NGNTYLE(SEQ ID NO：956)的CDRL1，其中X1和X2可以是任意氨基酸，例如，X1是Y/F/H/R/K和/或X2是S/T/R/K/H；包括氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO：525)的CDRL2；和/或包括氨基酸序列FQGSHVP[Y/F]T(SEQ ID NO：957)的CDRL3，或包括氨基酸序列FQGSHVPXT(SEQ IDNO：958)的CDRL3，其中X可以是任意氨基酸，例如X为Y/F。
在一些实施方案中，抗tau抗体包括：包括氨基酸序列GY[S/T]FT[D/E/S]Y(SEQ IDNO：959)的CDRH1，或包括氨基酸序列GY-X1-FT-X2-Y(SEQ ID NO：950)的CDRH1，其中X1和X2可以是任意氨基酸，例如X1是S/T和/或X2是E/D/S/T；包括氨基酸序列[F/Y]P[G/S][S/R/N][D/G][S/G/N](SEQ ID NO：960)的CDRH2，或包括氨基酸序列X1-P-X2-X3-X4-X5(SEQ IDNO：961)的CDRH2，其中X1-X5可以是任意氨基酸，例如X1是F/Y和/或X2是S/T/G/A/V/I/L和/或X3是S/T/R/K/H/N/Q和/或X4是D/E/G/A和/或X5是S/T/N/Q/G/A；包括氨基酸序列[P/S][T/A/S][V/I/Y][V/Y][A/S/G][R/K]DYAM[D/E]Y(SEQ ID NO：962)的CDRH3，或包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-DYAM-X7-Y(SEQ ID NO：963)的CDRH3，其中X1-X7可以是任意氨基酸，例如X1是S/T/P/A/I/L/V和/或X2是T/S/A/V/I/L和/或X3是A/V/I/L/Y/F和/或X4是A/V/I/L/Y/F和/或X5是A/V/I/L/G/S/T和/或X6是R/K/H和/或X7是E/D；包括氨基酸序列RSSQSIV[Y/H][S/R/T]NGNTYLE(SEQ ID NO：955)的CDRL1，或包括氨基酸序列RSSQSIV-X1-X2-NGNTYLE(SEQ ID NO：956)的CDRL1，其中X1和X2可以是任意氨基酸，例如X1是Y/F/H/R/K和/或X2是S/T/R/K/H；包括氨基酸序列KVSNRFS(SEQ ID NO：525)的CDRL2；和/或包括氨基酸序列FQGSHVP[Y/F]T(SEQ ID NO：957)的CDRL3，或包括氨基酸序列FQGSHVPXT(SEQ ID NO：958)的CDRL3，其中X可以是任意氨基酸，例如X是F/Y。
在一些实施方案中，抗tau抗体包括：包括氨基酸序列GFSL[S/N]T[S/F][A/G]M(SEQ ID NO：964)的CDRH1，或包括氨基酸序列GFSL-X1-T-X2-X3-M(SEQ ID NO：965)的CDRH1，其中X1-X3可以是任意氨基酸，例如X1是S/T/N/Q和/或X2是S/T/F/Y和/或X3是A/V/I/L/G；包括氨基酸序列YWDDD(SEQ ID NO：362)的CDRH2；包括氨基酸序列R[R/V/K]R[G/Y/S]Y[G/A]MDY(SEQ ID NO：966)的CDRH3，或包括氨基酸序列R-X1-R-X2-Y-X3-MDY(SEQ IDNO：967)的CDRH3，其中X1-X3可以是任意氨基酸，例如X1是R/K/H/A/V/I/L和/或X2是G/A/V/I/L/S/T/Y/F和/或X3是A/V/I/L/G；包括氨基酸序列K[A/S]SQS[V/L][S/L][N/S][不存在/S][不存在/G][不存在/N][不存在/Q][不存在/K][不存在/N][D/Y][V/L]A(SEQ ID NO：968)的CDRL1，或包括氨基酸序列K-X1-SQS-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-A(SEQ ID NO：969)的CDRL1，其中X1-X12可以是任意氨基酸和/或其中X5-X10中的一个或多个可以不存在，例如，X1是S/T/A/V/I/L和/或X2是A/V/I/L和/或X3是S/T/A/V/I/L和/或X4是N/Q/S/T和/或X5是S/T/不存在的和/或X6是G/A/V/I/L/不存在的和/或X7是N/Q/不存在的和/或X8是N/Q/不存在的和/或X9是K/R/H/不存在的和/或X10是N/Q/不存在的和/或X11是E/D/Y/F和/或X12是A/V/I/L；包括氨基酸序列[Y/G][A/T]S[N/T]R[C/E][T/S](SEQ IDNO：970)的CDR L2，或包括氨基酸序列X1-X2-S-X3-R-X4-X5(SEQ ID NO：971)的CDRL2，其中X1-X5可以是任意氨基酸，例如X1是Y/F/G/A/V/I/L和/或X2是A/V/I/L/T/S和/或X3是N/Q/T/S和/或X4是C/S/E/D和/或X5是T/S；和/或包括氨基酸序列Q[Q/N]D[Y/H][R/S][S/H]P[L/Y]T(SEQ ID NO：972)的CDRL3，或包括氨基酸序列Q-X1-D-X3-X4-X5-P-X6-T(SEQ ID NO：973)的CDRL3，其中X1-X6可以是任意氨基酸，例如X1是Q/N和/或X2是Y/F/H/R/K和/或X3是R/K/H/S/T和/或X4是S/T/H/K/R和/或A/V/I/L/Y/F。
在一些实施方案中，抗tau抗体包括：包括氨基酸序列GFSL[S/N]T[S/F][A/G]M(SEQ ID NO：964)的CDRH1，或包括氨基酸序列GFSL-X1-T-X2-X3-M(SEQ ID NO：965)的CDRH1，其中X1-X3可以是任意氨基酸，例如X1是S/T/N/Q和/或X2是S/T/F/Y和/或X3为G/A/I/L/V；包括氨基酸序列YWDDD(SEQ ID NO：362)的CDRH2；包括氨基酸序列R[R/V/K/S/G][Y/R][Y/不存在][S/不存在][不存在/N][G/S/Y/R][Y/N/G][G/A/Y/N][M/F/Y]DY(SEQID NO：974)的CDRH3，或包括氨基酸序列R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-DY(SEQ ID NO：975)的CDRH3，其中X1-X9中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X3-X5中的一个或多个可以不存在，例如，X1是R/K/H/A/V/I/L/G/S/T和/或X2是Y/F/R/K/H和/或X3是Y/F/不存在的和/或X4是S/T/不存在的和/或X5是N/Q/不存在的和/或X6是G/A/V/I/L/S/T/Y/F/R/K/H和/或X7是Y/F/N/Q/G/A/V/I/L和/或X8是G/A/V/I/L/Y/F/N/Q和/或X9是M/F/Y；包括氨基酸序列[K/S][S/A]S[Q/S]S[L/I/V][L/S][N/S/D][D/S/T][V/G/D/Y][N/G/不存在][Q/不存在][K/不存在][N/T/不存在][Y/不存在][L/a不存在][A/H/N](SEQ ID NO：976)的CDRL1，或包括氨基酸序列X1-X2-S-X3-S-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO：977)的CDRL1，其中X1-X15中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X9-X14中的每一个可以不存在，例如，X1是K/R/H/S/T和/或X2是S/T/A/V/I/L和/或X3是Q/N/S/T和/或X4是L/I/V/A和/或X5是A/V/I/L/S/T和/或X6是N/Q/S/T/D/E和/或X7是D/E/S/T和/或X8是G/A/V/I/L/D/E/Y/F和/或X9是N/Q/G/A/不存在的和/或X10是Q/N/不存在的和/或X11是K/R/H/不存在的和/或X12是N/Q/T/S/不存在的和/或X13是Y/F/不存在的和/或X14是A/V/I/L/不存在的和/或X15是A/V/I/L/H/K/R/N/Q；包括氨基酸序列[Y/G/L/R][A/T/V]S[N/T/K][R/L][C/E/D/A][T/S](SEQ ID NO：978)的CDRL2，或包括氨基酸序列X1-X2-S-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO：979)的CD RL2，其中X1-X6可以是任意氨基酸，例如，X1是Y/F/G/A/V/I/L/R/K/H和/或X2是A/V/I/L/T/S和/或X3是N/Q/T/S/K/R/H和/或X4是R/K/H/A/V/I/L和/或X5是C/S/E/D/A/V/I/L和/或X6是T/S；和/或包括氨基酸序列[W/Q][Q/N][G/D][T/S/Y/H][H/S/R][F/I/S/H]P[Q/R/L/Y][不存在/Y]T(SEQ ID NO：980)的CDRL3，或包括氨基酸序列X1-X2-X3-X4-X5-X6-P-X7-X8-T(SEQ ID NO：981)的CDRL3，其中X1-X8中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X8可以不存在，例如X1是Q/N/W/F/Y和/或X2是Q/N和/或X3是G/A/V/I/L/D/E和/或X4是T/S/Y/F/H/K/R和/或X5是H/K/R/S/T和/或X6是F/Y/A/V/I/L/S/T/H/K/R和/或X7是Q/N/R/K/H/A/V/I/L/Y/F和/或X8是Y/F/不存在的。
功能修饰
在一些实施方案中，可以修饰本公开的抗体以优化一种或多种功能特性(例如，抗体亲和力或活性)。抗体功能特性的非限制性示例包括表位或抗原亲和力、动员或固定靶标的能力及活化或抑制靶标、过程或途径的能力。在一些实施方案中，功能特性包括或涉及调节蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质聚集、酶活性、受体-配体相互作用、细胞信号传导途径、蛋白水解级联和/或生物或生理应答的能力。
抗体修饰可以通过调节表位亲和力来优化抗体。此类修饰可以通过亲和力成熟进行。亲和力成熟技术用于鉴定编码对靶抗原具有最高亲和力的CDR的序列。在一些实施方案中，可以使用抗体展示技术(例如，噬菌体或酵母)。此类方法可以包括使编码优化的亲本抗体的核苷酸序列突变。核苷酸序列可以作为整体随机突变或改变特定氨基酸残基的表达以产生数百万至数十亿的变体。可基于在天然人抗体库中观察到的序列或氨基酸频率来选择进行突变的位点或残基。变体可以进行多轮重复的亲和筛选[例如，使用展示文库筛选技术、表面等离振子共振技术、荧光相关细胞分选(FACS)分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)等]用于靶抗原结合。可以进行多轮重复的筛选、突变和表达以鉴定对靶抗原具有最高亲和力的抗体片段序列。此类序列可以直接并入抗体序列中用于生产。在一些情况下，亲和力成熟的目标是使抗体亲和力与原始或起始抗体的亲和力相比增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1,000倍或超过1,000倍。在亲和力低于所需的情况下，可重复该过程。
在一些实施方案中，可用不同的抗原形式评估抗体亲和力。在一些实施方案中，可以在体外(例如，通过ELISA)测试抗体对不同抗原形式的亲和力。可以使用脑部样品或级分进行体外测试。此类样品或级分可以从患有AD的受试者(例如，人AD患者)获得。在一些实施方案中，脑部样品或级分是从非人受试者获得。此类非人受试者可以包括在AD疾病模型研究中使用的非人动物(例如小鼠、大鼠和灵长类动物)。在一些实施方案中，用于抗体亲和力测试的脑部样品或级分可以源自TG4510/P301S小鼠品系。可以将抗体亲和力与缺乏正在分析对其的亲和力的特定抗原的对照样品进行比较。在一些实施方案中，对照样品可以包括来自非患病人受试者的脑部样品或级分。在一些实施方案中，来自野生型和/或Tau敲除小鼠品系的脑部样品或级分可用作对照样品。可以使用重组或分离的蛋白抗原(例如，通过ELISA)进行体外亲和力测试。在一些实施方案中，重组或分离的ePHF用于抗体亲和力测试。在一些实施方案中，可以使用表8中列出的抗原。
在一些实施方案中，抗体亲和力分析可用于调节抗体多特异性(例如，降低或增强抗体多特异性)。此类调节可包括调节对两个或更多个表位或抗原的相对亲和力。例如，可以优化抗体对一个表位或抗原的亲和力高于第二表位或抗原。
可以修饰抗体以优化抗体功能特性。此类功能特性可以基于与一种或多种抗体功能特性有关的分析测定结果来评估或工程改造。测定可用于筛选多种抗体以基于功能标准对抗体进行鉴定或分级。可以修饰抗tau抗体以优化tau聚集抑制。此类抑制可基于tau聚集的物理破坏或者可基于抗tau抗体从测定样品中耗竭tau蛋白的能力。可以使用一种或多种tau聚集测定(例如，通过tau接种测定)评估基于tau聚集抑制的优化。
生产修饰
在一些实施方案中，可以进行修饰以优化抗体生产。此类修饰可包括或涉及蛋白质折叠、稳定性、表达和/或免疫原性中的一种或多种。可以进行修饰以解决负面影响生产的一种或多种抗体特征。此类特征可包括但不限于未配对的半胱氨酸或不规则二硫化物；糖基化位点(例如，N-连接的NXS/T位点)；酸裂解位点、氨基酸氧化位点、与小鼠种系序列的一致性；天冬酰胺脱酰胺位点；天冬氨酸酯异构化位点；N端焦谷氨酸形成位点；和倾向于聚集的氨基酸序列区(例如，在CDR序列内)。
在一些实施方案中，本公开的抗体可以使用重组DNA技术制备(例如，参见美国专利号4,816,567，其通过引用整体并入本文)。编码抗体的DNA可以使用常规程序分离和测序(例如，通过使用能够与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，杂交瘤细胞可用作优选的DNA来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染到宿主细胞中。宿主细胞可以包括但不限于HEK293细胞、HEK293T细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和骨髓瘤细胞，它们不另外产生免疫球蛋白，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。可对DNA进行修饰，例如通过取代人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠类序列(美国专利号No.4,816,567)，或通过使非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列连接。
抗体人源化
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可以制备为人源化抗体。“人源化”抗体是含有源自非人免疫球蛋白(例如鼠免疫球蛋白)的最小序列(例如可变结构域或CDR)的嵌合抗体。人源化抗体可以从人(受者)免疫球蛋白制备，其中来自高变区的残基被来自一种或多种非人“供体”抗体(例加小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基置换。可以基于所需的特异性、亲和力和/或能力来选择供体抗体。人源化抗体可包括一个或多个回复突变，包括一个或多个氨基酸逆转回在供体抗体中发现的氨基酸。相反，人源化抗体中包括的来自供体抗体的残基可以突变以匹配人受者抗体中存在的残基。可以引入回复突变以降低对人源化抗体的人免疫应答。在一些实施方案中，引入回复突变以避免抗体制造的问题(例如蛋白质聚集或翻译后修饰)。
为了构建编码具有人恒定区的完全人源化抗体的表达质粒，可以将编码抗体可变区的DNA序列插入到表达载体(例如，哺乳动物表达载体)的上游启动子/增强子和免疫球蛋白信号序列与下游免疫球蛋白恒定区基因之间。然后可以将DNA样品转染到哺乳动物细胞中以产生抗体。可以使用来自任何类别的人抗体的恒定结构域。有五大类完整的人抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM；并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1(人和鼠)、IgG2(人)、IgG2a(鼠)、IgG2b(鼠)、IgG2c(鼠)、IgG3(人和鼠)、IgG4(人)、IgA(鼠)、IgA1(人)和IgA2(人)。
可以制备有编码人源化抗体的DNA稳定转染的细胞系并用于建立稳定的细胞系。可以扩增产生人源化抗体的细胞系以表达人源化抗体，人源化抗体可从细胞培养基中收获和纯化。
在一些实施方案中，本公开的人源化抗体可与非人物种具有交叉反应性。物种交叉反应性可以允许抗体在不同动物中用于各种目的。例如，交叉反应性抗体可用于临床前动物研究以提供关于抗体功效和/或毒性的信息。非人物种可包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猪、山羊、绵羊和非人灵长类(例如，猕猴)。
抗体缀合物
在一些实施方案中，本公开的抗体可以是抗体缀合物或制备为抗体缀合物。如本文所用，术语“缀合物”是指附接至受者实体的任何剂、货物或化学部分或附接此类剂、货物或化学部分的方法。如本文所用，术语“抗体缀合物”是指具有附接的剂、货物或化学部分的任何抗体。用于制备抗体缀合物的缀合物可包括治疗剂。此类治疗剂可以包括药物。包括缀合药物的抗体缀合物在本文中称为“抗体药物缀合物”。抗体药物缀合物可用于基于相关抗体对与此类靶标相关的蛋白质或表位的亲和力将缀合的药物导向特定靶标。此类抗体药物缀合物可用于将与此类缀合药物相关的生物活性定位至靶向的细胞、组织、器官或其他靶向的实体。在一些实施方案中，用于制备抗体缀合物的缀合物包括可检测标记。为了检测的目的，可以将抗体与可检测标记缀合。此类可检测标记可包括但不限于放射性同位素、荧光团、发色团、化学发光化合物、酶、酶辅因子、染料、金属离子、配体、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、半抗原、量子点或本领域已知或本文所述的任何其他可检测标记。
缀合物可直接或经由接头附接至抗体。直接附接可以通过共价键合或通过非共价缔合(例如，离子键、流体静力键、疏水键、氢键、杂化等)。用于缀合物附接的接头可包括能够将抗体连接至缀合物的任何化学结构。在一些实施方案中，接头包括聚合物分子(例如核酸、多肽、聚乙二醇、碳水化合物、脂质或其组合)。抗体缀合物接头可以是可裂解的(例如，通过与酶接触、改变pH或改变温度)。
示例性抗tau抗体
在一些实施方案中，抗tau抗体包含至少一个抗原结合结构域，例如来自本文所述的抗体(例如，选自例如表1、表3、表6、表2A-2C、表4或表5中所述的V0001-V0065、V1001-V1005或V2001-V2005的抗体)的可变区或其抗原结合片段，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自本文所述的抗体(例如，选自例如表3、表6或表4中所述的V0001-V0065、V1001-V1005或V2001-V2005)的重链可变区，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，重链可变区包含对表3、表6或表4中提供的重链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守性取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代，例如保守性取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码抗tau抗体的核苷酸序列包含来自本文所述的抗体(例如，选自例如表3或表4中所述的V0001-V0065、V1001-V1005或V2001-V2005)的重链可变区的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自本文所述的抗体(例如，选自例如表3、表6或表4中所述的V0001-V0065、V1001-V1005或V2001-V2005)的轻链可变区，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含对表3、表6或表4中提供的轻链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守性取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代，例如保守性取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码抗tau抗体的核苷酸序列包含来自本文所述的抗体(例如，选自例如表3或表4中所述的V0001-V0065、V1001-V1005或V2001-V2005)的轻链可变区的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自本文所述的抗体(例如，选自例如表3、表6或表4中所述的V0001-V0065、V1001-V1005或V2001-V2005)的重链可变区和轻链可变区，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含：重链可变区，所述重链可变区包含对表3、表6或表4中提供的重链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守性取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代，例如保守性取代)的氨基酸序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含对表3、表6或表4中提供的轻链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守性取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代，例如保守性取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链恒定区，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，或鼠IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C或IgG3恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区包含表X中阐述的氨基酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，编码重链恒定区的核酸包含表X中阐述的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含轻链恒定区，例如κ轻链恒定区，例如人κ或λ轻链恒定区或鼠κ或λ轻链恒定区。在一些实施方案中，轻链恒定区包含表X中阐述的氨基酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，编码轻链恒定区的核酸包含表X中阐述的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链恒定区和轻链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区和轻链恒定区包含表X中阐述的氨基酸序列，或与之基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，编码抗tau抗体的核苷酸序列包含重链恒定区的核苷酸序列和κ或λ轻链恒定区的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码重链恒定区和轻链恒定区的核苷酸序列包含表X中阐述的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区和恒定区、轻链可变区和恒定区或两者，对于可变区而言包含表3、表6或表4的氨基酸序列，并且对于恒定区而言包含表X的氨基酸序列；或是由表3、表6或表4和表X的核酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如，具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码的。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自本文所述的抗体(例如，选自例如表7或表4中所述的V0001-V0065、V1001-V1005或V2001-V2005)的重链可变区的至少一个、两个、三个或四个框架区，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述框架区中的一个或多个(或集体全部框架区)相对于表7或表4中所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，抗tau抗体包括重链框架区中的取代，例如重链的FRH1、FRH2、FRH3和/或FRH4中的一个或多个取代。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自本文所述的抗体(例如，选自例如表7或表4中所述的V0001-V0065、V1001-V1005或V2001-V2005)的轻链可变区的至少一个、两个、三个或四个框架区，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，所述框架区中的一个或多个(或集体全部框架区)相对于表7或4中所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，抗tau抗体包括轻链框架区中的取代，例如轻链的FRL1、FRL2、FRL3和/或FRL4中的一个或多个取代。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自重链可变区的表2A-2C、表3、表6、表4或表5中的氨基酸序列的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，或是由表4中的核酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码的。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于表2A-2C、表6、表4或5中所示的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失，或由表4中所示的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，所编码的抗tau抗体包括重链CDR中的取代，例如重链的CDR1、CDR2、和/或CDR3中的一个或多个取代。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自轻链可变区的包含表2A-2C、表6、表4或表5中的氨基酸序列的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)，或是由表4中的核酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码的。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于表2A-2C、表6、表4或表5中所示的或由表4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，抗tau抗体包括轻链CDR中的取代，例如轻链CDR1、CDR2和/或CDR3中的一个或多个取代。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自重链可变区和轻链可变区的包含表2A-2C、表6、表4或表5中所示的氨基酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或集体全部CDR)，或是由表4中所示的核苷酸序列编码的。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于表2A-2C、表6、表4或表5中所示的CDR具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失，或由表4中所示的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含来自重链可变区的所有三个CDR、来自轻链可变区的所有三个CDR或两者(例如，来自重链可变区和轻链可变区的所有六个CDR)(其包含表2A-2C、表6、表4或表5中所示的氨基酸序列)，或是由表4中所示的核苷酸序列编码的。
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可包括通过以下方式鉴定的CDR：经由与结合抗原的共结晶法对本文呈现的可变结构域序列的CDR分析；通过基于与其他抗体的比较的计算评估(例如，参见Strohl，W.R.Therapeutic Antibody Engineering.WoodheadPublishing，Philadelphia PA.2012.第3章，第47-54页)；或如先前所述的Kabat、Chothia、Al-Lazikani、Lefranc或Honegger编号方案。
表2A：所选抗体的基于Kabat编号系统的CDR序列
Figure BDA0003992935460001111
表2B：所选抗体的基于Chothia编号系统的CDR序列
Figure BDA0003992935460001112
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Figure BDA0003992935460001121
表2C：所选抗体的基于IMGT编号系统的CDR序列
Figure BDA0003992935460001122
表3.示例性抗Tau抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列
Figure BDA0003992935460001123
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Figure BDA0003992935460001131
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Figure BDA0003992935460001141
表4.示例性抗tau抗体
Figure BDA0003992935460001142
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Figure BDA0003992935460001161
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Figure BDA0003992935460001251
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Figure BDA0003992935460001271
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Figure BDA0003992935460001291
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Figure BDA0003992935460001301
表6.抗tau抗体的示例性重链和轻链CDR氨基酸序列
Figure BDA0003992935460001302
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Figure BDA0003992935460001311
表7.抗tau抗体的示例性FR氨基酸序列
Figure BDA0003992935460001312
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表X.重链和轻链恒定区
Figure BDA0003992935460001332
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Figure BDA0003992935460001391
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Figure BDA0003992935460001401
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：299、343和395的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQID NO：460、518和557的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：299、343、395、460、518和557的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：299、343、395、460、518或557中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1140、1141和395的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：460、518和557的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：1140、1141、395、460、518和557的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1140、1141、395、460、518和557中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1155、1156和1157的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1158、1159和557的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HCCDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1155、1156、1157、1158、1159和557的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体所有CDR)相对于SEQ ID NO：1155、1156、1157、1158、1159和557中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：304、347和400的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQID NO：464、523和562的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：304、347、400、464、523和562的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体所有CDR)相对于SEQ ID NO：304、347、400、464、523和562中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1142、1143和400的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：464、523和562的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：1142、1143、400、464、523和562的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1142、1143、400、464、523和562中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1160、1161和1162的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1163、1164和562的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HCCDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1160、1161、1162、1163、1164和562的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1160、1161、1162、1163、1164和562中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：314、341和410的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQID NO：1154、529和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：314、341、410、1154、529和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：314、341、410、1154、529和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1144、1145和410的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1146、529和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1144、1145、410、1146、529和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1144、1145、410、1146、529和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1165、1166和1167的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：473、528和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1165、1166、1167、473、528和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1165、1166、1167、473、528和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：315、341和410的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQID NO：474、529和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：315、341、410、474、529和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：315、341、410、474、529和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1147、1148和410的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：474、529和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：1147、1148、410、474、529和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1147、1148、410、474、529和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1168、1169和1167的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1170、528和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HCCDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1168、1169、1167、1170、528和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1168、1169、1167、1170、528和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：316、341和410的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQID NO：475、530和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：316、341、410、475、530和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：316、341、410、475、530和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1149、1150和410的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：475、530和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：1149、1150、410、475、530和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1149、1150、410、475、530和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1171、1166和1167的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1172、528和571的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HCCDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1171、1166、1167、1172、528和571的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1171、1166、1167、1172、528和571中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：325、362和435的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQID NO：495、540和587的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：325、362、435、495、540和587的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：325、362、435、495、540和587中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1152、1153和435的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：495、540和587的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3序列分别包含SEQ ID NO：1152、1153、435、495、540和587的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1152、1153、435、495、540和587中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链互补决定区1(HC CDR1)、HC CDR2和/或HCCDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3序列分别包含SEQID NO：1173、1174和1175的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含LC CDR1、LC CDR2和/或LC CDR3中的至少一个、两个、三个或全部，其中LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1176、1177和587的序列。在一些实施方案中，抗tau抗体包含HC CDR1、HCCDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3序列分别包含SEQ ID NO：1173、1174、1175、1176、1177和587的序列。在一些实施方案中，所述CDR中的一个或多个(或集体全部CDR)相对于SEQ ID NO：1173、1174、1175、1176、1177和587中的任一者的氨基酸序列具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个变化，例如氨基酸取代、插入或缺失。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：150的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：78的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：224的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO：4和78的氨基酸序列；或分别由SEQ ID NO：150和224的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，编码抗tau抗体的重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：150的核苷酸序列或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列一致性)的序列；和/或编码轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：224的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列一致性)的序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：155的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：83的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：229的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO：9和83的氨基酸序列；或分别由SEQ ID NO：155和229的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，编码抗tau抗体的重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：155的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列；和/或编码轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：229的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：167的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：93的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：241的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO：21和93的氨基酸序列；或分别由SEQ ID NO：167和241的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，编码抗tau抗体的重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：167的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列；和/或编码轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：241的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：168的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：94的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：242的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO：22和94的氨基酸序列；或分别由SEQ ID NO：168和242的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，编码抗tau抗体的重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：168的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列；和/或编码轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：242的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：169的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：95的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：243的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO：23和95的氨基酸序列；或分别由SEQ ID NO：169和243的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，编码抗tau抗体的重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：169的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列；和/或编码轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：243的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：197的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：122的氨基酸序列；或由SEQ ID NO：270的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，抗tau抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区分别包含SEQ ID NO：51和122的氨基酸序列；或分别由SEQ ID NO：197和270的核苷酸序列，或与前述序列中的任一者基本上相同(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列编码。在一些实施方案中，编码抗tau抗体的重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：197的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列；和/或编码轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO：270的核苷酸序列，或基本上相同(例如具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的序列。
