MXPA01004169A - Produccion mejorada de vector de virus adenoasociados. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con el campo de vectores virales disenados geneticamente, de manera mas especifica con vectores de virus adenoasociados (AAV), para usarse en terapia genetica. La presente invencion proporciona un proceso para la produccion de vectores de virus adenoasociados recombinantes de alto titulo que estan esencialmente libres de virus auxiliares tales como los adenovirus. La invencion proporciona celulas que empaquetan virus adenoasociados (AAV) que han sido provistas con un acido nucleico que codifica para un producto genetico que proporciona funcion de AAV auxiliar que permite la generacion de AAV recombinante sin la produccion del virus auxiliar recombinante.

Description

PRODUCCIÓN MEJORADA DE VECTOR DE VIRUS ADENOASOCIADOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION La invención se relaciona con el campo de los vectores virales diseñados genéticamente, de manera más especifica con vectores de virus adenoasociados (AAV) , para usarse en terapia genética. Los virus adenoasociados son porovirus humanos no patógenos (revisado en (Berns, 1990a; Berns, 1990b) ) . Los virus se reproducen como una sola hebra de ADN de aproximadamente 4.6 kb. Ambas de las hebras más menos están empaquetadas y son infecciosas. La reproducción eficiente de AAV requiere la coinfección de la célula por un virus auxiliar. Los virus que han sido identificados como auxiliares de AAV son los adenovirus, virus del herpes simple (HSV) , citomegalovirus (CMV) y virus de la pseudorabia (Berns, 1996) . En la ausencia de un virus auxiliar no se observa reproducción sustancial del AAV. El AAV por lo tanto también está clasificado como un virus dependiente. Cuando no está presente un virus auxiliar, el genoma del AAV puede integrarse al genoma de la célula huésped. El virus natural tiene una fuerte preferencia (70%) por el sitio de integración sobre el brazo largo del cromosoma 19 (ql3.3-qter (Kotin et al, 1990; Samulski, 1993; Samulski et al, 1991) . Después de la integración, la expresión de los genes del virus no es detectable. Los provirus integrados se reproducen Itef: 12887B como una parte normal del genoma de la célula huésped tras la división de las células transducidas y finaliza en ambas células hijas. Esta etapa del ciclo de vida del virus se conoce como la etapa latente. Esta etapa latente es estable 5 pero puede ser interrumpida tras la infección de la célula transducida por un virus auxiliar. Después de la infección del virus auxiliar, el AAV es escindido del genoma de la célula huésped y comienza a reproducirse. Durante la fase inicial de este sitio Utico son expresados los genes rep. 10 Aproximadamente de 12 a 16 horas después se producen las proteínas de la cápsula VPl, VP2 y VP3 en cantidades detectables y el ADN del virus reproducido es empaquetado en estos viriones. Una representación esquemática del genoma del AAV y sus genes se describen en la Figura 1. 15 Los viriones se acumulan en el núcleo de la célula y son liberados cuando la célula se lisa como resultado de la acumulación de AAV y el virus auxiliar (revisado en Berns, 1990a; Berns, 1990b) . De este modo han sido caracterizados seis serotipos de AAV de primate (Berns et al, 1994; Rutledge 20 et al, 1998). El genoma del AAV contiene dos genes rep y cap (Fig. 1) . Tres promotores (P5, P19 y P40) dirigen la síntesis de los ARNm que codifican para 4 proteínas Rep (Re?78, Rep68, Rep52 y Rep40) y tres proteínas de la cápsula (VPl, VP2 y VP3) . El genoma del AAV está flanqueado en ambos lados por 25 una secuencia de 145 pb, llamada la repetición terminal iÜtjM¡aaÉÉgMII_iÉtt_*_«_*_it ?i „? i.- iiá--.. ....i*. n - . .»»-,.*?* invertida (ITR), la cual parece contener todas las secuencias que actúan en la posición cis requeridas para la integración, reproducción y encapsulación del virus (Lusby et al, 1980; Samulski et al, 1989) . 5 Durante una infección productiva el promotor P5 es activado primero y dirige la producción Rep78 y Repß8. Esas proteínas son esenciales para la reproducción del AAV y la regulación trans de los genes virales. La Rep52 y la Rep40 son expresadas del promotor P19 y se piensa que están 10 implicadas en el empaquetamiento de los genomas de AAV (Chejanovsky y Cárter, 1989; Smith y Kotin, 1998). Las proteínas de la cápsula VPl, VP2 y VP3 son producidas a partir de un transcripto de 2.6 kb del promotor P40 de AAV, el cual se empalma en dos ARNm de 2.3 kb utilizando el mismo 15 sitio de empalme pero dos sitios receptores de empalme diferentes. Los sitios receptores de empalme se localizan a ambos lados de la señal de inicio de la transducción de la VPl. La VPl es traducida del mensajero que utiliza el receptor de empalme directamente en la parte frontal del 20 codón de la VPl. La VP2 y la VP3 son traducidas del ARN mensajero que se empalma al receptor 3' del ATG de la VPl. Las proteínas VP2 y VP3 son traducidas de este mensajero pero utilizan un inicio de traducción de ACG (VP2) o ATG corriente abajo (VP3) . Puesto que las tres regiones de codificación 25 están en cuadro, las proteínas de la cápsula comparten un -fftlhfT r-??r * - dominio grande con una secuencia de aminoácidos idéntica. La VP3 está totalmente contenida dentro de la VPl y la VP2, pero las últimas dos contienen secuencias aminoterminales adicionales. De manera similar, la VPl contiene toda la 5 proteína VP2 pero contiene una secuencia N-terminal adicional. Las tres proteínas de la cápsula terminan en la misma posición (Ruffing et al, 1994). La cápsula de AAV es de 20 a 24 mm de diámetro (Berns y Bohensky, 1987; Srivastava et al, 1983) y contiene aproximadamente 5% de VPl, 5% de VP2 y 10 90% de VP3. Se cree que esta relación refleja la abundancia relativa de los mensajeros de empalme, alternativamente, y la eficiencia del inicio de la traducción reducida en el codón de inicio de ACG para la VP2. Los vectores de virus adenoasociados pueden 15 producirse reemplazando las secuencias de los genes rep y cap en el AAV natural con la secuencia de interés. Para producir el virus recombinante, necesitan suministrarse células humanas infectadas con virus auxiliares concomitante con los genes rep y cap a través de diferentes medios. Esto se hace 20 de manear rutinaria a través de la transfección de un llamado plásmido de empaquetamiento, que proporciona la función para empaquetar AAV, que contiene los genes rep y cap del AAV pero que carece de ITR de AAV. El AAV recombinante es generado típicamente o transíectando un plásmido de empaquetamiento 25 junto con un plásmido que contiene el AAV recombinante en células infectadas con virus auxiliar. El virus recombinante es cosechado típicamente de tales cultivos de las 48 a las 72 horas después de la transfección de las células. El AAV recombinante generado de esta manera es de alto título y puede hacerse esencialmente libre de AAV natural (Alien et al, 1997; Samulski et al, 1989). Puesto que las células son también concomitantemente infectadas con un virus auxiliar, usualmente un adenovirus, este virus auxiliar es también producir (Clark et al, 1997; Flotte et al, 1993; Herzog et al, 1997; Monahan et al, 1998; Snyder et al, 1997a) . La reproducción del AAV y también el empaquetamiento pueden efectuarse en el tubo de prueba utilizando un sistema libre de células (Hong et al, 1992; Hong et al, 1994; Ni et al, 1994; Zhou y Muzyczka, 1998; ard et al, 1998). La presencia del virus auxiliar en preparaciones de rAAV no es deseable. El virus auxiliar recombinante es un patógeno potencial y aún contaminaciones menores de preparaciones de AAV recombinante con el virus auxiliar no son aceptables para uso clínico. Se emplean varios métodos para remover el virus auxiliar de las preparaciones de AAV recombinante. En el caso de adenovirus esos incluyen diferencias en densidad y sensibilidad a la temperatura. Las partículas de AAV tienen una densidad de 1.41 a 1.45 g/cm3, mientras que los adenovirus 2 y 5, los virus auxiliares más comúnmente utilizados tienen una densidad de 1.33 g/cm3. Con la centrifugación por gradiente de densidad esta diferencia es utilizada para separar los dos virus (Clark et al, 1997; Herzog et al. 1997). Las diferencias en la sensibilidad a la temperatura también son utilizadas para remover adenovirus 5 contaminantes. Las partículas de virus adenoasociadas con más resistentes al tratamiento térmico que las partículas de adenovirus. De manera rutinaria, las preparaciones de AAV son incubadas durante 1 hora a 5ß°C. El AAV recombinante es resistente a este tratamiento, mientras que el virus auxiliar 10 adenovirus no (Flotte et al, 1993; Monahan et al, 1998; Snyder et al, 1997a) . Aunque esos métodos son adecuados para remover la mayoría de los virus auxiliares, non son ideales para aplicaciones clínicas de AAV recombinante. Una razón es que para aplicaciones clínicas necesitan producirse grandes 15 cantidades de AAV recombinante. Esto implica que también deben producirse grandes cantidades de virus auxiliar el cual debe posteriormente ser removido completamente de la preparación de rAAV. Además, el proceso de validación de la ausencia del virus auxiliar es difícil. 20 La invención se relaciona directamente con la generación, producción y purificación de vectores virales diseñados genéticamente diseñados para introducir y expresar un gen de interés en células de mamífero. La presente invención proporciona un proceso para la producción de 25 vectores de virus adenoasociados (AAV) recombinantes, de alto título, que están esencialmente libres de virus auxiliares tales como adenovirus. Varios virus pueden proporcionar funciones auxiliares para los AAV. La función auxiliar de los adenovirus es por el momento la mejor caracterizada. En adenovirus, han sido identificadas cuatro regiones que son requeridas para una infección por AAV completamente permisiva. Esas son las regiones El, E2a, E4orf6 y VA. En la El, los genes de ambas de las regiones Ela y Elb son importantes. Los estudios en los cuales el papel de esos genes ha sido descubierto y caracterizado son revisados en (Cárter, 1990) . El HSV también puede funcionar como un virus auxiliar para AAV. Los genes de HSV con función de virus auxiliar identificados incluyen los genes ICP8 e ICP4, la ADN polimerasa viral y posiblemente la helicasa viral (Berns, 1996) . La invención proporciona una célula que empaqueta virus adenoasociados (AAV) que han sido provistos con ácido nucleico que codifica para un producto genético que proporciona función auxiliar para AAV, que permite generar AAV recombinante sin producción de virus auxiliar concomitante. De manera más específica, la invención proporciona métodos, líneas celulares, vectores adenovirales recombinantes y moléculas recombinantes especialmente adecuadas para la producción a gran escala de patrones de AAV recombinante de alto título que están libres de reproducción de adenovirus competentes. En las células normales la reproducción y empaquetamiento de AAV es indetectable. Sin embargo, puede inducirse la reproducción y empaquetamiento de bajo nivel en ausencia de función de virus auxiliar. Han sido publicados varios métodos para inducir un ciclo de reproducción productivo de AAV a baja escala. Esos incluyen pero no se limitan al tratamiento de las células con fármacos citostáticos o irradiación con UV (Yacobson et al, 1989; Yalkinoglu et al, 1988) y no son adecuados para la producción de gran escala de patrones de AAV recombinante de alto título que estén libres de reproducción de virus auxiliares competentes. La invención proporciona una solución estructuralmente mejor para evitar completamente la generación de virus auxiliares durante la producción de AAV recombinante. La prevención de la generación del virus auxiliar evita el requerimiento de purificación laboriosa y validación y prueba subsecuente de las preparaciones. La invención proporciona la forma de eliminar la generación de virus auxiliares durante la producción de AAV eliminando el requerimiento de virus auxiliar para la reproducción de AAV. Los métodos para mejorar la producción de AAV recombinante han atraído mucha atención en años recientes. Han sido encontradas varias formas de expresar los gens rep y cap de AAV para mejorar el rendimiento de AAV recombinante sobre los métodos estándar (Alien et al., 1997; Conway et al, 1997; Li et al, 1997; Vincent et al, 1997). Además, la función de virus auxiliar ha estado bajo estudio y se han encontrado métodos para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las preparaciones de AAV recombinante (Ferrari et al, 1997; Ferrari et al, 1996; Xiao et al, 1998b) . En un aspecto de la invención se proporciona una célula empaquetadora la cual expresa el gen E2A de adenovirus y las funciones auxiliares adicionalmente requeridas, donde las funciones auxiliares adicionalmente requeridas no poseen superposición de secuencia con la función auxiliar de E2A ya presente en la célula empaquetadora, que conducen a la formación de RCA. De manera preferible el gen E2A se deriva del adenovirus tsl25. En otro aspecto de la invención se proporciona una célula empaquetadora la cual expresa la región El de adenovirus y las funciones auxiliares adicionalmente requeridas, donde las funciones auxiliares adicionalmente requeridas no poseen superposición de secuencia con la función auxiliar de El ya presente en la célula empaquetadora, que conduce a la formación de RCA. En un aspecto particular de la invención la célula empaquetadora comprende líneas de células PER. Las líneas de células PER han sido generadas a partir de células retinoblásticas embriónicas humanas normales (HER) las cuales fueron inmortalizadas con un plásmido completamente caracterizado que contiene la región El del adenovirus humano 5 (WO 97/00326). Las células PER son específicamente útiles en la prevención de la formación de RCA en combinación con vectores de adenovirus sin El novedosos (WO 97/00326) , los cuales no poseen superposición de secuencia con la región El presente en las células PER. En un aspecto de la invención, las células PER son provistas con la función de virus auxiliar adicionalmente requerida a través de la infección de un adenovirus sin El que no contiene superposición de secuencia con las secuencias de El ya presentes en las células PER, lo que conduce a la formación de RCA. En otro aspecto de la invención, las