在一些实施方案中，抗tau抗体包含由密码子优化的核酸序列编码的VH和/或VL。密码子优化可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现，诸如但不限于通过根据Genescript、EMBOSS、Bioinformatics、NUS、NUS2、Geneinfinity、IDT、NUS3、GregThatcher、Insilico、Molbio、N2P、Snapgene和/或VectorNTI的方法。
可以使用本文呈现的抗体序列中的任一者(例如，可变结构域氨基酸序列、可变结构域氨基酸序列对、CDR氨基酸序列、可变结构域CDR氨基酸序列集合、可变结构域CDR氨基酸序列集合对和/或框架区氨基酸序列)制备根据本公开的抗tau抗体，任何抗tau抗体均可制备为例如单克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、抗体模拟物、scFv或抗体片段。
在一些实施方案中，使用本文呈现的抗体序列中的任一者的抗tau抗体可以制备为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。当制备为小鼠IgG抗体时，抗tau抗体可制备为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3同种型。当制备为人IgG抗体时，抗tau抗体可制备为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。制备为人抗体或人源化抗体的抗tau抗体可以包括一个或多个人恒定结构域。
在一些实施方案中，本公开提供了编码上述抗体中任一种的核酸(例如，分离的核酸)，以及包含所述核酸的病毒基因组、载体、AAV颗粒和细胞。
Tau蛋白抗原
在一些实施方案中，抗tau抗体与tau蛋白抗原，例如tau蛋白上的表位结合。Tau蛋白抗原可包括人微管相关蛋白tau同种型2(SEQ ID NO：920)或其片段。Tau蛋白抗原可包括ePHF或其片段。Tau蛋白抗原可包括一个或多个磷酸化残基。此类磷酸化残基可以对应于病理tau中发现的那些残基。在一些实施方案中，tau蛋白抗原包括表8中列出的那些中的任一种。在表中，与每种抗原相关的磷酸化残基加有双下划线。在一些实施方案中，tau蛋白可包括所列序列的变体(例如磷酸化或未磷酸化变体)或片段。
表8.Tau蛋白抗原序列
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在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体与本文所述的tau蛋白抗原上的tau蛋白表位结合。此类tau蛋白表位可以包括表8所列的tau蛋白抗原氨基酸序列或包括在表8所列的tau蛋白抗原氨基酸序列中。在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体与包括由至少两种tau蛋白的复合物形成的区域的tau蛋白表位结合。
在一些实施方案中，本文公开了编码的抗体，所述抗体与前述抗体竞争与tau结合。在一些实施方案中，本文公开了一种抗体，所述抗体与和前述抗tau抗体的表位相同的表位、基本上相同的表位，或与前述抗tau抗体的表位重叠的表位结合。
在一些实施方案中，竞争或交叉竞争是指抗体干扰抗tau抗体(例如本文提供的抗tau抗体)与靶标(例如tau蛋白)结合的能力。对结合的干扰可以是直接的或间接的(例如，通过对抗体或靶标的变构调节)。抗体能够干扰另一种抗体与靶的结合的程度，以及因此是否可以称它竞争，可以使用竞争结合测定，例如FACS测定、ELISA或BIACORE测定来确定。在一些实施方案中，竞争结合测定是定量竞争测定。在一些实施方案中，当在竞争结合测定(例如，本文所述的竞争测定)中第一抗tau抗体与靶标的结合减少10％或更多，例如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、98％或更多、99％或更多时，认为第一抗体与第二抗tau抗体竞争与靶标结合。
在一些实施方案中，表位包含抗原(例如tau蛋白抗原)中与抗体特异性相互作用的部分。此类部分，在本文中称为表位决定簇，通常包含或者是诸如氨基酸侧链或糖侧链的元件的一部分。可以通过本领域已知的或本文公开的方法，例如通过结晶法或通过氢-氘交换来定义表位决定簇。抗体上与表位决定簇特异性相互作用的部分中的至少一个或一些部分通常位于一个或多个CDR中。通常，表位具有特定的三维结构特征。通常，表位具有特定的电荷特征。一些表位是线性表位，而另一些是构象表位。
在一个实施方案中，表位决定簇是抗原上的部分，例如氨基酸侧链或糖侧链，或其一部分，当抗原和抗体共结晶时，所述部分在抗体上的部分的预定距离内，例如在5埃内，在本文中称为结晶表位决定簇。在一些实施方案中，表位的结晶表位决定簇统称为结晶表位。
例如，当以相同的方式测量抗体和第二抗体或参考抗体两者的相互作用时，如果第一抗体和第二抗体或参考抗体特异性地与抗原上相同的表位决定簇相互作用，则第一抗体与第二抗体(例如，参考抗体，例如，本文公开的抗体)结合相同的表位。重叠的表位共有至少一个表位决定簇。当两种抗体与共同的表位决定簇特异性相互作用时，第一抗体与第二抗体(例如参考抗体，例如本文公开的抗体)结合重叠表位。如果发现第二抗体或参考抗体的表位决定簇的至少一半是第一抗体的表位中的表位决定簇，则第一抗体和第二抗体(例如参考抗体，例如本文公开的抗体)结合基本上重叠的表位。如果第一抗体结合第二抗体或参考抗体的表位的核心表位决定簇的至少一半，则第一抗体和第二抗体(例如，参考抗体，例如本文公开的抗体)结合基本上相同的表位，其中核心表位决定簇通过结晶学定义。
表位特异性
本公开的抗体可与tau蛋白表位结合，所述表位可包括SEQ ID NO：920-926的残基或包括在SEQ ID NO：920-926的残基内。抗体可与其他抗tau抗体(包括但不限于AT100、AT120、PT3、C10.2、PT76、IPN002、6C5和UCB D)竞争与tau蛋白表位结合。tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的C端残基409-436。此类表位可以包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基413-430。与此类残基结合的抗体可表现出约0.1nM至约0.5nM的KD。在一些实施方案中，tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基55-76、159-194、219-247和/或381-426。此类表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基57-72、175-191、223-238和/或383-400。与此类残基结合的抗体可表现出约0.5nM至约5nM的KD。
在一些实施方案中，本公开提供了与第二抗体针竞争与tau蛋白表位结合的抗体。此类表位可以包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基32-49、55-76、57-72、159-194、175-191、185-200、219-247、223-238、381-426、383-400、409-436和413-430中的一个或多个。
Tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基409-436和413-430中的一个或多个。竞争与此类表位结合的第二抗体可以包括选自由以下组成的组的可变结构域对：具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：93的氨基酸序列的VL；具有SEQ IDNO：22的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：94的氨基酸序列的VL；以及具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：95的氨基酸序列的VL。
与此类第二抗体竞争tau表位结合的抗体可以包括：CDRH1，其包括G[F/Y]TFT[R/I][Y/F](SEQ ID NO：931)，或更通常地G-X1-TFT-X2-X3(SEQ ID NO：932)的氨基酸序列，其中X1、X2和X3可以是任意氨基酸，例如X1和/或X3可以是具有疏水性和/或芳香族侧链的氨基酸，诸如F或Y，和/或X2可以是带正电荷的残基(诸如R、K、H)或具有脂肪族侧链的残基(诸如A、V、I或L)；CDRH2，其包括NPNNGG(SEQ ID NO：341)的氨基酸序列；CDRH3，其包括GTGTGAMDY(SEQ ID NO：410)的氨基酸序列；CDRL1，其包括氨基酸序列RSSQSLVH[N/S]NG[I/N]T[H/Y]LY(SEQ ID NO：933)，或更通常地RSSQSLVH-X1-NG-X2-T-X3-LY(SEQ ID NO：934)，其中X1、X2和X3可以是任意氨基酸，例如X1是Q/N/S/T和/或X2是A/V/I/L/Q/N和/或X3是H/R/K/Y/F；CDRL2，其包括氨基酸序列RVS[N/S]RFS(SEQ ID NO：935)，或更通常地RVSXRFS(SEQ ID NO：936)，其中X可以是任意氨基酸，例如X1是Q/N/S/T；和/或CDRL3，其包括氨基酸序列FQGTHVPRT(SEQ ID NO：571)。
在一些实施方案中，CDRH1可包括氨基酸序列G[F/Y]TFT[R/I][Y/F](SEQ ID NO：931)。CDRH2可以包括氨基酸序列NPNNGG(SEQ ID NO：341)。CDRH3可以包括氨基酸序列GTGTGAMDY(SEQ ID NO：410)。CDRL1可以包括氨基酸序列RSSQSLVH[N/S]NG[I/N]T[H/Y]LY(SEQ ID NO：933)。CDRL2可以包括氨基酸序列RVS[N/S]RFS(SEQ ID NO：935)。CDRL3可以包括氨基酸序列FQGTHVPRT(SEQ ID NO：571)。
在一些实施方案中，tau蛋白表位可包括人tau(SEQ ID NO：920)的残基57-72、175-191、223-238和/或383-400中的一个或多个。竞争与此类表位结合的第二抗体可以包括选自由以下组成的组的可变结构域对：具有SEQ ID NO：51的氨基酸序列的VH和具有SEQID NO：122的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO：53的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：124的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：125的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：125的氨基酸序列的VL；具有SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：126的氨基酸序列的VL；具有SEQID NO：35的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列的VL；以及具有SEQ IDNO：48的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列的VL。
与此类第二抗体竞争tau表位结合的抗体可以包括：CDRH1，其包括GFSL[S/N]T[S/F][A/G]M(SEQ ID NO：964)，或更通常地GFSL-X1-T-X2-X3-M(SEQ ID NO：965)的氨基酸序列，其中X1-X3可以是任意氨基酸，例如X1是S/T/N/Q和/或X2是S/T/F/Y和/或X3是G/A/I/L/V；CDRH2，其包括氨基酸序列YWDDD(SEQ ID NO：362)；CDRH3，其包括氨基酸序列R[R/V/K/S/G][Y/R][Y/不存在][S/不存在][不存在/N][G/S/Y/R][Y/N/G][G/A/Y/N][M/F/Y]DY(SEQID NO：974)，或更通常地R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-DY(SEQ ID NO：975)，其中X1-X9中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X3-X5中的一个或多个可以不存在，例如X1是R/K/H/A/V/I/L/G/S/T和/或X2是Y/F/R/K/H和/或X3是Y/F/不存在的和/或X4是S/T/不存在的和/或X5是N/Q/不存在的和/或X6是G/A/V/I/L/S/T/Y/F/R/K/H和/或X7是Y/F/N/Q/G/A/V/I/L和/或X8是G/A/V/I/L/Y/F/N/Q和/或X9是M/F/Y；CDRL1，其包括氨基酸序列[K/S][S/A]S[Q/S]S[L/I/V][L/S][N/S/D][D/S/T][V/G/D/Y][N/G/不存在][Q/不存在][K/不存在][N/T/不存在][Y/不存在][L/不存在][A/H/N](SEQ ID NO：976)，或更通常地X1-X2-S-X3-S-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO：977)，其中X1-X15中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X9-X14中的一个或多个可以不存在，例如X1是K/R/H/S/T和/或X2是S/T/A/V/I/L和/或X3是Q/N/S/T和/或X4是L/I/V/A和/或X5是A/V/I/L/S/T和/或X6是N/Q/S/T/D/E和/或X7是D/E/S/T和/或X8是G/A/V/I/L/D/E/Y/F和/或X9是N/Q/G/A/不存在的和/或X10是Q/N/不存在的和/或X11是K/R/H/不存在的和/或X12是N/Q/T/S/不存在的和/或X13是Y/F/不存在的和/或X14是A/V/I/L/不存在的和/或X15是A/V/I/L/H/K/R/N/Q；CDRL2，其包括氨基酸序列[Y/G/L/R][A/T/V]S[N/T/K][R/L][C/E/D/A][T/S](SEQ ID NO：978)，或更通常地X1-X2-S-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO：979)，其中X1-X6可以是任意氨基酸，例如X1是Y/F/G/A/V/I/L/R/K/H和/或X2是A/V/I/L/T/S和/或X3是N/Q/T/S/K/R/H和/或X4是R/K/H/A/V/I/L和/或X5是C/S/E/D/A/V/I/L和/或X6是T/S；和/或CDRL3，其包括氨基酸序列[W/Q][Q/N][G/D][T/S/Y/H][H/S/R][F/I/S/H]P[Q/R/L/Y][不存在的/Y]T(SEQ ID NO：980)，或更通常地X1-X2-X3-X4-X5-X6-P-X7-X8-T(SEQ ID NO：981)，其中X1-X8中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X8可以不存在，例如X1是Q/N/W/F/Y和/或X2是Q/N和/或X3是G/A/V/I/L/D/E和/或X4是T/S/Y/F/H/K/R和/或X5是H/K/R/S/T和/或X6是F/Y；A/V/I/L/S/T/H/K/R和/或X7是Q/N/R/K/H/A/V/I/L/Y/F和/或X8是Y/F/不存在的。
CDRH1可以包括氨基酸序列GFSL[S/N]T[S/F][A/G]M(SEQ ID NO：964)。CDRH2可以包括氨基酸序列YWDDD(SEQ ID NO：362)。CDRH3可以包括氨基酸序列R[R/V/K/S/G][Y/R][Y/不存在][S/不存在][不存在/N][G/S/Y/R][Y/N/G][G/A/Y/N][M/F/Y]DY(SEQ ID NO：974)。CDRL1可以包括氨基酸序列[K/S][S/A]S[Q/S]S[L/I/V][L/S][N/S/D][D/S/T][V/G/D/Y][N/G/不存在][Q/不存在][K/不存在][N/T/不存在][Y/不存在][L/不存在][A/H/N](SEQ ID NO：976)。CDRL2可以包括氨基酸序列[Y/G/L/R][A/T/V]S[N/T/K][R/L][C/E/D/A][T/S](SEQ ID NO：978)。CDRL3可以包括氨基酸序列[W/Q][Q/N][G/D][T/S/Y/H][H/S/R][F/I/S/H]P[Q/R/L/Y][不存在/Y]T(SEQ ID NO：980)。
II.载体化
根据本公开，提供了用于通过腺相关病毒颗粒(AAV)递送抗tau抗体或其功能变体的组合物。在一些实施方案中，AAV颗粒(例如，本文所述的AAV颗粒)或多个颗粒可以在体内、离体或在体外经由几种施用途径中的任一种提供，例如递送至细胞、组织、器官或生物体。
如本文所用，“AAV颗粒”是包含衣壳和具有至少一个有效载荷区和至少一个反向末端重复序列(ITR)区的病毒基因组的病毒。
如本文所用，“病毒基因组”或“载体基因组”是指封装在AAV颗粒中的核酸序列。病毒基因组包含至少一个编码多肽(例如，抗体、基于抗体的组合物或其片段)的有效载荷区。
如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是编码一个或多个多肽的任何核酸分子。至少，有效载荷区包含编码抗体、基于抗体的组合物或其片段的核酸序列，但也可任选地包含一个或多个促进转录表达和/或多肽翻译的功能或调控元件。
在一些实施方案中，AAV颗粒、病毒基因组和/或有效载荷及其使用方法可以如WO2017189963或WO2020223276中所述，其各自的内容通过引用整体并入本文。
本文公开的核酸序列、病毒基因组和多肽可以工程化为含有组装的模块元件和/或序列基序，以使得抗体或其功能变体(例如，本文所述的抗体)的表达成为可能。在一些实施方案中，核酸序列编码包含以下的一者或多者的抗体：抗体的CDR(例如，重链和/或轻链CDR)、可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区、重链和/或轻链恒定区或其组合。在一些实施方案中，编码抗体的核酸序列还可以编码接头，例如使得抗体的VH/重链和VL/轻链经由接头连接。在一些实施方案中，病毒基因组还可包含启动子区、内含子、Kozak序列、增强子或聚腺苷酸化序列。表达顺序、结构位置或多联体计数(例如，VH、VL、重链、轻链和/或接头)可以不同地处于不同的有效载荷区内或之中。由有效载荷区表达的接头的特性、位置和数目也可以变化。在一些实施方案中，有效载荷是包含一个或多个人源化抗体序列的区域，人源化抗体序列诸如但不限于人源化抗体VL、轻链结构域和/或人源化抗体VH、重链结构域或其片段。
在一些实施方案中，本公开提供用于将包含在重组AAV颗粒(例如，本文所述的AAV颗粒)内的病毒基因组内所包含的抗体(例如，本文所述的抗tau抗体)和/或编码抗体(例如本文所述的抗tau抗体)的核酸序列递送至细胞、组织、器官或受试者的方法。
腺相关病毒(AAV)和AAV颗粒
在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)是以单链DNA病毒基因组为特征的细小病毒科(Parvoviridae)的小的无包膜二十面体衣壳病毒。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒科包括依赖病毒属(Dependovirus)，依赖病毒属包括AAV。在一些实施方案中，AAV能够在脊椎动物宿主中复制，所述脊椎动物宿主包括但不限于人、灵长类、牛、犬、马和绵羊。
细小病毒和细小病毒科的其他成员在Kenneth I.Berns，“Parvoviridae：TheViruses and Their Replication，”FIELDS VIROLOGY第69章(1996年第3版)中有大体描述，其内容通过引用整体并入。
已经证明AAV可用作生物工具，这是由于它们的结构相对简单，它们能够感染各种细胞(包括休眠细胞和分裂细胞)而不整合到宿主基因组中并且不复制，以及它们相对良性的免疫原性特征。可以操纵病毒的基因组以含有用于组装功能性重组病毒或病毒颗粒的最少组分，所述功能性重组病毒或病毒颗粒负载或工程化以靶向特定组织并表达或递送所需的有效载荷。
野生型AAV载体基因组是长度大约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA(ssDNA)分子。反向末端重复序列(ITR)传统上为病毒基因组的5′末端和3′末端加帽，为病毒基因组提供复制起点。虽然不希望受理论束缚，但是AAV病毒基因组通常包含两个ITR序列。这些ITR具有由ssDNA的形成能量稳定的双链区的5′末端和3′末端处的自身互补区(在野生型AAV中为145nt)限定的特征性T形发夹结构。双链发夹结构包含多种功能，包括但不限于通过起到宿主病毒复制细胞的内源DNA聚合酶复合物的引物的作用而充当DNA复制起点。
野生型AAV病毒基因组还包含两个开放阅读框的核苷酸序列，一个开放阅读框用于四种非结构Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，由Rep基因编码)，一个开放阅读框用于三种衣壳或结构蛋白(VP1、VP2、VP3，由衣壳基因或Cap基因编码)。Rep蛋白对于复制和包装很重要，而衣壳蛋白经组装以产生AAV或AAV衣壳的蛋白壳。选择性剪接和交替起始密码子和启动子引起从单个开放阅读框生成四种不同的Rep蛋白以及从单个开放阅读框生成三种衣壳蛋白。尽管因AAV血清型而不同，但作为非限制性示例，对于AAV9/hu.14(US 7,906,111的SEQ ID NO：123，其内容通过引用整体并入本文中)，VP1是指氨基酸1-736，VP2是指氨基酸138-736，并且VP3是指氨基酸203-736。换句话说，VP1是全长衣壳序列，而VP2和VP3是整体的较短组分。因此，VP3区中序列的变化也是VP1和VP2的变化，然而，与亲本序列相比，VP3的百分比差异最大，因为它是三者中最短的序列。尽管这里关于氨基酸序列进行描述，但是可以类似地描述编码这些蛋白质的核酸序列。三个衣壳蛋白一起组装产生AAV衣壳蛋白。虽然不希望受理论束缚，但是AAV衣壳蛋白通常包含1∶1∶10摩尔比的VP1∶VP2∶VP3。如本文所用，“AAV血清型”主要由AAV衣壳限定。在一些情况下，ITR也具体地按照AAV血清型(例如AAV2/9)来描述。
为了用作生物工具，可以修饰野生型AAV病毒基因组以用包含具有至少一个ITR区的有效载荷区的核酸序列置换rep/cap序列。通常，在重组AAV病毒基因组中有两个ITR区。在生产过程中可以反式提供rep/cap序列以生成AAV颗粒。
除了编码的异源有效载荷之外，AAV载体可以包含任何天然存在的和/或重组AAV血清型核苷酸序列或变体的整个或部分病毒基因组。AAV变体可在核酸水平(基因组或衣壳)和氨基酸水平(衣壳)上具有显著同源性的序列，以产生通常为物理和功能等效物，通过类似机制复制，并通过类似机制组装的构建体。Chiorini等人，J.Vir.71：6823-33(1997)；Srivastava等人，J.Vir.45：555-64(1983)；Chiorini等人，J.Vir.73：1309-1319(1999)；Rutledge等人，J.Vir.72：309-319(1998)；和Wu等人，J.Vir.74：8635-47(2000)，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是重组AAV病毒载体，其是复制缺陷型的并且在其病毒基因组内缺乏编码功能性Rep和Cap蛋白的序列。这些缺陷型AAV载体可能缺乏大多数或所有亲本编码序列并且基本上仅携带一个或两个AAV ITR序列和用于递送至细胞、组织、器官或生物体的感兴趣的核酸。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个控制元件，该控制元件提供其中所编码的编码序列的复制、转录和翻译。只要编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和/或翻译，并非所有控制元件总是需要存在。表达控制元件的非限制性示例包括用于转录起始和/或终止的序列、启动子和/或增强子序列、有效的RNA加工信号序列(诸如剪接和多聚腺苷酸化信号序列)、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译功效的序列(例如，Kozak共有序列)、增强蛋白质稳定性的序列和/或增强蛋白质加工和/或分泌的序列。
根据本公开，用于治疗学和/或诊断学中的AAV颗粒包含病毒，该病毒已被蒸馏或减少至转导感兴趣的核酸有效载荷或货物所需的最小组分。以这种方式，将AAV颗粒工程化为用于特异性递送的媒介物，同时缺乏在野生型病毒中发现的有害的复制和/或整合特征。
本公开的AAV载体可以重组产生并且可以基于腺相关病毒(AAV)亲本序列或参考序列。如本文所用，“载体”是运输、转导或以其他方式充当异源分子(诸如本文所述的核酸)的载剂的任何分子或部分。
除了单链AAV病毒基因组(例如，ssAAV)之外，本公开还提供了自身互补AAV(scAAV)病毒基因组。scAAV载体基因组含有一起退火形成双链DNA的DNA链。通过跳过第二链合成，scAAV允许在转导细胞中快速表达。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是scAAV。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是ssAAV。
用于产生和/或修饰AAV颗粒的方法在本领域中公开，诸如假型AAV载体(PCT专利公开第WO200028004号、第WO200123001号、第WO2004112727号、第WO2005005610号和第WO2005072364号，其各自的内容通过引用整体并入本文)。
可以修饰AAV颗粒以增强递送效率。此类经修饰的AAV颗粒可以有效地包装并用于以高频率和最小毒性成功地感染靶细胞。在一些实施方案中，根据美国公开第US20130195801号中描述的方法工程化AAV颗粒的衣壳，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以将包含编码多肽的有效载荷区的AAV颗粒引入哺乳动物细胞中。
AAV血清型
在一些实施方案中，AAV颗粒，例如用于载体化递送本文所述的抗体(例如，抗tau抗体)的AAV颗粒可包含或源自任何天然或重组AAV血清型。本公开的AAV颗粒可包含或源自任何天然或重组AAV血清型。根据本公开，AAV颗粒可以利用或基于一血清型或包含选自以下中的任一种的肽：VOY101、VOY201、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3 (PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3 (G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9 K449R、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAVSM 10-2、AAV改组100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAV SM10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真实型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAVCBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAVCHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P 1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAVCKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAVCKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAVCKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAVCLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAVCLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAVCLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAVCLv-D8、AAV CLv-E 1、AAV CLv-K1、AAVCLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAVCLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAVCLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAVCSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8和/或AAVF9/HSC9及其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国公开第US20030138772号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV1(US20030138772的SEQ IDNO：6和64)、AAV2(US20030138772的SEQ ID NO：7和70)、AAV3(US20030138772的SEQ ID NO：8和71)、AAV4(US20030138772的SEQ ID NO：63)、AAV5(US20030138772的SEQ ID NO：114)、AAV6(US20030138772的SEQ ID NO：65)、AAV7(US20030138772的SEQ ID NO：1-3)、AAV8(US20030138772的SEQ ID NO：4和95)、AAV9(US20030138772的SEQ ID NO：5和100)、AAV10(US20030138772的SEQ ID NO：117)、AAV11(US20030138772的SEQ ID NO：118)、AAV12(US20030138772的SEQ ID NO：119)、AAVrh10(US20030138772的SEQ ID NO：81的氨基酸1至738)、AAV16.3(US20030138772SEQ ID NO：10)、AAV29.3/bb.1(US20030138772 SEQ ID NO：11)、AAV29.4(US20030138772 SEQ ID NO：12)、AAV29.5/bb.2(US20030138772 SEQ ID NO：13)、AAV1.3(US20030138772 SEQ ID NO：14)、AAV13.3(US20030138772 SEQ ID NO：15)、AAV24.1(US20030138772 SEQ ID NO：16)、AAV27.3(US20030138772 SEQ ID NO：17)、AAV7.2(US20030138772 SEQ ID NO：18)、AAVC1(US20030138772 SEQ ID NO：19)、AAVC3(US20030138772 SEQ ID NO：20)、AAVC5(US20030138772 SEQ ID NO：21)、AAVF1(US20030138772 SEQ ID NO：22)、AAVF3(US20030138772 SEQ ID NO：23)、AAVF5(US20030138772 SEQ ID NO：24)、AAVH6(US20030138772SEQ ID NO：25)、AAVH2(US20030138772SEQ ID NO：26)、AAV42-8(US20030138772SEQ ID NO：27)、AAV42-15(US20030138772 SEQ ID NO：28)、AAV42-5b(US20030138772 SEQ ID NO：29)、AAV42-1b(US20030138772 SEQ ID NO：30)、AAV42-13(US20030138772 SEQ ID NO：31)、AAV42-3a(US20030138772 SEQ ID NO：32)、AAV42-4(US20030138772 SEQ ID NO：33)、AAV42-5a(US20030138772 SEQ ID NO：34)、AAV42-10(US20030138772 SEQ ID NO：35)、AAV42-3b(US20030138772 SEQ ID NO：36)、AAV42-11(US20030138772 SEQ ID NO：37)、AAV42-6b(US20030138772 SEQ ID NO：38)、AAV43-1(US20030138772 SEQ ID NO：39)、AAV43-5(US20030138772 SEQ ID NO：40)、AAV43-12(US20030138772 SEQ ID NO：41)、AAV43-20(US20030138772 SEQ ID NO：42)、AAV43-21(US20030138772 SEQ ID NO：43)、AAV43-23(US20030138772 SEQ ID NO：44)、AAV43-25(US20030138772SEQ ID NO：45)、AAV44.1(US20030138772 SEQ ID NO：46)、AAV44.5(US20030138772 SEQ ID NO：47)、AAV223.1(US20030138772 SEQ ID NO：48)、AAV223.2(US20030138772SEQ ID NO：49)、AAV223.4(US20030138772SEQ ID NO：50)、AAV223.5(US20030138772 SEQ ID NO：51)、AAV223.6(US20030138772SEQ ID NO：52)、AAV223.7(US20030138772SEQ ID NO：53)、AAVA3.4(US20030138772 SEQ ID NO：54)、AAVA3.5(US20030138772SEQ ID NO：55)、AAVA3.7(US20030138772SEQ ID NO：56)、AAVA3.3(US20030138772 SEQ ID NO：57)、AAV42.12(US20030138772 SEQ ID NO：58)、AAV44.2(US20030138772 SEQ ID NO：59)、AAV42-2(US20030138772 SEQ ID NO：9)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国公开第US20150159173号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV2(US20150159173的SEQ IDNO：7和23)、rh20(US20150159173的SEQ ID NO：1)、rh32/33(US20150159173的SEQ ID NO：2)、rh39(US20150159173的SEQ ID NO：3、20和36)、rh46(US20150159173的SEQ ID NO：4和22)、rh73(US20150159173的SEQ ID NO：5)、rh74(US20150159173的SEQ ID NO：6)、AAV6.1(US20150159173的SEQ ID NO：29)、rh.8(US20150159173的SEQ ID NO：41)、rh.48.1(US20150159173的SEQ ID NO：44)、hu.44(US20150159173的SEQ ID NO：45)、hu.29(US20150159173的SEQ ID NO：42)、hu.48(US20150159173的SEQ ID NO：38)、rh54(US20150159173的SEQ ID NO：49)、AAV2(US20150159173的SEQ ID NO：7)、cy.5(US20150159173的SEQ ID NO：8和24)、rh.10(US20150159173的SEQ ID NO：9和25)、rh.13(US20150159173的SEQ ID NO：10和26)、AAV1(US20150159173的SEQ ID NO：11和27)、AAV3(US20150159173的SEQ ID NO：12和28)、AAV6(US20150159173的SEQ ID NO：13和29)、AAV7(US20150159173的SEQ ID NO：14和30)、AAV8(US20150159173的SEQ ID NO：15和31)、hu.13(US20150159173的SEQ ID NO：16和32)、hu.26(US20150159173的SEQ ID NO：17和33)、hu.37(US20150159173的SEQ ID NO：18和34)、hu.53(US20150159173的SEQ ID NO：19和35)、rh.43(US20150159173的SEQ ID NO：21和37)、rh2(US20150159173的SEQ ID NO：39)、rh.37(US20150159173的SEQ ID NO：40)、rh.64(US20150159173的SEQ ID NO：43)、rh.48(US20150159173的SEQ ID NO：44)、ch.5(US20150159173的SEQ ID NO46)、rh.67(US20150159173的SEQ ID NO：47)、rh.58(US20150159173的SEQ ID NO：48)或其变体，包括但不限于Cy5R1、Cy5R2、Cy5R3、Cy5R4、rh.13R、rh.37R2、rh.2R、rh.8R、rh.48.1、rh.48.2、rh.48.1.2、hu.44R1、hu.44R2、hu.44R3、hu.29R、ch.5R1、rh64R1、rh64R2、AAV6.2、AAV6.1、AAV6.12、hu.48R1、hu.48R2和hu.48R3。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利第US 7198951号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV9(US 7198951的SEQ ID NO：1-3)、AAV2(US 7198951的SEQ ID NO：4)、AAV1(US 7198951的SEQ ID NO：5)、AAV3(US7198951的SEQ ID NO：6)和AAV8(US7198951的SEQ ID NO：7)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是AAV9序列或在其中具有突变，如NPulicherla等人所述(Molecular Therapy 19(6)：1070-1078(2011)，其通过引用整体并入本文)，诸如但不限于AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利第US 6156303号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV3B(US 6156303的SEQ ID NO：1和10)、AAV6(US 6156303的SEQ ID NO：2、7和11)、AAV2(US 6156303的SEQ ID NO：3和8)、AAV3A(US 6156303的SEQ ID NO：4和9)或其衍生物。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国公开第US20140359799号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV8(US20140359799的SEQ IDNO：1)、AAVDJ(US20140359799的SEQ ID NO：2和3)或其变体。
在一些实施方案中，血清型可以是AAVDJ或其变体，诸如AAVDJ8(或AAV-DJ8)，如Grimm等人所述(Journal ofVirology 82(12)：5887-5911(2008)，其通过引用整体并入本文)。AAVDJ8的氨基酸序列可包含两个或更多个突变以便去除肝素结合结构域(HBD)。作为非限制性示例，通过引用整体并入本文的美国专利第7,588,772号中描述为SEQ ID NO：1的AAV-DJ序列可包含两个突变：(1)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)和(2)R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。作为另一个非限制性示例，可以包含三个突变：(1)K406R，其中氨基酸406处的赖氨酸(K；Lys)变为精氨酸(R；Arg)，(2)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)和(3)R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如国际公开第WO1998011244号中描述的AAV4序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV4(WO1998011244的SEQ IDNO：1-20)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是AAV2序列或在其中具有突变以生成AAV2G9，如国际公开第WO2014144229号中所述并且通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如国际公开第WO2005033321号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV3-3(WO2005033321的SEQ IDNO：217)、AAV1(WO2005033321的SEQ ID NO：219和202)、AAV106.1/hu.37(WO2005033321的SEQ ID No：10)、AAV114.3/hu.40(WO2005033321的SEQ ID No：11)、AAV127.2/hu.41(WO2005033321的SEQ ID NO：6和8)、AAV128.3/hu.44(WO2005033321的SEQ ID No：81)、AAV130.4/hu.48(WO2005033321的SEQ ID NO：78)、AAV145.1/hu.53(WO2005033321的SEQID No：176和177)、AAV145.6/hu.56(WO2005033321的SEQ ID NO：168和192)、AAV16.12/hu.11(WO2005033321的SEQ ID NO：153和57)、AAV16.8/hu.10(WO2005033321的SEQ ID NO：156和56)、AAV161.10/hu.60(WO2005033321的SEQ ID No：170)、AAV161.6/hu.61(WO2005033321的SEQ IDNo：174)、AAV1-7/rh.48(WO2005033321的SEQ ID NO：32)、AAV1-8/rh.49(WO2005033321的SEQ ID NO：103和25)、AAV2(WO2005033321的SEQ ID NO：211和221)、AAV2-15/rh.62(WO2005033321的SEQ ID No：33和114)、AAV2-3/rh.61(WO2005033321的SEQ ID NO：21)、AAV2-4/rh.50(WO2005033321的SEQ ID No：23和108)、AAV2-5/rh.51(WO2005033321的SEQ ID NO：104和22)、AAV3.1/hu.6(WO2005033321的SEQ ID NO：5和84)、AAV3.1/hu.9(WO2005033321的SEQ ID NO：155和58)、AAV3-11/rh.53(WO2005033321的SEQID NO：186和176)、AAV3-3(WO2005033321的SEQ ID NO：200)、AAV33.12/hu.17(WO2005033321的SEQ ID NO：4)、AAV33.4/hu.15(WO2005033321的SEQ ID No：50)、AAV33.8/hu.16(WO2005033321的SEQ ID No：51)、AAV3-9/rh.52(WO2005033321的SEQ IDNO：96和18)、AAV4-19/rh.55(WO2005033321的SEQ ID NO：117)、AAV4-4(WO2005033321的SEQ ID NO：201和218)、AAV4-9/rh.54(WO2005033321的SEQ ID NO：116)、AAV5(WO2005033321的SEQ ID NO：199和216)、AAV52.1/hu.20(WO2005033321的SEQ ID NO：63)、AAV52/hu.19(WO2005033321的SEQ ID NO：133)、AAV5-22/rh.58(WO2005033321的SEQ IDNo：27)、AAV5-3/rh.57(WO2005033321的SEQ ID NO：105)、AAV5-3/rh.57(WO2005033321的SEQ ID No：26)、AAV58.2/hu.25(WO2005033321的SEQ ID No：49)、AAV6(WO2005033321的SEQ ID NO：203和220)、AAV7(WO2005033321的SEQ ID NO：222和213)、AAV7.3/hu.7(WO2005033321的SEQ ID No：55)、AAV8(WO2005033321的SEQ ID NO：223和214)、AAVH-1/hu.1(WO2005033321的SEQ ID No：46)、AAVH-5/hu.3(WO2005033321的SEQ ID No：44)、AAVhu.1(WO2005033321的SEQ ID NO：144)、AAVhu.10(WO2005033321的SEQ ID NO：156)、AAVhu.11(WO2005033321的SEQ ID NO：153)、AAVhu.12(WO2005033321SEQ ID NO：59)、AAVhu.13(WO2005033321的SEQ ID NO：129)、AAVhu.14/AAV9(WO2005033321的SEQ ID NO：123和3)、AAVhu.15(WO2005033321的SEQ ID NO：147)、AAVhu.16(WO2005033321的SEQ IDNO：148)、AAVhu.17(WO2005033321的SEQ ID NO：83)、AAVhu.18(WO2005033321的SEQ IDNO：149)、AAVhu.19(WO2005033321的SEQ ID NO：133)、AAVhu.2(WO2005033321的SEQ IDNO：143)、AAVhu.20(WO2005033321的SEQ ID NO：134)、AAVhu.21(WO2005033321的SEQ IDNO：135)、AAVhu.22(WO2005033321的SEQ ID NO：138)、AAVhu.23.2(WO2005033321的SEQ IDNO：137)、AAVhu.24(WO2005033321的SEQ ID NO：136)、AAVhu.25(WO2005033321的SEQ IDNO：146)、AAVhu.27(WO2005033321的SEQ ID NO：140)、AAVhu.29(WO2005033321的SEQ IDNO：132)、AAVhu.3(WO2005033321的SEQ ID NO：145)、AAVhu.31(WO2005033321的SEQ IDNO：121)、AAVhu.32(WO2005033321的SEQ ID NO：122)、AAVhu.34(WO2005033321的SEQ IDNO：125)、AAVhu.35(WO2005033321的SEQ ID NO：164)、AAVhu.37(WO2005033321的SEQ IDNO：88)、AAVhu.39(WO2005033321的SEQ ID NO：102)、AAVhu.4(WO2005033321的SEQ ID NO：141)、AAVhu.40(WO2005033321的SEQ ID NO：87)、AAVhu.41(WO2005033321的SEQ ID NO：91)、AAVhu.42(WO2005033321的SEQ ID NO：85)、AAVhu.43(WO2005033321的SEQ ID NO：160)、AAVhu.44(WO2005033321的SEQ ID NO：144)、AAVhu.45(WO2005033321的SEQ ID NO：127)、AAVhu.46(WO2005033321的SEQ ID NO：159)、AAVhu.47(WO2005033321的SEQ ID NO：128)、AAVhu.48(WO2005033321的SEQ ID NO：157)、AAVhu.49(WO2005033321的SEQ ID NO：189)、AAVhu.51(WO2005033321的SEQ ID NO：190)、AAVhu.52(WO2005033321的SEQ ID NO：191)、AAVhu.53(WO2005033321的SEQ ID NO：186)、AAVhu.54(WO2005033321的SEQ ID NO：188)、AAVhu.55(WO2005033321的SEQ ID NO：187)、AAVhu.56(WO2005033321的SEQ ID NO：192)、AAVhu.57(WO2005033321的SEQ ID NO：193)、AAVhu.58(WO2005033321的SEQ ID NO：194)、AAVhu.6(WO2005033321的SEQ ID NO：84)、AAVhu.60(WO2005033321的SEQ ID NO：184)、AAVhu.61(WO2005033321的SEQ ID NO：185)、AAVhu.63(WO2005033321的SEQ ID NO：195)、AAVhu.64(WO2005033321的SEQ ID NO：196)、AAVhu.66(WO2005033321的SEQ ID NO：197)、AAVhu.67(WO2005033321的SEQ ID NO：198)、AAVhu.7(WO2005033321的SEQ ID NO：150)、AAVhu.8(WO2005033321SEQ ID NO：12)、AAVhu.9(WO2005033321的SEQ ID NO：155)、AAVLG-10/rh.40(WO2005033321的SEQ ID No：14)、AAVLG-4/rh.38(WO2005033321的SEQ IDNO：86)、AAVLG-4/rh.38(WO2005033321的SEQ ID No：7)、AAVN721-8/rh.43(WO2005033321的SEQ ID NO：163)、AAVN721-8/rh.43(WO2005033321的SEQ ID No：43)、AAVpi.l(WO2005033321SEQ ID NO：28)、AAVpi.2(WO2005033321SEQ ID NO：30)、AAVpi.3(WO2005033321SEQ ID NO：29)、AAVrh.38(WO2005033321的SEQ ID NO：86)、AAVrh.40(WO2005033321的SEQ ID NO：92)、AAVrh.43(WO2005033321的SEQ ID NO：163)、AAVrh.44(WO2005033321SEQ ID NO：34)、AAVrh.45(WO2005033321 SEQ ID NO：41)、AAVrh.47(WO2005033321SEQ ID NO：38)、AAVrh.48(WO2005033321的SEQ ID NO：115)、AAVrh.49(WO2005033321的SEQ ID NO：103)、AAVrh.50(WO2005033321的SEQ ID NO：108)、AAVrh.51(WO2005033321的SEQ ID NO：104)、AAVrh.52(WO2005033321的SEQ ID NO：96)、AAVrh.53(WO2005033321的SEQ ID NO：97)、AAVrh.55(WO2005033321 SEQ ID NO：37)、AAVrh.56(WO2005033321的SEQ ID NO：152)、AAVrh.57(WO2005033321的SEQ ID NO：105)、AAVrh.58(WO2005033321的SEQ ID NO：106)、AAVrh.59(WO2005033321 SEQ ID NO：42)、AAVrh.60(WO2005033321 SEQ ID NO：31)、AAVrh.61(WO2005033321的SEQ ID NO：107)、AAVrh.62(WO2005033321的SEQ ID NO：114)、AAVrh.64(WO2005033321的SEQ ID NO：99)、AAVrh.65(WO2005033321 SEQ ID NO：35)、AAVrh.68(WO2005033321 SEQ ID NO：16)、AAVrh.69(WO2005033321 SEQ ID NO：39)、AAVrh.70(WO2005033321 SEQ ID NO：20)、AAVrh.72(WO2005033321 SEQ ID NO：9)或其变体，包括但不限于AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVcy.6、AAVrh.12、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.25/42 15、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh14。