células PER son provistas con la función de virus auxiliar adicionalmente requerida a través de la transfección con ADN plasmídico que contiene los genes que codifican para la función del virus auxiliar, plásmidos los cuales no contienen superposición de secuencia con las secuencias de El ya presentes en las células PER, lo que conduce a la formación de RCA. Un ejemplo de tal célula PER, PER.C6 ha sido depositada bajo el número de acceso 96022940 ECACC en el Centro para la Investigación de Microbiología Aplicada (CAMR) . Las líneas celulares más comúnmente utilizadas para la producción de rAAC son HeLa y 293. Aunque esas líneas celulares son ampliamente utilizadas existen varias desventajas inherentes a ellas. Las células HeLa son derivadas de cáncer humano y de este modo contienen uno o más oncogenes en su ADN. Es concebible que algo del ADN cromosomal esté coempaquetado con los vectores virales i^^ | . . . . . . -_„. . . . . ......... . . . . . . . trr???t?ra?1t_r producidos en esas células y de este modo puedan finalizar en las células objetivo en el paciente. En comparación con las células HeLa, las células 293 tienen la ventaja de que no se derivan de cáncer humano. Sin embargo, son transfectadas establemente con algunas secuencias de adenovirus y como resultado de eso expresan genes de El (Graham et al, 1977a) . Esta expresión del gen de El es suficiente para la producción de AAV recombinante (Herzog et al, 1997; Snyder et al, 1997bM Shou et al, 1998) . Sin embargo, la línea celular 293 tiene una desventaja. No únicamente la región El es integrada de manera estable en el ADN de las células. Del lado izquierdo del genoma del adenovirus se sabe que la línea celular contiene al menos 1-4344 secuencias del adenovirus 5 que contiene el ITR izquierdo, la señal de empaquetamiento, el gen de El y el gen que codifica para la proteína IX (Louis et al, 1997). La presencia de más de solo las secuencias de El deja una región significativa de superposición sobre ambos lados con los vectores de adenovirus sin El más comúnmente utilizados o mutantes de supresión tales como el dl312 (Snyder et al, 1997b) . La región de superposición es suficiente para la recombinación homologa entre los vectores de adenovirus sin El más comúnmente utilizados y las secuencias del adenovirus 5 en 293. Tal evento de recombinación homologa puede conducir a la generación indeseable del adenovirus que compite por la reproducción (RCA) (Hehir et al, 1996) . Especialmente para preparaciones a gran escala la presencia de RCA en patrones de vector de adenovirus sin El es un problema (Imler et al, 1996; Lochmuller et al, 1994). La invención descrita en (Ferrari et al, 1996) y la WO 96/40240 comprende la transfección de células 293 con un fragmento de ADN de 35,000 pb aislado de ADN digerido con Xbal del adenovirus dl309 para proporcionar las funciones auxiliares de adenovirus para la producción de AAV recombinante. Esta técnica no es ideal puesto que este fragmento de Xbal tiene considerable superposición con las secuencias de adenovirus en 293, lo que permite la generación inadvertida del adenovirus que compite por la reproducción. Otra desventaja es que el dl309 tiene una inserción de ADN en la región E3. La refinación de la técnica ha conducido a la generación de plásmidos auxiliares de adenovirus con supresiones de genes de adenovirus, reteniendo a la vez la función del virus auxiliar para la producción de AAV recombinante (WO 97/17458, Ferrari et al, 1997; Li et al, 1997; Xiao et al, 1998a). El uso de esos plásmidos auxiliares sin gen de ayuda adenovirus para evitar el RCA se restringe en general a células 293. Como se indicó anteriormente, este línea células tiene varias desventajas, una desventaja adicional de la línea celular 293 es que únicamente expresa la región El y de este modo la función auxiliar adicionalmente requerida para la producción eficiente y a gran escala de AAV recombinante, la cual necesita ser proporcionada por separado. Además, el cultivo de las células 293 es considerado problemático. En otro aspecto de la invención, se proporciona una célula empaquetadora la cual expresa las regiones El y E2a de adenovirus, por ejemplo derivada del adenovirus tsl25. En esta modalidad preferida de la invención la expresión funcional de E2a puede sincronizarse para utilizar el rendimiento de AAV recombinante. Las funciones auxiliares adicionalmente requeridas son proporcionadas en forma de un adenovirus sin El, E2a o en forma de ADN plasmídico que contiene los genes que codifican para la función del virus auxiliar, mientras que el vector del adenovirus auxiliar o el ADN plasmídico no contiene superposición de secuencia con las funciones del virus auxiliar ya presentes en las células empaquetadoras de la presente invención, lo que conduce a la formación de RCA. En esta modalidad preferida puede proporcionarse función auxiliar de E2a extra a la célula empaquetadora siempre que el método no introduzca superposición de secuencia con la región El ya presente en las células empaquetadoras, lo que conduce a la formación de RCA. En una modalidad preferida de la invención, la expresión de genes tardíos de adenovirus es representada esencialmente por intervención con la transcripción de los genes tardíos o por la remoción de uno o más de los genes codificadores del ADN que codifica para la función auxiliar adicionalmente requerida. En otro aspecto de la invención, las células de la invención se hacen crecer en grandes números para la 5 producción, cosecha y purificación de AAV recombinante. Para la producción de AAV recombinante las células son abastecidas con el ADN del AAV recombinante, el ADN que contiene los genes rep y cap de AAV y ADN que contiene las funciones de virus auxiliar. En una modalidad preferida de la invención 10 los genes rep y cap de AAV se ligan físicamente al ADN plasmídico que proporciona la función auxiliar adicionalmente requerida, de modo que estén presentes sobre una y la misma molécula. Las células pueden ser provistas con el ADN necesario para la producción de AAV recombinante justo antes 15 del inicio de la producción de AAV recombinante, caso en el cual, por cada producción las células necesitan ser abastecidas con el ADN a través de un proceso. El proceso puede ser cualquier método adecuado para la transfección o infección de ADN en grandes números de células. En una 20 modalidad particularmente preferida de la invención el ADN requerido para la producción de AAV recombinante es transfectado en células PER por medio de poli (2- (dimetilamino) etil-10-4-aminobutil) fosfaceno u otros poli (órgano) fosfacenos . De manera alternativa, las partes del 25 ADN requeridas para la producción de AAV recombinante pueden ser integradas de manera estable en el ADN cromosomal de la célula PER. En otro aspecto de la invención las células de la invención, el AAV recombinante es producido con la célula 5 empaquetadora de la invención creciendo en cultivos en suspensión utilizando medio libre de suero completamente definido. En una modalidad de la invención se proporciona un método para generar una célula empaquetadora que contiene 10 todas las funciones auxiliares necesarias para un ciclo de reproducción de AAV, por lo que las funciones auxiliares no contienen superposiciones que conduzcan a la formación del virus auxiliar que compite por la reproducción. En una modalidad preferida de la invención la célula empaquetadora 15 es transformada de manera estable con la región El de adenovirus, región la cual no contiene superposición con las funciones auxiliares adicionalmente requeridas. En una modalidad particularmente preferida de la invención la célula empaquetadora es transformada de manera estable con la región 20 El y el gen de E2a. En esta modalidad particular de la invención la función de E2a puede ser activada o desactivada después de una señal. En una modalidad preferida de esta invención el gen de E2a es derivado del adenovirus mutante H5tsl25, por lo que tal señal es un cambio en la temperatura. 25 En otra modalidad particularmente preferida de la invención ^ !_^_l_=_SftfeS^íf^_ÍllL_--__1_ -il ^_**£ *_. . ». » , . _A»<a^á¡áS la célula empaquetadora es transformada de manera estable con la región El del adenovirus 5, el gen de E2a uy la región del adenovirus 5 (Martínez et al, 1989) o el gen E4orf6 del adenovirus 5, o ambos. En esta modalidad particularmente preferida la actividad transcripcional de la región VA del adenovirus 5 y/o el gen E4orf6 del adenovirus 5 es regulada. Esto significa que la actividad transcripcional puede ser activada o desactivada después de una señal. Como se utiliza aquí el término "función auxiliar adicionalmente requerida" también se refiere a funciones de virus auxiliar que permiten la producción eficiente (a gran escala) del AAV recombinante, para lo cual los genes codificadores no son integrados de manera estable en el ADN de la célula que produce AAV recombinante o para lo cual se desea la expresión adicional. Tales funciones auxiliares adicionalmente requeridas pueden ser proporcionadas a través de cual método viral o no viral capaz de transferir material genético externo a células de mamífero tales como, pero sin limitarse a: transferencia genética mediada por poli (órgano) fosfacenos, polietilenimina, precipitación con fosfato de calcio, electroporación, recombinante, lípido o liposoma . En una modalidad de la invención se proporciona una célula empaquetadora que requiere únicamente una función de empaquetamiento de AAV adicional y un vector de AAV ^¡jjg^jl^ _*_j!_i Í_ recombinante para la producción de AAV recombinante. La célula empaquetadora comprende y proporciona la función auxiliar adenovirus requerida del ADN adenoviral integrado de manera estable. En un aspecto de la invención la función auxiliar es proporcionada por una región £1 integrada de manera estable. En otro aspecto de la invención la función helper es proporcionada por una región El integrada de manera estable y un gen E2a integrado de manera estable. En esta modalidad particular de la invención, la función de E2a puede ser activada o desactivada después de una señal. En una modalidad preferida de esta invención el gen E2a se deriva del adenovirus mutante H5tsl25, por lo que la señal es un cambio en la temperatura. En otra modalidad particularmente preferida de la invención la célula empaquetadora es transformada de manera estable con la región El del adenovirus 5, el gen de E2a y la región VA del adenovirus 5 (Martínez et al, 1989) o el gen E4orf6 del adenovirus 5, o ambos. En esta modalidad particularmente preferida la actividad transcripcional de la región VA del adenovirus 5 y/o el gen E4orf6 del adenovirus 5 es regulada, lo que significa que la actividad transcripcional puede ser activada o desactivada después de una señal. La invención proporciona una cultivo celular que comprende una célula de acuerdo a la invención. La producción a gran escala de vectores recombinantes para terapia genética humana requiere un método de cultivo fácil y escalable de manera ascendente para la línea celular productora, de manera preferible un cultivo en suspensión u otro de tales cultivos a gran escala como un cultivo en biorreactor, en medio 5 desprovisto de cualesquier constituyentes humanos o animales, es decir en medio libre de suero. Han sido ideados varios" sistemas para hacer crecer células de mamífero en grandes números. Esos incluyen, pero no se limitan a, cultivo en botella giratoria, jugos y biorreactores celulares. Cada uno 10 de esos sistemas tiene ventajas y desventajas. Los biorreactores en los cuales las células crecen en suspensión son los más fáciles de estandarizar y escalar a volúmenes cada vez más grandes. Sin embargo, una desventaja es que las células en suspensión no son transfectadas fácilmente. Se 15 desarrollaron muchos medios de cultivo celular diferentes para soportar el crecimiento óptimo de una gran variedad de diferentes células. La mayoría de esos medios se basan en variaciones del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y están suplementados con suero bovino. Hemos adaptado 20 células de acuerdo a la invención a cultivos en suspensión utilizando un medio libre de suero definido. Los cultivos libres de suero tienen la ventaja de que son completamente definidos puesto que no dependen de una fuente natural de suero que pueda variar en calidad y presencia de agentes 25 adventicios. Esos medios libres de suero contienen aditivos AIÉÍltAÉ que reemplazan componentes esenciales para el crecimiento de células en suero. La invención también proporciona un método para la producir virus adenoasociados recombinantes, que comprende 5 utilizar una célula o cultivo celular de acuerdo a la invención y que proporciona el uso de esos vectores de virus adenoasociados en la terapia genética. La invención se describe sobre la base de AAV-2 pero está claro que también otros serotipos de AAV (tales 10 como el 1 y 3 hasta 5) o aún serotipos a ser descubiertos pueden ser adaptados para los mismos propósitos. También los virus dependientes comunes en otras especies pueden ser utilizados para los mismos propósitos, por ejemplo el adenovirus adenoasociado canino es capaz de infectar células 15 humanas. Además el AAV se reproduce en muchos tipos de células de mamífero, en tanto esté presente la especie de adenovirus específica, y los virus dependientes de otras especies puedan ser producidos con las células y métodos de la presente invención utilizando las especies respectivas de 20 adenovirus específicos. Los ejemplos no limitantes de los virus no pertenecientes a primates son los virus adenoasociados de aves, caninos, bovinos (Berns, 1996) . Por ejemplo, está claro para aquellos expertos en la técnica que también los adenovirus 1 a 4, 6 a 51 u otros adenovirus 25 humanos o animales pueden ser manipulados para el mismo ..,,..^U-^_eá¿-áteito.f.: propósito, siempre que la función entre los productos genéticos sea comparable. Los productos genéticos que proporcionan una función auxiliar de AAV similar pero que se derivan de diferentes virus, tales como, pero sin limitarse a HSV, CMV y virus de la pseudorrabia, o son derivados de otras fuentes naturales o son producidos en forma sintética, pueden ser utilizados para el mismo propósito. La invención es explicada de manera adicional en la parte experimental de la descripción y los dibujos sin limitar la invención.