变体的非限制性示例包括WO2005033321的SEQ ID NO：13、15、17、19、24、36、40、45、47、48、51-54、60-62、64-77、79、80、82、89、90、93-95、98、100、101、109-113、118-120、124、126、131、139、142、151，154、158、161、162、165-183、202、204-212、215、219、224-236，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如国际公开第WO2015168666号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAVrh8R(WO2015168666的SEQ IDNO：9)、AAVrh8RA586R突变体(WO2015168666的SEQ ID NO：10)、AAVrh8R R533A突变体(WO2015168666的SEQ ID NO：11)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利第US9233131号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAVhE1.1(US9233131的SEQ ID NO：44)、AAVhEr1.5(US9233131的SEQ ID NO：45)、AAVhER1.14(US9233131的SEQ ID NO：46)、AAVhEr1.8(US9233131的SEQ ID NO：47)、AAVhEr1.16(US9233131的SEQ ID NO：48)、AAVhEr1.18(US9233131的SEQ ID NO：49)、AAVhEr1.35(US9233131的SEQ ID NO：50)、AAVhEr1.7(US9233131的SEQ ID NO：51)、AAVhEr1.36(US9233131的SEQ ID NO：52)、AAVhEr2.29(US9233131的SEQ ID NO：53)、AAVhEr2.4(US9233131的SEQ ID NO：54)、AAVhEr2.16(US9233131的SEQ ID NO：55)、AAVhEr2.30(US9233131的SEQ ID NO：56)、AAVhEr2.31(US9233131的SEQ ID NO：58)、AAVhEr2.36(US9233131的SEQ ID NO：57)、AAVhER1.23(US9233131的SEQ ID NO：53)、AAVhEr3.1(US9233131的SEQ ID NO：59)、AAV2.5T(US9233131的SEQ ID NO：42)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利公开第US20150376607号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV-PAEC(US20150376607的SEQ ID NO：1)、AA V-LK01(US20150376607的SEQ ID NO：2)、AAV-LK02(US20150376607的SEQ ID NO：3)、AAV-LK03(US20150376607的SEQ ID NO：4)、AAV-LK04(US20150376607的SEQID NO：5)、AAV-LK05(US20150376607的SEQ ID NO：6)、AAV-LK06(US20150376607的SEQ IDNO：7)、AAV-LK07(US20150376607的SEQ ID NO：8)、AAV-LK08(US20150376607的SEQ ID NO：9)、AAV-LK09(US20150376607的SEQ ID NO：10)、AAV-LK10(US20150376607的SEQ ID NO：11)、AAV-LK11(US20150376607的SEQ ID NO：12)、AAV-LK12(US20150376607的SEQ ID NO：13)、AAV-LK13(US20150376607的SEQ ID NO：14)、AAV-LK14(US20150376607的SEQ ID NO：15)、AAV-LK15(US20150376607的SEQ ID NO：16)、AAV-LK16(US20150376607的SEQ ID NO：17)、AAV-LK17(US20150376607的SEQ ID NO：18)、AAV-LK18(US20150376607的SEQ ID NO：19)、AAV-LK19(US20150376607的SEQ ID NO：20)、AAV-PAEC2(US20150376607的SEQ ID NO：21)、AAV-PAEC4(US20150376607的SEQ ID NO：22)、AAV-PAEC6(US20 150376607的SEQ IDNO：23)、AAV-PAEC7(US20150376607的SEQ ID NO：24)、AAV-PAEC8(US20150376607的SEQ IDNO：25)、AAV-PAEC11(US 20150376607的SEQ ID NO：26)、AAV-PAEC12(US20150376607的SEQID NO：27)或其变体。
在一些实施方案中，AAv血清型可以是或具有如美国公开第US9163261号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV-2-pre-miRNA-101(US9163261的SEQ ID NO：1)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利公开第US20150376240号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV-8h(US20150376240的SEQID NO：6)、AAV-8b(US20150376240的SEQ ID NO：5)、AAV-h(US20150376240的SEQ ID NO：2)、AAV-b(US20150376240的SEQ ID NO：1)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有美国专利第US20160017295号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAV SM 10-2(US20160017295的SEQID NO：22)、AAV改组100-1(US20160017295的SEQ ID NO：23)、AAV改组100-3(US20160017295的SEQ ID NO：24)、AAV改组100-7(US20160017295的SEQ ID NO：25)、AAV改组10-2(US20160017295的SEQ ID NO：34)、AAV改组10-6(US20160017295的SEQ ID NO：35)、AAV改组10-8(US20160017295的SEQ ID NO：36)、AAV改组100-2(US20160017295的SEQ IDNO：37)、AAV SM 10-1(US20160017295的SEQ ID NO：38)、AAV SM 10-8(US20160017295的SEQ ID NO：39)、AAV SM 100-3(US20160017295的SEQ ID NO：40)、AAV SM 100-10(US20160017295的SEQ ID NO：41)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利公开第US20150238550号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于BNP61 AAV(US20150238550的SEQ ID NO：1)、BNP62AAV(US20150238550的SEQ ID NO：3)、BNP63 AAV(US20150238550的SEQ ID NO：4)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或者可以具有美国专利公开第US20150315612号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAVrh.50(US20150315612的SEQ ID NO：108)、AAVrh.43(US20150315612的SEQ ID NO：163)、AAVrh.62(US20150315612的SEQ ID NO：114)、AAVrh.48(US20150315612的SEQ ID NO：115)、AAVhu.19(US20150315612的SEQ ID NO：133)、AAVhu.11(US20150315612的SEQ IDNO：153)、AAVhu.53(US20150315612的SEQ ID NO：186)、AAV4-8/rh.64(US20150315612的SEQ ID No：15)、AAVLG-9/hu.39(US20150315612的SEQ ID No：24)、AAV54.5/hu.23(US20150315612的SEQ ID No：60)、AAV54.2/hu.22(US20150315612的SEQ ID No：67)、AAV54.7/hu.24(US20150315612的SEQ ID No：66)、AAV54.1/hu.21(US20150315612的SEQID No：65)、AAV54.4R/hu.27(US20150315612的SEQ ID No：64)、AAV46.2/hu.28(US20150315612的SEQ ID No：68)、AAV46.6/hu.29(US20150315612的SEQ ID No：69)、AAV128.1/hu.43(US20150315612的SEQ ID No：80)或其变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如国际公开第WO2015121501号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于真实型AAV(ttAAV)(WO2015121501的SEQ ID NO：2)、“UPenn AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO：8)、“日本AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO：9)或其变体。
根据本公开，AAV衣壳血清型的选择或使用可来自多个物种。在一些实施方案中，AAV可以是禽类AAV(AAAV)。AAAV血清型可以是或具有如美国专利第US 9238800号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAAV(US 9,238,800的SEQ ID NO：1、2、4、6、8、10、12和14)或其变体。
在一些实施方案中，AAV可以是牛AAV(BAAV)。BAAV血清型可以是或具有如美国专利第US 9,193,769号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于BAAV(US9193769的SEQ ID NO：1和6)，或其变体。BAAV血清型可以是或具有如美国专利第US7427396号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于BAAV(US7427396的SEQ IDNO：5和6)，或其变体。
在一些实施方案中，AAV可以是山羊AAV。山羊AAV血清型可以是或具有如美国专利第US7427396号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于山羊AAV(US7427396的SEQ ID NO：3)，或其变体。
在其他实施方案中，AAV可以工程化为来自两种或多种亲本血清型的杂交AAV。在一些实施方案中，AAV可以是包含来自AAV2和AAV9的序列的AAV2G9。AAV2G9AAV血清型可以是或具有如美国专利公开第US20160017005号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，AAV可以是由AAV9衣壳文库产生的在氨基酸390-627(VP1编号)中具有突变的血清型，如Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6)：1070-1078(2011)，其内容通过引用整体并入本文。血清型及对应的核苷酸和氨基酸取代可以是但不限于AAV9.1(G1594C；D532H)、AAV6.2(T1418A和T1436X；V473D和I479K)、AAV9.3(T1238A；F413Y)、AAV9.4(T1250C和A1617T；F417S)、AAV9.5(A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6(T1231A；F411I)、AAV9.9(G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10(A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11(A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13(A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14(T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16(A1775T；Q592L)、AAV9.24(T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26(A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33(A1667C；D556A)、AAV9.34(A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35(A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40(A1694T、E565V)、AAV9.41(A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44(A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45(A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46(G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47(G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48(C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50(A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53(G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54(C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55(T1605A；F535L)、AAV9.58(C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59(T1336C；Y446H)、AAV9.61(A1493T；N498I)、AAV9.64(C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65(C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68(C1510A；P504T)、AAV9.80(G1441A；G481R)、AAV9.83(C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87(T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90(A1196T；Y399F)、AAV9.91(T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93(A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94(A1675T；M559L)和AAV9.95(T1605A；F535L)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有国际公开第WO2016049230号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于AAVF1/HSC1(WO2016049230的SEQ IDNO：2和20)、AAVF2/HSC2(WO2016049230的SEQ ID NO：3和21)、AAVF3/HS C3(WO20 16049230的SEQ ID NO：5和22)、AAVF4/HSC4(WO2016049230的SEQ ID NO：6和23)、AAVF5/HSC5(WO2016049230的SEQ ID NO：11和25)、AAVF6/HSC6(WO2016049230的SEQ ID NO：7和24)、AAVF7/HSC7(WO2016049230的SEQ ID NO：8和27)、AAVF8/HSC8(WO2016049230的SEQ ID NO：9和28)、AAVF9/HSC9(WO2016049230的SEQ ID NO：10和29)、AAVF11/HSC11(WO2016049230的SEQID NO：4和26)、AAVF12/HSC12(WO2016049230的SEQ ID NO：12和30)、AAVF13/HSC13(WO2016049230的SEQ ID NO：14和31)、AAVF14/HSC14(WO2016049230的SEQ ID NO：15和32)、AAVF15/HSC15(WO2016049230的SEQ ID NO：16和33)、AAVF16/HSC16(WO2016049230的SEQID NO：17和34)、AAVF17/HSC17(WO2016049230的SEQ ID NO：13和35)，或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利第US 8734809号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于，AAV CBr-E1(US8734809的SEQ IDNO：13和87)、AAV CBr-E2(US8734809的SEQ ID NO：14和88)、AAV CBr-E3(US8734809的SEQID NO：15和89)、AAV CBr-E4(US8734809的SEQ ID NO：16和90)、AAV CBr-E5(US8734809的SEQ ID NO：17和91)、AAVCBr-e5(US8734809的SEQ ID NO：18和92)、AAV CBr-E6(US8734809的SEQ ID NO：19和93)、AAV CBr-E7(US8734809的SEQ ID NO：20和94)、AAV CBr-E8(US8734809的SEQ ID NO：21和95)、AAVCLv-D 1(US8734809的SEQ ID NO：22和96)、AAVCLv-D2(US8734809的SEQ ID NO：23和97)、AAV CLv-D3(US8734809的SEQ ID NO：24和98)、AAV CLv-D4(US8734809的SEQ ID NO：25和99)、AAV CLv-D5(US8734809的SEQ ID NO：26和100)、AAVCLv-D6(US8734809的SEQ ID NO：27和101)、AAV CLv-D7(US8734809的SEQ ID NO：28和102)、AAV CLv-D8(US8734809的SEQ ID NO：29和103)、AAV CLv-E1(US8734809的SEQID NO：13和87)、AAV CLv-R1(US8734809的SEQ ID NO：30和104)、AAV CLv-R2(US8734809的SEQ ID NO：31和105)、AAV CLv-R3(US8734809的SEQ ID NO：32和106)、AAV CLv-R4(US8734809的SEQ ID NO：33和107)、AAV CLv-R5(US8734809的SEQ ID NO：34和108)、AAVCLv-R6(US8734809的SEQ ID NO：35和109)、AAV CLv-R7(US8734809的SEQ ID NO：36和110)、AAV CLv-R8(US8734809的SEQ ID NO：X和X)、AAV CLv-R9 (US8734809的SEQ ID NO：X和X)、AAV CLg-F1(US8734809的SEQ ID NO：39和113)、AAV CLg-F2(US8734809的SEQ IDNO：40和114)、AAV CLg-F3(US8734809的SEQ ID NO：41和115)、AAV CLg-F4(US8734809的SEQ ID NO：42和116)、AAV CLg-F5(US8734809的SEQ ID NO：43和117)、AAV CLg-F6(US8734809的SEQ ID NO：43和117)、AAV CLg-F7(US8734809的SEQ ID NO：44和118)、AAVCLg-F8(US8734809的SEQ ID NO：43和117)、AAV CSp-1(US8734809的SEQ ID NO：45和119)、AAV CSp-10(US8734809的SEQ ID NO：46和120)、AAV CSp-11(US8734809的SEQ ID NO：47和121)、AAV CSp-2(US8734809的SEQ ID NO：48和122)、AAV CSp-3(US8734809的SEQ ID NO：49和123)、AAV CSp-4(US8734809的SEQ ID NO：50和124)、AAV CSp-6(US8734809的SEQ IDNO：51和125)、AAV CSp-7(US8734809的SEQ ID NO：52和126)、AAV CSp-8(US8734809的SEQID NO：53和127)、AAV CSp-9(US8734809的SEQ ID NO：54和128)、AAVCHt-2(US8734809的SEQ ID NO：55和129)、AAV CHt-3(US8734809的SEQ ID NO：56和130)、AAV CKd-1(US8734809的SEQ ID NO：57和131)、AAV CKd-10(US8734809的SEQ ID NO：58和132)、AAVCKd-2(US8734809的SEQ ID NO：59和133)、AAV CKd-3(US8734809的SEQ ID NO：60和134)、AAV CKd-4(US8734809的SEQ ID NO：61和135)、AAV CKd-6(US8734809的SEQ ID NO：62和136)、AAV CKd-7(US8734809的SEQ ID NO：63和137)、AAV CKd-8(US8734809的SEQ ID NO：64和138)、AAV CLv-1(US8734809的SEQ ID NO：35和139)、AAV CLv-12(US8734809的SEQ IDNO：66和140)、AAV CLv-13(US8734809的SEQ ID NO：67和141)、AAV CLv-2(US8734809的SEQID NO：68和142)、AAV CLv-3(US8734809的SEQ ID NO：69和143)、AAV CLv-4(US8734809的SEQ ID NO：70和144)、AAV CLv-6(US8734809的SEQ ID NO：71和145)、AAV CLv-8(US8734809的SEQ ID NO：72和146)、AAV CKd-B1(US8734809的SEQ ID NO：73和147)、AAVCKd-B2(US8734809的SEQ ID NO：74和148)、AAV CKd-B3(US8734809的SEQ ID NO：75和149)、AAV CKd-B4(US8734809的SEQ ID NO：76和150)、AAV CKd-B5(US8734809的SEQ IDNO：77和151)、AAV CKd-B6(US8734809的SEQ ID NO：78和152)、AAV CKd-B7(US8734809的SEQ ID NO：79和153)、AAV CKd-B8(US8734809的SEQ ID NO：80和154)、AAV CKd-H1(US8734809的SEQ ID NO：81和155)、AAV CKd-H2(US8734809的SEQ ID NO：82和156)、AAVCKd-H3(US8734809的SEQ ID NO：83和157)、AAV CKd-H4(US8734809的SEQ ID NO：84和158)、AAV CKd-H5(US8734809的SEQ ID NO：85和159)、AAV CKd-H6(US8734809的SEQ IDNO：77和151)、AAV CHt-1(US8734809的SEQ ID NO：86和160)、AAV CLv1-1(US8734809的SEQID NO：171)、AAV CLv1-2(US8734809的SEQ ID NO：172)、AAV CLv1-3(US8734809的SEQ IDNO：173)、AAV CLv1-4(US8734809的SEQ ID NO：174)、AAV Clv1-7(US8734809的SEQ ID NO：175)、AAV Clv1-8(US8734809的SEQ ID NO：176)、AAV Clv1-9(US8734809的SEQ ID NO：177)、AAV Clv1-10(US8734809的SEQ ID NO：178)、AAV.VR-355(US8734809的SEQ ID NO：181)、AAV.hu.48R3(US8734809的SEQ ID NO：183)，或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如国际公开第WO2016065001号中描述的序列，其内容通过引用整体并入本文，诸如但不限于，AAV CHt-P2(WO2016065001的SEQID NO：1和51)、AAV CHt-P5(WO2016065001的SEQ ID NO：2和52)、AAV CHt-P9(WO2016065001的SEQ ID NO：3和53)、AAV CBr-7.1(WO2016065001的SEQ ID NO：4和54)、AAV CBr-7.2(WO2016065001的SEQ ID NO：5和55)、AAV CBr-7.3(WO2016065001的SEQ IDNO：6和56)、AAV CBr-7.4(WO2016065001的SEQ ID NO：7和57)、AAV CBr-7.5(WO2016065001的SEQ ID NO：8和58)、AAV CBr-7.7(WO2016065001的SEQ ID NO：9和59)、AAV CBr-7.8(WO2016065001的SEQ ID NO：10和60)、AAV CBr-7.10(WO2016065001的SEQ ID NO：11和61)、AAV CKd-N3(WO2016065001的SEQ ID NO：12和62)、AAV CKd-N4(WO2016065001的SEQID NO：13和63)、AAV CKd-N9(WO2016065001的SEQ ID NO：14和64)、AAV CLv-L4(WO2016065001的SEQ ID NO：15和65)、AAV CLv-L5(WO2016065001的SEQ ID NO：16和66)、AAV CLv-L6(WO2016065001的SEQ ID NO：17和67)、AAV CL v-K1(WO2016065001的SEQ IDNO：18和68)、AAV CLv-K3(WO2016065001的SEQ ID NO：19和69)、AAV CLv-K6(WO2016065001的SEQ ID NO：20和70)、AAV CLv-M1(WO2016065001的SEQ ID NO：21和71)、AAV CLv-M11(WO2016065001的SEQ ID NO：22和72)、AAV CLv-M2(WO2016065001的SEQ ID NO：23和73)、AAV CLv-M5(WO2016065001的SEQ ID NO：24和74)、AAV CLv-M6(WO2016065001的SEQ IDNO：25和75)、AA V CLv-M7(WO2016065001的SEQ ID NO：26和76)、AAV CLv-M8(WO2016065001的SEQ ID NO：27和77)、AAV CLv-M9(WO2016065001的SEQ ID NO：28和78)、AAV CHt-P1(WO2016065001的SEQ ID NO：29和79)、AAV CHt-P6(WO2016065001的SEQ IDNO：30和80)、AAV CHt-P8(WO2016065001的SEQ ID NO：31和81)、AAV CHt-6.1(WO2016065001的SEQ ID NO：32和82)、AAV CHt-6.10(WO2016065001的SEQ ID NO：33和83)、AAV CHt-6.5(WO2016065001的SEQ ID NO：34和84)、AAV CHt-6.6(WO2016065001的SEQID NO：35和85)、AAV CHt-6.7(WO2016065001的SEQ ID NO：36和86)、AAV CHt-6.8(WO2016065001的SEQ ID NO：37和87)、AAV CSp-8.10(WO2016065001的SEQ ID NO：38和88)、AAV CSp-8.2(WO2016065001的SEQ ID NO：39和89)、AAV CSp-8.4(WO2016065001的SEQID NO：40和90)、AAV CSp-8.5(WO2016065001的SEQ ID NO：41和91)、AAV CSp-8.6(WO2016065001的SEQ ID NO：42和92)、AAV CS p-8.7(WO2016065001的SEQ ID NO：43和93)、AAV CSp-8.8(WO2016065001的SEQ ID NO：44和94)、AAV CSp-8.9(WO2016065001的SEQID NO：45和95)、AAV CBr-B7.3(WO2016065001的SEQ ID NO：46和96)、AAV CBr-B7.4(WO2016065001的SEQ ID NO：47和97)、AAV3B(WO2016065001的SEQ ID NO：48和98)、AAV4(WO2016065001的SEQ ID NO：49和99)、AAV5(WO 2016065001的SEQ ID NO：50和100)，或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以具有或者可以是选自表9中发现的那些中的任一种的血清型。
在一些实施方案中，AAV衣壳可以包含表9中的序列，任一序列的片段或变体。
在一些实施方案中，AAV衣壳可以由如表9所述的序列、片段或变体编码。
在本文提及和/或描述的DNA和RNA序列中的任一个中，单字母符号具有以下描述：A代表腺嘌呤；C代表胞嘧啶；G代表鸟嘌呤；T代表胸腺嘧啶；U代表尿嘧啶；W代表弱碱基诸如腺嘌呤或胸腺嘧啶；S代表强核苷酸诸如胞嘧啶和鸟嘌呤；M代表氨基核苷酸诸如腺嘌呤和胞嘧啶；K代表酮基核苷酸诸如鸟嘌呤和胸腺嘧啶；R代表嘌呤即腺嘌呤和鸟嘌呤；Y代表嘧啶即胞嘧啶和胸腺嘧啶；B代表不是A的任何碱基(例如，胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)；D代表不是C的任何碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)；H代表不是G的任何碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)；V代表不是T的任何碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤)；N表达任何核苷酸(不是空位)；并且Z为零。
在本文提及和/或描述的氨基酸序列中的任一个中，单字母符号具有以下描述：G(Gly)代表甘氨酸；A(Ala)代表丙氨酸；L(Leu)代表亮氨酸；M(Met)代表甲硫氨酸；F(Phe)代表苯丙氨酸；W(Trp)代表色氨酸；K(Lys)代表赖氨酸；Q(Gln)代表谷氨酰胺；E(Glu)代表谷氨酸；S(Ser)代表丝氨酸；P(Pro)代表脯氨酸；V(Val)代表缬氨酸；I(Ile)代表异亮氨酸；C(Cys)代表半胱氨酸；Y(Tyr)代表酪氨酸；H(His)代表组氨酸；R(Arg)代表精氨酸；N(Asn)代表天冬酰胺；D(Asp)代表天冬氨酸；T(Thr)代表苏氨酸；B(Asx)代表天冬氨酸或天冬酰胺；J(Xle)代表亮氨酸或异亮氨酸；O(Pyl)代表吡咯赖氨酸；U(Sec)代表硒代半胱氨酸；X(Xaa)代表任何氨基酸；和Z(Glx)代表谷氨酰胺或谷氨酸。
表9.AAV血清型
Figure BDA0003992935460001871
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Figure BDA0003992935460001881
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Figure BDA0003992935460001891
在一些实施方案中，AAV血清型是VOY101或其变体。在一些实施方案中，VOY101衣壳包含氨基酸序列SEQ ID NO：1023。在一些实施方案中，VOY101氨基酸序列由包含SEQ IDNO：1022的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，VOY101衣壳包含与SEQ ID NO：1023具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VOY101衣壳包含与SEQ IDNO：1022具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，AAV血清型是VOY201或其变体。在一些实施方案中，VOY201衣壳包含氨基酸序列SEQ ID NO：1025。在一些实施方案中，VOY201氨基酸序列由包含SEQ IDNO：1024的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，VOY201衣壳包含与SEQ ID NO：1025具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VOY201衣壳包含与SEQ IDNO：1024具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，AAV血清型是PHP.B或其变体。在一些实施方案中，PHP.B衣壳包含氨基酸序列SEQ ID NO：1005。在一些实施方案中，PHP.B氨基酸序列由包含SEQ ID NO：1004的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，PHP.B衣壳包含与SEQ ID NO：1005具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，PHP.B衣壳包含与SEQ IDNO：1004具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，AAV血清型是PHP.N或其变体。在一些实施方案中，PHP.N衣壳包含氨基酸序列SEQ ID NO：1009。在一些实施方案中，PHP.N衣壳包含与SEQ ID NO：1009具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV血清型是AAV9或其变体。在一些实施方案中，AAV9衣壳包含氨基酸序列SEQ ID NO：1003。在一些实施方案中，AAV9氨基酸序列由包含SEQ ID NO：1002的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，AAV9衣壳包含与SEQ ID NO：1003具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV9衣壳包含与SEQ IDNO：1002具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，衣壳蛋白包含含有TLAVPFK(SEQ ID NO：1151)的氨基酸序列的插入片段。在一些实施方案中，相对于根据SEQ ID NO：1003编号的参考序列，插入片段紧接在位置588之后存在。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含根据SEQ ID NO：1003编号的A587D和Q588G的氨基酸取代。
在一些实施方案中，衣壳蛋白包含根据SEQ ID NO：1003编号的K449R的氨基酸取代；和包含TLAVPFK(SEQ ID NO：1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO：1003编号的参考序列紧接在位置588之后存在。
在一些实施方案中，衣壳蛋白包含：根据SEQ ID NO：1003编号的K449R的氨基酸取代；包含TLAVPFK(SEQ ID NO：1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO：1003编号的参考序列紧接在位置588之后存在；和根据SEQ ID NO：1003编号的A587D和Q588G的氨基酸取代。
在一些实施方案中，衣壳蛋白包含：包含TLAVPFK(SEQ ID NO：1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO：1003编号的参考序列紧接在位置588之后存在；和根据SEQ ID NO：1003编号的A587D和Q588G的氨基酸取代。
在一些实施方案中，AAV血清型是AAV9 K449R或其变体。在一些实施方案中，AAV9K449R衣壳包含氨基酸序列SEQ ID NO：1011。在一些实施方案中，AAV9 K449R衣壳包含与SEQ ID NO：1011具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV衣壳允许静脉内施用后血脑屏障渗透。此类AAV衣壳的非限制性示例包括AAV9、AAV9 K449R、VOY101、VOY201或包含肽插入片段的AAV衣壳，诸如但不限于AAVPHP.N(PHP.N)、AAVPHP.B(PHP.B)、PHP.S、G2A3、G2B4、G2B5、G2A12、G2A15、PHP.B2、PHP.B3或AAVPHP.A(PHP.A)。
在一些实施方案中，AAV衣壳适于肌内施用和/或肌纤维转导。此类AAV衣壳的非限制性示例包括AAV2、AAV3、AAV8及其变体，诸如但不限于AAV2变体、AAV2/3变体、AAV8变体和/或AAV2/3/8变体。
在一些实施方案中，AAV血清型是AAV2变体。作为非限制性示例，AAV血清型是包含SEQ ID NO：1026或其片段或变体的AAV2变体。作为非限制性示例，AAV血清型与SEQ ID NO：1026具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性。
在一些实施方案中，AAV血清型是AAV2/3变体。作为非限制性示例，AAV血清型是包含SEQ ID NO：1027或其片段或变体的AAV2/3变体。作为非限制性示例，AAV血清型是与SEQID NO：1027具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的AAV2/3变体。作为非限制性示例，AAV血清型是包含SEQ ID NO：1028或其片段或变体的AAV2/3变体。作为非限制性示例，AAV血清型是与SEQ ID NO：1028具有至少70％同一性，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一性的AAV2/3变体。
在一些实施方案中，AAV血清型可包含与本文所述的那些中的任一种具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的衣壳氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV血清型可由与本文所述的那些中的任一种具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的衣壳核酸序列编码。
在一些实施方案中，AAV血清型由于其对中枢神经系统的细胞的向性而被选择使用。在一些实施方案中，中枢神经系统的细胞是神经元。在另一个实施方案中，中枢神经系统的细胞是星形胶质细胞。
在一些实施方案中，AAV血清型由于其对肌肉细胞的向性而被选择使用。
在一些实施方案中，用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子可以是CTG、TTG或GTG，如美国专利第US8163543号中所述，其内容通过引用整体并入本文。
本公开涉及由衣壳(Cap)基因编码的结构衣壳蛋白(包括VP1、VP2和VP3)。这些衣壳蛋白形成病毒载体诸如AAV的蛋白质结构外壳(即衣壳)。由Cap多核苷酸合成的VP衣壳蛋白通常包括甲硫氨酸作为肽序列中的第一个氨基酸(Met1)，其与对应Cap核苷酸序列中的起始密码子(AUG或ATG)相关。然而，通常第一甲硫氨酸(Met1)残基或通常任何第一氨基酸(AA1)在多肽合成之后或期间被蛋白质加工酶诸如Met氨肽酶裂解掉。该“Met/AA剪裁”过程常常与多肽序列中第二个氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸等)的对应乙酰化相关。Met剪裁通常发生于VP1和VP3衣壳蛋白，但也可发生于VP2衣壳蛋白。
在Met/AA剪裁不完全的情况下，可产生构成病毒衣壳的一种或多种(一种、两种或三种)VP衣壳蛋白的混合物，其中一些衣壳蛋白可包含Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)，而其中一些衣壳蛋白可由于Met/AA剪裁而缺乏Met1/AA1氨基酸(Met-/AA-)。关于衣壳蛋白中Met/AA剪裁的进一步讨论，参见Jin等人Direct Liquid Chromatography/Mass SpectrometryAnalysisfor Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated VirusCapsid Proteins.Hum GeneTherMethods.2017年10月28日(5)：255-267；Hwang等人N-Terminal Acetylation of Cellular Proteins Creates Specific DegradationSignals.Science.2010年2月19日.327(5968)：973-977；其内容各自通过引用整体并入本文。
根据本公开，对衣壳蛋白的提及不限于剪裁的(Met-/AA--)或未剪裁的(Met+/AA+)，并且在上下文中可以指独立的衣壳蛋白，由衣壳蛋白的混合物组成的病毒衣壳，和/或编码、描述、产生或形成本公开的衣壳蛋白的多核苷酸序列(或其片段)。对“衣壳蛋白”或“衣壳多肽”(诸如VP1、VP2或VP2)的直接提及也可以包括包含Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白(Met+/AA+)以及由于Met/AA剪裁而缺乏Met1/AA1氨基酸的对应VP衣壳蛋白(Met-/AA-)。
进一步根据本公开，对分别构成或编码一种或多种包含Met1/AA1氨基酸的衣壳蛋白(Met+/AA+)的具体SEQ ID NO：(无论是蛋白质还是核酸)的提及都应理解为教导缺乏Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白，因为在对序列的综述后，仅仅缺乏第一个所列氨基酸(无论是否是Met1/AA1)的任何序列是显而易见的。
作为非限制性示例，对长度为736个氨基酸且包括由AUG/ATG起始密码子编码的“Met1”氨基酸(Met+)的VP1多肽序列的提及也可以理解为教导长度为735个氨基酸且不包括736个氨基酸的Met+序列的“Met1”氨基酸(Met-)的VP1多肽序列。作为第二个非限制性示例，对长度为736个氨基酸且包括由任何NNN起始密码子编码的“AA1”氨基酸(AA1+)的VP1多肽序列的提及也可以理解为教导长度为735个氨基酸且不包括736个氨基酸AA1+序列的“AA1”氨基酸(AA1-)的VP1多肽序列。
对由VP衣壳蛋白形成的病毒衣壳的提及(诸如对具体AAV衣壳血清型的提及)，可并入包括Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白(Met+/AA1+)，由于Met/AA1剪裁而缺乏Met1/AA1氨基酸的对应VP衣壳蛋白(Met-/AA 1-)，及其组合(Met+/AA1+和Met-/AA 1-)。
作为非限制性示例，AAV衣壳血清型可包括VP1(Met+/AA1+)、VP1(Met-/AA1-)或VP1(Met+/AA1+)和VP1(Met-/AA1-)的组合。AAV衣壳血清型还可以包括VP3(Met+/AA1+)、VP3(Met-/AA1-)或VP3(Met+/AA1+)和VP3(Met-/AA1-)的组合；并且还可以包括VP2(Met+/AA1)和VP2(Met-/AA1-)的类似任选组合。
包含抗tau抗体有效载荷的AAV颗粒
如本文所述的AAV颗粒可用于将抗体有效载荷(例如，抗tau抗体)递送至靶组织(例如，CNS)。在一些实施方案中，编码抗tau抗体多肽的病毒基因组可以包装到病毒颗粒中，例如AAV颗粒中。用包含一种或多种抗tau抗体多核苷酸的病毒颗粒转导的靶细胞可在单细胞中表达所编码的一种或多种抗体。
在一些实施方案中，可以将包含抗tau抗体多核苷酸序列的AAV颗粒引入哺乳动物细胞中，所述多核苷酸序列包含编码至少一种抗体的重链和/或轻链的核酸序列。
本文所述的编码抗tau抗体多肽的AAV病毒基因组可用于人疾病、病毒、感染兽医应用和多种体内和体外环境的领域中。在一些实施方案中，编码抗tau抗体多肽的AAV病毒基因组用于预防和/或治疗tau蛋白病。
如本文所述的AAV颗粒的病毒基因组包含编码有效载荷的核酸序列和至少一个ITR。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个ITR序列，5′末端和3′末端各一个。此外，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组可包含附加组件的核酸序列，诸如但不限于用于增强表达的调控元件(例如，启动子)、非翻译区(UTR)、多聚腺苷酸化序列(polyA)、填充序列、内含子和/或接头序列。可以选择和/或工程化这些病毒基因组组件以进一步定制给定有效载荷在靶组织中表达的特异性和效率。
本公开的AAV颗粒的病毒基因组可包含封装在表9中所列或本文所述的衣壳中的任一种中的表10-18中所述的序列区的任何组合。
在一些实施方案中，病毒基因组可包含如表10-18所述的至少一个序列区。所述区域可以位于本文所述的其他序列区中的任一者之前或之后。病毒基因组还可包含如表10-18所述的一个或多个序列区的多于一个拷贝。