Breve descripción de los dibujos Figura 1. Describe la estructura y la organización del genoma del tAAV. Figura 2. Se sembraron células PER.C6 a una densidad de 1 x 106 células por 25 cm2 de frasco de cultivo celular y se cultivaron a 32-, 37- o 39°C. A los puntos en el tiempo indicados, las células fueron contadas en un contador de células de Burker. Las células PER.C6 crecen tanto a 32-, 37- y 39°C. Figura 3. Electroinmunotransferencia Western con 35mg de extracto celular completo de las líneas celulares generadas de PER.C6 transfectada con pcDNA3 (panel superior, carril 1), pcDNA3wtE2A (panel superior, carril 2), pcDNA3tsE2A (panel superior, carriles 4-14; panel medio, carriles 1-13 y panel inferior, carril 1-12) o células PER.C6 transfectadas de manera transitoria con pcDNA3tsE2A (panel superior, carril 3) . La mancha fue sondeada con un anticuerpo específico para el producto del gen de E2A (B6 aDBP) y se visualizó utilizando el sistema de detección ECL. Todas las líneas celulares PER.C6tsE2A expresan la proteína DBP sensible a la temperatura codificada por el tsE2A. Figura 4. La línea celular PER.C6tsE2A. c5-9 que expresa tsE2A fue cultivada en suspensión en Ex-cellMR libre de suero. Los puntos en el tiempo indicados, las células fueron contadas en un contador de células de Burker. Se indican los resultados de 8 cultivos independientes. Las PER.C6tsE2A crecen bien en suspensión en medio Ex-cellMR libre de suero.

Parte experimental Materiales y Métodos Constructos de ADN El plásmido de empaquetamiento pIM45 (7.3 kb) contiene los genes rep y cap de AAV-2 (McCarty et al, 1991) y fue una amable donación del Dr. S. Zolotukhin. El pACV-ßgal (8.3 kb) es un plásmido que contiene un cásete de expresión de CMV-LacZ entre AAV-ITRs y fue una amable donación del Dr. J.A. Kleinschmidt. El plásmido pIG.ElA.ElB contiene los genes de Ela y El Ad5 (nucleótidos 459 a 3510 del Ad5) bajo el control transcripcional del promotor de la PGK humana y se 5 describe en la WO/97/00326. El plásmido pE2a es otro nombre del plásmido pcDNA3wtE2A descrito más adelante. El plásmido pE4orf6 fue generado insertando un fragmento de 929 pb que codifica para la proteína E4orf6 del 10 Ad5 en el sitio de BamHI del pCMV/neo (Hinds et al, 1990) . pBr/Ad.Bam-rITR (depósito ECACC p97082122) Para facilitar la clonación del extremo cortado de 15 las secuencias de ITR, se trató ADN de adenovirus del tipo 5 (Ad5) humano natural con enzima de Klenow en presencia de un exceso de dNTPs. Después de la inactivación de la enzima de Klenow y la purificación por extracción con fenol/cloroformo seguida por precipitación con etanol, al ADN fue digerido con 20 BamHI. Esta preparación de ADN fue utilizada sin mayor purificación en una reacción de ligación con pBR322 derivado del ADN del vector preparado como sigue: el ADN del pBR322 fue digerido con EcoRV y BamHI, desfosforilado por tratamiento con enzima TSAP (Life Technologies) y purificado 25 sobre gel de agarosa LMP (SeaPlaque GTG). Después de la transformación en E. coli DH5a competente (Life Techn.) y el análisis de las colinas resistentes a la ampicilina, se seleccionó una clona que mostró un patrón de digestión como el esperado por un inserto que se extiende desde el sitio BamHI en el Ad5 hacia el ITR de la derecha. El análisis de secuencia del límite de clonación en la ITR derecha reveló que el residuo G 3' de la ITR estaba ausente, se encontró que el resto de la ITR era correcta. pBr/Ad.Cla-Bam (depósito ECACC P97082117) El ADN de adenovirus del tipo 5 natural fue digerido con Clal y BamHI, y el fragmento de 20.6 kb fue aislado del gel por electroelución. El pBR322 fue digerido con las mismas enzimas y purificado de gel de agarosa por GeneClean. Ambos fragmentos fueron ligados y transformados en DH5a competente. La clona resultante pBr/Ad. Cla-Bam fue analizada por digestión con enzima de restricción y mostró contener un inserto con secuencias de adenovirus de 919 a 21566 pb. pBr/Ad.AflII-Bam (depósito ECACC P97082114) La clona pBR/Ad. Cla-Bam fue linealizada con EcoRI (en el pBR322) y parcialmente digerida con la AflII. Después de la inactivación térmica del AflII durante 20' a 65°C los extremos del fragmento fueron llenados con enzima de Klenow. j^^-^^ El ADN fue entonces ligado a un oligo enlazante de doble hebra cortado que contenía un sitio Pací (5'- AATTGTCTTAATTAACCGCTTAA-3' ) . Este enlazante se produjo recociendo los siguientes dos oligonucleótidos: 5'- 5 AATTGTCTTAATTAACCGC-3' y 5' -AATTGCGGTTAATTAAGAC-3' , seguido por el corte con encima de Klenow. Después de la precipitación del ADN ligado al amortiguador de cambio, las ligaciones fueron digeridas con un exceso de enzima Pací para remover concatámeros del oligo. El fragmento parcial de 22016 10 pb que contenía secuencia de Ad5 de 3534 hasta 21566 pb y las secuencias del vector, se aisló en agarosa LMP (SeaPlaque GTG), se religó y transformó en DH5a competentes. Una clona que se encontró contenía el sitio de Pací y que había retenido el adenofragmento grande se seleccionó y secuenció 15 en el extremo 5' para verificar la inserción correcta del enlazante de Pací en el sitio AflII (perdido) . pBr/Ad.Bam-r!TRpac#2 (depósito ECACC P97082120) y pBr/Ad.Bam-rITR#8 (depósito ECACC P97082121) 20 Para permitir la inserción del sitio de Pací cerca de la ITR del Ad5 en la clona pBr/Ad. Bam-rITR se removieron aproximadamente 190 nucleótidos entre el sitio de Clal en el esqueleto del pBr322 y el inicio de las secuencias de ITR. Esto se hizo como sigue: fue digerido pBr/Ad. Bam-rITR con - ^ammUmmem* **- Clal y tratado con nucleasa Bal31 durante diferentes periodos de tiempo (2', 5', 10' y 15'). El grado de remoción de nucleótido fue seguido por reacciones separadas sobre del ADN del pBR322 (también digerido en el sitio de Clal), utilizando amortiguadores y condiciones diferentes. La enzima Bal31 fue inactivada por incubación a 37 °C durante 10', el ADN fue precipitado y resuspendido en un volumen más pequeño de amortiguador TE. Para asegurar los extremos cortados, los ADN fueron tratados adicionalmente con ADN polimerasa T4 en presencia de un exceso de dNTPs. Después de la digestión del ADN del pBr322 (control) con Salí, se observó la degradación satisfactoria (~150 pb) en la muestra tratada durante 10' ó 15' . Las muestra de pBr/Ad.Bam-rITR tratadas durante 10' ó 15' fuero entonces ligadas a los enlazantes de Pací cortados descritos anteriormente (véase pBr/Ad. Aflll-Bam) . Las ligaciones fueron purificadas por precipitación, digeridas con exceso de Pací y separadas de los enlazantes sobre un gel de agarosa LMP. Después de la religación, los ADN fueron transformados en DH5a competente y se analizaron las colonias. Se seleccionaron diez clonas que mostraron una supresión de aproximadamente la longitud deseada y esas fueron analizadas adicionalmente por secuenciamiento de seguimiento T (equipo de secuenciamiento T7, Pharmacia Biotech) . Se encontraron dos clonas con el enlazante de Pací insertado justo corriente abajo de la rITR. Después de la Bt«? í tullí I i 1 fi l nri digestión con Pací, la clona #2 tuvo 28 pb y la clona #8 tuvo 27 pb unidas a la ITR. pBr/Ad.aflII-rITR (depósito ECACC P97082116) 5 Se utilizó vector cosmídico pWE15 (Clontech) para clonar insertos de Ad5 más grandes. Primero, se insertó un enlazante que contenía un sitio de Pací único en los sitios de EcoRI del pWE15 creando pEW15.Pac. A este extremo se utilizó el oligo Pací de doble hebra como se describió para 10 pBr/Ad. Af111-Bam pero no con sus extremos de proyección de EcoRI . Los siguientes fragmentos fueron entonces aislados por electroelución de gel de agarosa: pWE15.Pac digerido con Pací, pBr/Ad. AfHl-Bam digerido con Pací y BamHI y pBr/Ad. Bam-rITR#2 digerido con BamHI y Pací. Esos fragmentos 15 fueron ligados juntos y empaquetados utilizando extractos de empaquetamiento de fago ? (Stratagene) de acuerdo al protocolo del fabricante. Después de la infección en bacterias huésped, las colonias se hicieron crecer sobre placas y se analizaron para determinar la presencia del 2Q inserto completo. El pWE/Ad. AfHl-rlTR contiene toda las secuencias de adenovirus del tipo 5 de 3534 pb (sitio AflII) hasta e incluyendo la ITR derecha (faltando el residuo G más 3') .

--— -M"¿u'j<iw*!- -. .-- ---^ . -. ~~- . -^-—. .. . —, _ * «^*-rf-a p E/Ad.?5' El constructo pWE/Ad.?5' es un ejemplo de una molécula de reproducción de acuerdo a la invención que contiene dos ITR adenovirales y todas las secuencias adenovirales de entre 3510 pb y 35938 pb, es decir, el genoma adenoviral completo excepto por la región El y la señal de empaquetamiento. El pWE/Ad.?5' ha sido producido en un antecedente de vector cosmídico de tres fragmentos. Primero la ITR5' del Ad5 fue amplificada utilizando los siguientes cebadores: ITR-EPH: 5' -CGG-AAT-TCT-TAA-TTA-AGT-TAA-CAT-CAT-CAA-TAA-TAT-ACC-3' e ITR-pIX: 5' -ACG-GCG-CGC-CTT-AAG-CCA-CGC-CCA-CAC-ATT-TCA-GTA-CGT-ACT-AGT-CTA-CGT-CAC-CCG-CCC-CGT-TCC-3' . El fragmento de la PCR resultante fue clonado en el vector pNEB193 (New Enland Biolabs) digerido con las mismas enzimas. El constructo resultante fue nombrado como pNEB/ITR-pIX. El secuenciamiento confirmó la amplificación correcta de las secuencias de Ad5 en la ITR izquierda (secuencias de Ad5 1 a 103) ligada al promotor pIX (secuencias de Ad5 3511 a 3538) excepto por una sola disparidad con la secuencia esperada de acuerdo al GenBank (No. de acceso: M73260/M29978) , es decir, que se encontró un residuo de G extra justo corriente arriba del sitio AflII. Este fragmento de ITR-pIX fue entonces aislado con EcoRI-AflII y ligado a un fragmento del vector EcoRI-AflII que contiene 3539-21567 ^^Se^^leséi^ secuencias del Ad5. El último fragmento se obtuvo mediante la digestión de pBr/Ad. Cla-Bam ( supra ) con EcoRI y parcialmente con AflII. La clona resultante fue nombrada como pAd/LITR(?5' ) -BamHI. El constructo final pWE/Ad.?5' se produjo entonces ligando el vector cosmídico pWE15.Pac ( supra ) digerido con Pací a pAd/LITR (?5' ) -BamHI digerido con PacI/BamHI y pBr/Ad. Bam-rITR. pac#2 ( supra ) digerido con PacI/BamHI. pWE/Ad,AflII-rITR?E2A. Este cós ido es esencialmente el mismo que el pWE/Ad.AflII-rITR (depósito ECACC P97082116) además de una supresión de las regiones de codificación de E2A. La supresión de las secuencias que codifican para E2A del pWE/Ad.AflII-rITR (depósito ECAAC P97082116) se ha efectuado como sigue. Las secuencias adenovirales que flanquean a la región que codifica para E2A al lado izquierdo y derecho fueron amplificadas del plásmido pBR/Ad. Sal . rITR (depósito ECACC P97082119) en una reacción de PCR con el sistema Expand PCR (Boehringer) de acuerdo al protocolo de los fabricantes. Se utilizaron los siguientes cebadores: Secuencias flanqueantes derechas (que corresponden a los nucleótidos 24033 a 25180 de Ad5) : ?E2 . SnaBI : 5' -GGC . GT . CGT .AGC . CCT . GTC . GAA.AG-3' I.» ít - , , . , .„ - A.

?E2A. DBP-Start : 5' -CCA.ATG. CAT.TCG.AAG. TAC. TTC. CTT. CTC CTA. TAG. GC-3' El fragmento de ADN amplificado fue digerido con SnaBI y Nsil (la Nsil se generó del cebador ?E2A. DBP-start, subrayado) Las secuencias flanqueantes izquierdas (que corresponden a los nucleótidos 21557 a 22442 de la Ad5) : ?E2A. DBP-stop : 5' -CCA.ATG . CAT .ACG . GCG . CAG .ACG . G-3' ?E2A.?amHI : 5' -GAG. GTG. GAT . CCC.ATG. GAC. GAG-3' El ADN amplificado fue digerido con BamHI y Nsil (la Nsil se generó en el cebador ?E2A. DBP-stop, subrayado). Posteriormente, los fragmentos de ADN digeridos fueron ligados en pBr/Ad. Sal-rITR digerido con SnaBI/BamHI para dar lugar a pBE.Ad. Sal-rITR?E2A. El secuenciamiento confirmó el reemplazo exacto de la región que codifica para DBP con un sitio de Nsil único en el plásmido pBR.Ad.Sal-rITR?E2A. A continuación se generó el cósmido pWE/Ad.AfIII-rITR?E2A. El plásmido pBR.Ad. Sal-rITR?E2A fue digerido con BamII y Spel. El fragmento de 3.9 kb en el cual la región que codifica para E2A fue reemplazado por el sitio de Nsil único fue aislado. El cósmido pWE/Ad.Af111-rITR fue digerido por BamHI y Spel. El fragmento de ADN de 35 Kb, del cual el ^á. fragmento BamHI/Spel que contiene la secuencia que codifica para E2A fue removido, fue aislado. Los fragmentos fueron ligados y empaquetados utilizando extractos de empaquetamiento del fago ? de acuerdo al protocolo de los fabricantes (Stratagene) , produciendo el cósmido pWE/Ad.AflII-rITR?E2A. pVA. El pVA (3.7 Kb) es un plásmido pUC119 que contiene la región VAI y VAII del adenovirus 5 (nucleótidos 10555 hasta 11075) . Los genes de VA del adenovirus 5 fueron clonados después de la PCR sobre el ADN aislado del adenovirus 5 natural utilizando los cebadores 5'- ACGCGTCGACCTCTGGCCGGTCAGGCGCGCGCAA-3' y 5'-ACGCGGCTCCCGCATCTGCCGCAGCACCGGATGC-3' . La PCR se efectuó utilizando el eqµipo de PCR expand long templateMR (Boehringer) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. El fragmento resultante fu digerido con Salí, y BamHI, presente en los cebadores, y ligado en pUC119 digerido con Salí y BamHI .

Cultivo Celular Las células 293 (Graham et al, 1977b) y células HeLa (Cáncer Res. 12:264, 1952) fueron cultivadas en medio de -áÁ .I Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Life technologies Breda, Holanda) que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado con calor a 37 °C y 10% de C02. Los cultivos adherentes de células PER.C6 se hicieron crecer en DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal y MgCl2 (10 mM) a 37°C y 10% de C02. Los cultivos en suspensión de células PER.C6 fueron cultivados en Ex-CellMR 525 (JRH Biosciences, Denver, Pennsylvania) suplementado con 1 x de L-Glutamina (GIBCO BRL) , aquí posteriormente llamado Ex-Cell^ a 37°C y 10% de C02 en cultivos estacionarios en discos de 6 pozos (Greiner, Alphen aan de Rijn, Holanda) o en vasos de cultivo tisular de Erlenmeyer (Corning) durante la agitación continua a 100 RPM.

Transfección Transfección de cul tivos de monocapa : Las células HeLA y las células 293 fueron transfectadas utilizando el sistema de transfección de Fosfato de Calcio (Life technologies, Almere) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las monocapas de células PER.C6 fueron transfectadas utilizando LipofectAMINEMR (Life technologies, Breda) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Transfección de cul tivos en suspensión : 'Las células PER.C6 en fase de crecimiento logarítmico fueron recolectadas por centrifugación (3000 g, 5 minutos, rta) . Las células fueron resuspendidas en mezcla de transfección (descrita más adelante a una concentración de 2 x 106 e incubadas durante 3 horas a 37 °C, 10% de C02. A menos que se indique otra cosa, las transfecciones se efectuaron bajo condiciones de agitación (100 RPM) . Para las transfecciones con DMRIE-CMR 5 (Life technologies, Breda) la mezcla de transfección se hizo en DMEM de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Después de la incubación de 3 horas en la mezcla de transfección, las células fueron recolectadas por centrifugación (3000 g, 5 min, rta) y resuspendidas en medio 10 Ex-CellMR fresco hasta una concentración final de 106 células por ml . La transfección con FuGENEMR (Boehringer Mannheim) se efectuó con mezcla de transfección hecha en el medio Ex-CellMR de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Después de tres horas de incubación con mezcla de transfección las 15 células fueron diluidas con medio Ex-CellMR a una concentración final de 106 células por ml . Las mezclas de trnasfección utilizando poli (2- (dimetilamino) etil-10-4- aminobutil) fosfaceno (PPZ) se hicieron como sigue. Se produjo una solución patrón de PPZ (2.4 mgramos/ml) disolviendo el 20 compuesto sólido en Hepes (5 mM, pH = 7.3) . La fórmula de PPZ es : Xi I - [ P=N- ] n-P=N- donde Xl f X2 son -N-CH2-CH2-N ( CH3 ) 2 o -N-CH2- 25 CH2-CH2-CH2-NH2 .

X2 Las mezclas de transfección se hicieron agregando la cantidad indicada de PPZ a 500 ul de medio Ex-CellMR. Esta solución fue mezclada con el mismo volumen de Ex-CellMR que contenía la cantidad indicada de ADN. La mezcla fue incubada durante 1 hora y posteriormente se utilizó para resuspender un sedimento de 2 x 106 células de PER.C6. Las células fueron incubadas con la mezcla de transfección durante tres horas y posteriormente diluidas con medio Ex-CellMR a una concentración final de 106 células por ml . Las células transfectadas fueron cosechadas 48 horas después y analizadas para determinar la actividad de ß- galactosidasa.