病毒基因组组件：反向末端重复序列(ITR)
在一些实施方案中，病毒基因组可包含至少一个反向末端重复序列(ITR)区。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个ITR区和编码有效载荷，例如抗体分子(例如，抗tau抗体分子)的核酸。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个ITR。在一些实施方案中，两个ITR侧接在编码转基因的核酸的5′末端和3′末端。在一些实施方案中，ITR起到包含复制识别位点的复制起点的作用。在一些实施方案中，ITR包含可以是互补的且对称排列的序列区。在一些实施方案中，并入到病毒基因组中的ITR可以由天然存在的核酸序列或重组来源的核酸序列组成。
在一些实施方案中，ITR可以是与衣壳相同的AAV血清型，例如，选自表9中列出的AAV血清型中的任一种的衣壳蛋白，或其功能变体。在一些实施方案中，ITR可以是与衣壳蛋白不同的AAV血清型。在一些实施方案中，AAV颗粒包含含有两个ITR的病毒基因组，其中病毒基因组的两个ITR是相同的AAV血清型。在其他实施方案中，病毒基因组的两个ITR是不同的AAV血清型。在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组的两个ITR都是AAV2 ITR或其功能变体。
ITR区可以独立地具有一定长度，诸如但不限于约100至约150个核苷酸的长度。ITR的长度可为约100-180个核苷酸，例如长度为约100-115、约100-120、约100-130、约100-140、约100-150、约100-160、约100-170、约100-180、约110-120、约110-130、约110-140、约110-150、约110-160、约110-170、约110-180、约120-130、约120-140、约120-150、约120-160、约120-170、约120-180、约130-140、约130-150、约130-160、约130-170、约130-180、约140-150、约140-160、约140-170、约140-180、约150-160、约150-170、约150-180、约160-170、约160-180或约170-180个核苷酸。在一些实施方案中，ITR具有约120-140个核苷酸的长度，例如约130个核苷酸的长度。在一些实施方案中，ITR具有约140-150个核苷酸的长度、约141个核苷酸的长度。在一些实施方案中，病毒基因组包含一个ITR区，所述ITR区包含表10中提供的序列中任一个的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个ITR区，所述ITR区包含表10中提供的序列中任一个的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列，其中第一和第二ITR包含相同序列或其中第一和第二ITR包含不同序列。
作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约141个核苷酸的5’ITR。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸的5’ITR。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约141个核苷酸的3’ITR。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸的3’ITR。在一些实施方案中，AAV颗粒包含两个ITR，一个ITR的长度为141个核苷酸，另一个ITR的长度为130个核苷酸。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含5′反向末端重复(5’ITR)序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含3′反向末端重复(3’ITR)序列区。5’ITR和3’ITR序列区的非限制性示例在表10中有描述。
表10.反向末端重复(ITR)序列区
Figure BDA0003992935460001981
在一些实施方案中，病毒基因组包含表10中提供的ITR。在一些实施方案中，病毒基因组包含选自ITR1-ITR4中的任一种的ITR或其功能变体。在一些实施方案中，病毒基因组可具有包含ITR1的ITR。在一些实施方案中，病毒基因组可具有包含ITR2的ITR。在一些实施方案中，病毒基因组可具有包含ITR3的ITR。在一些实施方案中，病毒基因组可具有包含ITR4的ITR。
在一些实施方案中，ITR包含SEQ ID NO：1035-1038中任一个的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，ITR包含SEQ ID NO：1035的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，ITR包含SEQ ID NO：1036的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，ITR包含SEQ ID NO：1037的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，ITR包含SEQID NO：1038的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组可具有两个ITR。作为非限制性示例，两个ITR是ITR1和ITR3。作为非限制性示例，两个ITR是ITR1和ITR4。作为非限制性示例，两个ITR是ITR2和ITR3。作为非限制性示例，两个ITR是ITR2和ITR4。
病毒基因组组件：启动子
在一些实施方案中，病毒基因组可包含增强转基因靶特异性和/或表达的元件(参见例如，Powell等人Viral Expression Cassette Elements to Enhance TransgeneTarget Specificity and Expression in Gene Therapy，2015；其内容通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组可包含增强转基因靶特异性和/或表达的元件，包括启动子、增强子(例如CMV增强子)或两者。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含有效地连接到转基因的启动子，该转基因是由编码有效载荷，例如抗体分子(例如，抗tau抗体分子)的核酸分子编码的。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含增强子，例如CMV增强子。在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因组包含至少两个启动子。
在一些实施方案中，病毒基因组包含物种特异性、诱导型、组织特异性和/或细胞周期特异性的启动子(例如，如Parr等人，Nat.Med.3：1145-9(1997)所述；其内容通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，病毒基因组包含足以例如在靶细胞中表达由转基因编码的有效载荷(例如抗体分子，例如抗tau抗体)的启动子。
在一些实施方案中，启动子引起有效载荷，例如抗体分子(例如抗tau抗体)在细胞、组织和/或器官中表达足够的时间段。在一些实施方案中，启动子引起有效载荷表达至少1小时至24小时，例如1-5小时、1-10小时、1-15小时、1-20小时、2-5小时、2-10小时、2-15小时、2-20小时、或2-24小时、3-5小时、3-15小时、3-20小时、3-24小时、4-5小时、4-15小时、4-20小时、4-24小时、5-15小时、5-20小时、5-23小时、6-15小时、6-20小时、6-24小时、7-15小时、7-20小时、7-24小时、8-10小时、8-15小时、8-20小时、8-24小时、9-10小时、9-15小时、9-20小时、9-24小时、10-15小时、10-20小时、10-23小时、11-15小时、11-20小时、11-24小时、12-15小时、12-20小时、12-24小时、13-15小时、13-20小时、13-24小时、14-15小时、14-20小时、14-23小时、15-20小时、15-24小时、16-20小时、16-24小时、17-20小时、17-24小时、18-20小时、18-24小时、19-20小时、19-24小时、20-24小时、21-24小时、22-24小时或23-24小时，例如1小时、5小时、10小时、12小时、14小时、18小时、20小时或24小时。在一些实施方案中，启动子引起有效载荷表达至少1-7天，例如1-6天、1-5天、1-4天、1-3天、1-2天、2-7天、2-6天、2-5天、2-4天、2-3天、3-7天、3-6天、3-5天、3-4天、4-7天、4-6天、4-5天、5-7天、5-6天或6-7天，例如1天、5天或7天。在一些实施方案中，启动子引起有效载荷表达1周至4周，例如1-3周、1-2周、2-4周、2-3周或3-4周。在一些实施方案中，启动子引起有效载荷表达至少1-12个月、至少10-24个月或至少1-10年，例如至少1年、至少5年、至少10年或10年以上。
在一些实施方案中，启动子可以是天然存在的启动子或非天然存在的启动子。在一些实施方案中，启动子来自天然表达的蛋白质。在一些实施方案中，启动子是工程化启动子。在一些实施方案中，启动子包括病毒启动子、植物启动子和/或哺乳动物启动子。在一些实施方案中，启动子可以是人启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的。在一些实施方案中，启动子不是细胞特异性启动子。
在一些实施方案中，启动子引起在一种或多种(例如多个)细胞和/或组织中表达，例如泛在启动子。在一些实施方案中，引起在一种或多种组织中表达的启动子包括但不限于人延伸因子1α-亚基(EF1α)启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子及其衍生物CAG、β葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)启动子或泛素C(UBC)启动子。在一些实施方案中，组织特异性表达元件可用于将表达限制于某些细胞类型，诸如但不限于可用于将表达限制于神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的肌肉特异性启动子、B细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子、胰腺腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子、星形胶质细胞启动子或神经系统启动子。在一些实施方案中，启动子是如以下所述的泛在启动子：Yu等人(Molecular Pain 2011，7：63)、Soderblom等人(E.Neuro 2015)、Gill等人(Gene Therapy2001，第8卷，1539-1546)和Husain等人(GeneTherapy 2009)，其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，启动子是选自CMV、CBA(包括衍生物CAG、CB6、CBh等)，EF-1α、PGK、UBC、GUSB(hGBp)或UCOE(HNRPA2B1-CBX3的启动子)的泛在启动子。
在一些实施方案中，启动子是肌肉特异性启动子，例如引起在肌细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，肌肉特异性启动子包括但不限于哺乳动物肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物肌间线蛋白(DES)启动子、哺乳动物肌钙蛋白I(TNNI2)启动子、合成C5-12启动子和哺乳动物骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子(参见，例如美国专利公开US20110212529，其内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，启动子是神经系统特异性启动子，例如引起有效载荷在神经元、星形胶质细胞和/或少突胶质细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，引起在神经元中表达的神经系统特异性启动子包括但不限于神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、血小板源性生长因子(PDGF)启动子、血小板源性生长因子B链(PDGF-β)启动子、突触蛋白(Syn)启动子、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)启动子、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)启动子、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)启动子、神经丝轻链(NFL)或重链(NFH)启动子、β球蛋白微基因nβ2启动子、前脑啡肽原(PPE)启动子、脑啡肽(Enk)启动子和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子。在一些实施方案中，引起在星形胶质细胞中表达的神经系统特异性启动子包括但不限于胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子和EAAT2启动子。在一些实施方案中，引起在少突胶质细胞中表达的神经系统特异性启动子包括但不限于髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子。在一些实施方案中，病毒基因组包含如以下所述的神经系统特异性启动子：Husain等人(Gene Therapy 2009)，Passini和Wolfe(J.Virol.2001，12382-12392)，Xu等人(GeneTherapy2001，8，1323-1332)，Drews等人(Mamm Genome(2007)18：723-731)，和Raymond等人(Joumal ofBiological Chemistry(2004)279(44)46234-46241)，其各自通过引用整体方式并入。
在一些实施方案中，启动子是肝脏启动子，例如引起在肝细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，肝脏启动子选自人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)或甲状腺素结合球蛋白(TBG)。在一些实施方案中，病毒基因组包含RNA pol III启动子。在一些实施方案中，RNA pol III启动子选自U6或H1。
在一些实施方案中，病毒基因组包含两个启动子。作为非限制性示例，启动子是EF1α启动子和CMV启动子。
在一些实施方案中，启动子是泛素c(UBC)启动子。UBC启动子可以具有300-350个核苷酸的大小。作为非限制性示例，UBC启动子为332个核苷酸。在一些实施方案中，启动子是β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)启动子。GUSB启动子可以具有350-400个核苷酸的大小。作为非限制性示例，GUSB启动子为378个核苷酸。在一些实施方案中，启动子是神经丝轻链(NFL)启动子。NFL启动子可以具有600-700个核苷酸的大小。作为非限制性示例，NFL启动子为650个核苷酸。在一些实施方案中，启动子是神经丝重链(NFH)启动子。NFH启动子可以具有900-950个核苷酸的大小。作为非限制性示例，NFH启动子为920个核苷酸。在一些实施方案中，启动子是scn8a启动子。scn8a启动子可以具有450-500个核苷酸的大小。作为非限制性示例，scn8a启动子为470个核苷酸。在一些实施方案中，启动子是磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
在一些实施方案中，启动子选自CAG启动子、CBA启动子(例如，最小CBA启动子)、CB启动子、CMV(IE)启动子和/或增强子、GFAP启动子、突触蛋白启动子或其功能变体。
在一些实施方案中，病毒基因组包含增强子元件、启动子和/或5′UTR内含子。增强子元件，本文也称为“增强子”，可以是但不限于CMV增强子，启动子可以是但不限于CMV、CBA、UBC、GUSB、NSE、突触蛋白、MeCP2和GFAP启动子，并且5’UTR/内含子可以是但不限于SV40和CBA-MVM。作为非限制性示例，组合使用的增强子、启动子和/或内含子可以是：(1)CMV增强子、CMV启动子、SV405’UTR内含子；(2)CMV增强子、CBA启动子、SV 405’UTR内含子；(3)CMV增强子、CBA启动子、CBA-MVM 5’UTR内含子；(4)UBC启动子；(5)GUSB启动子；(6)NSE启动子；(7)突触蛋白启动子；(8)MeCP2启动子；和(9)GFAP启动子。
在一些实施方案中，病毒基因组包含长度介于约100-2000个核苷酸之间的启动子。在一些实施方案中，启动子具有介于约100-700个核苷酸之间的长度，例如介于约100-600个核苷酸、100-500个核苷酸、100-400个核苷酸、100-300个核苷酸、100-200个核苷酸、200-700个核苷酸、200-600个核苷酸、200-500个核苷酸、200-400个核苷酸、200-300个核苷酸、300-700个核苷酸、300-600个核苷酸、300-500个核苷酸、300-400个核苷酸、400-700个核苷酸、400-600个核苷酸、400-500个核苷酸、500-700个核苷酸、500-600个核苷酸或600-700个核苷酸之间。在一些实施方案中，启动子具有介于约900-2000个核苷酸之间的长度，例如约900-1000个核苷酸、9000-1500个核苷酸、1000-1500个核苷酸、1000-2000个核苷酸或1500-2000个核苷酸。在一些实施方案中，启动子具有介于约1500至约1800个核苷酸之间的长度，例如约1715个核苷酸。在一些实施方案中，启动子具有约500至约750个核苷酸的长度，例如约557个核苷酸或约699个核苷酸。在一些实施方案中，启动子具有约200至约450个核苷酸的长度，例如约260个核苷酸、约283个核苷酸、约299个核苷酸、约380个核苷酸或约399个核苷酸。
在一些实施方案中，病毒基因组包含表11中提供的启动子。在一些实施方案中，启动子选自启动子1-启动子12中的任一个或其功能变体。
表11.启动子序列区
Figure BDA0003992935460002041
在一些实施方案中，病毒基因组包含表11中提供的启动子。在一些实施方案中，启动子选自启动子1-启动子12中的任一个或其功能变体。在一些实施方案中，启动子包含SEQID NO：1039-1050中任一个的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：1039的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：1040的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：1041的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：1042的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQID NO：1043的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：1044的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO：1050的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个启动子序列区。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子1。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子2。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子3。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子4。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子5。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子6。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子7。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子8。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子9。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子10。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子11。在一些实施方案中，该启动子序列区是启动子12。
在一些实施方案中，该启动子序列区还包含至少一个启动子亚区。作为非限制性示例，该启动子序列是启动子1，其还包含启动子2和启动子3亚区。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少2个或更多个启动子。在一些实施方案中，病毒基因组包含启动子12和启动子4。
在一些实施方案中，CAG启动子包含SEQ ID NO：1039的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，CBA启动子(例如，最小CBA启动子)包含SEQ ID NO：1041的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，CB启动子包含SEQ ID NO：1042的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，GFAP启动子包含SEQ ID NO：1044的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，突触蛋白启动子包含SEQ ID NO：1045的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，CMV(IE)启动子包含SEQ ID NO：1050的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，CMV(ie)增强子包含SEQ ID NO：1040的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含多于一个启动子序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个启动子序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个启动子序列区。
病毒基因组组件：非翻译区(UTR)
在一些实施方案中，病毒基因组包含非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，基因的野生型UTR转录但不翻译。在一些实施方案中，5’UTR从转录起始位点处开始并且在起始密码子处结束，并且3’UTR紧接在终止密码子之后开始并且继续直到用于转录终止信号。
在一些实施方案中，UTR包含在特定靶器官的丰富表达的基因中发现的特征以增强稳定性和蛋白质产生。作为非限制性示例，来自在肝脏中正常表达的mRNA(例如，白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5’UTR可用于本文所述的AAV颗粒的病毒基因组中以增强在肝细胞系或肝脏中的表达。
在一些实施方案中，病毒基因组包含5’UTR，例如野生型(例如，天然存在的)5′UTR或重组(例如，非天然存在的)5’UTR。在一些实施方案中，5′UTR包含在翻译起始中起作用的特征。在一些实施方案中，UTR，例如5’UTR，包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列参与核糖体启动许多基因翻译的过程。在一些实施方案中，Kozak序列具有CCR(A/G)CCAUGG的共有序列，其中R是起始密码子(ATG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，起始密码子的后面是另一个“G”。在一些实施方案中，Kozak序列包含GAGGAGCCACC(SEQ IDNO：1089)的核苷酸序列或与之具有至少95-99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含GCCGCCACCATG(SEQ ID NO：1079)的核苷酸序列或与之具有至少95-99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含含有Kozak序列的5’UTR。在一些实施方案中，病毒基因组包含不含Kozak序列的5’UTR。
在一些实施方案中，病毒基因组包含3’UTR，例如野生型(例如，天然存在的)3′UTR或重组(例如，非天然存在的)3’UTR。在一些实施方案中，3’UTR包含调节(例如增加或降低)核酸稳定性的元件。在一些实施方案中，3′UTR包含嵌入其中的腺苷和尿苷链段，例如富AU的特征片段。这些富AU的特征片段通常在具有高周转率的基因中普遍存在，并且例如在Chen等人，1995中有描述，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，富AR的特征片段包括富AU的元件(ARE)。在一些实施方案中，3’UTR包含选自I类ARE(例如，c-Myc和MyoD)、II类ARE(例如，GM-CSF和TNF-a)、III类ARE(例如c-Jun和生肌素)或其组合的ARE。在一些实施方案中，I类ARE在富U区内包含几个分散的AUUUA基序的拷贝。在一些实施方案中，II类ARE包含两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。在一些实施方案中，III类ARE包含富U区和/或不含AUUUA基序。在一些实施方案中，ARE使信使不稳定。
在一些实施方案中，3’UTR包含ELAV家族蛋白成员的结合位点。在一些实施方案中，3’UTR包含HuR蛋白的结合位点。在一些实施方案中，HuR蛋白与I-III类中任一类的ARE结合和/或增加mRNA的稳定性。不希望受理论束缚，据信在一些实施方案中，包含HuR特异性结合位点的3’UTR将导致HuR结合和体内信使的稳定。
在一些实施方案中，病毒基因组的3′UTR包含用于模板化添加poly-A尾的寡聚(dT)序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含miRNA种子、结合位点和/或完整序列。通常，微RNA(或miRNA或miR)是19-25个核苷酸的非编码RNA，其与核酸靶标的位点结合并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。在一些实施方案中，微RNA序列包含种子区，例如成熟微RNA的位置2-8的区域中的序列，该序列与核酸的miRNA靶序列具有完美的沃森-克里克互补性。在一些实施方案中，病毒基因组可以工程化为包括、改变或去除至少一个miRNA结合位点、序列或种子区。
在一些实施方案中，来自本领域已知的任何基因的UTR可并入本文所述的AAV颗粒病毒基因组中。这些UTR或其部分可以与从中选择它们的基因相同的取向放置，或者它们可以在取向或位置上改变。在一些实施方案中，病毒基因组中使用的UTR可以是反向的、缩短的、加长的，用本领域已知的一种或多种其他5′UTR或3′UTR制成的。在一些实施方案中，改变的UTR包含已经相对于参考序列以某种方式改变的UTR。例如，3′或5′UTR可以通过如上所教导的取向或位置的变化相对于野生型或天然UTR改变，或者可以通过附加核苷酸的纳入、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来改变。在一些实施方案中，病毒基因组包含人工UTR，例如不是野生型的变体的UTR，例如天然存在的UTR。在一些实施方案中，病毒基因组包含选自其蛋白质共用共同的功能、结构、特征或特性的转录物家族的UTR。
病毒基因组组件：miR结合位点
本发明的AAV病毒颗粒的组织或细胞特异性表达可通过引入组织或细胞特异性调控序列(例如，启动子、增强子)、微RNA结合位点(例如脱靶位点)来增强。不希望受理论束缚，据信基于对应的内源微RNA(miRNA)或对应的受控外源miRNA在组织或细胞(例如，非靶向细胞或组织)中的表达，所编码的miR结合位点可以调节(例如，预防、阻抑或以其他方式抑制)感兴趣的基因在本发明的病毒基因组上的表达。在一些实施方案中，miR结合位点调节(例如，降低)由本文所述的AAV颗粒的病毒基因组编码的有效载荷在表达对应mRNA的细胞或组织中的表达。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组包含编码微RNA结合位点(例如，脱靶位点)的核苷酸序列。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组包含编码miR结合位点、微RNA结合位点系列(miR BS)的核苷酸序列或其反向互补序列。
在一些实施方案中，编码miR结合位点系列或miR结合位点的核苷酸序列位于病毒基因组的3′-UTR区(例如，相对于编码有效载荷的核酸序列的3′)，例如在polyA序列之前，位于病毒基因组的5′-UTR区(例如，相对于编码有效载荷的核酸序列的5′)，或两种情况兼有。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR结合位点(miRBS)的至少1-5个拷贝，例如至少1-3、2-4、3-5、1、2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方案中，所有拷贝都相同，例如包含相同的miR结合位点。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列内的miR结合位点是连续的并且未被间隔区分开。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列内的miR结合位点被间隔区(例如，非编码序列)分开。在一些实施方案中，间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区编码序列或其反向互补序列包含以下的一种或多种：(i)GGAT；(ii)CACGTG；(iii)GCATGC，或(i)-(iii)中的一个或多个的重复序列。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR结合位点(miRBS)的至少1-5个拷贝，例如至少1-3、2-4、3-5、1、2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方案中，至少1、2、3、4、5个或所有拷贝是不同的，例如包含不同的miR结合位点。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列内的miR结合位点是连续的并且未被间隔区分开。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列内的miR结合位点被间隔区(例如，非编码序列)分开。在一些实施方案中，间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区编码序列或其反向互补序列包含以下的一种或多种：(i)GGAT；(ii)CACGTG；(iii)GCATGC，或(i)-(iii)中的一个或多个的重复序列。
在一些实施方案中，编码的miR结合位点与宿主细胞中的miR基本上相同(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点与宿主细胞中的miR包含至少1、2、3、4或5个错配或不超过6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，错配核苷酸是连续的。在一些实施方案中，错配核苷酸是非连续的。在一些实施方案中，错配核苷酸出现在miR结合位点的种子区结合序列外部，诸如在miR结合位点的一个或两个末端。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点与宿主细胞中的miR具有100％同一性。
在一些实施方案中，编码miR结合位点的核苷酸序列与宿主细胞中的miR基本上互补(例如，具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性)。在一些实施方案中，编码miR结合位点的核苷酸序列的互补序列与宿主细胞中的miR包含至少1、2、3、4或5个错配或不超过6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，错配核苷酸是连续的。在一些实施方案中，错配核苷酸是非连续的。在一些实施方案中，错配核苷酸出现在miR结合位点的种子区结合序列外部，诸如在miR结合位点的一个或两个末端。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点与宿主细胞中的miR具有100％同一性。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点或序列区的长度为至少约10至约125个核苷酸，例如，长度为至少约10至50个核苷酸、10至100个核苷酸、50至100个核苷酸、50至125个核苷酸或100至125个核苷酸。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点或序列区的长度为至少约7至约28个核苷酸，例如，长度为至少约8-28个核苷酸、7-28个核苷酸、8-18个核苷酸、12-28个核苷酸、20-26个核苷酸、22个核苷酸、24个核苷酸或26个核苷酸，并且任选地包含与miRNA(例如，miR122、miR142、miR183)的种子序列互补的至少一个连续区(例如，7或8个核苷酸)。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点与在肝脏或肝细胞中表达的miR(诸如miR122)互补。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点或所编码的miR结合位点系列包含miR122结合位点序列。在一些实施方案中，所编码的miR122结合位点包含ACAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO：1029)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1029具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列，例如，其中所述修饰可导致所编码的miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR122结合位点，例如所编码的miR122结合位点系列的至少3、4或5个拷贝，任选地其中所编码的miR122结合位点系列包含以下的核苷酸序列：ACAAACACCATTGTCACACTCCACACAAACACCATTGTCACACTCCACACAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO：1030)，或与SEQ ID NO：1030具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列，例如，其中所述修饰可导致所编码的miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，所编码的miR122结合位点中的至少两个直接连接，例如没有间隔区。在其他实施方案中，所编码的miR122结合位点中的至少两个被间隔区分开，间隔区例如长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，其位于两个或更多个连续编码的miR122结合位点序列之间。在实施方案中，间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个。在一些实施方案中，间隔区编码序列或其反向互补序列包含以下的一种或多种：(i)GGAT；(ii)CACGTG；(iii)GCATGC，或(i)-(iii)中的一个或多个的重复序列。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR122结合位点的至少3-5个拷贝(例如，4个拷贝)，有或无间隔区，其中所述间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点与在造血谱系，包括免疫细胞(例如，抗原呈递细胞或APC，包括树突细胞(DC)、巨噬细胞和B-淋巴细胞)中表达的miR互补。在一些实施方案中，与造血谱系中表达的miR互补的所编码的miR结合位点包含例如在US 2018/0066279中公开的核苷酸序列，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点或所编码的miR结合位点系列包含miR-142-3p结合位点序列。在一些实施方案中，所编码的miR-142-3p结合位点包含TCCATAAAGTAGGAAACACTAC A(SEQ ID NO：1031)的核苷酸序列，与SEQ ID NO：1031具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列；例如，其中所述修饰可以导致所编码的miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR-142-3p结合位点，例如所编码的miR-142-3p结合位点系列的至少3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR-142-3p结合位点的至少3-5个拷贝(例如，4个拷贝)，有或无间隔区，其中所述间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点与DRG(背根神经节)神经元中表达的miR，例如miR183、miR182和/或miR96结合位点互补。在一些实施方案中，与DRG神经元中表达的miR互补的所编码的miR结合位点包含例如在WO2020/132455中公开的核苷酸序列，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点或所编码的miR结合位点系列包含miR183结合位点序列。在一些实施方案中，所编码的miR183结合位点包含AGTGAATTCTACCA
Figure BDA0003992935460002131
A(SEQ ID NO：1032)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1032具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列；例如，其中所述修饰可以导致所编码的miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，与种子序列互补的序列对应于所编码的miR-183结合位点序列的双下划线部分。在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR183结合位点，例如所编码的miR183结合位点系列的至少3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR183结合位点的至少3-5个拷贝(例如，4个拷贝)，有或无间隔区，其中所述间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点或所编码的miR结合位点系列包含miR182结合位点序列。在一些实施方案中，所编码的miR182结合位点包含AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO：1033)的核苷酸序列，与SEQ ID NO：1033具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列；例如，其中所述修饰可以导致所编码的miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR182结合位点，例如所编码的miR182结合位点系列的3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR182结合位点的至少3-5个拷贝(例如，4个拷贝)，有或无间隔区，其中所述间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点或所编码的miR结合位点系列包含miR96结合位点序列。在一些实施方案中，所编码的miR96结合位点包含AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA(SEQ ID NO：1034)的核苷酸序列，与SEQ ID NO：1034具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性，或具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的序列；例如，其中所述修饰可以导致所编码的miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，病毒基因组包含所编码的miR96结合位点，例如所编码的miR96结合位点系列的3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR96结合位点的至少3-5个拷贝(例如，4个拷贝)，有或无间隔区，其中所述间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个。
在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR122结合位点、miR142结合位点、miR183结合位点、miR182结合位点、miR 96结合位点或其组合。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR122结合位点、miR142结合位点、miR183结合位点、miR182结合位点、miR 96结合位点或其组合的至少3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点中的至少两个直接连接，例如没有间隔区。在其他实施方案中，所编码的miR结合位点中的至少两个被间隔区分开，间隔区例如长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，其位于两个或更多个连续编码的miR结合位点序列之间。在实施方案中，间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。在一些实施方案中，间隔区编码序列或其反向互补序列包含以下的一种或多种：(i)GGAT；(ii)CACGTG；(iii)GCATGC，或(i)-(iii)中的一个或多个的重复序列。在一些实施方案中，所编码的miR结合位点系列包含miR122结合位点、miR142结合位点、miR183结合位点、miR182结合位点、miR96结合位点中的至少两个、三个、四个、五个或所有的组合的至少3-5个拷贝(例如，4个拷贝)，有或无间隔区，其中所述间隔区的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
病毒基因组组件：外显子序列区
在一些实施方案中，病毒基因组可包含至少一个外显子序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少2个、至少3个、至少4个或至少5个外显子区。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个外显子序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个外显子序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含四个外显子序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含多于四个外显子序列区。
在一些实施方案中，外显子区可以独立地具有诸如但不限于约50-150个核苷酸的长度，例如约50-140个核苷酸、约50-130个核苷酸、约50-120个核苷酸、约50-110个核苷酸、约50-100个核苷酸、约50-90个核苷酸、约50-80个核苷酸、约50-80个核苷酸、约50-70个核苷酸、约50-60个核苷酸、约60-150个核苷酸、约60-140个核苷酸、约60-130个核苷酸、约60-120个核苷酸、约60-110个核苷酸、约60-100个核苷酸、约60-90个核苷酸、约60-80个核苷酸、约60-80个核苷酸、约60-70个核苷酸、约70-150个核苷酸、约70-140个核苷酸、约70-130个核苷酸、约70-120个核苷酸、约70-110个核苷酸、约70-100个核苷酸、约70-90个核苷酸、约70-80个核苷酸、约80-150个核苷酸、约80-140个核苷酸、约80-130个核苷酸、约80-120个核苷酸、约80-110个核苷酸、约80-100个核苷酸、约80-90个核苷酸、约90-150个核苷酸、约90-140个核苷酸、约90-130个核苷酸、约90-120个核苷酸、约90-110个核苷酸、约90-100个核苷酸、约100-150个核苷酸、约100-140个核苷酸、约100-130个核苷酸、约100-120个核苷酸、约100-110个核苷酸、约110-150个核苷酸、约110-140个核苷酸、约110-130个核苷酸、约110-120个核苷酸、约120-150个核苷酸、约120-140个核苷酸、约120-130个核苷酸、约130-150个核苷酸、约130-140个核苷酸或约140-150个核苷酸。在一些实施方案中，外显子区的长度为约120个核苷酸至约140个核苷酸，例如约134个核苷酸。在一些实施方案中，外显子区的长度为约40个核苷酸至约60个核苷酸，例如约53个核苷酸。
在一些实施方案中，表12中提供了外显子区。
表12.外显子序列区
Figure BDA0003992935460002161
在一些实施方案中，病毒基因组包含选自外显子1、外显子2、外显子3、外显子4或其功能变体的外显子区。在一些实施方案中，外显子区包含SEQ ID NO：1051-1055中任一个的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个外显子序列区。在一些实施方案中，外显子序列区是外显子1序列区。在一些实施方案中，外显子序列区是外显子2序列区。在一些实施方案中，外显子序列区是外显子3序列区。在一些实施方案中，外显子序列区是外显子4序列区。在一些实施方案中，外显子序列区是外显子5序列区。
病毒基因组组件：内含子序列区
在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个增强编码有效载荷的转基因的表达的元件。在一些实施方案中，增强转基因表达的元件包括内含子或其功能变体。在一些实施方案中，病毒基因组包含内含子或其功能变体。在一些实施方案中，病毒基因组包含至少两个内含子区，例如至少2个内含子区、至少3个内含子区、至少4个内含子区或5个或更多个内含子区。
在一些实施方案中，病毒基因组包含选自以下的内含子：MVM内含子(67-97bp)、F.IX截短内含子1(300bp)、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体内含子(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体内含子(500bp)、SV40晚期剪接供体/剪接受体内含子(19S/16S)(180bp)或杂交腺病毒剪接供体/IgG剪接受体内含子(230bp)。在一些实施方案中，病毒基因组包含人β-球蛋白内含子区。
在一些实施方案中，病毒基因组包含长度为约10个核苷酸至约1200个核苷酸的内含子区。在一些实施方案中，内含子区包含约10-100个核苷酸，例如长度为约10-90个核苷酸、约10-80个核苷酸、约10-70个核苷酸、约10-60个核苷酸、约10-50个核苷酸、约10-40个核苷酸、约10-30个核苷酸、约10-20个核苷酸、约20-100个核苷酸、约20-90个核苷酸、约20-80个核苷酸、约20-70个核苷酸、约20-60个核苷酸、约20-50个核苷酸、约20-40个核苷酸、约20-30个核苷酸、约30-100个核苷酸、约30-90个核苷酸、约30-80个核苷酸、约30-70个核苷酸、约30-60个核苷酸、约30-50个核苷酸、约30-40个核苷酸、约40-100个核苷酸、约40-90个核苷酸、约40-80个核苷酸、约40-70个核苷酸、约40-60个核苷酸、约40-50个核苷酸、约50-100、约50-90个核苷酸、约50-80个核苷酸、约50-70个核苷酸、约50-60个核苷酸、约60-100个核苷酸、约60-90个核苷酸、约60-80个核苷酸、约60-70个核苷酸、约70-100个核苷酸、约70-90个核苷酸、约70-80个核苷酸、约80-100个核苷酸、约80-90个核苷酸或约90-100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，内含子区包含约100-600个核苷酸，例如长度为约100-500个核苷酸、约100-400个核苷酸、约100-300个核苷酸、约100-200个核苷酸、约200-600个核苷酸、约200-500个核苷酸、约200-400个核苷酸、约200-300个核苷酸、约300-600个核苷酸、约300-500个核苷酸、约300-400个核苷酸、约400-600个核苷酸、约400-500个核苷酸或约500-600个核苷酸的长度。在一些实施方案中，内含子区包含约900-1200个核苷酸，例如长度为约900-1100个核苷酸、约900-1000个核苷酸、约1000-1200个核苷酸、约1000-1100个核苷酸或约1100-1200个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，内含子区包含约20至约40个核苷酸例如约32个核苷酸的长度。在一些实施方案中，内含子区包含约340至约360个核苷酸，例如约347个核苷酸的长度。在一些实施方案中，内含子区包含约550至约570个核苷酸例如约566个核苷酸的长度。