Ensayos actividad de la ß-galactosidasa Las células fueron teñidas para la actividad de ß- galactosidasa con dos métodos diferentes. Para el análisis histoquímico y la determinación del número de unidades infecciosas se utilizó el siguiente procedimiento. Las células fueron lavadas dos veces con PBS (NPBI, Emmer- Compascuum) y fijadas durante 10 minutos en glutaraldehído 0.2% (Sigma, Zwijndrecht, Holanda) en PBS. Las células fueron lavadas dos veces con PBS y teñidas con solución de X-Gal >^-1--J" » - • « • — - - -- - — _ T tm 1- - „ ,. ^.,^^ (MgCl2.6H20 2 mM, K2Fe(CN)6 5 mM, 'K4Fe (CN) 6.3H20 5 mM y 40 mg/ml de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-galactopiranosido, Molecular Probes Europe, Leiden, Holanda) en amortiguador de fosfato 0.1 M pH = 7.4). Después de la tinsión durante la 5 noche a 37°C las células azules fueron contadas bajo un microscopio óptico (Olumpus CK2-TR) . Para la cuantificación de la actividad de la ß-galactosidasa en cultivos en suspensión de PER.C6 se utilizó el equipo de Cuantificación de LacZ/Galactosidasa FluoReporterMR (Molecular Proes, Leiden, 10 Holanda) de acuerdo al protocolo proporcionado por el fabricante. La actividad de la ß-galactosidasa de cada muestra se evaluó comparando la actividad de la ß- galactosidasa en 10 ul de la suspensión celular a una dilución en serie de una concentración conocida de ß-15 galactosidasa purificada.

Titulación del AAV recombinante Las células HeLa fueron sembradas a 4 x 104 células por cm2. El medio fue reemplazado al siguiente día con medio 0 fresco que contenía diluciones en serie de rAAv y adenovirus tsl49 (20 ufp/célula) . Después de 4 horas el medio fue reemplazado por medio fresco y las células fueron incubadas durante 24 horas a 37 °C, 10% de CO2 antes de la tinsión con ß-galactosidasa. El título del patrón de AAV recombinante fue ^ ^|j&^g calculado contando el número de células azules de la dilución más alta que dio lugar a las células azules y multiplicar este número por el factor de dilución. 5 Producción de AAV recombinante sobre células adherentes Las células fueron sembradas de modo que alcanzaron una confluencia del 70% el siguiente día. Las células fueron entonces transfectadas con pACV-ßgal y pIM45 (relación 1:4 peso/peso) e infectadas con el virus auxiliar de adenovirus 10 tsl49 (moi = 20), el virus auxiliar de adenovirus sin El IG.Ad.MLP.Luc (Vincent et al. 1996) o transfectadas con el ADN plasmídico auxiliar de adenovirus. En el último caso la cantidad total de plásmidos del gen auxiliar de adenovirus fue 1.5 veces (peso/peso) mayor que la cantidad total de 15 pACV-ßgal y pIM45. Cuando se utilizó más de un plásmido auxiliar de adenovirus, se utilizaron cantidades iguales (peso/peso) de los diferentes plásmidos de adenovirus. La producción de AAV recombinante sobre PER:C6tsE2A. c5-9 adherente se infectó de acuerdo a lo descrito para la línea 20 celular PER.C6 excepto por algunas modificaciones. La línea celular se hizo crecer a 39°C, 10% de Co2. Antes de la transfección las células fueron sembradas a 39°C, 10% de C02, de modo que alcanzaron una confluencia del 7Í)% al siguiente día. Las células fueron cultivadas posteriormente durante un J^m^gj^fcjj^^_^__-^__^_^_^ •_ . . . I ^aS?^,j día a 32°C, 10% de C02. A continuación las células fueron transfectadas a 37°C, 10% de Co2 de acuerdo a lo descrito para la línea celular PER.C6. El AAV recombinante fue cosechado 48 horas después de la transfección. Las células 5 fueron desprendidas en su medio de cultivo y sometidas a tres ciclos de congelamiento y descongelamiento. Los restos celulares fueron centrifugados (200 RPM, 10 minutos, ct ) . Cuando se utilizaron adenovirus tsl49 o vectores de adenovirus sin El, los sobrenadantes fueron inactivados con 10 calor a 56°C durante 1 hora. Cuando se utilizaron fragmentos de ADN de adenovirus para complementar la producción de AAV los sobrenadantes no fueron inactivados térmicamente. Todos los sobrenadantes fueron filtrados (0.45 uM, Millipore) antes del almacenamiento a -20°C. 15 Ejemplo 1 Generación de las lineas celulares productoras para la producción de vectores adenovirales recombinantes sin la región inicial 1 y la región inicial 2A 20 Aquí se describe la generación de líneas celulares para la producción de vectores adenovirales recombinantes sin la región inicial 1 (El) y la región inicial 2A (E2A) . Las líneas de células productoras complementan la supresión de El y E2A de los vectores adenovirales recombinantes en la posición trans por la expresión constitutiva de los genes de El y E2A, respectivamente. La línea celular retinoblástica de riñon embriónico humano transformada El de Ad5 preestablecida PER.C6 (WO 97/00326) y la línea celular de riñon embriónico humano transformada con Ad5 293 (Graham et al, 1977b) fueron equipadas además con casetes de expresión de E2A. El gen de E2A adneoviral codifica para una Proteína de Unión de ADN 72 kDa (DBP) la cual tiene una alta afinidad por el ADN de una sola hebra. Debido a esta característica, la expresión constitutiva de la DBP es tóxica para las células. El mutante tsl25E2A codifica para una DBP la cual tiene una sustitución Pro?Ser del aminoácido 413 (Vliet van der et al, 1975) . Debido a esta mutación, la DBP codificada por el tsl25E2A es completamente activa a la temperatura permisiva de 32 °C pero no se une al ADNss a la temperatura permisiva de 39°C. Esto permite la generación de líneas celulares que expresan constitutivamente E2A, las cuales no son funcionales y no son tóxicas a la temperatura no permisiva de 39°C, pero se vuelven funcionales después de un cambio de temperatura a la temperatura permisiva de 32 °C.

^? .... . . . . A. Generación de plásmidos gue expresan E2A natural o tsl25E2A sensible a la t mperatura . pcDNA3wtE2A: La región que codifica para la región incial 2A (E2A) natural completa fue codificada del plásmido pBR/Ad.Bam-rITR (depósito ECACC P97082122) con los cebadores DBPpcrl y DBPpcr2 utilizando el sistema de PCR de patrón grande ExpandMR de acuerdo al protocolo estándar del distribuidor (Boheringer Mannheim) . La PCr se efectuó en un programa de amplificación Biometra Trio Thermoblock: 94 °C durante 2 minutos, 1 ciclo; 94 °C durante 10 segundos + 51 °C durante 30 segundos + 68CC durante 2 minutos, 1 ciclo; 94°C durante 10 segundos + 58 °C durante 30 segundos + 68 °C durante 2 minutos, 10 ciclos; 94 °C durante 10 segundos + 58 °C durante 30 segundos + 68 °C durante 2 minutos con 20 segundos de extensión por ciclo, 20 ciclos; 68°C durante 5 minutos, 1 ciclo. El cebador DBPpcrl: CGG GAT CCG CCA CCA TGG CCA GTC GGG AAG AGG AG (5' a 3' ) contiene un sitio de restricción de BamHI único (subrayado) 5' de la secuencia de Kozak (itálica) y el codón de inicio de la secuencia que codifica para E2A. El cebador DBPpcr2 : CGG AAT TCT TAA AAA TCA AAG GGG TTC TGC CGC (5' a 3' ) contiene un sitio de restricción de EcoRI único (subrayado) 3' y del codón de alto de la secuencia que codifica para E2A. Los caracteres en negrillas se refieren a las secuencias derivadas de la región que codifica para E2A.

El fragmento de la PCR fue digerido con Ba HI/EcoRI y clonado en pcDAN3 digerido con BamHI/EcoRI (Invitrogen) para dar el pcDNA3vtE2A. pcDNA3tsE2A: La región codificadora del tsl25E2A 5 fue amplificada del ADN aislado del mutante de adenovirus sensible a la temperatura H5tsl25 (Ensinger y Ginsberg, 1972; Vliet van der et al, 1975) . El procedimiento de amplificación por PCR fue idéntico al de la amplificación de wtE2A. El fragmento de la PCR fue digerido con BamHI/EcoRI y clonado en 10 pcDNA3 digerido con BamHI/EcoRi (Invitrogen), dando lugar al pcDNA3tsE2A. La integridad de la secuencia codificadora del wtE2A y el tsE2A fue confirmada por secuenciamiento.

B. Características de crecimiento de las células productoras 15 para la producción de vectores de adenovirus recombinantes cultivados a 32-37- y 39° C. Las células PER.C6 fueron cultivadas en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, GIBCO BRL) suplementado con 10% de Suero Bovino Fetal (FBS, GIBCO BRL) y MgCl2 10 mM 20 en una atmósfera con 10% de Co2 a 32°C, 37°C o 39°C. Al día 0, se sellaron un total de 1 x 106 células PER.C6 por 25 cm2 de frasco de cultivo tisular (Nunc) y las células fueron cultivadas a 32°C, 37°C ó a 39°C. Al día 1-8 las células fueron contadas. La Figura 3 muestra que la velocidad de crecimiento y la densidad celular final del cultivo de PER.C6 a 39°C es comparable al de 37°C. La velocidad de crecimiento y la densidad final del cultivo de PER:C6 a 32 °C se redujeron ligeramente en comparación con los de 37°C ó 39°C. No se observó muerte celular significativa a ninguna de las temperaturas de incubación. De este modo las PER.C6 funcionan muy bien tanto a 32 °C como a 39°C, la temperatura permisiva y no permisiva para tsl25E2A, respectivamente.

C. Transfección de PER. C6 y 293 con vectores de expresión de E2A; transformación y generación de colonias de líneas de células Un día antes de la transfección, se sembraron 2 x 106 células PER.C6 por 6 cm de disco de cultivo tisular (Greiner) en DMEM, suplementado con 10% de FBS y MgCl2 lOmM e incubadas a 37 °C en una atmósfera con 10% de C02. Al siguiente día, las células fueron transfectadas con 3-, 5- u 8µg de cualquiera del ADN plasmídico de pcDNA3, pcDNA3wtE2A o pcDNA3tsE2A por disco, utilizando el equipo de reactivo LipoFectAMINE PLUSMR de acuerdo al protocolo estándar del distribuidor (GIBCO BRL) , excepto que las células fueron transfectadas a 39°C en una atmósfera con 10% de C02. Después de la transfección, las células fueron mantenidas constantemente a 39°C, la temperatura no permisiva para el tsl25E2A. Tres días después, las células fueron colocadas sobre DMEM, suplementado con 10% de FBS, MgCl2 lOmM y 0.25mg/ml de G418 (GIBCO BRL) y las primeras colonias resistentes a G418 aparecieron 10 días después de la transfección. Como se muestra en la Tabla 1, hubo una diferencia dramática entre el número total de colonias obtenidas después de la transfección de pCDNA3 (~200 colonias) o pcDNA3stE2A (-100 colonias) y pcDNA3wtE2A (únicamente 4 colonias) . Esos resultados indican que la toxicidad de E2A expresada constitutivamente puede ser superada utilizando un mutante de E2A sensible a la temperatura (tsl25E2A) y cultivando las células a la temperatura no permisiva de 39 °C. De cada transfección, se tomó un número de colonias desprendiendo las células del disco con una pipeta. Las células desprendidas fueron colocadas posteriormente en discos de cultivo tisular de 24 pozos (Greiner) y cultivadas adicionalmente a 39°C en una atmósfera con 10% de C02 en DMEM, suplementado con 10% de FBS, MgCl2 lOmM y 0.25mg/ml de G418. Como se muestra en la tabla 1, 100% de las colonias transfectadas con pcDNA3 (4/4) y 82% de las colonias transfectadas con pcDNA3tsE2A (37/45) se establecieron a líneas celulares estables (las restantes 8 colonias transfectadas con pcDNA3tsE2A crecieron lentamente y fueron desechadas). En contraste, únicamente una colonia transfectada con ,., .. . ... .. ****** pcDNA3wtE2A pudo establecerse. Las otras tres murieron directamente después de ser retiradas. A continuación, se determinaron los niveles de expresión de E2A en las diferentes líneas celulares por electroinmunotransferencia Western. Las líneas celulares fueron sembradas sobre discos de cultivo celular de 6 pozos y los cultivos subconfluentes fueron lavados dos veces con PBS (NPBI) y usados y desprendidos en RIPA (1% de NP-40, 5% de desoxicolato de sodio y 0.1% de SDS en PBS; suplementado con fenimetilsulfonilfluoruro lmM y 0.1 mg/ml de inhibidor de tripsina) . Después de 15 minutos de incubación sobre hielo, los usados fueron aclarados por centrifugación. Las concentraciones de proteína fueron determinadas por el ensayo de proteína Bio-Rad, de acuerdo a los procedimientos estándar del distribuidor (BioRad) . Se fraccionaron cantidades iguales de extracto celular completo fraccionado por SDS-PAGE sobre geles al 10%. Las proteínas fueron transferidas sobre membranas Immobilon-P (Millipore) e incubadas con el anticuerpo monoclonal B6 de aDBP (Reich et al, 1983) . El anticuerpo secundario fue un anticuerpo antirratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (BioRad) . El procedimiento de electroinmunotransferencia Western y las incubaciones con anticuerpo se efectuaron de acuerdo al protocolo proporcionado por Millipore. Los complejos de anticuerpo fueron visualizados con el sistema de detección CT, de acuerdo al protocolo del fabricante (Amersham) . La Figura 3 muestra que todas las líneas celulares derivadas de la transfección con pcDNA3tsE2A expresan la proteína E2A de 72 kDa (panel superior, carriles 4-14; panel medio, carriles 1-13; panel 5 inferior, carriles 1-12). En contraste, la única línea celular derivada de la transfección con pcDNA3wtE2A no expresó la proteína E2A (carril 2) . No se detecto proteína E2A en el extracto de una línea celular derivada de la transfección con pcDNA3 (carril 1), la cual sirve como un 0 control negativo. El extracto de células PER.C6 transfectadas transitoriamente con pcDNA3tsl25 (carril 3) sirvió como un control positivo para el procedimiento de electroinmunotransferencia Western. Esos datos confirman que la expresión constitutiva de wtE2A es tóxica para las células 5 y que esta toxicidad puede ser circunscrita utilizando el mutante tsl25 de la E2A. En contraste con las células PER.C6, el cultivo de las células 293 a 39°C es problemático. Por lo tanto, la transfección de las células 293 con pcDNA3, pcDNA3wtE2A o pcDNA3tsE2A se efectuó a 37°C en una atmósfera con 10% de C02, una temperatura semipermisiva par la DBP codificada por el tsl25E2A. Un día antes de la transfección, las células 293 fueron sembradas en, suplementado con 10% de FBS y MgCl2 lOmM, a una densidad de 3.6 x 105 células por cm de disco de cultivo tisular (Greiner) . Cinco horas antes de la g^|g^^g¡^| s transfección, las células recibieron medio fresco. Las células fueron transfectadas con 7.2 µg de ADN plasmídico de pcDNA3wtE2A o pcDNA3tsE2A, utilizando el sistema de transfección de fosfato de calcio de acuerdo al protocolo 5 estándar del distribuidor (GIBCO BRL) . Dos días después de la transfección, las células fueron colocadas sobre medio de selección, es decir DMEM suplementado con 10% de FBS, MgCl2 lOmM y O.lmg/ml de G418. Las primeras colonias aparecieron 12 días después de la transfección. Como se muestra en la tabla 10 2, el número total de colonias obtenidas después de la transfección de pcDNA3 (-100 colonias) o pcDNA3tsE2A (-25 colonias) fue significativamente mayor que el obtenido después de la transfección de pcDNA3wtE2A (únicamente dos colonias) . Esos resultados nuevamente muestran que la E2A 15 expresada constitutivamente es tóxica para las células, y que esta toxicidad puede ser circunscrita utilizando el tsl25E2A. Además, muestra que esta no es específica para las células PER.C6, pero que se aplica a células eucarióticas en general (por ejemplo células 293) . 20 D. Cowplementación de la supresión de E2A en Ad5. dl802 por células PER. C6 que expresan constitutivamente tsl25E2A. El adenovirus ?d5. dl802 es un vector derivado del Ad5 para la parte principal de la región que codifica para la •-"a»-t»Wfci-?mili i * • •*"—'-'* E2A y que no produce DBP funcional (Rice y Klessig, 1985) . El Ad5.dl802 fue utilizado para probar la actividad transcomplementadora de la E2A de las células PER.C6 que expresan constitutivamente el tsl25E2A. Las células PER.C6 originales o 3-9 clonas de PER.C6tsE2A fueron cultivadas en DMEM, suplementado con 10% de FBS y MgCl2 lOmM a 39°C y 10% de C02 en frascos en 25 cm2 en células pseudoinfectadas o infectadas con Ad5.dl802 a m.o.i. de 5. Posteriormente las células infectadas fueron cultivadas a 32 °C y las células fueron separadas por su apariencia de un efecto citopático (CPE) de acuerdo a lo determinado por cambios en la morfología celular y el desprendimiento de las células del matraz. La tabla 3 muestra que el CPE completo apareció en las 3-9 clonas de PER.C6tsE2A infectadas con Ad5.dl802 dentro de 2 días. No apareció CPE en las células PER.C6 infectadas con AD5.dl802 o las células pseudoinfectadas. Esos datos muestran que las células PER.C6 expresan constitutivamente el complemento de tsl25E2A en trans para la supresión de E2A en el vector Ad5.dl802 a la temperatura permisiva de 32°C.

E. Cultivo en suspensión libre de suero de líneas de células PER. C6tsE2A. La producción a gran escala de vectores adenovirales recombinantes para terapia genética humana requiere un método de cultivo fácil y escalable de manera »..., , ... . », - . . ....... __^___, .s?ass. ascendente para la línea celular productora, de manera preferible en cultivo en suspensión, en medio sin ningún constituyente humano o animal. Hasta ese punto, varias clonas de PER.C6tsE2A fueron llevadas a un cultivo en suspensión. Como un ejemplo, la línea celular PER.C6tsE2A (designada como c5-9) fue cultivada a 39°C y 10% de C02 en un matraz de cultivo tisular de 175 cm2 (Nunc) en DMEM, suplementado con 10% de FBS y MgCl2 lOmM. En la subconfluencia (70-80% confluente), las células fueron lavadas con PBS (NPBI) y el medio fue reemplazado por 25 ml de medio de suspensión libre de suero Ex-CellMR 525 (JRH) suplementado con 1 X de L-Glutamina (GIBCO BRL) , aquí designado posteriormente como Ex-CellMR. Dos días después, las células fueron desprendidas del matraz por oscilación y las células fueron centrifugadas a lOOOrpm durante 5 minutos. La masa celular fue resuspendida en 5ml de Ex-CellMR y se transfirieron 0.5ml de suspensión celular a un matraz de cultivo tisular de 80 cm2 (Nunc) , junto con 12 ml de Ex-CellMR fresco. 2 días después, las células fueron cosechadas (todas las células están en suspensión) y se contaron en un contador de células de Burker. A continuación, las células fueron sembradas en un Erlenmeyer de cultivo tisular de 125ml (Corning) a una densidad de sembrado de 3 x 105 células por ml en un volumen total de 20 ml de Ex-CellMR. Las células fueron cultivadas adicionalmente a 125rpm en un agitador orbital (GFL) a 39°C t^.......... ...,......._ ^ . . .. . . _______— ,-m?mtn en una atmósfera con 10% de C02. Las células fueron contadas el día 1-6 en un contador de células de Burker. En la Figura 4, se muestra la curva de crecimiento promedio de 8 cultivos. El PER.C6tsE2A funciona bien en cultivo en suspensión libre 5 de suero. La densidad celular máxima de aproximadamente 2 x 106 células por ml se alcanzó dentro de 5 días de cultivo.

Ejemplo 2 Células PER como células productoras para AAV recombinante . 10 Las células PER se derivaron de células de retina humana. La retina es conocida por su capacidad para sostener la reproducción de AAV. Por lo tanto verificamos si las células PER son permisivas para la producción de AAV recombinante. Las células PER.C6 fueron transfectadas 15 utilizando LipofectAMINAMR con el plásmido de empaquetamiento pIM45, el vector de rAAV pACV-ßgal (relación 10:1 peso/peso) e infectadas con adenovirus tsl49. El AAV recombinante fue aislado dos días después y titulado sobre células HeLa infectadas con adenovirus, el pACV-ßgal producido sobre las 20 células PER.C6 tuvo un título de 2 x 107 unidades infecciosas (Ul) por ml -Q 20 Ul por célula. El rendimiento de virus por célula obtenido con este sistema es comparable o mejor al reportado para las líneas de células 293 con el plásmido de empaquetamiento pIM45 (Vincent et al, 1997) . En paralelo ¿j^^| f|¡||^ ¿8fe-:.»M¿S analizamos si el patrón y nivel de las proteínas El expresadas fue suficiente para la producción de rAAV. Para evaluar esta cuestión, las células PER.C6 fueron transfectadas con el plásmido de empaquetamiento pIM45, el 5 vector de rAAV pACV-ßgal (relación 10:1 peso/peso) e infectadas con un vector de adenovirus sin El IG. Ad.MLP. Luc (Vincent et al, 1996) . El rendimiento de rAAV utilizando el vector de adenovirus sin El ID. Ad.MLP. Luc fue de 2 x 107 Ul/ml y de este modo el mismo que con el adenovirus tsl49. 10 Este resultado indica que tanto el patrón como el nivel de expresión de El en PER.C6 permite la producción eficiente de rAAV.

Producción libre de vector viral de AAV recombinante sobre PER.C6. 15 La producción de AAV recombinante utilizando ADN de adenovirus como auxiliar en lugar del adenovirus ha sido reportada (Ferrari et al, 1997; Ferrari et al, 1996; Li et al, 1997; Xiao et al, 1998a)). Este trabajo se efectuó exclusivamente en la línea celular 293. Nosotros deseamos 20 determinar si también la línea celular PER.C6 podría ser utilizada para producir AAV recombinante. Hasta este punto probamos dos constructos pWE/Ad.D5' y pWE/Ad.Af111-rITR los cuales contenían todos los genes de adenovirus excepto la región El. El constructo pWE/Ad. f111-rITR, como se mencionó contiene todo el adenovirus excepto El, sin embargo, el promotor del gen de la proteína IX contiene una supresión. El pW/Ad.D5' por el contrario contiene la ITR izquierda y toda la longitud del promotor de la proteína IX. El AAV 5 recombinante podría ser producido con ambos fragmentos de ADN adenoviral. Los rendimientos de AAV recombinante fueron diferentes comparación ambos constructos. El rendimiento del AAV recombinante utilizando pWE/Ad. Af111-rITR fue significativamente más alto que utilizando el pWE/Ad.D5' 10 (Tabla 4) . Una razón para la diferencia en el rendimiento podría ser la diferencia en la expresión de las proteínas relevantes de los dos plásmidos diferentes. Otra razón podría ser que la expresión de la proteína IX del adenovirus 5 afecta negativamente la producción de AAV recombinante. 15 Requerimientos mínimos para la producción de AAV recombinante en PER.C6. Para determinar el requerimiento mínimo para la producción de AAV recombinante en la línea celular PER.C6 20 obtuvimos clonas plasmídicas para los genes de adenovirus que se sabe afectan la producción del AAV (es decir, E2a, E4orf6 y VA) . Junto con la región El ya presente en PER.C6, todos los genes de adenovirus que se sabe afectan la producción de AAV fueron de este modo probados la vez por su efecto sobre 25 la producción de AAV recombinante sobre PER.C6. En contraste con las células HeLa, las células PER.C6 producen una cantidad baja pero detectable de AAV recombinante cuando son transfectadas con pIM45 y pACV-ßgal. La producción eficiente del AAV recombinante requerido por transfección de genes que codifican para el auxiliar adicional. La mayor cantidad de AAV recombinante se obtuvo de la transfección de los tres casetes de expresión por pE2a y pVA (Tabla 4). La transfección de pE2a solo o junto con pE4orf6 dio como resultado +10% del rendimiento del AAV recombinante en comparación con los otros tres genes. La transfección de solo E4 o únicamente de VA no produjo una cantidad significativa de AAV (Tabla 4). La producción sobre PER. C6tsE2A. c5-9 sin adición de genes auxiliares de adenovirus extra dio como resultado un título de 1.3 x 103. Con la adición de pE4orf6 y pVA únicamente o en combinación con pE2A el rendimiento de AAV recombinante se incrementó. Los valores más altos se obtuvieron utilizando el constructo pWE/Ad.Af111-rITR.