作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约15个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约32个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约41个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约53个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约73个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约168个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约172个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约292个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约347个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约387个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约491个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约566个核苷酸的内含子区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1074个核苷酸的内含子区。
在一些实施方案中，病毒基因组包含表13中提供的内含子区。
表13.内含子序列区
Figure BDA0003992935460002191
在一些实施方案中，病毒基因组包含选自内含子1至内含子15中的任一者或其功能变体的内含子区。在一些实施方案中，病毒基因组包含内含子1。在一些实施方案中，病毒基因组包含内含子3。在一些实施方案中，病毒基因组包含内含子12。在一些实施方案中，病毒基因组包含内含子12和内含子3。在一些实施方案中，病毒基因组包含内含子1和内含子12。在一些实施方案中，病毒基因包含SEQ ID NO：1056-1070中任一个的内含子区，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个内含子序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子1序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子2序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子3序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子4序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子5序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子6序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子7序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子8序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子9序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子10序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子11序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子12序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子13序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子14序列区。在一些实施方案中，内含子序列区是内含子15序列区。
在一些实施方案中，病毒基因组包含两个内含子序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个内含子序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含多于三个内含子序列区。
病毒基因组组件：信号序列区
在一些实施方案中，病毒基因组包含编码信号序列区(例如，一个、两个或三个信号序列区)的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码信号序列的核酸序列相对于编码VH和/或重链的核酸序列位于5′。在一些实施方案中，编码信号序列的核苷酸序列相对于编码VL和/或轻链的核酸序列位于5′。在一些实施方案中，所编码的抗体分子的所编码的VH、VL、重链和/或轻链在N端包含信号序列，其中所述信号序列任选地在抗体分子的细胞加工和/或定位期间被裂解。
在一些实施方案中，信号序列源自抗体、其变体或片段。在另一个实施方案中，信号序列区可能不是源自抗体。在一些实施方案中，信号序列源自与重链和轻链相同的抗体。在一些实施方案中，信号序列源自与重链或轻链序列之一相同的抗体。在一些实施方案中，信号序列源自与重链或轻链序列不同的抗体。
作为非限制性示例，信号序列或编码该信号序列的核苷酸序列可以源自抗tau抗体的重链或轻链，所述抗体诸如但不限于IPN002、PHF1和/或MC1。不希望受理论束缚，抗体重链或轻链序列的大约前57个核苷酸可被认为是信号序列。抗体来源的信号序列的非限制性示例包括信号13-信号18(分别为SEQ ID NO：1083-1088)。
在一些实施方案中，信号序列区可发出转录信号。在一些实施方案中，信号序列区可发出翻译信号。在一些实施方案中，信号序列区将有效载荷引导出细胞核或细胞。在一些实施方案中，信号序列区将有效载荷引导至特定靶标，其中靶标可以是器官、组织、细胞、细胞区室、细胞器或上述任一者的组分。
信号序列区可以独立地具有诸如但不限于以下的长度：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150个或多于150个核苷酸。病毒基因组中信号区的长度可为10-15、15-25、25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350、335-345和345-500个核苷酸。
在一些实施方案中，病毒基因组包含至少一个信号序列区。信号序列区的非限制性示例在表14中列出。
表14.信号序列区
Figure BDA0003992935460002221
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个信号序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个信号序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个信号序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含多于三个信号序列区。在一些实施方案中，包含多于一个信号序列的病毒基因组的信号序列是相同的。在另一个实施方案中，包含多于一个信号序列的病毒基因组的信号序列不是相同的。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个信号序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号1序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号2序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号3序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号4序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号5序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号6序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号7序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号8序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号9序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号10序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号11序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号12序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号13序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号14序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号15序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号16序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号17序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号18序列区。在一些实施方案中，信号序列区是信号19序列区。
在一些实施方案中，信号序列包含表14中提供的信号序列中的任一者或其功能变体。在一些实施方案中，所编码的信号序列包含由表14中提供的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码信号序列的核酸序列包含表14中提供的核苷酸序列中的任一者，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
病毒基因组组件：接头
在一些实施方案中，病毒基因组包含或编码接头区或接头。在一些实施方案中，接头连接病毒基因组的两个抗体序列区(例如，VH-接头-VL、VL-接头-VH重链-接头-轻链或轻链-接头-重链)。
在一些情况下，接头可以是可用于连接由有效载荷区编码的多肽(例如，表达期间的抗体轻链和重链)的肽接头。一些肽接头可以在表达后裂解以将重链和轻链结构域分开，允许成熟抗体或抗体片段的组装。接头裂解可以是酶促的。在一些情况下，接头包含酶裂解位点以促进细胞内或细胞外裂解。一些有效载荷区编码在从mRNA转录物翻译接头序列期间中断多肽合成的接头。此类接头可以促进从单个转录物翻译单独的蛋白质结构域(例如，重链和轻链抗体结构域)。在一些情况下，两个或更多个接头由病毒基因组的有效载荷区编码。
在一些实施方案中，所编码的接头包括表15中提供的接头。对于通过其氨基酸组成描述的那些序列(例如，G4S；SEQ ID NO：1106)，括号中提供的SEQ ID NO：表示氨基酸序列，而SEQ ID NO：栏列出了DNA SEQ ID NO。
表15.接头
Figure BDA0003992935460002241
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Figure BDA0003992935460002251
在一些实施方案中，所编码的接头包含由表15中提供的核苷酸序列中的任一者编码的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码接头的核酸序列包含表15中提供的核苷酸序列中的任一者，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所编码的接头包含例如用于细胞内和/或细胞外裂解的酶裂解位点。在一些实施方案中，裂解接头以将抗原结合结构域的VH和VL和/或抗体分子(例如，抗tau抗体)的重链和轻链分开。
在一些实施方案中，所编码的接头包含弗林蛋白酶接头(弗林蛋白酶裂解位点)或功能变体。在一些实施方案中，弗林蛋白酶刚好在碱性氨基酸靶序列(Arg-X-(Arg/Lys)-Arg)下游裂解蛋白质。在一些实施方案中，编码弗林蛋白酶接头的核苷酸序列包含SEQ IDNO：1090或1091的核苷酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，弗林蛋白酶在碱性氨基酸靶序列(例如，Arg-X-(Arg/Lys)-Arg)下游裂解蛋白质(例如，如Thomas，G.，2002.Nature Reviews MolecularCell Biology 3(10)：753-66所述；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，所编码的接头包含2A自裂解肽(例如，源自口蹄疫病毒(F2A)、猪捷申病毒-1(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(Thoseaasigna virus)(T2A)或马鼻炎A病毒(E2A)的2A肽)。2A命名具体是指微小核糖核酸病毒多聚蛋白在2A肽的C端中的甘氨酰-脯氨酰键处产生核糖体跳跃的区域(Kim，J.H.等人，2011.PLoS One 6(4)：e18556；其内容通过引用整体并入本文)。这种跳跃导致2A肽与其紧邻的下游肽之间的裂解。不希望受理论束缚，据信在一些实施方案中，2A肽引起侧接2A肽的蛋白质的化学计量表达且它们的较短长度可有利于生成病毒表达载体。
在一些实施方案中，所编码的接头包含T2A自裂解肽接头。在一些实施方案中，编码T2A接头的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1092的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码有效载荷的核酸编码弗林蛋白酶接头和T2A接头。
在一些实施方案中，所编码的接头包含内部核糖体进入位点(IRES)，其是在核苷酸序列例如mRNA序列中间用于启动翻译的核苷酸序列(＞500个核苷酸)(Kim，J.H.等人，2011.PLoS One 6(4)：e18556；其内容通过引用整体并入本文)，可用于例如调节一个或多个转基因的表达。IRES序列的使用确保了在IRES之前和之后的基因的共表达，但是在IRES之后的序列可以以比在IRES序列之前的序列更低的水平转录和翻译。
在一些实施方案中，所编码的接头包含小的且无支链的富含丝氨酸的肽接头，诸如Huston等人在美国专利第US5525491号中描述的那些，其内容整体并入本文，在一些实施方案中，包含富含丝氨酸的接头的多肽具有增加的溶解度。在一些实施方案中，所编码的接头包含人工接头，诸如Whitlow和Filpula在美国专利第US5856456号中和Ladner等人在美国专利第US 4946778号中描述的那些，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个或多个接头，诸如但不限于组织蛋白酶、基质金属蛋白酶或豆荚蛋白裂解位点。此类接头例如由Cizeau和Macdonald在国际公开第WO2008052322号中进行了描述，其内容整体并入本文。
在一些实施方案中，病毒基因组可以编码未被裂解的接头。在一些实施方案中，本文所述的抗体分子中的任一种可具有可变长度的柔性多肽接头，所述接头连接抗体分子的抗原结合结构域的可变结构域(例如，VH和VL)。例如，可以使用(Gly4-Ser)n接头，其中n为0、1、2、3、4、5、6、7或8(例如，SEQ ID NO：1098、1100、1102、1104-1105、1107-1108、1110-1112、1114-1115、1117-1119中的任一个)。在一些实施方案中，此类接头可以包括简单的氨基酸序列，诸如富含甘氨酸的序列。在一些情况下，接头包含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施方案中，接头可以包含不同长度的柔性肽接头，例如nxG4S，其中n＝1-10(SEQ ID NO：1119)，并且所编码的接头的长度在5至50个氨基酸之间变化。在非限制性示例中，接头可以是5xG4S(SEQ ID NO：1109)。不希望受理论束缚，据信在一些实施方案中，这些柔性接头较小并且没有侧链，因此它们往往不会影响蛋白质二级结构，同时在抗体区段之间提供柔性接头(George，R.A.等人，2002.Protein Engineering 15(11)：871-9；Huston，J.S.等人，1988.PNAS 85：5879-83；和Shan，D.等人，1999.Journal of Immunology.162(11)：6589-95；它们各自的内容通过引用整体并入本文)。此外，丝氨酸残基的极性提高了溶解度并防止聚集问题。
在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个G4S3接头(“G4S3”作为SEQ ID NO：1103公开)。在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个G4S接头(“G4S”作为SEQ ID NO：1097公开)。在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个弗林蛋白酶位点。在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个G4S5接头(“G4S5”作为SEQ ID NO：1109公开)。在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个T2A接头。在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个F2A接头。在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个P2A接头。在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个弗林蛋白酶和一个2A接头。作为非限制性示例，病毒基因组可包含弗林蛋白酶和T2A接头或弗林蛋白酶和F2A接头。
在一些实施方案中，AAV颗粒病毒基因编码至少一个IRES序列。在一些实施方案中，病毒基因组编码至少一个铰链区。作为非限制性示例，铰链是IgG铰链。
在一些实施方案中，编码接头的核酸序列的长度为约10至约700个核苷酸，例如约10至约700个核苷酸，例如约10至约100个，例如约50-200个核苷酸、约150-300个核苷酸、约250-400个核苷酸、约350-500个核苷酸、约450-600个核苷酸、约550-700个核苷酸、约650-700个核苷酸。在一些实施方案中，编码接头的核酸序列的长度为约5至约20个核苷酸，例如长度为约12个核苷酸。在一些实施方案中，编码接头的核酸序列的长度为约40至约60个核苷酸，例如长度为约54个核苷酸。
在一些实施方案中，接头区的长度可为1-50、1-100、50-100、50-150、100-150、100-200、150-200、150-250、200-250、200-300、250-300、250-350、300-350、300-400、350-400、350-450、400-450、400-500、450-500、450-550、500-550、500-600、550-600、550-650或600-650个核苷酸。接头区的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73，74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、125、130、135、140、145、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、165、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、185、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、640、650或大于650。在一些实施方案中，接头区的长度可为12个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为15个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为18个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为30个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为45个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为54个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为60个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为66个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为75个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为78个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为87个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为108个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为120个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为153个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为198个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为609个核苷酸。在一些实施方案中，接头区的长度可为623个核苷酸。
病毒基因组组件：标签
在一些实施方案中，病毒基因组可包含标签多肽(例如，本文的标签序列或标签序列区)。如本文所用，术语“标签”指示附于有效载荷的多核苷酸序列，其一旦表达就可用于鉴定所表达的有效载荷。可替代地，术语“标签”可指示附于有效载荷的多核苷酸序列，其发出将表达的有效载荷保留在细胞特定区域(例如，内质网)中的信号。
在一些实施方案中，编码标签多肽的核苷酸序列的长度为约10-50个核苷酸，例如约10-40个核苷酸、约10-30个核苷酸、约10-20个核苷酸、约20-50个核苷酸、约20-40个核苷酸、约20-30个核苷酸、约30-50个核苷酸、约30-40个核苷酸或约40至50个核苷酸。在一些实施方案中，编码标签多肽的核苷酸序列包含约10个核苷酸至约30个核苷酸，例如约18个核苷酸或约21个核苷酸。在一些实施方案中，编码标签多肽的核苷酸序列包含约20个核苷酸至约40个核苷酸，例如约27个核苷酸。
表16.标签序列区
Figure BDA0003992935460002301
在一些实施方案中，病毒基因组包含表16中提供的标签序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含标签1-标签7中的任一种或其功能变体。在一些实施方案中，标签序列包含SEQ ID NO：1127-1133中任一个的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所编码的标签多肽包含由SEQ ID NO：1127-1133中的任一者编码的氨基酸序列，或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个标签序列区。在一些实施方案中，标签序列区是标签1序列区。在一些实施方案中，标签序列区是标签2序列区。在一些实施方案中，标签序列区是标签3序列区。在一些实施方案中，标签序列区是标签4序列区。在一些实施方案中，标签序列区是标签5序列区。在一些实施方案中，所编码的标签序列区是标签6序列区。在一些实施方案中，所编码的标签序列区是标签7序列区。
在一些实施方案中，病毒基因组包含多于一个标签序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个标签序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含三个标签序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含多于三个标签序列区。
病毒基因组组件：多聚腺苷酸化序列区
在一些实施方案中，病毒基因组可包含至少一个多聚腺苷酸化序列区。在一些实施方案中，病毒基因组包含介于编码有效载荷的转基因的3′末端与3′ITR的5′末端之间的多聚腺苷酸化(本文称为poly A、polyA或poly-A)序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含两个或更多个polyA序列。在一些实施方案中，病毒基因组不包含polyA序列。
在一些实施方案中，polyA信号区包含约100-600个核苷酸，例如约100-500个核苷酸、约100-400个核苷酸、约100-300个核苷酸、约100-200个核苷酸、约200-600个核苷酸、约200-500个核苷酸、约200-400个核苷酸、约200-300个核苷酸、约300-600个核苷酸、约300-500个核苷酸、约300-400个核苷酸、约400-600个核苷酸、约400-500个核苷酸或约500-600个核苷酸的长度。在一些实施方案中，polyA信号区包含约100至150个核苷酸，例如约127个核苷酸的长度。
表17.Poly-A信号序列区
Figure BDA0003992935460002311
在一些实施方案中，表17中提供了polyA信号区。在一些实施方案中，病毒基因组包含选自polyA1、polyA2、polyA3或其功能变体的polyA序列区。在一些实施方案中，polyA信号区包含SEQ ID NO：1134-1136中任一个的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含一个polyA序列区。在一些实施方案中，polyA序列区是PolyA1序列。在一些实施方案中，polyA序列区是PolyA2序列。在一些实施方案中，polyA序列区是PolyA3序列。
在一些实施方案中，病毒基因组包含多于一个polyA序列区。
病毒基因组组件：填充序列区
在一些实施方案中，病毒基因组可包含至少一个或多个填充序列区。
在一些实施方案中，填充序列包含约100-2000、约200至1900、约300至1800、约400至1700、约500至1600、约600至1500、约700至1500、约800至1500、约900至1500、约1000-1500个核苷酸，例如约1000-1400个核苷酸、约1000-1300个核苷酸、约1000-1200个核苷酸、约1200-1500个核苷酸、约1200-1400个核苷酸、约1200-1300个核苷酸、约1300-1500个核苷酸、约1300-1400个核苷酸或约1400-1500个核苷酸的长度。在一些实施方案中，填充序列包含约1140个核苷酸至约1160个核苷酸，例如约1153个核苷酸的长度。在一些实施方案中，填充序列包含约1230个核苷酸至约1250个核苷酸，例如约1240个核苷酸的长度。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1153个核苷酸的填充区。作为非限制性示例，病毒基因组包含长度为约1240个核苷酸的填充区。
在一些实施方案中，A病毒基因组包含至少一个填充序列区。填充序列区的非限制性示例在表18中有描述。
表18.填充序列区
Figure BDA0003992935460002331
在一些实施方案中，病毒基因组包含两个或更多个填充序列。表18中提供了填充序列。在一些实施方案中，病毒基因组包含填充序列1、填充序列2或其功能变体。在一些实施方案中，病毒基因组包含填充序列1和填充序列2。在一些实施方案中，填充序列包含SEQID NO：1137的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，填充序列包含SEQ ID NO：1138的核苷酸序列或与之具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，病毒基因组不包含填充序列区。
病毒基因组组件：有效载荷
本公开的病毒基因组包含至少一个有效载荷区。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是指由病毒基因组编码的或在病毒基因组内的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区，或此类多核苷酸或多核苷酸区的表达产物，例如转基因、编码多肽或多个多肽的多核苷酸或调节核酸或调控核酸。本公开的有效载荷通常编码多肽(例如，抗体或基于抗体的组合物)或其片段或变体。
有效载荷区可以以反映类似于或镜像mRNA天然组织的区域的方式构建。
有效载荷区可以包含编码和非编码核酸序列的组合。
在一些实施方案中，AAV有效载荷区可以编码编码或非编码RNA。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，所述有效载荷区包含编码多于一种感兴趣的多肽(例如，抗体的重链和轻链)的核酸序列。在此类实施方案中，编码一种以上多肽的病毒基因组可以复制并包装到病毒颗粒中。用包含多于一种多肽的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞中表达所述多肽中的每一种。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，所述有效载荷区包含编码抗体或其片段的重链和轻链的核酸序列。重链和轻链表达并组装形成功能抗体，然后功能抗体可以被分泌。
在一些实施方案中，有效载荷区可包含至少一个反向末端重复序列(ITR)、启动子区、内含子区和编码区。在一些实施方案中，编码区包含抗体或其片段的重链区和/或轻链区，并且任何两个组件都可以被接头区分开。
在一些实施方案中，编码区可包含具有被接头和/或裂解位点分开的重链和轻链序列的有效载荷区。在一些实施方案中，重链和轻链序列被IRES序列分开。在一些实施方案中，重链和轻链序列被口蹄疫病毒序列分开。在一些实施方案中，重链和轻链序列被口蹄疫病毒序列和弗林蛋白酶裂解位点分开。在一些实施方案中，重链和轻链序列被猪捷申病毒-1病毒序列分开。在一些实施方案中，重链和轻链序列被猪捷申病毒-1病毒和弗林蛋白酶裂解位点分开。在一些实施方案中，重链和轻链序列被5xG4S序列(“5xG4S”作为SEQ ID NO：1109公开)分开。
在一些实施方案中，有效载荷区包含一个或多个编码抗tau抗体、其变体或片段的核酸序列。在一些实施方案中，变体是人源化变体，诸如包含表1、表6、表2A-2C、表4和表5中任一个的抗体中的任一个的任何一个或多个(例如，全部6个)CDR区的人源化变体。
在一些实施方案中，AAV颗粒的有效载荷区包含编码一种或多种多肽的核酸序列，所述多肽包含表3或表4任一个中各自列出的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)序列，或其变体或片段；任选地所述多肽还包含重链恒定区和/或轻链恒定区，诸如表X中列出的那些。所述多肽可以构成全长抗体(例如，包含VH和重链恒定区，诸如表X中列出的那些；以及VL和轻链恒定区，诸如表X中列出的那些)，或其抗体片段，诸如Fab、F(ab’)2、scFv等。有效载荷区还可以包含介于重链与轻链序列之间的接头。在某些实施方案中，重链或VH的编码序列在轻链或VL的编码序列的5′，或反之亦然。
在一些实施方案中，AAV颗粒的有效载荷区包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含表3或表4中列出的重链可变区和轻链可变区序列，或其变体或片段，其中重链可变区序列来自与轻链可变区序列不同的抗体。在某些实施方案中，AAV颗粒的有效载荷区包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含表3或表4中列出的重链可变区和轻链可变区序列，或其变体或片段，其中VH和VL序列来自相同抗体。有效载荷区还可以包含介于重链与轻链可变区序列之间的接头。
在一些实施方案中，有效载荷区在5′至3′方向包含抗体轻链序列、接头和重链序列(例如，轻链-接头-重链或L.接头.H或LH)。在另一个实施方案中，不使用或不存在接头。
在一些实施方案中，有效载荷区包含在5′至3′方向上编码来自表3或表4(对于VL序列而言)和表X(对于恒定区序列而言)的抗体轻链序列、接头和来自表3或表4(对于VH序列而言)和表X(对于恒定区序列而言)的重链序列的核酸序列。
在一些实施方案中，有效载荷区在5′至3′方向上包含抗体重链序列、接头区(可包含一个或多个接头)和轻链序列(即，重链-接头-轻链或H.接头.L或HL)。在另一个实施方案中，不使用或不存在接头。
在一些实施方案中，有效载荷区包含在5′至3′方向上编码来自表3或表4(对于VH序列而言)和表X(对于恒定区序列而言)的抗体重链序列、一个或多个接头和来自表3或表4(对于VL序列而言)和表X(对于恒定区序列而言)的轻链序列的核酸序列。
在一些实施方案中，有效载荷区包含编码单条重链的核酸序列。作为非限制性示例，重链包含表3(对于VH而言)、表2A-2C和表6(对于CDRH1-CDRH3而言)、表7(对于FRH1-FRH4而言)、表4(对于CDRH1-CDRH3或VH而言)、表5(对于CDRH1-CDRH3而言)和/或表X(对于重链恒定区而言)中描述的一个或多个氨基酸序列或其片段。
在一些实施方案中，有效载荷区还可包含编码轻链的核酸序列。作为非限制性示例，轻链包含表3(对于VL而言)、表2A-2C和表6(对于CDRL1-CDRL3而言)、表7(对于FRL1-FRL4而言)、表4(对于CDRL1-CDRL3或VL而言)、表5(对于CDRL1-CDRL3而言)和/或表X(对于轻链恒定区而言)中描述的一个或多个氨基酸序列或其片段。
表1、表3、表6、表7、表X、表2A-2C、表4和表5中示出的是抗体组分及其多核苷酸和/或多肽序列的列表。这些序列可由本公开的病毒基因组编码或包含在本公开的病毒基因组中。表1、表3、表6、表7、表X、表2A-2C、表4和表5中描述的抗体序列的变体或片段可用于本公开的病毒基因组中。
在一些实施方案中，AAV颗粒的有效载荷区包含编码表1、表3、表6、表7、表2A-2C、表4和表5中列出的有效载荷抗体多肽中的一种或多种或其变体或片段的一个或多个核酸序列。如本文所用，“抗体多核苷酸”是指编码抗体多肽的核酸序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒的有效载荷区包含表3、表X或表4中列出的一个或多个核酸序列，或其变体或片段。
在一些实施方案中，AAV颗粒的有效载荷区包含编码有效载荷抗体的核酸序列，所述有效载荷抗体与一种或多种有效载荷抗体多肽或其片段具有至少50％同一性，所述有效载荷抗体多肽或其片段包括表1、表3、表6、表7、表2A-2C、表4和表5中的任一者列出的框架区、恒定区及其抗原结合片段(诸如VH/VL和CDR)。所编码的抗体多肽可以与表1、表3、表6、表7、表X、表2A-2C、表4和表5中列出的有效载荷抗体多肽或其片段中的一种或多种，或其变体或片段具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，所编码的抗体多肽的可变区序列(例如，重链或轻链)可以与表3或表4中列出的有效载荷抗体多肽中的一种或多种或其变体或片段具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，所编码的抗体多肽的CDR区中的任何一个或多个可具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或与表1、表2A-2C、表6、表4和表5中的任一个中列出的有效载荷抗体多肽中的一种或多种或其变体或片段的CDR相比，含有至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个变化(例如，取代(包括保守性取代)、缺失和/或插入)。
在一些实施方案中，所编码的抗体多肽的框架区可具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或与表7或表4中列出的有效载荷抗体多肽中的一种或多种或其变体或片段的框架序列相比，含有至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个变化(例如，取代(包括保守性取代)、缺失和/或插入)。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3、表6、表7、表X、表4和/或表5中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有90％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有91％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有92％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有93％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有94％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有95％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有96％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有97％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有98％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有99％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷抗体(例如，全长重链或全长轻链；或其包含HCCDR1-3或LC CDR1-3的VH或VL)与表1、表2A-2C、表3-7和/或表X中列出的抗体多肽(例如，包含VH/VL区和CH/CL区的全长抗体)中的一种或多种或其变体或片段具有100％同一性。
在一些实施方案中，AAV颗粒的有效载荷区包含与表3或表4中列出的一个或多个核酸序列或其变体或片段具有至少50％同一性的核酸序列。有效载荷核酸序列可以与表3或表4中列出的一个或多个核酸序列或其变体或片段具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有90％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有91％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有92％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有93％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有94％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有95％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有96％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有97％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有98％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有99％同一性。
在一些实施方案中，有效载荷核酸序列与表3或表4中列出的核酸序列中的一个或多个或其变体或片段具有100％同一性。
在一些实施方案中，病毒基因组可包含一个或多个已经密码子优化的组件。密码子优化可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现，诸如但不限于通过根据Genscript、EMBOSS、Bioinformatics、NUS、NUS2、Geneinfinity、IDT、NUS3、GregThatcher、Insilico、Molbio、N2P、Snapgene和/或VectorNTI的方法。相同病毒基因组内的抗体重链和/或轻链序列可根据相同方法或根据不同方法进行密码子优化。
在一些实施方案中，病毒基因组可包含本文所述或本领域通常已知的组件的任何组合。在一些实施方案中，病毒基因组可包含以下组件的任何组合，包括但不限于5’ITR、启动子区(可包含一个或多个组件碎片)、外显子区、内含子区、Kozak序列、一个或多个信号序列(抗体信号序列或源自另一蛋白质的信号序列)、一个或多个弗林蛋白酶裂解位点、一个或多个接头序列、一个或多个抗体轻链可变区、一个或多个抗体轻链恒定区、一个或多个抗体重链可变区、一个或多个抗体重链恒定区、多聚腺苷酸化序列和/或填充序列。
在一些实施方案中，当以5′至3′方向读取时，AAV病毒基因组包含5’ITR、启动子区、任选内含子区、信号序列、抗体轻链区、接头区、信号序列、抗体重链区、多聚腺苷酸化序列、任选填充序列和3’ITR。在一些实施方案中，当以5′至3′方向读取时，AAV病毒基因组包含呈轻链-接头-重链格式的抗体构建体。
在一些实施方案中，当以5′至3′方向读取时，AAV病毒基因组包含5’ITR、启动子区、任选内含子区、信号序列、抗体重链区、接头区、信号序列、抗体轻链区、多聚腺苷酸化序列、任选填充序列和3’ITR。在一些实施方案中，当以5′至3′方向读取时，AAV病毒基因组包含呈重链-接头-轻链格式的抗体构建体。
病毒基因组可以编码抗体片段，诸如但不限于Fab、F(ab’)2或scFv片段。在一些实施方案中，病毒基因组编码Fab抗体片段。在另一个实施方案中，病毒基因组编码F(ab’)2抗体片段。在一些实施方案中，病毒基因组编码scFv。
在一些实施方案中，本文所述的病毒基因组或其片段包装在具有选自表9或本文所述的血清型的衣壳中以生成AAV颗粒。例如，衣壳血清型可以是VOY101、VOY201、AAVPHP.B、AAVPHP.N、AAV1、AAV2、AAV2变体、AAV3、AAV2/3变体、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV9 K449R、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVDJ或AAVDJ8，或其任何变体。在一些实施方案中，衣壳血清型是AAVPHP.B、AAV9、AAV6、AAVrh10和/或AAVDJ。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含上述病毒基因组的核酸、细胞、AAV载体和AAV颗粒。
AAV的产生
本公开提供了用于生成细小病毒颗粒(例如AAV颗粒)的方法，所述方法是通过在病毒复制细胞中进行病毒基因组复制。
根据本公开，将包含编码抗体、基于抗体的组合物或其片段的有效载荷区的病毒基因组并入在病毒复制细胞中产生的AAV颗粒中。制备AAV颗粒的方法是本领域众所周知的并且描述于例如美国专利第US6204059号、第US5756283号、第US6258595号、第US6261551号、第US6270996号、第US6281010号、第US6365394号、第US6475769号、第US6482634号、第US6485966号、第US6943019号、第US6953690号、第US7022519号、第US7238526号、第US7291498和第US7491508号、第US5064764号、第US6194191号、第US6566118号、第US8137948号；或国际公布第WO1996039530号、第WO1998010088号、第WO1999014354号、第WO1999015685号、第WO1999047691号、第WO2000055342号、第WO2000075353号和第WO2001023597号；Methods InMolecular Biology，编辑Richard，Humana Press，NJ(1995)；O’Reilly等人，BaculoVirus Expression Vectors，A Laboratory Manual，OxfordUniv.Press(1994)；Samulski等人，J.Vir.63：3822-8(1989)；Kajigaya等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 88：4646-50(1991)；Ruffing等人，J.Vir.66：6922-30(1992)；Kimbauer等人，Vir.，219：37-44(1996)；Zhao等人，Vir.272：382-93(2000)；其各自的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，使用WO2015191508中描述的方法制备AAV颗粒，其内容通过引用整体并入本文。
通常用于产生重组AAV病毒载体的病毒复制细胞包括但不限于293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞和其他哺乳动物细胞系，如美国专利第US6156303号、第US5387484号、第US5741683号、第US5691176号和第US5688676号；美国专利公开第2002/0081721号以及国际专利公开第WO 00/47757号、第WO 00/24916号和第WO 96/17947号，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以使用三重转染产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在哺乳动物细胞中产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在哺乳动物细胞中通过三重转染产生。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在HEK293细胞中通过三重转染产生。
本公开提供了用于产生AAV颗粒的方法，该方法包括以下步骤：1)用杆粒载体和病毒构建体载体和/或AAV有效载荷构建体载体共转染感受态细菌细胞，2)分离所得的病毒构建体表达载体和AAV有效载荷构建体表达载体并单独转染病毒复制细胞，3)分离并纯化所得的包含病毒构建体表达载体或AAV有效载荷构建体表达载体的有效载荷和病毒构建体颗粒，4)用包含病毒构建体表达载体或AAV有效载荷构建体表达载体的AAV有效载荷和病毒构建体颗粒共感染病毒复制细胞，5)收获并纯化包含细小病毒基因组的病毒颗粒。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生AAV颗粒的方法，该方法包括以下步骤：1)用有效载荷区、表达rep和cap基因的构建体和辅助构建体同时共转染哺乳动物细胞，诸如但不限于HEK293细胞，2)收获并纯化包含病毒基因组的AAV颗粒。
在一些实施方案中，用于AAV产生的病毒构建体载体可以含有编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是非ATG的，即次优起始密码子，允许在生产系统中表达改变比率的病毒衣壳蛋白，以提供宿主细胞提高的感染性。在非限制性示例中，病毒构建体载体可含有包含编码AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的核酸构建体，其中用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子是CTG、TTG或GTG，如美国专利第US8163543号中所述，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，用于AAV产生的病毒构建体载体可以含有编码AAV rep蛋白的核苷酸序列，其中AAV rep蛋白的起始密码子是非ATG的。在一些实施方案中，将单个编码序列用于Rep78和Rep52蛋白，其中用于Rep78蛋白翻译的起始密码子是选自由ACG、TTG、CTG和GTG组成的组的次优起始密码子，其在昆虫细胞中表达时实现部分外显子跳跃，如其内容通过引用整体并入本文的美国专利第8,512,981号中所述，例如以促进与Rep52相比Rep78不太丰富的表达，这可能是有利的，因为它会促进高载体产率。
在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组任选地编码选择标志物。选择标志物可包括细胞表面标志物，诸如在细胞表面表达的任何蛋白质，包括但不限于受体、CD标志物、凝集素、整联蛋白或其截短型式。
在一些实施方案中，选择标志物报告基因选自如下描述的那些：国际申请第WO96/23810号；Heim等人，Current Biology 2：178-182(1996)；Heim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)；或Heim等人，Science 373：663-664(1995)；WO 96/30540，其各自的内容通过引用整体并入本文)。
本文所述的编码抗tau抗体有效载荷的AAV病毒基因组可用于人疾病、兽医应用和多种体内和体外环境的领域中。本公开的AAV颗粒可用于治疗、预防、缓和或改善神经疾病和/或病症的医学领域。在一些实施方案中，AAV颗粒用于预防和/或治疗tau蛋白病。
本文的各种实施方案提供了包含本文所述的AAV颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文的各种实施方案提供了治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。
该方法的某些实施方案提出通过选自由静脉内、脑室内、实质内、鞘内、软膜下和肌内或其组合的药物组合物施用途径治疗受试者。该方法的某些实施方案提出治疗受试者的tau蛋白病和/或其他神经病症。在该方法的一个方面，tau蛋白病或其他神经病症的病理学特征得以减轻和/或tau蛋白病或其他神经病症的进展得以停止、减缓、改善或逆转。
本文的各种实施方案描述了降低有需要的受试者的中枢神经系统中可溶性tau水平的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的药物组合物。
本文还描述了用于设计、制备、制造和/或配制AAV颗粒的组合物、方法、过程、试剂盒和装置。在一些实施方案中，有效载荷，诸如但不限于抗tau抗体，可由有效载荷构建体编码或包含在质粒或载体或重组腺相关病毒(AAV)内。
本公开还提供了用于载体和病毒颗粒(例如AAV颗粒)的施用和/或递送方法，用于治疗或改善神经疾病，诸如但不限于tau蛋白病。
III.配制和递送
药物组合物
本文公开的化合物和AAV颗粒可以制备为药物组合物。如本文所用，术语“药物组合物”是指包含至少一种活性成分和最常药学上可接受的赋形剂的组合物。