Producción a gran escala de AAV recombinante Han sido ideados varios sistemas para hacer crecer células de mamíferos en grandes números. Esos incluyen pero no se limitan al cultivo en botella giratoria, cubos y biorrectivos celulares. Cada uno de esos sistemas tiene ventajas y desventajas. Los biorreactores en los cuales se . ^^¿¿. hacen crecer células en suspensión son los más fáciles de estandarizar y escalar a volúmenes cada vez más grandes. Sin embargo una desventaja es que las células en suspensión no son fácilmente transfectadas. Muchos medios de cultivo celular diferentes se desarrollaron para soportar el crecimiento óptimo de una gran variedad de células diferentes. La mayoría de esos medio se basan en variaciones del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y están suplementados con suero bovino. Hemos adaptado las células PER.C6 a cultivos en suspensión que utilizan un medio libre de suero definido. Los cultivos libres de suero tienen la ventaja de que están completamente definidos puesto que no dependen de una fuente natural de suero que puede variar en calidad y presencia de agentes adventicios. Esos medios libres de suero comprenden aditivos que reemplazan componentes esenciales del crecimiento celular en el suero. Observamos que muchos reactivos de transfección, específicamente los liposomas, funcionan mejor cuando las células fueron cultivadas en DMEM que cuando las células fueron cultivadas en medio Ex-CellMR libre de suero (no mostrado). La transfección de células PER.C6 podría, sin embargo, lograrse utilizando un reactivo no liposómico FuGENEMR o evitando el contacto del complejo liposoma: ADN (DMRIE-C) con el medio Ex-CellMR (Tabla 5) . Los agentes de transfección alternativos son (órgano) fosfacenos. No se sabe mucho acerca de la capacidad para transfectar células con esos agentes. Para estudiar el uso de tales agentes para la transfección de células PER en suspensión efectuamos una transfección con cantidades crecientes del compuesto poli (2- (dimetilamino) etil-10-4-aminobutil) fosfaceno (PPZ) con una cantidad constante de ADN. Las células fueron expuestas a la mezcla de transfección durante 3 horas antes de la remoción del medio. La transfección de las células en suspensión fue medida por suspensión con X-Gal y análisis fluorométrico dependiendo de la cantidad de PPZ agregada (Tabla 6 y 7) alcanzando el 5% de células positivas X-Gal con 320 ug de PPZ (Tabla 6) y 160 ug de PPZ (Tabla 7) . Cantidades mayores de PPZ en la mezcla de transfección se asociaron con una pérdida exhaustiva de células. A continuación evaluamos el potencial de las células PER para la producción a gran escala de AAV recombinante. La producción a gran escala potencial fue evaluada primero sobre células PER.C6 adherentes. A continuación fueron sembrados 10 discos de 170 cm2 (Greiner) con 2 x 107 PER.C6 por diso en DMEM + 10% deFCS. Las células fueron transfectadas con pACV-ßgal, pIM45 y pWE/Ad. AfIII-rlTR (2:8:30 ugramo respectivamente). Los virus se cosecharon 48 horas más tarde de acuerdo al siguiente protocolo. El medio fue removido de las células y las células fueron recolectadas desprendiéndolas en 4 ml/disco en DMEM .JJ--. fresco. La suspensión celular fue congelada y descongelada dos veces y posteriormente incubada con Dnasel (100 ugram/ml) a 37 °C, 30 minutos. La suspensión fue sometida a dos ciclos de congelamiento y descongelamiento adicionales después de los cuales los restos celulares fueron removidos por centrifugación (3000 RPM, 10 minutos) . El sobrenadante fue incubado con 13.3 ml de (NH4)2S04 saturado (4°C, 10 minutos). El precipitado fue removido por centrifugación a 10.000 RPM en un rotor SW27.1 (4°C, 15 minutos). El sobrenadante fue incubado con 26.6 ml adicionales (NH4)2S04 saturado e incubado durante 20 minutos a 4°C. El virus fue sedimentado por centrifugación a 12,00 RPM en un rotor SW27.1 (4°C, 30 minutos). El sedimento fue suspendidos en 5 ml de PBS (NPBI) y dividido igualmente en dos tubos Quick-Seal Ultra-Clear (Beckman Instruments, Mijdrecht, Holanda) . La suspensión de virus fue reforzada con un volumen igual de OptiPrep (Nycomed Pharma As, Oslo, Noruega) . Los tubos sellados se rotaron (290 minutos, 10 RPM) a un ángulo de 80 grados. El virus fue separado por centrifugación por densidad (3 horas a 71.000 RPM) en un toro Vti80 (Beckman Instruments) . Las fracciones fueron recolectadas (200 ul por fracción) y tituladas por la presencia de AAV recombinante. Las fracciones positivas fueron reunidas (+ 400-600 ul) y diluidas en 15 ml de PBS (NPBI) y posteriormente concentradas con Centriplus 100 y Centricon 100, respectivamente (Amicon, Capelle a/d Ijssel) .

Las fracciones concentradas fueron tituladas y se encontró que tenía un título de 8.5 x 109 unidades infecciosas por ml .

Tabla 1. Número de colonias después de la transfección de PER.C6 con vectores de expresión de E2A Plásmido número de colonias líneas celulares establecidas pcDNA3 «200 4/4 pcDNA3wtE2A 4 1/4 pcDNA3tsE2A «100 37/45 10 Tabla 2. Número de Colonias después de la transfección de 293 con vectores de expresión de E2A Plásmido número de colonias pcDNA3 15 «100 pcDNA3wtE2A 2 pcDNA3tsE2A 25 Tabla 3. Infección de PER.C6 y PER.C6tsE2A c3-9 con Ad.dl802 20 ÜNHMMÉMIÜ Tabla 4. Producción libre de adenovirus de AAv recombinante en PER.C6 y PER.C6tsE2A.c5-9 Función Auxiliar de Título de rAAV ACV-ßgal (IU/ml) adenovirus 5 Plasmidos PER.C6 PER.C6tsE2A.c5-9 pWE/Ad.?5' >103 8 x 104 pWE/Ad.Ad-AflII-rITR 1.3 x 106 9.6 x 105 pE2a, pE4orf6, pVA 3.2 x 105 3.2 x 105 10 pE2a, pVA 3.2 x 105 4 x 104 pE2a, pE4orf6 2 x 104 6.4 x 105 pEorfd, pVA 10 1 x 104 pE2a 2.5 x 104 6.4 x 103 PVA 0 1.3 x 103 pEorf6 0 1.3 x 103 5 sin Ad-DNA 10 1.3 x 103 Tabla 5. Transfección de células PER.C6 en suspensión.

Exp. Reactivo de ADN (ug) ADN/lípido % de Actividad de noa Transfección (ug/ul) Azul ß-gal 0 ugramos/106 células DMRIE-CMR 4 1:5 LO 1.52 0 0.0 -?jf l******* . .u-.

Tabla 5. Transfección de células PER.C6 en suspensión. (Continuación) Exp. Reactivo de ADN (ug) ADN/lípido % de Actividad de noa Transfección (ug/iul) Azul ß-gal ugramos/106 células 2 DMRIE-CMR 4 1:5 20 3.8 - - 0 0.0 3 DMRIE-CMR 20 1:10 ND 0.53 - - ND 0.0 4 DMRIE-CMR 20 1:20 ND 0.10 FuGENEMR 6 20 1:20 ND 0.34 ND 0.0 El experimento 1 se efectuó en discos de 6 pozos en cultivos estacionarios. El experimento 2 se efectuó en discos de 6 pozos en cultivos con agitación (100 RPM) . Durante la transfección los cultivos fueron incubados sin agitación. Los experimentos 3 y 4 se efectuaron en cultivos de Erlenmeyer bajo agitación continua (100 RPM) . á Tabla 6. Transfección de células PER.C6 en suspensión. Reactivo de ADN PPZ % de células Actividad de Transfección (ug) (ug) células viablesVml ß-gal azules (ugramos/106 células) PPZ 4 4 4 4 0 0 9 9 xx 110035 0.02 4 20 0 9 x 105 0.02 4 40 0 7 x 105 0.02 4 80 <0. 1 8 x 105 0.02 4 160 <0. 1 3 x 105 0.02 4 320 5 1.6 x 104 0.50 4 640 - <103 4 1280 _ <103 El número de células viables, determinado por exclusión de azul de tripan, dos días después de la transfección.

Tabla 7. Transfección de células PER.C6 en suspensión. Reactivo de .DN PPZ % de células Actividad de Transfección ug) (ug) células viablesVml ß-gal azules ugramos/106 células) PPZ 4 160 5 4 x 105 ND 4 200 1 9 x 105 ND 4 240 - <103 ND 4 280 _ <103 ND |_^u^|Hwdta Tabla 7. Transfección de células PER.C6 en suspensión. (continuació ) Reactivo de ADN PPZ % de élulas Actividad de Transfección (ug) (ug) células blesVml ß-gal azules ugramos/106 células 4 320 <103 ND 4 360 <103 ND 4 400 <103 ND 4 440 <103 ND 10 El número de células viables, determinado por exclusión de azul de tripan, dos días después de la transfección.

REFERENCIAS 15 Alien JM, Debelak DJ, Reynolds TC, Miller AD (1997) Identification and elimination of replication-competent adeno-associated virus (AAV) that can arise by nonhomologous recombination during AAV vector production. J-Virol 71: 6816- 22 issn: 0022-538x 20 Berns K (1996) Parvoviridae : The viruses and their replication. In: Fields Virology, Lippincott - Raven, New York Berns K, Bergoin M, Bloom M, Lederman M, Muzyczka N, Siegl G, Tal J, Tattersall P (1994) Parvoviridae. VIth Report of the international Committee on taxonomy of viruses. In: Virus taxonomy, Archives of Viology suppl. 10. Berns PC, Bohensky R (1987) Adeno-associated virus: an update. Adv. Virus Res. 32: 243-306 5 Berns KI (1990a) Parvoviridae and their replication. In: Virology, Raven Presa, New York Berns KI (1990b) Parvovirus replication. Microbiol, Rev. 54: 316-329 Cárter a (1990) Adeno-associated virus helper 10 functionsí In: CRC handbook of parvoviruses, CRO Press, Inc., Boca Ratón Chejanovsky N, Cárter BJ (1989) Mutagenesis of an AUG codon in the adeno-associated virus rep gene: effeets on viral DNA replication. Virology 173: 120-128 15 Clark K, Sierra T, Johnson P (1997) Recombinant adeno-associated virus vectors medíate long-term transgene expression in muscle. Hum Gene Ther 8: 659-669 Conway JE, Zolotukhin St Muzyczka N, Hayward GS, Byrne BJ (1997) Recombinant adeno-associated virus type 2 20 replication and packaging is entirely supported by a herpes simplex virus type 1 amplicon expressing Rep and Cap. J-Virol 71: 6780-9 issn: 0022-538x Ensinger M, Ginsberg H (1972) Selection and preliminary charactetization of temperature-sensitive mutants 25 of type 5 adenovirus. J Virol 10: 328-339 *. jiaAafa &&ümt ^^¡^¡^^ Ferrari F, Xiao x, McCarty D, Samulski R (1997) New developments in the generation of Ad-free, high-titer rAAV gene therapy vectors. Nat Med 3: 1295-1297 Ferrari FK, Samulski T, Shenk T, Samulski RJ (1996) 5 Second-strand synthesis is a rate-limiting step for efficient transduction by recombinant adeno-associated virus vectors. J-Virol 70: 3227-34 Flotte TR, Afione SA, Conrad C, McGrath SA, Solow R, Oka H, Zeitlin PL, Guggino WB, Cárter BJ (1993) Stable in 10 vivo expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator with an adeno-associated virus vector, Proc Nati Acad Sci USA 90: 10613-1-617 Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R (1977a) Characteristics of a human ceil line transformed by DNA from 15 adenovirus type 5. J Gen Virol 36: 59-72 Graham FL, Smiley J, Russell WC, Naiva R (1977b) Characteristics of a human cell line transtormed by DNA from adenovirus type 5. J Gen Virol 36: 59-72 Hehir K, Armentano D, Cardoza L, Choquette T, 20 Berthelette P, White G, Couture L, Everton M, Keegan J, Martin J, Pratt D, Smith M, Smith A, Wadsworth S (1996) Molecular characterization of replication competent variants of adenovirus vectors and genome modifications to prevent their occurence. J Virol 70: 8459-8467 m-'nfM"l!*"~i-~ Herzog, R, Hagstrom J, Kung S, Tai S, Wilson J, Fischer K, High K (1997) Stable gene transfer and expression of human blood coagulation factor IX after intramuscular injection of recombinant adeno-associated virus. Proc Nati Acad Sci USA 94: 5804-5809 Hinds P, Finlay C, Quartin R, Baker S, Fearon E, Vogeistein B, Levine A (1990) Mutant p53 DNA clones from human colon carcinomas coorperate with ras in transforming primary rat cellS: a comparison of the "hot spot" mutant phenotypes. Cell growth differ. 1: 571-580 Hong G, Ward P, Berns KI (1992) in vi tro replícation of adeno-associated virus DNA. Proc Nati Acad Sci USA 89: 4673-4677 Hong G, Ward P, Berns KI (1994) Intermediates of adeno-associated virus DNA replication in vi tro . J Virol 68: 2011-2015 Imler J, Chartier C, Dreyer D, Dieterle A, Sainte- Marie M, Faure T, Pavirani A, Methali M (1996) Novel complementation cell lines derived from human lung carcinoma A549 cells support the growth of El-deleted adenovirus vectors, Gene Ther 3: 75-84 Kotin RM, Siniscalco M, Samulski RJ, Zhu X, Hunter L, Laughlin S, Muzyczka N, Rocchi M, Berns KI (1990) Site-specific integration by adeno-associated virus. Proc Nati Acad Sci USA 87: 2211-2215 Li J, Samulski R, Xiao X (1997) Role for highly regulated rep gene expression in adeno-associated virus vector production. J Virol 71: 5236-5243 Lochmuller H, Jani A, Huard J, Prescott S, Simoneau 5 M, Massie B, Karpati G, Acsadi G (1994) Emergence of early región 1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication-defective adenovirus recombinants (DEI+DE3) during múltiple passages in 293 cells. Hum Gene Ther 5: 1485-1492 10 Louis N, Evelegh C, Graham F (1997) Cloning and sequencing of the cellular-viral junctions from the human adenovirus type 5 transformed 293 cell line. J Virol 233: 423-429 Lusby E, Fife KH, Berns Kl (1980) Nucleotide 15 sequence of the inverted terminal repetition in adeno- associated virus DNA. J Virol 34: 402-409 Martínez C, Luna da la S, Peleaz E, Lopez-Turiso A, Valcarcel J, Haro de O, Ortin J (1989) Permanent cell lines that show temperature-dependent expression of adenovirus 20 virus associated RNA. J Virol 63; 5445-5450 McCarty DM, Christensen M, Muzyczka N (1991) Sequences required for coordínate induction of adeno- associated virus pl9 and p40 promoters by Kep protein. J- Virol 65: 2936-45 issn: 0022-538x ?ti?Ttri]ii?????írft?ira""g~M--'-" ' • - Monahan P, Samulski R, Tazelaar J, Xiao C, Nichols T, Bellinger D. Read M, Walsh C (1998) Direct intramuscular injection with recombinant AAV-vectors results in sustained expression in a dog model of hemophilla. Gene Ther 5: 40-49 5 Ni T, Zhou X, McCarty D, Zolotukhin I, Muzyczka N (1994) In vitro replication of adeno-associated virus DNA. J Virol 68: 1128-1138 Reich N, Sarnow P, Duprey E, Levine A (1983) Monoclonal antibodies which recognize native and denatured 10 forms of the adenovirus DNA-binding protein. Virology 128: 480-484 Rice SA, Klessig DF (1985) Isolation and analysis of adenovirus type 5 mutants containing deletions in the gene encoding the DNA-binding protein. J Virol 56: 767-778 15 Ruffing M, Heid H, Kleinschmidt JA (1994) Mutations in the carboxy terminus of adeno-associated virus 2 capaid proteins aftect viral infectivity: lack of an RGD integrin- binding motif. J-Gen-Virol 75: 3385-92 Rutledge E, Halbert C, Russell D (1998) Infectious 20 clones and vectors derived from adeno-associated virus (AAV) serotypes other than AAV-2. J Virol 72: 309-319 Samulski RJ (1993) Adeno-ansociated virus. Integration at a specific chromosomal locus. Curr Opin Gen Dev 3: 74-80 Samulski RJ, Chang L, Shenk T (1989) Helper-free stocks ot recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol 63: 3822-3828 5 Samulski RJ, Zhu X, Xiao X, Brook JD, Housman DE, Epstein N, Hunter LA (1991) Targeted integration of adeno- associated virus (MV) into human chromosome 19. EMBO J. 10: 3941-3950 Smith a, Kotin a (1998) The Rep52 gene product of 10 adeno-assoctated virus is a DNA helicase with 3'-to 5' polarity. J Virol 72: 4874-4881 Snyder R, Miao O, Patijn J, Spratt S, Danos 0, Nagy D, Gown A, Winther B, Meuse L, Cohén L, Thompson A, Kay M (1997a) Persistent and therapeutic concentration of human 15 factor IX in mice after hempatic gene transfer of recombinant AAV vectors, Nat . Genetics 16: 270-276 Snyder RO, Spratt SK; Lagarde C, Bohl- D, Kaspar B, Sloan B, Cohén LK, Danos O (1997b) Efficient and stable adeno-associated virus-mediated transduction in the skeletal 20 muscle of adult immunocompetent mice. Hum-Gene-Ther 8: 1891- 900 issn: 1043-0342 Srivastava A, Lusby E, Berns K (1983) Nucleotide sequence and organisation of the adeno-associated virus 2 genome. J Virol 45: 555-564 rti '-jaft^M' Vincent AJPE, Esandi Mdc, Someren GDv, Noteboom JL, C.J.J A, Vecht 0, Smitt PAES, Bekkum DWv, Valerio D, Hoogerbrugge PM, Bout A (1996) Treatment of Lepto-meningeal metástasis in a rat model using a recombinant adenovirus containing the HSVtk gene. J. Neurosurg. 85: 648-654 Vincent KA, Piraino ST, Wadsworth SC (1997) Analysis of recombinant adeno-associated virus packaging and requirements for rep and cap gene products. J-Virol 71: 1897-905 issn: 0022-538x Vliet van der P, Levine A, Ensinger M, Ginsberg H (1975) Thermolabile DNA binding proteins from cells infected with a temperature-sensitive mutant of adenovirus defective in viral DNA synthesis. J Virol-15: 348-354 Ward P, Dean F, O'Donnell Mr Berns K. (1998) Role of the adenovirus DNA-binding protein in in vi tro adeno-associated virus DNA replication. J Virol 72: 420-427 Xiao X, Li J, Samulski R (1998a) Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol 72: 2224-2232 Xiao X, Li J, Samulski RJ (1998b) Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus, J-Viroí 72: 2224-32 issn; 0022-538x Yacobson E, Hrynko T, Peak M, Winocour E (1989) Replication of adeno-associated virus in cells irradiated with UV light at 254 nm J Virol 63: 1023-1030 Yalkinoglu A, Heilbronn R, Burkle A, Sahiehofer J, zur Hausen H (1988) DNA amplification of adeno-associated virus as a response to cellular genotoxic stress. Cáncer Res 48: 3123-3125 Zhou 3, Murphy J, Escobedo J, Dwarki V (1998) Adenoassociated virus-mediated delivery of erythropoietin leads elastomérica sustained elevation of hematocrit in nonhuman primates. Gene ther 5: 655-670 Zhou x, Muzyczka N (1998) In vitro packaging of adenos associated virus DNA. J Virol 72: 3241-3247 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere. k á^hlwKiM4a

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 5 1. Una célula para empaquetar virus adenoasociados (AAV) , caracterizada porque que ha sido provista con ácido nucleico que codifica para al menos un producto genético que proporciona función auxiliar para el AAV que permite generar AAV recombinante sin producción de virus auxiliar 10 recombinante. 2. La célula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico codifica para un producto genético de adenovirus. 3. La célula de conformidad con la reivindicación 15 2, caracterizada porque el producto genético comprende El de adenovirus o un fragmento funcional de la misma. . La célula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el producto genético comprende E2A de adenovirus o un fragmento funcional de la mismo, donde la E2A 20 se deriva preferiblemente del adenovirus tsl25. 5. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque ha sido provista además con al menos un ácido nucleico adicional que codifica para la función auxiliar adicionalmente requerida. Mfiaat *<ií¡?m ? 6. La célula de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el producto genético codifica para la El de adenovirus o un fragmento funcional de la misma y al menos uno de ácido nucleico adicional codifica para la E2A de 5 adenovirus o un fragmento funcional de la misma, donde la E2A se deriva preferiblemente del adenovirus tsl25. 7. La célula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el ácido nucleico que codifica para el E4orf6 de adenovirus o un fragmento funcional del mismo. 10 8. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque ha sido derivada de una célula retinoblástica embriónica humana. 9. La célula de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque una célula PER.C6 que ha sido 15 depositada bajo el número de acceso 96022940 ECACC en el Centro para la Investigación de Microbiología Aplicada (CAMR) o una célula derivada de la misma. 10. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende el 20 cósmido pWE/Ad.AfHl-rlTR (depósito ECACC p97082116 en el CAMR) . 11. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende el cósmido pWE/Ad.AflII-rITR?E2A. 12. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque comprende el plásmido pcDNA3wtE2A. 13. Un cultivo celular, caracterizado porque 5 comprende una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 14. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende medios sin ningún constituyente humano o animal. 10 15. El cultivo celular de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque comprende un cultivo celular en suspensión u otro cultivo a gran escala. 16. El uso de una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o un cultivo 15 celular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 para producir virus adenoasociados recombinantes. ^jg ^t ?Ék