根据本公开的药物组合物中活性成分(例如抗体)、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量可根据正在治疗的受试者的特性、大小和/或状况，并进一步根据施用组合物的途径而变化。例如，该组合物可包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。例如，该组合物可包含0.1％至100％，例如.5％至50％、1％至30％、5％至80％、至少80％(w/w)的活性成分。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适于对人进行施用的药物组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合施用于任何其他动物，例如施用于非人动物，例如非人哺乳动物。为了使组合物适于向各种动物施用，对适于向人施用的药物组合物的修饰得到很好的理解，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有)来设计和/或进行此类修饰。考虑施用该药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠、大鼠；禽类，包括商业上相关的禽类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在一些实施方案中，将组合物施用于人、人患者或受试者。
配制物
本公开的化合物和AAV颗粒可以使用一种或多种赋形剂配制以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞渗透性；(3)允许持续或延迟释放(例如，从持续释放配制物中释放)；和/或(4)改变生物分布(例如，将抗体靶向特定组织或细胞类型)。除了常规赋形剂诸如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂以外，本公开的配制物还可包括但不限于脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、转染细胞(例如，用于移植到受试者中)及其组合。
本文所述的药物组合物可通过药理学领域中已知或此后开发的方法制备。此类制备方法可以包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合的步骤。
根据本公开的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量散装制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用给受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的适宜分数，例如此类剂量的一半或三分之一。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以与环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(也称为普朗尼克(Pluronic)或泊洛沙姆(poloxamer))组合配制在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以与0.001％普朗尼克酸(F-68)(泊洛沙姆188)在约7.0的pH下配制在PBS中。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以与0.001％普朗尼克酸(F-68)(泊洛沙姆188)在约7.3的pH下配制在PBS中。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以与0.001％普朗尼克酸(F-68)(泊洛沙姆188)在约7.4的pH下配制在PBS中。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以配制在包含氯化钠、磷酸钠和环氧乙烷/环氧丙烷共聚物的溶液中。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以配制在包含氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和泊洛沙姆188/普朗尼克酸(F-68)的溶液中。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以配制在包含约180mM氯化钠、约10mM磷酸钠和约0.001％泊洛沙姆188的溶液中。在一些实施方案中，该配制物的pH可为约7.3。最终溶液中氯化钠的浓度可为150mM-200mM。作为非限制性示例，最终溶液中氯化钠的浓度可为150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。最终溶液中磷酸钠的浓度可为1mM-50mM。作为非限制性示例，最终溶液中磷酸钠的浓度可为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或50mM。泊洛沙姆188(普朗尼克酸(F-68))的浓度可为0.0001％-1％。作为非限制性示例，泊洛沙姆188(普朗尼克酸(F-68))的浓度可为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％。最终溶液可具有6.8-7.7的pH。最终溶液的pH的非限制性示例包括6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7的pH。
在一些实施方案中，本发明的AAV颗粒可以配制在包含约1.05％氯化钠、约0.212％磷酸氢二钠七水合物、约0.025％磷酸二氢钠一水合物和0.001％泊洛沙姆188，pH为约7.4的溶液中。作为非限制性示例，AAV颗粒在该配制溶液中的浓度可为约0.001％。最终溶液中氯化钠的浓度可为0.1-2.0％，非限制性示例为0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、0.95％、0.96％、0.97％、0.98％、0.99％、1.00％、1.01％、1.02％、1.03％、1.04％、1.05％、1.06％、1.07％、1.08％、1.09％、1.10％、1.25％、1.5％、1.75％或2％。最终溶液中磷酸氢二钠的浓度可为0.100-0.300％，非限制性示例包括0.100％、0.125％、0.150％、0.175％、0.200％、0.210％、0.211％、0.212％、0.213％、0.214％、0.215％、0.225％、0.250％、0.275％、0.300％。最终溶液中磷酸二氢钠的浓度可为0.010-0.050％，非限制性示例为0.010％、0.015％、0.020％、0.021％、0.022％、0.023％、0.024％、0.025％、0.026％、0.027％、0.028％、0.029％、0.030％、0.035％、0.040％、0.045％或0.050％。泊洛沙姆188(普朗尼克酸(F-68))的浓度可为0.0001％-1％。作为非限制性示例，泊洛沙姆188(普朗尼克酸(F-68))的浓度可为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％。最终溶液可具有6.8-7.7的pH。最终溶液的pH的非限制性示例包括6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7的pH。
根据本公开的药物组合物中活性成分(例如抗体)、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量可根据正在治疗的受试者的特性、大小和/或状况，并进一步根据施用途径而变化。例如，组合物可包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。例如，组合物可包含0.1％至100％，例如0.5％至50％、1％至30％、5％至80％或至少80％(w/w)的活性成分。
根据本公开，化合物可以配制用于CNS递送。可以使用穿过血脑屏障的剂。例如，可以将分子靶向血脑屏障内皮的一些细胞穿透肽可以用于配制(例如，Mathupala，ExpertOpin Ther Pat.，2009，19，137-140；其内容通过引用整体并入本文)。
赋形剂和稀释剂
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以纯度为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施方案中，赋形剂经批准用于人和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂可经美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药用级的。在一些实施方案中，赋形剂可符合《美国药典》(USP)、《欧洲药典》(EP)、《英国药典》和/或《国际药典》的标准。
如本文所用，赋形剂包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，如适于所需的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和制备技术是本领域已知的(参见Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第21版，A.R.Gennaro，Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2006；通过引用整体并入本文)。常规赋形剂介质的使用可考虑在本公开的范围内，除非任何常规赋形剂介质可能与某些物质或其衍生物不相容，诸如因产生任何不期望的生物效应或以有害方式与本公开的药物组合物的任何其他组分相互作用。
示例性的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
非活性成分
在一些实施方案中，本公开的配制物可包含至少一种非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指对药物组合物的活性无贡献的剂。在一些实施方案中，可用于本公开的配制物中的非活性成分全部、没有或一些受美国食品和药物管理局(FDA)批准。
本文公开的配制物可包含阳离子或阴离子。配制物可包含Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Mg+或其组合。作为非限制性示例，配制物可包含与金属阳离子的聚合物和络合物(参见例如，美国专利第6265389号和第6555525号，其各自通过引用整体并入本文)。
IV.施用和给药
施用
本公开的化合物和组合物(例如，AAV颗粒)可以通过产生治疗有效结果的任何递送途径施用。这些递送途径包括但不限于肠内(递送到肠内)、胃肠内、硬膜外(递送到硬脑膜中)、口服(通过口腔)、经皮、大脑内(递送到大脑)、脑室内(递送到脑室中)、表皮(施加到皮肤上)、皮内(递送到皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、经鼻施用(通过鼻子)、静脉内(递送到静脉中)、静脉内推注、静脉滴注、动脉内(递送到动脉)、肌内(递送到肌肉中)、心内(递送到心脏中)、骨内输注(递送到骨髓)、鞘内(递送到脊椎管)、实质内(递送到组织例如脑组织的物质中)、腹膜内(输注或注射到腹膜中)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼睛)、海绵窦内注射(递送到病理腔中)、腔内(递送到阴茎根部)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、经皮(通过完好皮肤扩散以便全身分布)、经粘膜(通过粘膜扩散)、经阴道、吹入(嗅吸法)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(滴到结膜上)、滴耳剂、耳用(在耳中或通过耳)、含服(针对脸颊)、结膜、皮肤、牙齿(递送到一颗或多颗牙齿上)、电渗、子宫颈内、窦内、气管内、体外、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、关节内、胆内、支气管内、囊内、软骨内(在软骨内)、尾部内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内、冠状动脉内(在冠状动脉内)、海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、导管内(在腺管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜内或在硬膜下)、表皮内(递送到表皮)、食管内(递送到食管)、胃内(在胃部内)、齿龈内(在齿龈内)、回肠内(在小肠的远端部分内)、病灶内(在局部病灶内或直接引入到局部病灶)、管腔内(在管的内腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、髓内(在骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、心肌内(在心肌内)、眼内(在眼睛内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、窦内(在鼻窦或眶周窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑膜腔内)、腱内(在腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴的任何水平的脑脊液内)、胸内(在胸腔内)、小管内(在器官的小管内)、瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在中耳内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子电渗疗法(借助于电流，其中可溶性盐的离子迁移到身体的组织中)、灌洗(以浸泡或冲洗开放性伤口或体腔)、喉部(直接递送在喉上)、鼻胃(通过鼻子进入胃部)、封闭敷料技术(局部途径施用，然后用封闭该区域的敷料覆盖)、眼(递送至眼睛外部)、口咽(直接递送至口和咽)、肠胃外、透皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(通过口服或鼻吸入递送到呼吸道内以获得局部或全身作用)、眼球后(在脑桥后或在眼球后)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(通过气管壁)、经鼓膜(穿过或通过鼓室)、输尿管(递送至输尿管)、尿道(递送至尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断、神经阻滞、胆道灌注、心脏灌注、光分离置换法和经脊柱。
在一些实施方案中，组合物可以以允许它们穿过血脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的方式施用。本公开的化合物和组合物可以以任何合适的形式施用，包括但不限于作为液体溶液、作为悬浮液或作为适于液体溶液或在液体溶液中的悬浮液的固体形式。
在一些实施方案中，向受试者的递送可以经由单一途径施用。在一些实施方案中，向受试者的递送可以经由多部位施用途径。施用可包括推注。施用可包括在数分钟、数小时或数天的时间段内持续递送。通过输注施用可包括可根据受试者、分布、配制物或其他递送参数而变化的输注速率。施用可以通过多于一种的施用途径。作为非限制性示例，组合施用可包括鞘内和脑室内施用，或静脉内和实质内施用。
静脉内施用
本公开的化合物和组合物可以通过全身施用来向受试者施用。在一些实施方案中，全身施用可包括静脉内施用。全身施用可包括动脉内施用。
本公开的化合物和组合物可以通过静脉内施用来向受试者施用。在一些实施方案中，静脉内施用可以通过皮下递送实现。在一些实施方案中，AAV颗粒经由聚焦超声(FUS)例如联合微泡静脉内施用(FUS-MB)或MRI引导的FUS联合静脉内施用来向受试者施用，例如，如Terstappen等人(Nat Rev Drug Discovery，https：//doi.org/10.1038/s41573-021-00139-y(2021))，Burgess等人(Expert Rev Neurother.15(5)：477-491(2015))和/或Hsu等人(PLOS One 8(2)：1-8)所述，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，AAV颗粒经静脉内施用于受试者。静脉内施用可以通过尾静脉注射实现(例如，在小鼠模型中)。静脉内施用可以通过眶后注射实现。
向CNS施用
本公开的化合物和组合物可以通过直接注射到脑部而施用于受试者。作为非限制性示例，脑部递送可以通过海马内施用。施用可以通过实质内施用。在一些实施方案中，实质内施用是施用到中枢神经系统的组织。施用可以通过颅内递送(参见，例如，美国专利第8119611号；其内容通过引用整体并入本文)。施用可以通过注射到CSF通路。向CSF通路递送的非限制性示例包括鞘内和脑室内(例如，小脑延髓池内-ICM)施用。向脑部施用可以通过全身递送。作为非限制性示例，全身递送可以通过血管内施用。作为非限制性示例，全身或血管内施用可以是静脉内的。施用可以通过眼内递送途径。眼内施用的非限制性示例包括玻璃体内注射。
肌内施用
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过肌内施用递送。不希望受理论束缚，肌细胞的多核性质为AAV递送后的基因转导提供了优势。肌细胞能够表达具有适当翻译后修饰的重组蛋白。具有血管结构的肌肉组织的富集允许转移到血流和全身递送。肌内施用的示例包括全身(例如，静脉内)、皮下或直接施用至肌肉中。在一些实施方案中，施用多于一次注射。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过肌内递送途径递送。(参见，例如，美国专利第6506379号；其内容通过引用整体并入本文)。肌内施用的非限制性示例包括静脉内注射或皮下注射。
在一些实施方案中，将本公开的AAV颗粒施用于受试者并转导受试者的肌肉。作为非限制性示例，AAV颗粒通过肌内施用进行施用。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过皮下施用来向受试者施用。
在一些实施方案中，肌内施用是经由全身递送。
在一些实施方案中，肌内施用是经由静脉内递送。
在一些实施方案中，肌内施用是经由直接注射至肌肉。
在一些实施方案中，通过施用转导肌肉，并这被称为肌内施用。
在一些实施方案中，肌内递送包括在一个部位施用。
在一些实施方案中，肌内递送包括在多于一个部位施用。在一些实施方案中，肌内递送包括在两个部位施用。在一些实施方案中，肌内递送包括在三个部位施用。在一些实施方案中，肌内递送包括在四个部位施用。在一些实施方案中，肌内递送包括在多于四个部位施用。
在一些实施方案中，肌内递送与至少一种其他施用方法组合。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以通过外周注射向受试者施用。外周注射的非限制性示例包括腹膜内、肌内、静脉内、结膜或关节注射。本领域公开AAV载体的外周施用可以转运至中枢神经系统，例如转运至运动神经元(例如，美国专利公开第US20100240739号和第US20100130594号；期各自的内容通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以通过实质内施用来向受试者施用。在一些实施方案中，实质内施用是向肌肉组织施用。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒如Bright等人2015(Neurobiol Aging.36(2)：693-709)中所述那样递送，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，将本公开的AAV颗粒施用至受试者的腓肠肌。
在一些实施方案中，将本公开的AAV颗粒施用至受试者的股二头肌。
在一些实施方案中，将本公开的AAV颗粒施用至胫骨前肌。
在一些实施方案中，将本公开的AAV颗粒施用至比目鱼肌。
贮库施用
如本文所述，在一些实施方案中，本公开的药物组合物、AAV颗粒配制成贮库用于长期释放。通常，特定器官或组织(“靶组织”)被靶向施用。
在一些方面，本公开的药物组合物、AAV颗粒在空间上保留在靶组织内或邻近靶组织。提供了向哺乳动物受试者的靶组织提供药物组合物、AAV颗粒的方法，该方法是通过在使得药物组合物、AAV颗粒基本上保留在靶组织中的条件下使靶组织(其包含一种或多种靶细胞)与药物组合物、AAV颗粒接触，这意味着至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99或大于99.99％的组合物保留在靶组织中。有利地，通过测量进入一种或多种靶细胞的药物组合物、AAV颗粒的量来确定保留。例如，施用于受试者的药物组合物、AAV颗粒的至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％在施用后的一段时间存在于细胞内。例如，可以使用包含本公开的药物组合物、AAV颗粒和一种或多种转染试剂的水性组合物对哺乳动物受试者进行肌内注射，并且通过测量肌细胞中存在的药物组合物、AAV颗粒的量来确定保留。
某些方面涉及向哺乳动物受试者的靶组织提供本公开的药物组合物、AAV颗粒的方法，该方法是通过在使得药物组合物、AAV颗粒基本上保留在此类靶组织中的条件下使靶组织(其包含一种或多种靶细胞)与药物组合物、AAV颗粒接触。药物组合物、AAV颗粒包含足够的活性成分，使得在至少一种靶细胞中产生感兴趣的效果。在一些实施方案中，药物组合物、AAV颗粒通常包含一种或多种细胞穿透剂，但是也考虑到了“裸”配制物(诸如没有细胞穿透剂或其他剂)，有或无药学上可接受的载剂。
剂量和方案
本公开提供了向有需要的受试者施用根据本公开的化合物和组合物的方法。施用可以按有效预防、治疗、管理或诊断疾病、病症和/或病状的任何量和任何施用途径。所需的确切量可以根据受试者的物种、年龄、总体状况，疾病的严重程度，特定组合物，施用模式，活性模式等因受试者而不同。受试者可以是但不限于人、哺乳动物或动物。组合物可以配制成单位剂型以便于施用和剂量均一。然而应理解，本公开的组合物的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定个体，具体的治疗有效剂量水平、预防有效剂量水平或适当的诊断剂量水平可根据多种因素而变化，包括正在治疗的病症和病症的严重程度；所采用的特定有效载荷的活性；采用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所采用的化合物和组合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗持续时间；与采用的化合物和组合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。
在一些实施方案中，根据本公开的化合物和组合物可以按下述剂量水平每天施用一次或多次以获得所需治疗、诊断或预防效果，所述剂量水平足以递送每天0.0001mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约25mg/kg受试者体重。
在一些实施方案中，所需剂量可使用多次施用(例如，两次、三次、四次或多于四次施用)来递送。当采用多次施用时，可以使用分次施用方案，诸如本文所述的那些施用方案。如本文所用，“分次剂量”是将“单一单位剂量”或总日剂量分成两个或更多个剂量，例如“单一单位剂量”分两次或更多次施用。如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/一次/单一途径/单一接触点，即单一施用事件施用的任何治疗剂的剂量。
本公开的化合物和组合物可以作为“脉冲剂量”或作为“连续流”施用。如本文所用，“脉冲剂量”是在一段时间内以设定频率施用的任何治疗剂的一系列单一单位剂量。如本文所用，“连续流”是在单一途径/单一接触点，即连续施用事件中连续施用一段时间的治疗剂的剂量。总日剂量，即在24小时内给予或开出的量，可以通过这些方法中的任一种，或作为这些方法的组合，或通过适于药物施用的任何其他方法施用。
在一些实施方案中，AAV颗粒的递送可包含约1x106VG至约1x1016VG的总剂量。在一些实施方案中，递送可以包含约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、1.9x1010、2x1010、3x1010、3.73x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、2.5x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、9x1012、1x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG的总剂量。作为非限制性示例，总剂量为1x1013VG。作为另一个非限制性示例，总剂量为2.1x1012VG。
在一些实施方案中，AAV颗粒的递送可包含约1x106VG/mL至约1x1016VG/mL的组合物浓度。在一些实施方案中，递送可包含约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、9x1012、1x1013、2x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG/mL的组合物浓度。在一些实施方案中，递送包含1x1013VG/mL的组合物浓度。在一些实施方案中，递送包含2.1x1012VG/mL的组合物浓度。
组合
本公开的化合物和组合物可以与一种或多种其他治疗剂、预防剂、研究剂或诊断剂组合使用。“与......组合”并不旨在暗示剂必须同时施用和/或配制用于一起递送，但这些递送方法也在本公开的范围内。组合物可以与一种或多种其他所需的治疗剂或医疗程序同时施用，在其之前施用或在其之后施用。一般而言，每种剂将以针对该剂确定的剂量和/或时间计划施用。在一些实施方案中，本公开涵盖药物组合物、预防组合物、研究组合物或诊断组合物与可以改善它们的生物利用度，降低和/或改变它们的代谢，抑制它们的排泄和/或改变它们在体内的分布的剂组合递送。
V.组合物的方法和用途
在一些实施方案中，本公开提供了与使用和评价用于治疗和诊断应用的化合物和组合物有关的方法。
治疗应用
在一些实施方案中，本公开的方法包括使用本文公开的化合物和/或组合物来治疗治疗性适应症的方法。如本文所用，术语“治疗性适应症”是指可以通过某种形式的治疗或其他治疗干预来减轻、稳定、改善、治愈或以其他方式解决的任何症状、病状、病症或疾病。在一些实施方案中，本公开的方法包括通过施用本文公开的抗体来治疗治疗性适应症。
如本文所用，术语“治疗”等是指病理过程的缓解或减轻。在本公开的上下文中，就其涉及下文叙述的任何其他病状而言，术语“治疗”等意指缓解或减轻与此类病状相关的至少一种症状，或者减缓或逆转此类病状的进展或预期进展。
在疾病标志物或症状的上下文中，“降低”或“减少”意指此类水平的显著降低，常常是统计学显著的。降低可以是，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地降低到对于没有此类病症的个体而言在正常范围内接受的水平。
在疾病标志物或症状的上下文中，“增加”或“升高”意指此类水平的显著升高，常常是统计学显著的。增加可以是，例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地增加到对于没有此类病症的个体而言在正常范围内接受的水平。
可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛的减轻、生活质量、维持疗效所需的药物剂量、疾病标志物的水平或适于正在治疗或靶向预防的给定疾病的任何其他可测参数来评估对疾病的治疗或改善功效。通过测量此类参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。与本文所述的化合物或组合物的施用有关，“有效对抗”疾病或病症表明以临床上适当的方式施用至少对一部分患者产生有益作用，诸如症状改善、治愈、疾病负荷减轻、蛋白质聚集减少、神经原纤维缠结减少、神经退行性变减少、寿命延长、生活质量改善或通常被熟悉治疗特定类型的疾病和病症的医生认为是积极的其他作用。
当疾病状态的一个或多个参数存在常常在统计学上显著的显著改善时，或依据没有恶化或发展出它们原本所预期的症状，治疗或预防作用显而易见。例如，在可测量的疾病参数中至少10％，且优选至少20％、30％、40％、50％或更多的有利变化可以指示治疗有效。给定化合物或组合物的功效也可以使用本领域已知的给定疾病的实验动物模型来判断。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状的统计学显著调节时，证明了治疗的功效。
本公开的化合物和附加治疗剂可以组合施用。此类组合可以处于相同的组合物中，或者附加治疗剂可以作为单独组合物的一部分施用或通过本文所述的另一种方法施用。
在一些实施方案中，可通过本公开的方法解决的治疗性适应症包括神经适应症。如本文所用，“神经适应症”是指涉及中枢神经系统(CNS)的任何治疗性适应症。根据本公开治疗神经适应症的方法可包括施用本文所述的化合物(例如，抗体)和/或组合物。神经适应症可包括涉及tau的不规则表达或聚集的神经疾病和/或病症。此类适应症可包括但不限于神经退行性疾病、阿尔茨海默病(AD)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)、额颞叶变性(FTLD)、额颞叶痴呆(FTD)、慢性创伤性脑病(CTE)、进行性核上性麻痹(PSP)、唐氏综合征、皮克病、皮质基底节变性(CBD)、皮质基底节综合征、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、朊病毒病、克雅二氏症(CJD)、多系统萎缩、仅缠结性痴呆、中风和进行性皮质下胶质增生。
在一些实施方案中，治疗有需要的受试者的神经疾病和/或病症的方法可包括以下步骤中的一个或多个：(1)递送、生成和/或选择抗tau抗体或其片段或组合物；和(2)向受试者施用抗tau抗体或其片段或组合物。向受试者施用可减缓、终止或逆转疾病进展。作为非限制性示例，疾病进展可通过认知测试来测量，所述认知测试诸如但不限于简易精神状态检查(MMSE)或本领域技术人员已知的其他类似诊断工具。作为另一个非限制性示例，疾病进展可以通过受试者的脑部、CSF或其他组织的病理学特征的变化来测量，病理学特征的变化诸如但不限于tau(可溶性或不可溶性)水平的降低。在一些实施方案中，不溶性过度磷酸化tau的水平降低。在一些实施方案中，可溶性tau的水平降低。在一些实施方案中，可溶性和不溶性tau都降低。在一些实施方案中，不溶性过度磷酸化tau的水平增加。在一些实施方案中，可溶性tau的水平增加。在一些实施方案中，不溶性和可溶性tau水平都增加。在一些实施方案中，神经原纤维缠结的大小、数目、密度或其组合减小。在另一个实施方案中，神经原纤维缠结的大小、数目、密度或其组合增加。
神经退行性变
神经退行性疾病是指以神经元结构和功能的进行性损失为特征，最终导致神经元细胞死亡的一组病状。神经元是神经系统的构建块，并且通常不能复制和/或被置换，因此神经元损伤和/或死亡是特别具破坏性的。其他导致神经元细胞损失的非变性疾病，诸如中风，具有类似的使人衰弱的结果。促使细胞结构或功能退化的靶向分子通常可证实对治疗神经适应症，包括神经退行性疾病和中风有益。
认为某些分子对神经突生长具有抑制作用，促使中枢神经系统修复损伤的能力有限。此类分子包括但不限于髓鞘相关蛋白，诸如但不限于RGM(排斥性导向分子)、NOGO(神经突生长抑制剂)、NOGO受体、MAG(髓鞘相关糖蛋白)和MAI(髓鞘相关抑制剂)。在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可用于靶向前述抗原(例如，神经突增生抑制剂)。
许多神经退行性疾病与错误折叠的蛋白质的聚集相关，所述错误折叠的蛋白质包括但不限于α突触核蛋白、tau(如在tau蛋白病中)、β淀粉样蛋白、朊病毒蛋白、TDP-43和亨廷顿蛋白(参见，例如De Genst等人，2014，Biochim Biophys Acta；1844(11)：1907-1919和Yu等人，2013，Neurotherapeutics.；10(3)：459-472，其中的参考文献，其全部通过引用整体并入本文)。聚集是由可溶性蛋白向不溶性、高度有序的原纤维沉积物的疾病特异性转化而引起的。这种转化被认为会防止对错误折叠的蛋白质的恰当处理或降解，从而导致进一步聚集。与α突触核蛋白错误折叠和聚集相关的病状称为“突触核蛋白病”。在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可用于靶向错误折叠或聚集的蛋白质。
阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(AD)是一种使人衰弱的神经退行性疾病，当前全世界有超过3500万人受到折磨，预计该数字在未来几十年会加倍。对症治疗已可用许多年，但是这些治疗没有解决潜在的病理生理学问题。使用这些和其他治疗的新近临床试验在很大程度上失败，并且迄今为止，尚未鉴定出已知的治愈方法。
AD脑部的特征在于存在两种形式的病理性聚集物，由β-淀粉样蛋白(Aβ)组成的细胞外斑块和由过度磷酸化微管相关蛋白tau组成的细胞内神经原纤维缠结(NFT)。基于早期遗传发现，认为β-淀粉样蛋白改变会引发疾病，其中tau的变化被认为是下游的。因此，大多数临床试验已经以Aβ为中心。尽管没有tau基因的突变与AD有联系，但已经证实此类改变会导致称为tau蛋白病变的痴呆家族，证明tau的变化可促成神经退行性过程。tau通常是已知基于其磷酸化程度与微管缔合的极易溶解的蛋白质。tau的过度磷酸化会阻抑其与微管的结合和微管组装活性。在tau蛋白病中，tau变得过度磷酸化，错误折叠并聚集为成对螺旋丝(PHF)、扭带或直丝的NFT。在AD中，NFT病理，而不是斑块病理，与神经病理学标志诸如神经元损失、突触缺陷、疾病严重程度和认知衰退更紧密相关。NFT病理以刻板的方式穿过脑部并且动物研究表明沿神经元连接的跨细胞增殖机制。
已经提出了几种方法用于治疗性干扰tau病理进展和防止后续的分子和细胞后果。考虑到NFT由过度磷酸化、错误折叠和聚集形式的tau组成，则在这些阶段的每个阶段的干扰都得到了最热衷追求的一组靶标。引入限制磷酸化，阻断错误折叠或防止聚集的剂已经全部产生有前景的结果。在小鼠模型中用晚期抗磷酸tau抗体被动和主动免疫已经导致tau聚集的显著降低和认知参数的改善。还有人提出引入抗tau抗体可防止tau病理的跨神经元扩散。
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可根据本文提出的方法用于治疗患有AD和其他tau蛋白病的受试者。在一些情况下，本公开的方法可用于治疗怀疑发展AD或其他tau蛋白病的受试者。
与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)
尽管阿尔茨海默病的部分特征在于存在tau蛋白病理，但tau基因中没有已知的突变与该疾病有因果联系。已经证实tau基因中的突变导致常染色体显性遗传性tau蛋白病，称为与17号染色体相关的额颞叶痴呆和帕金森综合征(FTDP-17)，并且证明tau的改变可导致脑部中的神经退行性变化。认为tau基因中导致FTDP-17的突变会影响剪接模式，从而导致具有四个微管结合结构域(而不是三个)的tau比例升高。这些分子被视为更成淀粉样的，意味着它们更有可能变得过度磷酸化并且更有可能聚集成NFT(Hutton，M.等人，1998，Nature393(6686)：702-5，其内容通过引用整体并入本文)。尽管在身体上和行为上，FTDP-17患者可显得与阿尔茨海默病患者非常相似，但在尸检时FTDP-17脑部缺乏AD脑部的突出Aβ斑块病理(Gotz，J.等人，2012，British Journal of Pharmacology 165(5)：1246-59，其内容通过引用整体并入本文)。在治疗上靶向tau蛋白的聚集物可改善和预防脑部中的退行性变化，并潜在地引起认知能力的提高。
迄今为止，还没有预防、减缓进展或治愈FTDP-17的治疗。可以开出药物以减少攻击性、激动或危险行为。仍然需要影响潜在病理生理的疗法，诸如靶向tau蛋白的抗体疗法。
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可用于治疗患有FTDP-17的受试者。在一些情况下，本公开的方法可用于治疗怀疑发展FTDP-17的受试者。
慢性创伤性脑病
与遗传相关联的tau蛋白病不同，慢性创伤性脑病是与反复的头部损伤相关联的退行性tau蛋白病。该疾病首先在表现为“拳击醉态”的拳击手中有描述，并且后来主要在玩美式足球、冰球、摔跤和其他接触性运动的运动员中鉴定出来。患有CTE的患者的脑部特征在于伴有过度磷酸化种类的聚集tau在NFT中积聚的独特脑萎缩模式。在CTE中，tau的病理变化伴有许多其他病理生物学过程，诸如炎症(Daneshvar，D.H.等人，2015Mol CellNeurosci 66(Pt B)：81-90，其内容通过引用整体并入本文)。靶向tau聚集物可提供从疾病进展中的缓和并且可允许认知提高。
迄今为止，还没有治疗或治愈CTE的医学疗法。该病状仅在死亡后得以诊断，这是由于缺乏体内技术来鉴定CTE特异性生物标志物。仍然需要影响潜在病理生理的疗法，诸如靶向tau蛋白的抗体疗法。
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可用于治疗患有CTE的受试者。在一些情况下，本公开的方法可用于治疗怀疑发展CTE的受试者。
朊病毒病
朊病毒病，也称为传染性海绵状脑病(TSE)，是一组影响神经系统的罕见进行性病状。相关病状是罕见的并且通常由PRNP基因中使得能够产生朊病毒蛋白的突变引起。基因突变导致朊病毒蛋白结构异常。可替代地，异常朊病毒可以通过从外部来源暴露而获取，例如通过消耗含有异常朊病毒蛋白的牛肉产品。异常朊病毒错误折叠，致使脑组织迅速退化。朊病毒病包括但不限于克雅二氏症(CJD)、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(Gerstmann-
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-Scheinker syndrome，GSS)、致命性失眠(FFI)、可变蛋白酶敏感性朊病毒病(VPSPr)和库鲁病(kuru)。朊病毒病很罕见。在美国每年诊断出大约350例朊病毒病。
CJD是以肌肉协调问题、人格改变(包括精神损害)、视力受损、无意识的肌肉痉挛、虚弱和最终昏迷为特征的退行性脑部病症。最常见的CJD类别是散发性的，由于遗传突变而是遗传性的并且是获得性的。散发性CJD是影响没有已知疾病风险因素的人的最常见形式。获得形式的CJD通过脑部和神经系统组织暴露于朊病毒而传播。作为示例，变体CJD(vCDJ)与牛海绵状脑病(BSE)(也称为“疯牛”病)有联系。CJD是致命的并且患者通常在诊断的一年以内死亡。
朊病毒病与由朊病毒蛋白的替代构象同种型PrPSc组成的感染因子相关。认为PrPSc复制是通过在正常朊病毒蛋白(PrPC)中诱导感染性朊病毒而发生的。复制在没有核酸的情况下发生。
迄今为止，还没有管理或治愈CJD或其他朊病毒疾病的疗法。通常，治疗旨在减轻症状和增加患者的舒适度，例如用止痛药。仍然需要影响潜在病理生理的疗法。
在一些实施方案中，本公开的抗tau抗体可用于治疗患有朊病毒病的受试者。在一些情况下，本公开的方法可用于治疗怀疑发展朊病毒病的受试者。
诊断应用
在一些实施方案中，本公开的化合物(例如，抗体)和组合物可用作诊断剂。抗tau抗体可用于对表达tau蛋白的细胞、组织、器官等进行鉴定、标记或染色。抗tau抗体可用于鉴定组织切片(例如，组织学组织切片)，包括已知或怀疑具有tau蛋白聚集物的组织中存在的tau蛋白。此类抗体在某些情况下可用于鉴定患有神经疾病和/或病症的受试者。组织切片可以来自CNS组织。
在一些实施方案中，本公开的诊断方法可包括使用免疫组织化学技术分析一种或多种细胞或组织。此类方法可包括使用本文所述的任何抗tau抗体中的一种或多种。免疫组织化学方法可包括对组织切片染色以确定一种或多种tau蛋白或其他标志物的存在和/或水平。组织切片可以源自受试者CNS组织(例如，患者CNS、动物CNS和来自疾病动物模型的CNS)。组织切片可来自福尔马林固定的组织或未固定的新鲜冷冻组织。在一些情况下，组织切片来自福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织。本文所述的抗tau抗体可用作一抗。一抗用于直接接触组织切片并且与靶表位结合。一抗可以直接与可检测标记缀合或者可以通过使用检测剂诸如二抗检测。在一些实施方案中，一抗或检测剂包括可用于与底物反应以生成可见产物(例如，沉淀物)的酶。此类酶可包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和过氧化氢酶。
本文所述的抗tau抗体可根据本公开的免疫组织化学方法用于检测组织或细胞中的tau蛋白。在一些情况下，这些抗体用于检测和/或确定组织中tau蛋白的水平。免疫组织化学染色技术中使用的抗tau抗体的水平可以改变以增加可见染色或降低染色的背景水平。在一些实施方案中，使用约0.01μg/ml至约50μg/ml的抗体浓度。例如，可以使用约0.01μg/ml至约1μg/ml、约0.05μg/ml至约5μg/ml、约0.1μg/ml至约3μg/ml、约1μg/ml至约10μg/ml、约2μg/ml至约20μg/ml、约3μg/ml至约25μg/ml、约4μg/ml至约30μg/ml或约5μg/ml至约50μg/ml的抗体浓度。
tau蛋白的水平和/或特性可根据本领域已知的用于鉴定蛋白和/或定量蛋白水平的任何方法来确定。在一些实施方案中，此类方法可以包括但不限于质谱法、阵列分析(例如，抗体阵列或蛋白质阵列)、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫沉淀、表面等离振子共振分析和ELISA。在一些情况下，可在分析前从样品中免疫沉淀tau蛋白。此类免疫沉淀可以使用本文公开的抗tau抗体进行。在一些实施方案中，使用抗tau抗体从生物样品中免疫沉淀tau蛋白，然后使用质谱法鉴定和/或定量。
在一些实施方案中，通过使用抗tau抗体生成的诊断信息为治疗提供信息。因此，本公开提供了治疗神经疾病和/或病症的方法，所述方法包括从受试者获得样品，使用抗tau抗体诊断一种或多种神经疾病和/或病症，并且施用基于诊断选择的治疗。此类治疗可以包括用抗tau抗体的治疗。根据此类方法施用的抗tau抗体可以包括本文所述的那些中的任一种。
在一些实施方案中，本公开提供了通过使用捕获抗体和检测抗体来检测和/或定量样品中的tau蛋白的方法。如本文所用，“捕获抗体”是以可以分离或检测的方式结合分析物的抗体。捕获抗体可以与表面或其他载体(例如，珠粒)缔合。检测抗体是利于观察分析物存在与否的抗体。根据检测和/或定量tau蛋白的一些方法，捕获抗体和检测抗体均与tau蛋白结合。捕获抗体和检测抗体可与tau蛋白的不同表位或区域结合以避免竞争结合。在一些实施方案中，检测抗体可以与可检测标记缀合用于直接检测。在一些实施方案中，可以使用与检测抗体的恒定结构域或与检测抗体的可检测标记结合的二抗来评估检测抗体的结合。捕获抗体、检测抗体和/或二抗可以源自不同物种。这可以防止二抗与捕获抗体和检测抗体结合。
VI.试剂盒和装置
试剂盒
在一些实施方案中，本公开的化合物和组合物可包括在试剂盒中。此类化合物和组合物可以包括本文公开的抗tau抗体。在非限制性示例中，试剂盒可以包括用于生成抗tau抗体(包括tau蛋白抗原)的试剂。试剂盒可以包括附加试剂和/或使用说明书，例如用于产生或合成抗tau抗体的使用说明书。试剂盒可以包括一种或多种缓冲液。试剂盒可以包括附加组分，例如用于抗体或抗原附着的固体支持物或基质。
在一些实施方案中，本公开包括用于筛查、监测和/或诊断受试者的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种抗tau抗体。此类试剂盒可以单独使用或与一种或多种其他筛查、监测和/或诊断方法组合使用。试剂盒可以包括缓冲液，生物标准品，二抗、检测试剂和用于样品预处理(例如，用于抗原修复、阻断等)的组合物中的一种或多种。
试剂盒组分可以是包装的。在一些实施方案中，试剂盒组分以水性介质或以冻干形式包装。包装可包括一个或多个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或者可以将组分置于其中和/或适当等分的其他容器。在存在多个试剂盒组分(标记试剂和标记可以包装在一起)的情况下，试剂盒可以包括可以将附加组分单独置于其中的第二容器、第三容器或其他附加容器。
当试剂盒组分以一种和/或多种液体溶液提供时，液体溶液可以是水性的。液体溶液可以无菌提供。试剂盒组分可以作为干粉提供。可以提供干粉组分由试剂盒使用者重构，例如通过添加合适的溶剂重构。溶剂也可以在试剂盒中的一个或多个单独容器中提供。在一些实施方案中，标记染料以干粉形式提供。
试剂盒可包括采用试剂盒组分以及试剂盒中未包括的其他试剂的说明书。说明书可以包括可以实现的变型。
装置
本文所述的化合物和组合物中的任一者都可以与装置组合，涂覆到装置上，或嵌入装置中，或通过装置递送。装置可以包括但不限于植入物、支架、骨置换物、人工关节、瓣膜、起搏器或其他可植入的治疗装置。
VII.定义
在本说明书的不同地方，以组或范围公开本公开的化合物的取代基。明确的意图是本公开包括此类组和范围的成员的每一个单独的子组合。
约：如本文所用，术语“约”意指所叙述的值的+/-10％。
活性：如本文所用，术语“活性”是指事情正在发生或正在进行的情况。组合物可具有活性且该活性可涉及一个或多个生物学事件。
腺相关病毒：如本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指包含任何颗粒、序列、基因、蛋白或源自其中的组分的依赖病毒属的成员。
AAV颗粒：如本文所用，“AAV颗粒”是包含具有至少一个有效载荷区和至少一个ITR区的病毒基因组的病毒。本公开的AAV载体可以重组产生并且可以基于腺相关病毒(AAV)亲本序列或参考序列。AAV颗粒可源自本文所述或本领域已知的任何血清型，包括血清型的组合(即，“假型”AAV)或源自各种基因组(例如，单链的或自身互补的)。另外，AAV颗粒可以是复制缺陷型的和/或靶向的。
以组合施用：如本文所用，术语“以组合施用”或“组合施用”意指两种或更多种剂同时或在一定时间间隔内施用于受试者，使得每种剂对患者的作用可重叠。在一些实施方案中，它们彼此在约60分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟或1分钟内施用。在一些实施方案中，剂的施用被充分紧密地间隔在一起，以便实现组合(例如，协同)效应。
改善：如本文所用，术语“改善”是指病状或疾病的至少一种指标的严重程度的减小。例如，在神经退行性病症的情况下，改善包括神经元损失的减少。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼和蠕虫。在一些实施方案中，动物是转基因动物、基因工程动物或克隆物。
大约：如本文所用，术语“大约”或“约”，正如适用于一个或多个目标值那样，是指与规定参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另有规定或另外从上下文中显而易见(除非在此类数字超过可能值的100％的情况下)，术语“大约”或“约”是指落入规定参考值任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的一系列值。
与......缔合：如本文所用，术语“与......缔合”、“缀合”、“联接”、“附接”和“栓系”当关于两个或更多个实体使用时，意指实体直接或经由接头彼此物理缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得实体例如在工作条件下，例如在生理条件下保持物理缔合。“缔合”不需要通过共价化学键合，并且可以包括足够稳定的其他缔合或键合形式，使得“缔合的”实体保持物理缔合，例如离子键合、流体静力键合、疏水键合、氢键合或基于杂交的连接。
双功能：如本文所用，术语“双官能”是指能够执行或维持至少两种功能的任何物质、分子或部分。所述功能可以影响相同的结果或不同的结果。产生所述功能的结构可以相同或不同。
生物相容：如本文所用，术语“生物相容”意指与活细胞、组织、器官或系统相容，免疫系统几乎没有造成损伤、毒性或排斥的风险。
可生物降解：如本文所用，术语“可生物降解”意指能够通过生物的作用分解成无害产物。
生物活性：如本文所用，短语“生物活性”是指任何物质在生物系统和/或生物体中具有活性的特征。例如，将施用于生物体时，对该生物体具有生物学作用的物质被视为具有生物活性。
衣老：如本文所用，术语“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白壳。在一些实施方案中，术语衣壳可以指编码病毒颗粒的蛋白壳的核酸。
嵌合抗原受体(CAR)：如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含至少一个抗原特异性靶向区(ASTR)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的人工嵌合蛋白，其中抗原特异性靶向区构成全长抗体或其片段。作为非限制性示例，CAR的ASTR可以是本文提出的抗体或其片段中的任一者。能够以高亲和力结合靶抗原的任何分子可用于CAR的ASTR中。CAR可以任选地具有细胞外间隔区结构域和/或共刺激结构域。CAR也可用于产生携带CAR的细胞毒性细胞。
化合物：本公开的化合物包括中间体或最终化合物中出现的原子的所有同位素。“同位素”是指具有相同原子序数但由核中不同数目的中子引起质量数不同的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。
本公开的化合物和盐可以通过常规方法与溶剂或水分子组合以形成溶剂化物和水合物来制备。
综合位置边化(CPETM)：如本文所用，术语“综合位置进化”是指允许沿着抗体可变结构域的序列对每个位置的氨基酸变化的效应进行作图的抗体进化技术。这种综合诱变技术可用于增强一种或多种抗体特性或特征。
综合蛋白质合成(CPSTM)：如本文所用，术语“综合蛋白质合成”是指可用于通过将最佳特性组合到新的高性能抗体中来优化抗体特性或特征的组合蛋白质合成技术。
条件活性：如本文所用，术语“条件活性”是指野生型多肽的突变体或变体，其中所述突变体或变体在生理条件下比亲本多肽活性高或低。此外，条件活性多肽在异常条件下可以具有与亲本多肽相比增加或降低的活性。条件活性多肽可以在正常生理条件或异常条件下可逆或不可逆地失活。
保守：如本文所用，术语“保守”分别是指多核苷酸序列或多肽序列中是在所比较的两个或更多个序列的相同位置未发生改变的那些的核苷酸或氨基酸残基。相对保守的核苷酸或氨基酸是在比序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸更相关的序列中保守的那些。
在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有100％同一性，则称它们是“完全保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则称它们是“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％、约98％或约99％同一性，则称它们是“高度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有至少30％同一性、至少40％同一性、至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，则称它们是“保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此具有约30％同一性、约40％同一性、约50％同一性、约60％同一性、约70％同一性、约80％同一性、约90％同一性、约95％同一性、约98％同一性或约99％同一性，则称它们是“保守的”。序列保守性可适用于多核苷酸或多肽的整个长度或者可适用于其部分、区域或特征。
控制元件：如本文所用，“控制元件”、“调节控制元件”或“调控序列”是指提供编码序列在受体细胞中的复制、转录和翻译的启动子区、多聚腺苷酸化信号序列、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等。只要所选编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和/或翻译，并非所有控制元件总是需要存在。
细胞毒性：如本文所用，“细胞毒性”是指杀伤细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或对其造成有害、有毒或致命作用。
递送：如本文所用，“递送”是指将化合物、物质、实体、部分、货物或有效载荷提供至受试者或目的地的动作或方式。
可检测标记：如本文所用，“可检测标记”是指与另一实体附接、并入或缔合的一种或多种标志物、信号序列或部分，所述标志物、信号序列或部分易于通过本领域已知的方法检测，包括放射照相术、荧光、化学发光、酶活性、吸光度等。可检测标记包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光化合物、发色团、酶、酶辅因子、染料、金属离子、配体、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、半抗原、量子点等。可检测标记可位于与它们缀合或以其他方式附接、并入或缔合的实体中或实体上的任何位置。例如，当与肽或蛋白质缀合或以其他方式附接、并入或缔合时，可检测标记可以处于氨基酸上、氨基酸内或氨基酸之间，或者可以与N端或C端附接或缔合。
消化：如本文所用，术语“消化物”意指分裂成更小的碎片或组分。当提及多肽或蛋白质时，消化引起肽的产生。
远端：如本文所用，术语“远端”意指远离中心或远离感兴趣的点或区域。
给药方案：如本文所用，“给药方案”是施用计划或医师确定的治疗、预防或姑息护理方案。
封装：如本文所用，术语“封装”意指包封、包围或包住。
工程化：如本文所用，当将实施方案设计成具有不同于起始化合物、材料或分子(例如，不同于野生型或天然分子)的特征或特性(无论是结构的还是化学的)时，它们是“工程化的”。
有效量：如本文所用，术语剂的“有效量”是足以实现有益或所需结果(例如临床结果)的量，并且因而，“有效量”取决于其施加的情况。例如，在施用治疗癌症的剂的情况下，剂的有效量是例如与不施用该剂所获得的应答相比足以实现对治疗性适应症的治疗的量。
表位：如本文所用，“表位”是指一种或多种实体上能够与抗体或其他结合生物分子相互作用的表面或区域。例如，蛋白质表位可含有与抗体相互作用的一个或多个氨基酸和/或翻译后修饰(例如，磷酸化残基)。在一些实施方案中，表位可以是“构象表位”，其是指涉及具有或形成表位的实体的特定三维排列的表位。例如，蛋白质的构象表位可以包括来自折叠的非线性氨基酸链段的氨基酸组合和/或翻译后修饰。
EvoMapTM：如本文所用，EvoMapTM是指多肽图谱，其中呈现了关于多肽长度内单个氨基酸突变的作用及其对该多肽的特性和特征的影响的详细信息。
表达：如本文所用，基因、核酸或蛋白质的“表达”是指以下事件中的一种或多种：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3′末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
特征：如本文所用，“特征”是指特定、特性或区别性要素。
配制物：如本文所用，“配制物”是指根据配方制备的材料或混合物。配制物可包括与载剂或赋形剂组合的化合物(例如，抗体)或物质。
片段：如本文所用，“片段”是指一部分。例如，蛋白质片段可以包括通过消化从培养的细胞中分离的全长蛋白质获得的多肽。
功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是它表现出它以之为特征的特性和/或活性的形式的生物分子。例如，“功能性”抗体可包括结合特定靶标或激活或抑制特定生物过程的抗体。
半数最大有效浓度：如本文所用，术语“半数最大有效浓度”或“EC50”是指使给定反应、活性或过程增加一半所需的物质的浓度。例如，当使用结合测定(例如，ELISA测定)测量样品中的抗体与靶标的结合时，EC50是产生该测定可观察到的最大结合的50％所需的样品中抗体的浓度。类似地，术语“半数最大抑制浓度”或“IC50”是指使给定反应或过程减少一半所需的浓度。例如，能够抑制生物过程的抗体的IC50是样品中使生物过程减少50％所需的抗体浓度。EC50和IC50值在特定时间限制和/或条件下可以不同。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子之间(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间的整体关联性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性或相似，则认为它们彼此“同源”。术语“同源”一定是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。根据本公开，如果两个多核苷酸序列编码的多肽对于至少约20个氨基酸的至少一个链段为至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％，则认为两个多核苷酸序列是同源的。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列的特征在于编码至少4-5个独特指定的氨基酸的链段的能力。对于长度小于60个核苷酸的多核苷酸序列，同源性由编码至少4-5个独特指定的氨基酸的链段的能力决定。根据本公开，如果蛋白质对于至少约20个氨基酸的至少一个链段具有至少约50％、60％、70％、80％或90％同一性，则认为两个蛋白质序列是同源的。
异源区：如本文所用，术语“异源区”是指不认为是同源区的区域。
同源区：如本文所用，术语“同源区”是指在位置、结构、进化起源、特征、形式或功能上相似的区域。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子之间(例如DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子之间的整体关联性。两个多核苷酸肽序列之间的百分比同一性的计算，例如，可以通过为了最佳比较目的而比对所述两个序列来进行(例如，为了最佳比对可在第一和第二核酸序列之一或两者中引入空位并且为了比较的目的可忽视不相同的序列)。在某些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较对应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置在第二序列中被与对应位置相同的核苷酸占据时，则所述分子在该位置上相同。两个序列之间的百分比同一性是序列共有相同位置的数目的函数，考虑到了为了两个序列的最佳比对需要引入的空位数目和每个空位的长度。可以使用数学算法实现序列的比较和两个序列之间百分比同一性的测定。例如，两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用诸如以下描述的那些方法确定：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编辑，Oxford University Press，NewYork，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；和SequenceAnalysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M Stockton Press，New York，1991；其各自通过引用并入本文。例如，两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)中的Meyers和Miller的算法(CABIOS，1989，4：11-17)，使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定。两个核苷酸序列之间的百分比同一性可替代地，可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵确定。通常用于确定序列之间的百分比同一性的方法包括但不限于Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J AppliedMath.，48：1073(1988)中公开的那些方法；通过引用并入本文。在公开可用的计算机程序中编纂用于确定同一性的技术。用于确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research，12(1)，387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.，215，403(1990))。体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中，在陪替氏培养皿(Petri dish)等中，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”是指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指从天然状态改变或取出的，例如从在天然状态下与之缔合的至少一些组分改变或取出的物质或实体。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境，例如宿主细胞中。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是在自然界中发现它的环境的一部分。在一些实施方案中，分离的核酸是重组的，例如并入到载体中。
接头：如本文所用，“接头”是指连接两个分子的一个分子或一组分子。在一些实施方案中，接头可以是可裂解的(例如，通过与酶接触、改变pH或改变温度)。
微RNA(miRNA或miR)结合位点：如本文所用，“miR结合位点”包含通过完全或部分杂交全部或部分能够结合或结合微RNA(miR)的核酸序列(无论RNA还是DNA，例如不同之处在于RNA为“U”或DNA中为“T”)。通常，此类结合发生在反向互补取向的miR与miR结合位点之间。在一些实施方案中，miR结合位点从编码miR结合位点的AAV载体基因组转录。
在一些实施方案中，miR结合位点可以系列编码或转录。此类“miR结合位点系列”或“miRBSs”可以包括具有相同或不同核酸序列的两个或更多个miR结合位点。
修饰的：如本文所用，“修饰的”是指改变的分子状态或结构。分子可以许多方式修饰，包括化学、结构和功能修饰。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的”或“野生型”意指存在于自然界中而没有人工辅助或不涉及人工。
非人脊椎动物：如本文所用，“非人脊椎动物”包括除智人(Homo sapiens)以外的所有脊椎动物，包括野生和驯养物种。非人脊椎动物的示例包括但不限于哺乳动物，例如羊驼、爪哇牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、狗、驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、美洲驼、骡、猪、灵长类动物、兔、驯鹿、绵羊、水牛和牦牛。
脱靶：如本文所用，“脱靶”是指非预期的活性或与除预期靶标以外的实体的结合。
有效地连接：如本文所用，短语“有效地连接”是指两个或更多个分子、构建体、转录物、实体、部分等之间的功能性连接。
颗粒：如本文所用，“颗粒”是由至少两种组分，即蛋白质衣壳和包封在衣壳内的多核苷酸序列(例如，病毒基因组)组成的病毒。
患者：如本文所用，“患者”是指可能寻求或需要治疗，要求治疗，正在接受治疗，将接受治疗的受试者，或受过训练的专业人员针对特定疾病或病状护理的受试者。
有效载荷：如本文所用，“有效载荷”是指由剂递送的任何物质。例如，有效载荷可以包括与抗体缀合，以便递送至隐匿抗体表位的细胞、组织或区域的治疗剂。
肽：如本文所用，“肽”小于或等于50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
药学上可接受的：短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人和动物的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述的化合物以外(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的媒介物)并且具有在患者中基本上无毒和非炎性的特性的任何成分。赋形剂可以包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性赋形剂包括但不限于：丁羟甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二碱式)、硬脂酸钙、交联羧甲纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
药学上可接受的盐：本公开还包括本文所述的化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)而改性。药学上可接受的盐的示例包括但不限于碱性残基诸如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基诸如羧酸的碱性盐或有机盐；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等，以及无毒的铵盐、季铵盐和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，优选非水介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表在以下找到Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页，Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use，P.H.Stah1和C.G.Wermuth(编者)，Wiley-VCH，2008和Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science，66，1-19(1977)，其各自通过引用整体并入本文。
药学上可接受的溶剂化物：如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂化物”意指其中合适的溶剂分子并入晶格中的化合物。合适的溶剂在施用剂量下是生理上可耐受的。例如，溶剂化物可以通过从包含有机溶剂、水或其混合物的溶液中结晶、重结晶或沉淀来制备。合适的溶剂的示例是乙醇、水(例如一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMEU)、1，3-二甲基-3，4，5，6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂化物称为“水合物”。
药代动力学：如本文所用，“药代动力学”是指分子或化合物的任何一种或多种特性，因为它涉及确定施用于活生物体的物质的命运。药代动力学分为几个方面，包括吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。这通常称为ADME，其中：(A)吸收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是物质分散或散布在身体的流体和组织中；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物向子代谢物的不可逆转化；和(E)排泄(或消除)是指物质从身体中消除。在罕见的情况下，一些药物不可逆地积聚在身体组织中。
物理化学：如本文所用，“物理化学”意指或涉及物理和/或化学特性。
预防：如本文所用，术语“预防”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低发展与该感染、疾病、病症和/或病状相关的病理的风险。
增殖：如本文所用，术语“增殖”意指快速生长、扩增或增加或引起快速生长、扩增或增加。“增殖性”意指具有增殖能力。“抗增殖性”意指具有与增殖特性相反或不适当的特性。
预防性：如本文所用，“预防性”是指用于预防疾病传播的治疗或作用过程。
预防：如本文所用，“预防”是指保持健康和防止疾病传播所采取的措施。
感兴趣的蛋白质：如本文所用，术语“感兴趣的蛋白质”或“所需蛋白质”包括本文提供的那些及其片段、突变体、变体和改变。
近端：如本文所用，术语“近端”意指位于更靠近中心或更靠近感兴趣的点或区域。
纯化的：如本文所用，“纯化”、“纯化的”、意指制备基本上纯的或没有不需要的组分、材料污损、混杂物或缺陷。“纯化的”是指纯的状态。“纯化”是指使得纯净的过程。
区域：如本文所用，术语“区域”是指区段或一般区域。在一些实施方案中，当提及多肽或蛋白质时，区域可包括沿着多肽或蛋白质的氨基酸的线性序列或者可包括三维区域、表位或表位簇。当提及多核苷酸时，区域可包括沿着多核苷酸的核酸的线性序列或者可包括三维区域、二级结构或三级结构。区域可以包括端部区域。如本文所用，术语“端部区域”是指位于给定实体的末端或“端部”的区域。当提及多肽时，端部区域可包括N端和/或C端。N端是指具有游离氨基酸氨基的多肽的末端。C端是指具有游离氨基酸羧基的多肽的末端。N端和/或C端区域可以指位于任一末端的单个端部官能团、单个氨基酸或多个氨基酸。当提及多核苷酸时，端部区域可包括5′端和3′端。5′端是指包括游离核酸磷酸基团的多核苷酸的末端。3′端是指包括游离核酸羟基的多核苷酸的末端。多核苷酸端部区域可以指位于端部的单个端部官能团、单个核苷酸或多个核苷酸。
RNA和DNA：如本文所用，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物；术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核酸的聚合物。DNA和RNA可以是天然合成的，例如分别通过DNA复制和DNA转录合成；或是化学合成的。RNA和DNA可以是单链的(即，分别为ssRNA或ssDNA)或多链的(例如，双链的，即，分别为dsRNA和dsDNA)。如本文所用的术语“信使RNA”或“mRNA”是指编码一条或多条多肽链的氨基酸序列的单链RNA。
样品：如本文所用，术语“样品”是指较大实体的一部分或子集。来自生物有机体或材料的样品在本文中称为“生物样品”，并且可包括但不限于组织、细胞和体液(例如，血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。样品还可以包括从完整生物体或其组织、细胞或组分部分的子集或其级分或部分(包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤外部切片、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤和器官)制备的匀浆、裂解物或提取物。样品还可以包括培养基，诸如营养肉汤或凝胶，其可以含有细胞组分，诸如蛋白质或核酸分子。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”是指可指导蛋白质的转运或定位的序列。
单一单位剂量：如本文所用，“单一单位剂量”是以一个剂量/一次/单一途径/单一接触点，即单一施用事件施用的任何治疗剂的剂量。在一些实施方案中，单一单位剂量作为离散剂型(例如，片剂、胶囊、贴剂、装载注射器、小瓶等)提供。
间隔区：如本文所用，“间隔区”通常是位于两个或更多个连续miR结合位点序列之间的，长度为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的任何选定核酸序列。间隔区的长度也可以超过10个核苷酸，例如20、30、40或50个或超过50个核苷酸。
分次剂量：如本文所用，“分次剂量”是将单个单位剂量或总日剂量分成两个或更多个剂量。
稳定：如本文所用，“稳定”是指实体的状态，足够稳健以经受一定程度的扰动。例如，稳定的化合物或蛋白质可以在从反应混合物中分离至有用的纯度期间保持完整。
稳定化的：如本文所用，术语“稳定化”或“稳定化的”意指使得稳定或变得稳定。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指根据本公开的化合物、组合物、方法、试剂盒或装置可以对其施用或施加，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的的任何生物体。受试者可以包括动物(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人)和植物。接受、需要医学治疗，符合医学治疗条件或寻求医学治疗的受试者在本文中称为“患者”。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的感兴趣的特征或特性的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(即使有)完成和/或继续进行到完成或实现或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。
患有：“患有”疾病、病症和/或病状的个体已被诊断出具有或展示出疾病、病症和/或病状的一种或多种症状。
易患：“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未被诊断出具有和/或可能未表现出该疾病、病症和/或病状的症状，但隐匿发展疾病或其症状的倾向。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状(例如神经退行性疾病)的个体可以通过以下一项或多项来表征：(1)与疾病、病症和/或病状的发展相关的遗传突变；(2)与疾病、病症和/或病状的发展相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或病状相关的蛋白质和/或核酸增加和/或减少的表达和/或活性或功能异常；(4)与疾病、病症和/或病状的发展相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或病状的家族史；和(6)与疾病、病症和/或病状的发展相关的微生物暴露和/或感染。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体将会发展该疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患疾病、病症和/或病状的个体不会发展该疾病、病症和/或病状。
持续释放：如本文所用，术语“持续释放”是指化合物或剂在特定时间段内，通常以相对受控或一致的速率释放。
合成的：术语“合成的”意指通过人工产生、制备和/或制造的。本公开的合成多核苷酸、多肽或其他分子可使用化学或酶促方法制备。
靶标：如本文所用，术语“靶标”是指感兴趣或关注的实体，该实体可包括受试者、器官、组织、细胞、蛋白质、核酸、生物分子，或任何前述的组、复合物或部分。在一些实施方案中，靶标可以是抗体对其具有亲和力或期望抗体，将抗体设计或开发成对其具有亲和力的蛋白质或其表位。如本文所用，术语“靶标”也可用于指剂针对特定对象的活性。例如，对特定蛋白质“X”具有亲和力的抗体可称为靶向蛋白质X或者可以称为靶向蛋白质X的抗体或称为蛋白质X靶向抗体。类似地，作为剂活性的受试者的对象可以称为“靶向”对象。例如，在抗体对特定蛋白质“X”具有亲和力的情况下，蛋白质X可以称为被该抗体靶向。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防效果和/或引起所需的生物学和/或药理学效果的任何剂。能够在活生物体中产生生物效应的治疗剂在本文中称为“药物”。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送至患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者的剂(例如，抗体或其他治疗剂)的量，当以该量递送或施用时足以治疗、改善感染、疾病、病症和/或病状的症状，诊断、预防感染、疾病、病症和/或病状，和/或延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作。在一些实施方案中，治疗有效量以单剂量提供。在一些实施方案中，治疗有效量以包括多个剂量的剂量方案施用。本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，如果单位剂型包括当作为此类剂量方案的一部分施用时有效的量，则可以认为该单位剂型包括治疗有效量的特定剂或实体。
治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、病症和/或病状的受试者中足以治疗、改善感染、疾病、病症和/或病状的症状，诊断、预防感染、疾病、病症和/或病状，和/或延迟感染、疾病、病症和/或病状的发作的结果。
总日剂量：如本文所用，“总日剂量”是在24小时内给予或开出的量。它可以作为单一单位剂量施用。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全减轻、改善、改良、缓解特定感染、疾病、病症和/或病状，延迟其发作，抑制其进展，降低其严重程度和/或降低其一种或多种症状或特征的发生率。例如，“治疗”受试者的神经退行性疾病可以指抑制神经退行性变；促进神经元细胞的健康；逆转、预防或减少脑部中斑块或缠结的形成；和/或逆转、预防或减少受试者的记忆丧失或其他神经功能或活性丧失。治疗可以施用于未表现出疾病、病症和/或病状体征的受试者，和/或施用于仅表现出疾病、病症和/或病状的早期体征的受试者，用于降低发展与所述疾病、病症和/或病状相关的病理的风险。
未修饰的：如本文所用，“未修饰的”是指以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。未修饰可以指生物分子的野生型或天然形式。分子可以经历一系列修饰，由此每个经修饰的分子可以充当用于后续修饰的“未修饰的”起始分子。
载体：如本文所用，“载体”是转运、转导或以其他方式充当异源分子的载体的任何分子或部分。本公开的载体可以重组产生。
病毒基因组：如本文所用，“病毒基因组”或“载体基因组”是包含至少一个反向末端重复序列(ITR)和至少一个编码有效载荷的多核苷酸。病毒基因组编码有效载荷的至少一个拷贝。
VIII.等同形式和范围
本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定根据本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。本发明的范围并非旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所述。
在权利要求书中，除非指出相反或从上下文显而易见，否则冠词如“一”、“一个(种)”和“所述(该)”可以意指一个或多于一个。除非指出相反或从上下文显而易见，否则，否则如果组成员中的一个、多于一个或全部存在于、用于给定产物或方法中或以其他方式与给定产物或方法相关，则认为组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是满意的。本发明包括其中该组中恰好一个成员存在于、用于给定产物或方法中或以其他方式与给定产物或方法相关的实施方案。本发明包括其中多于一个成员或整个组成员存在于、用于给定产物或方法中或以其他方式与给定产物或方法相关的实施方案。
还应当注意，术语“包含”旨在为开放式的并且容许但不要求包括附加要素或步骤。当在本文中使用术语“包含”时，术语“由......组成”因此也被涵盖和公开。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解，除非另外指出或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则表示为范围的值可在本发明的不同实施方案中假定在规定范围内的任何具体值或子范围，到该范围下限单位的十分之一，除非上下文另外明确指明。
另外，应理解落在现有技术之内的本发明的任何特定实施方案可以从任何一项或多项权利要求中明确排除。因为此类实施方案被视为对于本领域的普通技术人员是已知的，因此它们可以被排除，即使该排除在本文没有被明确陈述。本发明组合物的任何特定实施方案(例如，任何核酸或由其编码的蛋白质；任何产生的方法；任何使用方法；等等)可以出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。
即使在引用中没有明确陈述，所有引用的来源，例如本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，通过引用并入本申请。在引用的来源与本申请的陈述冲突的情况下，应以本申请中的陈述为准。
章节和表格标题不旨在是限制性的。
实施例
实施例1.抗原制备
进行抗原制备以支持小鼠免疫及抗人tau抗体的生成和表征。包括人微管相关蛋白tau同种型2(SEQ ID NO：920)的富集的成对螺旋丝(ePHF；肌氨酰不溶性tau)连同几种具有对应于病理性tau的不同磷酸化残基的tau蛋白抗原一起制备。相关序列呈现于表19中。磷酸化残基在表中加双下划线。
表19.Tau蛋白抗原
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将Tau蛋白抗原与钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合用于免疫接种。对于ePHF抗原制备，从AD或非AD额叶皮质组织的级分中分离ePHF。皮质组织级分根据Greenberg和Davies(1990)描述的方法稍加修改来制备(Liu等人，JNeuroscience，2016，其内容通过引用整体并入本文)。简言之，将脑组织在Teflon玻璃匀浆器中用冷的匀化缓冲液(10mM Tris/1mM EDTA/0.8M NaCl/10％蔗糖，pH 7.4)匀化，该缓冲液含蛋白酶抑制剂(Roche MolecularSystems，Inc.，Branchburg，NJ)和磷酸酶抑制剂混合物(ThermoFisher，Waltham，MA，产品目录号78437)或1mM NaF/1mM Na3VO4。然后将脑匀浆在4℃下以27,000x g离心30分钟。将所得上清液用1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸在1％(v/v)2-巯基乙醇的存在下在37℃下进行提取2.5小时，接着在室温以108,000xg离心30分钟。从该离心回收的沉淀用0.5mL PBS/管快速漂洗一次。弃去漂洗过的PBS。向每管再添加0.5mL的PBS以溶解PHF。合并来自6支管的PHF，并超声处理合并的PHF溶液。将所得溶液浓缩至～5X并进一步超声处理。然后通过HT7蛋白质印记(western)分析PHF样品用于定性和PT3 ELISA定量评估。然后将PHF样品储存在-80℃下。
实施例2.免疫接种
野生型和tau敲除小鼠队列用实施例1描述的ePHF或KLH缀合的tau蛋白抗原免疫接种。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选来自免疫小鼠的血清中抗体与白蛋白缀合的抗原的结合的存在。使用抗原特异性抗体的血清测试为阳性的免疫小鼠制备杂交瘤细胞。通过直接ELISA筛选来自杂交瘤细胞培养基的上清液以鉴定产生抗原特异性抗体的细胞。选择产生具有阳性抗原结合的抗体的杂交瘤克隆物用于亚克隆和抗体序列分析。
所选克隆物的可变结构域氨基酸序列和核酸序列呈现于表3中，每个ID#对应于所选杂交瘤克隆物所表达的抗体。进行互补决定区(CDR)分析以鉴定重链CDRH1、CDRH2和CDRH3序列以及轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。鉴定的CDR氨基酸序列包括表6中呈现的那些。
实施例3.Tau结合
来自于从上述免疫接种获得的抗体的可变结构域核酸序列用于制备重组小鼠IgG抗体。通过直接ELISA分析这些候选抗体与ePHF的结合以及对ePHF高于野生型tau的特异性。
对于直接的ePHF和野生型tau ELISA，首先将板用ePHF或野生型tau包被。在PBS中制备抗原溶液并向每个孔中移液50μL。将板覆盖并在37℃下孵育一小时或在4℃下孵育过夜。然后将板洗涤并通过向每个孔中添加150μl封闭缓冲液封闭并在室温下孵育一小时。然后将板洗涤，之后添加在封闭缓冲液中制备的连续稀释的候选抗体样品。通过洗涤板并向每个孔中添加酶标记的二抗在封闭缓冲液中的溶液来进行候选抗体结合的检测。通过添加底物并对所得反应产物进行分光光度分析来检测二抗结合。抗体与ePHF和野生型tau结合的半数最大有效浓度(EC50)呈现于表20中。
表20.ELISA结果
Figure BDA0003992935460002911
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Figure BDA0003992935460002921
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Figure BDA0003992935460002931
对抗体V0004、V0009、V0022、V0023、V0024和V0052的后续分析指示对ePHF的选择性是野生型tau的100倍。此外，这些抗体在1mg/mL的溶液中展示出低的多特异性和良好的稳定性。
实施例4.通过抗体竞争进行的表位聚类
来自于从上述免疫接种获得的抗体的可变结构域核酸序列用于制备重组小鼠IgG抗体以进行iPHF亲和力测量和表位结合竞争分析。通过Octet(ForteBio，Menlo Park，CA)分析进行研究。
对于iPHF亲和力分析，将候选抗体固定在抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器尖端(ForteBio，目录号18-5088)上的动力学缓冲液(ForteBio，目录号18-1105)中。然后洗涤生物传感器尖端，之后引入iPHF在动力学缓冲液中的溶液进行iPHF与候选抗体的缔合和解离分析。使用数据分析HT版本11.1获得亲和力测量，并针对背景和高频噪声进行校正。
对于表位结合竞争分析，使用夹心测定形式分析也称为对候选抗体进行“表位聚类”的过程，其中首先将第一“捕获”抗体附于Octet生物传感器，之后依次引入抗原和第二抗体，并使用生物传感器读数来确定是一种还是两种抗体与每种抗原结合。将展示出竞争性表位结合的抗体置于相同或相似的表征类别或“聚类”中。将展示出同时结合的抗体置于单独的类别中。PT3、IPN002或C10.2抗体用作捕获抗体并如上所述固定在AMC生物传感器尖端上。然后洗涤生物传感器尖端并在10μg/ml MOPC中封闭。进一步洗涤后，生物传感器捕获抗体与iPHF缔合。然后分析候选抗体与iPHF的结合。MOPC(非抗原特异性对照)和PT3、IPN002或C10.2抗体(在每种情况下匹配生物传感器抗体)用作直接竞争对照。结果示于表21中。
表21.表位聚类结果
Figure BDA0003992935460002941
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Figure BDA0003992935460002951
鉴定了展示出受PT3、C10.2或PT3和C10.2两者交叉阻断的候选抗体。鉴定了未展示出受测试的任何抗体交叉阻断或未展示出与iPHF结合的其他候选抗体。
实施例5.肽抗原的表位聚类
来自于从上述免疫接种获得的抗体的可变结构域核酸序列用于制备重组小鼠IgG抗体以通过夹心ELISA进行PHF tau表位聚类。抗tau抗体AT120(针对肽1)、PT3(针对肽5)、C10.2(针对肽12)、PT76、6C5和UCB D在测定中用作捕获抗体。将捕获抗体以1μg/ml的浓度稀释在PBS中，并使用50μl该溶液包被测定板的每个孔。将板覆盖并在4℃下孵育过夜。然后将板洗涤并通过向每个孔中添加150μl封闭缓冲液封闭并在室温下孵育一小时。将板再次洗涤，之后用在封闭缓冲液中的ePHF或野生型tau包被，接着在室温下孵育1小时。然后将板洗涤，之后添加在封闭缓冲液中制备的连续稀释的候选抗体样品。通过洗涤板并向每个孔中添加酶标记的二抗在封闭缓冲液中的溶液来进行候选抗体结合的检测。通过添加底物并对所得反应产物进行分光光度分析来检测二抗结合。基于测试的每种抗tau捕获抗体观察到的竞争(表位阻断)确定测试的每种候选抗体的表位“聚类”。结果示于表22中。
表22.表位聚类结果
Figure BDA0003992935460002961
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Figure BDA0003992935460002971
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Figure BDA0003992935460002981
多种抗体与C10.2或PT3竞争表位结合，一种抗体与C10.2和PT3两者竞争表位结合。多种抗体也与PT176和UCB D竞争表位结合，一种抗体与PT176、UCB D和C10.2竞争表位结合。
实施例6.免疫耗竭筛查
来自于从上述免疫接种获得的抗体的可变结构域核酸序列用于制备重组小鼠IgG抗体进行免疫耗竭测定筛选。免疫耗竭测定通过评估与耗竭溶液相关的改变的特性来分析抗体候选从溶液中耗竭靶抗原的能力。这里，使用tau RD生物传感器细胞来分析从用候选抗体进行免疫耗竭的溶液获得的上清液中由ePHF诱导的tau聚集。RD生物传感器细胞响应tau聚集产生荧光信号。对于该测定，将500nM至0.8nM抗体溶液(总共测试5个稀释度)与10mg/ml蛋白G Dynabead溶液在室温下孵育30分钟以产生抗体包被的珠粒。将10nM ePHF稀释在磷酸盐缓冲盐水中并超声处理，然后在室温下与抗体包被的珠粒制剂孵育90分钟。然后收集上清液并以1：5稀释，之后在室温下用1∶1 lipofectamine 2000(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)在optimem(Thermo Fisher Scientific)中孵育20分钟。将20μl所得溶液添加到生物传感器细胞培养物(最终培养基体积150μl)中。将细胞培养两天，之后固定进行荧光分析。用Draq5染剂将细胞核染色，并通过Cytation 5捕获九个10X图像/孔(每个条件一式三份孔)。确定每个孔的具有tau聚集物的细胞百分比，并针对用MOPC-21IgG对照珠粒处理过的细胞归一化，处理过的细胞平行用作接种对照。选择在初始分析中展示出tau聚集抑制的抗体用于剂量应答曲线分析以确定抑制tau聚集的半数最大抑制浓度(IC50)。测试的每种候选抗体的平均IC50值(基于几何平均值)示于表23中。
表23.聚集抑制
Figure BDA0003992935460002991
多种抗体展示出小于30nM的tau聚集抑制IC50值，14种抗体低于10nM。
实施例7.组织染色
来自于从上述免疫接种获得的抗体的可变结构域核酸序列用于制备重组小鼠IgG抗体并且测试其结合人脑组织切片中的病理性tau的能力。将来自患有或未患阿尔茨海默病(AD)的患者的冷冻保存的人脑组织切片固定在载玻片上并用PBS洗涤。在室温下使用0.9％过氧化氢和0.02％Triton-X100在1X PBS中的溶液淬灭组织切片中的内源过氧化物酶活性30分钟。然后用PBS洗涤组织切片并在室温下用含有0.02％Triton-X 100的10％正常山羊血清在PBS中的封闭溶液孵育1小时。通过用蛋白稀释剂在PBS中1∶500稀释来制备候选抗体溶液。将组织切片在室温下在候选抗体溶液中孵育1小时，之后在PBS中洗涤以去除未结合的抗体。然后将组织切片用生物素化的山羊抗小鼠IgG在含有蛋白稀释剂的PBS中的溶液处理，并在室温下孵育1小时。将组织切片再次在PBS中洗涤并用抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物溶液处理，之后在室温下孵育30分钟。将组织切片再次在PBS中洗涤，然后用3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)底物溶液处理，以在候选抗体结合和过氧化物酶免疫复合物形成的位点处产生褐色酶沉淀物。使酶促反应进行约1分钟，之后通过在PBS洗涤溶液中漂洗而停止。然后固定组织切片用于显微镜评价免疫染色(指示候选抗体结合)。基于观察到的染色程度对免疫染色的组织切片进行分级。结果示于表24中。在表中，“-”指示没有染色，而“+”、“+/++”、“++”、“++/+++”和“+++”指示从低到高的阳性染色水平。“+/-”指示没有染色，除了在非疾病组织中观察到一些染色以外。指示了产生染色细胞核的抗体。
表24.组织染色结果
Figure BDA0003992935460003001
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Figure BDA0003992935460003011
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Figure BDA0003992935460003021
多种抗体在AD脑组织切片中产生阳性染色，在来自非AD脑组织的脑组织切片中几乎没有或没有观察到阳性染色。
当评估抗体V0004、V0009、V0022、V0023、V0024和V0052时，使用固定的人脑组织获得类似结果。当比较野生型小鼠与携带P301S tau突变的FTD突变型tau转基因小鼠之间的脑组织染色时，对于这些抗体也获得类似结果。
实施例8.iPHF亲和力分析
通过Octet(ForteBio，Menlo Park，CA)分析评估抗人tau抗体对iPHF的亲和力。用选自表3呈现的那些的克隆特异性可变结构域对和小鼠IgG1恒定结构域制备重组小鼠IgG抗体。将候选抗体固定在生物传感器尖端(ForteBio)上的动力学缓冲液(ForteBio)中。然后洗涤生物传感器尖端，之后引入iPHF在动力学缓冲液中的溶液进行与候选抗体的缔合和解离分析。使用数据分析HT版本11.1获得亲和力测量(KD)并针对背景和高频噪声进行校正。结果呈现于表25中。
表25.亲和力分析结果
Figure BDA0003992935460003022
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Figure BDA0003992935460003031
表25中所示的抗体全部展示出小于150nM的KD值，抗体V0009、V0022、V0050、V0052、V0026、V0058、V0055、V0024、V0023和V00016展示出小于10nM的KD值。在测试的抗体中，除了V00016(其对野生型tau展示出几乎等效的亲和力)外，所有抗体均对野生型tau展示出弱亲和力或无亲和力(大于200nM KD)。
实施例9.肽扫描表位分析
用选自表3呈现的那些的克隆特异性可变结构域对和小鼠IgG1恒定结构域制备重组小鼠IgG抗体。用不同的抗tau抗体，使用肽扫描方法进行表位分析(例如，参见Verelst，J.等人Front Mol Biosci.2020年3月31日；7：48)。获得对应于磷酸化人tau的重叠合成生物素化肽文库(Pepscan，Lelystad，NL)并用于包被测定板孔，每个孔用单独的文库成员包被。用选自表3呈现的那些的克隆特异性可变结构域对和小鼠IgG1恒定结构域制备重组小鼠IgG抗体。用标记的二抗，使用肽-抗体复合物的比色检测或通过将生物素化肽与测定孔中的链霉抗生物素蛋白包被的生物传感器缔合并通过基于生物层干涉测量法(BLI)的检测评估抗体结合来分析每个孔中抗体与肽的结合。
结果指示V0022、V0023和V0024抗体在靠近tau C端处结合，对对应于人tau(SEQID NO：920)的残基409-436的肽具有亲和力。这些抗体对对应于人tau(SEQ ID NO：920)的残基413-430的肽展示出最高的亲和力(V0022 KD＝3.06x10-10M；V0023 KD＝2.07x10-10M；V0024 KD＝2.25x10-10M)。
抗体V0052展示出与人tau的多个区域缔合，指示全长tau上的表位可以是构象的(包括通过蛋白质折叠分组在一起的多个区域)。V0052对对应于人tau(SEQ ID NO：920)的残基55-76、159-194、219-247和381-426的肽展示出亲和力。在这些区域中，V0052对人tau(SEQ ID NO：920)的残基57-72(KD＝1.40x10-8M)、175-191(KD＝7.24x10-9M)、223-238(KD＝2.08x10-9M)和383-400(KD＝1.26x10-8M)的亲和力更高，对人tau(SEQ ID NO：920)的残基223-238的亲和力最高(KD＝2.08x10-9M)。
V0009在人tau(SEQ ID NO：920)的残基32-49和185-200周围展示出最大的亲和力。
实施例10.CDR序列分析
对与上述抗体相关的CDR氨基酸序列进行比对并评估序列结构之间的关系。在EMBL-EBI网站上使用基于网络的T-coffee程序(适于相对小的序列的多序列比对)进行相应CDR区中的多序列比对。以所分析的CDR序列中高水平的序列同一性鉴定了许多抗体组，在一些情况下与特异性表位和/或结合亲和力相关。
抗体V0020与V0021之间的比对
抗体V0020与V0021之间的比对如下所示。
Figure BDA0003992935460003041
Figure BDA0003992935460003051
VH CDR序列比对得到GYTFTS[Y/N](SEQ ID NO：927)或更通常地GYTFTSX(SEQ IDNO：928)的CDRH1共有序列，其中X可以是任意氨基酸，例如X为Y/F/N/Q；NPNNS[D/E](SEQ IDNO：929)或更通常地NPNNSX(SEQ ID NO：930)的CDRH2共有序列，其中X可以是任意氨基酸，例如具有带负电荷的侧链的氨基酸；和ANYYGGSQFAY(SEQ ID NO：409)的CDRH3共有序列，其在该组的抗体中是保守的。
VL CDR序列比对证明轻链CDR序列在该组的抗体中是完全保守的。
抗体V0022-V0024之间的比对
如上所述，抗体V0022-V0024展示在人tau的C端附近结合，对对应于人tau(SEQ IDNO：920)的残基413-430的肽具有最高的亲和力。鉴于这种重叠，进行抗体V0022-V0024之间的CDR序列比对并用于鉴定共有序列。
抗体V0022-V0024之间的比对如下所示。
Figure BDA0003992935460003052
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Figure BDA0003992935460003061
如上所述，抗体V0022-V0024展示在人tau的C端附近结合，对对应于人tau(SEQ IDNO：920)的残基413-430的肽具有最高的亲和力。
VH CDR序列比对得到G[F/Y]TFT[R/I][Y/F](SEQ ID NO：931)或更通常地G-X1-TFT-X2-X3(SEQ ID NO：932)的CDRH1共有序列，其中X1、X2和X3可以是任意氨基酸，例如，X1和/或X3可以是具有疏水性和/或芳族侧链的氨基酸，诸如F或Y，和/或X2可以是带正电荷的残基(诸如R、K、H)或具有脂族侧链的残基(诸如A、V、I或L)；NPNNGG(SEQ ID NO：341)的CDRH2共有序列，其在该组抗体中是保守的；和GTGTGAMDY(SEQ ID NO：410)的CDRH3共有序列，其在该组抗体中是保守的。
VL CDR序列比对得到RSSQSLVH[N/S]NG[I/N]T[H/Y]LY(SEQ ID NO：933)或更通常地RSSQSLVH-X1-NG-X2-T-X3-LY(SEQ ID NO：934)的CDRL1共有序列，其中X1、X2和X3可以是任意氨基酸，例如X1是Q/N/S/T和/或X2是A/V/I/L/Q/N和/或X3是H/R/K/Y/F；RVS[N/S]RFS(SEQ ID NO：935)或更通常地RVSXRFS(SEQ ID NO：936)的CDRL2共有序列，其中X可以是任意氨基酸，例如X为Q/N/S/T；和FQGTHVPRT(SEQ ID NO：571)的CDRL3共有序列，其在该组的抗体中是保守的。
抗体V0022-V0025之间的比对
抗体V0022-V0025与V0050之间的比对如下所示。
Figure BDA0003992935460003071
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Figure BDA0003992935460003072
VH CDR序列比对得到G[F/Y]TFT[R/I/D][Y/F](SEQ ID NO：937)或更通常地G-X1-TFT-X2-X3(SEQ ID NO：938)的CDRH1共有序列，其中X1、X2和X3可以是任意氨基酸，例如X1和X3各自独立地为F/Y和/或X2是任意残基(诸如R/K/H/D/E/G/A/I/L/V)；NPNNG[G/E](SEQID NO：939)或更通常地NPNNGX(SEQ ID NO：940)的CDRH2共有序列，其中X可以是任意氨基酸，例如E/D/G/A/V/I/L；和G[T/R]G[T/M]G[不存在/Y][不存在/Y]A[M/L]DY(SEQ ID NO：941)或更通常地G-X1-G-X2-G-X3-X4-A-X5-DY(SEQ ID NO：942)的CDRH3共有序列，其中X1-X5中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X3和/或X4可以不存在，例如X1为S/T/R/K/H和/或X2为S/T/V/L/A/I/M和/或X3和X4各自独立地为Y/F/不存在和/或X5为A/V/I/L/M。
VL CDR序列比对得到具有约11至约17个氨基酸的CDRL1共有序列，其具有[R/G][S/A]S[Q/E][S/N][L/V][V/Y][H/G][S/A/N][N/T/L][G/N][I/N/不存在][T/不存在][H/Y/不存在][L/不存在][Y/不存在](SEQ ID NO：943)或更通常地X1-X2-S-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO：944)的氨基酸序列，其中X1-X15可以是任意氨基酸和/或其中X11、X12、X13、X14和/或X15可以不存在，例如X1为R/K/H/G/A/V/I/L和/或X2为S/T/A/V/I/L和/或X3为Q/N/E/D和/或X4为S/T/N/Q和/或X5为L/V/A/I和/或X6为A/V/I/L/Y/F和/或X7为H/R/K/G/A和/或X8为S/T/A/V/I/L/N/Q和/或X9为N/Q/A/I/L/V/M/S/T和/或X10为G/A/N/Q和/或X11为Q/N/A/V/I/L/不存在和/或X12为T/S/不存在和/或X13为H/R/K/Y/F/不存在和/或X14为A/V/I/L/不存在和/或X15为Y/F/不存在；具有约3至约7个氨基酸的CDRL2共有序列，其具有[R/G][V/A][S/T][N/T/S][R/L][F/A][S/D](SEQ ID NO：945)或更通常地X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：946)的氨基酸序列，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7可以是任意氨基酸，例如，X1为R/K/H/G/A和/或X2为V/A/I/L和/或X3为S/T和/或X4为N/Q/T/S和/或X5为R/K/H/A/V/I/L和/或X6为F/Y/A/V/I/L/G和/或X7为S/T/D/E；和具有约9个氨基酸的CDRL3共有序列，其具有[F/Q][G/N][G/V][T/L][H/T][V/I]P[R/W]T(SEQ IDNO：947)或更通常地X1-X2-X3-X4-X5-X6-P-X7-T(SEQ ID NO：948)的氨基酸序列，其中X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7可以是任意氨基酸，例如，X1为F/Y/Q/N和/或X2为G/A/Q/N和/或X3为G/A/V/I/L和/或X4为T/S/A/V/I/L和/或X5为H/R/K/T/S和/或X6为V/I/A/L和/或X7为R/K/H/W/F/Y。
抗体V0026、V0027和V0032之间的比对
抗体V0026、V0027和V0032之间的比对如下所示。
Figure BDA0003992935460003091
Figure BDA0003992935460003092
VH CDR序列比对得到GY[S/T]FT[D/E]Y(SEQ ID NO：949)或更通常地GY-X1-FT-X2-Y(SEQ ID NO：950)的CDRH1共有序列，其中X1和X2可以是任意氨基酸，例如X1为S/T和/或X2为D/E/S/T；[F/Y]PG[S/R][D/G][S/N](SEQ ID NO：951)或更通常地X1-PG-X2-X3-X4(SEQ ID NO：952)的CDRH2共有序列，其中X1-X4可以是任意氨基酸，例如，X1为F/Y和/或X2为S/T/R/K/H和/或X3为D/E/G/A和/或X4为S/T/N/Q；和P[T/A][V/I/Y][V/Y][A/S][R/K]DYAM[D/E]Y(SEQ ID NO：953)或更通常地P-X1-X2-X3-X4-X5-DYAM-X6-Y(SEQ ID NO：954)的CDRH3共有序列，其中X1-X6可以是任意氨基酸，例如X1为T/S/A/V/I/L和/或X2为V/I/A/L/Y/F和/或X3为V/I/A/L/Y/F和/或X4为A/V/I/L/S/T和/或X5为R/K/H和/或X6为D/E。
VL CDR序列比对得到RSSQSIV[Y/H][S/R/T]NGNTYLE(SEQ ID NO：955)或更通常地RSSQSIV-X1-X2-NGNTYLE(SEQ ID NO：956)的CDRL1共有序列，其中X1和X2可以是任意氨基酸，例如X1为Y/F/H/R/K和/或X2为S/T/R/K/H；KVSNRFS(SEQ ID NO：525)的CDRL2共有序列，其在该组抗体中是保守的；和FQGSH VP[Y/F]T(SEQ ID NO：957)或更通常地FQGSHVPXT(SEQID NO：958)的CDRL3共有序列，其中X可以是任意氨基酸，例如Y、F。
抗体V0026、V0027、V0031和V0032之间的比对
抗体V0026、V0027、V0031和V0032之间的比对如下所示。
Figure BDA0003992935460003101
Figure BDA0003992935460003111
VH CDR序列比对得到GY[S/T]FT[D/E/S]Y(SEQ ID NO：959)或更通常地GY-X1-FT-X2-Y(SEQ ID NO：950)的CDRH1共有序列，其中X1和X2可以是任意氨基酸，例如X1为S/T和/或X2为E/D/S/T；[F/Y]P[G/S][S/R/N][D/G][S/G/N](SEQ ID NO：960)，或更通常地X1-P-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO：961)的CDRH2共有序列，其中X1-X5可以是任意氨基酸，例如X1为F/Y和/或X2为S/T/G/A/V/I/L和/或X3为S/T/R/K/H/N/Q和/或X4为D/E/G/A和/或X5为S/T/N/Q/G/A；和[P/S][T/A/S][V/I/Y][V/Y][A/S/G][R/K]DYAM[D/E]Y(SEQ ID NO：962)或更通常地X1-X2-X3-X4-X5-X6-DYAM-X7-Y(SEQ ID NO：963)的CDRH3共有序列，其中X1-X7可以是任意氨基酸，例如X1为S/T/P/A/I/L/V和/或X2为T/S/A/V/I/L和/或X3为A/V/I/L/Y/F和/或X4为A国/V/I/L/Y/F和/或X5为A/V/I/L/G/S/T和/或X6为R/K/H和/或X7为E/D。
VL CDR序列比对得到RS SQSIV[Y/H][S/R/T]NGNTYLE(SEQ ID NO：955)或更通常地RSSQSIV-X1-X2-NGNTYLE(SEQ ID NO：956)的CDRL1共有序列，其中X1和X2可以是任意氨基酸，例如X1为Y/F/H/R/K和/或X2为S/T/R/K/H；KVSNRFS(SEQ ID NO：525)的CDRL2共有序列，其在该组的抗体中是保守的；和FQGSHVP[Y/F]T(SEQ ID NO：957)或更通常地FQGSHVPXT(SEQ ID NO：958)的CDRL3共有序列，其中X可以是任意氨基酸，例如Y和F。
抗体V0052、V0054、V0055、V0057和V0058之间的比对
如以上呈现的肽扫描表位分析中所述，V0052对对应于人tau(SEQ ID NO：920)的残基55-76、159-194、219-247和381-426的肽展示出亲和力。在这些区域中，V0052对人tau(SEQ ID NO：920)的残基57-72、175-191、223-238和383-400的亲和力更高。当ePHF结合至C10.2捕获抗体包被的板时，通过ELISA分析证实抗体V0054、V0055、V0057和V0058与ePHF的结合被阻断。已知C10.2抗体结合对应于人tau(SEQ ID NO：920)的氨基酸残基379-415的肽12(SEQ ID NO：923)，该肽与参与V0052 tau结合的残基重叠。鉴于这种重叠，进行抗体V0052、V0054、V0055、V0057和V0058之间的CDR序列比对并用于鉴定共有序列。
抗体V0052、V0054、V0055、V0057和V0058之间的比对如下所示。
Figure BDA0003992935460003121
Figure BDA0003992935460003131
/>
VH CDR序列比对得到GFSL[S/N]T[S/F][A/G]M(SEQ ID NO：964)或更通常地GFSL-X1-T-X2-X3-M(SEQ ID NO：965)的CDRH1共有序列，其中X1-X3可以是任意氨基酸，例如X1为S/T/N/Q和/或X2为S/T/F/Y和/或X3为A/V/I/L/G；YWDDD(SEQ ID NO：362)的CDRH2共有序列，其在该组的抗体中是保守的；和R[R/V/K]R[G/Y/S]Y[G/A]MDY(SEQ ID NO：966)或更通常地R-X1-R-X2-Y-X3-MDY(SEQ ID NO：967)的CDRH3共有序列，其中X1-X3可以是任意氨基酸，例如X1为R/K/H/A/V/I/L和/或X2为G/A/V/I/L/S/T/Y/F和/或X3为A/V/I/L/G。
VL CDR序列比对得到K[A/S]SQS[V/L][S/L][N/S][不存在/S][不存在/G][不存在/N][不存在/Q][不存在/K][不存在/N][D/Y][V/L]A(SEQ ID NO：968)或更通常地K-X1-SQS-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-A(SEQ ID NO：969)的CDRL1共有序列，其中X1-X12可以是任意氨基酸和/或其中X5-X10中的一个或多个可以不存在，例如，X1为S/T/A/V/I/L和/或X2为A/V/I/L和/或X3为S/T/A/V/I/L和/或X4为N/Q/S/T和/或X5为S/T/不存在和/或X6为G/A/V/I/L/不存在和/或X7为N/Q/不存在和/或X8为N/Q/不存在和/或X9为K/R/H/不存在和/或X10为N/Q/不存在和/或X11为E/D/Y/F和/或X12为A/V/I/L；[Y/G][A/T]S[N/T]R[C/E][T/S](SEQ ID NO：970)或更通常地X1-X2-S-X3-R-X4-X5(SEQ ID NO：971)的CDRL2共有序列，其中X1-X5可以是任意氨基酸，例如，X1为Y/F/G/A/V/I/L和/或X2为A/V/I/L/T/S和/或X3为N/Q/T/S和/或X4为C/S/E/D和/或X5为T/S；和Q[Q/N]D[Y/H][R/S][S/H]P[L/Y]T(SEQ ID NO：972)或更通常地Q-X1-D-X3-X4-X5-P-X6-T(SEQ ID NO：973)的CDRL3共有序列，其中X1-X6可以是任意氨基酸，例如，X1为Q/N和/或X2为Y/F/H/R/K和/或X3为R/K/H/S/T和/或X4为S/T/H/K/R和/或A/V/I/L/Y/F。
抗体V0052、V0054、V0055、V0057、V0058、V0036和V0049之间的比对
如以上呈现的肽扫描表位分析中所述，V0052对对应于人tau(SEQ ID NO：920)的残基55-76、159-194、219-247和381-426的肽展示出亲和力。在这些区域中，V0052对人tau(SEQ ID NO：920)的残基57-72、175-191、223-238和383-400的亲和力更高。当ePHF结合至C10.2捕获抗体包被的板时，通过ELISA分析证实抗体V0036、V0049、V0054、V0055、V0057和V0058与ePHF的结合被阻断。已知C10.2抗体结合对应于人tau(SEQ ID NO：920)的氨基酸残基379-415的肽12(SEQ ID NO：923)，该肽与参与V0052 tau结合的残基重叠。鉴于这种重叠，进行抗体V0036、V0049、V0052、V0054、V0055、V0057和V0058之间的CDR序列比对并用于鉴定共有序列。
抗体V0052、V0054、V0055、V0057、V0058、V0036和V0049之间的比对如下所示。
Figure BDA0003992935460003141
/>
Figure BDA0003992935460003151
Figure BDA0003992935460003152
VH CDR序列比对得到GFSL[S/N]T[S/F][A/G]M(SEQ ID NO：964)或更通常地GFSL-X1-T-X2-X3-M(SEQ ID NO：965)的CDRH1共有序列，其中X1-X3可以是任意氨基酸，例如X1为S/T/N/Q和/或X2为S/T/F/Y和/或X3为G/A/I/L/V；YWDDD(SEQ ID NO：362)的CDRH2共有序列，其在该组的抗体中是保守的；和[R/V/K/S/G][Y/R][Y/不存在][S/不存在][不存在/N][G/S/Y/R][Y/N/G][G/A/Y/N][M/F/Y]DY(SEQ ID NO：974)或更通常地R-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-DY(SEQ ID NO：975)的CDRH3共有序列，其中X1-X9中的每一个可以是任意氨基酸和/或X3-X5中的一个或多个可以不存在，例如X1为R/K/H/A/V/I/L/G/S/T和/或X2为Y/F/R/K/H和/或X3为Y/F/不存在和/或X4为S/T/不存在和/或X5为N/Q/不存在和/或X6为G/A/V/I/L/S/T/Y/F/R/K/H和/或X7为Y/F/N/Q/G/A/V/I/L和/或X8为G/A/V/I/L/Y/F/N/Q和/或X9为M/F/Y。
VL CDR序列比对得到[K/S][S/A]S[Q/S]S[L/I/V][L/S][N/S/D][D/S/T][V/G/D/Y][N/G/不存在][Q/不存在][K/不存在][N/T/不存在][Y/不存在][L/不存在][A/H/N](SEQID NO：976)或更通常地X1-X2-S-X3-S-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO：977)的CDRL1共有序列，其中X1-X15中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X9-X14中的一个或多个可以不存在，例如，X1为K/R/H/S/T和/或X2为S/T/A/V/I/L和/或X3为Q/N/S/T和/或X4为L/I/V/A和/或X5为A/V/I/L/S/T和/或X6为N/Q/S/T/D/E和/或X7为D/E/S/T和/或X8为G/A/V/I/L/D/E/Y/F和/或X9为N/Q/G/A/不存在和/或X10为Q/N/不存在和/或X11为K/R/H/不存在和/或X12为N/Q/T/S/不存在和/或X13为Y/F/不存在和/或X14为A/V/I/L/不存在和/或X15为A/V/I/L/H/K/R/N/Q；[Y/G/L/R][A/T/V]S[N/T/K][R/L][C/E/D/A][T/S](SEQ ID NO：978)或更通常地X1-X2-S-X3-X4-X5-X6(SEQ ID NO：979)的CDRL2共有序列，其中X1-X6可以是任意氨基酸，例如，X1为Y/F/G/A/V/I/L/R/K/H和/或X2为A/V/I/L/T/S和/或X3为N/Q/T/S/K/R/H和/或X4为R/K/H/A/V/I/L和/或X5为C/S/E/D/A/V/I/L和/或X6为T/S；和[W/Q][Q/N][G/D][T/S/Y/H][H/S/R][F/I/S/H]P[Q/R/L/Y][不存在/Y]T(SEQ IDNO：980)或更通常地X1-X2-X3-X4-X5-X6-P-X7-X8-T(SEQ ID NO：981)的CDRL3共有序列，其中X1-X8中的每一个可以是任意氨基酸和/或其中X8可以不存在，例如，X1为Q/N/W/F/Y和/或X2为Q/N和/或X3为G/A/V/I/L/D/E和/或X4为T/S/Y/F/H/K/R和/或X5为H/K/R/S/T和/或X6为F/Y/A/V/I/L/S/T/H/K/R和/或X7为Q/N/R/K/H/A/V/I/L/Y/F和/或X8为Y/F/不存在。
实施例11.被动免疫疗法接种模型分析
被动免疫疗法接种模型用于评估不同的抗tau抗体。为了评估，用选自表3呈现的那些的克隆特异性可变结构域对和小鼠IgG1恒定结构域制备重组小鼠IgG抗体。在该模型中，使用携带P301S tau突变的FTD突变型tau转基因小鼠。从8周龄开始并且持续6周，通过每周向研究小鼠的CA1海马区实质内输注75ng ePHF来进行接种。将抗体以40mg/kg的剂量通过腹膜内注射施用于小鼠。在接种前7天和3天以及接种开始后4天、11天、18天、25天和32天进行施用。在每种情况下，通过ELISA分析同侧海马样品与对病原性tau具有特异性AT8抗体的免疫反应性来确定抗体处理对病原性tau水平的影响。来自经过媒介物(对照)处理的小鼠和用各种抗体处理的小鼠的样品之间AT8反应性的降低百分比呈现于表26中。
表26.AT8反应性
Figure BDA0003992935460003171
每种测试的抗体得出AT8反应性降低的样品，V0023和PHF1相比于来自对照小鼠的样品产生最大的降低，并且V0023展示出最大的功效。
实施例12.工程化病毒基因组用于表达抗tau抗体
设计病毒基因组用于AAV递送抗tau抗体或其变体。将包含或编码表1-7任一个中提供的抗体序列的有效载荷区克隆到病毒基因组中。除抗体编码区外，病毒基因组可包括下列每个中的任何一个或多个：5’ITR、启动子(可具有几个组件)、一个或多个内含子或外显子序列、一个或多个信号序列、一个或多个接头序列、标签序列、多聚腺苷酸化序列、填充序列和3’ITR。序列组件可以选自表10-18中提供的序列。
生成一系列病毒基因组，其中重链和轻链的顺序相对于5′至3′方向交替。当5′至3′读取时，制备编码重链抗体序列、接头区和轻链抗体序列(重链-接头-轻链)的病毒基因组。还制备了编码轻链抗体序列、接头区和重链抗体序列(轻链-接头-重链)的病毒基因组。
将用于表达抗tau抗体的病毒基因组并入AAV颗粒中(例如，使用AAV1、AAV2、AAV2变体、AAV2/3变体或VOY101衣壳)。
实施例13.AAV颗粒的产生和纯化
本文考虑的任何病毒基因组都可以封装在AAV衣壳中以生成AAV颗粒。可以使用本领域已知的方法产生AAV颗粒，例如三重转染或杆状病毒介导的病毒产生。可以采用本领域已知的任何合适的容许或包装细胞来产生颗粒。哺乳动物细胞常常是优选的。还优选提供从复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能的反式互补包装细胞系，例如293细胞或其他E1a反式互补细胞。
基因盒可以含有一些或全部细小病毒(例如，AAV)cap和rep基因。然而，优选地，通过将编码衣壳和/或Rep蛋白的包装载体引入细胞中反式提供一些或所有cap和rep功能。最优选地，基因盒不编码衣壳或Rep蛋白。可替代地，使用经过稳定转化以表达cap和/或rep基因的包装细胞系。
在一些情况下，根据如US20160032254(其内容通过引用并入本文)中描述的程序从培养上清液中产生并纯化重组AAV病毒颗粒。产生也可涉及本领域已知的方法，包括使用293T细胞、sf9昆虫细胞、三重转染或任何合适的产生方法的那些。
在一些情况下，用聚乙烯亚胺(PEI)与产生AAV所需的质粒，即AAV2 rep、腺病毒辅助构建体和侧翼为ITR的转基因盒转染293T细胞(粘附/悬浮)。AAV2 rep质粒也含有所研究的特定病毒的cap序列。转染后二十四小时(没有改变培养基进行悬浮)，转染发生在含/不含血清的DMEM/F17中，将培养基更换为含或不含血清的新鲜培养基。转染后三(3)天，从293粘附细胞的培养基中取样。随后刮取细胞，或将悬浮细胞沉淀，并转移到容器中。对于粘附细胞，离心去除细胞沉淀后，从刮取后的上清液中取出第二样品。接下来，通过三个连续的冻融循环(-80C至37C)或添加洗涤剂triton实现细胞裂解。通过离心或深层过滤去除细胞碎片，并从培养基中取出样品3。通过DNA qPCR，通过DNA酶抗性基因组滴定来定量样品的AAV颗粒。此类转染的总产率等于上述样品3的颗粒浓度。
根据基因组拷贝数(每毫升的基因组颗粒数)测量AAV颗粒滴度。基因组颗粒浓度基于如先前报道的载体DNA的DNA qPCR(Clark等人(1999)Hum.Gene Ther.，10：1031-1039；Veldwijk等人(2002)Mol.Ther.，6：272-278)。

Claims (54)

1.一种与tau结合的分离的例如重组的抗体，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，所述轻链可变区包含LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:315、341和410的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:474、529和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:314、341和410的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:1154、529和571的氨基酸序列；
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:316、341和410的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:475、530和571的氨基酸序列；
(iv)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:325、362和435的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:495、540和587的氨基酸序列；
(v)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:304、347和400的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:464、523和562的氨基酸序列；
(vi)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:299、343和395的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:460、518和557的氨基酸序列；或
(vii)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的HC CDR序列中的任一者的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的LC CDR序列中的任一者的氨基酸序列。
2.一种与tau结合的分离的例如重组的抗体，所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，所述轻链可变区包含LCCDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:1180、341、410、1181、1182和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO:1183、1184、410、1185、1182和571的氨基酸序列；或
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ IDNO:1186、1187、1167、1188、528和571的氨基酸序列；
任选地，其中所述抗体与人tau蛋白的包含根据SEQ ID NO:920编号的残基409-436的区域结合。
3.如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体与所述人tau蛋白的包含根据SEQ ID NO:920编号的残基409-436的所述区域结合，并且其中：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:1180、341和410的氨基酸序列；并且
(ii)所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:1181、1182和571的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中：
(i)所述VH包含SEQ ID NO:22、21、23、51、9或4的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)所述VH包含对SEQ ID NO:22、21、23、51、9或4的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；
(iii)所述VH包含由SEQ ID NO:168、167、169、197、155或150的核苷酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或
(iv)所述VH包含表3或表4中提供的任何VH的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或对表3或表4中提供的任何VH的所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中：
(i)所述VL包含SEQ ID NO:94、93、95、122、83或78的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)所述VL包含对SEQ ID NO:94、93、95、122、83或78的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；
(iii)所述VL包含由SEQ ID NO:242、241、243、270、229或224的核苷酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或
(iv)所述VL包含表3或表4中提供的任何VL的所述氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；或对表3或表4中提供的任何VL的所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中：
(i)所述VH包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列；
(ii)所述VH包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列；
(iii)所述VH包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列；
(iv)所述VH包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列；
(v)所述VH包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列；或者，
(vi)所述VH包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中：
(i)编码所述VH的核苷酸序列包含SEQ ID NO:168、167、169、197、155或150的核苷酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或
(ii)编码所述VL的核苷酸序列包含SEQ ID NO:242、241、243、270、229或224的核苷酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的抗体，所述抗体是全长抗体、双特异性抗体、Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体，所述抗体包含选自人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4、鼠IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG2c和鼠IgG3的重链恒定区；和/或选自κ或λ轻链恒定区例如人或小鼠κ或人或小鼠λ轻链恒定区的轻链恒定区。
10.如权利要求1-9中任一项所述的抗体，所述抗体包含：重链恒定区，所述重链恒定区包含表X中提供的重链恒定区的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或轻链恒定区，所述轻链恒定区包含表X中提供的轻链恒定区的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
11.如权利要求1-10中任一项所述的抗体，所述抗体结合：
(1)tau蛋白的C端，例如根据SEQ ID NO:920编号的残基409-436；
(2)tau蛋白的微管结合结构域；
(3)tau蛋白的富脯氨酸结构域；
(4)包含至少一个、两个、三个或更多个磷酸化残基，例如根据SEQ ID NO:920编号的残基T212、T217、S396、S404、S409或其组合的tau蛋白；
(5)富集的成对螺旋丝tau蛋白(ePHF)；和/或，
(6)包含由至少两种tau蛋白的复合物例如tau二聚体形成的区域的表位。
12.如权利要求1-11中任一项所述的抗体，所述抗体以小于约120nM的解离常数(KD)(例如，通过Octet测量的，例如，如实施例8中所述)与tau蛋白结合。
13.如权利要求1-12中任一项所述的抗体，所述抗体降低或抑制tau的聚集，例如以约1nM至约30nM的半数最大抑制浓度(IC50)抑制tau的聚集(例如，通过免疫耗竭测定(例如用tau RD生物传感器细胞)测量的，例如如实施例6中所述)。
14.一种分离的例如重组的抗体，所述抗体与如前述权利要求中任一项所述的抗体竞争与tau的结合。
15.一种分离的例如重组的抗体，所述抗体与同如前述权利要求中任一项所述的抗体的表位相同的表位、基本上相同的表位，或与如前述权利要求中任一项所述的抗体的表位重叠的表位结合。
16.一种分离的例如重组的核酸，所述核酸编码如前述权利要求中任一项所述的抗体。
17.一种编码抗体的分离的例如重组的核酸，所述抗体包含VH和VL，所述VH包含HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3，所述VL包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中：
(i)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:315、341和410的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:474、529和571的氨基酸序列；
(ii)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:314、341和410的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:1154、529和571的氨基酸序列；
(iii)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:316、341和410的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:475、530和571的氨基酸序列；
(iv)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:325、362和435的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:495、540和587的氨基酸序列；
(v)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:304、347和400的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:464、523和562的氨基酸序列；
(vi)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3分别包含SEQ ID NO:299、343和395的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:460、518和557的氨基酸序列；或
(vii)所述HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的HC CDR序列中的任一者的氨基酸序列；并且所述LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3包含表1、表6、表2A-2C、表4或表5的任何LC CDR序列的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的核酸，其中：
(i)所述VH包含SEQ ID NO:22、21、23、51、9或4的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列；和/或
(ii)所述VL包含SEQ ID NO:94、93、95、122、83或78的氨基酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性或对其氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过10个修饰的氨基酸序列。
19.如权利要求17或18所述的核酸，所述核酸包含：
(i)表3或表4中提供的任何VH的核苷酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或
(ii)表3或表4中提供的任何VL的核苷酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
20.如权利要求17-19中任一项所述的核酸，所述核酸包含：
(i)SEQ ID NO:168、167、169、197、155或150的核苷酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或
(ii)SEQ ID NO:242、241、243、270、229或224的核苷酸序列或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
21.如权利要求17-20中任一项所述的核酸，其中所述抗体包含：
(i)重链恒定区，所述重链恒定区包含表X中提供的重链恒定区的氨基酸，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)轻链恒定区，所述轻链恒定区包含表X中提供的轻链恒定区的氨基酸序列，或与之具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
22.如权利要求17-21中任一项所述的分离的核酸序列，其中编码所述重链可变区和/或所述轻链可变区的所述核酸序列是密码子优化的。
23.一种分离的例如重组的抗体，所述抗体由如权利要求17-22中任一项所述的核酸编码。
24.一种编码有效载荷的分离的核酸，其中所编码的有效载荷包含如权利要求1-15或23中任一项所述的抗体，或由如权利要求17-22中任一项所述的核酸编码的抗体。
25.如权利要求24所述的核酸，所述核酸还编码信号序列和任选地第二信号序列，任选地，其中编码所述信号序列和/或所述第二信号序列(如果存在)的所述核苷酸序列包含表14中列出的信号序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
26.如权利要求24或25所述的核酸，其中：
(i)编码信号序列的核苷酸序列相对于编码所述VH的所述核苷酸序列位于5'；和/或
(ii)编码信号序列的核苷酸序列相对于编码所述VL的所述核苷酸序列位于5'。
27.如权利要求24-26中任一项所述的核酸，其中：
(i)所编码的VH和VL的所述序列直接连接(例如，没有接头)；或
(ii)所编码的VH和VL的所述序列经由接头连接，任选地，所述接头包含表15中提供的接头序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
28.如权利要求24-27中任一项所述的核酸，其中所编码的有效载荷是全长抗体、双特异性抗体、Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段(scFv)、单结构域抗体或骆驼抗体。
29.一种病毒基因组，所述病毒基因组包含有效地连接至编码包含如权利要求1-15和23中任一项所述的抗体的有效载荷的所述核酸的启动子，任选地，其中所述启动子：
(i)选自人延伸因子1α-亚基(EF1α)、巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)或泛素C(UBC)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板源性生长因子B链(PDGF-β)、细胞间粘附分子2(ICAM-2)、突触蛋白(Syn)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻链(NFL)或重链(NFH)、β-球蛋白微基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)或其片段，例如其截短物或功能变体；和/或
(ii)包含表11中提供的启动子序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％同一性的核苷酸序列。
30.如权利要求29所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含增强子，任选地，其中所述增强子是CMV立即早期(CMVie)增强子。
31.如权利要求29或30所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含：
(i)聚腺苷酸化(polyA)信号区，任选地，其中所述polyA信号区包含SEQ ID NO:1134-1136中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％同一性的核苷酸序列；
(ii)ITR序列，任选地，其中：
(a)所述ITR序列相对于所编码的有效载荷位于5'，和/或所述ITR序列相对于所编码的位于3'；和/或
(b)所述ITR序列包含SEQ ID NO:1035-1038中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性的核苷酸序列；
(iii)至少1、2或3个内含子区，任选地，其中每个内含子区独立地包含表13中列出的内含子区中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％同一性的核苷酸序列；
(iv)至少1、2或3个外显子区，任选地，其中每个外显子区独立地包含表12中的外显子序列中的任一者的核苷酸序列，或与之具有至少95％同一性的核苷酸序列；和/或
(v)Kozak序列，任选地，其中所述Kozak序列包含GCCGCCACCATG(SEQ ID NO:1079)或GAGGAGCCACC(SEQ ID NO:1089)的核苷酸序列。
32.如权利要求29-31中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组还包含编码miR结合位点的核苷酸序列，所述miR结合位点例如是调节，例如减少相应miRNA在其中表达的细胞或组织中由所述病毒基因组编码的所述有效载荷的表达的miR结合位点。
33.如权利要求32所述的病毒基因组，所述病毒基因组包含所编码的miR结合位点的至少1-5个拷贝，例如至少1、2、3、4或5个拷贝。
34.如权利要求32或33所述的病毒基因组，所述病毒基因组包含所编码的miR结合位点的至少3或4个拷贝，任选地，其中所有拷贝包含相同的miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个、三个或全部包含不同的miR结合位点。
35.如权利要求32-34中任一项所述的病毒基因组，其中所编码的miR结合位点包含miR122结合位点、miR183结合位点、miR-142-3p或其组合，任选地，其中：
(i)所编码的miR122结合位点包含SEQ ID NO:1029的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQID NO:1029具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列；
(ii)所编码的miR183结合位点包含SEQ ID NO:1032的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQID NO:1032具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列；和/或
(iii)所编码的miR-142-3p结合位点包含SEQ ID NO:1031的核苷酸序列，或与之基本上相同(例如，具有至少90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或对SEQ ID NO:1031具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰但不超过十个修饰的核苷酸序列。
36.如权利要求29-35中任一项所述的病毒基因组，所述病毒基因组是单链的。
37.一种载体，所述载体包含如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组，任选地，其中所述载体还包含：
(i)编码Rep蛋白例如非结构蛋白的核苷酸序列，其中所述Rep蛋白包括Rep78蛋白、Rep68、Rep52蛋白和/或Rep40蛋白，任选地，其中所述Rep78蛋白、所述Rep68蛋白、所述Rep52蛋白和/或所述Rep40蛋白由至少一个Rep基因编码；和/或
(ii)编码衣壳蛋白例如结构蛋白的核苷酸序列，其中所述衣壳蛋白包含VP1多肽、VP2多肽和/或VP3多肽，任选地，其中所述VP1多肽、所述VP2多肽和/或所述VP3多肽由至少一个Cap基因编码。
38.一种分离的例如重组的AAV颗粒，所述AAV颗粒包含：
(i)衣壳蛋白，和
(ii)如权利要求16和17-28中任一项所述的核酸、如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组或如权利要求37所述的载体。
39.如权利要求38所述的分离的AAV颗粒，其中：
(i)所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:1003的氨基酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
(ii)所述衣壳蛋白包含对SEQ ID NO:1003的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；
(iii)所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:1011的氨基酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
(iv)所述衣壳蛋白包含对SEQ ID NO:1011的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30、20或10个修饰的氨基酸序列；
(v)所述衣壳蛋白包含由SEQ ID NO:1002的核苷酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码的氨基酸序列；和/或
(vi)编码所述衣壳蛋白的所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:1002的核苷酸序列，或与之具有至少80％(例如，至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。
40.如权利要求38或39所述的分离的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含：
(i)根据SEQ ID NO:1003编号的位置K449处的氨基酸取代，例如K449R取代；
(ii)包含TLAVPFK(SEQ ID NO:1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地，其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO:1003编号的参考序列紧接在位置588之后存在；
(iii)根据SEQ ID NO:1003编号的位置587处的除“A”以外的氨基酸和/或位置588处的除“Q”以外的氨基酸；和/或
(iv)根据SEQ ID NO:1003编号的A587D和/或Q588G的氨基酸取代。
41.如权利要求38-40中任一项所述的分离的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含：
(i)(a)根据SEQ ID NO:1003编号的K449R的氨基酸取代；和(b)包含TLAVPFK(SEQ IDNO:1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地，其中所述插入片段紧接在SEQ ID NO:1003的位置588之后存在；
(ii)(a)根据SEQ ID NO:1003编号的K449R的氨基酸取代；(b)包含TLAVPFK(SEQ IDNO:1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地，其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO:1003编号的参考序列紧接在位置588之后存在；和(c)根据SEQ ID NO:1003编号的A587D和Q588G的氨基酸取代；或
(iii)(a)包含TLAVPFK(SEQ ID NO:1151)的氨基酸序列的插入片段，任选地，其中所述插入片段相对于根据SEQ ID NO:1003编号的参考序列紧接在位置588之后存在；和(b)根据SEQ ID NO:1003编号的A587D和Q588G的氨基酸取代。
42.如权利要求38-41中任一项所述的AAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包括：
(i)VOY101、VOY201、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、AAVPHP.N(PHP.N)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2变体、AAV2/3变体、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV9、AAV9 K449R、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVDJ、AAVDJ8或AAV2G9衣壳蛋白或其功能变体；任选地，所述衣壳蛋白包括VOY101衣壳蛋白；和/或
(ii)表1中列出的衣壳蛋白中的任一者或其功能变体。
43.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求16-22和24-28中任一项所述的核酸、如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组或如权利要求38-42中任一项所述的AAV颗粒，任选地，其中所述宿主细胞是昆虫细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞。
44.一种产生抗体的方法，所述方法包括在适于基因表达的条件下培养如权利要求43所述的宿主细胞。
45.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-15和23中任一项所述的抗体、如权利要求16-22和24-28中任一项所述的分离的核酸、包含如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒或如权利要求38-42中任一项所述的AAV颗粒；和药学上可接受的赋形剂。
46.一种将与tau结合的外源抗体递送至受试者的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求1-15和23中任一项所述的抗体、如权利要求16-22和24-28中任一项所述的分离的核酸、包含如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒(例如，多种AAV颗粒)、如权利要求38-42中任一项所述的AAV颗粒(例如，多种AAV颗粒)或如权利要求44所述的药物组合物；任选地，
(i)所述受试者患有、已被诊断患有与tau表达相关的疾病或处于患与tau表达相关的疾病的风险中；
(ii)所述受试者患有、已被诊断患有神经病症例如神经退行性病症，或处于患神经病症例如神经退行性病症的风险中；和/或，
(iii)所述受试者患有、已被诊断患有tau蛋白病或处于患tau蛋白病的风险中。
47.一种治疗患有或被诊断患有神经病症或神经退行性病症例如tau蛋白病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-15和23中任一项所述的抗体、如权利要求16-22和24-28中任一项所述的分离的核酸、包含如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒(例如，多种AAV颗粒)、如权利要求38-42中任一项所述的AAV颗粒(例如，多种AAV颗粒)或如权利要求45所述的药物组合物。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述神经病症包括：
(i)tau蛋白病；和/或
(ii)AD、FTDP-17、FTLD、FTD、CTE、PSP、唐氏综合征、皮克病、CBD、皮质基底节综合征、ALS、朊病毒病、CJD、多系统萎缩、仅缠结性痴呆或进行性皮质下胶质增生。
49.如权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
50.如权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述AAV颗粒经静脉内、肌内、经由脑实质内施用、脑室内、经由小脑延髓池内(ICM)注射、鞘内、经由聚焦超声(FUS)例如联合微泡静脉内施用(FUS-MB)或MRI引导的FUS联合静脉内施用来向所述受试者施用；任选地，所述AAV颗粒经静脉内或经由小脑延髓池注射(ICM)施用于所述受试者。
51.如权利要求46-50中任一项所述的方法，所述方法还包括施用适于治疗或预防神经病症或神经退行性病症例如tau蛋白病的附加治疗剂和/或疗法，任选地，其中所述附加治疗剂和/或疗法包括胆碱酯酶抑制剂(例如，多奈哌齐、卡巴拉汀和/或加兰他敏)、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂(例如，美金刚)、抗精神病药、抗焦虑药、抗惊厥剂、多巴胺激动剂(例如，普拉克索、罗匹尼罗、罗替戈汀和/或阿扑吗啡)、MAO B抑制剂(例如，司来吉兰、雷沙吉兰和/或沙芬酰胺)、儿茶酚O-甲基转移酶(COMT)抑制剂(恩他卡朋、奥匹卡朋和/或托卡朋)、抗胆碱能药(例如，苯托品和/或苯海索)、金刚烷胺、卡比多巴-左旋多巴、脑深部模拟(DBS)或其组合。
52.如权利要求1-15和23中任一项所述的抗体、如权利要求16-22和24-28中任一项所述的分离的核酸、包含如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒、如权利要求38-42中任一项所述的AAV颗粒或如权利要求45所述的药物组合物，其用于制造药物。
53.如权利要求1-15和23中任一项所述的抗体、如权利要求16-22和24-28中任一项所述的分离的核酸、包含如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒、如权利要求38-42中任一项所述的AAV颗粒或如权利要求45所述的药物组合物，其用于治疗神经病症或神经退行性病症例如tau蛋白病。
54.有效量的如权利要求1-15和23中任一项所述的抗体、如权利要求16-22和24-28中任一项所述的分离的核酸、包含如权利要求29-36中任一项所述的病毒基因组的AAV颗粒、如权利要求38-42中任一项所述的AAV颗粒或如权利要求45所述的药物组合物在制造用于治疗受试者的神经病症或神经退行性病症例如tau蛋白病的药物中的用途。
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